KR20230145023A - 미생물 감염을 소독, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

미생물 감염을 소독, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화된 상태의 염소의 고체 전구체의 사용을 포함하는 안정한 항미생물제 및 소독제 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 필요에 따른 저장 및 혼합 용기 및 필요에 따른 제제의 제조 및 전달 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 생체내, 표면 상 및 분무 적용을 통한 항바이러스제, 항생제 및 일반적 항미생물제 용도를 제공한다.

Description

미생물 감염을 소독, 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원(들)에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 7월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 63/048,815를 우선권 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 산화된 상태의 염소의 고체 또는 액체 전구체와 아세트산 또는 그의 염의 조합물을 포함하는 새로운 조성물에 관한 것이며, 여기서 이러한 조성물은 광범위 스펙트럼의 박테리아 및/또는 바이러스, 진균 및 기생충 병원체 및 본원에서 집합적으로 나타낸 미생물을 치료하는 데 유용한 소독제이다.
감염성 질환은 전세계적으로 주요 사망 원인이고, 모든 소아 사망의 거의 2/3를 비롯하여, 매년 1천3백만명 초과의 사망을 유발한다. 더욱이, 항생제 내성은 증가하고 있으며, 폐렴, 결핵 및 콜레라를 포함한 광범위한 인간 질환에서의 이환율에 기여하고 있다. 다수의 인간 병원체에서 통상적인 항생제에 대한 내성이 발생한다는 것이 특히 우려된다. 기존 항생제의 새로운 보다 강력한 유도체의 도입은 단지 일시적인 해결책만을 제공하는데, 이는 기존 내성 메카니즘이 새로운 유도체를 수용하도록 신속하게 적합화되기 때문이다. 내성 그람-양성 박테리아가 상당한 위협을 제기하지만, 흔한 그람-음성 병원체, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 다중약물 내성 (MDR) 균주의 출현이 특히 우려된다. 추가로, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii) 및 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)의 분리주는 실질적으로 모든 항생제에 대해 내성인 것으로 나타났다.
바이러스는 또한 감염성 역학에서 유의한 관심사이다. 많은 인수공통 기원의 심각한 바이러스 발생이 점점 더 흔해지고 있다. 예를 들어, 2000년대 초중반 SARS (중증 급성 호흡기 증후군) 및 MERS (중동 호흡기 증후군) 발생, 2009년 H1N1 범유행 및 이후 2020년 SARS CoV-2 범유행은 이들 바이러스 병원체의 치료 및 확산 예방 둘 다에 관심을 집중시켰다.
호흡기도를 감염시키는 많은 바이러스는 비말 감염을 통해 전달된다. 그 경우에, 바이러스를 함유하는 호흡기 비말이 감염된 사람에 의해 배출되고, 직접 접촉 시 또는 비말이 내려앉는 표면과 접촉 시 다른 자들에 의해 픽업된다. 전형적으로, 감염은 코, 눈, 귀 또는 입으로 들어간 결과, 점막 또는 상피 세포 상의 수용체에 대한 바이러스의 결합을 통해 진행된다. 추가로, 일부 바이러스는 바이러스를 함유하는 에어로졸 입자를 통해 전염되거나 또는 공기 매개된다. 어느 경우든, 바이러스는 감염된 개체로부터의 발현 후 수시간 내지 수일 동안 생존할 수 있다.
표면 또는 오염된 상피의 소독을 위한 통상적인 조성물 및 방법은 모든 감염원의 불활성화에 충분하지 않다. 현재 형태의 통상적인 소독제 조성물은 길고 비실용적인 노출 시간을 요구할 수 있거나, 또는 민감성 기기 또는 살아있는 조직에서는 사용될 수 없는 유해 또는 부식성 용액 또는 증기를 사용할 수 있고, 따라서 내성 병원체로부터의 증가하는 건강 위험에 대한 실용적인 해결책을 제공하지 못한다.
염소 산화물 또는 산화된 염소 (본원에서 "OC"로도 지칭됨)는 많은 부류의 화학 종을 포함하고, 종종 자연에서 발견될 뿐만 아니라 포유동물 내 생물학적 시스템에서 발견된다. 염소 산화물은 또한 중성 화합물 또는 이온, 소위 옥시음이온으로서 존재할 수 있다. 염소의 여러 옥시음이온이 존재하며, 여기서 옥시음이온은 상응하는 음이온 하이포클로라이트 (ClO-), 클로라이트 (ClO2 -), 클로레이트 (ClO3 -) 또는 퍼클로레이트 (ClO4 -)로 +1, +3, +5 또는 +7의 산화 상태를 취할 수 있다. 차아염소산 (HOCl)의 낮은 pH에서의 표준 환원 전위는 + 1.63이고, 아염소산의 경우 (HClO2), 표준 환원 전위는 1.64인 반면, 염기성 pH에서는 각각 + 0.89 및 + 0.78이다. pH 5 내지 7에서, 환원 전위는 + 1보다 더 높다.
결과적으로, 하이포클로라이트 및 클로라이트는 일반적으로 미생물 및 기생충을 사멸시키는 잠재력을 갖는 가장 유용한 산화 상태이다. 특히, 클로라이드 이온 Cl-은 가장 안정한 산화 상태이고, 반응성이 아니며, 또한 소독제로서도 효과적이지 않다. 산화 상태 +5 및 +7의 클로레이트 및 퍼클로레이트는 더 낮은 산화 상태보다 더 반응성이고, 취급하기가 더 어려울 수 있다.
하이포클로라이트 이온은 화학식 ClO-를 가지며, 여기서 염소 (Cl)는 산화 상태 +1이고, 이는 Cl의 저-에너지 산화 상태가 -1이기 때문에 잠재적으로 불안정한 산화 상태이다. 하이포클로라이트 이온 및 클로라이트 이온 둘 다는 다수의 양이온과 조합되어, 이들 산화된 염소의 염으로서의 하이포클로라이트 및 클로라이트를 형성한다. 통상의 예는, 일반적으로 수처리 (예를 들어, 수영장 등)에 사용되는 표백 분말, 염소 분말 또는 염소화 석회를 비롯한 상업용 제품의 주요 활성 성분인 차아염소산나트륨 (가정용 표백제) 및 차아염소산칼슘을 포함한다. 본원에서 "주요 염소 산화물"로도 지칭되는 클로라이트 및 하이포클로라이트 이온은 다양한 맥락에서 유용하다. 아염소산나트륨 및 차아염소산나트륨은 강한 산화제이고, 물 정제, 소독, 뿐만 아니라 동물 제품의 표백 및 탈취에 사용되어 왔다.
차아염소산나트륨은 산성 조건 하에 고도로 독성인 염소 기체를 생성하기 때문에, 가정용 목적을 위한 상업적으로 입수가능한 수용액은 강염기성 용액이고, pH는 수산화나트륨을 사용하여 조정된다.
차아염소산은 박테리아, 조류, 진균 및 다른 유기물을 신속하게 불활성화시키는 것으로 공지된 약산이며, 이는 광범위한 미생물에 걸쳐 효과적인 작용제이다. 추가적으로, 차아염소산은 약산이고 사람들이 차아염소산을 견딜 수 있도록 하는 특정 화합물을 자연적으로 생산하기 때문에 일반적으로 인간에게 비-독성이다. 그의 살생물 특성과 그의 안전성 프로파일의 조합으로 인해, 차아염소산은 많은 상이한 산업, 예컨대 의료, 식품 서비스, 식품 소매, 농업, 상처 관리, 실험실, 병원, 치과 또는 꽃 산업에 걸쳐 많은 유익한 용도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
차아염소산은 염소가 물에 용해될 때 형성된다. 특히, 하이포클로라이트의 산성화는 염소 원자가 산화 상태 +1인 차아염소산을 생성한다. 차아염소산은 용액으로부터 빠져나올 수 있는 염소 기체와 평형 상태로 존재한다. 평형은 하기 식 (식 1)에 예시된 바와 같이 pH-의존성이다:
Cl2 + H2O HOCl + Cl- + H+ ClO- + Cl- + 2 H+ (1)
pH 증가 →
상기 식 (식 1)을 참조하면, 높은 pH는 반응을 우측으로 유도하여, 염소의 클로라이드 및 하이포클로라이트로의 불균등화를 촉진하는 반면, 낮은 pH는 반응을 좌측으로 유도하여, 독성일 수 있는 염소 기체 (Cl2)의 방출을 촉진한다.
특히 -1보다 더 높은 산화 상태의 염소 용액의 이전의 의학적 용도와 관련된 유의한 과제는 그의 안정성이며, 이는 이들 화학 종이 더 높은 에너지 상태에 있고 클로라이드 이온 Cl-으로 돌아가려는 경향이 있어 주위 온도에서 용액 중에서 분해될 것이기 때문이다. 이는 주위 조건에서 염소 산화물의 제약 제제 및 의료 장치의 요구되는 보관 수명 안정성을 방해한다. 따라서, 의료 장치 및 약물에 요구되는 적절한 보관 수명은 염소 산화물의 용액의 경우 달성하기 어렵다. 모든 염소 산화물에 대한 이러한 고유의 한계는, 특히 가변적인 온도, 광, 습도 및 대기 기체를 갖는 영역에서 보다 고온에서의 수송 및 저장을 제한한다.
따라서, 염소 산화물을 함유하는 제제가 효과적인 항미생물제일 수는 있지만, 통상적인 제제는 상당한 결점을 갖는다. 예를 들어, 약산 HOCl은 통상적인 조건 하에 생산될 때 불안정하고 불순하다. 결과적으로, 의도된 단기간 사용을 허용하는 안정성을 갖는 염소 산화물을 부위에 제공할 수 있는 보다 제어되고 즉각적인 제조 방법에 대한 필요가 존재한다. 일반적으로, 내성 미생물 및 바이러스를 치료하기 위한 새로운 치료제에 대한 유의한 미충족 의료 필요가 존재한다.
본 발명은 제약상 허용되는 희석제, 아주반트 또는 담체 중에 용해되고 활성화제와 조합된 산화된 상태의 염소의 전구체를 포함하는 소독제 조성물을 제공한다. 생성된 조성물은 생체내 사용뿐만 아니라 표면 소독을 위한 개선된 항미생물제를 제공한다. 바람직한 제제에서, 본 발명의 조성물은 아세트산 활성화제를 하이포클로라이트 형태와 조합하여 포함한다. 임의로, 본 발명의 제제는 점도 증진제 및/또는 염료와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제제의 점도는 점도 증진제를 사용하여 겔을 형성하도록 조정될 수 있다. 본 발명의 제제는 바람직하게는 사용 전에 다중-구획 장치의 일부로서 별개의 챔버를 포함하는 용기에서 혼합된다. 본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 피부 또는 흡입-기반 투여를 위해 제제화될 수 있다. 추가로, 본 발명의 제제는 환자의 호흡기계로의 신속한 도입을 위한 네뷸라이저 또는 유사한 장치를 통한 흡입을 위해 제조될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물은 생체내 및 표면상 둘 다에서 광범위 스펙트럼의 박테리아 및/또는 바이러스 병원체를 치료하기 위한 유용한 소독제이다.
특정한 측면에서, 본 발명은 바이러스 및 박테리아 감염 둘 다를 포함한 호흡기 감염을 치료 및 예방하는 안전하고 효과적인 수단을 제공하는 항미생물 제제에 관한 것이다. 바람직한 조성물은 차아염소산-기재의 광범위-스펙트럼의 항바이러스 및/또는 항박테리아 흡입 용액을 포함한다. 본 발명의 용액은 바람직하게는 흡입 전달을 위해 네뷸라이징된다. 보다 구체적으로, 바람직한 제제는 아세트산 (대략 0.25%)으로 안정화된 차아염소산 (HOCl) (약 25 ppm 내지 약 200 ppm)을 포함하여, 유의한 항미생물 효과를 갖는 지속가능한 농도의 HOCl을 생성한다. 아세트산의 첨가는 HOCl 안정성을 증가시키고, 따라서 보관-수명이 연장된 치료의 개발을 가능하게 한다. 추가로, 조성물은 바람직하게는 pH 5.5에서 제제화되고, 생리학적으로 등장성이어서, 기도 내에서의 내약성을 증가시킨다.
본 발명의 조성물은 독특한 항병원성 특성을 갖는다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물은 외피보유 바이러스에 작용하고, 코로나-유형 바이러스에 대한 우수한 항바이러스 효과를 제공한다. 따라서, 이러한 조성물은 SARS 감염 (예를 들어, COVID-19)의 치료 및 확산 예방에 특히 유용하다. 보다 구체적으로, SARS-CoV-2 및 많은 다른 바이러스는 호흡기계의 세포로의 진입점인 표면 단백질 (즉, 스파이크 단백질)을 갖는다. 이들 스파이크 단백질은 HOCl에 의한 산화에 취약한 -SH 기를 포함한다. 심지어 비교적 낮은 농도의 HOCl도 정상 조직 및 세포내 효소에는 무해하면서, (예를 들어, 바이러스 스파이크 단백질 상의) 세포외 -SH 기를 산화시킨다. 이에 따라, 본 발명의 조성물의 항바이러스 효과는 최초 노출 시, 감염 동안 및 비리온이 세포내에 있고 후속적으로 호흡기도 내의 세포에 의해 방출될 때, 호흡기도에서 바이러스 입자를 파괴한다.
따라서, 특히 외피보유 바이러스에 대한 본 발명의 조성물의 독특한 살바이러스 특성은 이러한 조성물이 코로나바이러스의 확산을 예방하기 위한 진행중인 노력에 있어서 강력한 도구가 되게 한다. 이러한 조성물은 광범위한 환자 집단 중에서 질환의 지속기간 및 증상의 중증도를 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고체의 산화된 염소 종 염, 활성화제, 예컨대 아세트산 및 제약상 허용되는 희석제, 아주반트 또는 담체를 포함하는 소독제 조성물을 제공한다. 고체의 산화된 염소 종 염은 화학식 M n+ [Cl (O) x ]n n-에 기초하며, 여기서 M은 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 전이 금속 이온이고, n은 1 또는 2이고, x는 1 내지 4 (경계값 포함)의 정수이다. 활성화제는 화학식 R1XOn(R2)m에 기초하며, 여기서 R1 기는 아미노, 아미도, 카르복실, 술폰 또는 히드록시 기로 임의로 치환된, 1 내지 10개의 수소화된 탄소 원자를 포함하고, 여기서 기 X는 탄소, 인 및 황으로부터 선택되고; n 및 m은 각각 독립적으로 2 또는 3이고, R2는 H, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 전이 금속 이온 염 및 암모늄 염으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 산화된 염소 염은 차아염소산 HOCl의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 활성화제는 아세트산이다. 다른 실시양태에서, 산화된 염소 염은 아염소산 HOClO의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 포함한다. 다시, 이러한 실시양태에서, 활성화제는 아세트산이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 약 0.1 mOsm 내지 약 500 mOsm 범위의 오스몰랄농도를 포함한다.
일부 실시양태에서, 산화된 염소 종 염, 아세트산 또는 그의 금속 또는 암모늄 염의 양은 4 내지 8의 pH를 생성한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 점도-증진제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 점도-증진제는 산화된 염소 종에 의해 산화될 수 없다.
일부 실시양태에서, 점도-증진제는 수용성 겔화제를 포함한다. 수용성 겔화제는 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 술폰산 공중합체, 포스피노 폴리카르복실산 및 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 및 술폰산-술폰화 스티렌 삼원공중합체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 염료를 포함한다. 염료는 바람직하게는 제제 중 산화된 염소 화합물의 존재에 대한 비색 지시제를 생성한다. 염료는 환원-산화 염료일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 염료의 색 및 강도는 산화된 염소 화합물의 산화 상태에 좌우된다.
본 발명의 제제는 수용액, 겔, 크림, 연고 또는 오일로서 구성될 수 있다. 본 발명의 제제는 다중-구획 용기에서 제조 및 저장될 수 있다. 일부 측면에서, 수성 및 고체 성분은 조합 전 별개의 각각의 구획 내에 함유되어 있다.
본 발명의 제제는 표면 상의 항미생물제로서 뿐만 아니라 질환 치료에 적용하기 위해 유용하다. 이에 따라 본 발명의 제제는, 예를 들어 네뷸라이저, 흡입기, 기화기 또는 다른 적합한 전달 수단과 함께 사용하기 위한 흡입 제품으로서 유용하다. 추가로, 본 발명의 조성물은 동물 또는 농업적 사육에서 피부 상처, 유방염 또는 임의의 다른 감염성 질환에 적용하기 위해; 뿐만 아니라 항바이러스 적용을 위해 제제화될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시양태에 따른 소독제 조성물의 제조, 저장 및 분배를 위한 예시적인 다중-구획 또는 다중-챔버 용기를 보여주는 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 샘플 용액을 사용하여 수득된 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명에 따른 샘플 용액을 사용하여 수득된 결과를 보여준다.
본 발명은 일반적으로 산화된 상태의 염소의 고체 및 액체 전구체와 활성화제, 예를 들어 아세트산 또는 그의 염의 조합물, 뿐만 아니라 1종 이상의 추가의 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물의 사용은 다양한 생물적 및 비생물적 표면 및 환경 상의 광범위 스펙트럼의 박테리아 및/또는 바이러스 병원체의 치료를 위한 소독제로서 작용한다.
본 발명의 일부 바람직한 제제는 장기간 안정성을 갖는 조성물을 즉각적으로 생성하는 고체 형태의 다성분 (즉, 2-성분, 3-성분, 4-성분 등) 제제이다. 이는 선행 기술에 기재된 차아염소산 또는 이산화염소의 통상적인 용액에서 전형적으로 관찰되는 보관 수명과 관련된 한계를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 고체 전구체 (API-P)로부터의 산화된 염소 종의 즉시 사용가능한 제제의 즉각적인 생성은 사용 부위에서 다중-구획 장치 또는 용기에서 수행될 수 있다. 다중-구획 장치 또는 용기는 본 발명과 일치하는 제조된 조성물의 제조, 분배 및 장기간의 안정한 저장을 위해 사용된다. 특히, 본원에 기재된 이러한 다중-구획 용기는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 요구되는 성분을 개별적으로 함유하는 다수의 구획 또는 챔버를 가질 수 있다. 한 예에서, 제제는 산화된 상태의 염소의 고체 전구체와 아세트산 또는 그의 염, 점도 증진제 및 염료를 포함하고, 후속적으로 조합되어 목적하는 사용 시간 및 부위에서 항미생물 조성물을 제조한다.
항미생물 제제에서 API로서 유용한 또 다른 염소 산화물은 이산화염소이며, 여기서 염소 원자는 산화 상태 +3이다. 아염소산나트륨의 주요 반응은 하기 식 (식 2)에 예시된 바와 같이 이산화염소의 생성이다:
5 NaClO2 + 4 HOR 5 NaOR + 4 ClO2 + 2H2O (2)
상기 식 (식 2)을 참조하면, HOR은 통상적으로 무기 산, 예컨대 HCl 또는 시트르산이며, 이는 아염소산나트륨을 먼저 아염소산으로, 이어서 실온에서 고도로 수용성인 이산화염소로 전환시키기 위해 양성자 공급원이 필요하기 때문이다.
이산화염소의 이점은 독성 환경 오염물인 염소화 탄화수소, 예를 들어 트리할로-메탄에 반응하는 것으로 공지된 염소 기체 Cl2를 생성할 수 없다는 것이다. 이산화염소의 또 다른 이점은 소독제로서의 활성 또는 그의 수용액의 안정성이 pH-의존성이 아니라는 것이다.
본 발명은 염소 산화물을 사용하는 선행 기술 조성물과 연관된 과제를 다룬다. 특히, 본 발명은 산화된 상태의 염소 (OC)의 고체 전구체와 양성자 공급원을 제공하는 활성화제의 조합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 활성화제의 바람직한 예는 아세트산 또는 그의 염이며, 여기서 본 발명의 소독제 조성물은 의도된 단기간 사용을 허용하는 안정성을 가지면서 사용 부위에서 제어되고 즉각적인 과정으로 즉각적으로 형성된다. 이러한 조성물은 광범위 스펙트럼의 미생물의 치료에 유용한 소독제이다. 특히, 활성 제약 성분이 사용 부위에서 염소 산화물의 안정한 고체 전구체 (이하에서 "API-P"로 지칭됨)로부터 생성되는 경우에, 예를 들어 동시에 용액 또는 겔을 생체적합성 pH 값으로 완충시키는 활성화제로서 아세트산을 포함시키는 것은, 선행 기술에서의 안정성 문제가 더 이상 존재하지 않는다.
이전에 기재된 바와 같이, 선행 기술의 기술적 해결책은 생물학적 유체와 생체적합성인 최종 항미생물 용액의 이온 강도 또는 오스몰랄농도를 고정시키는 방법을 다루지 못한다. 심지어 추가로, 선행 기술은, 예를 들어 레올로지 및 유동성을 조절함으로써 치료 관심 영역에서 API의 접촉 시간 및 지속성을 조절하고 증가시키는 방법을 제시하지 못한다. 또한 여전히, 선행 기술은 API의 산화 상태를 모니터링하는 비교적 간단하지만 효과적인 수단 및 소독제 조성물의 혼합 동안 API가 어디에 적용되었는지의 시각적 지표를 제공하지 못한다.
추가적으로, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 점도 증진제 (본원에서 "VE"로도 지칭됨)의 사용을 추가로 포함할 수 있고/거나 산화된 상태의 염소의 고체 전구체와 활성화제, 예를 들어 아세트산 또는 그의 염의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 염소 원자의 산화 상태에 따라 달라지는 색을 갖는 염료, 바람직하게는 예를 들어 산화환원 민감성 염료를 제제에 포함시키는 것이다.
특히, 본 발명의 일부 바람직한 조성물은 장기간 안정성을 갖는 조성물을 즉각적으로 생성하는, 파괴가능한 벽 또는 장벽에 의해 분리된 고체 형태의 다성분 (즉, 2-성분, 3-성분, 4-성분 등) 제제이다. 이는 선행 기술에 기재된 차아염소산 또는 이산화염소의 용액에서 관찰되는 보관 수명과 관련된 임의의 문제를 제거한다.
보다 구체적으로, 고체 전구체 API-P로부터의 산화된 염소 종의 즉시 사용가능한 제제의 즉각적인 생성은 사용 부위에서 다중-구획 장치 또는 용기에서 수행될 수 있다. 다중-구획 장치 또는 용기는 본 발명과 일치하는 제조된 조성물의 제조, 분배 및 장기간의 안정한 저장을 위해 사용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 이러한 다중-구획 용기는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 요구되는 성분을 개별적으로 함유하는 다수의 구획 또는 챔버를 가질 수 있다. 예를 들어, 산화된 상태의 염소의 고체 전구체와 활성화제, 예를 들어 아세트산 또는 그의 염, 점도 증진제 및 염료가 혼합되고, 후속적으로 목적하는 사용 시간 및 부위에서 목적하는 소독제의 제제화 시에 조성물이 생성된다.
아세트산은 다양한 포유동물 조직에서 발견되는 풍부한 천연 화합물이다. 이는 또한 탄수화물의 박테리아 발효의 부산물이다.
아세트산나트륨은 비-독성이고, 경구 및 비경구 사용을 위한 약물 제제에서 허용된다. 아세트산의 살박테리아 효과는 널리 공지되어 있다. 이는 문제가 되는 그람-음성 박테리아, 예컨대 피. 불가리스(P. vulgaris), 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 및 에이. 바우만니이(A. Baumannii) 등에 대해 입증된 효과를 갖는다. 아세트산의 미생물학적 스펙트럼은, 0.5 - 3%의 낮은 농도에서 시험한 경우에도, 넓다. 사전-형성된 바이오필름을 근절하는 아세트산의 농도는 0.10% 내지 2.5% 범위였다. 따라서, 아세트산 및 그의 금속 염은 pH의 안정화를 위해 그의 금속 염과 함께 완충제로서 작용하는 그의 능력 때문에 항미생물 제제에 사용하기에 매우 매력적인 화합물이다.
추가로, 그의 항미생물 특성 이외에도, 아세트산은 OC와 같은 산화제에 의해 추가로 산화될 수 없기 때문에 및 살아있는 조직에서 고농도인 그의 내인성 성질 때문에 매력적이다.
따라서, 다중-구획 용기는 사용 부위에서 즉각적으로 API의 활성 용액을 생성하기 위해 필요한 성분을 혼합하는 데 있어서 실용적인 사용을 가능하게 한다. 최종 항미생물 용액의 이온 강도 또는 오스몰랄농도를 고정시켜 의학적 적용의 경우에 사용 영역에서 그러한 오스몰랄농도에 적합화되도록 하기 위해, 사전-계산된 양의 NaCl이 계획된 용도에 따라 다중-구획 장치에 포함될 수 있다는 것을 주목하여야 한다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 호흡기 투여를 위한 흡입 제제이다. 따라서, 액체를 에어로졸로 전환시키는, 낭성 섬유증, 천식, COPD 및 다른 호흡기 질환 또는 장애의 치료에 일반적으로 사용되는 네뷸라이저 또는 흡입기가 본 발명에 유용하다. 흡입 투여를 위한 장치는 본 발명의 제제의 분무화를 생성하기 위해 압축 공기 또는 초음파 에너지를 사용할 수 있다. 임의의 종류의 가압 계량 용량 흡입기 (pMDI), 건조 분말 흡입기 (DPI), 저속 미스트 흡입기 (SMI)가 또한 유용하다. 임의의 정전기 또는 비-정전기 흡입기, 예를 들어 보르텍스(VORTEX) 또는 파리(Pari) 또는 심포텍(Sympotec)이 또한 본 발명을 실시하는 데 유용하다.
본원에 기재된 사전-로딩된 다중-구획 용기는 성분의 혼합 시에 안정한 광범위-스펙트럼의 항미생물 용액을 제조하고, 사실상 생체적합성 불활성 화학 종만을 남긴다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 API의 활성화는 미생물에 대해 산화된 염소와 상승작용적으로 작용하고 4 내지 8의 pH 범위에서 산도를 추가로 유지하는 활성화제, 예를 들어 아세트산을 사용하여 생성된다. 본 발명의 방법 및 그의 제제는 용액 중 산화된 염소 OC의 고유의 장기간 안정성 결여를 피하며, 이는 소독제 조성물을 수용액으로서 저장할 필요가 없기 때문이다.
본 발명의 또 다른 이점은 적용에 도움이 될 다른 화합물을 첨가하는 옵션이다. 예를 들어, 상처 치유 적용에 있어서, 피부 상에서 접촉 시간을 연장시키기 위해 제품의 점도 (μ)를 증가시킬 필요가 있다. 본 발명은 API에 의해 화학적으로 산화될 수 없는 수용성 또는 용해성 점도 증진제 (VE)의 사용에 의해, 치료 관심 영역에서 API의 접촉 시간 및 지속성의 개선된 조절을 제공함으로써 이러한 문제를 해결한다. VE는 레올로지 및 유동성이 각각의 소독 방법 및 영역에 적합화되어, 완전한 유동성을 갖는 용액 또는 겔을 생성하는 것을 보장한다. VE는, 예를 들어 수용성 겔화제, 예컨대 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 API에 의해 산화될 수 없는 임의의 다른 올리고머 또는 중합체를 포함할 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 환원-산화 염료 (본원에서 "ROD" 또는 "ROD들"로도 지칭됨)의 군으로부터 선택된 1종 이상의 염료를 포함할 수 있으며, 여기서 색 및 강도는 산화된 염소의 산화 상태에 좌우된다. 염소 원자의 산화 상태의 시각적 지표 (즉, 색에 의함)를 제공하는 것 이외에도, ROD는 그 자체의 항미생물 효과를 추가로 제공한다는 것을 주목해야 한다. 이는 신규 방식으로 제제 중 성분들 사이의 상승 작용을 증진시킨다. ROD는 API인 산화된 염소의 산화 활성을 모니터링하기에 충분한 기간 동안 그의 색을 유지할 수 있고, 제제가 적용된 영역의 시각적 지표를 추가로 제공할 수 있다.
본 발명의 추가의 이점, 뿐만 아니라 추가의 본 발명의 특색은 이하에 제공된 본 발명의 설명으로부터 분명할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 산화된 염소 종 (OC)은 하기 나타낸 화학식을 갖는다:
M n+ [Cl (O) x ]n n-
여기서 M은 임의의 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 전이 금속 이온이고, n은 1-5의 정수이고, x는 1-4의 정수이다.
M = Na, n = 1, x = 1인 경우에, API-P는 고체 NaOCl이다. M = Ca, n = 2, x = 1인 경우에, API-P는 고체 Ca(OCl)2이다. M = Na, n = 1, x = 2인 경우에, API-P는 고체 NaClO2이다. M = Ca, n = 2, x = 2인 경우에, API-P는 고체 Ca(ClO2)2이다. x = 3 또는 4인 경우에, API-P는 보다 반응성인 클로레이트 및 퍼클로레이트 종을 생성한다.
하나의 비제한적 예는 도 1에 따른 캡(2)에서 차아염소산나트륨 또는 차아염소산칼슘으로부터 차아염소산의 즉각적인 생성이며, 구획(4)에서 아세트산나트륨 완충제 용액은, 임의로 색 및 점도 증진제와 함께, 구획(9)에서 5 내지 6의 pH를 갖는 즉시 사용가능한 API 차아염소산 용액을 제공한다.
또 다른 비제한적 예는, HOCl에 대해 안정하고 수용성인 API-P인 칼슘 디-하이포클로라이트 Ca(OCl)2이다. 이는 물에서 즉각적으로 용해되어, 자연에 존재하는 수산화칼슘만을 남기고, 본 발명의 2종의 활성 성분 중 하나인 HOCl을 생성하며, 이는 Cl-, 및 수소 및 산소를 함유하는 생체적합성 종으로 분해된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 WF10으로 공지된 테트라클로로-데카옥시드 (TCDO), CAS 번호 92047-76-2인 산화된 염소의 고체 전구체 또는 본원에 참조로 포함된 문헌 [Meuer et al., CA2616008]에 기재된 바와 같이 제조된 OXO-K993의 안정화된 용액이다. 이는 클로라이트 이온 ClO2 -의 알칼리 또는 알칼리 토류 염을 물 중 과량의 산소와 조합함으로써 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 이점은 건조 및 무수 품질의 고체 형태 전구체 API-P에 제약 안정성 문제가 없다는 것이고, 따라서 본 발명은 선행 기술의 주요 기술적 문제 중 하나를 해결한다.
본 발명의 한 측면은 API-P와, 카르복실산 관능기 -COOH, 술폰산 관능기 -SO3H, 인산 관능기 -PO3H 또는 붕산 관능기 -B(OH)2 (이들 각각은 제제에서 API-P의 활성화제로서 작용함)를 포함하는 분자의 조합물이다. 일반적으로, 활성화제는 화학식 R1XOn(R2)m을 가지며, 여기서 기 R1은 아미노, 아미도, 카르복실 또는 히드록시 기로 임의로 치환된, 약 1 내지 약 10개의 수소화된 탄소 원자를 포함하는 기일 수 있다. 기 X는 탄소, 인 또는 황 원자일 수 있고, n 및 m은 2 또는 3이고, R2는 양성자 (H) 또는 임의의 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 전이 금속 이온이다. 화학식에서의 치환기의 성질은 용도 및 염소 종에 따라 달라지고, 아미노 기를 포함하는 임의의 화합물, 예를 들어 암모니아, 아미노산, 예를 들어 타우린, 또는 제제의 상승작용적 잠재력을 증가시키는 치료 약물일 수 있다. 활성화제는 화학식 R1XOnR2에 의해 정의된 바와 같은 2종 이상의 화합물의 임의의 조합물 또는 혼합물일 수 있다.
바람직한 비제한적 예는 카르복실산 R3COOH이며, 여기서 R3은 H, 또는 히드록실 기로 임의로 치환된, 약 1 내지 약 24개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 포화 또는 불포화 탄화수소 쇄이다. 활성화제의 비제한적 예는 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 히푸르산, 말레산, 붕산, 황산, 인산, 붕산, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS), 2-(카르바모일메틸아미노)에탄술폰산 (ACES), 2-(카르바모일메틸아미노)에탄술폰산 (ADA), 2-(카르바모일메틸아미노)에탄술폰산 (비신), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산, PIPES) 또는 임의의 아미노산일 수 있다.
타우린은 체내에서 OC의 효과를 정상적으로 완화시키는 내인성 아미노산이고, OC와 조합되어, 그 자체로 항박테리아 특성을 갖는 ClNH-CH2CH2-SO3H와 같은 내인성 N-클로로-아미노산을 형성할 수 있기 때문에 특히 바람직하다.
아세트산은 인간에서 내인성이고, 항박테리아 특성을 갖고, 매우 낮은 독성을 갖고, 금속 염과의 혼합물로 완충제를 형성하기 때문에 바람직하며, 본 발명의 추가 설명에서 비제한적 예로서 사용된다.
본 발명의 이점은, API-P가 고체이고 대규모로 상업적으로 입수가능하기 때문에, 본 발명에 따른 고체 다성분 제품이 온도, 공기, 습도, 광, 산소 또는 다른 주위 조건에 상관없이 제약 또는 의료 장치 설정에서 안정성 문제에 의해 방해받지 않는다는 것이다.
본원에 개시된 API-P는 수용성일 수 있고, 아세트산 및/또는 그의 염과 조합되어 최종 용액에서 거의 즉각적으로 생리학적 pH 및 이온 강도에 도달할 수 있다.
계내에서 항미생물 API를 즉각적으로 생성하는 능력은 제품의 사용 용이성 및 다양성을 증가시킨다. 추가로, 성분의 포장이 필요에 따라 분리 및 조합될 수 있어, 저장 안정성 및 현장에서의 사용에 추가로 영향을 미친다.
여행, 재난 대응, 군사 인원 또는 미생물 범유행에 이상적으로 적합한 소형의 안정한 단일-사용 2 또는 3-성분 장치가 본 발명에 의해 고려된다. 추가로, 활성 항미생물제의 전구체 (때때로 본원에서 API-P로 지칭됨)를 함유하는 대형 포맷 (예를 들어, 탱크)의 설계는 농업 환경, 수산양식 산업 또는 군사 작업에서 유용하고, 보다 넓은 영역을 소독하는 데 적합하다.
점성 용액 및 겔의 제조를 위한 점도 증진제
본 발명의 일부 실시양태에서, API 이외의 성분이 포함될 수 있다. 예를 들어, 점도 증진제가 상처 치유 또는 피부 소독에 바람직하다. 바람직한 점도 증진제는 API를 산화시키지 않는 수용성 겔화제이다. 겔화제는 관심 영역, 예를 들어 피부에서 API의 장기간 지속성을 제공한다.
본 발명에 따른 겔화제의 예는 폴리아크릴산 (카르보머(CARBOMER)), 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 임의의 다른 올리고머, 중합체 또는 블록-공중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 점도 증진제는 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 술폰산 공중합체, 포스피노 폴리카르복실산 및 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 및 술폰산-술폰화 스티렌 삼원공중합체로부터 선택될 수 있다.
아크릴레이트 공중합체와 같은 중합체는 본 발명의 제제에서 약 0.01% 내지 약 5%의 농도 범위에서 잘 기능한다. 아크릴레이트 공중합체는 폴리알케닐 폴리에테르와 가교된 아크릴산의 단독중합체 및 공중합체이다. 아크릴레이트 공중합체는 다양한 그라프트 밀도로 존재한다. 하나의 예시적인 가교제는 매우 안정한 펜타에리트리톨이다. H2O2의 제제를 안정화시키는 것으로 공지된 폴리아크릴산 (PAA) 중합체가 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 OC의 중합체-안정화된 용액은 많은 맥락에서, 예를 들어 상처 치료, 무균 포장, 전자제품 제조 및 펄프와 종이 표백에서 적용된다. API는 겔 또는 점성 유체로서 제제화될 수 있으며, 이는 필요한 수준의 API와의 장기간 및 친밀한 접촉을 보장하도록 무생물이거나 또는 감염된 상피 점막 또는 피부 표면을 대표하는 표적 표면에 적용될 수 있다. API의 비-점성 제제는 또한 환경적 소독을 달성하기 위해 또는 호흡기 질환의 치료를 위한 흡입 목적을 위해 미스트로서 한정된 공간 내의 공기 중에 분산될 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴산 카르보머의 농도는 0.01 - 0.1% 농도에서 증가하는 점도를 갖는다. 원하는 경우에, 이는 0.1 - 1% 농도 범위에서 보통의 겔을 형성한다.
지시제로서의 항박테리아 산화환원-민감성 항박테리아 염료
본 발명의 제제에 대한 추가의 첨가제는 환원-산화 염료 (이하 ROD)이며, 여기서 염료의 색 및 강도는 OC의 산화 상태에 좌우된다. 보다 더 유리하게는, ROD 자체가 항미생물 효과를 가지며, 본원에 제시된 제제의 구성성분 사이의 항미생물 상승작용을 증가시킨다. ROD의 표준 반-전지 전위가 OC보다 더 낮은 양의 값을 갖는 경우에, OC가 활성인 한 제제의 색이 유지될 것이다. 이로써, 색은 제제가 적용된 영역 및 활성 OC가 존재하는 영역에서 시각적 단서를 제공한다. 이는, 예를 들어 본 발명에 따른 제제가, 큰 무리의 소가 유방염에 대해 치료될 필요가 있는 유방염의 치료에 사용되는 경우에 특히 유리하며; 본 발명에 따른 착색 제제는 어느 동물이 치료되었는지를 가시화하였다. 추가로, OC의 산화력이 사라질 때 색이 나타나는 반대 유형의 지시제를 사용하는 것이 또한 유용하다.
본 발명에 유용한 적합한 염료의 비제한적 예는 OC의 존재 하에 가시적인 pH-비의존성 염료이다. 바람직한 예는 N-페닐안트라닐산 (보라색-적색), N-에톡시크리소이딘 (청록색), o-디아니시딘 (적색), 소듐 디페닐아민 술포네이트 (적색-보라색), 디페닐벤지딘 (보라색), 디페닐아민 (보라색) 및 비올로겐이며, 이는 OC의 존재 하에 무색이지만 OC의 부재 하에 진청색이다.
활성 OC의 존재 하에 진청색이지만 OD의 부재 하에 무색인 pH-의존성 염료의 예는 소듐 2,6-디브로모페놀-인도페놀 또는 소듐 2,6-디클로로페놀-인도페놀, 소듐 o-크레졸 인도페놀, 티오닌 (동의어 라우스 바이올렛), 메틸렌 블루, 겐티안 바이올렛, 인디고테트라술폰산, 인디고 카르민 (동의어 인디고-디술폰산), 인디고모노 술폰산이다. OC의 존재 하에 적색 또는 적색-보라색인 염료의 예는 페노사프라닌, 사프라닌 T, 뉴트럴 레드 및 디알킬-p-페닐렌디아민 (SPD, 적색 보라색)이다.
이들 염료 중 다수, 즉 메틸렌 블루 (MB) 및 겐티안 바이올렛 (GV)은 그 자체로 항박테리아 효과를 갖고, 그의 조합은, 예를 들어 문헌 [Edwards in Advances in Wound Care (2016), 5, pp 11-19]에 기재된 바와 같이, 폴리비닐 알콜 또는 폴리우레탄과 같은 중합체와 조합되어 상처 드레싱에서 발포체로 항박테리아 염료로서 사용되어 왔다.
본 발명에 유용한, 특히 유용한 부류의 염료는 대사적, 생태학적 및 진화적 유의성을 갖는 착색된 산화환원-활성의 질소함유 방향족 화합물인 미생물 페나진이다.
추가의 부류의 페나진은 그의 모 페나진보다 훨씬 더 강한 항미생물 특성을 갖는 비스-N-옥시드 페나진을 포함한다. 이들 화합물의 대부분은 박테리아에 의해 생산된 천연 화합물이고, 헤테로-방향족 N-산화된 화합물이며, 이하 HANOX로 나타낸다. 산화환원 염료인 ROD 이외에도, HANOX 화합물은 그의 색이 OC의 산화 상태에 좌우되기 때문에 본 발명에서 유용하다.
추가로, 특정 페나진 유도체. 특히, 이들은 매우 다양한 박테리아, 효모 및 진균, 예컨대 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테리움 피오게네스(Corynebacterium pyogenes), 모락셀라 보비스(Moraxella bovis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 미크로스포룸 카니스(Microsporum canis)에 대해 높은 활성을 입증하였다. 따라서, 페나진 유도체는 농업에서 미생물 기원의 동물 질환의 치료에 특히 유용하다.
이들 유도체에 의한 놀라운 결과는 사용 조건 하에 조직에 대한 유해 효과의 결여로, 이들이 바람직하게는 조성물의 0.05 중량 퍼센트 내지 1.0 중량 퍼센트 범위의 양으로 사용되는 국소 적용에 특히 적합하다는 것이다.
이들은 국소 적용, 예를 들어 미분된 분말 및 과립상 물질을 포함한 고체 또는 겔 제제, 및 용액, 현탁액, 농축물, 팅크제, 슬러리 및 에어로졸, 크림, 겔, 젤리, 연고 및 페이스트를 포함한 액체 제제에서 특히 가치있다.
메틸렌 블루는 본 발명에 유용한 또 다른 특히 바람직한 염료이며, 이는 FDA가 그것을 약물 제제에서 부형제로서 승인하였고, 그것이 항박테리아 특성을 가지며, 그의 치료제로서의 효과가 광역학 요법을 사용하여 증진될 수 있기 때문이다.
본 발명에 유용한 다중-구획 장치
도 1은 본 발명에 따른 제제의 즉각적인 생성을 위한 예시적인 다중-구획 장치를 보여주는 개략도이다.
구획의 수를 포함한 장치의 설계는 사용 사양에 맞게 적합화될 수 있다. 장치(8)는 건조 형태(2)의 API-P로 나타내어지는 API의 고체 전구체를 함유하는, 제1 구획과 회합된 스크류 캡(1)으로 이루어진다. 스크류 캡(1)은 밀봉부 또는 포트(3)를 한 방향으로 돌려 API-P를 제2 구획(4)에 넣음으로써 밀봉부 또는 포트를 개방하는 능력을 가지며, 제2 구획은 활성화제의 수용액을 포함하고 또한 사전-계산된 양의 염화나트륨을 포함하여 용액의 최종 오스몰랄농도가 체액과 등삼투성이 되게 한다. 목적하는 최종 pH를 얻기 위해, 물 중 활성화제 및 임의로 사전-계산된 양의 그의 금속 또는 아미노산 염은 임의로 구획(4), (5) 또는 (10) 내로 사전-로딩될 수 있다. (4)에서의 보다 작은 입자는 API-P가 활성화제 용액 중에 신속하게 용해되어 API를 생성한다는 것을 예시한다. 제3 구획(5)은 각각의 장치의 기술적 용도에 따라 산화환원 염료 (ROD)의 용액을 함유하기 위한 것으로, 임의적이다. 구획(4) 및 (5)은 벽(6)에 의해 분리된다. 구획(4) 및 (5)은 또한 파괴가능한 격막 또는 벽(7)에 의해 구획(10)으로부터 분리된다. 임의로, 구획(4) 및 (5)과 동일한 수준의 제4 구획은 아미노산, 예를 들어 API의 안정화를 위한 필수 또는 비필수 아미노산 또는 타우린을 함유할 수 있다. 단순성을 위해, 본 예시에서, 제4 구획(10)은 임의로 순수한 물, 활성화제 용액일 수 있다. 스크류 캡(2)을 반대 방향으로 돌리는 경우에, 즉시 사용가능한 소독제 용액이 장치로부터 방출되고 소독을 위한 관심 영역에 적용될 수 있다. 본 발명의 한 측면은 산화된 염소 종인, 스크류 캡(2) 내의 고체 전구체 API-P이다. 다중-구획 장치로부터 생성된 용액은 결국 수용액 중 점도 증진제 (VE)의 용액을 제조하는 데 사용될 수 있다. 병, 백, 시린지, 흡입기, 손 소독 장치, 분무 병, 플라스크 또는 탱크를 포함한, 전구체 성분 및 첨가제의 혼합을 허용하는 기능을 하는 임의의 다중-챔버 장치가 본 발명의 문맥에서 유용하다. 상기 언급된 바와 같이, 복잡한 혼합 절차 없이 침상에서 또는 현장에서 용이하게 활성화될 수 있고 주위 온도에서 저장될 수 있는 장치가 바람직하다.
본 발명에 따른 다중-구획 장치는 폐쇄 시스템이고, 혼합 오류를 제거하도록, 환자 및 인원에 대한 목적하지 않은 노출을 피하도록 설계될 수 있으며, 조인트 커미션(Joint Commission) 및 USO 797 가이드라인을 충족시킨다.
본 발명에 유용한 설계의 비제한적 예는 비 브라운(B Braun)으로부터의 듀플렉스(Duplex) 용기, 크레덴스 컴패니언 세이프티 시린지 시스템(Credence Companion Safety Syringe System), 듀얼-믹스(Dual-Mix) 다중-챔버 백 또는 이지렉(Easyrec) 키트이며, 이는 API의 즉시 사용가능한 제제를 생성하기 위해 1종 이상의 유체 상 내로 혼합시키기 위한 고체 또는 고체의 혼합물을 방출하는 스크류 캡을 포함한다.
광역학 요법을 사용한 항미생물 목적을 위한 본 발명의 용도
항미생물 광역학 요법 (aPDT)을 사용한 박테리아 제거는 임플란트주위염 치료에서 대안적 치료 양식을 사용하여 밝혀졌다. 따라서, OC, 아세트산 또는 그의 염, 임의로 점도 증진제를 포함하는 본 발명의 제제의 또 다른 바람직한 실시양태는, 예를 들어 포유동물에서 상처 치유 또는 박테리아 감염을 개선시키기 위한 광역학 요법의 사용을 위한 메틸렌 블루로 예시되는 ROD의 포함이다. 이 경우에, 본 발명에 따른 제품의 투여 부위는 염료의 광역학 효과의 생성에 적합화된 파장을 갖는 광으로 조사될 수 있다.
문헌 [Photodiagnosis Photodyn. Ther. (2018), 23, pp 347-352]에서, 소우자(Souza) 등은 엔테로코쿠스 파에칼리스(enterococcus faecalis)로 감염된 근관에서 광역학 요법과 연관된 왕복 기기 및 하이포클로라이트 용액의 항미생물 활성을 보여주기 위해 광역학 요법을 사용하였다. 그러나, 시험 용액에는 항박테리아 염료가 없었다. 이들 기술은 본 발명에 참조로 포함된다.
API 제조를 위한 단계적 방법
본 발명은 활성화제, 예를 들어 아세트산 또는 그의 염과 조합된 염소화된 종의 고체 전구체 API-P의 조성물 및 사용 방법 및 그의 사용 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 하기 6 단계를 포함한다:
1. 하기로 나타내어지는 화학식 M n+ [Cl (O) x ]n n-을 가지며, 여기서 M은 임의의 알칼리 금속, 알칼리 토금속 또는 전이 금속 이온일 수 있고, 여기서 n은 1-5의 정수이고, x는 1-4의 정수이고, y는 1-2의 정수인 API-P의 사전-계산된 양. 0.01 - 1000 ppm 범위, 바람직하게는 0.1 - 100 ppm 범위의 최종 용액 중 OC 형태의 API의 농도를 생성하는 고체 상태 (API-P)를 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩한다. API-P를 0.1 - 500 mOsm 범위의 최종 오스몰랄농도를 생성하기 위한 사전계산된 양의 NaCl 및 임의로 임의의 다른 안정화 고체와 혼합한다.
2. 화학식 R1XOn(R2)m를 가지며, 바람직하게는 아세트산이고, 임의로 그의 금속 또는 암모늄 염과의 혼합물인 활성화제의 사전계산된 양. 활성화제를 제약상 허용되는 희석제, 아주반트 또는 담체 중에 용해시켜, 0.05 - 10% 범위, 바람직하게는 0.08 내지 0.5% 범위, 보다 더 바람직하게는 0.10 내지 0.2% 범위의 활성화제의 농도를 생성한다. API-P를 NaCl과 사전혼합하지 않는 경우에, 단계 2에서의 용액은 그 단계로부터의 양의 NaCl을 포함할 수 있으며, 어느 방식으로든 150 mM NaCl에 상응하는 0.1 - 500 mOsm 범위, 바람직하게는 약 300 mOsm의 최종 오스몰랄농도를 생성한다. 용액의 분취물을 다중-구획 장치의 제2 구획 내로 로딩한다.
3. 본 발명에 따른 주요 제품을 생성하기 위해, 구획(1) 및 (2)을, 포트를 개방하거나 또는 밀봉부인 제1 및 제2 구획 사이의 막 장벽을 파괴함으로써 혼합하여 구획 내의 내용물을 혼합하고, 이어서 주위 압착 또는 진탕에 의해 소독제 용액을 생성한다. 생성된 용액은 사용 전에 다중-구획 장치 상의 캡을 통해 취출될 수 있다. 용액은 등장성이고, 4 내지 9, 바람직하게는 5 내지 6 범위의 pH를 가지며, 일반적으로 항미생물 목적을 위해, 예를 들어 흡입 요법을 위해, 예를 들어 포유동물의 상기도에서 바이러스 감염과 싸우기 위한 천식 흡입기 또는 네뷸라이저를 사용하는 흡입 요법을 위해 사용된다.
4. 단계 4에서의 색 지시제가 치료 절차에서, 예를 들어 유방염의 치료에서 또는 API의 산화 활성의 지표에 대해 정보를 추가할 수 있는 적용의 경우, API의 산화 상태에 따라 달라지는 색을 갖는 염료 (ROD)를, 0.01 - 1000 ppm 농도 범위의 염료 농도를 생성하기 위한 사전계산된 양으로, 다중-구획 장치의 임의적인 구획 내로 임의로 로딩한다.
5. 의도된 용도에 따라, API의 안정화제로서의 사전계산된 양의 아미노산, 바람직하게는 API와 동일한 농도의 타우린을 다중-구획 장치의 임의적인 구획 내로 임의로 로딩한다. 단계 4는 생물학적 표면에 대한 산화성 스트레스를 감소시키기 위해 수행된다.
6. 의도된 용도에 따라, API에 의해 산화될 수 없는 일정량의 수용성 점도 증진제 (VE)를, 0.01 - 25% 농도 범위, 바람직하게는 0.1 - 10% 범위, 보다 더 바람직하게는 0.2 - 1% 범위로, 단계 1-3의 선택된 순서로부터 생성된 용액과 혼합하고, 임의로 단계 4-5 중 임의의 단계와 조합한다. 0.01 - 0.1%의 VE 농도는 점성이지만 유체인 용액을 생성하며, 0.3 - 1%는 겔을 생성한다. 피부 또는 상처 적용을 위해, VE를 포함하는 단계 3에서의 제3 구획을 혼합 절차에 포함시켜 점성 또는 겔-형성된 제품을 제조할 수 있다.
농업에서의 본 발명의 용도
농업에서, 특히 동물 농장에서, 박테리아, 바이러스 및 진균에 의해 유발된 많은 종류의 감염성 질환은 농장의 일상 작업에 영향을 미치고, 시설의 운용 비용에 영향을 미친다. 이들 상황에서, 본 발명에 따라 설계된 제제는 치료적으로 또는 예방적으로 작용하고, 피부 감염에 특히 유용하다.
하나의 중요한 예는 소에서의 유방염이며, 이는 미국 낙농 산업에서 매년 약 1.7 - 2십억 USD의 비용이 든다. 장기간 항생제를 받은 소로부터의 우유는 잔류 약물이 시스템에 남아있을 때까지는 시판가능하지 않기 때문에, 효과적이고 환경 친화적인 유방염 치료는 어려운 것으로 입증되었다. 소의 유방 및 유두에서의 감염은 동물의 주 혈류로부터 멀기 때문에, 어떠한 백신도 효과적이지 않다. 치료를 받고 있는 소를 표시하기 위해, 낙농업자는 테이프 스트립을 적용하여 치료되는 소를 알리고 표시한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 측면은 OC, 아세트산 또는 그의 염, 점도 증진제 VE 및 메틸렌 블루로 예시되는 ROD를 포함하는 겔 또는 점성 용액을 사용한 유방염의 치료이다. 착색된 겔은 유방 및 유두의 영역 상에 머무르고, 아세트산은 유두의 피부 내로 침투하는 능력을 가지며, 색은 테이프 스트립을 사용할 필요가 없게 한다. 추가적으로, 적용된 겔은 겔의 치료 효과를 증가시키기 위해 적합한 파장을 갖는 광을 사용하여 조사될 수 있다. 이 경우에, 단계 1-4 및 단계 6을 수행하여 본 발명의 사용 제제를 수득한다.
수산양식에서의 본 발명의 용도
수질은 어류, 굴, 프론 및 새우로 예시되는 수생 동물의 성공적인 양식을 위한 전제조건이다. 개방 수계는 종종 바이러스, 박테리아, 이, 원충, 진균 병원체, 조류 및 기생충과 같은 유기체를 가져온다. 식품 제조에 매력적인 수생 종의 높은 사멸률로 이어지는 통상의 바이러스 감염은 코이 헤르페스 바이러스 질환, 췌장 질환 (PD) 및 감염성 연어 빈혈 (ISA)이다. 적절한 수질 또는 충분한 양의 순수한 물은 가장 자주 이용가능하지 않다. 선행 기술의 사육 설비는 종종 이들 감염성 종이 사육 종에 접근하여 영향을 미치는 것을 방해하는 수단을 갖지 않는다. 추가로, 감염되었을 때, 이들 질환에 대한 효율적인 요법을 제공하는 효율적인 치유법도 없다.
본 발명에 따른 산화된 염소 종 OC의 바람직한 실시양태는 모든 이들 감염 및 유해 유기체 및 세포의 효과적인 치료이다. 본 발명의 OC 제제는 이들 수계 병원체를 방제하는 데 매우 효과적이다. 예를 들어, 이산화염소는 선행 기술에서 규정된 문제를 해결하는 데 효과적인 광범위-스펙트럼의 살생물제이다. 본 발명의 제제는 심지어 특수 탱크에서 사용되어, 예를 들어 사육 연어를 어류 아가미 또는 사육 종의 임의의 다른 부분에 해를 끼치지 않으면서 반복적으로 치료함과 동시에 질환을 유발하는 미생물에 대한 파괴적 효과를 갖는다. 이들 적용에서, API-P가 NaOClO2 또는 Ca(OClO2)2인 제제가 구획(1) 내로 로딩되고, 단계 1-3에서 사용된 사전계산된 양의 아세트산과 혼합된다.
본 발명의 항바이러스 용도
본원에 개시된 방법은 오염된 표면, 장비, 예를 들어 의료 장비, 가구 표면, 문손잡이, 장치, 의류 또는 인원의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 제제는 겔, 수용액으로서 또는 API의 미스트화 또는 기화에 의해 표면 또는 국한된 공간으로 적용될 수 있다. 제제가 필요에 따라 제조된다는 사실은 고효력 항미생물제로 저장 분해에 대한 우려 없이 영역의 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 활성제를 틈새 및 미세환경에, 심지어 감염성 조직 또는 체액에 의해 오염된 것으로 의심되는 인원에 분산시키는 것을 고려한다. 이들 제제의 기화는 내성 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염에 대한 유익한 치료적 또는 예방적 영향을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 제제는 실질적인 독성 위험 없이 적용될 수 있다. 바람직한 실시양태는 상기도에서의 바이러스 감염의 치료이다. 따라서, 본 발명의 시스템 및 방법은 호흡기도에서 바이러스 감염을 치료하는 수단으로서 산화된 염소 OC를 제공한다. 본 발명의 조성물은 SARS, MERS 및 SARS CoV-2 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 감염을 치료하는 데 유용하다. 이는 본 발명에 이르러 본 발명에 따른 다중-구획 장치와 조합된 본 발명의 API의 전구체를 통해 처음으로 용이해졌으며, 이는 주위 조건에서 저장된 용액의 활성의 결여를 평가할 필요가 없기 때문이다.
특히, OC의 흡입가능한 차아염소산 제제, 활성화제, 예를 들어 아세트산, 최종 용액의 레올로지를 조절하는 부형제, 오스몰랄농도-조절제, 예를 들어 염화나트륨. 이러한 본 발명의 제제는 본 발명에 이르러 부위에서 제조될 수 있으며, 이와 함께 네뷸라이저, 예컨대 소프트 미스트 흡입기, 제트 네뷸라이저, 초음파 네뷸라이저 및 진동 메쉬 네뷸라이저를 통한 전달 방법이 사용될 수 있다. 사용 시에, 흡입기 및 네뷸라이저는 흡입을 통한 전달을 위해 본 발명의 조성물을 에어로졸화한다.
에어로졸화를 위한 제제는 건조 분말 형태, 용액 또는 현탁액 형태로 제공될 수 있다. 미세 액적, 스프레이 및 에어로졸은 비강내 또는 폐내 펌프 분배기 또는 압착 병에 의해 전달될 수 있다. 조성물은 또한 흡입기, 예컨대 계량 용량 흡입기 또는 건조 분말 흡입기를 통해 흡입될 수 있다. 조성물은 또한 네뷸라이저, 예컨대 초음파 네뷸라이저를 통해 흡입되어, OC 및 아세트산의 조성물을 흡입가능한 제제를 통해 호흡기도에 직접 제공할 수 있다. 이는 바이러스뿐만 아니라 다른 미생물에 의해 유발되는 호흡기계의 감염을 예방 및 치료한다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 제제는 바이러스 감염의 예방 및 치료에 안전하고 효과적이다.
본 발명의 조성물은 또한 호흡기 점막으로의 전달을 용이하게 하기 위해 제약상 허용되는 담체, 예컨대 희석제를 포함할 수 있다. 담체는 수성 담체, 예컨대 염수일 수 있다. 조성물은 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 갖는, 등장성일 수 있다. 적합한 비-독성 제약상 허용되는 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 다양한 담체가 조성물의 상이한 제제에, 예를 들어 점적제로서 또는 스프레이, 현탁액 또는 폐 전달을 위한 또 다른 형태로서 사용되든 간에, 특히 적합할 수 있다.
흡입을 위한 제제는 건조 분말 형태, 용액 또는 현탁액 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 점적제, 액적 및 스프레이를 투여하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 장치에 의해 전달될 수 있다. 조성물은 점적기, 피펫 또는 분배기에 의해 전달될 수 있다. 미세 액적, 스프레이 및 에어로졸은 비강내 또는 폐내 펌프 분배기 또는 압착 병에 의해 전달될 수 있다.
비강내 전달은 비강 스프레이 장치를 통해 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 제제는 비강 스프레이로서 설계될 수 있다. 비강 스프레이는 코로 취입되고, 호흡기도로 전달된다.
소프트 미스트 흡입기는 액체 용기를 가압하기 위해 사용자-작동에 의해 스프링에 저장된 기계적 에너지를 사용하여, 함유된-액체가 소프트 미스트의 형태로 흡입을 위해 노즐로부터 분무되도록 한다. 소프트 미스트 흡입기는 작동을 위해 기체 추진제 또는 전력에 의존하지 않는다. 소프트 미스트 흡입기에서의 평균 액적 크기는 약 5.8 마이크로미터이다.
제트 네뷸라이저가 가장 통상적으로 사용되고, 아토마이저로 지칭될 수 있다. 제트 네뷸라이저는 압축 기체 (예를 들어, 공기 또는 산소)를 사용하여, 고속으로 그를 통해 방출 시 액체 의약을 에어로졸화한다. 이어서 생성된 치료 용액 또는 현탁액의 에어로졸화된 액적은 치료를 위해 사용자에 의해 흡입된다. 압축 기체는 저장 용기에서 사전-압축될 수 있거나 또는 네뷸라이저 내의 압축기에 의해 필요에 따라 압축될 수 있다.
초음파 네뷸라이저는 전자 진동자에 의존하여 고주파 초음파를 생성하며, 이는 용액의 치료 현탁액의 저장소를 통해 지시될 때, 흡입용 의약을 에어로졸화한다.
진동 메쉬 네뷸라이저는 액체 저장소의 상단에 수천개의 구멍을 갖는 막의 진동을 사용하여 흡입용 미세-액적 미스트를 에어로졸화한다. 진동 메쉬 네뷸라이저는 초음파 네뷸라이저의 결점 중 일부를 피하여, 감소된 치료 시간 및 네뷸라이징되는 액체의 보다 적은 가열과 함께 보다 효율적인 에어로졸화를 제공한다.
바이러스 감염의 치료는 아세트산 및 차아염소산의 상승작용적 조성물을 사용하여 달성된다. 아세트산 성분은 조직으로의 침투에 특히 효과적인 반면, 차아염소산은 조직의 외부 표면 상의 감염의 치료에 특히 효과적이다. 상기 기재된 바와 같이, 이들 조성물은 호흡기도를 치료하고 호흡기 감염을 예방하는 데 효과적이다.
개시된 조성물은 차아염소산 및 아세트산의 농도를 NaCl에 의해 균형맞추는 것이 바이러스의 안전한 치료를 가능하게 하기 때문에 특히 효과적이다. 정확한 균형은 제제, 치료 부위 및 심지어 목적하는 표면 침투량에 좌우된다. 차아염소산은 약 5 ppm 내지 약 1000 ppm 또는 그 초과로 존재할 수 있다. 상이한 용도, 상이한 전달 방법 및 조직 유형은 더 높거나 더 낮은 농도를 요구할 수 있다. 아세트산은 약 0.1% 내지 약 5.0% 또는 그 초과, 바람직하게는 약 1.0%로 존재할 수 있다. 두 성분의 균형을 맞춤으로써, 조성물은 그것이 적용되는 조직의 표면 및 표면 아래를 치료하는 이중 효과를 가질 수 있다.
OC가 차아염소산 HOCl인 경우에, 약 15-60 ppm의 농도의 OC를 갖는 본 발명의 조성물은 통상적으로 감염된 폐의 치료에 충분하다. OC가 이산화염소 OCl2인 경우에, 통상적으로 0.1-5 ppm의 농도이면 충분하다.
일부 경우에, 바이러스를 완전히 파괴하거나 또는 바이러스가 호흡기도에 들어가는 것을 방지하기 위해, 조성물은 수초 내지 수분 내지 1시간 이상 범위의 장기간 동안 호흡기도와 접촉되어야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 조성물은 감염 부위와의 더 긴 접촉 시간을 가능하게 하는 겔 형태이다.
공지된 항바이러스 치료와 조합된 조성물의 사용은 조성물의 효능을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 항바이러스 물질의 1회 이상의 용량의 투여 (본 발명의 조성물과 동시에 또는 순차적으로)를 추가로 포함한다. 이들은 아시클로비르, 아데포비르, 아다만틴, 보세프레비르, 브리부딘, 시도포비르, 엠트리시타빈, 엔테카비르, 팜시클로비르, 포미비르센, 포스카르넷, 간시클로비르, 라미부딘, 펜시클로비르, 텔라프레비르, 텔비부딘, 테노포비르, 발라시클로비르, 발간시클로비르, 비다라빈, m2 억제제, 뉴라미니다제 억제제, 인터페론, 리바비린, 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, 비-구조 단백질 5a (ns5a) 억제제, 케모카인 수용체 길항제, 인테그라제 가닥 전달 억제제, 프로테아제 억제제 및 퓨린 뉴클레오시드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 또한 공지된 항미생물 치료와 조합하여 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시프로플록사신, 베타-락탐 항생제, 예컨대 암피실린 또는 카르바페넴, 아지트로마이신, 세팔로스포린, 독시시클린, 푸시드산, 겐타마이신, 리네졸리드, 레보플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 리팜핀, 테트라시클린, 토브라마이신, 반코마이신, 아미카신, 데프타지딤, 세페핌, 트리메토프림/술파메톡사졸, 피페라실린/타조박탐, 아즈트레아남, 메로페넴, 콜리스틴 또는 클로람페니콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항생제 물질의 1회 이상의 용량의 투여 (본 발명의 조성물과 동시에 또는 순차적으로)를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 아미노글리코시드, 카르바세펨, 카르바페넴, 제1 세대 세팔로스포린, 제2 세대 세팔로스포린, 제3 세대 세팔로스포린, 제4 세대 세팔로스포린, 글리코펩티드, 마크롤리드, 모노박탐, 페니실린, 폴리펩티드, 퀴놀론, 술폰아미드, 테트라시클린, 린코사미드 및 옥사졸리디논을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항생제 부류로부터의 항생제 물질의 1회 이상의 용량의 투여를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세르트랄린, 라세미 및 입체이성질체 형태의 티오리다진, 벤조일 퍼옥시드, 타우롤리딘 및 헥시티딘을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비항생제 항미생물 물질의 투여를 포함한다.
조성물의 투여 요법은 조성물에 대한 노출의 양, 빈도 및 지속기간을 포함할 수 있다. 투여 요법은 감염의 중증도 또는 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위해 처방된 요법에 따라 달라질 수 있다.
조성물은 단일 1일 용량으로 또는 다중 용량, 예를 들어 1일에 2, 3, 4회 또는 그 초과의 용량으로 투여될 수 있다. 조성물을 받는 대상체는 수시간 또는 수분의 기간 동안 조성물에 노출될 수 있다. 노출 지속기간은 감염의 빈도, 양 또는 심지어 중증도에 좌우될 수 있다.
고체 전구체로부터 본 발명의 용액 중에 형성된 API의 총 1일 양은 OC의 성질에 따라 0.01 - 1000 mg 범위일 수 있다. 실제 투여량은 투여되는 구체적 조성물, 투여 방식 및 관련 기술분야에 공지된 다른 인자에 좌우될 수 있다.
조성물은 호흡기도의 임의의 구성원, 예컨대 호흡기 상피, 비강, 비강 상피, 인두, 식도, 후두, 후두개, 기관, 용골, 기관지, 세기관지 또는 폐에 투여될 수 있다. 조성물을 호흡기도에 투여하는 것은 바이러스에 의해 전염되는 임의의 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다.
특정의 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 전체 방, 시설, 의료 장치 및 수술 기기를 소독하는 데 사용될 수 있다. 의료 장치의 공급물은 종종 처음에 멸균되지만, 추가의 또는 후속의 세정 및 소독 또는 멸균이 요구될 수 있다. 특히, 임의의 공지된 기술을 사용하여 재사용하기 전에 재사용가능한 의료 장치를 멸균 또는 소독하는 것이 특히 중요하다. 조성물은 다음을 사용하여 의료 장치에 적용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은, 이를 장치의 표면 상에 닦거나 펴바름으로써, 에어로졸 또는 미스트 형태의 조성물을 장치 상에 분무함으로써, 소정 부피의 조성물을 함유하는 용기에 장치를 침지시킴으로써, 또는 예컨대 꼭지로부터의 조성물의 흐름에 장치를 둠으로써 적용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 의료 장치 및 수술 기기를 또한 조성물 중에 잠기게 하여 저장하고 사용 시점에 꺼낼 수 있다.
개시된 조성물 중 일부는 2% 이상의 아세트산을 함유하고, OC와 조합되었을 때 피부 및 다른 조직을 치료하는 데 안전하고 효과적인 것으로 입증되었다. 이들 조성물 내의 OC는 아세트산의 조정 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이는 조성물이 조직에 해를 끼치지 않으면서 아세트산의 소독 특성을 이용하도록 한다.
COVID-19 치료 및 다른 호흡기 감염성 질환을 위한 본 발명의 용도
이전에 기재된 바와 같이, 한 측면에서, 본 발명은 SARS-CoV-2를 포함한 호흡기 감염을 치료하고 그의 확산을 예방하는 안전하고 효과적인 수단을 제공하도록 개발된 소독제 조성물에 관한 것이다.
SARS 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 조성물은 차아염소산-기재의 네뷸라이징되는 광범위-스펙트럼의 항바이러스 및 항박테리아 흡입 용액을 포함한다. 보다 구체적으로, 제제는 아세트산 (대략 0.25%)으로 안정화된 차아염소산 (HOCl) (25 ppm 내지 200 ppm)을 포함하여, 양성 항미생물 효과를 갖는 지속가능한 농도의 HOCl을 생성한다. 아세트산의 첨가는 HOCl 안정성을 증가시키고, 따라서 보관-수명이 연장된 치료의 개발을 가능하게 한다. 추가로, 조성물은 증가된 pH 5.5 및 등장성으로 제제화되어 호흡기도 내에서의 내약성을 증가시킨다.
본 발명의 조성물은 특히 외피보유 바이러스에 대해 독특한 살바이러스 특성을 갖고, 우수한 항바이러스 활성을 제공한다. 따라서, 이러한 조성물은, 예를 들어 COVID-19의 치료 및 예방에 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, SARS-CoV-2 및 많은 다른 바이러스는 호흡기계의 인간 세포 내로의 "도어 오프너"로 지칭되는 표면 단백질 (즉, 스파이크 단백질)을 갖는다. 이들 스파이크 단백질은 HOCl에 의한 산화에 취약한 -SH 기를 포함한다. 낮은 농도의 HOCl도 정상 조직 및 세포내 효소에는 무해하면서, (예를 들어, 바이러스 스파이크 단백질 상의) 세포외 -SH 기를 산화시킬 가능성이 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물의 항바이러스 효과는 최초 노출 시, 감염 동안 및 비리온이 세포내에 있고 후속적으로 인간 기도 세포에 의해 방출될 때, 호흡기도에서 바이러스 입자를 파괴할 수 있다. 따라서, 특히 외피보유 바이러스에 대한 본 발명의 조성물의 독특한 살바이러스 특성은 조성물이 코로나바이러스의 확산을 예방하기 위한 진행중인 노력에 있어서 강력한 잠재적 도구가 되게 한다. 이러한 조성물은 전세계에 걸친 코로나바이러스의 병독성을 고려하여, 특히 전례없는 필요의 시점에서, 광범위한 COVID-19 환자 집단 중에서 질환의 지속기간 및 증상의 중증도를 감소시킬 수 있다.
표 1 (하기)은 25 ppm - 200 ppm HOCl + 0.25% 아세트산으로 이루어진 본 발명의 조성물의 성분의 목록을 제공한다.
불활성 기체: 아르곤 (100%)
*차아염소산나트륨 용액은 또 다른 GMP 생산자의 것으로 변경될 수 있다.
본 발명의 바람직한 조성물에서의 활성 성분은 차아염소산 (HOCl)이다. 이 활성 성분은 차아염소산나트륨으로부터 유래되며, 알칼리성 pH에서 기체상 Cl2와 물의 반응으로부터 수용액으로서 생성된다. 3% NaOCl이 생성되고, 이를 최대 200 ppm (0.01% w/w) HOCl에 도달하도록 최종 IS에 첨가한다. 조성물의 다른 성분은 하기를 포함한다: 수산화나트륨, Ph.Eur./USP-NF 등급, 0.1M 용액, 요구되는 pH (5.5)가 되도록 첨가됨; pH 안정화제 아세트산, Ph.Eur./USP-NF 등급 빙초산, 0.25%; 오스몰농도 조정제 염화나트륨, Ph.Eur./USP-NF 등급, 등장성 제제 (303mOsm)에 도달하도록 첨가됨; 및 역삼투를 통해 정제되고 이온 교환 공정에 의해 또는 Ph.Eur./USP-NF 연구논문에 따라 탈이온화된 물인 정제수.
조성물에 대한 바람직한 임상 투여량은 5 mL의 25 - 100 ppm 차아염소산이다. 최종 제품은 또한 0.25% 아세트산 완충제를 함유한다. 이에 따라, 용액은 99.1% 초과의 HOCl 및 0.9% 미만의 OCl-을 함유한다. HOCl은 IS에서 활성 물질이고, 등가 농도의 OCl-과 비교하여 소독제로서 80배 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, HOCl은 IS에서 API이고 최종 제품에서 미생물의 성장을 억제하기 위해 항미생물제로서 작용하는 이중 효과를 제공한다. 조성물은 플라스틱 PET 바이알/병에 제공될 수 있다. 환자에게 투여하기 전에, 조성물은 네뷸라이저/흡입 장치 저장소로 전달된다. 이 전달은 클리닉에서 수행된다. 네뷸라이저로 전달한 후에, 용액은 액체 에어로졸 전달을 통해 환자에게 즉시 (1-2시간 이내에) 투여된다. 환자는 5 mL의 네뷸라이징된 조성물을 받아야 한다.
바이러스 투여를 위한 조성물은 전형적으로 단일-용량 투여이고, 예를 들어 파리 보이(PARI BOY)를 사용하여 네뷸라이징에 의해 호흡기도로 전달된다. 네뷸라이저 파리 보이(PARI BOY) 클래식 흡입 시스템은 파리 보이 클래식 압축기, 파리 LC 스프린트(PARI LC SPRINT) 네뷸라이저를 함유한다. 하기도 및 상기도에서 시험 용액의 적절한 침착을 얻기 위해, 네뷸라이저에 파리 스마트마스크(PARI SMARTMASK)가 장착될 것이다. 다른 네뷸라이저 및 흡입기가 사용될 수 있다는 것을 주목하여야 한다.
HOCl은 신체 자신의 면역 세포, 즉 호중구 및 단핵구/대식세포에 의해 생산된다. 이는 분자 구조, 특히 티올, 티올-에테르 및 아미노 기를 갖는 것 (예를 들어, 단백질, 지방산)을 염소화 및 산화시켜, 광범위한 미생물의 정상 기능의 변성 및 상실을 유발하는 강력한 산화제이다. HOCl은 FDA에 의해 "광범위한 미생물에 대해 가장 높은 살박테리아 활성을 갖는 유리 유효 염소의 형태"인 것으로 간주된다". HOCl은 강한 산화제이지만, 낮은 농도 (≤0.1%)에서도, 이는 상처 관리 적용에서 매우 잘 허용되고 안전하다.
참조로 포함됨
본 개시내용 전반에 걸쳐 이루어진 다른 문헌, 예컨대 특허, 특허 출원, 특허 공개, 저널, 서적, 논문, 웹 내용에 대한 임의의 및 모든 참조 및 인용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다.
실시예
실시예 1: 다중-구획 장치 내로의 로딩을 위한 API-P 및 NaCl의 건조, 공기 무함유 고체 혼합물의 제조를 위한 일반적 절차
1a. 염화나트륨 중 50 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
8.95 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 50 mg의 건조 차아염소산나트륨 (mw: 74.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1b. 염화나트륨 중 100 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
8.90 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 100 mg의 건조 차아염소산나트륨 (mw: 74.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1c. 염화나트륨 중 200 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
8.8 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 200 mg의 건조 차아염소산나트륨 (mw: 74.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1d. 염화나트륨 중 500 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
8.5 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 500 mg의 건조 차아염소산나트륨 (mw: 74.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1e. 염화나트륨 중 25 ppm 차아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
8.975 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 25 mg의 건조 차아염소산칼슘 (mw: 142.98 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1f. 염화나트륨 중 50 ppm 차아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
8.975 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 50 mg의 건조 차아염소산칼슘 (mw: 142.98 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1g. 염화나트륨 중 100 ppm 차아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
8.9 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 100 mg의 건조 차아염소산칼슘 (mw: 142.98 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1h. 염화나트륨 중 100 ppm 차아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
8.9 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 100 mg의 건조 차아염소산칼슘 (mw: 142.98 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1i. 염화나트륨 중 100 ppm 차아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
8.9 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 100 mg의 건조 차아염소산칼슘 (mw: 142.98 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1j. 염화나트륨 중 1 ppm 아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
89.99 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 10 mg의 건조 아염소산나트륨 (mw: 90.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1k. 염화나트륨 중 5 ppm 아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말의 제조
89.99 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 50 mg의 건조 아염소산나트륨 (mw: 90.44 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
1l. 염화나트륨 중 10 ppm 아염소산칼슘을 포함하는 건조 분말의 제조
89.99 g의 건조 NaCl (mw: 58.44 g/mol) 중에, 100 mg의 건조 아염소산칼슘 (mw: 157.89 g/mol)을 균질한 혼합 분말로 블렌딩하고, 광으로부터 차폐된 용기에 공기 무함유 및 건조 조건 하에 저장하였다. 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(1) 내로 로딩하였다.
실시예 2: 다중 구획 장치 내로의 저부피 분취물 로딩을 위한 1 L 활성화제 원액의 제조를 위한 일반적 절차
2a. 아세트산 활성화제 원액 (0.125%, pH 2.95)
998.75 mL의 멸균수 중에, 1.25 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다.
2b. 아세트산 활성화제 원액 (0.125%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 1.25 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2c. 아세트산 활성화제 원액 (0.25%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 2.5 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2d. 아세트산 활성화제 원액 (0.25%, pH 5.0)
998.75 mL의 멸균수 중에, 2.5 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하였다.
2e. 아세트산 활성화제 원액 (1%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 10 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2f. 아세트산 활성화제 원액 (2%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 20 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용해시켰다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2g. 아세트산/아세트산나트륨 활성화제 원액 (0.1 M, pH 5.0)
800 mL의 증류수 중, 5.772 g의 아세트산나트륨 (mW: 82 g/mol), 1.778 g의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 10N HCl 또는 10 N NaOH를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2h. 등장성 아세트산 활성화제 원액 (0.125%, pH 2.95)
998.75 mL의 멸균수 중에, 1.25 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 첨가하였다.
2i. 등장성 아세트산 활성화제 원액 (0.125%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 1.25 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 첨가하였다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2j. 등장성 아세트산 활성화제 원액 (0.25%, pH 4.3)
998.75 mL의 멸균수 중에, 2.5 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 첨가하였다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 4.3으로 조정하였다.
2k. 등장성 아세트산 활성화제 원액 (0.125%, pH 5.0)
998.75 mL의 멸균수 중에, 1.25 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 첨가하였다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하였다.
2l. 등장성 아세트산 활성화제 원액 (0.25%, pH 5.0)
998.75 mL의 멸균수 중에, 2.5 mL의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 첨가하였다. 10 N NaOH를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하였다.
2m. 등장성 아세트산/아세트산나트륨 활성화제 원액 (0.1 M, pH 5.0)
800 mL의 증류수 중, 5.772 g의 아세트산나트륨 (mW: 82 g/mol), 1.778 g의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol) 및 8.4 g의 NaCl (mw: 58.44 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 10N HCl 또는 10 N NaOH를 사용하여 pH를 5.0으로 조정하고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2n. 아세테이트 완충제 (0.1 M, pH 5.0)
800 mL의 멸균수 중, 5.772 g의 아세트산나트륨 (mW: 82 g/mol) 및 1.778 g의 아세트산 (mw: 60.05 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 10N HCl을 사용하여 pH를 5.0으로 조정하고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2o. ACES 완충제 (0.1 M, pH 6.7)
800 mL의 멸균수 중, 18.22 g의 N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (mW: 182.2 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 10N NaOH를 사용하여 pH를 6.7로 조정하고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2p. 시트르산 용액 (0.1 M, pH 2.2)
19.2 g 양의 시트르산 (mw: 192.1 g/mol)을 1L의 멸균수 중에 용해시켰다.
2q. 시트레이트 완충제 (0.1 M, pH 6.0)
800 mL의 멸균수 중, 12.044 g의 시트르산나트륨 (mW: 294.1 g/mol) 및 11.341 g의 시트르산 (mw: 192.1 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 0.1 N NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2r. ADA 완충제 (0.1 M, pH 6.6)
800 mL의 멸균수 중, 95.11 g의 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카르복시메틸)아미노]아세트산 (ADA, mW: 190.22 g/mol)을 용액에 첨가하였다. 10N NaOH를 사용하여 pH를 6.6으로 조정하였을 때 ADA가 용해되었고, 부피가 1 L가 될 때까지 증류수를 첨가하였다.
2s. 염료 페놀 레드를 포함하는 EBBS 완충제 (pH 7.0)
800 mL의 멸균수 중, 200 mg의 CaCl2 (mW: 110.98 g/mol), 200 mg의 MgSO4-7H2O (mW: 246.47 g/mol), 400 mg의 KCl (mW: 75 g/mol), 2.2 g의 NaHCO3 (mW: 84.01 g/mol), 6.8 g의 NaCl (mw: 58.44 g/mol), 140 mg NaH2PO4H2O (mw: 138 g/mol), 1 g D-글루코스 (덱스트로스) (mw: 180.16 g/mol) 및 10 mg 페놀 레드 (mw: 354.38 g/mol)를 용액에 첨가하였다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 용액의 pH를 7.0 또는 또 다른 목적하는 pH로 조정하였다.
2t. 멸균 등장성의 산소화된 물
1 L 원액 부피의 산소로 포화된 멸균수를 9 g의 NaCl에 첨가하고, 광으로부터 차폐된 밀봉된 병에 실온에서 저장하였다.
실시예 3: 실시예 1로부터의 용액과 조합된 산화된 염소의 고체 염으로부터의 즉시 사용가능한 소독제 제제의 즉각적인 제조.
실시예 3.1: 일반적 절차의 비제한적 단계
1. 실시예 1로부터의 임의의 분말의 90 mg의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(4) 내로 로딩한다.
2. 실시예 2로부터의 임의의 활성화제 용액의 10 mL의 분취물을 다중-구획 장치의 구획(4) 내로 로딩한다.
3. 본 발명에 따른 주요 제품을 생성하기 위해, 도 1에 따른 스크류 캡과 구획(4) 사이의 밀봉부, 장벽 또는 포트(3)를 파괴하거나 개방하여 구획(1) 내의 내용물을 구획(4) 내의 용액과 혼합하고, 이어서 부드럽게 압착 또는 진탕하여 소독제 용액을 생성한다. 생성된 용액은 다중-구획 장치 상의 스크류 캡을 제거한 후에 개구부를 통해 취출될 수 있으며, 이제 즉시 사용가능하다. 등장성 용액은 4 내지 9, 바람직하게는 5 내지 6의 범위의 pH를 가지며, 일반적으로 항미생물 목적으로 사용된다.
4. 임의로, 의도된 용도에 따라, API의 산화 상태에 따라 달라지는 색을 갖는 고체 형태의 수용성 염료 (ROD)를, 0.01 - 1000 ppm 농도 범위의 염료 농도를 생성하기 위한 사전계산된 양으로, 다중-구획 장치의 구획(9) 내로 임의로 로딩하고, 구획(1), (4) 및 (9)의 혼합물을 포함하도록 단계 3에서의 절차를 반복한다.
5. 임의로, 의도된 용도에 따라, API의 안정화제로서의 사전계산된 양의 아미노산, 바람직하게는 API와 동일한 농도의 타우린을 다중-구획 장치의 구획(5) 내로 임의로 로딩하고, 구획(1), (4) 및 (5)의 혼합물을 포함하도록 단계 3에서의 절차를 반복한다.
6. 임의로, 의도된 용도에 따라, 예를 들어 피부 또는 상처 적용을 위해, 0.01 - 25% 농도 범위의 최종 용액 중 점도 증진제 (VE)의 농도를 얻기 위해 사전계산된 양의, API에 의해 산화될 수 없는 수용성 VE를 다중-구획 장치의 구획(5) 내로 로딩한다. 0.01 - 0.1%의 VE 농도는 점성이지만 유체인 용액을 생성하며, 0.3 - 1%는 겔을 생성한다. 단계 3, 4 및/또는 5로부터의 용액 중 VE의 분산액을 실버슨 혼합기 또는 이스트랄 혼합기를 사용하여 점성 용액 또는 겔로 전환시키고, 피부 또는 상처 적용을 위한 부위에 사용한다. 점성 용액 또는 겔은 보다 느린 분자 운동으로 인해 증가된 안정성을 갖고, 추후 사용을 위해 공기 및 광으로부터 용액 또는 겔을 보호하는 연질 백, 병에 패킹될 수 있다.
실시예 4: HOCl 및 아세트산의 실시예 3 시험 용액의 시험관내 항-바이오필름 효과
다중-구획 장치로부터 3종의 상이한 시험 용액을 생성하였다. 구획(1)에 염화나트륨 중 200 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말 (실시예 1c) 90 mg이 로딩되어 있는 다중구획 장치로부터 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 모든 3종의 시험 용액을 생성하였다. 3개의 상이한 다중구획-장치에서 구획(4)에는 아세트산 용액 (0.125%, pH 4.3, 실시예 2b)의 10 mL의 3종의 분취물이 있었다. 용액 1: (0.25%, pH 4.3, 실시예 2c), 용액 2: (1%, pH 4.3, 실시예 2e), 용액 3: (2%, pH 4.3, 실시예 2f).
실험 설정
시험 유기체: 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 야생형 균주 바이오필름 유형: 0.5% 글루코스가 보충된 고체화 배지 상에 놓인 반투과성 막 상에서 성장시킨 48시간 된 또는 24시간 된 바이오필름. 48시간 된 바이오필름의 경우에, 바이오필름을 갖는 막을 24시간 후에 새로운 플레이트로 옮겼다.
초기 생존 세포 양: 5 x 109 콜로니 형성 단위 (CFU)
처리 방법: 바이오필름을 갖는 막을 새로운 플레이트로 옮겼다. 멸균 거즈를 8-10개 층으로 제2 막 상에 놓고, 1 ml의 항미생물 용액을 거즈 층 상에 피펫팅하였다. 처리를 실온에서 2 내지 3시간 또는 4 내지 6시간 동안 수행하였다. 4 내지 6시간 처리의 경우에, 처리를 개시한지 2 또는 3시간 후에 거즈 층을 1ml 샘플 용액을 갖는 새로운 거즈 층으로 대체하였다.
평가 방법: 거즈 층을 폐기하고, 바이오필름을 갖는 각각의 막을 5ml 0.9% NaCl을 함유하는 15ml 튜브로 옮기고, 10초 동안 볼텍싱하고, 초음파 조에서 10분 동안 초음파처리하고, 다시 10초 동안 볼텍싱하였다. 10배 연속 희석물을 제조하고, 10ul의 각각의 희석물을 생존 CFU 카운팅을 위해 LB 플레이트 상에 스폿-플레이팅하였다.
결과 및 결론
도 2는 샘플 용액을 사용하여 수득된 결과를 보여준다. 200ppm HOCl 용액 중 HAc 농도를 0.25%에서 1% 및 2%로 증가시키는 것은 에스. 아우레우스 바이오필름의 사멸을 점차 증가시켰다. 1% 아세트산 단독의 효과는 바이오필름에 대해 단지 경미한 효과를 가졌다. 시장에서 모두 에스. 아우레우스 바이오필름에 대해 단지 경미한 효과를 보인 4종의 상이한 경쟁 상처 치유 제품과 3종의 시험 용액을 비교하였다. 피. 아에루기노사로부터의 바이오필름에 대해 훨씬 더 강한 효과가 나타났다. 차아염소산 및 아세트산 (pH 4.3)은 다른 연구에서 안전한 것으로 나타난 농도에서 상승작용적으로 및 효율적으로 작용하는 것으로 결론내려진다.
실시예 5: 생체내 독성 연구
실시예 5.1: 래트에서의 7일 흡입 독성 연구.
코겔(Kogel) 등에 의해 2913년에 https://www.pmiscience.com/resources/docs/default-source/default-document-library/2013_ukogel_ict_poster.pdf?sfvrsn=d6a9f606_0에 기재된 바와 같이, 래트에서의 7일 흡입 독성 연구를 수행하였다. 경제 협력 개발 기구 (OECD)에 따라 래트 흡입 연구를 수행하였다. 구획(1)에 염화나트륨 중 100 ppm 차아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말 (실시예 1b) 90 mg 및 구획(4)에 아세트산 용액 (0.125%, pH 4.3, 실시예 2b)의 10 mL의 분취물이 로딩되어 있는 다중구획 장치로부터 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 시험 용액을 생성하였다. 시험 가이드라인 412에 따라, 스프라그-돌리 래트를 참조로서 여과된 신선한 공기 (모의) 또는 시험 용액에 노출시켰다. 동물의 관리 및 사용은 문헌 [American Association for Laboratory Animal Science Policy (1996)]에 따랐다. 모든 동물 실험은 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 규정된 등급화 시스템에 따라 코 및 좌측 폐의 규정된 해부학적 부위에서 조직병리학적 평가를 수행하였다. 유동 세포측정법에 의해 기관지폐포 세척액 중 유리 폐 세포를 결정하고, 다중-분석물 프로파일링 (MAP)에 의해 염증 매개체를 측정하였다. 시스템 독성학 접근법을 위해, 호흡기도 내의 특정 부위, 즉 호흡기 비강 상피 (RNE) 및 폐로부터 RNA 샘플을 수득하였다. 폐 RNA 단리를 위해, 주기관지 및 폐 실질의 호흡기 상피를 레이저 포획 미세절제 (LCM)에 의해 분리하고, 추가로 가공하고, 전체 게놈 아피메트릭스 마이크로어레이 (진칩(GeneChip)® 래트 게놈 230 2.0 어레이) 상에서 분석하였다. 기관지 또는 폐 실질에서의 염증, 세포 스트레스, 세포 증식과 관련된 주요 교란은 발견되지 않았다.
실시예 6: 유방염의 치료
단계 4에서의 색 지시제가 치료 절차에서, 예를 들어 API의 산화 활성의 지표에 대해 정보를 추가할 수 있는 적용의 경우, ROD를 포함하는 구획을 절차에 포함시킨다.
실시예 7: 임상 항바이러스 요법
구획(1)에 염화나트륨 중 1 ppm 아염소산나트륨을 포함하는 건조 분말 (실시예 1j) 90 mg 및 구획(4)에 시트르산 용액 (0.1 M, pH 2,2, 실시예 2p)의 10 mL의 분취물이 로딩되어 있는 다중구획 장치로부터 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 생성된 5 mL의 시험 용액을 기마 에어로졸 코르시아 네뷸라이저(Gima Aerosol Corsia Nebulizer)의 의약 컵에 로딩하였다. 네뷸라이저에 부착된 호스 및 페이스 마스크를 코로나바이러스 폐 감염 환자의 입에 부착시키고, 시작하였다. 10-15분의 호흡 후에, 유체를 다 사용하고, 네뷸라이저를 껐다. 치료 부작용이 일어나지 않도록 보장하기 위해 환자를 수시간 동안 모니터링하였다. 환자의 점막 및 섬모를 잠재적인 부작용에 대해 조사하였다.
실시예 8: 흡입 용액 (IS)의 약리학
변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)에 대한 조성물의 흡입 용액 (IS)의 바이러스-불활성화 특성을 조사하였다. 50, 100 및 200 ppm HOCl (pH 5.5) (및 희석된 50% 용액)의 IS 제품은 바이러스 불활성화 특성을 나타냈으며, 이는 바이러스 불활성화를 나타내는 IS 제품의 최저 농도가 25 ppm HOCl이었다는 것을 시사한다. 추가의 희석물을 시험하였고, 5, 10 및 20 ppm의 농도를 갖는 희석 용액은 어떠한 바이러스 불활성화 및 효과도 나타내지 않았으며, 이는 비-활성인 보다 낮은 범위가 입증되었다는 것을 시사한다. 50, 100 및 200 ppm HOCl (pH 5.5)을 갖는 IS 제품은 모든 시험된 HOCl 농도에서 외피보유 DNA 백시니아 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 입증하였다. 백시니아 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 제품은 SARS-CoV-2를 포함한 모든 외피보유 바이러스에 대해 활성인 것으로 간주된다. 별개의 연구에서, IS는 10 내지 200 ppm HOCl에서 SARS-CoV-2를 불활성화하는 것으로 나타났다.
항박테리아 활성에 관하여, 에스. 아우레우스 및 피. 아에루기노사의 밤샘 배양물을 각각 2 및 24시간 동안 성장시켜, 플랑크톤성 및 바이오필름 성장 박테리아 둘 다에 대해 IS를 시험하였다. 피. 아에루기노사 및 에스. 아우레우스에 대해 50 ppm HOCl IS에서 완전한 효과가 관찰되었다 (그러나 에스. 아우레우스 바이오필름에 대해서는 100 ppm HOCl IS).
요약하면, HOCl 농도가 50 내지 200 ppm인 IS 제품은 2가지 상이한 MVA 시험관내 시험에서 바이러스 불활성화를 나타낸다. 시험 제품의 희석 후, 항바이러스 활성을 나타내는 최저 농도는 25 ppm HOCl이었고, 항바이러스 활성을 나타내지 않는 시험된 최저 희석 농도는 5, 10 및 20 ppm HOCl이었다. 이들 실험으로부터 항바이러스 유효 농도 범위는 25 내지 200 ppm HOCl이었다. IS는 다양한 농도에서 SARS-CoV-2를 불활성화시키는 것으로 나타났다.
실시예 8.1: 항바이러스 효능
백시니아 바이러스에 대한 HOCl의 항바이러스 유효성
항바이러스 검정을 수행하여 변형된 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA)에 대한 HOCl의 살바이러스 활성을 평가하였다. 사용된 제품은 하기 농도의 50, 100 및 200 ppm HOCl을 함유하는 IS였다:
● 비희석 (80.0%)
● 아쿠아 비데스트로 희석. (50.0%)
● 아쿠아 비데스트로 희석. (10.0%)
● 아쿠아 비데스트로 희석. (1.0%) - 200 ppm HOCl만
시험 방법은 감염성 검정을 통해 확인된 바와 같은 MVA 감염된 BHK21-세포에 1-80% 희석률의 시험 제품 (50, 100 및 200 ppm HOCl)을 노출시키는 것을 포함하였다. 제품을 MVA 감염된 세포와 1 또는 2분 동안 접촉시킨 다음, 불활성화 검정을 수행하여 살바이러스 활성을 결정하였다. 또한 제품 접촉 후에 세포독성의 결정을 수행하였다.
방법
시험 바이러스 현탁액을 제조하기 위해, BHK 21-세포를 MEM 및 10% 또는 2% 소 태아 혈청과 함께 배양하였다. 세포를 0.1의 감염 다중도로 감염시켰다. 시험 제품을 비희석하여 시험하였다. 간섭 물질 및 시험 바이러스 현탁액의 첨가로 인해 80.0% 용액이 생성되었다.
EN 5.5에 따른 종점 적정으로서, 최고 희석률로 시작하여 0.1 mL의 각각의 희석물을 마이크로타이터 플레이트의 8개의 웰 내로 0.1 mL의 새로 분할된 세포 (웰당 10-15 x 103개 세포)가 되도록 전달하여, 감염성을 결정하였다. 마이크로타이터 플레이트를 5% CO2-분위기 하에 37℃에서 인큐베이션하였다. 도립 현미경을 사용하여 세포병변 효과를 판독하였다. 감염 용량 TCID50/mL의 계산은 스피어만(Spearman) 및 캐베르(Kaerber)의 방법으로 계산하였다.
시험 소독제의 살바이러스 활성은 소독제가 없는 대조군 적정과 비교하여 역가의 감소를 계산함으로써 평가하였다. 차이는 감소 배율 (RF)로서 주어진다. EN 14476에 따르면, 특정한 농도의 소독제 또는 소독제 용액은 권장된 노출 기간 이내에 역가가 적어도 4 log10 단계만큼 감소되는 경우에 바이러스-불활성화 효능을 갖는다. 이는 ≥99.99%의 불활성화에 상응한다.
EN 5.5에 따라 살바이러스 활성의 결정을 수행하였다. 20℃ ± 1.0℃에서 수조 내 밀봉된 시험 튜브에서 불활성화 시험을 수행하였다. 적절한 노출 시간 후에 분취물을 보유하고, 잔류 감염성을 결정하였다. EN 5.5.4.1에 따라 세포독성의 결정을 수행하였다. 시험 검증을 위한 참조로서 EN 5.5.6에 따른 0.7% 포름알데히드 용액을 포함시켰다. 접촉 시간은 5, 15, 30 및 60분이었다. 추가로, 포름알데히드 시험 용액의 세포독성을 10-5까지의 희석물로 EN 5.5.6.2에 따라 결정하였다.
결과
80.0% 검정에서 모든 비희석 시험 제품 (즉, 50, 100, 200 ppm HOCl)은 1분의 노출 시간 후에 MVA를 불활성화시킬 수 있었다. 감소 배율은 하기와 같았다:
● 50 ppm HOCl: ≥5.25±0.33
● 100 ppm HOCl: ≥5.13±0.25
● 200 ppm HOCl: ≥5.25±0.33
이들은 ≥99.999%의 불활성화에 상응하였다.
50.0% 용액은 또한 1분의 노출 시간 후에 MVA를 불활성화시킬 수 있었다. 감소 배율은 하기와 같았다:
● 50 ppm HOCl: ≥4.25±0.33
● 100 ppm HOCl: ≥4.13±0.25
● 200 ppm HOCl: ≥4.25±0.33
이들은 ≥99.99%의 불활성화에 상응하였다.
10.0% 용액은 노출 시간 1분 이내에 MVA를 불활성화시킬 수 없었다. 1.0% 용액 (200 ppm HOCl)은 또한 1분 이내에 MVA를 불활성화시킬 수 없었다.
결론적으로, 비희석으로 시험된 50, 100 및 200 ppm HOCl의 흡입 IS 제품은 1분의 노출 시간 후에 MVA에 대한 활성을 입증하였다 (0.3 g/L BSA).
실시예 8.2: 항박테리아 및 항-바이오필름 효능
실시예 8.2.1. IS의 항박테리아 및 항-바이오필름 효능
항박테리아 검정을 수행하여 각각 플랑크톤성 및 바이오필름 박테리아를 나타내는 2 또는 24시간 동안 성장시킨 피. 아에루기노사 및 에스. 아우레우스에 대한 IS의 살박테리아 활성을 평가하였다. 사용된 제품은 하기 농도의 IS (즉, 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성 함유)였다:
● 10 ppm HOCl
● 50 ppm HOCl
● 100 ppm HOCl
● 200 ppm HOCl
● 500 ppm HOCl
제품을 피. 아에루기노사 또는 에스. 아우레우스와 1시간 동안 접촉시킨 다음, 분취물을 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션되도록 두었다. 다음 날, 플레이트를 성장에 대해 평가하고, 부분 성장의 경우에 log 감소를 정량화하였다.
방법
180 rpm에서 진탕시키면서 37℃에서 밤새 (17시간) 배양 튜브 내 5 mL LB에서 MH340 (피. 아에루기노사 PAO1) 및 5 mL TSB에서 NCTC-8325-4 (에스. 아우레우스)를 성장시켰다.
그 후, 밤샘 배양물을 50배 희석하고, 200 μL의 희석된 박테리아 현탁액을 96 둥근 웰 마이크로타이터 플레이트에 웰마다 침착시켰다 (8회 기술적 반복). 박테리아당 조건 및 처리당 1개의 마이크로타이터 플레이트. 2시간 성장 ("플랑크톤성" 박테리아) + 1시간 처리 및 24시간 성장 ("바이오필름" 박테리아) + 1시간 처리. 박테리아를 37℃에서 각각 2 및 24시간 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 박테리아를 0.9% NaCl (대조군), 10 ppm HOCl, 50 ppm HOCl, 100 ppm HOCl, 200 ppm HOCl 및 500 ppm HOCl IS로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다.
처리 기간 (1시간) 후, 웰당 20 μL를 LB 플레이트 상에 스폿팅하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날 플레이트를 성장 (염수는 대조군임) 또는 성장 없음에 대해 검사하였다.
결과
하기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 피. 아에루기노사 플랑크톤성 박테리아 및 바이오필름은 에스. 아우레우스보다 더 낮은 제품 농도에서 근절되었다. 대표적인 플랑크톤성 및 바이오필름 에스. 아우레우스 및 피. 아에루기노사에서 전반적으로 최종 IS 제품 (100 ppm HOCl)의 완전한 항박테리아 효과가 있다.
결론적으로, 10 또는 50 ppm HOCl의 농도의 IS는 각각 통상의 플랑크톤성 박테리아 병원체 피. 아에루기노사 및 에스. 아우레우스를 사멸시킨다. 50 또는 100 ppm HOCl을 갖는 IS는 각각 피. 아에루기노사 및 에스. 아우레우스의 바이오필름 형태를 사멸시킨다.
실시예 8.2.2. IS 및 아세트산의 항박테리아 및 항-바이오필름 효능
또 다른 항박테리아 검정을 수행하여 플랑크톤성 박테리아를 나타내는 2시간 동안 성장시킨 피. 아에루기노사 및 에스. 아우레우스에 대한 IS 및 아세트산의 살박테리아 활성을 평가하였다. 사용된 제품은 하기 농도의 IS (즉, 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성 함유) 또는 아세트산 단독이었다:
● 25 ppm HOCl
● 50 ppm HOCl
● 100 ppm HOCl
● 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성
제품을 피. 아에루기노사 또는 에스. 아우레우스와 1시간 동안 접촉시킨 다음, 분취물을 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션되도록 두었다. 다음 날, 플레이트를 성장에 대해 평가하고, 부분 성장의 경우에 log 감소를 정량화하였다.
방법
에스. 아우레우스 (NCTC-8325-4) 및 피. 아에루기노사 PAO1 (MH340)의 희석된 밤샘 배양물 (OD 0.5, 에스. 아우레우스의 경우 ~107개 및 피. 아에루기노사의 경우 ~108개)을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 2시간 동안 성장시켜, 플랑크톤성 그람-양성 및 그람-음성 박테리아에 대한 항박테리아 특성을 시험하였다. 그 후, 웰을 수거 전 1시간 동안 다양한 농도의 HOCl (25, 50 및 100 ppm HOCl, 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성), 등장성 0.25% 아세트산 (pH 5.5) 및 0.9% 염수 (대조군)의 IS로 처리하였다.
1시간 후, 데이-엥글리(Dey-Engley) 중화 브로쓰 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), D3435)를 모든 웰에 첨가하여 IS를 불활성화시키고, 웰의 내용물을 10배 시리즈로 희석하고, 적절한 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다 (10-8까지). 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 호기성으로 성장시켰다. 카운팅가능한 희석물 중 콜로니의 수로부터 CFU 카운트를 계산하여 log 감소를 계산하였다. 각각의 박테리아의 3회 기술적 반복으로 시험을 실행하였다.
결과
하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 25, 50 및 100 ppm HOCl IS는 그람-양성 (에스. 아우레우스) 및 그람-음성 (피. 아에루기노사) 박테리아 둘 다를 근절하였다. 등장성 0.25% 아세트산 (pH 5.5)은 박테리아를 근절하지 않았다.
결론적으로, IS는 각각 25 ppm 및 10 ppm의 HOCl 농도에서 플랑크톤성 그람-양성 (에스. 아우레우스) 및 그람-음성 박테리아 (피. 아에루기노사)를 효율적으로 근절한다. 아세트산은 그람-양성 (에스. 아우레우스) 박테리아를 근절하지 않고, 그람-음성 박테리아 (피. 아에루기노사)의 최소 감소를 나타낸다.
실시예 8.3: 항-SARS-CoV-2 효능
바이러스 불활성화 및 세포독성 검정을 수행하여 SARS-CoV-2 감염된 Vero E6 세포에 대한 IS의 살바이러스 활성을 평가하였다. 사용된 제품은 하기 농도의 IS였다:
● 10 ppm HOCl
● 50 ppm HOCl
● 100 ppm HOCl
● 200 ppm HOCl
시험 방법은 10-200 ppm HOCl 농도의 시험 제품을 SARS-Cov-2 감염된 Vero E6 세포에 48시간 동안 노출시키는 것을 포함하였다. 이어서, 세포를 염색하고, 바이러스 항원 양성 세포의 수를 계수하였다. 세포 증식 검정을 수행하여 세포독성을 평가하였다.
방법
Vero E6 세포/웰을 96-웰 플레이트에 시딩하고, 바이러스 (감염 다중도 0.002)를 첨가하고, 세포독성 검정을 위해 37℃에서 1시간 동안 또는 비처리 대조군의 경우 배지만 인큐베이션하였다. 바이러스를 제거하고, 비희석 또는 절반으로 희석된 10 ppm HOCl, 50, 100 또는 200 ppm HOCl의 IS를 15분 동안 첨가하고, 그 후 검정물을 48시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션된 세포를 고정시키고, 1차 항체 SARS-CoV-2 스파이크 키메라 모노클로날 항체 및 2차 항체 F(ab')2-염소 항-인간 IgG Fc 교차-흡착 2차 항체, HRP로 염색하였다. 단일 감염된 세포를 DAB 기질로 가시화하고, 이뮤노스폿(ImmunoSpot) 시리즈 5 UV 분석기에 의해 자동으로 카운팅하였다. 셀 타이터 아퀴어스 원 솔루션 셀 프로리퍼레이션 어세이(Cell Titer AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)를 사용하여 세포독성 검정을 수행하였다.
결과
이 연구에서, 시험 화합물의 항바이러스 효과를 대조군과 비교하여 바이러스가 없는 VERO 세포의 양에 의해 평가하였다. IS가 바이러스 양성 VERO 세포의 양을 낮추었다는 결과에 기초하여, 이에 따라 IS는 10 ppm 내지 100 ppm HOCl 농도에서 VERO 세포를 사멸시키지 않으면서 SARS-CoV-2를 불활성화시켰다. VERO 세포는 극도로 취약하고 연구 IS에 적합하지 않은 것으로 보고되었으며, 이에 따라 훨씬 더 우수한 항바이러스 활성이 더 강건한 세포에서 얻어졌을 수 있다. 그러나, SARS-CoV-2의 부류 3 미생물로서의 분류로 인해, 다른 세포 유형에서는 이들 실험을 실행하는 것이 가능하지 않았다. 바이러스 불활성화 및 세포독성 결과가 도 3에 제시된다.
도 3을 참조하면, 각각의 막대는 평균과 평균의 표준 오차 (오차 막대)를 나타낸다. 좌측 축은 비처리 대조군에 대해 정규화된 바이러스 항원 양성 세포의 수 (백분율)를 보여준다. 우측 축은 비처리 대조군에 대해 정규화된 세포 생존율 (흡광도) (백분율)을 보여준다. MOI = 감염 다중도.
50, 100 및 200 ppm의 비희석 실험은 미지의 메카니즘으로 인해 VERO 세포를 사멸시켰고, 따라서 상기 도면에 보고되어 있지 않음을 주목한다. 그러나, 10 ppm 비희석 및 50, 100 및 200 ppm의 50:50 희석은 VERO 세포를 사멸시키지 않았고, SARS-Cov-2 불활성화가 관찰되었다. 결론적으로, 다양한 농도에서, IS는 SARS-CoV-2를 불활성화시킨다.
실시예 9: 흡입 용액 (IS)의 독성학
IS의 독성학을 특징화하기 위해 여러 생체내 연구가 수행되었고 진행 중이다.
덴마크의 엘레가드 괴팅겐 미니피그(Ellegaard Goettingen Minipigs) 사에서 괴팅겐 미니피그에서의 비-GLP 생체내 흡입 독성 연구를 수행하였다. 이들 연구는 선택된 동물에 대한 2 또는 4주의 회복 기간을 포함한, 네뷸라이징된 IS의 삽관에 의한 미니피그에서의 5-일 반복 투여 연구를 포함한다. 추가로, 후속 연구를 위한 용량 수준의 선택에 도움이 되도록 삽관에 의한 소규모 파일럿 연구를 수행하였다. 폐에 도달하는 IS의 양을 최대화하기 위해 이들 연구에서 투여 경로로서 삽관을 선택하였다.
이들 연구 후에, 제안된 임상 시험에서 연구될 의도된 인간 노출을 모방하기 위해 엘레가드 괴팅겐 미니피그에서 네뷸라이징된 IS의 마스크에 의한 투여로 5일 지속기간의 추가 연구를 또한 수행하였다.
미니피그에서의 14-일 반복 용량 GLP 흡입 독성 연구에 대한 예비 연구로서 미니피그에서의 추가 비-GLP 최대 허용 투여량 연구를 수행하였다. 두 연구 (예비 및 주요 연구)는, 다시 인간 투여를 가능한 한 가깝게 모방하기 위해 마스크를 통한 투여를 갖는다. 동물 복지 제한사항으로 인해, 미니피그는 1일에 1회만 투여될 수 있고, 따라서 1일에 다수회 5 mL 투여와 대조적으로 임상 연구를 위해 의도된 종일 투여 (즉, 100 ppm으로 18 mL)를 전달하기 위해 60분 동안 네뷸라이징된 IS에 노출된다.
실시예 9.1: 반복-용량 독성
덴마크의 엘레가드 괴팅겐 미니피그에서 초기 독성 연구 (비-GLP)를 수행하였다. 영국의 코반스(Covance)에서 추가의 예비 비-GLP 연구를 수행하였고, 영국의 코반스에서 GLP 연구가 진행 중이다. 모든 완료된 및 계획된 반복-용량 독성 연구를 하기 서브섹션에 요약한다.
실시예 9.1.1: 생체내 흡입 연구 - 삽관
6-8개월령의 21마리의 수컷 및 21마리의 암컷인 42마리의 건강한 젊은-성체 괴팅겐 미니피그를 이 실험에 사용하였다. 미니피그의 체중은 대략 12 kg이었다. 미니피그를 엘레가드 괴팅겐 미니피그의 AAALAC 인터내셔널(AAALAC International) 승인된 장벽 시설 수용소에서 지역 환경, 급식 및 관리에 대한 시설 표준에 따라 사육 및 수용하였다. 실험 프로토콜은 덴마크 동물 실험 연구소(Danish Animal Experiments Inspectorate) (허가 번호 2020-15-0201-00530)에 의해 승인되었으며, 모든 절차를 덴마크 동물 시험법에 따라 수행하였다. 연구를 GLP에 따라 수행하지는 않았지만, 데이터는 문서화된 연구 계획 및 지역 표준 작업 절차에 따라 기록 및 보고하였다.
연구를 2개의 별개의 단계에서 수행하였다. 제1 단계에서, 32마리의 동물 (군당 4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)을 5일 동안 처리하고, 종결시켰다. 제2 단계에서, 추가 10마리의 동물 (5마리의 수컷 및 5마리의 암컷)을 최고 용량으로 처리하고; 마지막 처리 후 제5일에 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷을 사멸시키고, 14 또는 28-일 회복 기간 후에 각각 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷을 사멸시켰다. 두 단계는 편의상 단일 연구로서 본원에 요약 및 보고된다.
동물을 하기와 같이 투여 군에 할당하였다:
주요 단계
● 대조군으로서 0.9% NaCl (4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)
● 50 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)
● 100 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)
● 200 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (4마리의 수컷 및 4마리의 암컷)
회복 단계
● 200 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (최종 용량 후에 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷을 사멸시킴)
● 200 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (2주 회복 후에 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷을 사멸시킴)
● 200 ppm HOCl + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 (4주 회복 후에 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷을 사멸시킴)
추가적으로, 파일럿 연구에서 4마리의 미니피그를 사용하였으며, 여기서 3마리는 500 ppm + 0.25% HAc, pH 5.5, 등장성 IS를 투여받았고, 1마리는 염수를 받아 대조군으로서 작용하였다.
모든 미니피그를 5일 동안 매일 마취시켜 (부토르파놀에 의해 강화된 프로포폴을 정맥내 카테터에 의해 사용함) 기관내 관을 통해 5 mL 네뷸라이징 제품 (대조군의 경우 염수)을 받도록 하였다. 미니피그를 총 유량 2 L/분 (50% 산소) 및 일회 호흡량 10 mL/kg인 부피-제어 환기의 GE 마취 기계를 사용하여 환기시켰다. P피크 (본 발명자들의 주요 결과 파라미터, 잠재적 기관지수축을 평가하기 위함)를 포함한 폐활량측정법, 뿐만 아니라 호기말이산화탄소분압측정법, 비-침습성 혈압, 심박수 (ECG) 및 온도를 2분마다 기록하였다.
동물을 인공호흡기 시스템에서 적어도 10분 안정화되도록 한 후 P피크를 포함한 관찰을 기록하였다. 동물을 기준선 측정으로서 10분 동안 모니터링하고; 그 후, 5 mL 제품의 네뷸라이징을 시작하였다 (에어로겐 솔로(Aerogen Solo) 네뷸라이저, 티믹 앱스(Timik Aps), 덴마크 콜딩). 네뷸라이징은 11-20분 지속되었다 (제조업체에 따라, 2-5분/mL). 모든 제품이 네뷸라이징된 후에, 동물이 의식을 회복할 수 있기 전에 동물을 (흡입후) 추가 15분 동안 모니터링하였다.
마취/흡입 전 아침마다 및 마취/흡입 후 오후마다, 모든 동물을 점수화하여 일반적 상태, 식욕, 행동, 기침, 폐 기능 및 이동성을 평가하였다. 혈액 샘플을 제1 용량 전 및 마지막 용량 후 다시 채취하고, 임상 병리상태 파라미터에 대해 평가하였다. 회복 동물의 경우, 혈액을 또한 휴약기 동안 임상 병리상태에 대해 평가하였다.
2 또는 4주 휴약 후에 사멸시킨 회복군 동물을 제외하고는, 모든 동물을 투여 완료 후 제5일에 사멸시켰다. 안락사 후 경험있는 수의학 병리학자가 호흡기계에 특별히 주의를 기울이면서 상용적 부검을 수행하여 계내 독성의 잠재적 육안 징후를 관찰하였다. 폐 및 종격 림프절을 칭량하였다. 모든 7개의 폐엽으로부터 근위로 (주기관지 포함) 및 원위로, 모든 동물 (플러스 동물 시설로부터의 2마리의 감시, 비처리 동물)의 기관, 용골, 종격 림프절, 심장 (우심실 및 좌심실 근육), 신장 및 간으로부터 조직병리학을 위한 샘플을 수집하였다.
500 ppm HOCl을 사용한 파일럿 연구에서, 주로 근위 폐 샘플 내 호흡기 상피에서 중간 정도의 섬모 상실이 있었다. 이러한 결과에 기초하여, 200 ppm HOCl이 주요 연구에 적합한 고용량 수준일 것으로 결정되었다.
주요 연구에서, 모든 미니피그는 1일 2회 임상 평가에서 정상인 것으로 밝혀졌다.
혈액학적 및 생화학적 파라미터는 기준선 (흡입 전 제1일) 및 실험 종료 시 (흡입 후 제5일) 모든 군에 대해 주목할 만하지 않았다. 치료의 효과를 나타내는 결과는 없었다.
폐활량측정법 측정치에서, 주요 결과 파라미터 P피크는 흡입과 관련하여 및 흡입 후에 여러 처리군 또는 대조군 사이에 상이하지 않았다. 추가로, 실험당 미니피그당 관찰된 P피크의 가장 큰 차이는 1 cm H2O였으며, 이는 기계의 검출 한계 내에 있고 임상 유의성이 없었으나; 2마리의 피그 (대조군에서 1마리 및 200 ppm HOCl 군에서 1마리)의 경우 P피크의 차이가 2 cm H2O였다. 이는 네뷸라이징된 제품의 흡입이 기관지-수축을 유도하지 않았다는 것을 명확히 강조한다. 모든 다른 파라미터는 처리에 의해 영향을 받지 않았다.
부검 시, 처리에 대한 반응의 어떠한 분명한 육안 징후도 관찰되지 않았다.
연구의 제1 파트 (0, 50, 100 또는 200 ppm을 사용한 군당 4 + 4마리의 동물의 처리군, 플러스 500 ppm HOCl로 투여된 3마리의 동물의 파일럿 군)에서, 약물 노출과 관련된 병리학적 결과는 국부 림프절 증식증, 용골 영역 (기관 분기부) 및 주기관지에서의 상피 섬모의 상실이었다. 주기관지의 경우, 섬모의 상실은 주로 폐엽에서 근위에 존재하였고, 모든 엽은 동등하게 영향을 받았다. 호중구성 과립구 침윤은 기관, 용골 및 주기관지의 점막 및 점막하에서 관찰되었고, 발생은 섬모 상실의 패턴을 따랐다. 약물 노출과 관련된 병리학적 결과는 500 및 200 ppm HOCl을 투여한 경우에 존재하였다. 그러나, 500 ppm이 가장 현저한 결과를 초래하였다. 100 ppm HOCl을 받은 단일 동물에서는 최소의 섬모 상실만이 관찰되었다. 모든 다른 경미한 육안 및 현미경 결과는 매일의 마취 절차와 관련된 것으로 간주되거나 또는 부수적 결과였다. 수컷 및 암컷 동물 사이에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
연구의 제2 파트 (동물에게 200 ppm으로 투여하고 마지막 용량 직후 사멸시키거나 (1 + 1) 또는 2주 회복 후에 사멸시키거나 (2 + 2) 또는 4주 회복 후에 사멸시킴 (2 + 2))에서, 회복이 없는 200 ppm HOCl 군에서의 조직병리학적 결과는 주요 연구에서의 200ppm 군과 대등한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 5일 동안 200ppm HOCl의 매일 흡입은 기관, 용골 영역 및 주기관지에서 섬모의 상실을 초래한다는 것이 확인되었다. 섬모 상실의 회복은 2주 및 4주의 회복 둘 다 후에 발견되었다. 증식증이 회복군의 기관지 및 세기관지 상피에서 관찰되었으며, 이는 세포 재생의 징후를 나타낸다. 기관, 용골 및 주기관지의 점막 및 점막하에서의 호중구성 과립구 침윤은 회복 후에 관찰되지 않았다. 회복군은 증가된 양의 폐포내 대식세포를 나타냈다. 그러나, 각각의 군 내의 적은 수의 동물과 함께, 결과를 시험 약물에 명확하게 관련시키는 것을 어렵게 만드는 큰 변동이 관찰되었다. 추가로, 제1 연구에서 200 ppm HOCl 군에서의 폐포내 대식세포의 추정 개수는 제2 연구에서보다 훨씬 더 높았다. 추가로, 때때로 무기질화와 연관된 폐포 대식세포의 국소 침윤은 괴팅겐 미니피그에서 흔한 결과로서 보고된다. 암컷 및 수컷 동물 사이에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
100 ppm HOCl (5.0 mL)의 SIS가 삽관에 의한 미니피그에의 투여 후 NOAEL인 것으로 간주되었다.
실시예 9.1.2: 생체내 흡입 연구 - 마스크 사용
이 연구에서, 건강한 미니피그를 코를 덮는 마스크에 의해 네뷸라이징 IS 또는 네뷸라이징 염수 용액 (대조군으로서 0.9% w/v NaCl) 10 mL (10 mL가 네뷸라이저에 첨가되지만, 잔류 부피가 1.2 mL이므로, 예상된 전달량은 8.8 mL였음)로 5일 동안 매일 처리하였다. 이전에 발견된 NOAEL 100 ppm 뿐만 아니라 50 ppm을 시험하고, 염수 대조군과 비교하였다.
12마리의 건강한 젊은-성체 괴팅겐 미니피그 (6-8개월령)를 이 실험에 사용하였다 (31355). 미니피그 (6마리의 수컷 및 6마리의 암컷)의 체중은 대략 12 kg이었다. 미니피그를 엘레가드 괴팅겐 미니피그의 AAALAC 인터내셔널 승인된 장벽 시설 수용소에서 지역 환경, 급식 및 관리에 대한 시설 표준에 따라 사육 및 수용하였다. 실험 프로토콜은 덴마크 동물 실험 연구소 (허가 번호 2020-15-0201-00530)에 의해 승인되었고, 모든 절차를 덴마크 동물 시험법에 따라 수행하였다.
동물을 4마리의 동물 (2마리의 수컷 및 2마리의 암컷)씩 하기 투여군으로 무작위로 나누었다:
● 대조군으로서 0.9% NaCl (n=4)
● 50 ppm HOCl + 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성 (n=4)
● 100 ppm HOCl + 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성 (n=4)
미니피그를 연구 전 주 동안 두번의 경우에 슬링 감금을 수용하도록 훈련하였다. 연구 동안, 한 번에 2마리의 미니피그를 조용하고 조명이-어두운 작업실에서 슬링에 넣었다. 동물을 저용량 미다졸람 (0.3-0.7 mg/kg - 각각의 동물을 진정시키기 위해 필요에 따라 5일 동안 증가시킴)으로 가볍게 진정시키고, 그의 눈을 진정시키기 위해 덮었다. 그 후, 마스크를 코 위에 놓고, 마스크를 파리 보이® 클래식 네뷸라이저에 연결하였다. 네뷸라이저 챔버를 초기에 4 mL IS 또는 염수로 충전하고, 대략 30분 후에 10 mL가 투여될 때까지 연속적으로 재충전하였다 (2 mL로 3회). 제조업체에 따르면, 잔류 부피는 대략 1.2 mL이고, 따라서 투여된 용량은 ~8.8 mL였다. 맥박 산소측정기를 각각의 동물의 꼬리에 연결하여 맥박 및 산소 포화도를 측정하고; 호흡 빈도의 카운팅을 포함한 측정치를 5, 10, 15 및 20분의 흡입 후에 기록하였다. 상기 절차 후, 동물을 회복 상자에 넣고, 완전한 회복까지 관찰한 후, 그의 수용소로 다시 넣었다. 절차를 5일 동안 매일 반복하였다. 제5일에, 동물을 마지막 흡입 후 안락사시켰다.
절차 전 아침마다 및 절차 후 오후마다, 모든 동물을 점수화하여 일반적 상태, 식욕, 행동, 기침, 폐 기능 및 이동성을 평가하였다.
혈액 샘플을 흡입 전 첫날 (기준선) 및 흡입 마지막 날 흡입 후에 채취하였다. 표준 생화학 및 혈액학 (감별 카운트 포함)을 수행하였다.
안락사 후 경험있는 수의학 병리학자가 호흡기계에 특별히 주의를 기울이면서 상용적 부검을 수행하여 계내 독성의 잠재적 육안 징후를 관찰하였다. 폐 및 종격 림프절을 칭량하였다. 우측 앞쪽 및 좌측 뒤쪽 폐엽으로부터 근위로 (주기관지 포함) 및 원위로, 기관, 용골, 종격 림프절, 심장 (우심실 및 좌심실 근육), 신장 및 간으로부터 조직병리학을 위한 샘플을 수집하였다. 조직병리학을 위해 표준화된 접근법을 사용하여 비도를 수집하여 3가지 비강 수준을 조사하였다.
폐 (기관, 용골, 기관지 및 세기관지 포함), 림프절 (용골하), 비도 (비강 개구부, 비갑개, 상악비갑개, 서골비기관, 사골비갑개 및 비인두를 덮는 편평, 이행, 호흡기 및 후각 상피), 간, 신장 및 심장을 조직학적으로 검사하였다.
몇몇 경우에, 흡입과 관련하여 또는 코로부터 마스크를 제거한 후에 몇몇 기침 또는 재채기가 들렸으며; 이는 대조군에서 1마리의 동물, 50ppm 군에서 2마리의 동물 및 100ppm 군에서 1마리의 동물에 대해 주목되었다. 이는 마스크가 코 주위에 생성하는 습한 국부 환경에 대한 반응일 가능성이 있을 수 있다. 발생은 군들 사이에 유사하였기 때문에, IS에 기인하는 것으로 간주되지는 않는다. 호흡률, 맥박 및 산소 포화도는 군들 사이에 유사하였다. 동물은 투여 후 최대 10분 내에 경도 진정으로부터 회복되었다.
정기적인 매일 검사에서 어떠한 임상 징후도 관찰되지 않았다. 기준선 (흡입 전 제1일)으로부터 실험 후 (흡입 후 제5일)까지의 혈액학적 및 생화학적 파라미터의 발생은 모든 군에 대해 주목할 만하지 않았다. 모든 군에서 관찰된 크레아틴 키나제 상승은 가장 가능성 있게는 취급 및 혈액 수집과 관련된 고전으로 인한 것으로 간주된다.
부검 시, 독성의 어떠한 분명한 육안 징후도 관찰되지 않았다.
약물 노출과 관련된 병리학적 결과는 기관, 용골-영역 및 폐에서 관찰되지 않았다. 기관, 용골-영역 및 폐에서 관찰된 모든 경미한 육안 및 현미경 결과는 매일의 진정 절차, 경정맥으로부터의 혈액 샘플링의 비-성공적 시도, 안락사와 관련된 것으로 간주되거나 또는 부수적 결과였다. 예를 들어, 때때로 무기질화와 연관된 폐포 대식세포의 국소 침윤이 모든 군의 일부 동물에서 관찰되었고, 괴팅겐 미니피그에서 흔한 결과로서 보고된다. 또한, 펜토바르비탈에 의한 안락사는 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그, 양, 비-인간 영장류, 개 및 고양이에서의 연구에 기초하여 울혈, 부종, 출혈, 기종 및 괴사를 포함한 폐 조직 손상을 유도할 수 있고, 종에 걸쳐 일관성이 나타나는 것으로 보고되었다.
코 및 비인두 내의 충혈, 상피 박리, 섬모 상실 및 림프 증식증이 모든 3개의 군에서 관찰되었다. 상기 변화는 국소 영역에서 가장 자주 관찰되었다. 비인두의 경우, 염수 군과 비교하여 100 ppm 및 50 ppm HOCl 군 둘 다에서 더 많은 동물이 변화를 갖는 것으로 등록되었다. 그러나, 병변의 설명은 군들에 걸쳐 유사하였고, 적은 수의 동물에 기초하여 3개의 연구군 사이에 어떠한 명확한 차이도 관찰될 수 없는 것으로 결론내렸다. 상피 박리는 조직 샘플링의 인공물로 볼 수 있다는 것을 주목해야 한다. 100 및 50 ppm HOCl의 마스크 흡입은 염수 대조군과 비교하여 결과에 있어서 유의성의 증가와 연관될 수 없는 것으로 결론내려진다.
결론적으로, 염수 대조군을 포함한 모든 군에서 결과가 관찰되었지만, IS 처리된 동물에서 IS에 기인하는 것으로 간주되는 것은 전혀 없었다. 이 연구에 기초하여, IS에 대한 NOAEL은 마스크에 의한 투여의 경우 100 ppm (8.8 mL)이었다.
실시예 9.1.3: 생체내 다중-용량 안전성 연구
후속 GLP 연구에서 용량의 선택에 도움이 되도록 최대 허용 용량을 평가하기 위해 미니피그의 생체내 흡입 모델에서 IS를 시험하였다. 건강한 미니피그 (n=6; 군당 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷의 3개 군)를 코를 덮는 마스크에 의해 1.2, 2.3 또는 5.4 μg/L의 농도의 에어로졸 (50, 100 또는 200 ppm HOCl + 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성 사용)로 7일 동안 매일 처리하였다. 1일 치료 지속기간은 60분이었고, 1일 50, 100 및 200 ppm의 IS 투여 군에서 각각의 동물은 각각 19.9, 19.1 또는 22.2 mL를 받았다. 동물을 IS의 7일 흡입 후 제8일에 안락사시켰다. 연구 동안, 임상 상태, 체중, 음식물 소비, 혈액학 (말초 혈액), 혈액 화학, 기관 중량, 육안 병리학 및 조직병리학 조사를 수행하였다. 제제의 달성된 에어로졸 농도 및 공칭 차아염소산 농도로부터 계산된 HOCl 농도는 각각 군 1, 2 및 3에 대한 목표의 99%, 92% 및 110%였다. 임상 상태, 체중, 음식물 소비, 혈액학 또는 혈액 화학 파라미터 또는 기관 중량에 대한 시험 품목 관련 효과는 없었고, 품목-관련 육안 병리학 또는 조직병리학 결과도 없었다. IS는 괴팅겐 미니피그에게 연속 7일 동안 1일에 60분 동안 페이스 마스크를 통해 투여되었을 때 잘 허용되었고, 50, 100 또는 200 ppm 농도가 괴팅겐 미니피그에서의 장기간 독성 연구에서 1일 60분 노출에 적절한 것으로 간주된 것으로 결론내렸다.
실시예 10: 상처 관주 용액 (WIS)의 세포독성
200 ppm HOCl의 상처 관주 용액 (WIS)의 시험관내 세포독성을 2가지 세포독성 연구에서 평가하였다. 연구의 목적은 WIS가 시험관내에서 배양된 포유동물 L929 세포에 독성인지 여부를 결정하는 것이었다. 시험은 ISO 10993-5에 기재된 방법을 따르며, 시험 품목의 제제를 ISO 10993-12에 따라 제조하였다. 하기 서브섹션은 시험관내 세포독성 연구를 요약한다.
실시예 10.1: WIS (200 ppm HOCl)의 시험관내 세포독성
0.25% 아세트산 및 200 ppm HOCl, pH: 4.3을 함유하는 시험 품목 WIS (SOF 0001/05-01)를 검사하여 배양된 포유동물 세포 (마우스 섬유모세포)에 대한 잠재적 세포독성 활성을 결정하였다. 시험을 미국 약전, 방법 <87> 및 ISO 10993-5 가이드라인에 따라 수행하였다.
WIS (SOF 0001/05-01)의 제제를 완전 세포 배양 배지 (10% 태아 소 혈청 및 50 μg/mL 겐타마이신으로 보충된 햄 F12 배지)를 사용하여 제조하였다. 0.2 g 시험 품목/mL 희석 배지의 희석 비를 사용하였다. 이 제제를 비희석하여 시험하였을 뿐만 아니라 희석된 1부 제제 + 3부 신선한 세포 배양 배지를 시험하였다.
양성 대조군 (소듐 라우릴 술페이트 (SLS), 0.2 mg/mL) 및 비처리 대조군 배양물 (또한 완전 세포 배양 배지로 처리된 음성 대조군으로서의 역할도 함)을 연구에 포함시켰다. 삼중 세포 배양물을 각각의 시험 시점에 48시간 동안 처리하였다. 대조군 처리는 적절한 반응을 생성하였으며, 이는 시험 시스템의 정확한 기능 및 민감성을 입증한다. 희석된 제제는 독성을 나타내지 않은 반면 (모든 경우에 세포독성 등급 0), 비희석 제제는 세포독성을 나타냈다 (모든 경우에 세포독성 등급 4).
이 연구의 시험 조건 (장기간 노출, 48시간) 하에, 비희석 WIS (0.25% 아세트산 및 200 ppm 차아염소산, pH: 4.3)는 배양된 L929 세포에 대한 세포독성 효과를 나타냈다. 이들 결과에 기초하여, WIS 0.25% 아세트산 및 200 ppm 차아염소산, pH: 4.3은 세포독성 등급이 >2였기 때문에 ISO 10993-5 및 USP<87>의 요건을 통과하지 못한 것으로 결론내려진다. 그러나, WIS (SOF 0001/05-01)의 희석된 제제는 독성을 나타내지 않았다 (모든 경우에 세포독성 등급 0).
실시예 10.2: WIS (200 및 448 ppm HOCl)의 시험관내 세포독성
이 연구에서, WIS (200 ppm HOC1, 0.25% 아세트산), SOF 003/53 (448 ppm HOC1, 1% 아세트산) 및 SOF 003/51 (200 ppm HOC1, 1% 아세트산) 제제의 시험관내 세포독성을 평가하였다. 적용된 시험관내 검정은 1, 4, 24 및 48시간 동안 제제에 대한 노출 후 파열된 세포 막으로부터의 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출 및 세포주 NCTC 클론 929 (L-929)에서의 대사 활성 (MTT)을 측정한다. 검정을 EUNCL SOP (EUNCL-GTA-03)에 따라 수행하였다.
모든 시험된 제제에 대해, 시험 농도 (10-0.005%) 및 노출 기간 (1, 4, 24 및 48시간)에서 유의한 막 파열은 측정되지 않았다.
ISO-10993-5 국제 표준의 가이드라인에 따르면, WIS 제제 중 어떠한 것도 2개의 가장 짧은 노출 기간 (1 및 4시간)에서 NCTC 클론 929 (L-929) 세포에서의 세포독성 효과 (즉, 세포 생존율의 30% 초과의 감소)를 유발하지 않았다.
24 및 48시간의 노출 후, WIS는 세포에 대한 세포독성 효과를 갖지 않은 반면 (즉, 세포 생존율의 30% 미만의 감소), SOF 003/53 및 SOF 003/51 제제는 이들 시점에서 세포독성을 유도하였다 (즉, 각각 24시간의 노출 후 40-45%만큼 및 48시간 후 55-60%만큼 생존율을 감소시킴).
실시예 11: 흡입 용액 (IS)의 유전자독성
IS를 사용한 GLP 시험관내 연구를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories, 헝가리)에서 수행하였다.
실시예 11.1: 시험관내 박테리아 역돌연변이 검정
본 발명의 흡입 용액을 박테리아 역돌연변이 검정을 사용하여 잠재적인 돌연변이유발 활성에 대해 시험하였다. 연구를 GLP에 따라 수행하였다.
페노바르비탈/β-나프토플라본-유도 래트의 간으로부터 제조된 미토콘드리아-후 상청액 (S9 분획)의 존재 및 부재 하에 히스티딘-요구 영양요구성 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 균주 (살모넬라 티피무리움 TA98, TA100, TA1535 및 TA1537) 및 트립토판-요구 영양요구성 에스케리키아 콜라이 균주 (에스케리키아 콜라이 WP2 uvrA)를 사용하여 실험을 수행하였다. 연구는 예비 상용성 시험 및 검정 1 (플레이트 혼입 방법)을 포함하였다. 하기 농도가 하기와 같이 적절한 기록과 함께 의뢰자에 의해 선택 및 제공되었다: 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm 및 500 ppm, 이들은 0.05, 0.1, 0.2 및 0.5 mg/mL와 등가임. 가장 높은 처리 부피 (500 μL)에서, 이들은 25, 50, 100 및 250 μg/플레이트와 등가였으며; 이들 농도를 검정 1에 사용하였다. 세포독성으로 인해, 각각 6.3 μL, 20 μL, 63.2 μL 및 200 μL의 공급 물질의 처리 부피를 사용하여 50ppm 시험 품목 농도: 0.3162, 1.0, 3.162 및 10 μg/플레이트의 플레이트당 보다 낮은 처리 부피로 추가의 처리 플레이트 농도를 또한 사용하였다. 최대 시험 농도는 250 μg/플레이트였고, 최소 시험 농도는 0.3162 μg 시험 품목/플레이트였다 (총 8가지 농도). 모든 검사된 박테리아 균주에서 250, 100 및 50 μg/플레이트 농도에서 대사 활성화 없이 및 250 μg/플레이트 농도에서 대사 활성화와 함께 시험 품목의 억제 세포독성 효과 (부재 / 약간 감소된 배경 론 발생)가 관찰되었다.
검정에서 복귀돌연변이주 콜로니의 수는 용매 대조군과 비교하여 임의의 생물학적으로 유의미한 증가를 나타내지 않았다. 재현가능한 용량-관련 경향은 없었고, 임의의 치료-관련 효과의 지표도 없었다.
이 돌연변이유발성 검정의 보고된 데이터는 시험 품목이 적용된 실험 조건 하에 사용된 균주의 게놈에서 염기 쌍 변화 또는 프레임시프트에 의한 유전자 돌연변이를 유도하지 않았고, 따라서 결론적으로 IS가 이 연구에 사용된 시험 조건 하에 돌연변이유발 활성을 갖지 않았음을 나타낸다.
실시예 11.2: 시험관내 포유동물 세포 소핵 검정
마우스 림프종 L5178Y TK+/- 3.7.2 C 세포를 사용하는 시험관내 소핵 시험에서 본 발명의 흡입 용액을 시험하였다. 연구를 GLP에 따라 수행하였다. 2가지 검정을 수행하였다 (검정 1 및 검정 2). 둘 다의 검정에서, 대사 활성화의 존재 하에 (S9-믹스의 존재 하에) 3-시간 처리 및 대사 활성화의 부재 하에 (S9-믹스의 부재 하에) 3-시간 및 24-시간 처리를 수행하였다. 처리 시작 24시간 후에 샘플링을 수행하였다.
검정 1에서의 시험 품목의 검사 농도 (대사 활성화의 존재 및 부재)는 하기와 같이 의뢰자에 의해 선택 및 제공되었다: 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm 및 500 ppm, 이들은 OECD 번호 487 가이드라인에서 결정 시 1 mL인 처리 값 (최종 처리 배지 중 10% (v/v))을 고려하여 0.05, 0.1, 0.2 및 0.5 mg/mL와 등가이다. 검정 1에서, 시험 품목의 과도한 세포독성이 관찰되었기 때문에 연구를 종결하였다. 선택된 농도 범위는 (적절한 세포독성 범위 내에서) 허용가능성 기준을 충족시키기기 위해 적어도 3가지 시험 농도를 평가하기에 충분히 개선되지 않았다. 세포 카운트의 상대적 증가 (RICC)가 <~40%인 임의의 결과는 검정에서 허용되지 않았고, 목표는 사용된 농도가 가이드라인 기준을 충족시키기에 충분하였음을 입증하기 위해 대략 40%-50%의 세포독성이 검정에서 달성되어야 하는 것이다. 따라서, 세포독성 효과에 관한 추가 정보를 제공하고 조절 허용성 기준을 충족시키기 위해 변형된 보다 밀접한 간격의 농도로 추가의 실험 (검정 2)을 수행하였다.
검정 2 (대사 활성화의 존재 및 부재)에서의 시험 품목의 검사 농도는 검정 1에서와 동일하였지만, 추가의 보다 낮은 처리 농도를 적용하였다. 따라서, 대사 활성화의 존재 하의 단기간 치료의 경우에 평가를 위해 10, 5 및 2 μg/mL (총 3가지)의 허용되는 농도를 선택하였고, 대사 활성화의 부재 하의 단기간 치료의 경우에 평가를 위해 6, 2 및 1 μg/mL (총 3가지)의 농도를 선택하였고, 대사 활성화의 부재 하의 장기간 치료의 경우에 평가를 위해 7, 6, 2 및 1 ppm (총 4가지)의 농도를 선택하였다. 처리 농도 중 어떠한 것도 대사 활성화의 존재 및 부재 하의 실험에서 적절한 음성 (비히클) 대조군 값과 비교하였을 때 소핵화 세포의 수의 생물학적으로 또는 통계적으로 유의한 증가를 유발하지 않았다.
결론적으로, IS는 대사 활성화의 존재 및 부재 하에 수행된 실험에서 소핵화 마우스 림프종 L5178Y TK+/- 3.7.2 C 세포의 빈도의 통계적으로 또는 생물학적으로 유의한 재현가능한 증가를 유발하지 않았다. 따라서, IS는 연구 조건 하에 이 시험 시스템에서 유전자독성이 아닌 것으로 간주되었다.
실시예 12: 다른 독성 연구
실시예 12.1: 시험관내 폐 계면활성제 기능성
본 발명의 흡입 용액을 폐 계면활성제 기능에 대한 그의 효과를 평가하기 위해 모의 폐포 모델에서 시험하였다. 폐 계면활성제는 폐 표면 장력을 감소시켜, 호흡 동안 정상적인 확장 및 수축을 가능하게 한다. 폐 계면활성제를 방해하는 에어로졸의 흡입은 독성 반응을 유도할 수 있다.
시험 방법은 모의 호흡 주기 동안 네뷸라이징된 IS에 적은 부피의 폐 계면활성제를 노출시키면서 폐 계면활성제 표면 장력을 정량화하는 것을 포함하였다. 표면 장력의 변화를 평가하였다.
방법
구속성 액적 계면활성측정계의 이전에 널리 기재된 일정한 관통 유동 설정을 사용하여 폐 계면활성제 기능에 대한 제품의 효과를 시험하였다. 이 방법은 생체내 연구와 비교하였을 때 유해 물질을 검출하는 데 있어서 100% 민감성을 나타냈다.
한 방울의 폐 계면활성제 (10 μg)를 폐 계면활성제의 모의 호흡 주기 동안 네뷸라이징된 500 ppm HOCl IS (5분에 걸쳐 5 mL)에 노출시켰다 (폐포를 모방하기 위함). 표면 장력을 축대칭 강하 진탕 분석에 의해 연속적으로 평가하여, 생체내 무기폐를 유도할 수 있는 잠재적인 임계적으로 낮은 표면 장력 (10 mN/m 미만)을 검출하였다.
결과
폐 계면활성제를 최고 농도 (500 ppm HOCl + 0.25% 아세트산, pH 5.5, 등장성)의 네뷸라이징 흡입 제품에 노출시켰을 때 폐 계면활성제 기능의 억제는 측정되지 않았다. 유사한 결과가 0.9% NaCl (대조군)에 대해 수득되었다.
실시예 12.2: 단리된 닭 눈 방법을 사용한 안구 자극 시험
용액이 입 및 코로 전달될 것이기 때문에, 눈에 가능한 자극 특성을 조사하기 위한 연구를 수행하였다. GLP 연구, 안구 자극에 대한 시험: 흡입 용액 (SIS)을 사용한 단리된 닭 눈 방법을 가이드라인 OECD 438에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 각각 500, 200, 100 또는 50 ppm 차아염소산 (HOCl)을 함유한 4가지 농도의 IS가 의뢰자에 의해 제공되었다. 연구를 2일에 걸쳐 수행하였고, 각각의 날을 실험 (즉, 실험 1 및 실험 2)으로 지칭하였다. 각각의 실험에서, 3개의 눈을 30 μL의 시험 품목 (실험 1에서 500 ppm 또는 200 ppm 및 실험 2에서 100 ppm 또는 50 ppm)으로 처리하였다. 각각의 실험에서, 3개의 양성 대조군 눈을 유사한 방식으로 30 μL의 5% (w/v) 벤즈알코늄 클로라이드 용액으로 처리하였다. 음성 대조군 눈을 30 μL의 생리 염수 (0.9% (w/v) NaCl 용액)로 처리하였다. 각막 두께, 각막 혼탁도 및 플루오레세인 보유율을 측정하고, 임의의 형태학적 효과 (예를 들어, 상피의 함몰 또는 느슨화)를 평가하였다.
연구에 사용된 모든 눈으로부터의 결과는 품질 관리 표준을 충족시켰다. 음성 대조군 및 양성 대조군 결과는 실험에서의 과거 대조군 데이터 범위 내에 있었다. 따라서, 연구는 유효한 것으로 간주되었다.
가이드라인에 따르면, 이 연구의 결과는 시험 물질이 비-자극성 또는 중증 자극성인 3개의 카테고리 중 하나에 할당되거나 또는 추가 정보에 대한 요구가 존재한다는 것이다. 상이한 농도의 흡입 용액 (SIS)을 사용한 단리된 닭 눈에서의 이러한 시험관내 눈 자극 검정에 기초하여, 500 ppm, 200 ppm 및 100 ppm 시험 품목 농도를 추가 정보를 필요로 하는 것으로 분류하였다. 생체내 연구는 이들 농도에서 지시된다. 50ppm 시험 품목 농도를 비-자극성으로서 분류하였다.
실시예 13: 흡입 용액 (IS)을 사용한 항박테리아 시험
본 발명의 흡입 용액을 플랑크톤성-성장 그람-양성 (스타필로코쿠스 아우레우스) 및 그람-음성 (슈도모나스 아에루기노사) 박테리아에 대한 항박테리아 검정에서 시험하였으며, 이는 10-25 ppm HOCl의 농도에서 둘 다의 박테리아의 효율적인 사멸을 나타냈다. 코펜하겐 대학교의 코스테르톤 바이오필름 센터에서 시험을 수행하였다. 이러한 시험의 결과가 하기 표 4에 제공된다.
Figure pct00007
결과: 표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 항박테리아 효과는 피. 아에루기노사에 대해 10 ppm HOCl에서 이미 관찰되었고, 박테리아 중 어느 것도 25 ppm HOCl에서 성장하지 않았다.
요약: 본 발명의 흡입 용액은 각각 25 ppm 및 10 ppm 이상의 HOCl 농도에서 그람-양성 (에스. 아우레우스) 및 그람-음성 박테리아 (피. 아에루기노사)를 효율적으로 근절한다. 모든 박테리아에 대한 완전한 효과는 IS 25 ppm HOCl에 대해 관찰되었다.
이들 관찰에 기초하여, IS의 제조 동안 임의의 잠재적 박테리아 오염은 HOCl의 광범위-스펙트럼의 항미생물 활성에 의해 제품에서 즉시 근절될 것임이 명백하다. 따라서, 박테리아가 내독소를 생산하기 때문에 임의의 내독소의 생산은 매우 가능성이 없다.
실시예 14: 백시니아 바이러스에 대한 IS의 표준 EN 14476에 따른 항바이러스 활성 (25 ppm HOCl로 시작함)
일반적인 살바이러스 활성에 대한 EN 14476은 화학적 소독제 및 방부제에 대해 수행된다. 이는 의료 영역에서의 살바이러스 활성의 평가를 위한 정량적 현탁 시험이고, 공인된 실험실에 의해 수행된다.
Figure pct00008
n.d.= 수행하지 않음
IS에 대한 결과: IS 50 ppm의 50% 희석물로서의 시험 제품인 25 ppm HOCl은 청정 조건 하에 1분의 노출 시간 후에 백시나 바이러스를 불활성화시킬 수 있었다 (표 5 참조). 따라서, 30 또는 60분 후에 활성을 측정하지 않았다. 감소 배율은 ≥4.25±0.33 (1분)이었다. EN 14476 표준에 따르면, 백시니아 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는 제품은 모든 외피보유 바이러스에 대해 활성인 것으로 간주된다.
손 및 표면 소독제에 대한 결과: 살생물 제품 규정에 따른 EN 시험을 또한 손 소독제 및 표면 소독제 용액 (HOCl, 200 ± 30 ppm, HAc 0.25%, pH 4.3)에 대해 수행하였다. 결과는 이. 콜라이, 진균, 효모 및 백시나 바이러스에 대한 항미생물 효율을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음).
요약: 모든 EN 시험은 손 소독제 및 표면 소독제에 대한 표준에 따라 1분 내지 30초 동안 효모, 진균, 박테리아 및 바이러스의 신속하고 효과적인 불활성화를 나타낸다. IS의 결과는 손 소독제 용액과 유의하게 상이하지 않았으며, 또한 25 ppm HOCl에서 유사한 소독 특성을 나타낸다.
실시예 15: 항미생물 유효성 시험
챌린지 시험은 USP42-NF37 2S 챕터<51> 효능 또는 Ph. Eur. 5.1.3 항미생물 보존에 따라 수행될 수 있다. 용액 배치 (pH 4.3, IS에 대한 대표적인 HOCl 배치)를 다양한 미생물로 챌린지하였으며, 하기에서, USP42-NF37 2S 챕터<51>에 따른 시험이 하기 표 6에 제시된다:
Figure pct00009
결과 및 요약: USP 42-NF37 2S 챕터<51>에 기재된 바와 같은 항미생물 효능 시험에 대한 허용 기준은 제14일 및 제28일 둘 다에서 모든 시험 미생물에 대해 충족되었다. 추가로, 최저 농도의 IS는 항미생물 유효성에 대해 USP42-NF37 2S 챕터 <51>에 따라 시험될 수 있다.
실시예 16: 최소 억제 농도 (MIC) 시험
IS를 대표하는 브로쓰 마이크로희석물 (최고 농도의 시험 물질, HOCl 용액, pH 4.3, 100 ppm HOCl의 희석물 + 1% 아세트산 희석물)에 의해 5종의 병원성 박테리아 균주에 대한 최소 억제 농도 (MIC)의 결정을 수행하였다. 마이크로타이터 트레이에서의 처리 후 24시간 동안 인큐베이션한 후, 광학 밀도를 측정하여 성장을 평가하였다. 추가로, 현탁액을 한천 상에 플레이팅하고, 다음 날 성장을 제어하였다. 코펜하겐 대학교, 보건 및 의료 과학부, 면역학 및 미생물학과의 바이오필름 시험 시설에서 모든 시험을 수행하였다.
Figure pct00010
결과: 시험된 모든 미생물에 대해 MIC는 25 ppm HOCl + 0.25% 아세트산이었다. 광학 밀도 (플레이트 판독기) 및 뮐러 힌톤 한천 플레이트 상에서의 성장 둘 다에 의해 성장을 결정하였다.
IS의 미생물학적 속성에 대한 결론
10 ppm HOCl에서 시작하는 본 발명의 흡입 용액 (IS) 제품, 뿐만 아니라 다른 대표적인 HOCl 제제로 수행된 항미생물 시험의 결과는, IS 제품이 탁월한 항미생물 활성을 갖는다는 것을 명확하게 지지하며, 따라서 본 발명자들은 또한 IS가 다른 대표적인 제품에 대해서와 같이 어떠한 미생물도 없이 전달될 것임을 확신한다. 이는 용액 중 HOCl의 산 형태가 매우 우세한 (≥99.1%) pH 4.3 및 pH 5.5 (SIS) 둘 다에서 제품 중 HOCl의 광범위-스펙트럼의 항미생물 활성으로 인한 것이다. 이는 또한 HOCl (산 형태)의 항미생물 활성에 대해 보고하고 있는 문헌 및 시장에서 이미 승인되고 판매된 다양한 건강 관리 제품 (예를 들어, 상처 관주/헹굼 용액)에서 미생물 성장을 억제하기 위한 보존제로서 HOCl이 사용되어 왔다는 것을 보고하고 있는 문헌에 의해 지지된다. 따라서, IS는 비-무균, 비-멸균 시설에서 제조된다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식에 따른 고체의 산화된 염소 염:
    M n+ [Cl (O) x ]n n-
    여기서 M은 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 전이 금속 이온 중 하나이고, n은 1 또는 2이고, x는 1, 2, 3 또는 4임;
    하기 화학식에 따른 활성화제:
    R1XOn(R2)m
    여기서 R1은 아미노, 아미도, 카르복실, 술폰 또는 히드록시 기로 임의로 치환된, 1 내지 10개의 수소화된 탄소 원자를 포함하고, X는 탄소, 인 및 황 중 하나이고, n 및 m은 각각 2 또는 3이고, R2는 H, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 전이 금속 이온 염 또는 암모늄 염 중 하나임; 및
    제약상 허용되는 희석제, 아주반트 또는 담체
    를 포함하는 항미생물 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화된 염소 염이 차아염소산의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염인 제제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 활성화제가 아세트산인 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산화된 염소 염이 아염소산의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염인 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 활성화제가 아세트산인 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 활성화제가 아세트산인 제제.
  7. 제1항에 있어서, 약 0.1 mOsm 내지 약 500 mOsm 범위의 오스몰랄농도를 갖는 제제.
  8. 제6항에 있어서, 약 4 내지 약 8의 pH를 갖는 제제.
  9. 제1항에 있어서, 점도-증진제를 추가로 포함하는 제제.
  10. 제9항에 있어서, 점도-증진제가 산화된 염소 염에 의한 산화에 대해 내성을 갖는 것인 제제.
  11. 제9항에 있어서, 점도-증진제가 수용성 겔화제를 포함하는 것인 제제.
  12. 제11항에 있어서, 수용성 겔화제가 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 술폰산 공중합체, 포스피노 폴리카르복실산, 폴리(아크릴산)-아크릴아미도알킬프로판 및 술폰산-술폰화 스티렌 삼원공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
  13. 제1항에 있어서, 비색 염료를 추가로 포함하는 제제.
  14. 제13항에 있어서, 염료가 환원-산화 염료인 제제.
  15. 제14항에 있어서, 염료의 색 및 색 강도가 산화된 염소 화합물의 산화 상태에 좌우되는 것인 제제.
  16. 제1항에 있어서, 수용액, 겔, 크림, 연고 또는 오일로 제제화된 제제.
  17. 제1항에 있어서, 다중-구획 용기에서 제조 및 저장된 제제.
  18. 제17항에 있어서, 유체 및 고체 성분이 상기 유체 및 고체 성분을 조합하여 조성물을 제조하기 전 별개의 각각의 구획 내에 함유되어 있는 것인 제제.
  19. 약 pH 5.5에서 약 25 ppm 내지 약 100 ppm의 차아염소산 및 약 0.25% 아세트산을 포함하는 흡입 제제.
  20. 제19항에 있어서, 혈액에 대해 등장성인 제제.
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