WO2019088683A1 - 피어스 1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

피어스 1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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pierce
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protein
cells
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성영훈
노재일
박완제
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김유진
오자현
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating cancer or inhibiting cancer metastasis comprising, as an active ingredient, an expression or activity inhibitor of Pierce 1 protein.
  • Cancer is a mass of cells composed of undifferentiated cells which, unlike normal cells, can regulate and inhibit proliferation and suppression according to the individual's needs, ignoring the necessary conditions in the tissues and is called a tumor.
  • These unlimited, proliferating cancer cells penetrate into surrounding tissues and, in the worse case, become metastasized to other organs of the body, resulting in severe pain and ultimately death.
  • the number of domestic cancer patients has continued to increase and has increased by about 44% over the past 10 years, and the international market for anticancer drugs has also increased to about $ 100 billion annually .
  • Retinoblastoma (Rb) and p53 gene are known to affect the expression of genes appear to mutations or disabled in the majority of cancers, of which Pierce 1 (Pierce 1) gene is overexpressed in the Rb deficient cells enterprise of p53 And it is known that the promoter of pierce 1 can be activated by p53. That is, it is known that the transcriptional activity of Pierce 1 can be affected by the absence / activation of Rb and p53, and thus it is known whether the generation of cancer can be regulated through transcription of pierce 1 gene or regulation of pierce 1 protein activity none.
  • the present inventors have made efforts to discover a novel use of the Pierce 1 gene.
  • the present inventors have found that in the cell and mouse model group suppressing the Pierce 1 gene, the growth and migration ability of the cancer cells as well as the tumor growth and cancer metastasis are significantly inhibited
  • the present invention has been accomplished by confirming that the Pierce 1 protein of the present invention or the gene encoding the same can be used as an active ingredient of a composition for cancer prevention, cancer treatment or cancer metastasis inhibition.
  • Pierce 1 gene can be transcriptionally regulated by p53, which is a cancer tumor gene, there is no known direct anticancer effect or inhibition of cancer metastasis through Pierce 1 gene.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for cancer prevention, treatment or inhibition of metastasis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting cancer, which contains, as an active ingredient, an expression or activity inhibitor of Pierce 1 protein.
  • the present invention also provides a health functional food for cancer prevention and improvement, which contains as an active ingredient an expression or activity inhibitor of Pierce 1 protein.
  • the Pierce 1 protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the expression or activity inhibitor of the Pierce 1 protein comprises an antisense nucleotide complementary to the mRNA of Pierce 1, siRNA, shRNA and ribozyme May be one or more selected from the group consisting of
  • the expression or activity inhibitor of Pierce 1 is selected from the group consisting of a compound, peptide, peptide mimetics, substrate analog, aptamer and antibody that complementarily bind to Pierce 1 protein It may be more than one selected.
  • the cancer may be any one or more selected from the group consisting of rectal cancer, colon cancer, ovarian cancer, kidney cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, melanoma, have.
  • the present invention also provides a method for screening candidate substances for cancer prevention, treatment or inhibition of metastasis.
  • the screening method may comprise the following steps:
  • the screening method may comprise the following steps:
  • the cancer may be any one or more selected from the group consisting of rectal cancer, colon cancer, ovarian cancer, kidney cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, melanoma, have.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising administering to a subject suffering from cancer a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of Pierce 1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient do.
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer metastasis comprising administering to a subject having cancer a pharmaceutical composition containing an effective amount of a pharmaceutically effective amount of Pierce 1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient .
  • the present invention also provides a method of promoting apoptosis or inhibiting cell migration comprising the step of treating Pierce 1 protein expression or activity inhibitor to hyperproliferative cells.
  • the present invention provides the use of a composition comprising Pierce 1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient for cancer prevention, treatment or inhibition of metastasis.
  • the present invention provides the use of a composition comprising Pierce 1 protein expression or activity inhibitor as an active ingredient for promoting hyperproliferative cell death or inhibiting cell migration.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing cancer, treating cancer or inhibiting metastasis, which comprises an expression or activity inhibitor of Pierce 1 as an active ingredient.
  • the expression of Pierce 1 gene or the activity of Pierce 1 protein Can be effectively used as an active ingredient of a composition for cancer prevention, treatment or metastasis inhibition, and can be screened for anticancer drug candidates using the expression of the Pierce 1 gene or the activity of Pierce 1 protein as a marker .
  • FIG. 1 shows the results of comparing the expression level of Pierce 1 with normal tissues in various cancers of the tissues.
  • FIG. 2 shows the survival curves of patients with lung cancer with high expression levels of Pierce 1 and those with low expression levels.
  • FIG. 3 shows the results of comparing Pierce 1 expression levels in tissues obtained from lung cancer patients and normal tissues.
  • FIG. 4 is a graph showing expression levels of Pierce 1 gene in various types of lung cancer patients
  • 4A and 4B show the results of comparing the expression levels of Pierce 1 in patients with lung cancer divided into stage I and II, large-cell lung cancer (large), and lung cancer (LA)
  • FIGS. 4c and 4d show the results of comparing the expression level of Pierce 1 in lung cancer patients divided into KRAS mutations, No value, KRAS wild type (KRAS WT) and KRAS mutation types (KRAS Mut).
  • FIG. 5 is a graph comparing pearls 1 expression levels and cell growth effects in various lung cancer cell lines
  • FIG. 5A shows the results of confirming the expression level of Pierce 1 in a cell line overexpressing HRAS G12V (hoeflich Cell Line)
  • FIG. 5B shows the results of inhibition of pearls 1 expression (siPrc # 1 and # 3) cell growth inhibition in KRAS-mutant lung cancer cells (KRAS m ) and normal WT lung cancer cells compared with the control group (siCTL).
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of the KRAS G12D inhibitory effect on the growth of cancer cells following the inhibition of Pierce 1 expression in a lung cancer cell line having KRAS G12D .
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of the KRAS G12D inhibitory effect on the growth of cancer cells following the inhibition of Pierce 1 expression in a lung cancer cell line having KRAS G12D .
  • FIG. 7 shows the results of confirming the effect of reducing the number of in vivo lung cancer lesions according to the suppression of Pierce 1 expression in a lung cancer-induced mouse model.
  • Fig. 8 shows the results of confirming in vivo tumor growth inhibition effect by suppression of Pierce 1 expression in a lung cancer mouse model by KRAS G12D .
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the type of mutation of Pierce 1 in various cancers, in particular, gene mutation in Pierce 1 in metastatic prostate cancer.
  • FIG. 10 shows the results of comparative analysis of the expression levels of Pierce 1 according to primary cancer and metastatic cancer in various types of cancer tissues and prostate cancer tissues.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in cells due to the suppression of Pierce 1 expression in the classical heterozygous melanoma cells
  • Fig. 11A shows that cultivation was carried out in a narrow area without unfolding according to Pierce 1 inhibition
  • FIG. 11B shows that the expression position of F-ACTIN, which is a metastatic marker, is changed.
  • FIG. 12 shows the results of confirming the cell growth inhibitory effect upon the suppression of Pierce 1 expression in the classical heteromain melanoma cells.
  • FIG. 13 shows the results of confirming the effect of inhibiting the cell migration ability by suppressing the expression of Pierce 1 in the classically heterogeneous melanoma cells.
  • FIG. 14 shows the results of confirming the effect of suppressing the cell migration ability by inhibiting the expression of Pierce 1 in the classically heterogeneous melanoma cells treated with the cell proliferation inhibitor.
  • FIG. 15 shows the results of confirming the killing effect of metastatic cancer cells upon Pierce 1 inhibition through anoikis assay in the classical heteromain melanoma cells.
  • FIG. 16 is a graph showing the in vivo inhibition of cancer metastasis by suppression of Pierce 1 expression in an experimental animal.
  • FIG. 16 is a graph showing the inhibition of tumor metastasis in the experimental animals and the survival and survival of lungs in mice injected with Pierce 1 knockdown cells and Pierce 1 expressing cells The results of comparing curves are shown.
  • Figure 17 shows the results of comparing the expression levels of Pierce 1 gene in various types of breast cancer.
  • Figure 18 shows the results of comparing the survival rates according to the expression levels of Pierce 1 in various types of breast cancer patients.
  • FIG. 19 shows the results of confirming the inhibitory effect of the ER-positive breast cancer cell line (MCF7) on the inhibition of pice 1 expression and cancer cell growth.
  • Fig. 20 shows the results of confirming the inhibitory effect on cell migration ability by suppression of Pierce 1 expression in ER-positive breast cancer cell lines.
  • FIG. 21 shows the results of confirming the inhibitory effect of pice 1 inhibition on the metastasis of breast cancer to lung in metastatic breast cancer experimental animals.
  • Figure 22 shows the results of comparing metastasis-free survival of patients with Pierce 1 expression in triple-negative breast cancer patients.
  • Figure 23 shows the results of comparing the inhibitory effects of the Pierce 1 inhibition on the migration ability of two kinds of Pierce 1 knockdown cells (KD # 2, # 3) in triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231).
  • Pierce 1 gene can be transcriptionally regulated by p53, a cancer tumor gene, there is no known direct anti-cancer effect of Pierce 1 gene.
  • the expression of Pierce 1 gene or the activity of Pierce 1 protein Can be effectively used as an active ingredient of a composition for cancer prevention, treatment or metastasis inhibition, and can be screened for anticancer drug candidates using the expression of the Pierce 1 gene or the activity of Pierce 1 protein as a marker .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or inhibiting cancer, which contains, as an active ingredient, an expression or activity inhibitor of Pierce 1 protein.
  • the " Pierce 1 " of the present invention is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Pierce 1 expression or activity inhibitor of the present invention is preferably one or more selected from the group consisting of antisense nucleotide, siRNA, shRNA and ribozyme complementarily binding to the mRNA of the gene encoding Pierce 1 But is not limited thereto.
  • the shRNA is preferably a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the shRNA may be amplified by chemical synthesis, amplification of a nucleotide sequence required by a polymerase chain reaction (PCR) Any of those which have been produced by a method known in the art as a method for producing siRNA, such as purifying an siRNA already present by synthesis, may be used.
  • Pierce 1 expression or activity inhibitor of the present invention is any one or more selected from the group consisting of a compound that binds complementarily to Pierce 1 protein, a peptide, peptide mimetics, a substrate analogue, an aptamer, But is not limited thereto.
  • the "cancer” of the present invention is more preferably any one or more selected from the group consisting of rectal cancer, colon cancer, ovarian cancer, kidney cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, melanoma and gastric cancer, Lung cancer, breast cancer, prostate cancer, and melanoma, but is not limited thereto.
  • the present inventors examined the expression levels of Pierce 1 in cancer patients of various tissues and found that the expression levels of Pierce 1 in patient tissues such as rectal cancer, colon cancer, ovarian cancer and kidney cancer (Fig. 1).
  • the inventors of the present invention have confirmed the antitumor effect by inhibiting the expression of Pierce 1 in lung cancer.
  • the expression of Pierce 1 was inhibited in various types of lung cancer patients, lung cancer cell lines and lung cancer mouse models, (Fig. 2 to Fig. 7 and Fig. 8).
  • the inventors of the present invention have confirmed the inhibition of cancer growth and cancer metastasis by inhibiting the expression of Pierce 1 in metastatic melanoma, and as a result, when knockout of Pierce 1 in hypertonic melanoma cells, cell proliferation ability and cell migration ability are decreased, It was confirmed that the death of metastatic cancer cells was increased (Figs. 12 to 15).
  • tumor formation in the lungs of a mouse model injected with a classical heterozygous melanoma cell line whereas in a mouse model injected with melanoma cells knocked out of Pierce 1, the formation of lung tumor tissue is inhibited and the survival rate is increased (Fig. 16).
  • the inventors of the present invention have confirmed the inhibition of cancer growth and suppression of cancer metastasis by inhibiting the expression of Pierce 1 in breast cancer, and as a result, the expression level of Pierce 1 is increased in most types of breast cancer (Fig. 17), and the specific HER2- , The survival rate was high when pice 1 expression was low and it was confirmed that the growth and migration ability of cancer cells were inhibited when the expression of pice 1 was inhibited in breast cancer cells, breast cancer patients and metastatic breast cancer test animals (FIGS. 19 to 19) 23).
  • the pierce 1 gene (Pierce1) of the present invention is to increase the expression in the cancer cells, as well as to suppress the cancer cell growth and tumor formation when suppressing it, can inhibit the metastasis of the cancer significantly, Pierce 1 gene ≪ / RTI > Inhibiting expression of Pierce 1 protein; Or Pierce 1 protein can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for cancer prevention, treatment or inhibition of metastasis.
  • the siRNA of the present invention may comprise a single strand of a sense-RNA strand homologous to the target sequence and a complementary antisense RNA strand, or a single strand of a stem-loop structure in which the sense strand and the antisense RNA strand are connected by a loop ,
  • the siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNAs paired with each other, and may have a hairpin structure that forms a stem-loop structure.
  • the siRNA may be a short hairpin RNA Quot;
  • the double-chain or stem portion may include a non-paired portion due to a mismatch (the corresponding base is not complementary), a bulge (no base corresponding to one chain), or the like.
  • the total length is 10 to 80 bases, preferably 15 to 60 bases, more preferably 20 to 40 bases.
  • the loop region has no special meaning in the sequence, and can be used without limitation if it has about 3-10 bases in order to connect the sense sequence and the antisense sequence at appropriate intervals.
  • the siRNA termini are both blunt or cohesive termini.
  • the sticky end structure can be a protruding structure with a 3 'end and a protruding structure with a 5' end, and the number of protruding bases is not limited.
  • the base water may be from 1 to 8 bases, preferably from 2 to 6 bases.
  • the siRNA can be added to a protruding portion of one end in a range where the effect of suppressing the expression of the target gene can be maintained, for example, a small RNA (for example, a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, ).
  • the siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure on both sides, and a stem loop structure in which one terminal region of double-stranded RNA is connected by linker RNA may be used.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the pairing of the stem portions.
  • compositions of the present invention may be of various oral or parenteral formulations.
  • buffers e.g., saline or PBS
  • antioxidants e.g., bacteriostats
  • chelating agents e.g., EDTA or glutathione
  • fillers e.g., extenders, binders, adjuvants Aluminum hydroxide
  • suspending agents thickening agents, disintegrating agents or surfactants, diluents or excipients.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch (cornstarch, wheat starch, rice starch, potatoes Starch and the like), calcium carbonate, sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol maltitol, cellulose, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose - It is prepared by mixing cellulose or gelatin. For example, tablets or tablets may be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, then milling it, adding suitable auxiliaries, and processing the mixture into granules.
  • excipient such as starch (cornstarch, wheat starch, rice starch, potatoes Starch and the like), calcium carbonate, sucrose, lactose, dextrose, sorbitol, mannitol, xylitol, ery
  • lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances or preservatives are included .
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid, or sodium alginate may optionally be added as a disintegrant, and may further include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations or suppositories.
  • non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
  • injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and may be administered externally for parenteral administration; Intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine, or intracerebral injection; Percutaneous administration agents; Or in the form of a nasal inhaler, according to methods known in the art.
  • suitable carriers for injectables include, but are not limited to, solvents or dispersion media containing water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils . More preferably, suitable carriers include isotonic solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose Etc. may be used.
  • solvents or dispersion media containing water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils . More preferably, suitable carriers include isotonic solutions such as Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine, or
  • injections may in most cases additionally include isotonic agents, such as sugars or sodium chloride.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and can be administered singly or in multiple doses.
  • the total effective amount of the composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and administered by a fractionated treatment protocol administered over a long period in multiple doses . It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • the daily dose is preferably 0.01 to 50 mg, more preferably 0.1 to 30 mg per kg of body weight per day on the basis of the cereal extract at the time of parenteral administration, and when administered orally, It may be administered in one to several divided doses so as to be preferably administered in an amount of 0.01 to 100 mg, more preferably 0.01 to 10 mg per kg of body weight per day on the basis of the composition.
  • the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.
  • the present invention also provides a health functional food for cancer prevention and improvement, which contains as an active ingredient an expression or activity inhibitor of Pierce 1 protein.
  • the " Pierce 1 " of the present invention is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Pierce 1 expression or activity inhibitor of the present invention is preferably one or more selected from the group consisting of antisense nucleotide, siRNA, shRNA and ribozyme complementarily binding to the mRNA of the gene encoding Pierce 1 But is not limited thereto.
  • the shRNA is preferably a nucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the shRNA may be amplified by chemical synthesis, amplification of a nucleotide sequence required by a polymerase chain reaction (PCR) Any of those which have been produced by a method known in the art as a method for producing siRNA, such as purifying an siRNA already present by synthesis, may be used.
  • Pierce 1 expression or activity inhibitor of the present invention is any one or more selected from the group consisting of a compound that binds complementarily to Pierce 1 protein, a peptide, peptide mimetics, a substrate analogue, an aptamer, But is not limited thereto.
  • the "cancer” of the present invention is more preferably any one or more selected from the group consisting of rectal cancer, colon cancer, ovarian cancer, renal cancer, rectal cancer, cervical cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, melanoma, Specifically, it is more preferable that it is at least one selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, prostate cancer and melanoma, but is not limited thereto.
  • Pierce 1 gene (Pierce1) of the present invention is cancer, and to increased expression in the cell, since it is possible to suppress significantly the metastasis of the cancer with the formation of cancer cells and tumor when inhibitory, inhibiting expression of Pierce 1 gene; Inhibiting expression of Pierce 1 protein; Or Pierce 1 protein can be usefully used as an active ingredient of a health functional food for cancer prevention and improvement.
  • the food composition according to the present invention can be prepared in various forms according to a conventional method known in the art.
  • Common foods include but are not limited to beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (eg, canned fruits, jam, maamalade, etc.), fish, meat and processed foods (Eg butter, chewing), edible vegetable oil, margarine (such as corn oil, etc.), breads and noodles (eg udon, buckwheat noodles, ramen noodles, spaghetti, macaroni, etc.), juice, various drinks, cookies, , Vegetable protein, retort food, frozen food, various kinds of seasoning (for example, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.).
  • beverages including alcoholic beverages
  • fruits and processed foods eg, canned fruits, jam, maamalade, etc.
  • fish meat and processed foods
  • Eg butter, chewing edible vegetable oil, margarine (such as corn oil, etc.)
  • breads and noodles eg udon, buckwheat noodles, ramen noodles
  • the nutritional supplement may be prepared by adding the composition of the present invention to capsules, tablets, rings, and the like.
  • the health functional foods include, but are not limited to, for example, liquefying, granulating, encapsulating and pulverizing the composition of the present invention in the form of tea, juice, and drink so as to be able to drink can do.
  • the composition of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared in the form of a powder or a concentrated liquid.
  • the composition of the present invention can be prepared in the form of a composition by mixing together with known active ingredients known to be effective for the prevention and improvement of metabolic diseases.
  • the health beverage composition may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient such as ordinary beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose, sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Xylitol, sorbitol, erythritol, and the like.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as tau Martin and stevia extract; Synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention may be contained as an active ingredient of a food composition for cancer prevention and improvement.
  • the amount thereof is not particularly limited to an amount effective for preventing and improving cancer, but it is preferably 0.01 To 100% by weight.
  • the food composition of the present invention can be prepared by mixing together with other active ingredients known to be effective for preventing and improving cancer.
  • the health food of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acid, protective colloid thickener, pH adjusting agent, Glycerin, an alcohol or a carbonating agent, and the like.
  • the health food of the present invention may contain natural fruit juice, fruit juice drink, or pulp for the production of vegetable drinks. These components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening candidate substances for cancer prevention, treatment, or metastasis inhibition, using the Pierce 1 protein or its expression gene mRNA as a marker.
  • the screening method of the present invention may comprise the following steps:
  • the measurement of step ii) may be performed using reverse transcription PCR, real time RT-PCR, Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA), immunohistochemical staining, immunoprecipitation, and immunofluorescence.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the expression level of the expression gene of Pierce 1 protein is preferably measured by performing reverse transcription PCR, real-time PCR or Northern blot, and the expression level of Pierce 1 protein is determined by Western blotting, immunohistochemistry, immunoprecipitation and immunofluorescence , But the present invention is not limited thereto. Any detection method used in the art for measuring the expression level of a gene or protein may be used.
  • screening method of the present invention may comprise the following steps:
  • the measurement of step ii) is preferably performed by any one selected from the group consisting of SDS-PAGE, immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chip, And any method known in the art for measuring the activity of a protein may be used.
  • the cancer is preferably one or more selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, and stomach cancer, but is not limited thereto.
  • Pierce 1 gene (Pierce1) of the present invention is to increase the expression in the cancer cells, when suppressing this it is possible to inhibit the formation of cancer cells and tumor significantly, Pierce 1 gene or pierce the first protein is a screening method of the anticancer drug candidates . ≪ / RTI >
  • Oncomain analysis was performed to obtain cancer tissue from Rectal adenoma and colon adenocarcinoma patients and to compare expression levels of Pierce 1 gene.
  • the KRAS mutation is one of the major genes responsible for lung cancer, accounting for about 25% of all lung cancer outbreaks.
  • the lung cancer patients were firstly divided into stage I and stage II, large cell and adenocarcinoma cells, and normal group according to KRAS mutation ), KRAS wild type (KRAS WT), and KRAS mutant (KRAS Mut), and Pierce 1 expression level was confirmed.
  • Fig. 5a Analysis of the microarray performed in Hoeflich study, as shown in, the result confirmed the expression of Pierce 1 after HRas G12V mutant is the expression, when the HRas G12V mutant amplification in the cancer cells, It was confirmed that the expression of Pierce 1 was increased (Fig. 5A).
  • A549 lung cancer cells with the KRas mutation were appropriately manipulated and used in the experiment.
  • 293T cells were transfected with PEI using an shRNA (sigma) sequence capable of inhibiting pice 1 expression (SEQ ID NO: 2 or 3)
  • shRNA shRNA sequence capable of inhibiting pice 1 expression
  • I made a lentivirus.
  • the cells were plated at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / culture dish in a 60 mm-sized culture dish and cultured.
  • the colony formation experiment was carried out by dividing the pearls 1 expression into normal and deteriorated cell groups. Cells of each culture dish were washed with 10 mM PBS (pH 7.2), fixed with 10% formalin, and stained with crystal violet to measure the number of colonies.
  • KRas-LA2 and Pierce 1 were confirmed in a mouse born by crossing a KRAS-LA2 mouse model and a Pierce 1 knockout mouse model.
  • a mouse model divided into a control group or an experimental group was bred in the same environment, and mice were sacrificed at 15 weeks of age to compare the lungs.
  • the type of mutation in Pierce 1 was analyzed through the C bioportal and oncomather databases, and in particular, the replication pattern of Pierce 1 in metastatic prostate cancer was analyzed.
  • pice 1 As the level of expression of pice 1 in primary cancer tissues has been increased, it has been confirmed that pice 1 can be a cancer metastasis inhibitory target in metastatic cancer, so that the expression level of pice 1 in actual metastatic cancer has been confirmed.
  • FIG. 10 it was confirmed that mRNA expression level of Pierce 1 was higher in metastatic cancer than in primary cancer in various kinds of cancer and prostate cancer (FIGS. 10A and 10B).
  • a comparative analysis of prostate cancer showed that the expression level of pice 1 in the prostate gland was higher than that of primary cancer, but lower than that of metastatic cancer (Fig. 10c) Respectively.
  • B16F10 cells a classical heterozygous melanoma cell line, were treated with shRNA (shP1) to induce decreased expression of Pierce 1, and the morphology was observed while the cells were cultured. Then, B16F10 cells were subcultured and the cells were fixed with paraformaldehyde 2 days later. Then, cells were immunostained using anti-F-ACTIN antibody and anti-paxillin antibody, and intracellular F-ACTIN and paxillin protein was confirmed.
  • shRNA shRNA
  • FIG. 11A it was confirmed that B16F10 cells of the control cell, Ctrl, were spread and compared with that of the control cell. 11A).
  • Fig. 11B F-ACTIN was found in whole cells like stem in control cells and paxillin was found under F-ACTIN, F-ACTIN disappeared in the cells with decreased expression of L-1, indicating that the cell movement was reduced at the molecular level (Fig. 11B).
  • B16F10 cells were treated with shRNA (shP1) to induce decreased expression of Pierce 1 and control cells were inoculated on a 6-well plate containing 1 x 10 5 cells per well and cultured, Respectively.
  • shRNA shRNA
  • control cells were inoculated on a 6-well plate containing 1 x 10 5 cells per well and cultured, Respectively.
  • 1 ⁇ 10 5 cells and 1 ⁇ 10 4 cells were added to 6-well and 60-mm plates and cultured, And 7 days later, cells were stained with crystal violet and observed. All experiments were carried out in triplicate independently (shCTL; experimental group: shP # 3, shP # 4 and shP # 5).
  • the wound healing assay was performed to determine if cell migration was decreased when Pierce 1 expression was decreased.
  • B16F10 cells were treated with shRNA (shP1) to induce a decrease in expression of Pierce 1 and control cells were inoculated in a 6-well plate at a rate of 2 ⁇ 10 5 cells and cultured in serum-free medium The next day, after scratching with a 200 [mu] l tip, the cells were further incubated to observe cell migration to the scratched area of the cells.
  • Serum medium was also added to the upper chamber of the transwell plate and coated at 37 ⁇ with a concentration of 200 ⁇ ⁇ / ml matrigel or 50 ⁇ ⁇ / ml fibronectin. Serum medium was added to the lower chamber on the following day, and the upper chamber coated with Matrigel or fibronectin was inoculated with 10 4 cells of Pierce 1 expression-suppressing cells and control cells together with serum-free medium and cultured for 2 days. After completion of the culture, cells were stained with crystal violet and observed.
  • FIG. 13 the wound healing analysis showed that the movement of metastatic cells was slowed down due to the decreased expression of Pierce 1, and the cell migration to scratch was delayed (FIGS. 13A and 13C).
  • FIG. 14 when B16F10 cells were cultured on matrigel or fibrinogen-coated plates, invasion of matrigel and migration to fibronectin were observed to be reduced by lowering of Pierce 1 expression (FIGS. 13B and 13D) .
  • FIG. 14 when cell proliferation was inhibited and cell migration ability was analyzed, it was confirmed that not only cell proliferation but also cell migration ability was inhibited by Pierce 1 knockdown (FIG. 14).
  • B16F10 cells or control cells (1 ⁇ 10 4 cells), which induced the expression of Pierce 1, were maintained in the medium for 3 days under the condition that the cells could not be adhered to the floor by an anoikis assay, 2 ⁇ M of Calcein-AM and 4 ⁇ M of EthD-1 were added to each cell and incubated for 30 min. The cells were observed by fluorescence microscope and viable cells and apoptotic cells were observed.
  • B16F10 cells inhibiting the expression of Pierce 1 or 2 x 10 5 control cells were injected into the tail vein of 3-week-old B6 mice and the mice were kept under normal conditions for 5 weeks. Five weeks after the injection of B16F10 cells, the mortality rate of the mice was determined, and the mice were sacrificed and the lungs were harvested. The formation of cancerous tissue was observed in the extracted lung, and the lung tissue sample was stained with hematoxylin & Eosin to confirm the formation of tumor cells in the tumor tissue.
  • Kaplan-Meiers survival curve analysis was performed to analyze the correlation between the type of breast cancer and the level of expression of Pierce 1 in patients.
  • MCF7 cells When the expression of Pierce 1 was decreased, the level of proliferation of MCF7 cells, an ER-positive breast cancer cell line, was observed. MCF7 cells were treated with shRNA to induce a decrease in expression of Pierce 1 and control cells were inoculated on a 6-well plate containing 2x10 5 cells per well and cultured, and the number of cells was counted every 3 days. Nine days after the initiation of the culture, the cells were then stained with crystal violet.
  • the wound healing assay was performed to confirm the cell migration ability of ER - positive MCF7 cell line by inhibiting Pierce 1 expression.
  • the experimental group two PIERCE1 knockdown (KD) cell lines
  • MCF7 cells control cells
  • the medium was replaced with 0.5% serum medium and cells were cultured. While the cells were being cultured, the cells were observed to migrate to the scratched area every two days, and the cell migration ability was confirmed.
  • MMTV-PyMT over-expressing mice and PIERCE1 KO mice were inoculated to induce breast cancer and their lung metastasis was observed.
  • the Pierce 1 gene is expressed in wild type (normal control, WT), heterozygous mutation Het) and knockout (KO) mice were prepared. The mice were then raised and sacrificed to 14-16 weeks of age to determine the number of breast metastasized to the lung. Breast cancer tumor tissues of sacrificed mice were obtained, homogenized and separated on a cell basis. MRNA was extracted from the cells isolated from the breast cancer tissue obtained and the mRNA expression level of Pierce 1 was confirmed by genotype.
  • Kaplan-Meiers survival curves were analyzed to determine the correlation between the type of breast cancer and the level of expression of Pierce 1 in patients.

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Abstract

본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 피어스 1 유전자(Pierce1)는 암 세포에서 발현 증가하여 있으며, 이를 억제하였을 때 암세포 및 종양의 형성을 유의적으로 억제할 수 있으므로, 피어스 1 유전자의 발현 억제; 피어스 1 단백질의 발현 억제; 또는 피어스 1 단백질의 활성 억제제는 암 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피어스 1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물
본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 치료용 또는 암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
암이란 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성된 세포덩어리로서 종양이라고도 한다. 이러한 무제한의 증식을 하는 암 세포는 주위의 조직으로 침투하고 더 심각한 경우는 신체의 다른 기관으로 전이가 되어 심각한 고통을 수반하고 결국 죽음을 초래하는 난치병이다. 의학의 발전에도 불구하고, 국내 암환자 발생자 수는 지속적으로 증가하여 최근 10년간 약 44%가 증가하였으며, 국제적으로도 항암제 시장 역시 증가하여 연간 약 1000억 달러의 규모를 가지는 것으로 보고된 바 있다.
Retinoblastoma(Rb) 및 p53 유전자는 대부분의 암에서 돌연변이 또는 비활성화로 나타나 관련 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 그 중 피어스 1(Pierce1) 유전자는 Rb가 결여된 세포에서 과발현되어 p53의 전사적 타겟이 될 수 있어, p53에 의해 피어스 1의 프로모터가 활성화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 즉, Rb 및 p53의 결여/활성화에 따라 피어스 1의 전사적 활성이 영향을 받을 수 있으나, 이로 인해 피어스 1 유전자의 전사 또는 피어스 1 단백질의 활성 조절을 통해 암 발생을 조절할 수 있는지 여부에 대하여는 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 피어스 1 유전자의 신규한 용도를 발굴하기 위해 노력한 결과, 피어스 1 유전자를 억제한 세포 및 마우스모델군에서 암세포의 성장 및 이주능뿐 아니라 종양의 성장 및 암 전이능이 유의적으로 억제하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 피어스 1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자는 암 예방, 암 치료 또는 암 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 피어스 1 유전자가 암종양유전자인 p53에 의해 전사 조절될 수 있음이 알려져 있음에도 불구하고, 피어스 1 유전자를 통해 직접적인 항암효과 또는 암 전이억제 효과에 대하여 알려진 바가 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피어스 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 피어스 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 피어스 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 피어스 1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 피어스 1의 발현 또는 활성 억제제는 피어스 1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 스크리닝 방법은 하기 단계로 이루어질 수 있다:
i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 스크리닝 방법은 하기 단계로 이루어질 수 있다:
i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질의 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 암은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 유효산 양의 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효산 양의 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 과증식성 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포사멸 촉진 또는 세포이동 억제 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 예방, 치료 또는 전이 억제 용도를 제공한다.
또한, 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 과증식성 세포사멸 촉진 또는 세포이동 억제 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 피어스 1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 피어스 1 유전자를 세포 수준에서 억제하였을 때 암세포의 성장 속도 및 이주능이 감소하고, 마우스 모델 수준에서 암 전이 및 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였으므로, 피어스 1 유전자의 발현 또는 피어스 1 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 피어스 1 유전자의 발현 또는 피어스 1단백질의 활성을 마커로 하여 항암제 후보물질을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 다양한 조직의 암에서 피어스 1의 발현 수준을 정상 조직과 비교한 결과를 보여준다.
도 2는 폐암 환자에서 피어스 1의 발현 수준이 높은 환자와 발현 수준이 낮은 환자 간의 생존곡선을 비교한 결과를 보여준다.
도 3은 폐암 환자에게서 얻은 조직과 정상 조직에서 피어스 1 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 4는 다양한 유형의 폐암 환자에서 피어스 1 유전자의 발현 수준을 확인한 도면으로,
도 4a와 b는 폐암 환자를 stage I 및 II로 나누거나, 대세포성 폐암 (large) 및 폐선 암종(LA)으로 나누어, 피어스 1의 발현수준을 비교한 결과를 보여주고,
도 4c와 d는 폐암 환자를 KRAS 변이 여부에 따라 정상군(No value), KRAS 야생형군(KRAS WT) 및 KRAS 변이군(KRAS Mut)으로 나누어 피어스 1의 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 5는 다양한 폐암 세포주에서 피어스 1 발현수준 및 세포 성장 효과를 비교한 도면으로,
도 5a는 에이치라스(HRasG12V)를 과발현하는 세포주(hoeflich Cell Line)에서 피어스1의 발현 수준을 확인한 결과를 보여주고,
도 5b는 KRAS 변이성 폐암세포(KRasm) 및 정상(WT) 폐암세포에서 피어스 1 발현 억제에 따른(siPrc#1과 #3) 세포성장 억제 효과를 대조군(siCTL)과 비교한 결과를 보여준다.
도 6은 케이라스 변이(KRasG12D)를 갖는 폐암 세포주에서 피어스 1 발현 억제에 따른 암세포 성장 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 7은 폐암유발 마우스 모델에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내(in vivo) 폐암 병변의 수 감소 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 8은 케이라스 변이(KRasG12D)에 의한 폐암 마우스 모델에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내(in vivo) 종양성장 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 9는 다양한 암에서 피어스 1의 변이 유형 분석, 특히 전이성 전립선 암에서의 피어스1의 유전자 변이를 분석한 결과를 보여준다.
도 10은 여러 종류의 암조직 및 전립선 암 조직에서 원발성 암과 전이성 암에 따른 피어스 1의 발현 수준을 비교 분석한 결과를 보여준다.
도 11은 고전이성 흑색종 세포에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 세포의 변화를 확인한 도면으로,
도 11a는 피어스 1 억제에 따라 펼쳐지지 않고 좁은 면적에서 배양되는 것을 확인한 것이고,
도 11b는 전이성 마커인 F-ACTIN의 발현 위치가 변하는 것을 확인한 것이다.
도 12는 고전이성 흑색종 세포에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 세포성장 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 13은 고전이성 흑색종 세포에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 세포 이동능력 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 세포 증식 억제제를 처리한 고전이성 흑색종 세포에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 세포 이동능력 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 15는 고전이성 흑색종 세포에서 아노이키스 분석(anoikis assay)을 통해 피어스 1 억제에 따른 전이성 암세포의 사멸 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 16은 실험동물에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내(in vivo) 암 전이 억제 효과를 확인한 도면으로 피어스 1 넉다운 세포를 주입한 마우스와 피어스 1 발현 세포를 주입한 마우스에서 폐로의 전이 여부 및 생존곡선을 비교한 결과를 보여준다.
도 17은 다양한 유형의 유방암에서 피어스 1 유전자의 발현 수준을 비교한 결과를 보여준다.
도 18은 다양한 유형의 유방암 환자에서 피어스 1의 발현 수준에 따른 생존률을 비교한 결과를 보여준다.
도 19는 ER 양성 유방암 세포주(MCF7)에서 피어스 1 발현 억제에 따른 암세포 성장 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 20은 ER 양성 유방암 세포주에서 피어스 1 발현 억제에 따른 세포 이동능력 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 21은 전이성 유방암 실험동물에서 피어스 1 억제에 따른 유방암의 폐로의 전이 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 22는 삼중음성유방암 환자에서 피어스 1 발현에 따른 환자의 무전이 생존률(metastasis-free survival)을 비교한 결과를 보여준다.
도 23은 삼중음성 유방암 세포(MDA-MB-231)에서 피어스 1 억제에 따른 대조군, 2종류의 피어스 1 넉다운 세포(KD#2, #3)의 이동능력 억제 효과 비교한 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 피어스 1 유전자가 암종양 유전자인 p53에 의해 전사 조절될 수 있음이 알려져 있음에도 불구하고, 피어스 1 유전자의 직접적인 항암효과에 대하여 알려진 바가 없었다.
본 발명의 피어스 1 유전자를 세포 수준에서 억제하였을 때 암세포의 성장 속도 및 이주능이 감소하고, 마우스 모델 수준에서 암 전이 및 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였으므로, 피어스 1 유전자의 발현 또는 피어스 1 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질은 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 피어스 1 유전자의 발현 또는 피어스 1 단백질의 활성을 마커로 하여 항암제 후보물질을 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본 발명은 피어스 1(Pierce1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 "피어스 1"는 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 "피어스 1의 발현 또는 활성 억제제"는 피어스 1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 shRNA는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제하는 등 당업계에 siRNA 제조 방법으로서 공지된 방법으로 제조된 것이라면 어떤 것을 사용하여도 좋다.
본 발명의 "피어스 1의 발현 또는 활성 억제제"는 피어스 1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 "암"은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로 폐암, 유방암, 전립선암 및 흑색종으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 다양한 조직의 암 환자를 대상으로 하여 피어스 1의 발현 수준을 확인한 결과, 직장암, 대장암, 난소암 및 신장암 등의 환자 조직에서 피어스 1의 발현 수준이 유의적으로 높은 것을 확인하였다(도 1).
또한, 본 발명자들은 폐암에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 항암 효과를 확인한 결과, 다양한 유형의 폐암 환자, 폐암 세포주 및 폐암 마우스 모델에서 피어스 1의 발현을 억제하였을 때 세포 성장 속도가 저하되며, 생체 내에서 종양 형성 또한 감소되는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 7과 8).
또한, 본 발명자들은 다양한 전이성 암에서 피어스 1의 발현 수준이 유의적으로 증가되어 있으며, 특히 전이성 전립선 암에서 피어스 1의 발현이 높은 수준으로 나타나 있는 것을 확인하였다(도 9 및 10).
또한, 본 발명자들은 전이성 흑색종에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 암 성장 억제 및 암 전이 억제 효과를 확인한 결과, 고전이성 흑색종 세포에서 피어스 1을 넉아웃 하였을 때 세포 증식능, 세포 이주능이 감소하고, 전이성 암세포의 사멸이 증가되는 것을 확인하였다(도 12 내지 도 15). 이와 함께, 고전이성 흑색종 세포주를 주입한 마우스 모델의 폐에서 종양이 형성되는 반면, 피어스 1를 넉아웃한 흑색종 세포를 주입한 마우스 모델에서는 폐 종양 조직의 형성이 억제되어 생존율이 증가하는 것을 확인하였다(도 16).
또한, 본 발명자들은 유방암에서 피어스 1의 발현 억제에 따른 암 성장 억제 및 암 전이 억제 효과를 확인한 결과, 대부분의 유방암 종류에서 피어스 1의 발현 수준이 증가하여 있으며(도 17), 특이 HER2 발현성 유방암의 경우 피어스1 발현이 낮을 때 생존율이 높음을 보이며, 유방암 세포, 유방암 환자 및 전이성 유방암 실험동물에서 피어스 1의 발현을 억제하였을 때, 암 세포의 성장 및 이주능이 억제되는 것을 확인하였다(도 19 내지 23).
따라서, 본 발명의 피어스 1 유전자(Pierce1)는 암 세포에서 발현 증가하여 있으며, 이를 억제하였을 때 암세포 성장과 종양형성을 억제할 뿐 아니라, 암의 전이를 유의적으로 억제할 수 있으므로, 피어스 1 유전자의 발현 억제; 피어스 1 단백질의 발현 억제; 또는 피어스 1 단백질의 활성 억제제는 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있으며,
상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 한정되지 않고 사용할 수 있다.
siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 곡류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 조성물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 피어스 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 "피어스 1"는 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 "피어스 1의 발현 또는 활성 억제제"는 피어스 1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 shRNA는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제하는 등 당업계에 siRNA 제조 방법으로서 공지된 방법으로 제조된 것이라면 어떤 것을 사용하여도 좋다.
본 발명의 "피어스 1의 발현 또는 활성 억제제"는 피어스 1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 "암"은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 직장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하며, 구체적으로 폐암, 유방암, 전립선암 및 흑색종으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 피어스 1 유전자(Pierce1)는 암 세포에서 발현 증가하여 있으며, 이를 억제하였을 때 암세포 및 종양의 형성과 함께 암의 전이를 유의적으로 억제할 수 있으므로, 피어스 1 유전자의 발현 억제; 피어스 1 단백질의 발현 억제; 또는 피어스 1 단백질의 활성 억제제는 암 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물과 대사성 질병의 예방 및 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 0.03 g 이다.
또한, 본 발명의 조성물은 암 예방 및 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 암 예방 및 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 암 예방 및 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA를 마커로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 하기 단계로 구성될 수 있다:
i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 단계 ii)의 측정은 역전사 PCR (Reverse Transcription PCR), 실시간 PCR(real time RT-PCR), 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 피어스 1 단백질의 발현 유전자의 발현 수준은 역전사 PCR, 실시간 PCR 또는 노던 블롯을 수행하여 측정하는 것이 바람직하며, 피어스 1 단백질의 발현 수준은 웨스턴블랏, 면역조직화학 염색법, 면역침강 및 면역형광법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고, 당업계에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해 사용하는 검출 방법은 어떤 것을 사용하여도 무방하다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법은 하기 단계로 구성될 수 있다:
i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질의 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 단계 ii)의 측정은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에서 단백질의 활성을 측정하기 위해 알려진 방법이라면 어떤 것을 사용하여도 무방하다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 피어스 1 유전자(Pierce1)는 암 세포에서 발현 증가하여 있으며, 이를 억제하였을 때 암세포 및 종양의 형성을 유의적으로 억제할 수 있으므로, 피어스 1 유전자 또는 피어스 1 단백질은 항암제 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
다양한 유형의 암에서 피어스 1 발현 수준의 변화 확인
피어스 1(PIERCE 1)의 발현에 따른 암 발병과의 상호관계를 분석하였다.
온코마인(oncomain) 분석을 수행하여, 직장암(Rectal adenoma) 및 대장암(colon adenocarcinoma), 환자로부터 암 조직을 수득하여, 피어스 1 유전자의 발현 수준을 비교하였다.
그 결과, [도 1]에서 나타난 바와 같이 직장암 및 대장암에서 피어스 1의 발현 수준이 정상 조직에 비해 증가한 것을 확인하였으며, 이를 통해 암 발병에 피어스 1이 다양한 암의 발병과 관련되어 있을 것으로 예상하였다. 또한, 대장암의 종양 크기에 따라 피어스 1의 발현 수준을 분석하였을 때, 대장암 종양의 크기가 커짐에 따라 피어스 1의 발현 수준이 보다 증가하는 것으로 확인하여, 암의 발병뿐 아니라 진행에 있어서도 피어스 1의 발현이 직접적인 영향을 줄 수 있을 것으로 예상하였다(도 1).
[실시예 2]
폐암에서 피어스 1 발현 억제에 따른 종양성장 억제 효과 확인
<2-1> 폐암 환자에서 피어스 1의 발현 수준에 따른 생존 곡선 분석
암 환자에서 피어스 1의 발현 수준이 증가하여있음을 확인하여, 피어스 1 발현 수준에 따라 폐암 환자에서도 예후 양상의 차이를 나타내는지 확인하였다. Kaplan-Meiers 생존 곡선 분석을 통해 피어스 1의 발현 수준에 따른 전체 생존률(overall survival) 및 암 무진행 생존률(progression free survival)을 확인하였다.
그 결과, [도 2]에서 나타난 바와 같이 피어스 1의 발현 수준이 낮은 군에 속한 환자들에서 전체 생존률 및 암 무진행 생존률이 모두 높은 수준으로 나타나는 것으로 확인하였다(도 2).
<2-2> 폐암 환자의 조직에서 피어스 1의 발현 수준 확인
사람의 폐암에서 피어스 1의 발현 수준을 확인하기 위해 151명의 폐암 환자에서 얻은 조직 및 정상 조직에서 피어스 1의 발현을 확인하였다.
먼저 폐암 면역항체화학법을 통해 폐암 조직에 있는 피어스 1의 발현을 확인하였고(도 3a), 정상세포에서 확인되는 피어스 1을 low, 폐암 조직 중 20-40%를 middle, 그리고 41%이상을 high로 놨을 때 피어스 1이 71명의 환자에서 middle로, 그리고 55명의 환자에서 high로 발견되었으며, 총 126명의 폐암 조직에서 피어스 1이 과발현된 것을 확인하였다(도 3b).
<2-3> 다양한 유형의 폐암 환자에서 피어스 1의 발현 수준 확인
KRAS 변이는 폐암 유발의 주요 유전자 중 하나로, 전체 폐암 발병 원인 중 약 25%를 차지한다. 피어스 1 유전자의 발현이 암세포 관련 유전자에 의해 영향을 받을 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 폐암 환자를 stage I과 stage II, 대세포와 선암세포, 및 KRAS 성 변이 여부에 따라 정상군(No value), KRAS 야생형군(KRAS WT) 및 KRAS 변이군(KRAS Mut)으로 나누어, 피어스 1 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, [도 4]에서 나타난 바와 같이, 폐암 환자 중 stage II 폐암 및 선암세포에서 피어스 1의 발현이 증가되어 있었으며, 특히 선암세포 내 KRAS 변이군에서 KRAS 야생형군에 비해 피어스 1의 발현 수준이 유의적으로 증가되어 있는 것을 확인하였다.
이와 함께, KRAS 뿐 아니라 HRAS 발현에 있어서도 피어스 1 발현과의 연관성을 확인하고자, HRasG12V를 과발현시킨 세포에서 피어스 1의 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, [도 5a]에서 나타난 바와 같이 Hoeflich 연구에서 수행한 마이크로어레이를 분석한 결과, HRasG12V변이체가 과 발현 후에 피어스 1의 발현 정도를 확인한 결과, 암세포 내에서 HRasG12V 변이체가 증폭되었을 때, 피어스 1의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 5a).
또한 추가적인 KRAS 변이성 폐암 2종과 KRAS 정상 폐암 5종에서 피어스 1 발현에 따른 세포 성장 변화 정도를 확인하였다. 먼저 세포를 12 well dish에 배양 후 피어스 1 및 대조군에 대한 siRNA를 lipofectamine RNAiMAX로 transfection한 뒤 72시간 후 crystal violet으로 세포를 염색하였다.
그 결과, [도 5b]에서 나타난 바와 같이 모든 KRAS 변이(KRasm) 폐암에서 피어스 1 발현 저하에 따른 성장 억제가 관찰되었으며, KRAS 정상세포(WT)에서는 5종 중 3종에서 피어스 1 억제에 따른 성장 지연 효능을 확인하였다(도 5b).
<2-4> 폐암 세포주에서 피어스1 발현 억제에 따른 암세포 성장 억제 효과 확인
폐암세포에서 피어스 1의 발현 수준에 따라 콜로니 형성 수준과 관련성이 있는지를 확인하기 위하여, KRas 변이를 가지는 암세포주인 A549 폐 종양세포를 적절히 조작하여 실험에 사용하였다.
피어스 1 발현 저하 암세포주를 제작하기 위해, 피어스 1 발현을 억제시킬 수 있는 shRNA (sigma) 시퀀스(서열번호 2 또는 3)를 사용하여 293T cell 에 PEI 로 Transfection 한 후 24시간 간격으로 상층액을 회수하여 렌티바이러스를 만들었다. 이를 원하는 A549 폐 종양세포주에 polybrene과 같이 넣어 접종을 시키고, puromycin을 이용하여 피어스 1 넉다운 세포주를 선택하였다. 위의 세포를 60 mm 크기의 배양접시에 5×104 세포/배양접시의 밀도로 분주하고 배양하여 피어스 1 의 발현이 정상인 세포군과 저하된 세포군으로 나누어 콜로니 형성(Colony Formation) 실험을 수행하였다. 각 배양접시의 세포들을 10 mM PBS (pH7.2)로 세척하고 10% 포르말린(Formalin)으로 고정시킨 뒤 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색하여 콜로니 수를 측정하였다.
그 결과, [도 6]에서와 같이, shRNA로 피어스 1의 발현을 억제한 폐암 세포에서 대조군에 비해 피어스 1의 mRNA 발현 수준이 억제되는 것을 확인하였다(도 6a). 또한, A549 폐 종양세포의 콜로니 형성이 피어스 1의 발현이 저하 되었을 시 감소되었으며 이는 세포의 성장 속도가 감소하였기 때문인 것으로 확인하였다(도 6b 및 도 6c).
<2-5> 폐암유발 마우스 모델에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내( in vivo ) 종양성장 억제 효과 확인
세포 수준에서 피어스 1의 발현을 억제하면 암세포의 성장 속도가 감소하는 것을 확인하였으므로, 생체 내(in vivo)에서도 피어스 1 발현 억제에 의해 종양 형성이 억제될 수 있는지 확인하였다.
먼저, 우레탄(Urethane)에 의한 폐암 형성에서의 피어스 1의 발현 저하에 따른 효과를 확인하기 위해서 FVB 배경의 1 개월령 정상 마우스(n = 7)와 피어스 1 녹아웃(n = 9) 마우스에 1 g/kg 우레탄을 1주일에 한 번씩 4번 투여하여 폐암 마우스모델을 제조하였다. 제조된 마우스모델은 3개월 동안 사육한 다음, 희생하여 마우스의 폐를 관찰하였다.
그 결과, [도 7]에서와 같이, 피어스 1 녹아웃 마우스의 경우에 정상 마우스 대비하여 폐암 병변의 수가 줄어 들었으며 조직검사 결과를 기반으로 평가 시에도 발병률이 상당히 약화되었음을 확인하였다(도 7).
<2-6> KRAS변이 마우스 모델에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내( in vivo ) 종양성장 억제 효과 확인
KRasG12D 변이에 의한 폐암 마우스 모델에서의 피어스 1 발현 저하 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
케이라스-엘에이2(KRas-LA2) 마우스 모델과 피어스 1 녹아웃 마우스 모델을 교배시켜 태어난 마우스 중에서, KRas-LA2 및 피어스 1의 발현 여부를 확인하였다. 확인 후, Kras-LA2(KI/+), Pierce1(+/+)인 마우스는 대조군(n=12)으로 사용하였고, Kras-LA2 (KI/+), Pierce1(-/-)인 마우스는 실험군(n=12)으로 사용하였다. 각각 대조군 또는 실험군으로 나눈 마우스 모델을 동일 환경에서 사육하고, 15주령일 때 마우스를 희생하여 폐를 비교 관찰하였다.
그 결과, [도 8]에서와 같이, 피어스 1 녹아웃 마우스의 경우에 대조군 대비하여 병변의 수와 크기에 있어서 현저하게 줄어들었으며 이는 통계학적으로 매우 유의성이 있는 결과를 얻었다(도 8a 및 8b). 동시에 각 마우스에서 얻어진 폐암 샘플을 가지고 H&E 염색을 통해 40×, 100× 의 배율로 관찰한 결과에서도 상기의 결과를 일치함을 확인하였다(도 8c).
[실시예 3]
전이성 암에서 피어스 1의 변이 유형 및 발현 수준의 변화 확인
<3-1> 다양한 암에서 피어스 1의 변이 유형 분석 및 전이성 암에서의 복제 양상 분석
다양한 암에서 피어스 1의 변이 유형을 씨바이오포탈(C bioportal) 및 온코마인 데이터베이스를 통해 분석하였으며 특히 전이성 전립선 암에서의 피어스 1의 복제 양상에 대해 분석을 수행하였다.
그 결과, [도 9]에서 나타난 바와 같이, 전립선 암과 같은 대부분의 암에서 2% 미만으로 피어스 1 유전자에 변형이 나타남을 확인하였다. 이 중 전이성 전립선 암에서 피어스 1이 20% 이상 증폭 되어 있으며, 이는 여러 전이성 암에서 피어스 1이 과 발현되어 있는 온코마인 데이터베이스 분석과 상응하는 결과로 볼 수 있었다. 반면에 비전이성 전립선 암에서는 큰 차이를 볼 수 없었다. 이는 전이성 암에서 피어스 1이 중요하게 작용할 수 있으며, 이러한 암 전이를 억제하는데 중요한 타겟이 될 수 있음을 시사한다(도 9).
<3-2> 전이성 암에서 피어스 1의 발현 수준 확인
원발성 암조직에서 피어스 1의 발현 수준이 증가하는 바와 더불어, 전이성 암에서 피어스 1이 암 전이 억제 타깃이 될 수 있음을 확인하였으므로, 실제 전이성 암에서 피어스 1의 발현 수준을 확인하였다.
온코마인(oncomain) 분석을 수행하여, 여러 종류의 암조직(multi cancer) 및 전립선 암조직에서 원발성 암(primary cancer) 및 전이성 암에 따른 피어스 1의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, [도 10]에서 나타난 바와 같이 여러 종류의 암 및 전립선 암에서 원발암보다 전이성 암에서 피어스 1의 mRNA 발현 수준이 높은 것으로 확인하였다(도 10a 및 도 10b). 특히, 전립선 암을 비교 분석한 결과, 전립샘(prostate gland)에서 피어스 1의 발현 수준은 원발성 암보다 높은 반면, 전이성 암보다 낮은 것을 확인하여(도 10c), 전이성 암에서 피어스 1의 발현 수준이 보다 높은 것으로 확인하였다.
[실시예 4]
전이성 흑색종에서 피어스 1 발현 억제에 따른 종양성장 억제 및 전이 억제 효과의 확인
<4-1> 고전이성 암에서 피어스 1 발현 억제에 따른 세포 특징 확인
전이성 암에서 피어스 1의 발현 수준이 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였으므로, 피어스 1의 발현을 억제하여 전이성 암세포주의 특징을 확인하였다. 고전이성 흑색종 세포주인 B16F10 세포에 shRNA(shP1)을 처리하여 피어스 1의 발현 저하를 유도한 뒤, 세포를 배양하면서 형태를 관찰하였다. 그런 다음, B16F10 세포를 계대 배양하고 2일 뒤 파라포름알데하이드로 세포를 고정시킨 후, 항-F-ACTIN 항체 및 항-paxillin 항체를 이용하여 세포를 면역 염색하여, 세포 내 F-ACTIN 및 paxillin 단백질의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, [도 11a]에서 나타난 바와 같이 대조군 세포인 Ctrl의 B16F10 세포가 퍼져서 자라는 형태를 나타내는 것에 비해, 피어스 1의 발현이 저하되면서 세포움직임 저하에 따른 세포가 뭉치는 현상을 나타내는 것으로 확인하였다(도 11a). 또한, 세포 내 전이성 마커의 발현을 확인한 결과, [도 11b]에서 나타난 바와 같이 대조군 세포에서는 F-ACTIN이 줄기처럼 세포 전체에 형성되어 있으며, F-ACTIN 밑에 paxillin이 위치해 있는 것으로 확인되는 반면, 피어스 1의 발현이 저하된 세포에서는 F-ACTIN이 사라지는 것으로 확인하여, 세포의 움직임이 저하되는 것을 분자수준에서 확인하였다(도 11b).
<4-2> 피어스 1 발현 저하에 의한 전이성 흑색종 세포성장 억제 효과 확인
피어스 1의 발현을 저하하였을 때 B16F10세포 증식 수준의 변화를 확인하였다. B16F10 세포에 shRNA(shP1)을 처리하여 피어스 1의 발현 저하를 유도한 실험군 세포 및 대조군 세포를 1×105 세포씩 배지가 포함된 6-웰 플레이트에 접종하여 배양하면서, 하루에 한번씩 세포 수를 계수하였다. 이와 함께, 세포 생장 및 콜로니 형성능(colony forming activity)을 확인하기 위해 6-웰 및 60 mm 플레이트에 실험군 세포 또는 대조군 세포를 1×105 세포 및 1×104 세포씩 분주하고 배양하여, 5일 및 7일 후에 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 관찰하였다. 모든 실험은 동일한 조건에서 독립적으로 3 회 반복하여 실험을 수행하였다(대조군명: shCTL; 실험군명: shP#3, shP#4 및 shP#5).
그 결과, [도 12]에서 나타난 바와 같이 피어스 1의 발현이 저하됨에 따라 전이성 흑색종 세포주의 증식 속도가 감소하는 것을 통해 세포 분열 속도가 감소하는 것을 확인하였다(도 12a). 또한, 세포 생장 및 콜로니 형성능을 크리스탈 바이올렛 염색하여 확인하였을 때 역시, 피어스 1 넉다운에 의해 세포 생장 및 콜로니 형성이 대조군 세포에 비해 감소되는 것을 확인하였다(도 12b 및 도 12c).
<4-3> 피어스 1 발현 저하에 의한 전이성 흑색종 세포 이동능력 억제 효과의 확인
피어스 1의 발현을 저하하였을 때 세포 이동능이 저하하는지 확인하기 위해 wound healing 분석을 수행하였다. B16F10 세포에 shRNA(shP1)을 처리하여 피어스 1의 발현 저하를 유도한 실험군 세포 및 대조군 세포를 각각 6-웰 플레이트에 2×105 세포씩 접종하여 무혈청 배지(serum-free media)에서 배양을 개시하고, 다음날 200 ㎕ 팁으로 스크래치를 낸 후, 하루를 추가 배양하여 세포의 스크래치된 영역으로의 세포 이동을 관찰하였다.
또한, 트랜스웰 플레이트의 위쪽 챔버에 혈청 배지를 가하고, 200 ㎍/㎖ 매트리겔(matrigel) 또는 50 ㎍/㎖ 피브로넥틴(fibronetic)의 농도로 37℃에서 코팅하였다. 다음날 아래쪽 챔버에는 혈청 배지를 가하고, 매트리겔 또는 피브로넥틴이 코팅된 위쪽 챔버에는 무혈청 배지와 함께 104 세포의 피어스 1 발현 억제 세포 및 대조군 세포를 접종하여 2 일 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하여 관찰하였다.
세포 증식 억제에 따른 세포이동 억제와 비슷한 현상이 발생하므로 세포의 성장과 별개로 이주능 변화 연구를 위해 세포 증식을 억제한 환경에서 이주능 연구가 필요하다. 세포 증식을 억제한 환경에서 세포 이주능을 확인하기 위해, 피어스 1의 발현 저하를 유도한 실험군 세포 및 대조군 세포에 DNA 중합 억제제인 시스테인 β-D-아라비노퓨라노시드(Cytosine β-D-arabinofuranoside)을 10 μM 농도로 처리하여 세포 증식을 억제한 후, 위와 동일한 방법으로 wound healing 분석을 수행하였다.
그 결과, [도 13]에서 나타난 바와 같이 Wound healing 분석을 통해 피어스 1의 발현 저하를 통해 전이성 세포의 움직임이 저하되어 스크래치로의 세포 이동이 늦춰지는 것을 확인하였다(도 13a 및 도 13c). 이와 함께 매트리겔 또는 피브리노겐을 코팅한 플레이트에서 B16F10 세포를 배양하였을 때, 피어스 1 발현 저하에 의해 매트리겔에 대한 침범(invasion) 및 피브로넥틴에 대한 이주가 저하되는 것을 확인하였다(도 13b 및 도 13d). 또한, [도 14]에서 나타난 바와 같이 세포 증식을 억제하고 세포 이주능을 분석하였을 때, 피어스 1의 넉다운에 의해 세포 증식뿐 아니라 세포 이주능 또한 억제되는 것으로 확인하였다(도 14).
<4-4> 피어스 1 발현 저하에 의한 전이성 흑색종 세포사멸 효과 확인
이와 함께, 아노이키스 분석(anoikis assay)으로 세포가 바닥에 부착배양하지 못하는 조건에서 피어스 1의 발현 억제를 유도한 B16F10 세포 또는 대조군 세포 1×104 개를 3일 동안 배지에서 유지시켜 세포 사멸을 유도한 다음, 2 μM의 Calcein-AM 및 4 μM EthD-1 용액을 각각의 세포에 가하고 30 분간 배양한 뒤 형광현미경으로 관찰하여 생존 세포 및 사멸 세포의 여부를 관찰하였다.
그 결과, [도 15]에서 나타난 바와 같이 피어스 1의 발현이 억제됨에 따라 B16F10 세포가 서로 뭉치는 양상을 나타내며, 뭉쳐진 세포의 중앙 부위에서 세포 사멸이 활발히 유도되는 것을 확인하여(도 15), 피어스 1의 발현을 억제하는 것을 통해 전이성 암을 효과적으로 사멸 유도할 수 있을 것으로 확인하였다.
<4-5> 실험동물에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내( in vivo ) 암 전이 억제 효과의 확인
시험관 내 수준에서 피어스 1의 발현을 억제하여 전이성 암의 증식 및 이주능을 억제할 수 있을 것으로 확인하여, 생체 내에서 피어스 1의 발현 수준 억제에 따른 암 전이 억제 효과를 확인하였다.
3주령의 B6 마우스의 꼬리 정맥에 피어스 1의 발현을 억제한 B16F10 세포 또는 대조군 세포 2×105 개를 주입하여 5 주 동안 마우스를 정상 조건에서 사육하였다. B16F10 세포를 주입하고 5 주 뒤, 마우스의 사멸율을 확인한 후 마우스를 희생하여 폐를 적출하였다. 적출한 폐에서 암 조직의 형성을 관찰하고, 폐 조직 시료를 hematoxylin & Eosin 염색하여 종양 조직에서의 종양 세포의 형성 여부를 확인하였다.
그 결과, [도 16]에서 나타난 바와 같이 피어스 1의 발현을 억제하지 않은 B16F10 세포를 주입한 대조군 마우스는 세포 주입 후 4 내지 5주 사이에 죽는 반면, 피어스 1의 발현이 억제된 B16F10 세포를 주입한 실험군 마우스에서는 5 주가 경과하여도 마우스가 생존할 수 있음을 확인하였다(도 16a). 또한, 폐 조직을 관찰한 결과 대조군 마우스의 폐 조직에서는 B16F10 세포의 이동에 의해 종양 조직이 형성되는 반면, 실험군 마우스의 폐 조직에서는 피어스 1의 발현 저하로 인해 폐로의 전이가 10 배 이상 억제되는 것으로 확인하였다(도 16b 및 도 16c). 아울러, 대조군 및 실험군의 폐 조직을 염색하여 관찰한 결과, 대조군 마우스의 폐 조직에서는 종양 부위가 뚜렷하게 형성됨을 확인하였으나, 실험군 마우스의 폐 조직에서는 피어스 1 발현이 저하됨에 따라 종양 조직의 크기가 매우 작거나 형성되지 않음을 확인하였다(도 16d).
[실시예 5]
유방암에서 피어스 1 발현 억제에 따른 종양성장 억제 및 전이 억제 효과의 확인
<5-1> 다양한 유형의 유방암에서 피어스 1 유전자의 발현 수준 분석
피어스 1의 발현 양상이 폐암뿐 아니라 다른 암에서도 연관성을 가지는 것을 확인하고자 하였다. 유방암은 크게 루미날 A(Luminal A), 루미날 B(Luminal B), HER2 양성, 삼중음성유방암(TNBC)의 4 종류로 나눌 수 있다. 이에, 유방암 종류와 에스트로겐 리셉터(ER) 발현 유무에 따른 피어스 1 유전자의 발현 양상을 온코마인 데이터베이스(Oncomine Database)를 통해서 비교 분석하였다.
그 결과, [도 17]에서 나타난 바와 같이, 대부분의 유방암 종류에서 피어스 1 의 발현이 증가되어 있으며(도 17a) 특히, 에스트로겐 리셉터가 양성인 유형의 유방암에서 피어스 1 의 발현 억제는 유방암 치료에 효과를 지니고 있을 것으로 예상하였다(도 17b).
<5-2> 다양한 유형의 유방암 환자에서 피어스 1의 발현 수준에 따른 생존 곡선 분석
이와 함께, Kaplan-Meiers 생존 곡선 분석을 수행하여 유방암의 종류 및 피어스 1의 발현 수준에 따른 환자의 생존 여부와의 상관 관계를 분석하였다.
그 결과, [도 18]에서 나타난 바와 같이 HER2 양성 유방암 환자 및 기저 유사성 2형(basal-like 2 type)의 유방암 환자에서 피어스 1 발현 수준이 낮은 환자가, 피어스 1 발현 수준이 높은 환자에 비해 장기간 생존하는 것을 확인하였다(도 18a 및 도 18b). 이와 반대로, HER2 음성 유방암 환자 혹은 루미날 A 형의 환자에서는 피어스 1 발현 수준이 높은 환자에서 피어스 1 발현 수준이 낮은 환자에 비해 장기간 생존하는 경향을 나타내는 것으로 확인하였다(도 18c).
<5-3> 유방암 세포주에서 피어스 1 발현 억제에 따른 암세포 성장 억제 효과 확인
피어스 1의 발현을 저하하였을 때 ER 양성 유방암 세포주인 MCF7 세포의 증식 수준의 변화를 확인하였다. MCF7 세포에 shRNA를 처리하여 피어스 1의 발현 저하를 유도한 실험군 세포 및 대조군 세포를 2x105 세포씩 배지가 포함된 6-웰 플레이트에 접종하여 배양하면서, 3일에 한번씩 세포 수를 계수하였다. 그런 다음, 배양 개시 9일 후에 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, [도 19]에서 나타난 바와 같이, MCF7 세포에서 피어스 1의 발현을 억제함에 따라 세포 증식 속도가 대조군에 비해 절반 수준으로 억제되는 것을 확인하였다(도 19).
<5-4> 유방암 세포주에서 피어스 1 발현 억제에 따른 세포 이동능력 억제 효과 확인
ER 양성의 MCF7 세포주에서 피어스 1 발현 억제에 따른 세포 이주능을 확인하기 위해 wound healing 분석을 수행하였다. 실험군(2종류의 PIERCE1 낙다운(KD) 세포주) 및 대조군 세포(MCF7 세포)를 각각 2×105 세포씩 6-웰 플레이트에 분주하여 부착 배양한 후, 스크래치를 냄과 동시에 증식을 최소화시키기 위해 0.5% 혈청 배지로 배지를 교환하고, 세포를 배양하였다. 세포를 배양하면서, 이틀에 한번씩 스크래치된 영역으로 세포가 이동하는 것을 관찰하여 세포 이주능을 확인하였다.
그 결과, 피어스 1의 발현이 억제되면, 대조군 보다(con) 전이능 마커인 wound closure 속도가 현저히 줄어드는 것을 확인하였다(도 20).
<5-5> 실험동물에서 피어스 1 발현 억제에 따른 생체 내( in vivo ) 유방암 전이 억제 효과 확인
생체 내에서 피어스 1의 발현 수준에 따른 암 전이 억제 효과를 확인하기 위하여, MMTV-PyMT 과발현 마우스와 PIERCE1 KO마우스를 교배하여 유방암을 유도하였고, 이들의 폐 전이를 관찰하였다.
polyoma virus의 middle T antigen인 PyMT 단백질이 MMTV 프로모터에 의해 유방 특이적으로 발현되는 마우스 모델인 MMTV-PyMT 유방암 마우스 모델에서, 피어스 1 유전자를 야생형(정상 대조군, WT), 이형접합성 변이(heterozygous mutation, Het) 및 발현 억제(knockout, KO)된 마우스 모델 군을 각각 준비하였다. 그런 다음, 마우스를 14-16 주령까지 사육하고 희생하여 폐로 전이된 유방암의 수를 측정하였다. 희생한 마우스의 유방암 종양 조직을 수득하고, 균질화하여 세포 단위로 분리하였다. 분리 및 수득한 유방암 조직 유래의 세포로부터 mRNA를 추출하여 유전자형 별로 피어스 1의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, [도 21a]에서 나타난 바와 같이 유방암 조직 유래 세포에서 피어스 1 mRNA 발현 수준을 확인하였을 때, 이형접합성 변이 마우스군에서는 야생형 대조군과 유사한 수준으로 피어스 1 mRNA 발현 수준이 유지되나, KO 마우스군에서는 피어스 1 mRNA가 현저히 낮은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. 또한, [도 21b]에 나타난 바와 같이 피어스 1 유전자를 발현 억제를 유도한 마우스군에서 이형접합성 변이 및 야생형의 대조군에 비해 유방암 전이가 감소한 것을 확인하였다.
<5-6> 삼중음성 유방암에서 피어스 1 발현 억제에 따른 전이 억제 효과의 확인
다양한 유방암 환자에서 피어스 1 발현 수준에 따른 생존 곡선 분석
Kaplan-Meiers 생존 곡선 분석을 수행하여 유방암의 종류 및 피어스 1의 발현 수준에 따른 환자의 생존 여부와의 상관 관계를 분석하였다.
그 결과, [도 22]에 나타난 바와 같이 피어스 1의 발현이 높은 삼중음성 유방암환자에서 피어스 1이 낮은 환자보다 암 전이가 높은 것을 확인하였다(도 22).
피어스 1 발현 저하에 의한 삼중음성 유방암 세포 이동능력 억제 효과의 확인
먼저 삼중음성 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포 대조군, 및 2종류의 PIERCE1 낙다운(KD) 세포주를 6-웰 플레이트에 2 x 105 세포씩 분주하고 다음 날 200 ul 팁으로 스크래치를 낸 후 이틀 뒤 성장 억제제 처리가 없거나 있는 상황에서 관찰하였고, 이에 대한 wound area를 counting하였다.
그 결과, [도 23]에 나타난 바와 같이, 피어스 1의 발현이 억제되면, 삼중음성 유방암세포에서 대조군 보다(CTL) 전이능 마커인 wound closure 속도가 현저히 줄어들며, 이는 세포 성장 억제 환경에서도 동일하게 관찰되는 것을 확인하였다(도 23 a 및 도23b).

Claims (17)

  1. 피어스 1(Pierce1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 피어스 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 피어스 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 피어스 1을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 뉴클레오티드(antisense nucleotide), siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 피어스 1의 발현 또는 활성 억제제는 피어스 1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 암은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 및 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  6. 피어스 1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 및 개선용 건강기능식품.
  7. i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질 또는 이의 발현 유전자 mRNA의 발현 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 ii)의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time RT-PCR), 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 암은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 및 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  10. i) 피어스 1 단백질을 발현하는 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 처리된 세포주에서 피어스 1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    iii) 상기 단계 ii)에서 측정한 피어스 1 단백질의 활성 수준이, 피검물질을 처리하지 않은 미처리 대조군에 비해 감소하도록 하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 ii)의 측정은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 암은 직장암, 대장암, 난소암, 신장암, 자궁경부암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 및 흑색종 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 후보물질 스크리닝 방법.
  13. 약학적으로 유효산 양의 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
  14. 약학적으로 유효산 양의 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제방법.
  15. 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 과증식성 세포에 처리하는 단계를 포함하는 세포사멸 촉진 또는 세포이동 억제 방법.
  16. 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 예방, 치료 또는 전이 억제 용도.
  17. 피어스 1(Pierce1) 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 과증식성 세포사멸 촉진 또는 세포이동 억제 용도.
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