WO2023090903A1 - 신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 포함하는 암 또는 염증 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 암 또는 염증의 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 포함하는 암 또는 염증 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 암 또는 염증의 예방 또는 치료 방법 Download PDF

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leuconostoc mesenteroides
cancer
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민아림
권보은
이지영
김현정
박현경
이승원
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씨제이바이오사이언스 주식회사
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Definitions

  • the present application relates to a novel Leuconostoc mesenteroides strain, a composition for preventing, improving or treating cancer or inflammation comprising a culture thereof or a component derived therefrom, a composition for enhancing immunity including the same, and using the same It relates to a method for preventing or treating cancer or inflammation.
  • Cancer is an abnormal cell growth caused by various changes in gene expression, infiltrating and destroying adjacent tissues, metastasizing to distant locations, and eventually leading to death.
  • Cancer has a high mortality rate worldwide and is the second most common cause of death in Western societies after cardiovascular disease.
  • dietary habits have become westernized, high-fat diet intake has become common, and colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, and the like are continuously increasing due to a rapid increase in environmental pollutants and an increase in alcohol consumption.
  • lactic acid bacteria are closely related to the health of humans and animals while widely distributed in the mouth, intestines, vagina, feces of humans and animals, and fermented foods such as yogurt, cheonggukjang, and kimchi. Lactic acid bacteria have been reported to exhibit various health-promoting effects such as intestinal regulation, suppression of harmful bacteria, immune regulation, blood cholesterol lowering, and anticancer (WO2022-103138 A1).
  • the present application relates to a novel Leuconostoc mesenteroides strain, a composition for preventing, improving or treating cancer or inflammation comprising a culture thereof or a component derived therefrom, a composition for enhancing immunity including the same, and using the same
  • a method for preventing or treating cancer or inflammation is provided.
  • One object of the present application is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of lung cancer or breast cancer, comprising a Leuconostoc mesenteroides strain, a culture thereof, or a component derived therefrom as an active ingredient. .
  • Leukonostok Mecenteroides Leukonostok mecenteroides
  • CJRS-10671 Accession No. KCCM13059P
  • Leukonostok Mecenteroides CJRS-10672 Accession No. KCCM13060P
  • Another object of the present application is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition of the present application to a subject.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising a component derived therefrom as an active ingredient, and administered in combination with an anticancer agent.
  • Another object of the present application is to provide a method for preventing or treating lung cancer, breast cancer or colon cancer comprising administering the pharmaceutical composition of the present application to a subject.
  • Another object of the present application is to provide a food composition for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, comprising a strain of Leuconostoc mecenteroides, a culture thereof, or a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is to provide a health functional food for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, including a Leuconostoc mecenteroides strain, its culture, or a component derived therefrom as an active ingredient. .
  • Another object of the present application is to provide a feed composition for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, including a Leuconostoc mecenteroides strain, a culture thereof, or a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a food composition for preventing or improving cancer or inflammation, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a health functional food for preventing or improving cancer or inflammation, containing a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a feed composition for preventing or improving cancer or inflammation, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a pharmaceutical composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a food composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a health functional food for enhancing immunity, containing a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another object of the present application is Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or to provide a feed composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • the novel Leuconostoc mesenteroides strain exhibits anticancer and anti-inflammatory effects, and enhances CD8 T cell function to secrete immune-enhancing cytokines IL-6, IL-12p70 and IFN ⁇ It can be applied for prevention or treatment of cancer or inflammation, or for immunity enhancement purposes.
  • 1 is a view confirming the enzyme activity of Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • Figure 2 is a diagram confirming the hemolytic properties of CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • 3 is a diagram confirming the intestinal attachment ability of CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • Figure 4 is a diagram confirming IL (interleukin) -6 secretion due to CJRS-10671 and CJRS-10672 strains in macrophage cell lines.
  • FIG. 5 is a diagram confirming IL-12p70 secretion by CJRS-10671 and CJRS-10672 strains in human PBMC (peripheral blood mononuclear cells).
  • FIG. 6 is a diagram confirming the IFN ⁇ (Interferon-gamma) secretion ability of CD8 T cells caused by CJRS-10671 and CJRS-10672 strains in mouse splenocytes and human PBMC.
  • IFN ⁇ Interferon-gamma
  • FIG. 7 is a diagram confirming the cell cycle arrest effect of cancer cells caused by CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • cyclin B1 cyclin B1
  • CDK1 cyclin dependent kinase 1
  • FIG. 9 is a diagram confirming cancer cell death caused by CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the tumor suppression effect by administration of CJRS-10671 and CJRS-10672 in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • FIG. 11 is a diagram confirming the IFN ⁇ secretion ability of CD8 T cells by CJRS-10671 administration in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • FIG. 12 is a diagram confirming the IFN ⁇ secretion ability of CD8 T cells by CJRS-10672 administration in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • FIG. 13 is a diagram confirming the IFN ⁇ secretion ability of CD8 T cells in tumor tissue by administration of CJRS-10671 and CJRS-10672 in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • FIG. 14 is a diagram confirming changes in myeloid-derived suppressor cells (MDSC), which are immunosuppressive cells, by administration of CJRS-10671 and CJRS-10672 in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • MDSC myeloid-derived suppressor cells
  • LLC 15 is a diagram confirming immune cell profiling by CJRS-10671 administration in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • 16 is a diagram confirming immune cell profiling by CJRS-10672 administration in a mouse lung cancer model (LLC1).
  • 17 is a diagram confirming the tumor suppression effect by CJRS-10672 administration in a mouse breast cancer model (4T1).
  • One aspect of the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer or breast cancer, comprising a Leuconostoc mesenteroides strain, a culture thereof, or a component derived therefrom as an active ingredient. .
  • Leuconostoc mesenteroides refers to lactic acid bacteria having a round, spherical shape, and is known as lactic acid bacteria fermenting foods such as probiotics or kimchi.
  • the Leuconostoc mesenteroides strain of the present application may be any one or more selected from CJRS-10671 deposited under accession number KCCM13059P or CJRS-10672 deposited under accession number KCCM13060P.
  • CJRS-10671 strain of the present application may have high enzymatic activities of ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase and ⁇ -glucosidase
  • the CJRS-10672 strain of the application may have high enzymatic activity of ⁇ -glucosidase.
  • strain of the present application may have a suitability effect and an immune enhancing effect.
  • the strain of the present application included in the composition according to the present application may exist as live cells or dead cells, and may also exist in a dried or lyophilized form.
  • the culture of the present application includes a live cell culture (ie, a result of culturing live cells in a medium), a culture obtained by killing live cells in the live cell culture, or a culture filtrate (ie, dead cells or live cells removed from the culture). results) may be included.
  • the component derived from the strain of the present application may include, for example, a cytoplasmic fraction obtained by disrupting the cell body containing EV (Extracellular Vesicle) and the like.
  • the type of lactic acid bacteria suitable for inclusion in a pharmaceutical composition, a formulation method, and a method for separating components derived from strains are well known to those skilled in the art.
  • the strain of the present application may be a strain cultured at 25 to 40 ° C. for 4 to 72 hours by inoculating 0.1 to 10% in MRS liquid medium.
  • composition of the present application may be administered in combination with an anticancer agent.
  • Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc Mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P); its culture; Or it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising a component derived therefrom as an active ingredient, and administered in combination with an anticancer agent.
  • strain, culture, and derived components are as described above.
  • the strain of the present application may exhibit anticancer, anti-inflammatory and immune enhancing effects.
  • prevention refers to any activity that inhibits or delays the onset of cancer by administering the composition of the present application
  • treatment means that the symptoms of cancer are improved or beneficial by administration of the composition of the present application. It means any action that changes.
  • cancer may include any cancer known in the art without limitation, and for example, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma), mesothelioma, pancreatic cancer (eg, pancreatic ductal cancer, pancreatic endocrine tumor) ), cancer of the pharynx, larynx, esophagus, stomach (e.g. papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma), duodenal cancer, small intestine cancer, colon cancer (e.g.
  • colon cancer rectal cancer, anal cancer, familial colorectal cancer, hereditary Nasal polyposis colorectal cancer, digestive stromal tumors), breast cancer (eg, invasive ductal carcinoma, noninvasive ductal carcinoma, inflammatory breast cancer), ovarian cancer (eg, epithelial ovarian carcinoma, extratesticular germ cell tumor, ovarian germ cell tumor, ovarian low-grade tumors), testicular tumors, prostate cancer (eg, hormone-dependent prostate cancer, hormone-independent prostate cancer), liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma, primary liver cancer, extrahepatic cholangiocarcinoma), thyroid cancer (eg, medullary thyroid carcinoma) , renal cancer (e.g.
  • renal cell carcinoma transitional epithelial carcinoma of the renal pelvis and ureter
  • uterine cancer e.g. cervical cancer, endometrial cancer, uterine sarcoma
  • brain tumor e.g. medulloblastoma, glioma, pineal astrocytoma, ciliary cell tumor
  • astrocytoma diffuse astrocytoma, degenerative astrocytoma, pituitary adenoma
  • retinoblastoma skin cancer (e.g., basal cell carcinoma, malignant melanoma), sarcoma (e.g., rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, soft tissue sarcoma), malignant bone tumor
  • It may be bladder cancer, hematological cancer (eg, multiple myeloma, leukemia, malignant lymphoma, Hodgkin's disease, chronic myeloproliferative disease), primary cancer of unknown origin, and
  • the pharmaceutical composition of the present application may be administered through any general route as long as the composition of the present application can reach the target tissue.
  • various forms of administration may be considered, including intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, but the present application is not limited to these exemplary forms of administration.
  • the composition may be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition may be administered by a specific device capable of transporting active ingredients to target cells.
  • the pharmaceutical composition of the present application may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a colorant, and a flavoring agent.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include a buffer, a preservative, a pain reliever, a solubilizer, an isotonic agent, and a stabilizer.
  • pharmaceutically acceptable carriers may include bases, excipients, lubricants and preservatives.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present application may be prepared in various dosage forms by combining the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutically acceptable carrier for oral administration, it may be formulated as a tablet, troche, capsule, elixir, suspension, syrup or wafer.
  • it may be formulated as a multi-dose formulation such as an ampoule of unit dosage form or a multi-dose container.
  • the composition may also be formulated as solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, and sustained-release preparations.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomerating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents and preservatives may be further included.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is dependent on the type and severity of the subject, age, sex, and disease. It may be determined according to factors including type, activity of drug, sensitivity to drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present application may be determined by various factors including the type of anticancer agent as well as the type of carcinoma to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, weight, and severity of the disease.
  • the pharmaceutical composition of the present application is administered in combination with an anticancer agent, the dose of the anticancer agent administered in combination can be reduced, thereby reducing the side effects of the anticancer agent and increasing patient compliance.
  • Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be used in the form of animal medicines as well as medicines applied to humans.
  • the animal is a concept including livestock and companion animals.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be administered in combination with an anticancer agent.
  • the anti-cancer agents for example, taxane-based anti-cancer agents, statins, alkylating agents, platinum-based drugs, antimetabolites, antibiotics, vinca alkaloids anti-cancer agents, It may be a targeted therapy, an immune anti-cancer agent, a cancer vaccine, a cell therapy, an oncolytic virus, and a combination thereof, but is not limited thereto, and may specifically be an immune anti-cancer agent.
  • taxane-based anticancer agent examples include, but are not limited to, paclitaxel, docetaxel, larotaxel, and cabazitaxel.
  • the statin may be, for example, simvastatin, atorvastatin, lovastatin, fluvastatin, cerivastatin, and pitavastatin, but is not limited thereto.
  • alkylating drug examples include nitrogen mustard-based drugs, ethylenimine and methylmelamine-based drugs, methylhydrazine derivatives, alkyl sulfonate-based drugs, nitroso It may be a urea (Nitrosourea) drug and a triazine (Triazine) based drug, etc., but is not limited thereto.
  • the platinum agent may be, for example, Cisplatin, Carboplatin, and Oxaliplatin, but is not limited thereto.
  • the antimetabolite may be, for example, a folate antagonist drug, a purine antagonist drug, and a pyrimidine antagonist drug, but is not limited thereto.
  • the antibiotic is, for example, Etoposide, Topotecan, Irinotecan, Idarubicin, Epirubicin, Dactinomycin, Doxorubicin, Adriamycin ), daunorubicin, bleomycin, mitomycin-C, and mitoxantrone, but not limited thereto.
  • the vinca alkaloid-based anticancer agent may be, for example, vincristine, vinblastine, and vinorelbine, but is not limited thereto.
  • the targeted therapy is, for example, EGFR (Epidermal growth factor receptor) targeted therapy, HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) targeted therapy, CD20 (B cell marker) targeted therapy, CD33 (Myeloid Cell Surface Antigen) targeted therapy, CD52 ( cluster of differentiation 52) targeted therapy, CD30 (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 8) targeted therapy, bcr-abl (breakpoint cluster region protein-tyrosine-protein kinase)/c-Kit (tyrosine kinase receptor) targeted therapy, ALK (anaplastic) lymphoma receptor tyrosine kinase) targeted therapy, antiangiogenics targeted therapy, mTOR (Mammalian target of rapamycin) targeted therapy, CDK4/6 (Cyclin-dependent kinase 4/6) targeted therapy, PARP (Poly (ADP-ribose) ) polymerase) targeted therapeutic agents, proteasome inhibitors, tyrosine
  • the immune anticancer agent is, for example, anti-PD-1 (programmed cell death protein 1,), anti-PD-L1 (programmed cell death-ligand 1), CTLA4 (Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4), CTLA4/B7-1 /B7-2 interaction inhibitor and CD47/SIRP (Cluster of Differentiation 47/Signal-regulatory protein) interaction inhibitor, anti-Tim3 (T-cell immunoglobulin and mucin domain 3) and anti-LAG3 (Lymphocyte Activating 3), etc.
  • anti-PD-1 programmeed cell death protein 1
  • anti-PD-L1 programmeed cell death-ligand 1
  • CTLA4 Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4
  • CTLA4/B7-1 /B7-2 interaction inhibitor and CD47/SIRP (Cluster of Differentiation 47/Signal-regulatory protein) interaction inhibitor
  • anti-Tim3 T-cell immunoglobulin and mucin domain 3
  • anti-LAG3
  • the anti-cancer agent of the present application may be, but is not limited to, an anti-PD-1 immune anti-cancer agent.
  • the combined administration may be the simultaneous, sequential or reverse administration of the pharmaceutical composition and the anticancer agent, but the order of administration is not limited and as long as it is administered at an administration interval that can exert both pharmacological effects, belong to the category
  • the pharmaceutical composition and the anticancer agent may be individually formulated, or may be formulated as one formulation, but is not limited thereto.
  • administration of the pharmaceutical composition of the present application may be combined with anti-cancer therapy.
  • the anticancer therapy may be radiotherapy, neoadjuvant therapy, chemotherapy, targeted therapy, photodynamic therapy, and the like, but is not limited thereto and is known in the art. All known anti-cancer therapies may be included.
  • the pharmaceutical composition of the present application may exhibit an anticancer effect.
  • the anticancer effect may include cancer cell killing or tumor growth inhibitory effects (Examples 9 and 10-1).
  • the pharmaceutical composition of the present application may exhibit an anti-cancer effect by inhibiting the cell cycle of cancer cells, thereby suppressing cancer cell death or tumor growth (Example 8).
  • the pharmaceutical composition of the present application may exhibit an anti-inflammatory or immune enhancing effect by increasing the secretion of immune enhancing cytokines IL (interlukine) -6, IL-12p70 and IFN ⁇ (Interferon-gamma) ( Example 7).
  • Another aspect of the present application provides a method for preventing or treating lung cancer, breast cancer or colon cancer comprising administering the pharmaceutical composition of the present application to a subject.
  • the pharmaceutical composition and cancer are as described above.
  • the treatment method of the present application includes administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount to a subject suspected of having cancer.
  • the object refers to all mammals including dogs, cows, horses, rabbits, mice, rats, chickens, and humans, but the mammals of the present application are not limited by the above examples.
  • the pharmaceutical composition may be administered through parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal routes. For local treatment, it can be administered by any suitable method, including intralesional administration if necessary.
  • Parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration.
  • Preferred formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or drip formulations.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present application may vary depending on the condition and body weight of the subject, the severity of the disease, the type of drug, the route and period of administration, and may be appropriately determined by a person skilled in the art.
  • Another aspect of the present application provides a food composition for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, comprising the Leuconostoc mecenteroides strain of the present application, its culture, or a component derived therefrom as an active ingredient do.
  • Another aspect of the present application is a health functional food for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, comprising the Leuconostoc mecenteroides strain of the present application, its culture, or a component derived therefrom as an active ingredient to provide.
  • strains, cultures, derived components and cancers are as described above.
  • the food composition may be in the form of a health functional food or food additive.
  • health functional food refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functionality useful to the human body in accordance with the Health Functional Food Act (Article 3, Subparagraph 1), and "functional "” means to obtain useful effects for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or for physiological action (Article No. 2).
  • the food composition may additionally contain food additives, and the suitability as a "food additive" is determined by the general rules and general test methods of the Food Additive Code approved by the Korea Food and Drug Administration, unless otherwise specified. judged according to the standard.
  • Food Additives Codex examples include chemical synthetic products such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid, natural additives such as dark pigment, licorice extract, crystalline cellulose, and guar gum, L- and mixed preparations such as sodium glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • Foods containing the active ingredient of the present application include confectionery products such as bread, rice cakes, dried confections, candies, chocolates, chewing gum, jams, ice creams, ice creams, ice cream products such as ice cream powders; Dairy products such as milk, low-fat milk, lactose-degraded milk, processed milk, goat milk, fermented milk, butter milk, concentrated milk, milk cream, butter milk, natural cheese, processed cheese, powdered milk, and whey; meat products such as processed meat products, processed egg products, and hamburgers; fish meat products such as fish cakes, ham, sausages, and processed fish products such as bacon; noodles such as ramen, dried noodles, fresh noodles, fried noodles, luxury dried noodles, improved soft noodles, frozen noodles, and pasta; Beverages such as fruit drinks, vegetable drinks, carbonated drinks, soybean milk, lactobacillus drinks such as yogurt, and mixed drinks; seasonings such as soy sauce, soybean paste, gochujang, chunjang, chungkukjang,
  • the food composition of the present application includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol , carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present application may include fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination.
  • Another aspect of the present application provides a feed composition for preventing or improving lung cancer, breast cancer or colorectal cancer, comprising the Leuconostoc mecenteroides strain of the present application, its culture, or a component derived therefrom as an active ingredient do.
  • strains, cultures, derived components and cancers are as described above.
  • the feed composition may be in the form of a feed additive composition in addition to the feed composition.
  • the composition When the composition is prepared as a feed additive, the composition may be 20 to 90% high concentration or may be prepared in powder or granular form.
  • the feed additives are organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid, and malic acid, sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate), polyphenol, catechin, alpha-tocopherol, and rosemary. extract, vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytic acid, and the like, or any one or more natural antioxidants may be further included.
  • the composition When prepared as a feed, the composition may be formulated in a conventional feed form, and may include common feed ingredients together.
  • the feed and feed additives include grains such as milled or ground wheat, oats, barley, corn and rice; vegetable protein feeds such as those based on rape, soybean, and sunflower; animal protein feed such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; It may further include sugar and dairy products, for example, dry ingredients composed of various powdered milk and whey powder, etc., and may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • the feed additive may be administered to animals alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the feed additives can be easily administered to animals as a top dressing, directly mixed with animal feed, or in an oral formulation separate from feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier can be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soybean flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the feed additive may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet or top dressing in a microdispersible form.
  • the feed additive may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup, suspension, emulsion, or solution formulation.
  • the feed and feed additives may contain auxiliary agents, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifying agents, solution accelerators, and the like.
  • the feed additive may be used by adding it to an animal's feed by steeping, spraying or mixing.
  • the feed or feed additive of the present application can be applied to a number of animal diets including mammals, poultry and fish.
  • the mammal it can be used for pigs, cows, horses, sheep, rabbits, goats, rats, hamsters, and guinea pigs, which are rodents and laboratory rodents, as well as companion animals (eg, dogs and cats), and as the poultry, chickens, It can also be used for turkeys, ducks, geese, pheasants, and quails, and can be used for carp, crucian carp, and trout as the fish, but is not limited thereto.
  • Leukonostok mecenteroides of the present application provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a culture thereof or a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Another aspect of the present application provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition of the present application to a subject.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a food composition for preventing or improving cancer or inflammation, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a health functional food for preventing or improving cancer or inflammation, containing a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a feed composition for preventing or improving cancer or inflammation, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a pharmaceutical composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a food composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or, it provides a health functional food for enhancing immunity, containing a component derived therefrom as an active ingredient.
  • Leuconostoc mesenteroides CJRS-10671 (Accession No. KCCM13059P) or Leuconostoc mesenteroides CJRS-10672 (Accession No. KCCM13060P) of the present application; its culture; Or it provides a feed composition for enhancing immunity, comprising a component derived therefrom as an active ingredient.
  • composition of the present application strains, cultures, derived components, cancer, inflammation and immune enhancement, etc. are as described in the other aspects.
  • Example 1 Leuconostoc mesenteroides ( Leuconostoc mesenteroides ) Confirmation of sugar fermentation characteristics of the strain
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 strains of Leuconostoc mesenteroides isolated from kimchi were cultured using Difco's MRS liquid medium and Agar medium. Each medium was prepared according to the protocol and then sterilized at 121 ° C. for 15 minutes and used. Each strain was inoculated with 1% stock in MRS liquid medium 2 days before the experiment, incubated at 37°C for 20 hours, then inoculated with 2% in MRS liquid medium, and then cultured at 37°C for 20 hours. used
  • the sugar fermentation characteristics of 49 carbohydrates were confirmed using the API 50 CHL kit (Biomerieux, France). Specifically, after washing the second subcultured strain with PBS (phosphate buffered saline), the strain was suspended in API 50 CHL medium based on McFarland standard 2.0, inoculated into a strip, and cultured at 37 ° C. for 24 hours. A yellow reaction using carbohydrates was read as a positive reaction, and a purple color was read as a negative reaction in which carbohydrates were not used.
  • API 50 CHL kit Biomerieux, France
  • antibiotic resistance evaluation was conducted to confirm the minimum inhibitory concentration (MIC) according to the EFSA antibiotic resistance evaluation guidelines.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the guideline specifies the cut-off vlaues for 8 antibiotics.
  • strains CJRS-10671 and CJRS-10672 met the criteria for 5 antibiotics, but exceeded the MIC criteria for some antibiotics, so antibiotic resistance was acquired as intrinsic resistance according to EFSA guidelines. Genetic analysis for resistance was performed, and the results are shown in Table 3 below. According to the EFSA guidelines, in the case of intrinsic resistance, it can be used because there is no possibility of external transfer of the antibiotic resistance gene to other bacteria.
  • acid resistance and gallbladder resistance were evaluated to confirm suitability as an oral preparation. Specifically, the acid resistance test was performed by inoculating 1% of the second subcultured strain in a PBS solution corrected to pH 3.0 using 1N HCl, incubating at 37 ° C for 2 hours, and then comparing the initial viable cell count with the viable cell count after culture. .
  • Tolerability was measured by inoculating 1% of the activated strain in a PBS solution containing 1% oxgall (Difco, USA) and comparing the number of viable cells after incubation at 37 ° C for 2 hours with the initial viable cell number.
  • strain CJRS-10671 showed 95.7% acid resistance and 136.6% tolerance based on 100% initial viable count
  • strain CJRS-10672 showed 120.6 based on 100% initial viable count. % acid resistance and 67.9% acid resistance.
  • HT-29 cell line Korean Cell Line Bank, KCLB; Seoul, Korea
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's minimal essential medium
  • the HT-29 cell line was seeded with 1.0X10 5 cells/24 well to form a monolayer of about 80%, and then washed twice with PBS to remove antibiotics contained in DMEM.
  • the degree of intestinal adhesion was expressed as the number of strain CFU attached per 100 HT-29 cell lines, and as a control, Bifidobacterium bifidum ( Bifidobacterium bifidum ), Bifidobacterium infantis ( B. infantis ), Bifidobacterium lac This ( B. lactis ) ATCC type strain was used.
  • the intestinal adhesion capacity was about 217 ⁇ 21 bacteria/100 cells, equivalent to or better than that of the control strain (FIG. 3).
  • Example 7 Immune-enhancing cytokine secretion confirmation by strain
  • IL-6 secretion known as an immune-enhancing cytokine
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 of Example 1 As immunocytes, mouse macrophage cell line (Raw 264.7) and human monocytes (THP-1) were used. One week before entering the experiment, the Raw 264.7 cell line was subcultured and maintained in DMEM medium containing 10% FBS and 1% Antibiotic-antimycotic, and seeded in a flat 96-well plate at 6x10 4 cells/well one day before the experiment.
  • the THP-1 cell line was subcultured and maintained in RPMI medium containing 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (PS) and 2-mercaptoethanol (2-ME) 0.05 mM, and 8x10 4 cells 2 days before the experiment.
  • RPMI medium containing 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin (PS) and 2-mercaptoethanol (2-ME) 0.05 mM, and 8x10 4 cells 2 days before the experiment.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 increased IL-6 secretion when co-cultured with mouse or human-derived macrophages (FIG. 4).
  • CJRS-10671 or CJRS-10672 induces the secretion of IL-12p70, known as an immune-enhancing cytokine, in human PBMCs was measured.
  • Human PBMCs were seeded in 96 well plates at 2x10 5 cells/well. Then, when co-cultivating with CJRS-10671 and CJRS-10672, the medium containing 10% FBS without antibiotics was used. Then treated with immune cells at a ratio of 1:10. As a result of obtaining the supernatant after 24 hours of culture, it was confirmed that CJRS-10671 and CJRS-10672 increased IL-12p70 secretion when co-cultured with human PBMC (FIG. 5).
  • IFN ⁇ Interferon-gamma
  • CD8 T cells which are cytotoxic T cells, greatly affects anticancer efficacy.
  • CD8 + IFN ⁇ + was confirmed using mouse splenocytes and human PBMC to confirm the IFN ⁇ secretion ability of cytotoxic T cells by CJRS-10671 and CJRS-10672 strains.
  • HBSS Human Brain Staline
  • collagenase IV was inserted into the mouse spleen tissue with a syringe to allow the cells to flow out. After repeating this several times, the remaining tissue was cut into small pieces using a syringe and incubated at 37° C. for 25 minutes. It was further incubated for 5 minutes at 37° C. with 0.5M EDTA added. After mixing the cells using a Pasteur pipette, the cells were filtered through a cell strainer. After centrifugation at 1500 rpm for 3 minutes, red blood cells were removed using 1x RBC lysis buffer, and splenocytes were suspended in a new medium and used for the experiment.
  • Human PBMCs were purchased from stemcell technologies and stored in nitrogen tanks after receipt until use in experiments. On the day of the experiment, the stock was taken out of the nitrogen tank and melted in a constant temperature water bath. After putting RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS and centrifuging at 1500 rpm for 5 minutes, the PBMC were suspended in a new medium and used for the experiment.
  • a stimulator of T cells is required, so 0.1 ⁇ g/ml of anti-CD3 antibody was diluted in PBS 1 day before co-culture with the strain, and the concentration was 0.1 ⁇ g/ml in a flat 96-well plate. were coated in a volume of 100 ⁇ l per well. On the day of co-culture, the coated plate was prepared by washing twice with PBS, mouse splenocytes were isolated according to the protocol, and 5x10 5 cells/well were added to a 96-well plate coated with 1 ⁇ g/ml of purified anti-CD28 antibody.
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 strains were co-cultured with splenocytes at a ratio of 1:10 using an antibiotic-free culture medium. After 3 days of co-culture, brefeldin A was added, golgi stop was performed for 3-4 hours, and then markers to be identified were stained using BD transcription factor buffer set and fluorescent antibody to prepare analysis samples. Analysis samples were analyzed using BD Lyric (flow cytometer) and Flowjo programs, and the results were confirmed.
  • Human PBMCs were seeded at 2 x 10 5 cells/well, and co-culture was performed in the same manner as in Example 7-2.
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 increased the IFN ⁇ secretion ability of CD8 T cells in mouse splenocytes and human PBMC (FIG. 6).
  • lung cancer cell line LLC1 Lewis lung carcinoma, LL/2, LLC1
  • colorectal cancer cell line MC38 Murine Carcinoma-38 cells were used.
  • LLC1 and MC38 cell lines were cultured and maintained in DMEM medium containing 10% FBS and 1% Anti-anti. LLC1 and MC38 cell lines were seeded in a 6-well plate at 2.4x10 5 cells/well and 1.2x10 5 cells/well, respectively.
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 strains were added at ratios of cancer cell lines: strains of 1:10, 1:100, and 1:1000. After co-cultivation for 24 hours, the cells were removed using trypsin-EDTA, washed with 1x PBS, and 5 ml of ice-cold 75% EtOH was added while only the cells were left, and stored overnight at -20 ° C. Thereafter, Ki67 and PI fluorescence staining was performed, and cell cycle results were analyzed using BD Lyric (flow cytometer) and Flowjo programs. A group not treated with CJRS-10671 and CJRS-10672 strains (strain untreated group) was used as a control group.
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 strains of Example 1 were seeded in 6-well plates at 2.4x10 5 cells/well and 1.2x10 5 cells/well, respectively. . After 24 hours, the medium was replaced with a medium containing 0.5% FBS, followed by serum starvation for 24 hours.
  • CJRS-10671 and CJRS-10672 were treated at a cancer cell line:strain ratio of 1:10, 1:100, and 1:1000, and after 24 hours of co-culture, the cells were detached using trypsin-EDTA, washed with 1x PBS, and killed.
  • mice were subcutaneously injected with LLC1 cell line 4 x 10 5 cells/mouse. After tumor cell injection, when the tumor size reached about 30-50 mm 3 , the mice were divided into the following groups: negative control group (no treatment after tumor cell injection), CJRS-10671 or CJRS-10672 sample treated group, and immune control group. A group treated with checkpoint inhibitor anti-PD-1 (positive control group) and a group treated with CJRS-10671 or CJRS-10672 samples and anti-PD-1 in combination.
  • CJRS-10671 or CJRS-10672 samples were diluted in 100 ⁇ l PBS to 10 9 CFU per animal and administered a total of 10 times for 10 days, and anti-PD-1 (10 mg/kg, BioXCell) was intraperitoneally administered once every 2 days. did The size of the tumor was measured with a caliper three times a week, and the mouse was sacrificed on the day after the end of administration, the tumor weight was measured, and blood and organs were obtained and analyzed.
  • splenocytes were separated from the spleen tissue of each group and seeded in a round-bottom 96-well plate at 10 6 cells/well. After stimulation of splenocytes with PMA/Ionomycin, which stimulates all immune cells, for 3-4 hours, surface marker staining and intracellular cytokine staining (ICS) were performed, followed by FACS to measure the amount of IFN ⁇ secreted by CD8 T cells. quantity was confirmed.
  • PMA/Ionomycin which stimulates all immune cells
  • CD8 T cell function the same isolated splenocytes were stimulated for 1 day with CD3/CD28 (anti-CD3 antibody 2 ⁇ g/ml, anti-CD28 antibody 2 ⁇ g/ml) that stimulates T cells, followed by surface marker staining. and ICS were performed, and the amount of IFN ⁇ secreted by CD8 T cells was confirmed by FACS.
  • CD3/CD28 anti-CD3 antibody 2 ⁇ g/ml, anti-CD28 antibody 2 ⁇ g/ml
  • TILs tumor-infiltration lymphocytes
  • CD3/CD28 anti-CD3 antibody 2 ⁇ g/ml, anti-CD3 antibody 2 ⁇ g/ml, anti- After 1-day stimulation with CD28 antibody (2 ⁇ g/ml)
  • surface marker staining and ICS were performed, and the amount of IFN ⁇ secreted by CD8 T cells was confirmed by FACS.
  • both the CJRS-10671 and anti-PD-1 combination treatment group and the CJRS-10672 and anti-PD-1 combination treatment group increased the amount of IFN ⁇ secreted by CD8 T cells during T cell stimulation (FIG. 13).
  • splenocytes were isolated from the spleen tissue of each group, and surface marker staining was performed using a fluorescent antibody to confirm changes in immune cells and immunosuppressive cells.
  • the fluorescent markers for each immune cell were used as follows: M1 (CD11b + F4/80 + CD86 + ), M2 (CD11b + F4/80 + CD206 + ), DC (IA-IE + CD11b + CD11c + ), B cells (CD3 - B220 + ), NK cells (CD3 - NK1.1 + ), NKT cells (CD3 + NK1.1 + ), Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 + ). Analysis Samples were analyzed with BD Lyric (flow cytometer) and Flowjo programs, and the results were confirmed by % and #.
  • mice were subcutaneously injected with 3 x 10 5 cells/mouse of the 4T1 cell line.
  • the mice were divided into the following groups: negative control group (no treatment after tumor cell injection), CJRS-10672 sample treated group, and immune checkpoint inhibitor A group treated with anti-PD-1 (positive control group) and a group treated with CJRS-10672 samples and anti-PD-1 in combination.
  • CJRS-10672 samples were diluted in 100 ⁇ l PBS to 10 9 CFU per animal and administered a total of 10 times for 10 days, and anti-PD-1 (10 mg/kg, BioXCell) was intraperitoneally administered once every 2 days.
  • the size of the tumor was measured with a caliper three times a week, and the mouse was sacrificed on the day after the end of administration, the tumor weight was measured, and blood and organs were obtained and analyzed.
  • Example 10-4 the number of MDSC, which are immunosuppressive cells, among the obtained spleen-derived cells was confirmed in the same manner as in Example 10-4.
  • CJRS-10672 reduced the size of breast cancer compared to the negative control group or the anti-PD-1 treated group. True individuals were identified (FIG. 17).
  • the CJRS-10671 and CJRS-10672 strains were deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository institution under the Budapest Treaty, on October 19, 2021, respectively, and were given accession numbers KCCM13059P and KCCM13060P.
  • KCCM Korean Culture Center of Microorganisms

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Abstract

본 출원은 신규 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 포함하는 암 또는 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 포함하는 암 또는 염증 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 암 또는 염증의 예방 또는 치료 방법
본 출원은 신규 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 포함하는 암 또는 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 이를 포함하는 면역 증강용 조성물 및 이를 이용한 암 또는 염증의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
암(cancer)은 유전자 발현의 다양한 변화에 의하여 야기되는 비정상적 세포 성장으로서, 인접 조직을 침투 및 파괴하고 먼 위치까지 전이하여 결국 죽음에 이르게 한다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 폐암, 유방암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다.
한편, 유산균은 인간 및 동물의 구강, 장, 질, 분변, 그리고 요거트, 청국장, 김치와 같은 발효식품 등에 널리 분포하면서 사람과 동물의 건강과 밀접한 관련을 맺고 있다. 유산균은 정장작용, 유해균 억제, 면역조절, 혈중 콜레스테롤 저하, 항암 등 다양한 건강증진 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다(WO2022-103138 A1).
본 출원은 신규 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 포함하는 암 또는 염증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 이를 포함하는 면역 증강용 조성물 및 이를 이용한 암 또는 염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 출원의 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스(Leukonostok mecenteroides) CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 본 출원의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하고, 항암제와 병용 투여되는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 본 출원의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 신규한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주는 항암 및 항염증 효과를 나타내며, CD8 T 세포능을 강화하여 면역 강화 사이토카인인 IL-6, IL-12p70 및 IFNγ의 분비를 증가시키는 등 면역 증강 효과를 나타내는 바, 암 또는 염증의 예방 또는 치료, 면역 증강 용도로 적용될 수 있다.
도 1은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 효소활성을 확인한 도이다.
도 2는 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 용혈성을 확인한 도이다.
도 3은 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 장부착능을 확인한 도이다.
도 4는 대식세포주에서 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 IL(interleukin)-6 분비를 확인한 도이다.
도 5는 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)에서 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 IL-12p70 분비를 확인한 도이다.
도 6은 마우스 비장세포, 인간 PBMC에서 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 CD8 T세포의 IFNγ(Interferon-gamma) 분비능을 확인한 도이다.
도 7은 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 암세포의 세포주기 멈춤 (Cell cycle arrest) 효과를 확인한 도이다.
도 8은 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 암세포의 세포주기 멈춤 관련인자인 사이클린 B1(cyclin B1), CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1)의 발현을 확인한 도이다.
도 9는 CJRS-10671, CJRS-10672 균주로 인한 암세포 사멸을 확인한 도이다.
도 10은 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10671, CJRS-10672 투여에 의한 종양 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10671 투여에 의한 CD8 T 세포의 IFNγ 분비능을 확인한 도이다.
도 12는 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10672 투여에 의한 CD8 T 세포의 IFNγ 분비능을 확인한 도이다.
도 13은 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10671, CJRS-10672 투여에 의한 종양조직 내 CD8 T 세포의 IFNγ 분비능을 확인한 도이다.
도 14는 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10671, CJRS-10672 투여에 의한 면역억제세포인 MDSC(Myeloid-derived suppressor cells)의 변화를 확인한 도이다.
도 15는 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10671 투여에 의한 면역세포 변화(profiling)를 확인한 도이다.
도 16은 마우스 폐암 모델(LLC1)에서 CJRS-10672 투여에 의한 면역세포 변화(profiling)를 확인한 도이다.
도 17은 마우스 유방암 모델(4T1)에서 CJRS-10672 투여에 의한 종양 억제효과를 확인한 도이다.
도 18은 마우스 유방암 모델(4T1)에서 CJRS-10672 투여에 의한 면역억제세포인 MDSC의 변화를 확인한 도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)"는 동그란 구형의 모양을 하고 있는 젖산균을 의미하며, 프로바이오틱스 또는 김치 등의 식품을 발효하는 유산균으로 알려져 있다.
본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 수탁번호 KCCM13059P로 기탁된 CJRS-10671 또는 수탁번호 KCCM13060P로 기탁된 CJRS-10672 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 CJRS-10671 균주는 β-갈락토시다제(β-galactosidase), α-글루코시다제(α-glucosidase) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase)의 효소활성이 높을 수 있고, 본 출원의 CJRS-10672 균주는 β-글루코시다제의 효소활성이 높을 수 있다.
또한, 본 출원의 균주는 정장 효과 및 면역 증강 효과를 가질 수 있다.
본 출원에 따른 조성물에 포함되는 본 출원의 균주는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 본 출원의 배양물에는 생균 배양물(즉, 생균을 배지에서 배양한 결과물), 상기 생균 배양물에서 생균을 사균화한 배양물, 또는 배양여액(즉, 상기 배양물에서 사균체 또는 생균체가 제거된 결과물)이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원의 균주 유래의 성분으로는 예컨대, EV(Extracellular Vesicle) 등을 함유하는, 균체를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물이 포함될 수 있다. 이외에 약학적 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태, 제제화 방법 및 균주 유래 성분의 분리 방법 등은 당업자에게 잘 알려져 있다.
구체적으로, 본 출원의 균주는 MRS 액체배지에 0.1 내지 10% 접종하여 25 내지 40℃에서 4시간 내지 72시간 동안 배양한 균주일 수 있다.
또한, 본 출원의 조성물은 항암제와 병용 투여될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하고, 항암제와 병용 투여되는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 균주, 배양물, 유래 성분에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 균주는 항암, 항염증 및 면역증진 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, "예방"은 본 출원의 조성물 투여에 의하여 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어, "치료"는 본 출원의 조성물 투여에 의하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 출원에 있어서, 암은 당업계에 알려진 암이라면 제한 없이 포함할 수 있고, 예를 들면 폐암(예, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 악성 중피종), 중피종, 췌장암(예, 췌관암, 췌장 내분비 종양), 인두암, 후두암, 식도암, 위암(예, 유두 선암, 점액성 선암, 선편평상피암종), 십이지장암, 소장암, 대장암(예, 결장암, 직장암, 항문암, 가족성 대장암, 유전성 비용종증 대장암, 소화관 간질 종양), 유방암(예, 침윤성 유관암, 비침윤성 유관암, 염증성 유방암), 난소암(예, 상피성 난소암종, 고환외 배세포 종양, 난소성 배세포 종양, 난소 저악성도 종양), 고환 종양, 전립선암(예, 호르몬-의존성 전립선암, 호르몬-비의존성 전립선암), 간암(예, 간세포암, 원발성간암, 간외 담관암), 갑상선암(예, 갑상선 수질암종), 신장암(예, 신세포암종, 신우와 요관의 이행 상피암종), 자궁암(예, 자궁경부암, 자궁체암, 자궁 육종), 뇌종양(예, 수모세포종, 신경교종, 송과체 성세포종양, 모양세포성 성세포종, 미만성 성세포종, 퇴형성성 성세포종, 뇌하수체 선종), 망막모세포종, 피부암(예, 기저세포암, 악성 흑색종), 육종(예, 횡문근육종, 평활근육종, 연조직 육종), 악성 골종양, 방광암, 혈액암(예, 다발성 골수종, 백혈병, 악성 림프종, 호지킨병, 만성 골수 증식 질환), 원발 미상 암 등일 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 폐암, 유방암 또는 대장암일 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 본 출원의 조성물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여를 포함하는 다양한 투여 형식이 고려될 수 있으나, 본 출원은 이러한 투여의 예시형식에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 상기 조성물은 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 특정 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 경구투여의 경우 약학적으로 허용되는 담체는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 포함할 수 있다. 주사제의 경우 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제를 포함할 수 있다. 국소투여용의 경우 약학적으로 허용되는 담체는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르제, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼로 제형화될 수 있다. 주사제의 경우에는 단위 투약 제형의 앰플 또는 다용량 용기와 같은 다회 투약 제형으로 제형화할 수 있다. 상기 조성물은 또한 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함한다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 출원에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 항암제의 종류뿐 아니라 치료할 암종, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도를 포함하는 여러 관련 인자들에 의해 결정될 수 있다. 본 출원의 약학적 조성물을 항암제와 병용 투여할 경우, 병용 투여되는 항암제의 투여 용량을 감소시킬 수 있으며 그에 따라 항암제 부작용을 감소시키고 환자의 치료 순응도를 상승시킬 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 출원의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.
본 출원에 있어서, 본 출원의 약학적 조성물은 항암제와 병용 투여할 수 있다. 상기 항암제는 예를 들면, 탁산계 항암제, 스타틴, 알킬화 약물(Alkylating agents), 백금 제제(Platinum-based drug), 항대사산물(Antimetabolites), 항생제(Antibiotics), 빈카 알칼로이드계(Vinca alkaloids) 항암제, 표적 치료제, 면역 항암제, 암 백신(Cancer Vaccine), 세포 치료제(Cell therapy), 종양 용해성 바이러스(Oncolytic virus) 및 이들의 조합일 수 있고, 이로 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 면역 항암제일 수 있다.
상기 탁산계 항암제는 일예로, 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 라로탁셀(Larotaxel) 및 카바지탁셀(Cabazitaxel) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스타틴은 일예로, 심바스타틴(simvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로바스타틴(lovastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 세리바스타틴(cerivastatin) 및 피타바스타틴(pitavastatin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알킬화 약물은 일예로, 니트로겐 머스타드(Nitrogen mustard)계 약물, 에틸렌이민(Ethylenimine) 및 메틸메라민(Methylmelamine)계 약물, 메틸히드라진(Methylhydrazine) 유도체, 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate)계 약물, 니트로소우레아(Nitrosourea)계 약물 및 트리아진(Triazine)계 약물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 백금 제제는 일예로, 시스플라틴(Cisplatin), 카보플라틴(Carboplatin) 및 옥살리플라틴(Oxaliplatin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항대사산물은 일예로, 엽산 길항제(Folate antagonist)계 약물, 퓨린 길항제(Purine antagonist)계 약물 및 피리미딘 길항제(Pyrimidine antagonist)계 약물 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제는 일예로, 에토포시드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 이다루비신(Idarubicin), 에피루비신(Epirubicin), 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin, Adriamycin), 다우노루비신(Daunorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 미토마이신-C(Mitomycin C) 및 미토잔트론(Mitoxantrone) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 빈카 알칼로이드계 항암제는 일예로, 빈크리스틴(Vincristine), 빈블라스틴(Vinblastine) 및 비노렐빈(Vinorelbine) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 표적 치료제는 일예로, EGFR(Epidermal growth factor receptor) 표적 치료제, HER2(Human Epidermal growth factor Receptor 2) 표적 치료제, CD20(B cell marker) 표적 치료제, CD33(Myeloid Cell Surface Antigen) 표적 치료제, CD52(cluster of differentiation 52) 표적 치료제, CD30(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 8) 표적 치료제, bcr-abl(breakpoint cluster region protein-Tyrosine-protein kinase)/c-Kit(tyrosine kinase receptor) 표적 치료제, ALK(anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase) 표적 치료제, 항-혈관신생(Antiangiogenics) 표적 치료제, mTOR(Mammalian target of rapamycin) 표적 치료제, CDK4/6(Cyclin-dependent kinase 4/6) 표적 치료제, PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase) 표적 치료제, 프로테아좀(Proteasome) 저해제, 티로신 키나제(tyrosine kinase) 길항제, 프로테인 키나제 C(protein kinase C) 억제제 및 파네실 트랜스퍼라제(Farnesyl transferase) 억제제 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 면역 항암제는 일예로, 항-PD-1(programmed cell death protein 1,), 항-PD-L1(programmed cell death-ligand 1), CTLA4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4), CTLA4/B7-1/B7-2 상호작용억제제 및 CD47/SIRP(Cluster of Differentiation 47/Signal-regulatory protein) 상호작용억제제, 항-Tim3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3) 및 항-LAG3(Lymphocyte Activating 3) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 항암제는 이로 제한되는 것은 아니나, 항-PD-1 면역 항암제일 수 있다.
본 출원에서, 병용 투여는 상기 약학적 조성물과 항암제를 동시, 순차 또는 역순으로 투여하는 것일 수 있으나, 투여 순서는 제한되지 않고 두 약리효과가 발휘될 수 있는 투여 간격으로 투여되는 한, 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 상기 약학적 조성물과 항암제는 개별적으로 제제화될 수 있고, 또는 하나의 제제로 제제화될 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 있어서, 본 출원의 약학적 조성물의 투여는 항암 요법과 병용될 수있다. 상기 항암 요법은 방사선요법(radiotherapy), 네오아쥬번트요법(neoadjuvant therapy), 화학요법(chemotherapy), 표적요법(targeted therapy) 및 광역학 요법(Photodynamic therapy) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 항암 요법을 모두 포함할 수 있다.
본 출원에 있어서, 본 출원의 약학적 조성물은 항암 효과를 나타내는 것일 수 있다. 상기 항암 효과는 암세포 사멸 또는 종양 성장 억제 효과를 포함하는 것일 수 있다(실시예 9, 실시예 10-1).
일예로, 본 출원의 약학적 조성물은 암세포의 세포주기를 억제시킴으로써 암세포 사멸 또는 종양 성장 억제 효과를 나타내어 항암 효과를 나타내는 것일 수 있다(실시예 8).
다른 일예로, 본 출원의 약학적 조성물은 면역 강화 사이토카인인 IL(interlukine)-6, IL-12p70 및 IFNγ(Interferon-gamma)의 분비를 증가시킴으로써 항염증 또는 면역 증강 효과를 나타내는 것일 수 있다(실시예 7).
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 암 의심 개체 내에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭, 및 인간을 포함한 포유류 전체를 의미하나, 본 출원의 포유류는 상기 예에 의해 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내 경로를 통하여 투여될 수 있다. 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 제형은 정맥 주사, 피하 주사, 피 내 주사제, 근육 주사 또는 점적 주사 제형이다. 본 출원의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다를 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 균주, 배양물, 유래 성분 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 식품 첨가제의 형태일 수 있다.
본 출원에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미(제3조 제1호)하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것(동조 제2호)을 의미한다.
상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 들을 들 수 있다.
본 출원의 유효성분이 포함된 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류; 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류; 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류; 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류; 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류; 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료; 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품; 발효식품; 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 외에 본 출원의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 출원의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 균주, 배양물, 유래 성분 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 사료 조성물은 사료 조성물 외에 사료 첨가제 조성물의 형태일 수 있다.
상기 조성물이 사료 첨가제로서 제조될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 제조될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 및 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료 및 사료 첨가제는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 말, 양, 토끼, 염소, 설치동물 및 실험용 설치동물인 쥐, 햄스터, 기니피그 뿐만 아니라, 반려동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 잉어, 붕어 및 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스(Leukonostok mecenteroides) CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.
본 출원의 또 하나의 양태는 본 출원의 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
상기 본 출원의 조성물에서, 균주, 배양물, 유래 성분, 암, 염증 및 면역 증강 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
실시예 1: 류코노스톡 메센테로이데스( Leuconostoc mesenteroides ) 균주의 당 발효 특성 확인
김치에서 분리한 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671, CJRS-10672 균주는 Difco 사의 MRS 액체배지 및 Agar 배지를 사용하여 배양하였다. 각 배지는 프로토콜에 따라 조제 후 121℃에서 15분 멸균하여 사용하였다. 각 균주는 실험하기 2일 전 stock을 MRS 액체배지에 1% 접종하여 37℃에서 20시간 정치배양 후, 다시 MRS 액체배지에 2%에 접종(activation)하여 37℃에서 20시간 정치배양하여 실험에 사용하였다.
상기와 같이 배양한 CJRS-10671, CJRS-10672 균주에 대해 API 50 CHL kit(Biomerieux, France)를 이용하여 49종의 탄수화물에 대한 당 발효 특성을 확인하였다. 구체적으로, 2차 계대 배양한 균주를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 뒤 API 50 CHL 배지에 McFarland standard 2.0 기준으로 균주를 현탁하여 strip에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 탄수화물을 이용하여 노란색으로 나타나면 양성반응, 보라색으로 나타나면 탄수화물을 이용하지 못한 음성반응으로 판독하였다.
No. Type of test CJRS-10671 CJRS-10672 No. Type of test CJRS-10671 CJRS-10672
0 Control - - 25 Esculin ++ ++
1 Glycerol - - 26 Salicin ++ -
2 Erythritol - - 27 D-cellibiose ++ -
3 D-Arabinose - - 28 D-Maltose ++ ++
4 L-Arabinose ++ ++ 29 D-Lactose - -
5 D-Ribose ++ ++ 30 D-Melibiose ++ ++
6 D-Xylose ++ ++ 31 D-Saccharose (sucrose) ++ ++
7 L-Xylose - - 32 D-trehalose ++ ++
8 D-Adonitol - - 33 Inullin - -
9 Methyl-β-D-xylopyranoside - - 34 D-Melezitose - -
10 D-Galactose - - 35 D-Raffinose ++ ++
11 D-glucose ++ ++ 36 Amidon - -
12 D-fructose ++ ++ 37 Glycogen - -
13 D-Mannose ++ ++ 38 Xylitol - -
14 L-Sorbose - - 39 Gentibiose ++ -
15 L-Rhamnose - - 40 D-Turanose ++ -
16 Dulcitol - - 41 D-Lyxose - -
17 Inositol - - 42 D-Tagatose - -
18 D-Manitol + + 43 D-Fucose - -
19 D-Sorbitol + - 44 L-Fucose - -
20 Methyl-a-D-Mannopyranoside - - 45 D-Arabitol - -
21 Methyl-a-D-Glucopyranoside ++ ++ 46 L-Arabitol - -
22 N-Acetyl Glucosamine ++ ++ 47 potassium glucoNaTe + -
23 Amygdalin + - 48 potassium 2-ketogluconate - +
24 Arbutine + + 49 potassium 5-Ketoglyconate - -
(++): positive reaction (yellow), no. 25 (black), (+): weak reaction, (-): negative reaction (purple)
실시예 2: 균주의 효소활성 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 생화학적 특성을 분석하기 위해 API zym kit(Biomerieux, France)를 사용하여 19종의 효소활성을 조사하였다.
그 결과, 하기 표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, CJRS-10671의 경우 β-갈락토시다제(β-galactosidase), α-글루코시다제(α-glucosidase) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase)의 효소활성이 높고, CJRS-10672의 경우 β-글루코시다제의 효소활성이 높은 것을 확인하였다.
No. Enzyme CJRS-10671 CJRS-10672
1 Control
2 Alkaline phosphatase 0 0
3 Esterase (c4) 1 1
4 Esterase lipase (C8) 0 0
5 Lipase (c14) 0 0
6 Leucine arylamidase 1 1
7 Valine arylamidase 0 0
8 Cystine arylamidase 0 0
9 Trypsin 0 0
10 α-chymotrypsin 0 0
11 Acid phosphatase 0.5 0.5
12 Naphthol-AS-BO-phosphohydrolase 1 1
13 α-galactosidase 0.5 0
14 β-galactosidase 4 1
15 β-glucuronidase 0 0
16 α-glucosidase 5 2
17 β-glucosidase 5 5
18 N-acetyl-β-glucosamidase 0 0
19 α-mannosidase 0 0
20 α-fucosidase 0 0
실시예 3: 균주의 용혈성 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 용혈성 여부를 확인하기 위해 5% defibrinated sheep blood(MB cell, Korea)가 첨가된 blood agar에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니 주변의 clear zone 형성 유무를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 콜로니 주변에 적혈구가 분해된 clear zone이 형성되지 않은 것으로 보아 CJRS-10671, CJRS-10672 균주는 용혈성이 없음을 확인하였다.
실시예 4: 균주의 항생제 내성 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 항생제 내성을 확인하기 위해 EFSA의 항생제 내성 평가 가이드라인에 준하여 MIC(Minimum inhibitory concentration)를 확인하기 위한 항생제 내성 평가를 진행하였다. 류코노스톡 메센테로이데스의 경우 가이드라인에는 8종의 항생제에 대해 cut-off vlaues에 대한 기준이 명시되어 있다.
MIC 실험결과, CJRS-10671, CJRS-10672 균주는 항생제 5종에 대한 기준에는 부합하였으나, 일부 항생제에 대해 MIC 기준을 초과하여 EFSA 가이드라인에 따라 항생제 내성이 내재(intrinsic) 내성인지 획득(acquired) 내성 여부에 대한 유전자 분석을 진행하고 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. EFSA 가이드라인에 의하면 내재 내성을 가지는 경우에는 다른 박테리아로 항생제 내성 유전자를 외부 전이할 가능성이 없기 때문에 사용이 가능하다. 류코노스톡 속 균주는 클로람페니콜(chloramphenicol) (MICs≥ 4 μg/mL)에 대한 저항성을 가지고 있다고 보고되어 있으나, 이는 류코노스톡 속 자체의 내재 내성일 가능성이 높으며 다른 박테리아로의 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer) 가능성이 낮다고 알려져 있다(AB Flσrez, 2005).
Antibiotics Leuconostoc mesenteroides
Cut- off values
(mg/L)		 CJRS-10671 CJRS-10672 Susceptibility
Ampicillin 4 0.5 0.5 susceptible
Vancomycin N.R. N.R. N.R. N.R.
Gentamycin 16 8 16 susceptible
Kanamycin 16 128 512 resistance
Streptomycin 64 128 128 Moderate resistance
Erythromycin 1 0.125 0.125 susceptible
Clindamycin 1 0.03125 0.0625 susceptible
Tylosin N.R. N.R. N.R. N.R.
Tetracycline 8 2 1 susceptible
Chloramphenicol 4 32 32 Moderate resistance* Intrinsic resistance (AB Flσrez, 2005)
실시예 5: 균주의 내산 및 내담성 확인
경구제제는 장내에 안정하게 도달하여 효과를 나타내는 것이 중요하기 때문에 경구제제로서의 적합성을 확인하기 위해 내산 및 내담성(내담즙성) 평가를 진행하였다. 구체적으로, 내산성 시험은 1N HCl를 이용하여 pH 3.0으로 보정한 PBS 용액에 2차 계대배양한 균주를 1% 접종하여 37℃에서 2시간 배양 후 초기 생균수와 배양 후의 생균수를 비교하여 진행하였다.
내담성은 1% oxgall(Difco, USA)가 포함된 PBS 용액에 활성시킨 균주를 1% 접종하여 37℃에서 2 시간 배양 후의 생균수를 초기 생균수와 비교하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, CJRS-10671 균주는 초기 생균수 100% 기준으로 95.7%의 내산성 및 136.6%의 내담성을 나타내었고, CJRS-10672 균주는 초기 생균수 100% 기준으로 120.6%의 내산성 및 67.9%의 내담성을 나타내었다.
Bacteria Acid tolerance (%) Bile salts tolerance (%)
CJRS-10671 95.7 ± 12.2 136.6 ± 24.6
CJRS-10672 120.6 ± 31.1 67.9 ± 3.3
실시예 6: 균주의 장부착능 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주의 장내 환경에 대한 안정성 및 적합성을 판단하기 위해 장내 상피세포인 HT-29 세포주(Korean Cell Line Bank, KCLB; Seoul, Korea)를 이용하여 장부착능을 평가하였다. 구체적으로, HT-29 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum) (Gibco, Carlsbad, CA, USA) 및 100 U/mL 페니실린(penicillin)과 0.1 mg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 80% 정도의 단층를 형성할 수 있도록 HT-29 세포주를 1.0X105 cells/24 well로 시딩한 후 DMEM 내에 포함되어 있는 항생제를 제거하기 위해 PBS로 2회 세척하였다. 2차 계대 배양한 균주를 PBS로 2회 세척한 후 항생제 무첨가 DMEM 배지에 재용해하여 2 x 107 CFU/well 의 비율로 처리하였다. 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양한 후 부착되지 않은 세포는 PBS로 3회 세척하여 제거하였고, 부착된 HT-29 및 균주만 트립신-EDTA(ethylene-diamine-tetraacetic acid)를 첨가하여 떼어낸 후 MRS agar를 이용하여 생균수를 측정하였다. 장내부착 정도는 100개의 HT-29 세포주 당 부착되어 있는 균주 CFU 수로 표현하였으며, 대조군으로서 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인펀티스(B. infantis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis) ATCC type 균주를 사용하였다.
그 결과, CJRS-10671 균주의 경우 217 ± 21 bacteria/100 cells 정도의 장부착능을 나타내어 대조군 균주와 동등 이상의 장부착능을 나타냄을 확인하였다(도 3).
실시예 7: 균주에 의한 면역 강화 사이토카인 분비 확인
7-1. 대식세포주에서의 IL(interleukin)-6 분비 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672에 의해 면역세포에서 면역 강화 사이토카인으로 알려진 IL-6 분비가 유도되는지를 측정하였다. 면역세포로서 마우스 대식세포주(Raw 264.7), 인간 단핵구(THP-1)를 사용하였다. 실험에 들어가기 일주일 전에 Raw 264.7 세포주는 10% FBS와 1% Antibiotic-antimycotic가 포함된 DMEM 배지에 계대 배양 및 유지하고, 실험 1일 전 6x104 cells/well로 평평한 96 웰 플레이트에 시딩하였다. THP-1 세포주는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS) 및 2-머캅토에탄올(2-ME) 0.05 mM이 포함된 RPMI 배지에 계대 배양 및 유지하고, 실험 2일 전 8x104 cells/well로 평평한 96 웰 플레이트에 시딩한 후, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) 25ng/ml을 처리하여 인간 단핵구를 인간 대식세포로 2일 동안 분화시켰다. 이후, CJRS-10671, CJRS-10672와 공동배양 시 배지는 항생제가 제외된 10% FBS 포함 배지를 사용하였으며, CJRS-10671, CJRS-10672는 배양 후 Novocyte 장비를 이용하여 총 균수를 측정 및 계산한 뒤 면역세포와 1:10 비율로 처리하였다. 24시간 공동배양 후 배양한 플레이트를 원심분리하여 세포를 가라앉힌 뒤 상층액만 얻어 사이토카인 분비를 확인하였다. BD Biosciences의 BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse/Human Flex Set을 사용하여 분석 시료를 준비하였고 BD Lyric(유세포분석기)으로 reading, FCAP 프로그램으로 결과를 분석하였다.
그 결과, CJRS-10671, CJRS-10672는 마우스 또는 인간 유래 대식세포와 공동배양시 IL-6 분비를 증가시키는 것을 확인하였다(도 4).
7-2. 인간 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)에서의 IL-12p70 분비 확인
CJRS-10671, CJRS-10672에 의해 인간 PBMC에서 면역 강화 사이토카인으로 알려진 IL-12p70 분비가 유도되는지를 측정하였다. 인간 PBMC는 96 웰 플레이트에 2x105 cells/well로 시딩하였다. 이후, CJRS-10671, CJRS-10672와 공동배양 시 배지는 항생제가 제외된 10% FBS 포함 배지를 사용하였으며, CJRS-10671, CJRS-10672는 배양 후 Novocyte 장비를 이용하여 총 균수를 측정 및 계산한 뒤 면역세포와 1:10 비율로 처리하였다. 24시간 배양 후 상층액을 얻어 확인한 결과, CJRS-10671, CJRS-10672는 인간 PBMC와 와 공동배양시 IL-12p70 분비를 증가시키는 것을 확인하였다(도 5).
7-3. 마우스 비장세포(splenocyte), 인간 PBMC에서의 CD8 T 세포의 IFNγ(Interferon-gamma) 분비 확인
세포 독성 T 세포인 CD8 T 세포의 IFNγ의 분비능은 항암 효능에 큰 영향을 준다고 알려져 있다. CJRS-10671, CJRS-10672 균주에 의한 세포 독성 T 세포의 IFNγ의 분비능을 확인하기 위해 마우스 비장세포와 인간 PBMC를 이용하여 CD8+IFNγ+를 확인하였다.
구체적으로, 마우스 비장세포를 분리하기 위해 콜라게나제 IV(collagenase IV)가 포함된 HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)를 주사기를 마우스 비장조직 안쪽에 찔러넣어 세포를 바깥으로 흘러나오게 하였다. 이를 여러 번 번 반복 후 형태가 남은 조직을 주사기를 이용하여 잘게 자르고 37℃에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 0.5M EDTA를 첨가한 37℃에서 5분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 파스퇴르파이펫을 이용하여 세포를 섞어준 후 세포 스트레이너에 걸렀다. 1500 rpm에서 3분 동안 원심분리한 후 1x RBC 용해 버퍼를 이용하여 적혈구를 제거하고 비장세포를 새로운 배지에 현탁하여 실험에 이용하였다.
인간 PBMC는 stemcell technologies 사에서 구입하였으며 수령 후 실험에 이용하기 전까지 질소탱크에 보관하였다. 실험 당일 질소탱크에서 stock을 꺼내어 항온수조에 넣어 녹였다. 10% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지를 넣고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 PBMC를 새로운 배지에 현탁하여 실험에 이용하였다.
마우스 비장세포에서 IFNγ의 분비능을 확인하기 위해서는 T 세포의 자극원이 필요하므로 균주와의 공동배양 1일 전 항-CD3 항체 0.1μg/ml를 PBS에 희석하여 0.1μg/ml 농도로 평평한 96 웰 플레이트에 웰당 100μl 볼륨으로 코팅하였다. 공동배양 당일, 코팅된 플레이트는 PBS로 2번 세척하여 준비하였고, 마우스 비장세포는 프로토콜에 따라 분리한 후 정제된 항-CD28 항체 1μg/ml을 포함하여 코팅된 96 웰 플레이트에 5x105 cells/well로 시딩하였다. 그리고 CJRS-10671, CJRS-10672 균주를 비장세포와 1 : 10 비율로 항생제가 없는 배양배지를 이용하여 공동배양하였다. 공동배양 3일 후 브레펠딘 A(brefeldin A)를 첨가하여 golgi stop 3-4시간 진행 후, BD transcription factor buffer set과 형광항체를 이용하여 확인할 마커들을 염색하여 분석 시료를 준비하였다. 분석 시료는 BD Lyric(유세포분석기) 및 Flowjo 프로그램을 이용하여 분석 후 결과를 확인하였다.
인간 PBMC는 2 x 105 cells/well로 시딩한 후, 공동배양은 상기 실시예 7-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, CJRS-10671, CJRS-10672가 마우스 비장세포, 인간 PBMC에서 CD8 T 세포의 IFNγ 분비능을 증가시키는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 8: 균주에 의한 암세포의 세포주기 조절능 확인
8-1. 암세포의 세포주기 멈춤(Cell cycle arrest) 효과 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주에 의한 암세포주 세포주기 조절 능력을 확인하였다. 암세포주로서 폐암세포주 LLC1(Lewis lung carcinoma, LL/2, LLC1), 대장암세포주 MC38(Murine Carcinoma-38) 세포를 사용하였다. 실험에 들어가기 일주일 전에 LLC1, MC38 세포주는 FBS 10%와 Anti-anti 1%가 포함된 DMEM 배지에서 배양 및 유지하였다. 6 웰 플레이트에 LLC1, MC38 세포주를 각각 2.4x105 cells/well, 1.2x105 cells/well로 시딩하였다. 세포주기를 G0/G1으로 동기화시키기 위해 24시간 후 1x PBS로 2번 세척한 뒤, 0.5% FBS가 포함되어 있고 항생제가 없는 배양배지로 교체하였다. CJRS-10671, CJRS-10672 균주를 암 세포주 : 균주 비율이 1:10, 1:100, 1:1000이 되도록 첨가하였다. 24시간 공동배양 후 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 떼어 1x PBS로 세척 후 세포만 남긴 상태에서 빙냉 75% EtOH 5ml을 넣고 -20℃에 밤새 보관하였다. 이후, Ki67과 PI 형광염색하고 BD Lyric(유세포분석기) 및 Flowjo 프로그램을 이용하여 세포주기 결과를 분석하였다. CJRS-10671, CJRS-10672 균주를 처리하지 않은 군(균주 무처리군)을 대조군으로 하였다.
그 결과, 균주 무처리군에 비해 균주를 처리한 군에서 세포주기 멈춤(Cell cycle arrest) 효과가 나타났으며, 주로 CJRS-10671에 의해 G2/M 주기에서 멈춤 효과가 발생하는 것을 확인하였다(도 7).
8-2. 암세포의 세포주기 멈춤 관련인자인 사이클린 B1(cyclin B1), CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1)의 발현 확인
CJRS-10671, CJRS-10672 균주에 의한 암세포주의 G2/M 세포주기 조절 관련 인자인 사이클린 B1과 CDK1 발현의 변화를 확인하였다. 상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로 LLC1를 CJRS-10671, CJRS-10672 균주와 24시간 공동배양 후 트리졸(trizol)을 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 이로부터 cDNA를 합성하여 QunatStudio 5(real time PCR 기계)를 이용해 PCR을 수행하여 상대발현량을 측정하였다. CJRS-10671, CJRS-10672 균주를 처리하지 않은 군(균주 무처리군)을 대조군으로 하였다.
그 결과, G2/M 멈춤과 관련된 사이클린 B1과 CDK1이 감소하는 것을 확인했으며, 주로 LLC1에서 균주 무처리군에 비해 균주를 처리한 군에서 사이클린 B1과 CDK1의 상대발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 9: 균주에 인한 암세포 사멸 확인
상기 실시예 1의 CJRS-10671, CJRS-10672 균주에 의한 암세포주의 생존율의 변화를 확인하기 위해 LLC1, MC38 세포를 각각 6 웰 플레이트에 2.4x105 cells/well, 1.2x105 cells/well로 시딩하였다. 24시간 후 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체시킨 뒤 24시간 동안 serum starvation을 시켰다. CJRS-10671, CJRS-10672를 암 세포주 : 균주 비율이 1:10, 1:100, 1:1000이 되도록 처리하였고, 24시간 공동배양 후 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 떼어 1x PBS로 세척 후 죽은 세포와 살아있는 세포를 구분하기 위해 Fixable Viability Stain 510 항체로 형광염색하여 BD Lyric(유세포분석기) 및 Flowjo 프로그램을 이용하여 세포생존 결과를 분석하였다. 전체 세포를 100%로 계산하고, 살아있는 세포와 죽은 세포의 비율을 그림에 나타내었다.
그 결과, 균주 무처리군에 비해 균주를 처리한 군에서 세포 생존율이 감소함을 확인하였다(도 9).
실시예 10: 균주에 의한 마우스 폐암(LLC1) 모델에서의 항암 효과 확인
10-1. 종양 억제 효과
폐암 동물 모델을 구축하기 위해 c57BL/6 마우스에 LLC1 세포주 4 x 105 cells/mouse를 피하주사하였다. 종양 세포 주입 후 종양 사이즈가 약 30-50 mm3에 도달 시 마우스를 다음과 같은 군으로 나누었다: 음성대조군(종양 세포 주입 후 무처리), CJRS-10671 또는 CJRS-10672 시료를 처리한 군, 면역 체크포인트 억제제인 항-PD-1을 처리한 군(양성대조군) 및 CJRS-10671 또는 CJRS-10672 시료와 항-PD-1을 병용 처리한 군. CJRS-10671 또는 CJRS-10672 시료는 마리당 109 CFU가 되도록 100 μl PBS에 희석하여 10일 동안 총 10회 투여하였고, 항-PD-1(10mg/kg, BioXCell)는 2일에 1번씩 복강 투여하였다. 주 3번 종양의 크기를 캘리퍼로 측정하였고, 투여종료 다음 날 마우스를 희생하여 종양 무게 측정 및 혈액과 장기를 얻어 분석하였다.
그 결과, CJRS-10671은 단독 투여로도 항-PD-1 단독 투여군에 비해 종양 크기가 감소하였고, 항-PD-1와 병용 투여 시 종양 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다. CJRS-10672는 단독 투여시의 효과는 미미하나 항-PD-1와 병용 투여 시 유의적으로 종양 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(도 10).
10-2. CD8 T 세포의 IFNγ 분비능 확인
상기 실시예 10-1의 시험 종료 후 각 군의 비장조직으로부터 비장세포를 분리한 뒤 106 cells/well로 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 비장세포를 모든 면역세포를 자극시키는 PMA/Ionomycin으로 3-4시간 자극 후 표면 마커 염색과 세포내 사이토카인 염색(Intracellular Cytokine Staining; ICS)를 수행한 뒤 FACS를 통해 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양을 확인하였다. 추가로 CD8 T 세포능을 확인하기 위해서 동일하게 분리한 비장세포를 T 세포를 자극시키는 CD3/CD28(항-CD3 항체 2μg/ml, 항-CD28 항체 2μg/ml)으로 1일 자극 후 표면 마커 염색과 ICS를 수행한 뒤 FACS를 통해 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양을 확인하였다.
그 결과, CJRS-10671와 항-PD-1 병용 투여군에서 모든 면역세포 자극시 유의적으로 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양이 증가하는 것을 확인하였고, T 세포 자극 시에도 CD8 T 세포로부터 IFNγ 분비가 증가하는 경향을 확인하였다(도 11). 또한, CJRS-10672 항-PD-1 병용 투여군에서 모든 면역세포 자극 시에는 항-PD-1 단독 투여군 대비 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양이 유사한 수치를 나타내었지만, T 세포 자극 시 CD8 T 세포로부터 IFNγ 분비가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 12).
10-3. 암 조직 내 CD8 T 세포의 IFNγ 분비능 확인
상기 실시예 10-1의 시험 종료 후 각 군의 종양 조직으로부터 종양내림프구 (Tumor-infiltration lymphocytes; TILs)를 분리한 뒤 T 세포를 자극시키는 CD3/CD28(항-CD3 항체 2μg/ml, 항-CD28 항체 2μg/ml)으로 1일 자극 후 표면 마커 염색과 ICS를 수행한 뒤 FACS를 통해 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양을 확인하였다.
그 결과, CJRS-10671와 항-PD-1 병용 투여군 및 CJRS-10672와 항-PD-1 병용 투여군 모두 T 세포 자극 시 CD8 T 세포가 분비하는 IFNγ의 양이 증가하였다(도 13).
10-4. 면역억제세포의 변화 확인
상기 실시예 10-1의 시험 종료 후 각 군의 비장세포와 종양세포에서 면역억제세포로 알려진 MDSC(Myeloid-derived suppressor cells)의 변화를 CD11b+Gr-1+ 마커로 형광염색하여 FACS를 통해 확인하였다.
그 결과, 음성대조군에서 비장세포에서의 MDSC는 증가하였으나, CJRS-10671와 항-PD-1 병용 투여군 및 CJRS-10672와 항-PD-1 병용 투여군에서 MDSC가 감소되었다. 또한, 종양에서 같은 마커로 확인해 보았을 때에도 음성대조군과 비교하여 CJRS-10671와 항-PD-1 병용 투여군 및 CJRS-10672와 항-PD-1 병용 투여군에서 유의적으로 MDSC가 감소됨을 확인하였다(도 14).
10-5. 면역세포 변화 확인(profiling)
상기 실시예 10-1의 시험 종료 후 각 군의 비장조직에서 비장세포를 분리한 다음 형광 항체를 이용하여 표면 마커 염색을 수행하여 면역세포와 면역억제세포의 변화를 확인하였다. 각 면역세포의 형광 마커는 다음과 같이 사용하였다: M1(CD11b+F4/80+CD86+), M2(CD11b+F4/80+CD206+), DC(IA-IE+CD11b+CD11c+), B 세포(CD3-B220+), NK 세포(CD3-NK1.1+), NKT 세포(CD3+NK1.1+), Treg(CD4+CD25+Foxp3+). 분석 시료는 BD Lyric(유세포분석기) 및 Flowjo 프로그램으로 분석하였으며, 결과는 %와 #로 확인하였다.
그 결과, CJRS-10671, CJRS-10672 단독 투여군 또는 항-PD-1 병용투여군의 경우 M1, DC, NKT 세포의 % 및 #가 타 세포 대비 증가하는 양상을 나타내었다(도 15, 16).
실시예 11. 균주에 의한 마우스 유방암(4T1) 모델에서의 항암 효과 확인
유방암 동물 모델을 구축하기 위해 BALB/c 마우스에 4T1 세포주 3 x 105 cells/mouse를 피하주사하였다. 종양 세포 주입 후 종양 사이즈가 약 30-50 mm3에 도달 시 마우스를 다음과 같은 군으로 나누었다: 음성대조군(종양 세포 주입 후 무처리), CJRS-10672 시료를 처리한 군, 면역 체크포인트 억제제인 항-PD-1을 처리한 군(양성대조군) 및 CJRS-10672 시료와 항-PD-1을 병용 처리한 군. CJRS-10672 시료는 마리당 109 CFU가 되도록 100μl PBS에 희석하여 10일 동안 총 10회 투여하였고, 항-PD-1(10mg/kg, BioXCell)는 2일에 1번씩 복강 투여하였다. 주 3번 종양의 크기를 캘리퍼로 측정하였고, 투여종료 다음 날 마우스를 희생하여 종양 무게 측정 및 혈액과 장기를 얻어 분석하였다.
또한, 수득한 비장 유래 세포 중 면역억제세포인 MDSC의 수를 상기 실시예 10-4와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, CJRS-10672는 음성대조군 또는 항-PD-1을 처리한 군 대비 유방암의 크기를 감소시키는 것을 확인하였으며, 특히 CJRS-10672와 항-PD-1 병용 투여군에서 종양의 크기나 무게가 적어진 개체들을 확인하였다(도 17).
또한, CJRS-10672와 항-PD-1 병용 투여군에서 비장세포 내 면역억제세포인 MDSC의 수가 유의적으로 감소되었다(도 18).
상기 CJRS-10671, CJRS-10672 균주는 각각 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)에 2021년 10월 19일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM13059P, KCCM13060P를 부여 받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (18)

  1. 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하고, 항암제와 병용 투여되는, 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P) 중 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항암제와 병용 투여되는 것인, 조성물.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 항암제는 면역 항암제인 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역 항암제는 항-PD-1(programmed cell death protein 1,), 항-PD-L1(programmed cell death-ligand 1), CTLA4(Cytotoxic T Lymphocyte associated Antigen 4), CTLA4/B7-1/B7-2 상호작용억제제 및 CD47/SIRP(Cluster of Differentiation 47/Signal-regulatory protein) 상호작용억제제, 항-Tim3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3) 및 항-LAG3(Lymphocyte Activating 3)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 항암 요법과 병용되는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항암 요법은 방사선요법(radiotherapy), 네오아쥬번트요법(neoadjuvant therapy), 화학요법(chemotherapy), 표적요법(targeted therapy) 및 광역학 요법(Photodynamic therapy)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 투여방법으로 투여되는 것인, 조성물.
  10. 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이의 배양물 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 폐암, 유방암 또는 대장암의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  13. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  14. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  15. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 염증 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  16. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물.
  17. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품.
  18. 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10671(수탁번호 KCCM13059P) 또는 류코노스톡 메센테로이데스 CJRS-10672(수탁번호 KCCM13060P); 이의 배양물; 또는 이로부터 유래하는 성분을 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물.
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