WO2019074171A1 - 덴드로닉 소수성기를 갖는 새로운 양친매성 화합물 및 이의 활용 - Google Patents

덴드로닉 소수성기를 갖는 새로운 양친매성 화합물 및 이의 활용 Download PDF

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채필석
사더프아이만
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한양대학교 에리카산학협력단
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Definitions

  • the present invention relates to a newly developed amphiphilic compound having a dendronic hydrophobic group and a method for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein using the amphiphilic compound.
  • Membrane proteins play an important role in biological systems. Because these bio-macromolecules contain hydrophilic and hydrophobic moieties, amphiphilic molecules are needed to extract membrane proteins from the lipid environment and to solubilize and stabilize them in aqueous solutions.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 In order to analyze the structure of membrane proteins, it is necessary to obtain good quality membrane protein crystals. For this purpose, structural stability of membrane proteins in aqueous solution should be preceded.
  • the number of existing amphipathic molecules that have been used in membrane protein research is more than 100, but only about 5 have been actively used for membrane protein structure studies. These five ampholytic molecules are OG (n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside), NG (n-nonyl- ⁇ -D-glucopyranoside) dodecyl-? -D-maltopyranoside, and LDAO (lauryldimethylamine- N- oxide) (Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • OG n-octyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • NG n-nonyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • LDAO laauryldimethylamine- N-
  • membrane proteins In order to analyze the structure of membrane proteins, it is important to maintain the structural stability of membrane proteins in aqueous solution. Many membrane proteins have not yet been identified and their structural characteristics vary. The number of membrane proteins available has been limited.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a novel amphipathic compound which promotes the crystallization of a membrane protein by introducing a hydrophobic group having a dendronic structure in which four hydrophobic chains are radially extended at one point.
  • Non-Patent Document 1 S. Newstead et al., Protein Sci . 17 (2008) 466-472.
  • Non-Patent Document 2 S. Newstead et al., Mol . Membr . Biol . 25 (2008) 631-638.
  • An object of the present invention is to provide a compound represented by the formula (1).
  • Another object of the present invention is to provide a composition for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein comprising the above compound.
  • One embodiment of the present invention provides a compound represented by Formula 1:
  • Each of R 1 to R 4 is independently a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 aryl Lt; / RTI >
  • a 1 to A 4 may be -CH 2 -, oxygen (O) or sulfur (S);
  • X 1 to X 3 may each independently be a saccharide linked with oxygen.
  • saccharide refers to a compound that is relatively small in carbohydrate and is soluble in water to give a sweet taste. Saccharides are classified into monosaccharides, disaccharides and polysaccharides depending on the number of molecules constituting the sugar.
  • the saccharide used in the above embodiments may be a monosaccharide or a disaccharide and may specifically be glucose or maltose and more specifically may be maltose but is not limited thereto Do not.
  • the saccharide may act as a hydrophilic group.
  • three saccharides, which are hydrophilic groups are connected in parallel to minimize the increase in the length of the hydrophilic group while reducing the size of the complex with the membrane protein. If the size of the complex of the compound and the membrane protein is small, high quality membrane protein crystals can be obtained (GG Prive, Methods 2007, 41, 388-397).
  • amphiphilic molecules with a small hydrophilic group such as glucoside can have an excellent effect on the crystallization of the membrane protein.
  • R 1 to R 4 can act as a hydrophobic group.
  • alkyl groups having different lengths are introduced into hydrophobic groups.
  • a hydrophobic group and a hydrophilic group may be connected by an ether bond.
  • a linker was introduced to sufficiently secure the fluidity of the alkyl chain while maintaining the rigidity of the center of the molecule.
  • the compound of the present invention is characterized by having a hydrophobic group having a dendritic structure.
  • the dendritic structure is used in various fields including drug delivery, biochemical sensors, and fluorescence imaging, Amphiphilic compound structures have not yet been implemented. This is because it is difficult to synthesize an amphiphilic dendritic structure having a tail structure at both ends. Also, there is a strict restriction of the hydrophobic alkyl chain length of the amphipathic compound, which can be overcome by the introduction of multiple alkyl chains into the dendritic structure.
  • an amide or an amine group is mainly used as a functional group for synthesizing a dendritic structure, but this functional group has a disadvantage that it can not interact favorably with a target membrane protein due to its large polarity and hardness.
  • the compound of the present invention corresponds to an amphipathic compound containing a hydrophobic group of dendritic structure effective for solving the above problems and effective for membrane protein analysis.
  • R & lt ; 1 > R 4 may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group; R 1 to R 4 may be the same; A 1 to A 4 may be oxygen (O) or sulfur (S); X 1 to X 3 may be glucose or maltose linked with oxygen.
  • R 1 to R 4 may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group; R 1 to R 4 may be the same; A 1 to A 4 may be -CH 2 -; X 1 to X 3 may be glucose or maltose linked with oxygen.
  • R & lt ; 1 > R 4 is a C 1 -C 10 unsubstituted alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are -CH 2 -, oxygen (O) or sulfur (S);
  • DTMs dendronic trimaltosides
  • R 1 - R 4 is a C 3 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are -CH 2 -;
  • the X 1 to X 3 are maltose compounds connected to oxygen by the name "DTM-A5" and can be represented by the following formula (2).
  • R 1 - R 4 is a C 4 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are -CH 2 -;
  • the X 1 to X 3 are maltose compounds connected to oxygen by the name "DTM-A6" and can be represented by the following formula (3).
  • R 1 - R 4 is a C 5 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are -CH 2 -;
  • the compound wherein X 1 to X 3 are maltose linked with oxygen is referred to as "
  • DTM-A7 " can be represented by the following formula (4).
  • R 1 - R 4 is a C 6 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are -CH 2 -;
  • the compound in which X 1 to X 3 are maltose linked with oxygen is referred to as "
  • DTM-A8 " can be represented by the following formula (5).
  • R 1 - R 4 is a C 5 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are oxygen (O);
  • the compounds X 1 to X 3 are maltose linked with oxygen is named "DTM-E5" and can be represented by the following formula (6).
  • R 1 - R 4 is a C 6 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are oxygen (O);
  • the X 1 to X 3 are maltose compounds connected to oxygen by the name "DTM-E6" and can be represented by the following formula (7).
  • R 1 - R 4 is a C 7 alkyl group;
  • the R & lt ; 1 & R 4 is the same;
  • a 1 to A 4 are oxygen (O);
  • X 1 to X 3 was named a compound of maltose (maltose) is connected to the oxygen to "DTM-E7", to be represented by the formula 8.
  • the compound according to another embodiment of the present invention may be, but is not limited to, an amphipathic molecule for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein.
  • amphipathic molecule refers to a molecule in which hydrophobic groups and hydrophilic groups are present in a molecule and have affinity for both polar and non-polar solvents.
  • the phospholipid molecules present in the surfactant or cell membrane are amphiphilic molecules having a hydrophilic group at one end and a hydrophobic group at the other end and are characterized in that they form micelles or liposomes in an aqueous solution.
  • Amphiphilic molecules tend to be insoluble in water because hydrophilic groups have polarity but nonpolar groups coexist. However, when the concentration exceeds a certain threshold concentration (critical micelle concentration, CMC), the hydrophobic group aggregates into hydrophobic interactions and micelles are formed on the surface of the hydrophilic group, thereby increasing the solubility in water significantly.
  • CMC critical micelle concentration
  • the method for measuring CMC is not particularly limited, but it can be used in a method widely known in the art, and can be measured by, for example, a fluorescence staining method using diphenylhexatriene (DPH).
  • DPH diphenylhexatriene
  • the compound according to one embodiment of the present invention may have a critical micelle concentration (CMC) in the aqueous solution of 0.0001 mM to 1 mM, specifically 0.0001 mM to 0.01 mM, more specifically 0.003 mM to 0.04 mM, But is not limited thereto.
  • CMC critical micelle concentration
  • DDM which has been mainly used for membrane protein research
  • the DTMs of this specific example have a CMC value much lower than that of DDM, compared with the critical micelle concentration of 0.17 mM. Therefore, it was confirmed that DTMs are more advantageous than DDM because micelles are easily formed with a small amount, and membrane proteins can be effectively analyzed and analyzed using a small amount.
  • Still another embodiment of the present invention provides a composition for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein comprising the above compound.
  • composition may be, but is not limited to, a formulation of micelles, liposomes, emulsions or nanoparticles.
  • the micelle may have a radius of 2.0 nm to 60.0 nm and may be 3.0 nm to 40.0 nm. More specifically, the micelle formed by DTMs according to embodiments of the present invention may have a radius of 3.0 nm to 35.0 nm But is not limited thereto.
  • the method for measuring the radius of micelles is not particularly limited, but a method well known in the art can be used and can be measured using, for example, dynamic light scattering (DLS) experiments.
  • DLS dynamic light scattering
  • the micelle, liposome, emulsion or nanoparticle may contain a membrane protein therein. That is, the micelles, liposomes, emulsions or nanoparticles can extract and enclose membrane proteins present in the cell membrane. Therefore, it is possible to extract, dissolve, stabilize, crystallize or analyze the membrane protein by the micelle.
  • composition may further comprise a buffer, etc., which may aid in the extraction, solubilization, stabilization or analysis of the membrane protein.
  • the present invention also provides a process for preparing a compound represented by the following formula (1), which comprises the following steps 1) to 5):
  • step 4) performing a glycosylation reaction on the product of step 3) to introduce a protecting group-attached saccharide
  • step 5 a step of performing a deprotection reaction on the product of step 4.
  • Each of R 1 to R 4 is independently a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 aryl Lt; / RTI >
  • a 1 to A 4 may be -CH 2 -;
  • X 1 to X 3 may each independently be a saccharide linked with oxygen.
  • the compound prepared according to the above method may be a compound represented by the above Chemical Formulas 2 to 5.
  • the present invention also provides a process for preparing a compound represented by the following formula (1), which comprises the following steps 1) to 5):
  • step 2) reacting the product of step 1) with methallyl dichloride to synthesize ether-functionalized tetra-alkylated mono-ol derivatives;
  • step 4) performing a glycosylation reaction on the product of step 3) to introduce a protecting group-attached saccharide
  • step 5 a step of performing a deprotection reaction on the product of step 4.
  • Each of R 1 to R 4 is independently a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 aryl Lt; / RTI >
  • a 1 to A 4 may be oxygen (O) or sulfur (S);
  • X 1 to X 3 may each independently be a saccharide linked with oxygen.
  • the compound prepared according to the above method may be a compound represented by the above Chemical Formulas 6 to 8.
  • Still another embodiment of the present invention provides a method for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein. Specifically, there is provided a method for extracting, solubilizing, stabilizing, crystallizing or analyzing a membrane protein, comprising treating a membrane protein with a compound represented by the following formula (1) in an aqueous solution:
  • Each of R 1 to R 4 is independently a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 alkyl group, a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 cycloalkyl group, or a substituted or unsubstituted C 1 -C 15 aryl Lt; / RTI >
  • a 1 to A 4 may be -CH 2 -, oxygen (O) or sulfur (S);
  • X 1 to X 3 may each independently be a saccharide linked with oxygen.
  • R & lt ; 1 > R 4 may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group; R 1 to R 4 may be the same; A 1 to A 4 may be oxygen (O) or sulfur (S); X 1 to X 3 may be glucose or maltose linked with oxygen.
  • R 1 to R 4 may be a substituted or unsubstituted C 1 -C 10 alkyl group; R 1 to R 4 may be the same; A 1 to A 4 may be -CH 2 -; X 1 to X 3 may be glucose or maltose linked with oxygen.
  • the compounds may be 7 kinds of compounds represented by the formulas (2) to (8) according to an embodiment of the present invention, but the present invention is not limited thereto.
  • membrane protein is a generic term for proteins or glycoproteins that enter the cell membrane lipid bilayer. It exists in various states, such as through the entire cell membrane, in the surface layer, or in the cell membrane.
  • membrane proteins include, but are not limited to, enzymes, peptide hormones, receptors such as local hormones, acceptors such as sugars, ion channels, and cell membrane antigens.
  • the membrane protein includes any protein or glycoprotein that is introduced into the cell membrane lipid bilayer.
  • the membrane protein includes LHI-RC complex (light harvesting-I and the reaction center complex), UapA (uricacid-xanthine / H + symporter) LeuT (Leucine transporter), G-protein coupled receptors (GPCRs), or a combination of two or more thereof.
  • extraction of membrane protein means separating the membrane protein from the membrane.
  • solubilization of membrane protein refers to dissolving a water-insoluble membrane protein in an aqueous solution in micelles.
  • stabilization of membrane protein means to stably preserve the tertiary or quaternary structure so that the structure and function of the membrane protein are not changed.
  • crystallization of membrane protein means forming crystals of membrane protein in solution.
  • the term " analysis of membrane protein" means analyzing the structure or function of membrane protein.
  • the membrane protein can be analyzed by a known method. For example, it is possible to analyze the structure of the membrane protein using, for example, electron microscopy.
  • amphipathic compounds comprising dendronic hydrophobic groups can be used to store membrane proteins in an aqueous solution for a long period of time in a stable manner compared to conventional compounds, and thus can be utilized for functional analysis and structural analysis thereof.
  • Membrane protein structure and function analysis is one of the most interesting fields in current biology and chemistry. Since more than half of the new drugs being developed are targeted to membrane proteins, studies on protein structures that are closely related to the development of new drugs Application is possible.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the synthesis scheme of the DTM-Es of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the chemical structure of the DTMs of the present invention.
  • DTM-As shows a dynamic light scattering (DLS) profile of micelles formed by (a) DTM-As and (b) DTM-Es.
  • Figure 5 shows the structural stability of the LHI-RC complex dissolved by DTMs (a) at concentrations of CMC + 0.04 wt% and (b) CMC + 0.2 wt% And Fig.
  • FIG. 6 is a graph showing the long-term stability of solubilized LeuT protein by CMC + 0.04 wt% of DTM-As and (b) DTM-Es using SPA (scintillation proximity assay).
  • Figure 8 shows that MelB st protein was extracted at four temperatures (0, 45, 55, 65 ° C) using DTMs or DDM at a concentration of 1.5 wt%, incubated for 90 min at the same temperature, which is the result of measuring the amount of MelB st protein:
  • Figure 9 shows the long-term stability of solubilized beta 2 AR by (a) DDM, DTMs and (b) the long-term SEC profiles of the beta 2 AR-G s complex solubilized in DTM-A6 .
  • FIG. 10 shows the stability of the solubilized ⁇ 2 AR by DDM and DTMs.
  • DDM 0.2 wt% of CMC + ⁇ 2 AR solubilized by DTMs was incubated for 30 min at room temperature and then [ 3 H ] -dihydroalprenolol (DHA).
  • Fig. 11 is a diagram showing the results of EM analysis of the? 2 AR-G s complex which is made soluble by DTM-A6.
  • Dimethyl carbonate (dimethylmalonate, 1.0 eq.)
  • DMSO dimethylmalonate
  • NaH 3.0 eq.
  • Alkyl iodide Alkyl iodide, 2.5 eq.
  • the resulting mixture was stirred at room temperature until the reaction was complete.
  • the reaction was terminated by the addition of cooled 10% NH 4 Cl solution and then washed twice with ethylacetate. Washing the mixture of ethyl acetate (ethylacetate) fractions with brine (brine) and dried over anhydrous Na 2 SO 4.
  • the organic solvent was rotary evaporated to an oily residue, which was obtained by column chromatography purification (EtOAc / hexane) to yield the desired compound A as a colorless oil.
  • the reaction was terminated by the continuous addition of MeOH, water, 1 M HCl solution at 0 < 0 > C and then extracted twice with diethyl ether. Wash the ether fractions were mixed with brine (brine) and dried over anhydrous Na 2 SO 4. After removal of the organic solvent, the objective compound B was obtained in the form of a colorless oil by column chromatography purification (EtOAc / hexane) of the obtained oily residue.
  • the O-benzoylated compound F was dissolved in MeOH, and then a methanol solution of 0.5 M NaOMe was treated in the required amount so that the final concentration of NaOMe was 0.05 M.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 6 hours and neutralized with Amberlite IR-120 (H + form) resin. The resin was filtered off, washed with MeOH, and the solvent was removed in vacuo from the combined filtrate. 50 mL of diethyl ether was added to the residue dissolved in 2 mL of a MeOH: CH 2 Cl 2 (1: 1) mixture to yield the desired compound G as a white solid.
  • DTM-A5a was synthesized with a yield of 65% according to the general glycation procedure of Example 1-6.
  • DTM-A5 was synthesized with a yield of 92% according to the general synthetic procedure for the deprotection-vaporization reaction of Examples 1-7.
  • DTM-A6a was synthesized with a yield of 63% according to the general glycation procedure of Example 1-6.
  • DTM-A7a was synthesized with a yield of 66% according to the general glycation procedure of Example 1-6.
  • DTM-A8a was synthesized with a yield of 62% according to the general glycation reaction procedure of Examples 1-6.
  • DTM-A8 was synthesized with a yield of 94% according to the general synthetic procedure for the deprotection-vaporization reaction of Example 1-7.
  • DTM-Es The synthesis scheme of DTM-Es is shown in Fig. Three compounds of DTM-Es were synthesized according to the synthesis methods of the following ⁇ 2-1> to ⁇ 2-7>, and they are shown in FIG.
  • the O-benzoylated compound F was dissolved in MeOH, and then a methanol solution of 0.5 M NaOMe was treated in the required amount so that the final concentration of NaOMe was 0.05 M.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 6 hours and neutralized with Amberlite IR-120 (H + form) resin. The resin was filtered off, washed with MeOH, and the solvent was removed in vacuo from the combined filtrate. 50 mL of diethyl ether was added to the residue dissolved in 2 mL of a MeOH: CH 2 Cl 2 (1: 1) mixture to yield the desired compound G as a white solid.
  • DTM-E5 was synthesized according to the general synthetic procedure for the deprotection-vaporization reaction of Example 2-7.
  • DTM-E6 was synthesized following the general synthetic procedure for the deprotection-vaporization reaction of Example 2-7.
  • DTM-E7a was synthesized with a yield of 66% according to the general glycation procedure of Example 2-6.
  • DTM-E7 was synthesized according to the general synthetic procedure for the deprotection-vaporization reaction of Example 2-7.
  • the molecular weight (MW), critical micellar concentration (CMC) and hydrodynamic radii ( R ) of the formed micelles were measured to confirm the characteristics of DTMs synthesized according to the synthesis methods of Examples 1 and 2 above h ) was measured.
  • CMC critical micelle concentration
  • DTMs The CMC value of DTMs was much smaller than DDM. CMC values were observed to decrease with increasing alkyl chain length in both DTMs. This means that the longer the alkyl chain, the stronger the hydrophobic interaction between the amphipathic compounds. Thus, it can be seen that DTMs tend to aggregate more readily than DDM in aqueous solutions, since micelles are easily formed at low concentrations.
  • the size of the micelles formed by DTMs ranged from 3.2 to 34.4 nm and it was confirmed that micelles were formed larger than DDM.
  • the size of micelle formed by DTMs increased with increasing alkyl chain length. Further, the size distribution of the micelles formed by the DTMs was analyzed. As a result, it was confirmed that most DTMs except for DTM-A7 and A8 form micelles having homogeneous sizes (FIG. 4).
  • R. capsulatus the stability of the photosynthetic assembly of R. capsulatus was measured using the method described in our 208- th article (PS Chae et al., ChemBioChem 2008, 9, 1706-1709).
  • the inventors used membranes from R. capsulatus , U43 [pUHTM86Bgl] bacteria, which do not have light-harvesting complex II (LHII).
  • R. capsulatus 10 ml aliquots of the membrane lysate were homogenized using a glass homogenizer and incubated for 30 minutes at 32 DEG C with gentle agitation. The homogenized membrane was treated with 1.0 wt% DDM at 32 < 0 > C for 30 min.
  • Membrane debris was ultracentrifuged at 315,000 g for 30 minutes at 4 ° C to collect pellets.
  • the resin containing solution was filtered using 10 HisSpinTrap columns and the individual columns were washed twice with 500 ⁇ L binding buffer containing 10 mM Tris (pH 7.8), 100 mL NaCl and 1 x CMC DDM.
  • the LHI-RC complex purified by DDM was eluted using a buffer containing 1 M imidazole (2 x 300 ⁇ L).
  • 80 ⁇ l of the protein sample was diluted with 920 ⁇ L of DTM-As, DTM-Es, DDM and OG, respectively, so that the final concentration was CMC + 0.04 wt% or CMC + 0.2 wt%.
  • the LHI-RC complexes generated in each detergent were incubated at 25 ° C for 15 days. Protein stability was measured at regular intervals during incubation by measuring the UV-visible spectrum of the sample in the range of 650 nm to 950 nm. Protein integrity was assessed by monitoring absorbance at 875 nm (A 875 ).
  • Leucine transporter protein by DTMs. LeuT protein activity was measured by SPA (scintillation proximity assay) using protein substrate ([ 3 H] -Leu). Concentrations of DTMs or DDM were used for CMC + 0.04 wt% and CMC + 0.2 wt%.
  • LeuT leucine transporter
  • LeuT is expressed in E. coli C41 (DE3) transformed with pET16b encoding the C-terminal 8xHis-tagged transporter (expression plasmids are provided by Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA ).
  • LeuT protein was isolated and dissolved in 1.0 wt% DDM, then the protein was bound to Ni 2 + -NTA resin (Life Technologies, Denmark) and resuspended in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl , 199 mM KCl, 0.05% DDM and 300 mM imidazole.
  • Salmonella typhimurium MelB St (melibiose permease) having a 10-His tag at its C-terminus was digested with E. coli DW2 cells ( ⁇ melB and ⁇ melB) using the plasmid pK95 ⁇ AHB / WT MelB St / 0.0 > lacZY). ≪ / RTI > Cell growth and membrane preparation were performed according to the method described in AS Ethayathulla et al . ( Nat. Commun . 2014, 5 , 3009). Protein assays were performed with a Micro BCA kit (Thermo Scientific, Rockford, Ill.). PS Chae et al . , Nat.
  • Methods 2010, 7, 1003-1008 were used to evaluate DTMs or DDM for MelB St stability.
  • (Final protein concentration: 10 mg / mL) containing MelB St was dissolved in a dissolution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% glycerol , 20 mM melibiose) at four temperatures (0, 45, 55, 65 ° C) for 90 minutes.
  • a dissolution buffer (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% glycerol , 20 mM melibiose) at four temperatures (0, 45, 55, 65 ° C) for 90 minutes.
  • ultracentrifugation was performed at 355,590 g with a Beckman Optima TM MAX ultracentrifuge equipped with a TLA-100 rotor at 4 ° C for 45 minutes.
  • RSO vesicles were prepared and subjected to Trp ⁇ D 2 G FRET analysis.
  • RSO membrane vesicles were prepared by osmotic lysis from E. coli DW2 cells containing either MelB St or MelB Ec . 1.0% of the individual compounds (DDM, DTM-A5 and DTM-A6) were added to the RSO membrane vesicles mixed in buffer (pH 7.5) containing 100 mM KPi and 100 mM NaCl at a protein concentration of 1 mg / Min and ultracentrifuged using TLA 120.2 rotor over 300,000 g for 45 min at 4 < 0 > C.
  • the supernatant was applied to the FRET (Trp ⁇ D 2 G) experiment using the Amico-Bowman Series 2 (AB2) Spectrofluorometer.
  • the D 2 G FRET signals of MelB St and MelB Ec were collected at 490 and 465 nm, respectively, at the excitation of Trp residues at 290 nm. 10 ⁇ M D and G 2 each was added in one minute and 2 minute mark excess melibiose or the same amount of water (control) in MelB solution.
  • DTM-A5 and DTM-A6 in DTMs most effectively solubilized MelB st protein when the temperature was raised to 55 ° C. MelB st protein solubilization did not occur by DDM and DTMs at a temperature of 65 ° C.
  • DTM-E6, DTM-A5, and DTM-A6 increased the protein extraction efficiency at higher temperatures (0 ° C) compared to DTMs And DTMs were superior to DDM at higher temperature (55 ° C), indicating that DTMs are superior to DDM in terms of protein solubility stability with temperature.
  • the MelB protein solubilized by DDM retained the protein function only for one of the two homologues, whereas the MelB protein solubilized by DTM-A5 and DTM-A6 retained the two phases Protein function was maintained in all of the body.
  • DTM-A5 and DTM-A6 were found to be more effective than solubilization of MelB protein and better in maintaining the protein function than DDM.
  • Receptors were expressed in Sf9 insect cells infected with baculovirus and solubilized in 1% DDM.
  • the solubilized receptor in DDM was purified by alprenolol sepharose on a 0.01% cholesteryl succinate (CHS) dependent load.
  • CHS cholesteryl succinate
  • the ⁇ 2 AR purified by DDM was diluted with a buffer containing DDM or DTMs (DTM-A6, DTM-A7 or DTM-E7) to a final concentration of CMC + 0.2 wt%.
  • DTM-A6 and DTM-E7 in DTMs showed the ability to maintain the initial activity of solubilized receptors similar to DDM (FIG. 9).
  • receptors solubilized by DDM and DTM-E7 exhibited rapid loss of activity over time, while receptors solubilized in DTM-A6 and DTM-A7, over a 4-day incubation period, (Fig. 9 (a)).
  • DTM-As having a long alkyl chain generally has better ability to maintain the receptor protein activity than Q-TM-Es.
  • DTM-A6 and DTM-A7 are thought to be more effective in studying solubilized receptor proteins than DDM.
  • the 100 ⁇ M ⁇ 2 AR solubilized in 0.1% DDM at room temperature for 30 minutes was mixed with 120 ⁇ M G s heteroaryl trimmer (heterotrimer). 0.5 unit apyrase (NEB), and 2 mM MgCl 2 with the addition that promote the complex formation was then further incubated for 1 hour. The sample was then incubated for an additional 30 min to make a final concentration of 0.8% by adding 1% DTM-A6 and change from DDM to DTM-A6.
  • Protein solution was added to the M1 flag column and the protein was completely changed from DDM to DTM-A6 by washing with a series of buffers in which the molar ratio of 0.1% DDM buffer to 0.5% DTM-A6 buffer was different and the protein was dissolved in 0.05% (70xCMC) DTM- And finally eluted.
  • Preparative gel filtration was performed to purify the? 2 AR-G s complex with running buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.005% DTM-A6, 1 mM BI, 100 mM TCEP).
  • Analytical gel filtration was used to measure the stability of the ⁇ 2 AR-G s complex in DTM-A6. However, DTM-A6 (without compound) was used after 3 and 15 days of incubation, . ≪ / RTI >
  • the ⁇ 2 AR-G s protein complex was prepared for electron microscopy using a conventional negative staining protocol and imaged at room temperature on a Tecnai T12 electron microscope operating at 120 kV using a low-volume procedure. Images were recorded on a Gatan US4000 CCD camera at a magnification of 71,138x and a defocus value of about -1.1 [mu] m. All images were binned (2x2 pixels) to obtain a pixel size of 4.16 A at the sample level. Particles were manually removed using e2boxer (part of the EMAN2 software suite). 2D reference-free alignment and particle projection classification were performed using ISAC. The 124,279 projection of ⁇ 2 AR-G s was applied to the ISAC generating 131 classes that are consistent for bidirectional matching and 10,000 particle projections.
  • the particles generated from the ⁇ 2 AR-G s complex purified by DTM-A6 were found to be highly homogeneous, unlike the aggregated form of the particles observed in the complex purified by DDM in previous studies.
  • the components ( ⁇ 2 AR, G ⁇ s and G ⁇ ⁇ ) of the complex seen in a representative 2D class image were clearly distinguished (FIG. 11 b, c).
  • the EM image of this protein complex obtained through the use of DTM-A6 was clearer and clearer than the composite image obtained with other amphipathic molecules. This indicates that the amphiphilic compound of the present invention has an important potential to explain the structural and dynamic structural changes of the membrane protein complex through EM analysis.

Abstract

본 발명은 덴드로닉 소수성기를 갖는 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물을 이용하면 막단백질 가용화 효과가 우수할 뿐 아니라 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있기 때문에, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 특히 본 덴드로닉 소수성기를 갖는 양친매성 화합물들은 전자현미경을 통한 단백질복합체의 가시화에 매우 탁월한 특성을 보여주었다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이고, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타깃으로 하므로 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 막단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

Description

덴드로닉 소수성기를 갖는 새로운 양친매성 화합물 및 이의 활용
본 발명은 새롭게 개발한 덴드로닉 소수성기를 갖는 양친매성 화합물 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.
막단백질(membrane proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 지질 환경으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.
막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 충분히 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다.
막단백질의 구조분석을 위해서 수용액 상에서의 막단백질의 구조적 안정성을 유지하는 것이 중요한 부분이고, 막단백질은 아직까지 밝혀지지 않은 종류가 많고 그 구조적 특성이 다양하기 때문에 기존에 쓰이고 있는 양친매성 분자로 밝힐 수 있는 막단백질의 수는 한계가 있어 왔다.
본 발명자들은 하나의 지점에서 4개의 소수성 사슬이 방사선상으로 뻗어있는 수상 돌기(dendronic) 구조를 지닌 소수성기 도입함으로써 막단백질 결정화를 촉진하는 새로운 구조의 양친매성 화합물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
(비특허문헌 1) S. Newstead et al., Protein Sci . 17 (2008) 466-472.
(비특허문헌 2) S. Newstead et al., Mol . Membr . Biol . 25 (2008) 631-638.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
상기 R1 내지 R4 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기일 수 있고;
상기 A1 내지 A4는 -CH2-, 산소(O) 또는 황(S)일 수 있고;
상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.
상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있고, 보다 구체적으로 말토오스(maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성기인 당류 3개를 병렬로 연결하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다. 상기 화합물과 막단백질과의 복합체의 크기가 작으면 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있다 (G. G. Prive, Methods 2007, 41, 388-397). 특히, 글루코사이드(glucoside)와 같은 작은 친수성기를 갖고 있는 양친매성 분자는 막단백질 결정화에 있어서 탁월한 효과를 가질 수 있다.
또한, 상기 R1 내지 R4 는 소수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성도와 소수성도의 밸런스(hydrophile-lipophile balance)를 최적으로 하기 위하여 길이가 다른 알킬기를 소수성기로 도입하였다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 에터(ether) 결합에 의해 소수성기와 친수성기가 연결되어 있을 수 있다. 즉, 분자 중심부의 강직도(rigidity)를 유지하면서 알킬 사슬의 유동성을 충분히 확보하기 위한 링커를 도입하였다.
또한 본 발명의 화합물은 수상 돌기(dendritic) 구조의 소수성기를 가지고 있음을 특징으로 하는데, 상기 수상 돌기 구조는 약물 전달, 생화학적 센서, 형광 이미징을 포함하는 다양한 분야에서 사용되고 있으나, 막 단백질 연구를 위한 양친매성 화합물 구조에서는 아직 구현된 바 없다. 그 이유는 양측 말단에 꼬리 구조를 가지는 양친매성 수상 돌기 구조를 합성하는 것이 어렵기 때문이다. 또한, 양친매성 화합물의 소수성 알킬 사슬 길이의 엄격한 제한이 따르는데, 수상 돌기 구조에는 다수의 알킬 사슬의 도입을 통해서 이를 극복할 수 있다. 아울러, 수상 돌기 구조를 합성하는 작용기로 주로 아미드 또는 아민기가 사용되나, 이러한 작용기는 극성이 크고 경질되어 표적 막 단백질과 유리하게 상호작용할 수 없는 단점이 있기 때문이다.
이에 본 발명의 화합물은 상기 문제를 해결하여 막 단백질 분석에 효과적인 수상 돌기 구조의 소수성기를 포함하는 양친매성 화합물에 해당한다.
구체적으로, 상기 R1 내지 R4는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있고; 상기 R1 내지 R4는 동일할 수 있고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)일 수 있고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 글로코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
또한, 상기 R1 내지 R4는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있고; 상기 R1 내지 R4는 동일할 수 있고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-일 수 있고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 글로코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 R1 내지 R4는 C1-C10 비치환 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4 는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-, 산소(O) 또는 황(S)이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTMs(dendronic trimaltosides)"로 명명하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C3 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-A5"로 명명하였고, 하기 화학식 2으로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000002
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C4 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-A6"로 명명하였고, 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000003
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C5 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-A7"로 명명하였고, 하기 화학식 4으로 표시될 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000004
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C6 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-A8"로 명명하였고, 하기 화학식 5으로 표시될 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000005
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C5 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O)이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-E5"로 명명하였고, 하기 화학식 6으로 표시될 수 있다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000006
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C6 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O)이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-E6"로 명명하였고, 하기 화학식 7으로 표시될 수 있다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000007
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, R1 내지 R4는 C7 알킬기이고; 상기 R1 내지 R4는 동일하고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O)이고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "DTM-E7"로 명명하였고, 하기 화학식 8으로 표시될 수 있다.
[화학식 8]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000008
본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 존재하여 극성, 비극성 용매에 대해 2가지 성질 모두에 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 물에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하여 친수성기가 표면에 오는 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.
CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 널리 알려진 방법으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 mM 내지 1 mM일 수 있으며, 구체적으로, 0.0001 mM 내지 0.01mM, 보다 구체적으로, 0.003 mM 내지 0.04 mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 DTMs은 DDM 보다 매우 작은 CMC 값을 가졌다. 따라서, DTMs은 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 유리함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 60.0 nm일 수 있고, 구체적으로 3.0 nm 내지 40.0 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 본 발명의 실시예들에 따른 DTMs에 의해 형성된 미셀은 반지름이 3.0 nm 내지 35.0 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.
DTMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 범위가 넓게 나타남을 확인할 수 있다.
상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부에 막단백질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막 내부에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 5)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) 다이메틸말로네이트(dimethylmalonate)에 알킬기를 도입하고 환원시켜 다이알킬화된 모노올 유도체(dialkylated mono-ol derivatives)를 합성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 첨가하여 4개의 알킬기가 도입된 메탈릴 다이에터(tetra-alkylated methallyl diether)을 합성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)을 반응시켜 테트라알킬화된 트리올 유도체(tetra-alkylated tri-ol derivatives)을 합성하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000009
상기 화학식 1에서,
상기 R1 내지 R4 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기일 수 있고;
상기 A1 내지 A4는 -CH2- 일 수 있고;
상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
상기 방법에 따라 제조된 화합물은 상기 화학식 2 내지 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 5)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) 지방족 알코올(aliphatic alcohol) 또는 알킬싸이올(alkylthiol)과 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 반응시켜 다이알킬화된 모노올 유도체(ether-functionalized dialkylated mono-ol derivatives) 를 합성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 반응시켜 테트라알킬화된 모노올 유도체(ether-functionalized tetra-alkylated mono-ol derivatives)을 합성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)을 반응시켜 테트라알킬화된 트리올 유도체(tetra-alkylated tri-ol derivatives)을 합성하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000010
상기 화학식 1에서,
상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기일 수 있고;
상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)일 수 있고;
상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
상기 방법에 따라 제조된 화합물은 상기 화학식 6 내지 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002459-appb-I000011
상기 화학식 1에서,
상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기일 수 있고;
상기 A1 내지 A4는 -CH2-, 산소(O) 또는 황(S)일 수 있고;
상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 내지 R4는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있고; 상기 R1 내지 R4는 동일할 수 있고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)일 수 있고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 글로코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
또한, 상기 R1 내지 R4는 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있고; 상기 R1 내지 R4는 동일할 수 있고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-일 수 있고; 상기 X1 내지 X3은 산소로 연결된 글로코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 2 내지 8로 표시되는 7종의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬, 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 LHI-RC 복합체(light harvesting-I and the reaction center complex), UapA (uricacid-xanthine/H+ symporter), MelB (melibiose permease), LeuT (Leucine transporter), GPCRs (G-protein coupled receptors) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 덴드로닉 소수성기를 포함하는 양친매성의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.
막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이며, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타깃으로 하고 있으므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.
도 1는 본 발명의 DTM-As의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 DTM-Es의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 DTMs의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 (a) DTM-As 와 (b) DTM-Es 에 의해 형성된 마이셀들의 Dynamic light scattering (DLS) 프로파일을 나타낸 도이다.
도 5는 (a) CMC+0.04 wt% 농도 및 (b) CMC+0.2 wt% 농도로 각각 사용된 DTMs에 의해 용해된 LHI-RC complex의 일정한 기간 간격에 따른 구조적 안정성을 875 nm의 흡광도를 모니터링하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 CMC+0.04 wt% 농도의 (a) DTM-As 및 (b) DTM-Es에 의한 가용화된 LeuT 단백질의 장기간 안정성을 SPA(scintillation proximity assay)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 CMC+0.2 wt% 농도의 (a) DTM-As 및 (b) DTM-Es에 의한 가용화된 LeuT 단백질의 장기간 안정성을 SPA(scintillation proximity assay)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 DTMs 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelBst 단백질을 4개의 온도(0, 45, 55, 65 ℃)에서 추출 후, 90분 동안 같은 온도에서 인큐베이션하여 추출 후, 수용액에 용해되어 있는 MelBst 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelBst 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과;
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelBst 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram); 및
(c) 갈락토사이트 결합 분석(galactoside-binding assay) 결과.
도 9는 (a) DDM, DTMs에 의한 가용화된 β2AR의 장기간 안정성 및 (b) DTM-A6에 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 장기간 SEC 프로파일(long-term SEC profiles)을 나타낸 것이다.
도 10은 DDM, DTMs에 의한 가용화된 β2AR의 안정성을 측정한 결과로, CMC+0.2 wt%농도의 DDM 및 DTMs에 의해 가용화된 β2AR을 30분 동안 상온에서 incubation 한 후 [3H]-dihydroalprenolol (DHA)를 사용하여 단백질 활성을 측정하였다.
도 11은 DTM-A6에 의해 가용하된 β2AR-Gs 복합체의 EM 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> DTM-As의 합성 방법
DTM-As의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-7>의 합성 방법에 따라 DTM-As의 4종의 화합물을 합성하여 도 3에 나타내었다.
<1-1> 다이알킬화된 다이메틸말로네이트(dialkylated dimethylmalonate)의 일반 합성 절차 (도 1의 화합물 A)
다이메틸말로네이트(dimethylmalonate, 1.0 당량)를 N2 대기하에서 DMSO와 혼합된 NaH(3.0 당량)의 용액에 적가하였다. 알킬 아이오다이드(Alkyl iodide, 2.5 당량)를 가스 추출이 중단된 후에 분별로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 반응이 완결될 때까지 실온에서 교반하였다. 냉각된 10% NH4Cl 용액을 첨가하여 반응을 종결시킨 후 에틸아세테이트(ethylacetate)로 두 번 세척하였다. 혼합 에틸아세테이트(ethylacetate) 분획을 염수(brine)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 회전 증발시켜 유성 잔류물을 얻었으며, 컬럼크로마토 그래피 정제(EtOAc/헥산)에 의해 목적 화합물 A를 무색의 오일형태로 수득하였다.
<1-2> 화합물 A의 크랍초 디카복실레이션(Krapcho's decarboxylation) 및 다이알킬화된 모노에스터의 환원(reduction of dialkylated monoesters) 절차 (도 1의 단계 a)
DMSO과 혼합된 화합물 A(1.0 당량)의 용액에 LiCl(2.2 당량) 및 H2O(1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 12시간 동안 환류시키면서 가열한 후 물로 희석하였다. 희석된 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 2회 세척하였다. 혼합 유기 분획을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 제거한 후에 수득된 유성 잔류물을 더 정제하지 않고 환원시켰다. THF와 혼합된 다이알킬화된 모노메틸에스터(dialkylated monomethylester)의 냉각 용액에 LiAlH4(2.2 당량)를 첨가하였다. 생성된 회색 슬러리를 N2 대기하에 실온에서 6시간 동안 교반하였다. MeOH, 물, 1M HCl 용액을 0℃에서 연속적으로 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, 다이에틸 에터(diethyl ether)로 2회 추출하였다. 혼합 에터 분획을 염수(brine)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 제거한 후 수득된 유성 잔류물의 컬럼크로마토그래피 정제 (EtOAc/헥산)에 의해 목적 화합물 B를 무색의 오일형태로 수득하였다.
<1-3> 테트라알킬화된 메탈릴 다이에터(tetra-alkylated methallyl diether) 의 일반 합성 절차(도 1의 단계 b)
DMF와 잘 교반된 화합물 B 용액(2.5 당량)에 NaH(3.0 당량)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 불활성 대기하에서 50℃로 30분 동안 가열한 후, 실온에서 메탈릴 클로라이드(methallyl dichloride, 1.0 당량)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 70℃에서 24시간 동안 교반하였다. 메탄올을 첨가한 다음 에틸아세테이트로 희석하여 반응을 종료시켰다. 유기 분획을 물, 염수로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 C를 수득하였다.
<1-4> 하이드로보레이션(hydroboration)의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 c)
THF 와 혼합된 화합물 C(1.0 당량) 및 BH3-THF(1M, 1.1 당량)의 용액을 0℃, N2 대기하에 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 3M NaOH 용액(2.2 당량)으로 종료시킨 다음 30 wt% H2O2를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 더 교반하고, 다이에틸 에터(diethyl ether)로 희석시켰다. 희석된 반응 혼합물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 정제하여 목적 화합물 D를 수득하였다.
<1-5> 테트라알킬화된 트리올(tetra-alkylated tri-ol)의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 d)
DMF와 혼합된 화합물 D(1.0 당량) 용액에 NaH(3.0 당량)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 50℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, THF에 용해된 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄 (4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane, 3.0 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 가열하였다. 메탄올로 반응을 종료시킨 후, 유기 용매를 감압하에 제거하였다. 생성된 고체 잔류물을 다이에틸 에터로 용해시키고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 농축시킨 후, 생성된 유성 잔류물을 DCM/MeOH 혼합물에 용해시켰다. 이 용액에 농축 HCl 수 방울을 적가하고 생성된 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열 하였다. NaOH로 중화시키고 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 E를 수득하였다.
<1-6> 당화(maltosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 e)
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 E(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 말토실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide, 3.6 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 F를 유리질 고체형태로 수득하였다.
<1-7> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 g)
O-벤조일화된 화합물 F(O-benzoylated compound F)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 목적 화합물 G를 백색 고체형태로 수득하였다.
<제조예 1> DTM-A5의 합성
<1-1> Dimethyl 2-pentylmalonate (화합물 A1)의 합성
실시예 1-1의 절차에 따라 화합물 A1을 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.69 (s, 6H), 1.34-1.05 (m, 16H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 57.8, 52.4, 32.5, 32.2, 23.9, 22.6, 14.2.
<1-2> 2-pentylheptan-1-ol (화합물 B5)의 합성
실시예 1-2의 절차에 따라 화합물 B5를 89%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.48-1.40 (m, 1H), 1.36-1.18 (m, 16H), 0.87 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 65.8, 40.7, 32.5, 31.1, 26.7, 22.9, 14.3.
<1-3> 6-(((2-(((2-pentylheptyl)oxy)methyl)allyl)oxy)methyl)undecane (화합물 C9)의 합성
실시예 1-3의 절차에 따라 화합물 C9를 72%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.14 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.60-1.53 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 32H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.5, 113.0, 73.7, 71.7, 38.3, 31.9, 29.8, 26.8, 22.7, 14.1.
<1-4> 3-((2-pentylheptyl)oxy)-2-(((2-pentylheptyl)oxy)methyl)propan -1-ol (화합물 D13)의 합성
실시예 1-4의 절차에 따라 화합물 D13을 88%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.76 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 3.53-3.48 (m, 4H), 3.29 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 2.12-2.05 (m, 1H), 1.56-1.50 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 32H), 0.88 (t, J = 4.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.9, 71.6, 65.4, 41.4, 38.4, 32.1, 30.0, 27.0, 22.9, 14.3.
<1-5> 2-(hydroxymethyl)-2-((3-((2-pentylheptyl)oxy)-2-(((2-pentylheptyl)oxy)methyl)propoxy)methyl)propane-1,3-diol (화합물 E17)의 합성
실시예 1-5의 절차에 따라 화합물 E17을 42%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.62 (s, 6H), 3.41 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 3.38 (s, 2H), 3.32 (d, J = 4.0 Hz, 4H) 3.18 (d, J = 4.0 Hz, 4H), 2.97 (br s, 3H), 2.10-2.07 (m, 1H), 1.50-1.41 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.8, 73.6, 71.0, 69.7, 64.9, 45.2, 40.2, 38.3, 32.5, 31.6, 26.7, 22.9, 14.3.
<1-6> DTM-A5a의 합성
실시예 1-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-A5a를 65%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.87-7.84 (m, 18H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.55-7.45 (m, 18H), 7.43-7.31 (m, 36H), 7.27-7.21 (m, 9H), 6.08 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.65 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 5.62 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.18-5.08 (m, 6H), 4.55 (q, J = 12.0 Hz, 6H), 4.30-4.22 (m, 9H), 4.16-4.10 (m, 3H), 3.68 (t, J = 10.0 Hz, 6H), 3.17-3.04 (m, 15H), 2.97 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 1.96-1.87 (m, 1H), 1.48-42 (m, 2H), 1.28-1.08 (m, 32H), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.0, 165.7, 165.4, 164.9, 164.7, 133.4, 133.1, 129.8, 129.6, 129.5, 129.4, 129.3, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 100.9, 95.8, 74.7, 74.3, 72.3, 71.2, 70.2, 69.8, 69.1, 68.9, 68.8, 67.7, 63.4, 62.4, 60.3, 53.5, 44.8, 40.1, 38.2, 31.9, 31.4, 29.8, 26.8, 22.7, 20.9, 14.2.
<1-7> DTM-A5의 합성
실시예 1-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-A5을 92%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.14 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.97 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.87 (m, 3H), 3.83-3.79 (m, 6H), 3.68-3.58 (m, 15H), 3.52 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 3.47-3.42 (m, 9H), 3.31-3.30 (m, 3H), 3.30-3.28 (m, 3H), 3.27-3.21 (m, 9H), 2.15-2.07 (m, 1H), 1.61-1.52 (m, 2H), 1.39-1.21 (m, 32H), 0.91 (t, J = 7.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): 105.0, 102.9, 81.3, 77.8, 76.5, 75.5, 75.1, 74.8, 74.2, 71.5, 70.4, 70.1, 62.7, 62.3, 48.5, 46.6, 41.6, 39.5, 33.6, 32.7, 27.7, 23.8, 14.7. HRMS (FAB+): calcd. for C69H128O36 [M+Na]+ 1555.8083, found 1555.8087.
<제조예 2> DTM-A6의 합성
<2-1> Dimethyl 2-hexylmalonate (화합물 A2)의 합성
실시예 1-1의 절차에 따라 화합물 A2을 92%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.84 (m, 4H), 1.35-1.10 (m, 12H), 1.09-1.05 (m, 4H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.6, 57.8, 52.4, 32.5, 31.7, 29.6, 24.1, 22.7, 14.2.
<2-2> 2-hexyloctan-1-ol (화합물 B6)의 합성
실시예 1-2의 절차에 따라 화합물 B6를 87%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.53 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 1.47-1.43 (m, 1H), 1.38-1.18 (m, 20H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 65.2, 40.5, 32.0, 30.6, 26.9, 25.9, 22.7, 14.3.
<2-3> 7-(((2-(((2-hexyloctyl)oxy)methyl)allyl)oxy)methyl)tridecane (화합물 C10)의 합성
실시예 1-3의 절차에 따라 화합물 C10을 72%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.15 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 1.60-1.53 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.5, 113.0, 73.7, 71.7, 38.3, 31.9, 31.5, 29.8, 26.8, 22.7, 14.1.
<2-4> 3-((2-hexyloctyl)oxy)-2-(((2-hexyloctyl)oxy)methyl)propan-1-ol (화합물 D14)의 합성
실시예 1-4의 절차에 따라 화합물 D14를 86%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.76 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.55-3.46 (m, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.93 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 2.14-2.07 (m, 1H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.9, 71.6, 65.3, 41.4, 38.5, 32.1, 31.6, 29.9, 27.0, 22.9, 14.3.
<2-5> 2-((3-((2-hexyloctyl)oxy)-2-(((2-hexyloctyl)oxy)methyl) propoxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (화합물 E18)의 합성
실시예 1-5의 절차에 따라 화합물 E18을 44%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 6H), 3.51 (br s, 3H), 3.46 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.39 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 3.25 (d, J = 4.2 Hz, 4H), 2.17-2.11 (m, 1H), 1.54-1.41 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.8, 73.4, 70.8, 69.6, 64.2, 45.2, 40.2, 38.2, 32.0, 31.6, 29.9, 26.9, 22.8, 14.3.
<2-6> DTM-A6a의 합성
실시예 1-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-A6a를 63%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.13 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 8.05 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.94-7.87 (m, 18H), 7.81 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.70 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.56-7.53 (m, 6H), 7.48-7.40 (m, 18H), 7.38-7.33 (m, 12H), 7.31-7.27 (m, 15H), 7.24 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 7.16 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 6.18 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.73 (t, J = 12.0 Hz, 6H), 5.51 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.26-5.20 (m, 6H), 4.64 (q, J = 12.0 Hz, 6H), 4.42-4.34 (m, 9H), 4.24 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.80 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.75 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 3.31-3.06 (m, 18H), 2.05-1.97 (m, 1H), 1.56-1.48 (m, 2H), 1.34-1.20 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.0, 165.7, 165.4, 164.9, 164.7, 133.4, 133.1, 129.8, 129.6, 129.5, 129.4, 129.3, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 100.9, 95.8, 74.7, 74.3, 72.3, 71.2, 70.2, 69.8, 69.1, 68.9, 68.8, 67.7, 63.4, 62.4, 60.3, 53.5, 44.8, 40.1, 38.2, 31.9, 31.4, 31.3, 29.8, 26.8, 22.7, 20.9, 14.2.
<2-7> DTM-A6의 합성
실시예 1-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-A6을 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.13 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.96 (d, J = 10.0 Hz, 3H), 3.84 (m, 3H), 3.81-3.79 (m, 7H), 3.67-3.60 (m, 15H), 3.54 (t, J = 11.6 Hz, 3H), 3.45-3.42 (m, 9H), 3.38-3.30 (m, 3H), 3.26-3.22 (m, 10H), 2.14-2.09 (m, 1H), 1.60-1.50 (m, 2H), 1.37-1.22 (m, 40H), 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.1, 102.9, 81.4, 77.8, 76.6, 75.6, 75.1, 74.8, 74.2, 71.5, 70.4, 70.1, 62.8, 62.3, 48.5, 46.6, 41.7, 39.5, 33.2, 32.8, 32.7, 31.0, 28.0, 23.9, 14.7. HRMS (FAB+): calcd. for C73H136O36 [M+Na]+ 1611.8709, found 1611.8707.
<제조예 3> DTM-A7의 합성
<3-1> Dimethyl 2-heptylmalonate (화합물 A3)의 합성
실시예 1-1의 절차에 따라 화합물 A3을 92%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.69 (s, 6H), 1.34-1.15 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 57.8, 52.4, 32.5, 32.0, 30.0, 29.2, 24.2, 22.9, 14.3.
<3-2> 2-heptylnonan-1-ol (화합물 B7)의 합성
실시예 1-2의 절차에 따라 화합물 B7를 85%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.53 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 1.47-1.43 (m, 1H), 1.35-1.19 (m, 24H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 65.9, 40.7, 32.1, 31.1, 30.2, 29.5, 27.1, 22.9, 14.3.
<3-3> 8-(((2-(((2-heptylnonyl)oxy)methyl)allyl)oxy)methyl) pentadecane (화합물 C11)의 합성
실시예 1-3의 절차에 따라 화합물 C11을 74%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.15 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.60-1.53 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 48H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.7, 113.2, 74.0, 71.9, 38.5, 32.1, 31.7, 30.3, 29.6, 27.1, 22.9, 14.3.
<3-4> 3-((2-heptylnonyl)oxy)-2-(((2-heptylnonyl)oxy)methyl)propan-1-ol (화합물 D15)의 합성
실시예 1-4의 절차에 따라 화합물 D15를 86%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.76 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.55-3.46 (m, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.92 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 2.12-2.07 (m, 1H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 48H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 75.0, 71.8, 63.3, 41.4, 38.5, 32.1, 30.2, 29.9, 29.5, 27.0, 22.8, 14.2.
<3-5> 2-((3-((2-heptylnonyl)oxy)-2-(((2-heptylnonyl)oxy)methyl) propoxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (화합물 E19)의 합성
실시예 1-5의 절차에 따라 화합물 E19을 44%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.69 (s, 6H), 3.48 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 3.39 (d, J = 4.0 Hz, 4H), 3.25 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 3.03 (br s, 3H), 2.17-2.14 (m, 1H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 48H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.9, 73.6, 70.9, 69.7, 65.0, 45.2, 40.2, 38.3, 32.1, 31.6, 30.3, 29.6, 27.0, 22.9, 14.3.
<3-6> DTM-A7a의 합성
실시예 1-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-A7a를 66%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.87-7.84 (m, 18H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.53-7.44 (m, 18H), 7.43-7.31 (m, 36H), 7.27-7.21 (m, 9H), 6.09 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.65 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 5.62 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 5.42 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.18-5.09 (m, 6H), 4.55 (q, J = 12.0 Hz, 6H), 4.34-4.23 (m, 9H), 4.17-4.11 (m, 3H), 3.68 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.66 (d, J = 8.0 Hz, 3H) 3.25-3.06 (m, 15H), 2.97 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 1.95-1.85 (m, 1H), 1.46-1.41 (m, 2H), 1.28-1.12 (m, 48H), 0.86 (t, J = 8.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.8, 165.7, 165.5, 165.0, 164.7, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.4, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.2, 100.9, 95.9, 74.8, 74.4, 72.4, 72.3, 72.2, 71.2, 70.3, 69.9, 69.0, 65.8, 63.5, 62.4, 60.3, 53.5, 44.8, 40.2, 38.2, 31.9, 31.4, 29.4, 26.9, 22.7, 15.3, 14.2.
<3-7> DTM-A7의 합성
실시예 1-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-A6을 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.14 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.97 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.87 (m, 3H), 3.81-3.79 (m, 6H), 3.67-3.59 (m, 15H), 3.52 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 3.45-3.42 (m, 9H), 3.38-3.30 (m, 6H), 3.27-3.21 (m, 9H), 2.13-2.08 (m, 1H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.37-1.25 (m, 48H), 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.0, 102.9, 81.4, 77.8, 76.6, 75.6, 75.1, 74.8, 74.2, 71.5, 70.9, 70.4, 66.9, 62.7, 62.3, 46.6, 41.7, 39.5, 33.2, 32.7, 30.6, 28.1, 23.9, 15.6, 14.7. HRMS (FAB+): calcd. for C77H144O36 [M+Na]+ 1667.9335, found 1667.9330.
<제조예 4> DTM-A8의 합성
<4-1> Dimethyl 2-octylmalonate (화합물 A4)의 합성
실시예 1-1의 절차에 따라 화합물 A4을 93%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.84 (m, 4H), 1.34-1.15 (m, 20H), 1.12-1.03 (m, 4H), 0.87 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.6, 57.8, 52.4, 32.5, 32.0, 30.0, 29.4, 29.3, 24.1, 22.8, 14.2.
<4-2> 2-octyldecan-1-ol (화합물 B8)의 합성
실시예 1-2의 절차에 따라 화합물 B8를 87%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.53 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 1.47-1.43 (m, 1H), 1.32-1.18 (m, 28H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 65.9, 40.7, 32.1, 31.1, 30.3, 29.8, 29.5, 27.1, 22.9, 14.3.
<4-3> 9-(((2-(((2-octyldecyl)oxy)methyl)allyl)oxy)methyl)heptadecane (화합물 C12)의 합성
실시예 1-3의 절차에 따라 화합물 C12을 70%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.15 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 1.59-1.51 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 56H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.7, 113.2, 74.0, 71.9, 38.5, 32.1, 31.7, 30.3, 29.8, 29.6, 27.1, 22.9, 14.3.
<4-4> 3-((2-octyldecyl)oxy)-2-(((2-octyldecyl)oxy)methyl)propan-1-ol (화합물 D16)의 합성
실시예 1-4의 절차에 따라 화합물 D16를 89%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.76 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.54-3.46 (m, 4H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 2.96 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 2.13-2.07 (m, 1H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.32-1.18 (m, 56H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 75.0, 71.8, 63.3, 41.4, 38.5, 32.1, 31.7, 30.2, 29.9, 29.5, 27.0, 22.8, 14.2.
<4-5> 2-(hydroxymethyl)-2-((3-((2-octyldecyl)oxy)-2-(((2-octyldecyl)oxy)methyl)propoxy)methyl)propane-1,3-diol (화합물 E20)의 합성
실시예 1-5의 절차에 따라 화합물 E20을 44%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.71 (s, 6H), 3.48 (s, 2H), 3.39 (d, J = 4.0 Hz, 4H), 3.25 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 2.60 (br s, 3H), 2.17-2.14 (m, 1H), 1.53-1.51 (m, 2H), 1.36-1.18 (m, 56H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.7, 73.5, 70.8, 69.6, 64.5, 53.3, 45.2, 40.2, 38.2, 32.1, 31.5, 30.3, 29.8, 27.0, 22.8, 14.2.
<4-6> DTM-A8a의 합성
실시예 1-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-A8a를 62%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.09 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.89-7.84 (m, 18H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.57-7.46 (m, 18H), 7.43-7.37 (m, 16H), 7.36-7.29 (m, 17H), 7.26-7.18 (m, 12H), 6.13 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.67 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 5.46 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.22-5.13 (m, 6H), 4.59 (q, J = 10.0 Hz, 6H), 4.37-4.28 (m, 9H), 4.19 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.75 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.70 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.30-3.04 (m, 15H), 3.02 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 2.01-1.90 (m, 1H), 1.49-1.41 (m, 2H), 1.28-1.12 (m, 56H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.8, 165.5, 165.1, 164.8, 133.6, 133.4, 133.2, 129.9, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 128.2, 100.9, 95.9, 74.8, 74.4, 72.3, 72.2, 71.3, 69.9, 69.0, 67.8, 63.5, 62.4, 53.5, 44.9, 40.2, 38.3, 31.9, 31.4, 30.2, 29.7, 29.5, 26.9, 22.8, 14.2.
<4-7> DTM-A8의 합성
실시예 1-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-A8을 94%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.15 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.96 (d, J = 10.0 Hz, 3H), 3.87 (m, 3H), 3.83-3.79 (m, 6H), 3.68-3.59 (m, 15H), 3.52 (t, J = 12.0 Hz, 4H), 3.45-3.42 (m, 10H), 3.38-3.30 (m, 4H), 3.27-3.22 (m, 9H), 2.12-2.08 (m, 1H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.38-1.27 (m, 56H), 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 12H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.1, 103.0, 81.4, 77.9, 76.6, 75.6, 75.2, 74.8, 74.2, 71.5, 70.4, 70.1, 67.3, 62.8, 62.3, 46.7, 41.7, 39.5, 33.3, 32.7, 31.7, 30.9, 30.6, 28.1, 23.9, 15.6, 14.7. HRMS (FAB+): calcd. for C81H152O36 [M+Na]+ 1723.9961, found 1723.9956.
<실시예 2> DTM-Es의 합성 방법
DTM-Es의 합성 스킴을 도 2에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-7>의 합성 방법에 따라 DTM-Es의 3종의 화합물을 합성하여 도 3에 나타내었다.
<2-1> 다이알킬화된 메탈릴 다이에터(dialkylated methallyl diether) 의 일반 합성 절차 (도 2 의 화합물 A)
THF와 지방족 알코올(aliphatic alcohol, 2.5 당량)의 잘 교반된 용액에 N2 대기, 0℃에서 NaH(3.0 당량)를 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후에, 메탈릴 클로라이드(methallyl dichloride, 1.0 당량)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 24 시간 동안 환류시킨 다음 메탄올로 반응을 종료시켰다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트로 희석시킨 후, 물, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 후 수득된 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 정제 (Hex/EtOAc)하여 순수한 목적 화합물 A를 수득하였다.
<2-2> 하이드로보레이션(hydroboration)의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 a)
THF 와 혼합된 화합물 A(1.0 당량) 및 BH3-THF(1M, 1.1 당량)의 용액을 0℃, N2 대기하에 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 3M NaOH 용액(2.2 당량)으로 종료시킨 다음 30 wt% H2O2를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 더 교반하고, 다이에틸 에터(diethyl ether)로 희석시켰다. 희석된 반응 혼합물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 정제하여 목적 화합물 B를 수득하였다.
<2-3> 테트라알킬화된 메탈릴 다이에터(tetra-alkylated methallyl diether) 의 일반 합성 절차(도 2의 단계 b)
DMF와 잘 교반된 화합물 B 용액(2.5 당량)에 NaH(3.0 당량)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 불활성 대기하에서 50℃로 30분 동안 가열한 후, 실온에서 메탈릴 클로라이드(methallyl dichloride, 1.0 당량)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 70℃에서 24시간 동안 교반하였다. 메탄올을 첨가한 다음 에틸아세테이트로 희석하여 반응을 종료시켰다. 유기 분획을 물, 염수로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 제거한 후 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 C를 수득하였다.
<2-4> 하이드로보레이션(hydroboration)의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 a)
THF 와 혼합된 화합물 C(1.0 당량) 및 BH3-THF(1M, 1.1 당량)의 용액을 0℃, N2 대기하에 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 3M NaOH 용액(2.2 당량)으로 종료시킨 다음 30 wt% H2O2를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 더 교반하고, 다이에틸 에터(diethyl ether)로 희석시켰다. 희석된 반응 혼합물을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 유성 잔류물을 컬럼크로마토그래피 정제하여 목적 화합물 D를 수득하였다.
<2-5> 테트라알킬화된 트리올(tetra-alkylated tri-ol)의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 c)
DMF와 혼합된 화합물 D(1.0 당량) 용액에 NaH(3.0 당량)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 50℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, THF에 용해된 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]옥탄 (4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane, 3.0 당량)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 가열하였다. 메탄올로 반응을 종료시킨 후, 유기 용매를 감압하에 제거하였다. 생성된 고체 잔류물을 다이에틸 에터로 용해시키고, 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 농축시킨 후, 생성된 유성 잔류물을 DCM/MeOH 혼합물에 용해시켰다. 이 용액에 농축 HCl 수 방울을 적가하고 생성된 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열 하였다. NaOH로 중화시키고 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 E를 수득하였다.
<2-6> 당화(maltosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 d)
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 E(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 말토실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide, 3.6 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 F를 유리질 고체형태로 수득하였다.
<2-7> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 2의 단계 e)
O-벤조일화된 화합물 F(O-benzoylated compound F)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 목적 화합물 G를 백색 고체형태로 수득하였다.
<제조예 5> DTM-E5의 합성
<5-1> 1-((2-((pentyloxy)methyl)allyl)oxy)pentane (화합물 A21)의 합성
실시예 2-1의 절차에 따라 화합물 A21을 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.16 (s, 2H), 3.97 (s, 4H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.62-1.55 (m, 4H), 1.35-1.31 (m, 8H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.5, 113.4, 71.6, 70.6, 29.6, 28.5, 22.7, 14.2.
<5-2> 3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)methyl)propan-1-ol (화합물 B24)의 합성
실시예 2-2의 절차에 따라 화합물 B24를 91%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.75 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.52 (m, 4H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.04 (br s, 1H), 2.09 (m, 1H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 8H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.7, 64.6, 62.6, 41.4, 29.4, 28.4, 22.6, 14.1.
<5-3> 12-methylene-8,16-bis((pentyloxy)methyl)-6,10,14,18-tetraoxatricosane (화합물 C27)의 합성
실시예 2-3의 절차에 따라 화합물 C27을 86%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.14 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.45 (d, J = 5.6 Hz, 12H), 3.37 (t, J = 2.8 Hz, 8H), 2.18-2.14 (m, 2H), 1.56-1.53 (m, 8H), 1.33-1.31 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.2, 113.2, 71.8, 71.3, 69.2, 68.9, 40.4, 29.5, 28.5, 22.6, 14.1.
<5-4> 3-(3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)methyl)propoxy)-2-((3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)methyl)propoxy)methyl) pro- pan-1-ol (화합물 D30)의 합성
실시예 2-4의 절차에 따라 화합물 D30을 76%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.73 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 3.55-3.49 (m, 4H), 3.46 (d, J = 5.6 Hz, 4H), 3.42 (d, J = 6.0 Hz, 8H), 3.38 (t, J = 2.8 Hz, 8H), 2.92 (br s, 1H) 2.17-2.09 (m, 3H), 1.58-1.52 (quin, J = 6.8 Hz, 8H), 1.33-1.30 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.4, 70.1, 69.3, 64.4, 41.4, 40.4, 29.4, 28.5, 22.6, 14.2.
<5-5> 2-(hydroxymethyl)-2-((3-(3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)methyl) propoxy)-2-((3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)meth-yl)propoxy)methyl)propoxy) methyl)propane-1,3-diol (화합물 E33)의 합성
실시예 2-5의 절차에 따라 화합물 E33을 44%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.65 (s, 6H), 3.48-3.37 (m, 28H), 2.16-2.10 (m, 3H), 1.59-1.52 (quin, J = 6.8 Hz, 8H), 1.35-1.30 (m, 16H), 0.90 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 72.8, 71.4, 70.3, 69.8, 69.6, 69.2, 64.4, 45.2, 40.3, 40.1, 29.4, 28.4, 22.6, 14.2.
<5-6> DTM-E5a의 합성
실시예 2-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-E5a를 62%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.09 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.87 (t, J = 8.0 Hz, 20H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.54-7.18 (m, 61H), 6.12 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 5.67 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 5.45 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.19 (dd, J = 10.4 Hz, J = 4 Hz, 3H), 5.14 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.61 (t, J = 12.0 Hz, 6H), 4.36-4.28 (m, 10H), 4.18 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.74 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.68 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.40-3.35 (m, 16H), 3.31-3.29 (m, 3H), 3.22-3.14 (m, 9H), 3.01 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.95-1.89 (m, 1H), 1.54-1.53 (m, 8H), 1.31-1.29 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.6, 165.1, 165.0, 164.8, 133.7, 133.5, 133.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.3, 100.9, 95.9, 74.8, 72.3, 72.2, 71.3, 69.9, 69.7, 69.3, 69.0, 68.9, 63.5, 62.4, 60.5, 44.9, 40.4, 29.5, 28.5, 22.6, 22.1, 14.2.
<5-7> DTM-E5의 합성
실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-E5를 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.15 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.96 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.90-3.79 (m, 10H), 3.68-3.59 (m, 18H), 3.53 (t, J = 10.0 Hz, 6H), 3.45-3.40 (m, 27H), 3.27 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 2.15-2.08 (m, 3H), 1.56 (quin, J = 6.8 Hz, 8H), 1.35-1.32 (m, 16H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.1, 103.1, 81.5, 77.9, 76.6, 75.2, 74.9, 74.3, 72.4, 71.5, 71.2, 70.8, 70.3, 70.0, 62.8, 62.3, 46.7, 41.8, 30.6, 29.7, 23.7, 14.7. HRMS (FAB+): calcd. for C73H136O40 [M+Na]+ 1675.8506, found 1675.8510.
<제조예 6> DTM-E6의 합성
<6-1> 1-((2-((hexyloxy)methyl)allyl)oxy)hexane (화합물 A22)의 합성
실시예 2-1의 절차에 따라 화합물 A22을 92%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.01 (s, 2H), 3.82 (s, 4H), 3.27 (t, J = 9.6 Hz, 4H), 1.48-1.41 (m, 4H), 1.23-1.17 (m, 12H), 0.76 (t, J = 5.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.3, 112.9, 71.4, 70.4, 31.7, 29.7, 25.9, 22.6, 13.9.
<6-2> 3-(pentyloxy)-2-((pentyloxy)methyl)propan-1-ol (화합물 B25)의 합성
실시예 2-2의 절차에 따라 화합물 B25를 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.75 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.52 (m, 4H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.04 (br s, 1H), 2.09 (m, 1H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 12H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.1, 69.9, 62.6, 41.4, 31.4, 29.4, 25.6, 22.4, 13.7.
<6-3> 9,17-bis((hexyloxy)methyl)-13-methylene-7,11,15,19-tetraoxapentacosane (화합물 C28)의 합성
실시예 2-3의 절차에 따라 화합물 C28을 85%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.13 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.44 (d, J = 3.6 Hz, 12H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 8H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.62-1.43 (m, 8H), 1.38-1.21 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.2, 113.2, 71.8, 71.3, 69.2, 68.9, 40.5, 31.8, 29.8, 25.9, 22.8, 14.1.
<6-4> 3-(3-(hexyloxy)-2-((hexyloxy)methyl)propoxy)-2-((3-(hexyloxy)-2-((hexyloxy)methyl)propoxy)methyl) propan-1-ol (화합물 D31)의 합성
실시예 2-4의 절차에 따라 화합물 D31을 74%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.71 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.55-3.45 (m, 8H), 3.42 (d, J = 6.4 Hz, 8H), 3.38 (t, J = 6.6 Hz, 8H), 3.07 (br s, 1H), 2.16-2.08 (m, 2H), 1.58-1.50 (quin, J = 6.8 Hz, 8H), 1.33-1.20 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.3, 71.0, 69.9, 69.2, 64.0, 41.4, 40.3, 31.7, 29.6, 25.8, 22.6, 14.1.
<6-5> 2-((3-(3-(hexyloxy)-2-((hexyloxy)methyl)propoxy)-2-((3-(hexyloxy)-2-((hexyloxy)methyl)propoxy)methyl)pro-poxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (화합물 E34)의 합성
실시예 2-5의 절차에 따라 화합물 E34을 42%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 6H), 3.50-3.48 (m, 4H), 3.43-3.37 (m, 24H), 3.08 (br s, 3H), 2.15-2.12 (m, 3H), 1.54-1.53 (m, 8H), 1.31-1.29 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 73.0, 71.5, 70.4, 69.9, 69.7, 69.3, 65.0, 45.1, 40.3, 31.9, 29.8, 26.0, 22.8, 14.3.
<6-6> DTM-E6a의 합성
실시예 2-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-E6a를 65%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.88 (t, J = 8.0 Hz, 20H), 7.79 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.54-7.19 (m, 61H), 6.14 (t, J = 9.8 Hz, 3H), 5.68 (t, J = 9.6 Hz, 6H), 5.47 (t, J = 9.2 Hz, 3H), 5.21 (dd, J = 10.4 Hz, J = 3.2 Hz, 3H), 5.16 (t, J = 8.8 Hz, 3H), 4.59 (t, J = 12.0 Hz, 6H), 4.38-4.29 (m, 9H), 4.20 (d, J = 10.4 Hz, 3H), 3.75 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 3.69 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.39-3.30 (m, 17H), 3.21-3.19 (m, 9H), 3.13-3.05 (m, 3H), 3.02 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 2.15-2.08 (m, 2H), 1.95-1.88 (m, 1H), 1.54-1.52 (m, 8H), 1.31-1.29 (m, 24H), 0.87 (t, J = 4.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.8, 165.6, 165.1, 164.8, 133.7, 133.5, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.3, 100.9, 95.9, 74.8, 72.5, 72.3, 71.3, 70.2, 69.9, 69.8, 69.2, 69.0, 68.9, 63.5, 62.4, 44.9, 40.4, 31.8, 29.7, 25.9, 22.7, 14.2.
<6-7> DTM-E6의 합성
실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-E6을 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.96 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.90-3.81 (m, 10H), 3.69-3.60 (m, 18H), 3.53 (t, J = 12.0 Hz, 6H), 3.45-3.41 (m, 27H), 3.35-3.24 (m, 6H), 2.05-1.99 (m, 3H), 1.56 (quin, J = 6.6 Hz, 8H), 1.35-1.32 (m, 24H), 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.0, 102.9, 81.4, 77.8, 76.5, 75.1, 74.8, 74.1, 72.4, 71.5, 71.2, 70.7, 70.6, 70.2, 70.0, 62.8, 62.3, 46.7, 41.7, 41.6, 32.9, 30.8, 27.1, 23.8, 14.6. HRMS (FAB+): calcd. for C77H144O40 [M+Na]+ 1732.9132, found 1731.9124.
<제조예 7> DTM-E7의 합성
<7-1> 1-((2-((heptyloxy)methyl)allyl)oxy)heptane (화합물 A23)의 합성
실시예 2-1의 절차에 따라 화합물 A23을 90%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.14 (s, 2H), 3.95 (s, 4H), 3.39 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.57 (quin, J = 6.8 Hz, 4H), 1.30-1.28 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.4, 112.9, 71.4, 70.4, 31.9, 29.8, 29.2, 26.2, 22.6, 14.0.
<7-2> 3-(heptyloxy)-2-((heptyloxy)methyl)propan-1-ol (화합물 B26)의 합성
실시예 2-2의 절차에 따라 화합물 B26을 86%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.14 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.45 (d, J = 5.6 Hz, 12H), 3.37 (t, J = 2.8 Hz, 8H), 2.18-2.14 (m, 2H), 1.56-1.53 (m, 8H), 1.33-1.31 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.2, 113.2, 71.8, 71.3, 69.2, 68.9, 40.4, 29.5, 28.5, 22.6, 14.1.
<7-3> 10,18-bis((heptyloxy)methyl)-14-methylene-8,12,16,20-tetraoxaheptacosane (화합물 C29)의 합성
실시예 2-3의 절차에 따라 화합물 C29을 85%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.13 (s, 2H), 3.94 (s, 4H), 3.45 (d, J = 3.6 Hz, 12H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 8H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.57-1.51 (m, 8H), 1.30-1.28 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 143.3, 113.2, 71.8, 71.3, 69.2, 68.9, 40.5, 31.9, 29.8, 29.3, 26.3, 22.8, 14.2.
<7-4> 3-(3-(heptyloxy)-2-((heptyloxy)methyl)propoxy)-2-((3-(heptyloxy)-2-((heptyloxy)methyl)propoxy)methyl) pro- pan-1-ol (화합물 D32)의 합성
실시예 2-4의 절차에 따라 화합물 D32을 74%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.72 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.54-3.49 (m, 4H), 3.46 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 3.41 (d, J = 6.0 Hz, 8H), 3.38 (t, J = 6.4 Hz, 8H), 2.93 (br s, 1H), 2.15-2.10 (quin, J = 6.0 Hz, 2H), 1.56-1.52 (m, 8H), 1.33-1.20 (m, 32H), 0.88 (t, J = 5.2 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.3, 70.8, 69.3, 64.3, 63.9, 41.4, 40.3, 31.9, 29.7, 29.2, 26.2, 22.7, 14.2.
<7-5> 2-((3-(3-(heptyloxy)-2-((heptyloxy)methyl)propoxy)-2-((3-(heptyloxy)-2((heptyloxy)methyl)propoxy)methyl)-propoxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (화합물 E35)의 합성
실시예 2-5의 절차에 따라 화합물 E35을 44%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 6H), 3.42-3.39 (m, 8H), 3.36-3.30 (m, 20 H), 3.08 (br s, 3H), 2.15-2.12 (m, 3H), 1.49-1.46 (m, 8H), 1.31-1.29 (m, 32H), 0.81 (t, J = 6.8 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 72.8, 71.4, 70.3, 69.8, 69.6, 69.2, 64.4, 45.1, 40.2, 40.1, 31.9, 29.7, 29.3, 26.2, 22.7, 14.2.
<7-6> DTM-E7a의 합성
실시예 2-6의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 DTM-E7a를 66%의 수득률로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.98 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.88 (t, J = 8.0 Hz, 20H) 7.79 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.56-7.18 (m, 61H), 6.13 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 5.68 (t, J = 10.0 Hz, 6H), 5.46 (t, J = 10.0 Hz, 3H), 5.20 (dd, J = 8 Hz, J = 4 Hz, 3H), 5.15 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.59 (t, J = 10.0 Hz, 6H), 4.37-4.29 (m, 10H), 4.19 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.75 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.69 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.39-3.30 (m, 16H), 3.30-3.27 (m, 3H), 3.21-3.15 (m, 6H), 3.12-3.06 (m, 3H), 3.02 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 2.15-2.08 (m, 2H), 1.95-1.88 (m, 1H), 1.54-1.52 (m, 8H), 1.31-1.29 (m, 32H), 0.87 (t, J = 4.0 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.8, 165.6, 165.1, 164.8, 133.5, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.4, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.3, 100.9, 95.9, 74.8, 72.3, 72.2, 71.3, 69.9, 69.8, 69.3, 69.0, 67.8, 63.5, 62.4, 44.9, 40.4, 31.9, 29.8, 29.3, 26.3, 22.7, 14.2.
<7-7> DTM-E7의 합성
실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 DTM-E7를 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.15 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.97 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.88 (d, J = 12.0 Hz, 4H), 3.83-3.78 (m, 6H), 3.68-3.61 (m, 18H), 3.55 (t, J = 16.0 Hz, 6H), 3.46-3.30 (m, 27H), 3.27 (m, 6H), 2.05-1.99 (m, 3H), 1.56 (quin, J = 6.6 Hz, 8H), 1.33-1.31 (m, 32H), 0.90 (t, J = 6.6 Hz, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.1, 103.1, 81.5, 77.9, 76.6, 75.2, 74.9, 74.3, 72.4, 71.6, 70.8, 70.7, 70.3, 70.1, 62.8, 62.3, 41.8, 33.2, 30.9, 30.4, 27.5, 23.8, 14.7s. HRMS (FAB+): calcd. for C81H152O40 [M+Na]+ 1787.9758, found 1787.9763.
<실시예 3> DTMs 특성
상기 실시예 1 및 2의 합성 방법에 따라 합성된 DTMs의 특성을 확인하기 위하여, DTMs의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R h)을 측정하였다.
구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 소수성 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2018002459-appb-T000001
DTMs의 CMC 값은 DDM보다 훨씬 작았다. CMC 값은 두 종류의 DTMs 모두에서 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 이는 알킬사슬이 길수록 양친매성 화합물간의 소수성 상호작용을 보다 강하게 함을 의미한다. 따라서, DTMs 는 낮은 농도에서 미셀이 용이하게 형성되므로, 수용액상에서 DDM 보다 응집하려는 경향이 더 큼을 알 수 있다.
DTMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 3.2~34.4 nm로 범위가 넓었고 DDM보다 큰 미셀을 형성함을 확인하였다. DTMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 증가하였다. 추가로 상기 DTMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 분석한 결과, DTM-A7 및 A8을 제외한 대부분의 DTMs는 균질한 크기를 가진 미셀을 형성하는 것을 확인하였다(도 4).
<실시예 4> DTMs의 R. capsulatus superassembly(LHI-RC) 구조 안정화 능력 평가(도 5)
DTMs에 의한 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(photosynthetic superassembly)구조안정화 능력을 평가하는 실험을 하였다. 광합성 어셈블리는 LHI (light-harvesting complex I) 및 RC (reaction centre complex)로 구성되어 있다. LHI-RC의 구조적 안정성은 UV-Vis 분광법을 활용하여 20일간 단백질의 구조를 모니터링하는 방법으로 측정하였다. 양친매성 분자는 본 발명의 모든 DTMs와 기존 양친매성 분자인 DDM 및 OG를 사용하였으며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.04 wt% (도 5a) 및 CMC + 0.2 wt% (도 5b)에서 측정하여 양친매성 분자의 농도에 따른 LHI-RC 단백질 안정성을 조사하였다.
구체적으로, R. capsulatus의 광합성 어셈블리의 안정성은 본 발명자의 208년 논문(P. S. Chae et al., ChemBioChem 2008, 9, 1706-1709.)에 게재된 방법을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 본 발명자는 LHII(light-harvesting complex II)를 가지고 있지 않은 R. capsulatus, U43[pUHTM86Bgl] 박테리아로부터 얻은 멤브레인을 이용하였다. R. capsulatus 멤브레인의 동결액 10 ㎖ 분액을 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 균질화하고, 30분 동안 32℃에서 약하게 교반하여 배양하였다. 상기 균질화된 멤브레인을 1.0 wt% DDM을 32 ℃에서 30분 동안 처리하였다. 멤브레인 파편(debris)은 315,000 g로 4℃에서 30분 동안 초원심분리하여, 펠렛을 수집하였다. DDM에 의해 가용화된 LHI-RC 복합체를 함유하는 상층액에 200 μL Ni2+-NTA resin (10 mM Tris, pH 7.8을 포함하는 버퍼에서 전-평형 및 저장됨)을 첨가하여 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 수지 함유 용액을 10개의 HisSpinTrap 컬럼을 사용하여 여과하고, 개별 컬럼을 10 mM Tris (pH 7.8), 100 mL NaCl 및 1 x CMC DDM을 함유하는 500 μL 결합 버퍼로 두 번 세척하였다. 새로운 초원심분리 튜브로 교체한 후, 1 M 이미다졸(2×300 μL)이 함유된 버퍼를 사용하여 DDM에 의해 정제된 LHI-RC 복합체를 용출시켰다. 80 ㎕의 단백질 시료를 각각 920 μL의 DTM-As, DTM-Es, DDM 및 OG로 희석하여 최종 농도가 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%가 되도록 하였다. 각각의 세제 내에서 생성된 LHI-RC 복합체를 25℃에서 15일 동안 배양하였다. 단백질 안정성은 650 nm에서 950 nm의 범위에서 시료의 UV-가시 스펙트럼을 측정하여 배양하는 동안 규칙적인 간격으로 측정되었다. 단백질 보전성은 875 nm 흡광도(A875)를 모니터링함으로써 평가하였다.
모든 DTMs는 복합체를 안정화시키는데 있어서 DDM 및 OG보다 우수하였다. DTMs 중에서 DTM-E5가 가장 우수한 효과를 나타내었지만, 대부분의 DTMs의 성능은 유사하였다. CMC + 0.04 wt%에서 CMC + 0.2 wt%로 화합물의 농도가 증가하면 DDM과 OG 모두에서 단백질의 안정성이 떨어지는반면(도 5), DTMs 중 DTM-E7에서는 이와 유사한 결과가 얻었졌으나, 나머지 다른 DTMs 들은 이 높은 농도(CMC + 0.2 wt%)에서 LHI-RC 복합체를 안정화시키는 효과가 우수하였다(도 5).
<실시예 5> DTMs의 막단백질(LeuT) 구조 안정화 능력 평가
DTMs에 의한 LeuT(leucine transporter) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. LeuT 단백질 활성도를 단백질 기질([3H]-Leu)를 활용한 SPA(scintillation proximity assay)에 의해 측정하였으며, DTMs 또는 DDM의 농도는 CMC + 0.04 wt% 및 CMC + 0.2 wt%를 사용하였다.
G. Deckert 등의 논문(Nature 1998, 392, 353-358.)에 게재된 방법에 따라, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)의 정제를 수행하였다. LeuT는 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41(DE3)에서 발현된다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA에 의해 제공받음). 요약하면, LeuT 단백질을 분리하고, 1.0 wt% DDM에 용해화한 후에, 단백질을 Ni2 +-NTA resin(Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05 % DDM 및 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 그 다음, 약 1.5 mg/ml 단백질 샘플(stock)을 DDM 및 이미다졸이 없으나 DTMs 또는 DDM (대조군)을 최종 농도가 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%가 되도록 보충한 동등한 버퍼로 10배 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에 12일간 보관하고, 단백질 활성 측정 전 인큐베이션 동안 일정한 간격으로 원심분리하였다. 단백질 활성은 SPA(scintillation proximity assay) (M. Quicketal., Proc . Natl , Acad . Sci . U.S.A . 2007, 104, 3603-3608.)를 이용하여 [3H]-Leu 결합을 측정하여 결정하였다. 상기 최종 농도에서 200 mM NaCl 및 각각의 상기 화합물을 함유하는 버퍼 중 5 μL의 각 단백질 시료로 분석을 수행하였다. 20 nM [3H]-Leu 및 copper chelate(His-Tag) YSi beads(둘 모두 PerkinElmer, Denmark 로부터 구매함)의 존재 하에 SPA 반응을 수행하였다. [3H]-Leu 결합은 MicroBeta liquid scintillation counter(PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.
도 6 및 도 7에 나타난 결과와 같이, 가장 긴 알킬 사슬을 가지는 DTM-A6을 제외한 다른 모든 DTMs의 경우에 가용화된 LeuT의 활성 유지 능력이 DDM과 비교하여 우수하였다. 양친매성 화합물의 농도가 CMC + 0.04 wt%에서 CMC + 0.2 wt%로 증가하여도 결과는 유사하였다.
<실시예 6> DTMs의 MelB 막단백질 구조 안정화 능력 평가
DTMs에 의한 MelB(Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다.
구체적으로, 플라스미드 pK95△AHB/WT MelBSt/CH10를 사용하여 C-말단에 10-His tag를 가지는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) MelBSt(melibiose permease)를 E. coli DW2 세포(△melB 및 △lacZY)에서 발현하였다. A. S. Ethayathulla 등의 논문(Nat. Commun. 2014, 5,　3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 검정은 Micro BCA 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. P. S. Chae 등의 Nat. Methods 2010, 7, 1003-1008에 기재된 프로토콜을 사용하여 MelBSt 안정성에 대해 DTMs 또는 DDM을 평가하였다. MelBSt를 함유하는 멤브레인 샘플(최종 단백질 농도는 10 mg/mL)을 1.5% (w/v) DDM 또는 DTMs를 함유하는 용해화 버퍼 (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM melibiose)에 90분 동안 4개의 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 인큐베이션하였다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 45분 동안 4℃에서 TLA-100 rotor가 구비된 Beckman OptimaTM MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리를 수행하였다. 초원심분리하지 않은 멤브레인 단백질 20 ㎍을 미처리된 멤브레인 또는 초원심분리 후 동량의 상기 화합물들의 추출물에 적용하고, 처리된 샘플은 동등 부피로 각각의 웰에 로딩하였다. 로딩된 샘플을 SDS-15% PAGE로 분석하고, 그 다음 Penta-His-HRP 항체(Qiagen, Germantown, MD)로 면역블로팅하여 시각화하였다.
그리고, RSO 소낭(vesicles)을 제조하여 Trp → D2G FRET 분석을 하였다. RSO 멤브레인 소낭(vesicles)은 MelBSt 또는 MelBEc을 함유하는 E. coli DW2 세포로부터의 삼투 분해(osmotic lysis)를 통해 제조되었다. 단백질 농도 1 mg/ml에서 100 mM KPi 및 100 mM NaCl을 함유하는 버퍼(pH 7.5)에 혼합된 RSO 멤브레인 소낭에 1.0%의 개별 화합물 (DDM, DTM-A5 및 DTM-A6)를 23℃에서 60분 동안 처리하고 4℃에서 45분 동안 300,000g 이상의 TLA 120.2 로터를 사용하여 초원심분리시켰다. 상층액을 Amico-Bowman Series 2(AB2) Spectrofluorometer를 사용하여 FRET (Trp → D2G) 실험에 적용하였다. 2'-(N-Dansyl)aminoalkyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(D2G, dansyl-galactoside)는 Drs. Gerard Leblanc과 H. Ronald Kaback로부터 얻었다. MelBSt와 MelBEc의 D2G FRET 신호는 290 nm에서 Trp 잔기의 흥분시 490과 465 nm에서 각각 수집되었다. 10 μM D2G 및 과량의 멜리비오스 또는 동량의 물(대조군)을 MelB 용액에 1분 및 2분 시점에 각각 첨가하였다.
도 8(a) 및 (b)에 나타난 결과와 같이, 0℃ 및 45℃에서 DDM는 안정적으로 MelBst를 가용화하였다. DTM-E6을 제외한 대부분의 DTMs는 0℃ 및 45℃에서는 멤브레인으로부터 단백질을 가용화하는 효율이 DDM과 비교하여 유사하거나 낮았다.
그러나, 온도를 55℃로 올렸을 때 DTMs 중 DTM-A5 및 DTM-A6은 가장 효과적으로 MelBst 단백질을 가용화하였다. 온도가 65℃에서는 DDM 및 DTMs에 의해 MelBst 단백질 가용화가 일어나지 않았다.
전체적으로 낮은 온도 (0°C)에서는 DDM이 DTMs보다 높은 단백질 추출 효율을 보여준 반면 비교적 높은 온도(45°C)에서는 DTMs의 단백질 추출효율이 증가하여 DTM-E6, DTM-A5 및 DTM-A6이 DDM과 비슷하고 더 높은 온도(55°C)에서는 대부분의 DTMs가 DDM보다 더 우수한 것으로 보아 온도에 대한 단백질 가용화 안정성 측면에서 DTMs가 DDM보다 우수한 것을 확인하였다.
도 8(c)에 나타난 결과와 같이, DDM에 의해 가용화된 MelB 단백질은 두가지 상동체 중 하나에 대해서만 단백질 기능을 유지한 반면에, DTM-A5 및 DTM-A6에 의해 가용화된 MelB 단백질은 두 상동체 모두에서 단백질 기능을 유지하였다. 따라서, DTM-A5 및 DTM-A6는 MelB 단백질을 가용화하는데 효과적일 뿐만 아니라 상기 단백질 기능을 유지하는 효과에 있어서도, DDM보다 우수함을 확인하였다.
<실시예 7> DTMs의 β2AR 단백질 안정화 능력 평가
<7-1> 장기간 안정성 측정(long-term stability measurement)
수용체는 바큘로바이러스(baculovirus)로 감염된 Sf9 곤충 세포에서 발현되었고 1% DDM에 가용화되었다. DDM에 가용화된 수용체는 0.01% 콜레스테릴 석시네이트 (cholesteryl succinate,CHS)의존재하에 알프레놀올 세파로스(alprenolol sepharose)에 의해 정제되었다. DDM에 의해 정제된 β2AR을 DDM 또는 DTMs((DTM-A6, DTM-A7 또는 DTM-E7)를 함유하는 버퍼로 희석하여 최종 농도가 CMC+0.2 wt% 되도록 하였다. 각 화합물에 가용화된 β2AR을 실온에서 4일 동안 보관하였고, 실온에서 30분 동안 10 nM의 방사성 [3H]-다이 하이드로알프레놀올(dihydroalprenolol, DHA)로 인큐베이트함으로써 규칙적인 간격으로 수용체의 리간드 결합능력을 측정하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 일정량의 결합 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mg/ml BSA가 보충된)을 사용하여 상층액을 수집하였다. 추가로 15 ml 섬광 유체를 첨가하였다. 수용체-결합된 [3H]-DHA는 섬광 계수기(Beckman)로 측정하였다
그 결과, DTMs 중 DTM-A6 및 DTM-E7은 DDM과 유사한 가용화된 수용체의 초기 활성 유지 능력을 보였다(도 9). 그러나 장기간 수용체 안정화 능력에 있어서, DDM 및 DTM-E7에 의해 가용화된 수용체는 시간이 지남에 따라 빠른 활성 손실을 보여준 반면, DTM-A6 및 DTM-A7에 가용화된 수용체는 4일 배양 과정동안 수용체의 활성을 지속적으로 유지함을 보였다(도 9(a)). 또한 알킬사슬이 긴 DTM-As가 일반적으로 큐TM-Es보다 수용체 단백질의 활성 유지 능력이 우수하였다. 아울러, DTMs 중 C6 및 C7의 알킬 사슬을 가지는 즉, 알킬 사실이 길수록 화합물의 효능이 일반적으로 우수한 것으로 보아, DTMs의 효능은 알킬 사슬 길이에 의존하는 경향이 큰 것으로 확인되었다(도 10). 따라서 DTM-A6 및 DTM-A7은 DDM보다 가용화된 수용체 단백질 연구에 더욱 효과적일 것으로 판단된다.
<7-2> DTM-A6에 의해 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 정제 및 안정성 측정
0.1% DDM에 가용화된 100 μM β2AR을 실온에서 30분 동안 120 μM Gs 헤테로트리머(heterotrimer)와 혼합하였다. 0.5 unit apyrase (NEB) 및 2 mM MgCl2를 첨가하여 복합체 형성을 촉진시킨 다음, 1시간 더 인큐베이션하였다. 이어서, 1% DTM-A6을 첨가하여 0.8%의 최종 농도로 만들고 DDM에서 DTM-A6으로 변경하기 위해 샘플을 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 용액을 M1 Flag column 에 넣고 0.1% DDM 버퍼 대 0.5% DTM-A6 버퍼의 몰비가 다른 일련의 버퍼로 세척하여 DDM에서 DTM-A6으로 완전히 변경하고 단백질이 0.05%(70xCMC) DTM-A6 버퍼로 최종 용출되었다. 조제 겔 여과(preparative gel filtration)를 러닝 버퍼(20mM HEPES pH 7.5, 100mM NaCl, 0.005% DTM-A6, 1mM BI, 100mM TCEP)로 β2AR-Gs 복합체를 정제하기 위해 수행하였다. DTM-A6에서 β2AR-Gs 복합체의 안정성을 측정하기 위해 분석 겔 여과(analytical gel filtrations)는 상기와 같은 러닝 버퍼를 사용했지만 3일 및 15일 배양 후 DTM-A6(화합물이 없는 조건)을 사용하지 않고 수행하였다.
도 9(b)에 나타난 결과와 같이, DTM-A6에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체가 이전 연구에서 DDM에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체로부터 얻은 결과와 대조적으로 15일 동안 복합체로서의 완전성을 계속 유지한다는 것을 확인하였다. DDM의 경우에는 이 복합체는 2일 배양 후에도 수용체와 Gs 단백질 사이에 상당한 정도의 해리를 보였다.
<7-3> DTM-A6에 의해 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 negative stain EM analysis
β2AR-Gs 단백질 복합체는 기존의 음성 염색 프로토콜을 사용하여 전자 현미경 검사를 위해 준비되었으며 저용량 절차를 사용하여 120 kV에서 작동되는 Tecnai T12 전자 현미경으로 실내 온도에서 영상화하였다. 이미지는 Gatan US4000 CCD 카메라에서 71,138x의 배율 및 약 -1.1 μm 의 디포커스 값(defocus value)으로 기록하였다. 모든 이미지는 표본 수준에서 4.16 Å의 픽셀 크기를 얻기 위해 binned(2x2 픽셀)되었다. 입자들는 e2boxer(EMAN2 소프트웨어 제품군의 일부)를 사용하여 수동으로 제거하였다. ISAC를 사용하여 2D reference-free alignment 및 입자 투영 분류를 수행하였다. β2AR-Gs의 124,279 투영은 양방향 매칭 및 10,000개의 입자 투영에 대해 일관된 131개의 클래스를 생성하는 ISAC에 적용하였다.
그 결과, DTM-A6에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체로부터 생성된 입자들은 이전 연구에서 DDM에 의해 정제된 복합체에서 관찰된 입자들의 응집한 형태와 달리 매우 균일한 것으로 나타났다. 또한 대표적인 2D 클래스 이미지에서 본 복합체의 각 구성요소(β2AR, Gαs 및 Gβγ)들은 명확하게 구별되었다(도 11b, c). DTM-A6의 사용을 통해 얻은 본 단백질 복합체의 EM 이미지는 다른 양친매성 분자들를 통해 얻은 복합체 이미지보다 선명하고 명확하였다. 이는 본 발명의 양친매성 화합물이 EM 분석을 통해 막 단백질 복합체의 구조 및 동적 구조 변화를 설명할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000012
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기이고;
    상기 A1 내지 A4는 -CH2-, 산소(O) 또는 황 (S)이고;
    상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C10의 알킬기이고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)이고; 그리고 상기 X1 내지 X3은 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C10의 알킬기이고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 그리고 상기 X1 내지 X3은 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 8 중 하나인 화합물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000013
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000014
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000015
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000016
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000017
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000018
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000019
  7. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM인 화합물.
  9. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
  11. 1) 다이메틸말로네이트(dimethylmalonate)에 알킬기를 도입하고 환원시켜 다이알킬화된 모노올 유도체(dialkylated mono-ol derivatives)를 합성하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 생성물에 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 첨가하여 4개의 알킬기가 도입된 메탈릴 다이에터(tetra-alkylated methallyl diether)을 합성하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)을 반응시켜 테트라알킬화된 트리올 유도체(tetra-alkylated tri-ol derivatives)을 합성하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000020
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 내지 R4 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기이고;
    상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고;
    상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  12. 1) 지방족 알코올(aliphatic alcohol) 또는 알킬싸이올(alkyl thiol)과 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 반응시켜 다이알킬화된 모노올 유도체(ether-functionalized dialkylated mono-ol derivatives)를 합성하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 생성물에 메탈릴 다이클로라이드(methallyl dichloride)를 반응시켜 테트라알킬화된 모노올 유도체(ether-functionalized tetra-alkylated mono-ol derivatives)를 합성하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)을 반응시켜 테트라알킬화된 트리올 유도체(tetra-alkylated tri-ol derivatives)을 합성하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000021
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 내지 R4 는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기이고;
    상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)이고;
    상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C10의 알킬기이고; 상기 X1 내지 X3은 말토오스인 방법.
  14. 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002459-appb-I000022
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C15의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C15의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C15의 아릴기이고;
    상기 A1 내지 A4는 -CH2-, 산소(O) 또는 황(S)이고;
    상기 X1 내지 X3은 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C10의 알킬기이고; 상기 A1 내지 A4는 산소(O) 또는 황(S)이고; 그리고 상기 X1 내지 X3은 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-C10의 알킬기이고; 상기 A1 내지 A4는 -CH2-이고; 그리고 상기 X1 내지 X3은 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 막단백질은 LHI-RC 복합체(light harvesting-I and the reaction center complex), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelB (Melibiose permease), 또는 이들의 2 이상의 조합인 방법.
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