CN108997447B - 含有二硫键的化合物及其用途和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有二硫键的化合物及其用途和制备方法，所述化合物，其结构通式为：

Description

含有二硫键的化合物及其用途和制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有二硫键的化合物及其用途和制备方法。

背景技术

去垢剂，又称表面活性剂，是同时具有亲水极性基团和疏水非极性基团的双亲性分子。其一端为亲水基团，另一端为疏水基团；亲水基团常为极性基团，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基或胺基及其盐，羟基、酰胺基、醚键等也可作为极性亲水基团；而疏水基团常为非极性烃链，如8个碳原子以上烃链。根据其其在水中的解离状态特点，一般分为离子型去垢剂(包括阴离子和阳离子型)、非离子型去垢剂以及两性离子去垢剂等。

在膜蛋白的研究中，利用去垢剂通过竞争和削弱膜蛋白和膜脂质分子间的疏水结合，使得膜蛋白从脂膜中解体释放，并在溶液中维持其结构和功能的稳定性。在膜蛋白的研究过程中，不仅需要提高去垢剂的增容效率，还需要考虑将去垢剂降低到低于其临界胶束浓度，使膜蛋白脱离去除剂的作用，重新组装到脂膜上以进行结构和功能研究。

Nanodisc(纳米磷脂盘)，膜支架蛋白(membrane scaffold proteins,MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。通过这种特殊的结构，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持其生物学活性，为膜蛋白研究提供了有力的技术支持。膜支架蛋白(MSPs)是载脂蛋白(apo)A-I的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而形成圆盘状的结构，即纳米盘。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同时在没有去污剂的情况下也可以使膜蛋白溶解。

不同的膜蛋白、同一膜蛋白的不同处理阶段以及不同的研究方法对于去垢剂的性能具有不同的要求。然而，目前可供选择的商业化的传统去垢剂种类有限，很难同时满足多种膜蛋白体系和不同研究手段的要求。而且，目前去垢剂的置换或者去除主要依赖于物理方法，例如浓缩-稀释法或者biobeads吸附，但是这些方法通常会伴有去垢剂置换不完全的问题，进而可能对后续蛋白的结构和功能研究造成干扰。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种二含有二硫键的化合物，用于解决现有技术中去垢剂与被提取物质分离困难的问题；优化了膜蛋白的制备和功能研究。

本发明在膜蛋白研究中常用的传统去垢剂的结构基础上，引入可断裂化学键来桥连亲水性极性基团和疏水性非极性基团。该类去垢剂分子不仅能够分离纯化和稳定膜蛋白的生理结构和功能，在一定的断裂试剂的作用下，去垢剂可以降解成不具有去垢剂性质的分子片段。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种含有二硫键的化合物，所述化合物结构通式(I)为：

其中，所述的A为取代或未取代的亲水性的单糖基团、寡糖基团、铵内盐基团中的任意一种或几种，所述B为40个碳原子以内的疏水性脂肪族基团。

所述取代的单糖基团、取代的寡糖基团或取代的铵内盐基团的取代基选自取代或未取代的碳原子数为1～6的烷基，所述C1-C6的烷基的取代基选自-OH、-COOH、-NRR’，R和R’各自独立地选-H、C1-C3的烷基。

进一步地，所述A为二糖基团。

进一步地，所述B为所述B为开链的脂肪族基团或环状的脂肪族基团。

进一步地，所述环状基团为环烷基或者环烷烷基。

进一步地，所述B含有或者不含有杂原子，所述杂原子为氮原子、氧原子、硅原子、卤素原子中的任意一种或几种。

所述杂原子是指即可以存在于主链上、支链上也可以存在于环上。

优选地，所述A选自以下结构式中基团中的任意一种，其中a，c，f，g为1-6之间的整数，b，d，e，h为1-3之间的整数：

在以上结构式中波浪线上的化学键是连接二硫键中的硫原子。

优选地，所述B选自以下结构式中基团中的任意一种，其中m，n，z都为0-20之间的整数：

进一步地，所述二硫键桥连的可断裂去垢剂分子，其结构式为以下结构式中的任意一种：

本发明的另外一个方面提供了上述二硫键桥连的去垢剂分子的制备方法，至少包括以下步骤：

(1)将含有被保护的或者未保护的A基团的单卤代物加入溶剂中溶解，加入硫代苯磺酸钠进行取代反应，反应结束后，分离得到第一中间体；所述第一中间体通常指卤代的A基团的卤代基团被硫代苯磺酸钠取代后所获得的中间体化合物。

例如，如果A基团是含糖基团，则糖上的羟基需要被乙酰基取代进行保护。

所述步骤(1)中使用催化剂，所述催化剂为四丁基溴化铵。

进一步地，所述溶剂中含有分子筛。

在步骤(1)中取代反应是指卤代的A基团中卤素被硫代苯磺酸基团所取代，例如：

(2)将第一中间体溶于溶剂中，搅拌，逐滴加入含有B基团的硫醇化合物溶液进行取代反应，搅拌；本步骤中获得物质为第一中间体上的磺酸基团被硫醇化合物取代后所获得的中间体化合物。

所述步骤(2)中的取代反应是指硫醇取代苯磺酰基的反应。例如：

进一步地，如果是被保护的含糖基团还需要将乙酰基脱去：将步骤(2)获得的产物溶于溶剂中，加入甲醇钠进行取代反应，搅拌，得到二硫键桥连的可断裂去垢剂分子。

例如：

本发明还提供了上述的化合物的衍生物，为上述的化合物的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、互变异构体、旋转异构体、阻转异构体、消旋体、代谢产物、盐类、水合物或高聚物。

本发明的另外一方面提供了上述化合物及其衍生物在制备去垢制剂中的用途。

本发明的另外一个方面提供了一种去垢制剂，所述去垢制剂含有上述化合物或其衍生物。

进一步地，所述去垢制剂的有效成分为上述化合物或其衍生物。

本发明的另外一个方面提供了上述化合物、衍生物，以及去垢制剂在膜蛋白分离、纯化、离体表达或结构功能研究的中的应用。

进一步地，所述化合物、衍生物，以及去垢制剂需要在断裂试剂的作用下断裂。

进一步地，所述断裂剂为硼氢化钠(NaBH₄)、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(HSCH₂CH₂OH)、或三正丁基膦(TBUP)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的至少一种。

本发明的另外一个方面提供了一种离体膜系统的制备方法，所述制备方法包括使用了上述的化合物、衍生物，或去垢制剂。

离体膜系统是研究膜蛋白的重要体系，当分离后的膜蛋白存在膜体系中，例如nanodisc，则膜蛋白不会在溶液中聚集，可以与膜体系形成模拟细胞膜的骨架结构，从而用于进一步研究膜蛋白的性能。

如上所述，本发明的二硫键桥连的可断裂去垢剂及其用途和制备方法，具有以下有益效果：

本发明通过在小分子的相应位置引入二硫键，使其不仅保留了与原型去垢剂相当甚至更好的溶膜和蛋白稳定作用，而且其在断裂剂的作用下，可以实现完全地原位降解，降解成两个硫醇片段，失去表面活性剂的性质。借助于本方法，可以用于制备和研究膜蛋白。

评价实验发现，尤其是CCD-2具有与DDM相似的物理性质，可以用来纯化稳定不同家族的G蛋白偶联受体，在相关的蛋白纯化和稳定性实验中，其纯化稳定蛋白的作用甚至优于DDM(图1)。通过高效液相色谱分析，CCD-2被证实在优化的断裂条件下，可以被完全降解或者实现与其他去垢剂的置换(图2)。另外，本发明利用CCD-2可原位降解的性质发展出一种制备nanodisc样品的新方法，利用此方法制备的nanodisc的均一性优于之前依赖biobeads物理吸附的经典方法所制备出的nanodisc的均一性(图3a-3c)。

附图说明

图1a可断裂去垢剂CCD-2和DDM纯化的腺苷受体2A亚型蛋白(A类GPCR)的分析凝胶排阻层析色谱图。

图1b可断裂去垢剂CCD-2和DDM纯化的胰高血糖素类肽-1受体蛋白(B类GPCR)的分析凝胶排阻层析色谱图。

图1c可断裂去垢剂CCD-2和DDM纯化的平滑受体蛋白(F类GPCR)的分析凝胶排阻层析色谱图。

图2a为CCD-2在无待置换去垢剂存在下发生断裂反应前后的高效液相色谱分析谱图。

图2b为CCD-2在只有TCEP无待置换去垢剂存在下发生断裂反应前后的高效液相色谱分析谱图。

图2c为CCD-2在有OG待置换去垢剂存在下发生断裂反应前后的高效液相色谱分析谱图。

图2d为CCD-2在有DTM待置换去垢剂存在下发生断裂反应前后的高效液相色谱分析谱图。

图2e为CCD-2在有LMNG待置换去垢剂存在下发生断裂反应前后的高效液相色谱分析谱图。

图3a为采用化学断裂(CCD-2组)和biobeads物理吸附(DDM组)两种方式去除去垢剂所制备的nanodisc体系的

纯化结果图

图3b为采用biobeads物理吸附去除去垢剂(DDM组)所制备的nanodisc体系负染电镜照片。

图3c为采用化学断裂去除去垢剂(CCD-2组)所制备的nanodisc体系负染电镜照片。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1 二硫键桥连的可断裂去垢剂分子及其合成

1、二硫键桥连去垢剂，其结构式分别为上述(XII)-(XV)。

2、合成方法如下所示，试剂和反应条件：i)硫代苯磺酸钠，四丁基溴化铵，乙腈，70℃；ii)三乙胺，二氯甲烷，0℃到室温；iii)甲醇钠，甲醇，室温。

具体步骤如下：

(i)14g alpha-D-溴代麦芽糖七乙酸酯1溶于20ml无水乙腈中，加入644mg四丁基溴化铵(泰坦，货号：G28296B)和8g硫代苯磺酸钠(大唐医药，货号：BL-06097)。反应液在70℃回流6小时(或者反应过夜)。反应结束后，旋蒸除掉溶剂。加入100mL乙酸乙酯和100mL水，分出有机相，水相用乙酸乙酯(每次100ml)萃取三次，并入有机相，用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到纯净的中间体2。

中间体2结构表征，具体如下：

白色固体，分离产率32％。1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.94(dd,J＝8.6,1.4Hz,2H),7.65(tt,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.56(dd,J＝8.6,7.2Hz,2H),5.38–5.24(m,4H),5.04(t,J＝9.9Hz,1H),4.86(dd,J＝10.3,9.0Hz,1H),4.82(dd,J＝10.5,4.0Hz,1H),4.20(ddd,J＝12.3,4.8,3.3Hz,2H),4.06(dd,J＝12.3,3.8Hz,1H),3.99(dd,J＝12.5,2.4Hz,1H),3.97–3.86(m,2H),3.70(dt,J＝9.7,3.4Hz,1H),2.09(s,3H),2.08(s,3H),2.04(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.97(s,3H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ170.70,170.64,170.32,170.04,169.97,169.70,169.53,145.81,134.19,129.42,127.13,95.69,86.41,76.64,75.85,72.26,70.10,69.45,69.25,68.62,68.02,62.49,61.51,20.94,20.92,20.83,20.82,20.74,20.72,20.60.高分辨质谱C₃₂H₄₀O₁₉S₂[M+Na]⁺计算值：815.1503；实测值：815.1498。

(ii)3mmol化合物2溶于20ml无水二氯甲烷中，加入833ul三乙胺(泰坦，货号：01013520)，于0℃搅拌10分钟。6mmol对应的硫醇化合物溶解在1ml无水二氯甲烷中，逐滴加入上述反应体系中。于室温再搅拌1小时，旋蒸除掉溶剂。加入50mL乙酸乙酯和50mL水，分出有机相，水相用乙酸乙酯(每次约50ml)萃取三次，并入有机相，用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到纯净的中间体3a-3d。

其中，结构式分别为3a-3d的中间体对应的硫醇化合物均为市售产品，见下表：

中间体3a-3h结构表征，具体如下：

3a：白色固体，分离产率84％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.40(d,J＝4.0Hz,1H),5.30(dt,J＝17.8,9.5Hz,2H),5.09(t,J＝9.6Hz,1H),5.03(t,J＝9.9Hz,1H),4.83(dd,J＝10.6,4.0Hz,1H),4.53–4.47(m,2H),4.22(dd,J＝12.5,3.6Hz,1H),4.17(dd,J＝12.2,4.2Hz,1H),4.03–3.96(m,2H),3.90(dt,J＝10.3,3.0Hz,1H),3.68(ddd,J＝9.8,4.3,2.6Hz,1H),2.70(qt,J＝12.7,7.4Hz,2H),2.09(s,3H),2.07(s,3H),2.01(s,3H),1.99(s,3H),1.98(d,J＝4.3Hz,9H),1.60(ddt,J＝17.5,12.2,8.5Hz,2H),1.32–1.20(m,12H),0.84(t,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.63,170.60,170.34,170.31,170.01,169.54,169.49,95.67,87.41,76.47,76.36,72.35,70.03,69.83,69.34,68.55,67.98,62.77,61.46,40.09,31.92,29.54,29.31,29.29,28.96,28.47,22.73,21.02,20.87,20.77,20.74,20.69,20.67,14.20.高分辨质谱C₃₅H₅₄O₁₇S₂[M+Na]⁺计算值：833.2700；实测值：833.2694。

3b：白色固体，分离产率73％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.42(d,J＝4.0Hz,1H),5.33(dt,J＝18.5,9.6Hz,2H),5.11(t,J＝9.6Hz,1H),5.06(t,J＝9.9Hz,1H),4.85(dd,J＝10.6,4.0Hz,1H),4.55–4.50(m,2H),4.24(dd,J＝12.5,3.6Hz,1H),4.20(dd,J＝12.2,4.2Hz,1H),4.06–3.98(m,2H),3.93(dt,J＝10.2,3.0Hz,1H),3.75–3.67(m,1H),2.73(qt,J＝12.7,7.4Hz,2H),1.70–1.59(m,4H),1.25(s,14H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.72,170.70,170.43,170.39,170.10,169.63,169.58,95.75,87.52,76.55,76.44,72.43,70.10,69.92,69.42,68.62,68.05,62.84,61.53,40.18,32.01,29.68,29.65,29.44,29.36,29.03,28.55,22.81,21.09,20.94,20.84,20.80,20.76,20.74,14.26.高分辨质谱C₃₆H₅₆O₁₇S₂[M+Na]⁺计算值：847.2857实测值：847.2855。

3c：白色固体，分离产率76％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.42(d,J＝4.0Hz,1H),5.37–5.27(m,2H),5.11(t,J＝9.5Hz,1H),5.05(t,J＝9.9Hz,1H),4.85(dd,J＝10.5,4.0Hz,1H),4.55–4.49(m,2H),4.24(dd,J＝12.5,3.7Hz,1H),4.19(dd,J＝12.2,4.3Hz,1H),4.06–3.98(m,2H),3.92(ddd,J＝10.3,3.7,2.4Hz,1H),3.70(ddd,J＝9.7,4.2,2.5Hz,1H),2.72(qt,J＝12.7,7.3Hz,2H),2.11(s,3H),2.09(s,3H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,6H),1.99(s,3H),1.63(dtd,J＝15.0,7.7,2.2Hz,2H),1.32(q,J＝7.6Hz,2H),1.24(s,14H),0.86(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl₃)δ170.69,170.66,170.40,170.37,170.07,169.60,169.55,95.74,87.51,76.53,76.43,72.44,70.09,69.91,69.41,68.62,68.05,62.83,61.52,40.17,32.02,29.72,29.71,29.64,29.44,29.35,29.02,28.53,22.80,21.07,20.92,20.82,20.78,20.74,20.72,14.25.高分辨质谱C₃₇H₅₈O₁₇S₂[M+Na]⁺计算值：861.3013；实测值：861.3015。

3d：白色固体，分离产率89％。1H NMR(500MHz,CDCl₃)δ5.41(d,J＝4.0Hz,1H),5.32(dt,J＝18.8,9.5Hz,2H),5.10(t,J＝9.6Hz,1H),5.05(t,J＝9.9Hz,1H),4.85(dd,J＝10.5,4.0Hz,1H),4.56–4.48(m,2H),4.21(ddd,J＝22.1,12.3,3.9Hz,2H),4.07–3.96(m,2H),3.92(dt,J＝10.3,3.1Hz,1H),3.70(dt,J＝9.9,3.4Hz,1H),2.79–2.66(m,2H),2.11(s,3H),2.09(s,3H),2.03(s,3H),2.00(t,J＝5.5Hz,12H),1.63(p,J＝8.1Hz,2H),1.24(s,18H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ170.62,170.58,170.32,170.30,169.99,169.52,169.48,95.66,87.38,76.46,76.35,72.34,70.02,69.82,69.33,68.54,67.97,62.75,61.45,40.08,31.96,29.71,29.68,29.64,29.58,29.40,29.29,28.95,28.47,22.75,21.01,20.86,20.76,20.73,20.69,20.66,14.21.高分辨质谱C₃₈H₆₀O₁₇S₂[M+Na]⁺计算值：875.3170；实测值：875.3166。

(iv)1.8mmol化合物3a-3d溶于10ml甲醇中，加入33ul 30％甲醇钠的甲醇溶液(安耐吉，货号：W4200655000)，于室温再搅拌1小时。用安伯莱特氢离子交换树脂IR120(百灵威，货号：222221)中和到中性。过滤，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1)纯化分离，冻干后得到二硫键桥连去垢剂(X)-(XIII)。

去垢剂(X)-(XIII)的结构表征，具体如下：

CCD-1(I)：白色固体，分离产率99％。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ5.16(d,J＝3.8Hz,1H),4.33(d,J＝9.5Hz,1H),3.87(dd,J＝12.3,2.0Hz,1H),3.83–3.75(m,2H),3.69–3.56(m,4H),3.51(dt,J＝14.2,9.3Hz,2H),3.42(dd,J＝9.7,3.7Hz,1H),3.38(ddd,J＝9.7,4.7,1.9Hz,1H),3.24(t,J＝9.2Hz,1H),2.83(t,J＝7.3Hz,2H),1.68(p,J＝7.3Hz,2H),1.42–1.22(m,12H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CD₃OD)δ102.88,92.39,81.10,80.90,79.33,75.08,74.80,74.20,72.46,71.48,62.73,62.43,41.04,33.08,30.69,30.43,30.40,30.21,29.50,23.76,14.46.高分辨质谱C₂₁H₄₀O₁₀S₂[M+Na]⁺计算值：539.1961；实测值539.1958。

CCD-2(II)：白色固体，分离产率99％。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ5.16(d,J＝3.8Hz,1H),4.33(d,J＝9.5Hz,1H),3.87(dd,J＝12.3,2.0Hz,1H),3.82–3.75(m,2H),3.69–3.61(m,3H),3.59(t,J＝9.3Hz,1H),3.51(dt,J＝13.9,9.3Hz,2H),3.42(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),3.38(ddd,J＝9.7,4.6,1.9Hz,1H),3.24(t,J＝9.2Hz,1H),2.83(t,J＝7.3Hz,2H),1.68(p,J＝7.3Hz,2H),1.41–1.24(m,14H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CD₃OD)δ102.86,92.36,81.08,80.88,79.31,75.07,74.78,74.18,72.44,71.46,62.72,62.42,41.03,33.09,30.72,30.71,30.48,30.39,30.20,29.49,23.75,14.47.高分辨质谱C₂₂H₄₂O₁₀S₂[M+Na]⁺计算值：553.2117；实测值：553.2113。

CCD-3(III)：白色固体，分离产率99％。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ5.14(d,J＝3.8Hz,1H),4.31(d,J＝9.5Hz,1H),3.86(dd,J＝12.3,2.0Hz,1H),3.81–3.73(m,2H),3.67–3.60(m,3H),3.57(t,J＝9.4Hz,1H),3.50(dt,J＝13.8,9.4Hz,2H),3.41(dd,J＝9.7,3.7Hz,1H),3.37(ddd,J＝9.7,4.7,1.9Hz,1H),3.23(t,J＝9.2Hz,1H),2.81(t,J＝7.3Hz,2H),1.66(p,J＝7.3Hz,2H),1.37(q,J＝7.2Hz,2H),1.27(d,J＝4.4Hz,14H),0.87(t,J＝6.9Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,CD₃OD)δ102.81,92.30,81.02,80.82,79.27,75.03,74.73,74.14,72.41,71.43,62.69,62.40,41.01,33.06,30.75,30.73,30.70,30.47,30.37,30.18,29.48,23.73,14.47.高分辨质谱C₂₃H₄₄O₁₀S₂[M+Na]⁺计算值：567.2274；实测值：567.2271。

CCD-4(IV)：白色固体，分离产率99％。¹H NMR(800MHz,CD₃OD)δ5.20(d,J＝3.8Hz,1H),4.36(d,J＝9.5Hz,1H),3.91(dd,J＝12.3,2.0Hz,1H),3.84(dd,J＝11.5,2.1Hz,1H),3.81(dd,J＝12.3,4.7Hz,1H),3.72–3.66(m,3H),3.63(t,J＝9.3Hz,1H),3.56(t,J＝9.3Hz,1H),3.54(t,J＝9.3Hz,1H),3.46(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),3.42(ddd,J＝9.7,4.7,1.9Hz,1H),3.28(t,J＝9.4Hz,1H),2.86(t,J＝7.3Hz,2H),1.71(p,J＝7.4Hz,2H),1.41(p,J＝7.2Hz,2H),1.37–1.26(m,16H),0.92(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(201MHz,CD₃OD)δ102.86,92.37,81.10,80.90,79.33,75.09,74.79,74.20,72.48,71.51,62.74,62.45,41.06,33.07,30.79,30.76,30.72,30.69,30.47,30.37,30.20,29.49,23.73,14.44.高分辨质谱C₂₄H₄₆O₁₀S₂[M+Na]⁺计算值：581.2430；实测值：581.2426。

实施例2 对实施例1中的各去垢剂形成的胶束性质进行评价

1.CMC测定

各个去垢剂的临界胶束浓度(CMC)采用荧光染料法进行测定。将结构式分别为(XII)-(XV)的二硫键桥连去垢剂配成梯度溶液，根据疏水性荧光染料的荧光曲线突变点确定去垢剂的CMC值。例如，用含有40uM荧光染料8-氨基-1-磺酸萘铵盐(百灵威，货号：442848)的双蒸水配制浓度分别为0，42，84，126，168，204，240，360，480，600，800和1000uM的去垢剂的溶液，避光孵育20分钟。测定477nm/388nm的荧光曲线，曲线突变点便是去垢剂的CMC值。

2.动态光散射实验

结构式分别为(XII)-(XV)的二硫键桥连去垢剂用双蒸水配成0.05％(w/v)的溶液，用动态光散射仪测定各个去垢剂样品胶束的疏水直径(D_h)值，每个样品重复9次。

其中β-十二烷基麦芽糖苷(DDM)，XII为CCD-1，XIII为CCD-2，XIV为CCD-3，XV为CCD-4。

3.实验结果

从以上结果可以看出，随着疏水链上碳原子数的增加，实施例1中合成的可断裂去垢剂CCD-1～CCD-4的CMC值皆表现出下降的趋势。其中，CCD-2的CMC与其母体去垢剂DDM最为接近。因此，后续的评价主要围绕CCD-2进行展开。

实施例3 对CCD-2进行评价

用实施例1中的去垢剂CCD-2溶解和纯化不同家族的GPCR，具体包括腺苷受体2A亚型蛋白(A2a蛋白，A类GPCR)、胰高血糖素类肽-1受体蛋白(GLP-1R，B类GPCR)和平滑受体(SMO，F类GPCR)。

1.具体步骤：

在SF9细胞(invitrogen，货号11496-015)中对GPCR(A2a、GLP-1R和SMO)进行表达：

细胞在37℃培养至细胞密度达到1.0-1.3x10⁶cells/mL后收集，破碎得到细胞膜。细胞膜用低盐缓冲液(10mM氯化镁(西格玛奥德里奇，货号M4880)，20mM氯化钾(西格玛奥德里奇，P9541)，pH 7.5的20mMHepes(ABCONE，货号H33755))洗涤(50mL*3次)并离心，再用高盐缓冲液(1M氯化钠(上海生工，货号A610476)，10mM氯化镁,20mM氯化钾，20mMHepes，pH7.5)洗涤(50mL*3次)并离心。沉淀物重新悬浮到50ml低盐缓冲液中，加入36mg茶碱(上海生工，货号A500938)和100mg碘乙酰胺(上海生工，货号A600539)，于4℃下混匀0.5小时。加入50mL溶膜缓冲液(100mM Hepes，pH 7.5，1.6M氯化钠，200*CMC去垢剂(n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)，Anatrace，货号D310或者结构式为(XIII)的可断裂去垢剂CCD-2)，于4℃下混匀3小时，离心得到上清液，加入700mg TALON IMAC树脂(Clontech，货号635670)，于4℃下混匀12小时。含有树脂的溶液过滤除去水相，依次用洗涤液1(pH 7.5；800mM氯化钠；10％甘油(西格玛奥德里奇，G5516),20*CMC去垢剂,20mM咪唑(西格玛奥德里奇，货号I5513),10mM氯化镁)、洗涤液2(pH 7.5；500mM氯化钠；10％甘油,10*CMC去垢剂,20mM咪唑)各洗涤3次。用提取液(pH 7.5；300mM氯化钠；10％甘油,5*CMC去垢剂,220mM咪唑)冲洗树脂得到GPCR蛋白的缓冲溶液。通过分析凝胶排阻层析(analytical size-exclusion chromatography，aSEC)方法来评价蛋白的产量和样品的均一性。

同时在相同条件下采用DDM作为去垢剂作为对照。

2.实验结果：

如图1所示，对于实施例1中合成的二硫键去垢剂CCD-2可以用于上述三类G蛋白偶联受体蛋白(A2a、GLP-1R和SMO)的纯化过程中，其效果与DDM相当或者更优。

实施例4 对实施例1中去垢剂CCD-2完全降解条件的优化和确证

1.具体步骤：

(1)将500uM去垢剂CCD-2在不同断裂条件下进项降解，通过反相高效液相色谱法计算各反应条件下CCD-2的降解率，优化得到最优的反应条件。具体的筛选内容包括：(i)还原剂：硼氢化钠(NaBH₄，国药沪试，货号80115860)、二硫苏糖醇(DTT，百灵威，货号926470)、2-巯基乙醇(HSCH₂CH₂OH，TCI，货号M0058)、三正丁基膦(TBUP，阿达玛斯，货号01128934)和三(2-羧乙基)膦(TCEP，阿达玛斯，货号01281465)。(ii)反应摩尔当量：1eq，2.5eq，5eq，10eq。(iii)温度：室温(r.t.)或者低温(4℃)。(iv)反应时间：1h，2h或者4h。(v)反应溶剂：水或者Hepes缓冲液(pH7.5)。降解率根据反应前后色谱图中对应CCD-2保留时间处峰面积的变化百分比计算得到。

(2)将500uM去垢剂CCD-2与等量待置换去垢剂共孵育1h后，加入5eq TCEP低温孵育2h，采用反相高效液相分析置换效果结果如图2所示。其中，测试的待置换去垢剂包括：n-辛烷基-β-D-葡萄糖苷(OG，Anatrace，货号D310)，n-十二基-β-D-麦芽糖硫苷(DTM，Anatrace，货号O311)，十二烷基麦芽糖新戊二醇苷(LMNG，Anatrace，货号NG310)。

2.实验结果如下表：

从以上结果可以看出，TCEP是最高效的降解剂，5eq的TCEP在室温下1h或者在低温条件下2h可以实现CCD-2的完全降解。另外，从图2可以看出，在该断裂条件下，CCD-2可以原位完全置换成目标去垢剂。

实施例5 对CCD-2用于nanodisc的制备并进行电镜研究

1.具体步骤：

(1)膜骨架蛋白2N2(MSP2N2)的表达和纯化

膜骨架蛋白2N2(MSP2N2)在大肠杆菌BL-21(诺唯赞，货号C504-03)中表达。细菌在37℃培养至OD600大约为2.5～3.0，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(TCI，货号I0328)诱导大约3小时后，OD600达到10～15。4000g离心30分钟后收集菌体。菌体细胞用约40mL重悬缓冲液(20mM Tris-HCl，pH＝8.0,100mM氯化钠，5mM EDTA(ABCONE，货号E27918))悬浮后，超声破碎菌体细胞。将细菌破碎液35000g离心40分钟后，取上清，加入终浓度为20mM的咪唑和2.5mL Ni-NTA superflow蛋白纯化树脂(QIACEN，货号30430)，于4℃下混悬12小时。含有树脂的溶液过滤除去水相，依次用洗涤液1(40mM Tris-HCl,pH 8.0，150mM氯化钠，10mM咪唑)、洗涤液2(40mM Tris-HCl,pH 8.0，150mM氯化钠，30mM咪唑)各洗涤3次。用提取液(40mM Tris-HCl,pH 8.0，150mM氯化钠，200mM咪唑)冲洗树脂得到MSP2N2蛋白的缓冲溶液。将得到的MSP2N2蛋白溶液通过

纯化仪(Amersham/GE)进一步纯化后，再使用30kD浓缩管将蛋白浓缩到17mg/mL。

(2)去垢剂的去除和Nanodisc的组装

1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC，西格玛，货号42773)和1-棕榈酰基-2-油酰基L-丝氨酸-3-磷脂-单钠盐(POPS，西格玛，货号51581)分别溶解在胆酸钠缓冲液(25mM PBS缓冲液，pH7.4，150mM NaCl，200mM胆酸钠(Santa Cruz，货号sc-215868)中配成浓度为0.1M的储液。将以上两种脂储液按照3：7的体积比混合得到混合脂储液。8ul混合脂储液和280ug膜骨架蛋白(MSP2N2)加入到33uL去垢剂溶液(25mM HEPES缓冲液pH 7.5；800mM氯化钠,10％甘油,10*CMC去垢剂DDM或者CCD-2)中并用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，pH＝8.0,5mMEDTA(ABCONE，货号E27918))稀释到500uL后，在4℃预孵育1小时。DDM组加入100mgBiobeads(Bio-rad，货号152-3920)后4℃孵育过夜，而CCD-2组加入3.3ul TCEP溶液(0.1M)后4℃孵育2小时。孵育结束，三组皆14000rpm离心10分钟，取上清，使用

纯化仪(Amersham/GE)进一步纯化分析。最终，将保留体积为13ml处的馏分固定在400目加强型碳支持膜铜网上(中镜科仪，货号BZ31024a)，并通过120kV电镜仪(FEI,序列号9925765)采集负染照片。

2.实验结果

如图3所示，采用化学方法去除去垢剂制备得到的nanodisc(CCD-2组)相对于传统去垢剂DDM组通过Biobeads物理吸附去除去垢剂得到的nanodisc具有更高的产量和更小的聚集信号峰(图3a)，同时负染电镜照片中CCD-2组得到的nanodisc分散也更加清楚均一(图3b、3c)，证实了该类去垢剂在膜蛋白溶液电镜结构研究中巨大的应用潜力。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种含有二硫键的化合物，其特征在于：所述的化合物，其结构式为

2.如权利要求1所述的化合物在制备去垢剂制剂中的用途。

3.一种去垢剂制剂，所述去垢剂制剂含有如权利要求1所述的化合物。

4.如权利要求1所述的化合物以及权利要求3所述的去垢剂制剂在膜蛋白分离、纯化、离体表达或结构功能研究中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的化合物以及去垢剂制剂需要在断裂试剂的作用下断裂。

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