CN115103591A - 结晶性和液体结晶性25-羟基-胆甾-5-烯-3-硫酸钠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了25HC3S钠的结晶性和液体结晶形式。本公开内容包括25HC3S钠的形式I、II、III、V、IX、XI和XIII和它们的组合。本文中进一步公开了所述形式或它们的组合的药物制剂，以及治疗或预防疾病诸如高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症(例如，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化)的方法。还提供了用于制备25HC3S的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月27日提交的美国临时专利申请系列号62/954,279的优先权权益，该申请的公开内容通过引用并入本文。
简介
以前已经证实，胆固醇代谢物5-胆甾烯-3β-25-二醇-3-硫酸盐(“25HC3S”)减少脂质生物合成并增加胆固醇分泌和降解，并且可能用于治疗和预防高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与脂肪堆积和炎症相关的病症(例如，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化)。
胆固醇被身体用于制造和修复细胞膜，以及合成类固醇激素和维生素D，并在肝脏中转化为胆汁酸。胆固醇有外源性和内源性来源。美国人平均每天消耗约450mg胆固醇，并在肝脏和其它组织中产生额外的500mg至1,000mg。另一个来源是每天分泌到肠道中的500mg至1,000mg胆汁胆固醇，且约50％被重新吸收(肠肝循环)。
高血清脂质水平(高胆固醇血症和高甘油三酯血症)与胆固醇在动脉壁中的积累有关，并可以导致NAFLD和动脉粥样硬化。表征动脉粥样硬化的斑块会抑制血流并促进血块形成，并可以最终通过心脏病发作和/或中风导致死亡或严重残疾。已经开发了许多用于治疗高脂血症的治疗剂并且被医师广泛开处方。不幸的是，只有约35％的患者对目前可得到的疗法有应答。
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是在美国最常见的肝病。这种病症与肥胖、II型成人发作的糖尿病、久坐生活方式和高脂肪饮食有关。当采取适当的治疗步骤时，NAFLD的早期阶段(即脂肪肝)可能是可逆的。但是，如果不加以控制，它可以发展为更难以治疗的肝细胞炎症(非酒精性脂肪性肝炎或NASH)。如果不治疗，NASH可以导致肝组织的不可逆瘢痕形成(脂肪坏死)，并有可能导致肝硬化、肝衰竭和肝癌。
25HC3S已被公开为药学上可接受的盐，诸如钠盐，例如(例如，美国专利10,144,759和Ogawa等人,Steroids,74,81-87(2009))。结晶固体往往比非结晶固体更有利于加工、储存和稳定性。但是，能量学可能不利于合适结晶固体的容易形成，并且多晶型现象可能使得产生特定活性药物成分的稳定结晶固体变得不切实际。在本文中，发明人公开了结晶性25HC3S钠，包括稳定的脱水物、溶剂化物和水合物以及液晶25HC3S钠。还提供了制备25HC3S的方法。
发明内容
在本公开内容的某些方面，提供了结晶性25HC3S钠。
在本公开内容的某些方面，提供了稳定的结晶性25HC3S钠。
在本公开内容的其它方面，提供了结晶性25HC3S钠的水合物。
在本公开内容的再其它方面，提供了结晶性25HC3S钠的一水合物。
在本公开内容的再其它方面，提供了结晶性25HC3S钠的二水合物。
在本公开内容的另外方面，提供了结晶性25HC3S钠的可变水合物。
在本公开内容的某些方面，提供了无水结晶性25HC3S钠。
在本公开内容的另外方面，提供了结晶性25HC3S钠的形式I、形式II、形式III、形式IX、形式XI和形式XIII。
在本公开内容的另外方面，提供了液晶25HC3S钠。
在本公开内容的某些方面，提供了25HC3S钠的中间相。
在本公开内容的其它方面，提供了形式V 25HC3S钠。
在本公开内容的其它方面，提供了以下形式中的两种或更多种的混合物：25HC3S钠的形式I、25HC3S钠的形式II、25HC3S钠的形式III、25HC3S钠的形式V、25HC3S钠的形式IX、25HC3S钠的形式XI或25HC3S钠的形式XIII。
在本公开内容的某些方面，提供了治疗以下一种或多种的方法：高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症，例如，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病或动脉粥样硬化，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的结晶性或液晶中间相25HC3S钠的化合物或其药物组合物。
在本公开内容的其它方面，提供了药物组合物，其包含结晶性25HC3S钠或液晶25HC3S钠或二者以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
在本公开内容的其它方面，提供了药物组合物，其包含结晶性25HC3S钠形式I、结晶性25HC3S钠形式II、结晶性25HC3S钠形式III、液晶25HC3S钠形式V、结晶性25HC3S钠形式IX、结晶性25HC3S钠形式XI或结晶性25HC3S钠形式XIII中的两种或更多种的混合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
本公开内容的方面也包括用于制备25HC3S的方法。在某些情况下，方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与硫酸化试剂接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫复合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸盐化合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂是三氧化硫-吡啶复合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫二甲基甲酰胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在某些情况下，所述硫酸化试剂是硫酸和乙酸酐和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂是三氧化硫三乙胺和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸和吡啶和氯磺酸和2,6-二甲基吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂是氯磺酸乙酯。在某些情况下，所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐是25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐。在某些情况下，使硫酸化试剂在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前与酸酐接触。在某些情况下，所述酸酐选自乙酸酐、三氟乙酸酐和三氟甲基磺酸酐。在某些情况下，在有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐存在下，使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触。在某些情况下，所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐作为颗粒(例如，在前一反应或纯化的反应批中产生的晶种)存在。
在某些情况下，在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前表征所述硫酸化试剂。在某些情况下，通过1H-NMR表征所述硫酸化试剂。在某些情况下，表征所述硫酸化试剂包括在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前确定所述硫酸化试剂的降解程度。在某些情况下，确定所述硫酸化试剂的降解程度包括在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前确定所述硫酸化试剂中杂质的量。
在某些情况下，方法包括在产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以后淬灭未反应的硫酸化试剂。在某些情况下，淬灭未反应的硫酸化试剂包括在产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以后将水加入反应混合物。在某些情况下，淬灭未反应的硫酸化试剂包括将水加入反应混合物，随后将至少一种碱吡啶加入反应混合物。在某些情况下，所述至少一种碱选自三烷基胺诸如三乙胺或三甲胺。在某些情况下，所述至少一种碱选自2,6-二甲基吡啶或吡啶。在某些情况下，所述碱是吡啶。在某些情况下，在缓慢搅拌下淬灭所述反应混合物中未反应的硫酸化试剂。
在某些情况下，方法包括在使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触之前纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐具有70％或更大(诸如80％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大或99％或更大)的纯度。
在某些情况下，纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐具有一种或多种硫酸化副产物(例如，来自硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的副产物，其中相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，一种或多种副产物以5％w/w或更少、4％w/w或更少、3％w/w或更少、2％w/w或更少或1％w/w或更少的量存在。在某些情况下，相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，所述二硫酸化产物(即，5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐)以5％w/w或更少、4％w/w或更少、3％w/w或更少、2％w/w或更少或1％w/w或更少的量存在于纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐组合物中。
在某些情况下，通过液相色谱法纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括液相色谱法，其采用硅胶固定相和包括至少一种碱的流动相。在某些情况下，所述至少一种碱是吡啶。
在某些情况下，可以合并从液相色谱法收集的一种或多种级分。在某些情况下，可以将合并的级分浓缩。在某些情况下，通过蒸馏将合并的级分浓缩。在某些情况下，将合并的级分在真空下浓缩。在某些情况下，通过在真空下蒸馏将合并的级分浓缩。在某些情况下，使合并的级分与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触。在某些情况下，使合并的级分与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的一个或多个颗粒接触。在某些情况下，通过在蒸馏合并的级分的过程中加入25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(例如，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒)与合并的级分接触。在某些情况下，通过在蒸馏合并的级分以后加入25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与合并的级分接触。在某些情况下，将合并的级分浓缩并与组合物接触，所述组合物含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒和至少一种溶剂。
在某些情况下，产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种钠盐接触。在某些情况下，所述至少一种钠盐选自醋酸钠、碘化钠、氯化钠、氢氧化钠和甲醇钠。在某些情况下，方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与碘化钠接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸钠盐。
在某些情况下，用于制备25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与三氧化硫-吡啶复合物接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与至少一种钠盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐。
在某些情况下，用于制备25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐的方法包括使(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与硫酸化试剂接触以产生第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与有机碱接触以产生第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；在有至少一种表面活性剂存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐；通过脱氧从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫复合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸盐化合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂是三氧化硫-吡啶复合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫二甲基甲酰胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在某些情况下，所述硫酸化试剂是硫酸和乙酸酐和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸和2,6-二甲基吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸乙酯。
在某些情况下，所述第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐是(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐。
在某些情况下，与第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触的有机碱选自氢氧化物碱。在某些情况下，所述氢氧化物碱选自氢氧化四乙基铵、氢氧化四丁基铵、氢氧化四丙基铵和氢氧化四甲基铵。
在某些情况下，所述第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐选自四乙基铵阳离子盐、四丁基铵阳离子盐、四丙基铵阳离子盐和四甲基铵阳离子盐。
在某些情况下，在有至少一种表面活性剂存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与组合物接触，所述组合物具有氧化剂和至少一种表面活性剂。在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐包括在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与具有过氧单硫酸钾的组合物接触。在某些情况下，所述至少一种表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。非离子型表面活性剂可以选自聚氧乙烯二醇醚表面活性剂(例如，聚氧乙烯二醇辛基苯酚醚)、聚氧乙烯二醇脱水山梨糖醇烷基酯、脱水山梨糖醇烷基酯、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物，以及其它非离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂可以选自具有阴离子官能头基的表面活性剂，诸如含有磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、硫酸盐/酯或羧酸盐/酯头基的表面活性剂。例如，阴离子表面活性剂可以选自烷基硫酸盐/酯诸如月桂基硫酸铵、磺基琥珀酸二辛酯钠、全氟辛烷磺酸盐、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐、直链烷基苯磺酸盐、烷基-芳基醚磷酸盐、月桂基醚硫酸钠、木素磺酸盐或硬脂酸钠，以及其它阴离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可以选自具有阳离子官能头基(诸如吡啶鎓或季铵头基)的表面活性剂。例如，阳离子表面活性剂可以选自鲸蜡基三甲基硫酸氢铵、四丁基硫酸氢铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵、四丁基溴化鏻、四辛基溴化铵、四辛基碘化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三乙基溴化铵、苄基鲸蜡基二甲基氯化铵和苄基鲸蜡基二甲基溴化铵。两性离子表面活性剂包括阳离子和阴离子中心，诸如磺基甜菜碱(例如，3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)或甜菜碱(例如，椰油酰氨基丙基甜菜碱)。在某些情况下，所述表面活性剂是Extran实验室肥皂、La Parisienne肥皂或DL-α-生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(例如，TPGS-750-M-2)。
在某些情况下，在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与氧化剂和至少一种酮接触。在某些情况下，方法包括：在单独的氧化反应混合物中在有至少一种表面活性剂存在下使氧化剂(例如，过氧单硫酸钾)与至少一种酮接触，和使氧化反应性混合物与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触。在某些情况下，方法包括在有水存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，所述至少一种酮选自四氢噻喃-4-酮1,1-二氧化物和卤代酮。在某些情况下，所述卤代酮选自1,1,1-三氟-2-丁酮、4,4-二氟环己酮、2-2-2-4’-四氟乙酰苯和1,1,1-三氟丙酮。在某些情况下，所述至少一种酮是1,1,1-三氟-2-丁酮。
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种氧化物质接触。在某些情况下，所述至少一种氧化物质选自二氧杂环丙烷。在某些情况下，在具有第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物中原位产生所述二氧杂环丙烷。在某些情况下，单独产生所述二氧杂环丙烷(例如，在单独的反应容器例如烧瓶中)，并然后与具有第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物接触。
在某些情况下，在有至少一种碱存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，所述至少一种碱选自弱碱。在某些情况下，所述至少一种碱选自碳酸氢钾、碳酸氢钠、苯酚钾、柠檬酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液、甲酸钾和乙酸钾。在某些情况下，所述至少一种碱是碳酸氢钾。
在某些情况下，从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括通过使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触进行脱氧。在某些情况下，在有至少一种卤化物和至少一种酸存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触。在某些情况下，所述至少一种卤化物选自碘和金属卤化物。在某些情况下，所述金属卤化物选自碘化钠和碘化锂。在某些情况下，所述至少一种酸选自弱酸。在某些情况下，所述至少一种酸选自乙酸、盐酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、甲酸和甲烷磺酸。在某些情况下，方法包括在有乙酸存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。
在某些情况下，产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种钠盐接触。在某些情况下，所述至少一种钠盐选自醋酸钠、碘化钠、氯化钠、氢氧化钠和甲醇钠。在某些情况下，方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与碘化钠接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸钠盐。
附图简要描述
图1是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图2是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图3是液晶25HC3S钠形式V的XRPD衍射图。
图4是液晶25HC3S钠形式V的XRPD衍射图。
图5是结晶性25HC3S钠形式IX的XRPD衍射图。
图6是结晶性25HC3S钠形式XI的XRPD衍射图。
图7是结晶性25HC3S钠形式XI的XRPD衍射图。
图8是结晶性25HC3S钠形式XIII的XRPD衍射图。
图9是结晶性25HC3S钠形式XIII的XRPD衍射图。
图10是结晶性25HC3S钠形式I的索引结果。
图11是结晶性25HC3S钠形式I的热分析图。
图12是结晶性25HC3S钠形式I的可变温度XRPD实验。
图13是结晶性25HC3S钠形式I和结晶性25HC3S钠形式XIII的可变湿度XRPD实验。
图14是来自结晶性25HC3S钠形式I的脱水的XRPD衍射图。
图15是来自结晶性25HC3S钠形式I的脱水的XRPD衍射图(放大)。
图16是结晶性25HC3S钠形式II的DVS等温线。
图17是结晶性25HC3S钠形式II的索引结果(99:01乙腈(ACN)/H2O浆，0.21aw,3天)。
图18是结晶性25HC3S钠形式II的索引结果(95:05EtOH/H2O浆，0.30aw,10天)。
图19是结晶性25HC3S钠形式II的索引结果(丙酮浆，55℃,1天)。
图20是对于在图17-19中索引的浆，结晶性25HC3S钠形式II的XRPD峰位置变异性，显示了从大约4°2θ至大约11°2θ。
图21是对于在图17-19中索引的浆，结晶性25HC3S钠形式II的XRPD峰位置变异性，显示了从大约13°2θ至大约21.5°2θ。
图22是结晶性25HC3S钠形式II的可变湿度XRPD实验。
图23是通过可变湿度XRPD观察到的结晶性25HC3S钠形式II的XRPD峰位置变异性，显示了从大约7.5°2θ至大约10.2°2θ。
图24是结晶性25HC3S钠形式II的TGA热分析图。
图25是结晶性25HC3S钠形式II的DSC热分析图。
图26是结晶性25HC3S钠形式II的循环DSC实验。
图27是结晶性25HC3S钠形式II的可变温度XRPD实验。
图28是液晶25HC3S钠形式V的TGA热分析图。
图29是液晶25HC3S钠形式V的DSC热分析图。
图30是结晶性25HC3S钠形式XIII(从暴露于70℃真空2天的结晶性25HC3S钠形式I和形式XIII的混合物产生)的索引结果。
图31是结晶性25HC3S钠形式III和形式IX的XRPD衍射图。
图32是结晶性25HC3S钠形式III的索引结果。
图33是结晶性25HC3S钠形式IX在溶液中的1H-NMR谱。
图34是25HC3S钠在溶液中的1H-NMR谱。
图35是结晶性25HC3S钠形式III的XRPD衍射图。
图36是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图37是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图38是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图39是结晶性25HC3S钠形式I和形式XIII的XRPD衍射图。
图40是结晶性25HC3S钠形式XIII的XRPD衍射图。
图41是结晶性25HC3S钠形式XIII的XRPD衍射图。
图42是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图43是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图44是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图45是结晶性25HC3S钠形式III和形式IX混合物的XRPD衍射图。
图46是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图47是液体结晶性25HC3S钠形式V的XRPD衍射图。
图48是液体结晶性25HC3S钠形式V的XRPD衍射图。
图49是结晶性25HC3S钠形式III的XRPD衍射图。
图50是结晶性25HC3S钠形式III的XRPD衍射图。
图51是结晶性25HC3S钠形式IX的XRPD衍射图。
图52是结晶性25HC3S钠形式III的XRPD衍射图并放大。
图53是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图54是结晶性25HC3S钠形式II的XRPD衍射图。
图55是结晶性25HC3S钠形式I的XRPD衍射图。
图56是液体结晶性25HC3S钠形式V的XRPD衍射图。
图57是三氧化硫吡啶在氘代丙酮中的三个不同样品的1H-NMR谱。
图58A是具有21％杂质的三氧化硫-吡啶在氘代丙酮中的样品的1H-NMR谱在8.1至9.3ppm之间的区域的增强。图58B是具有33％杂质的三氧化硫-吡啶在氘代丙酮中的样品的1H-NMR谱在8.1至9.3ppm之间的区域的增强。图58C是具有36％杂质的三氧化硫-吡啶在氘代丙酮中的样品的1H-NMR谱在8.1至9.3ppm之间的区域的增强。
详细描述
结晶性和液体结晶性25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐(25HC3S)
易于通过x-射线粉末衍射分析结晶性25HC3S钠和液体结晶性25HC3S。x-射线粉末衍射图样是x-y图，x轴为°2θ(衍射角)，y轴为强度。x轴也可以是d间距的形式，它通过布拉格定律与衍射角相关，其中2dsinθ＝nλ，其中d是d间距，且λ是入射x射线波的波长。所述图样包含可以用于表征结晶性25HC3S钠的峰。除非另外指出，峰用它们在x轴上的位置表示，而不是用它们的y轴强度表示。还可以发生这样的情况：由于样品取向，由于样品相对于仪器的取向，存在于一台仪器上的一个样品中的峰可能不存在于在不同仪器上采集的另一个样品中。
来自x-射线粉末衍射的数据可以以多种方式用于表征结晶形式。例如，从衍射仪输出的整个x-射线粉末衍射图样可以用于表征25HC3S钠。但是，这样的数据的较小子集也可能并且通常适用于表征25HC3S钠。例如，来自这样的图样的一个或多个峰的集合可以用于表征结晶性25HC3S钠。在本申请中，如实施例16和实施例17中所述，所有报道的峰值以Cu-Kα辐射下的°2θ表示。实际上，经常甚至可以使用单个x-射线粉末衍射峰来表征这样的结晶形式。当本文中的结晶性25HC3S钠通过x-射线粉末衍射图样的“一个或多个峰”来表征并且列出了这样的峰时，通常是指列出的峰的任何组合可以用于表征结晶性25HC3S钠。此外，在x-射线粉末衍射图样中存在其它峰的事实通常不会否定或以其它方式限制该表征。
除了峰强度的变化外，在x轴上峰的位置也可能存在变异性。但是，在为了表征目的而报告峰的位置时，通常可以考虑这种变异性。沿x轴的峰位置的这样的变异性可能源自多个来源(例如，样品制备、颗粒尺寸、含水量、溶剂含量、仪器参数、数据分析软件和样品取向)。例如，在不同条件下制备的相同结晶性材料的样品可能产生稍微不同的衍射图样，且不同的x-射线仪器可能使用不同的参数进行操作，且这些可能导致来自相同结晶固体的稍微不同的衍射图样。
由于这样的变异性来源，通常在以°2θ表示的峰值之前使用词语“约”来描述x-射线衍射峰。出于本文报告数据的目的，该值通常为±0.1°2θ。这通常意味着在维护良好的仪器上，人们会预见到峰值测量的变异性为±0.1°2θ。除非另有说明，本文引用的x-射线粉末衍射峰通常以±0.1°2θ的这种变异性报告，并且无论何时在本文中公开，无论词语“约”是否存在，通常都旨在以这样的变异性报告，但是，在某些情况下，变异性可能高达±0.2°2θ或甚至更高，取决于仪器条件。
如本文中所述，化合物25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐(25HC3S)表示[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸盐，式I的化合物：
本公开内容使用术语“形式”来鉴定结晶性25HC3S钠的不同结晶形式或液体结晶形式。通过结构诸如x-射线粉末衍射；性能诸如吸湿性或热行为；和/或两者，可以看出形式的差异。术语“形式I”的使用是指形式I的结晶性25HC3S钠。同样地，“形式II”是指形式II的结晶性25HC3S钠。类似地，形式III、形式IX、形式XI和形式XIII分别是指形式III、形式IX、形式XI和形式XIII的结晶性25HC3S钠。形式V是指处于液体结晶相的25HC3S钠的形式。
通过偏振光显微术和x-射线粉末衍射中的一种或多种来观察生成的固体。基于与这些材料相关的峰的目视检查，对呈现出独特结晶性x-射线粉末衍射图样的材料给出在本公开内容中阐述的名称。
表1总结了为获得本公开内容中报道形式的25HC3S钠而进行的一些实验，即与实施例1-36相关的那些实验。
表1中带有星号(*)的单元格指示所鉴定的固体不是形式I、形式II、形式III、形式V、形式IX、形式XI或形式XIII之一。
表1中的时间、温度和湿度是近似的。术语“B”是指双折射，且“NB”是指当通过具有交叉极性的偏振光显微术观察样品时非双折射。使用表1中列出的各种溶剂和条件，使用基于溶剂的方法筛选结晶性25HC3S钠。使用溶剂或溶剂混合物的方法包括，例如，冷却溶液、蒸发、抗溶剂添加和悬浮(浆)。这些方法的变体可以包括溶剂、溶剂混合物、抗溶剂、温度、冷却速度、浓度、添加速度和混合顺序的变化，仅举几种可能性。
表1-25HC3S钠的筛选
通过在各种水性溶剂混合物中的竞争性水活度研磨实验(浆),可以研究水活度(aw)对水合状态的影响。可以通过x-射线粉末衍射来表征得到的固相。实验可以建立在各种aw的物理稳定形式。水活度也可以与相对湿度有关，因为RH％＝aw x 100。因此，可能将浆实验中无水/水合物系统的稳定性与固态稳定性直接联系起来。控制水活度的浆技术可以提供一种快速预测无水/水合物系统中的物理稳定形式的准确方法。在表2中提供了水活度实验的结果，并在大约室温进行。时间、温度和湿度是近似值。与表1一样，术语“B”是指当通过具有交叉极性的偏振光显微术观察时是双折射的。
表2-25HC3S钠的水活度浆
对几个x-射线粉末衍射图样进行了索引。本文中使用的“索引”通常表示在给定衍射图样中的峰位置的情况下确定结晶晶胞的尺寸和形状的过程。该术语的名称来源于将米勒指数标签分配给各个峰。例如，如果一个图样中的所有峰都被单个晶胞索引，这可以有力地证明样品包含单个结晶相。给定索引解决方案，可以直接计算晶胞体积，并可以用于确定它们的溶剂化状态。索引也可以是结晶形式的描述，并提供该相在特定热力学状态点的所有可用峰位置的简明总结。
本文报告了结晶性25HC3S钠的多种稳定结晶形式-形式I、II、IX、XI和XIII，和一种液晶形式,形式V。在本公开内容中，“稳定”是指，所述形式在给定的条件组下不容易相互转化为另一种形式。但是，当暴露于某些条件时，亚稳定形式可以如此容易地转化。因此，在一组条件(例如，湿度)下稳定的形式在另一组条件下可能不稳定。并非所有形式都能够在本文中进行索引。此外，形式III是一种亚稳定形式，其形成并且可以是形式IX的起始材料。尽管是亚稳定的，但形式III对于用于XRPD的分离来说是足够稳定的。
在许多情况下，提供结晶性25HC3S钠，包括稳定的结晶性25HC3S钠。结晶性25HC3S钠的例子包括无水结晶性25HC3S钠、结晶性25HC3S钠的水合物和结晶性25HC3S钠的溶剂化物。
结晶性25HC3S钠的水合物包括一水合物、二水合物和可变水合物。本文还提供了25HC3S钠的液晶水合物。
在某些情况下，可以通过包含以下一个或多个峰的x-射线粉末衍射图样来表征结晶性25HC3S钠的水合物：(i)在小于约2.8°2θ诸如在约2.1°2θ至约2.6°2θ之间的峰，(ii)在约4.3°2θ至约4.6°2θ之间的峰，(iii)在约5.0°2θ至约5.5°2θ之间的峰，(iv)在约8.6°2θ至约9.1°2θ之间的峰，和(v)在约15.0°2θ至约15.3°2θ之间的峰。在这些和其它情况下，可以通过包含以下一个或多个峰的x-射线粉末衍射图样来表征结晶性25HC3S钠的水合物：(i)在约2.1°2θ至约2.3°2θ之间的峰，和(ii)在约9.9°2θ至约10.0°2θ之间的峰。
在某些情况下，可以通过包含以下一个或多个峰的x-射线粉末衍射图样来表征无水结晶性25HC3S钠：(i)在约4.5°2θ至约4.8°2θ之间的峰，(ii)在约9.8°2θ至约9.9°2θ之间的峰，(iii)在约14.1°2θ至约14.3°2θ之间的峰，和(iv)在约16.1°2θ的峰。
在许多情况下，在本公开内容中提供了结晶性25HC3S钠形式I。形式I是结晶性25HC3S钠的二水合物。可以如表1所述制备形式I。例如，将25HC3S钠在丙酮/H2O溶液中制浆，加热，除去溶液，加水，并在环境下放置，得到形式I。也可以从甲醇制备形式I。在实施例20-23中进一步描述了形式I的制备，并在实施例24中与形式XIII混合。下表3将产生形式I的实施例与相应的XRPD衍射图附图相关联。
表3-形式I XRPD实施例/附图
| 实施例编号 | 附图 |
| 20 | 36 |
| 21 | 37 |
| 22 | 38 |
| 23 | 55 |
| 24 | 39 |
表4显示了在图55中发现的峰，而表3中其它附图的峰呈现在附图本身上。
表4-图55峰列表
结晶性25HC3S钠的形式I可以通过各种分析技术进行表征，包括通过x-射线粉末衍射。形式I的x-射线粉末衍射图样或其部分可以用于鉴定形式I。形式I包含各种x-射线粉末衍射峰，它们单独或一起可能有助于鉴定形式I的存在。例如，在许多情况下，可以通过包含在约2.1°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式I(并非本文中的所有衍射图都显示出这样的低角度峰)。除了在约2.1°2θ的峰之外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约5.4°2θ、约6.5°2θ、约10.8°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰。
在许多情况下，可以通过包含在约2.1°2θ、约6.5°2θ和约10.8°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式I。在某些情况下，X-射线粉末衍射图样可以进一步包含在约9.9°2θ、约15.0°2θ和约15.6°2θ的一个或多个峰。
图1是形式I的代表性样品的x-射线粉末衍射图样，其中x轴从0°2θ开始并到达40°2θ，而图53显示了相同的图样，但在约3°2θ至约39°2θ之间。例如，图1或图53中的任一个可以用于表征形式I。
形式I似乎在约38％和约70％RH和在约38％至约70％RH之间的相对湿度下是稳定的。因此，形式I由具有在约0.38和约0.70aw和在约0.38至约0.70aw之间的水活度的水性溶剂混合物中的浆产生。当暴露于升高的温度或接近0％RH的湿度条件时，形式I脱水成形式XIII。形式I具有吸湿性，且据信在高于0.73aw的水活度条件下会形成称为形式V的液晶。
形式I的x-射线粉末衍射图样被成功索引，表明所述图样代表单个结晶相(图10)。索引结果具有含有六个25HC3S钠分子的单斜晶胞。
(±5％)的晶胞体积导致
(±5％)的式单位体积(6个分子/晶胞)，这与水合物一致。形式I的式单位体积比无水形式(形式XIII)的式单位体积大了大约
体积差异提供了足够的空间来容纳至多2mol/mol的水。作为参考，一个水分子占据约
形式I的热分析图如图11所示。TGA热分析图在至多130℃下提供了8％重量损失，这与DSC热分析图中的广泛脱水吸热同时发生(图11)。假设损失是由于挥发的水，重量损失对应于大约2.4mol/mol水。图11中的DSC曲线还显示了在168℃和182℃附近的吸热。这些事件与分解有关。
形式I的脱水导致形式转化为形式XIII。通过可变温度x-射线粉末衍射实验证实了转化(图12)，所述实验显示了当加热到170℃并然后下降到135℃时的形式XIII(图12的图样5)。在同一实验中，在170℃时发现被鉴定为二硫酸氢三钠Na3H(SO4)2的分解产物。这些结果与图11中形式I的热分析图一致。
对主要由形式I和少量形式XIII组成的混合物进行的可变湿度x-射线粉末衍射实验如图13所示。在其中制备分析样品的实验室湿度为15％相对湿度(“RH”)。在x-射线粉末衍射分析期间，将所述材料暴露于增加并然后下降的湿度。在跨25％至85％RH的湿度条件，将所述材料鉴定为形式I。但是，所述材料在暴露于0％RH后立即部分脱水回到形式XIII。在20分钟后，在0％RH下完全脱水成形式XIII。在真空下向0％RH或70℃的暴露使形式I脱水成形式XIII。图14和图15对比了随着形式I脱水成形式XIII的材料的x-射线粉末衍射图样。
进一步公开了基本上纯的形式I。如本文中所述的“基本上纯的”通常表示没有以任何可察觉量存在的本文形式，除了可能痕量水平的其它形式的结晶性25HC3S钠、25HC3S钠的液体结晶形式或非结晶25HC3S诸如无定形25HC3S钠。相对于存在的25HC3S钠的总量(基于重量)，痕量水平的例子包括总计不超过约10％、5％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、或更少。
在本公开内容的许多情况下，提供了形式II结晶性25HC3S钠，包括基本上纯的形式II结晶性25HC3S钠。形式II是结晶性25HC3S钠的可变水合物。水含量通常以每摩尔25HC3S钠不大于约3摩尔水存在。在某些情况下，水对25HC3S钠的摩尔含量为约1至3，包括例如约2至3。形式II可以如表1所述制备。例如，将25HC3S钠在丙酮中制浆并在氮气下干燥得到形式II。形式II也可以如实施例27-30中所述制备。下表5将产生形式II的实施例与相应的XRPD衍射图附图相关联。
表5-形式II XRPD实施例/附图
| 实施例编号 | 附图 |
| 27 | 42 |
| 28 | 43 |
| 29 | 44 |
| 30 | 46 |
表6显示了在图46中发现的峰，而表5中其它附图的峰呈现在附图本身上。
表6-图46峰列表
形式II可以通过各种分析技术进行表征，包括通过x-射线粉末衍射。形式II的x-射线粉末衍射图样或其部分可以用于鉴定形式II。形式II包含各种x-射线粉末衍射峰，它们单独或一起可能有助于鉴定形式II的存在。在许多情况下，可以通过包含在约2.3°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式II。除了在约2.3°2θ的峰之外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约4.5°2θ的一个或多个峰，在约5.0°2θ和约5.1°2θ和在约5.0°2θ至约5.1°2θ之间的峰，在约5.9°2θ和约6.1°2θ和在约5.9°2θ至约6.1°2θ之间的峰，和在约14.8°2θ和约15.1°2θ和在约14.8°2θ至约15.1°2θ之间的至少一个峰。
在许多情况下，可以通过包含在约2.3°2θ和约5.0°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式II。在某些情况下，X-射线粉末衍射图样可以包含在约4.5°2θ、约5.9°2θ、约9.1°2θ和约15.1°2θ的一个或多个峰。
图2是形式II的x-射线粉末衍射图样，其中x轴从约0°2θ开始并到达约40°2θ，而图54显示相同的图样，但在约3°2θ至约39°2θ之间。图2或图54中的任何一个可以用于表征形式II。
形式II在各种温度和湿度条件下是稳定的。在本文中描述了形式II和基本上纯的形式II。形式II在从约21％至约30％RH的相对湿度下是稳定的。因此，从具有在0.21和0.30aw和在0.21至0.30aw之间的水活度的水性溶剂混合物中的浆产生形式II。如此制备的可变水合物表现出动力学稳定性。当暴露于升高的温度或低湿度条件时，已经看到形式II脱水成无水状态而没有形式转化。在完全水合状态下，形式II看起来容纳大约3mol/mol的水(图16显示了形式I在85％RH的DVS吸收等温线)。长时间暴露于75％或更高的RH后，形式II转化为25HC3S钠的液体结晶形式V。
已成功索引从各种实验中获得的形式II的多个x-射线粉末衍射图样(图17、图18和图19)。这些索引表明，形式II的晶胞体积会发生变化以适应不同量的水，且因此形式II是可变水合物。这些图样中的差异(归因于峰位置的变化)提示，观察到的峰存在一个范围(图18和19)。图20和21是浆的x-射线粉末衍射图样的放大区域。鉴于x-射线粉末衍射峰位置是晶胞参数的直接结果，由于可变水合及其对晶格参数的影响，一个x-射线粉末衍射图样不一定代表在所有条件下的结晶形式。x-射线粉末衍射图样应视为形式II的相同结晶相的离散状态。一般趋势是随着晶胞体积增加，峰向更小的散射角移动。各向异性应变可以导致一些峰随着晶胞体积增加而向更高的散射角移动。一些峰位置比其它峰位置对晶胞体积的变化更敏感。对晶胞体积变化敏感的峰可以用于确定特定样本的晶胞体积。移动的峰会产生通过目测看起来在质量上有所不同的x-射线粉末衍射图样，但并不表示结晶相的变化。
通过大体上根据实施例18进行的原位可变湿度x-射线粉末衍射实验，在环境温度和跨0％至85％RH的不同RH条件下获得形式II的多个x-射线粉末衍射图样。所述实验提供了一种系统方法来确定由吸水决定的晶胞体积变化，其中晶胞膨胀/收缩以容纳水。正如预期的那样，没有发生形式变化；但是，由于晶胞体积差异，观察到图样之间的峰偏移(图22和图23)。在较高湿度下，峰向较小散射角移动，从而提示晶胞体积与相对湿度成正比，并且可能会增加以掺入水。
在图16中提供的DVS等温线显示了形式II在相同相对湿度条件下的含水量变化，其中通过可变湿度x-射线粉末衍射证明了动力学形式稳定性。形式II从5％到55％RH(1mol/mol水)增加了大约3.5重量％，从55％到85％RH(2mol/mol水)增加了7重量％，从85％到95％RH增加了另外7重量％。仪器在85％RH以上超时，从而提示如果在该条件下放置更长时间，额外的水吸收是可能的。在解吸后观察到滞后。所述材料被回收并鉴定为形式II和形式V的混合物。通过x-射线粉末衍射，在干燥氮气下至多4天或在0％RH储存至多35天，形式II保持不变。暴露于75％RH后35天内转化为形式V。
在获得的三种索引溶液中，从形式II的索引结果观察到的最大晶胞体积提供在图17中。假设斜方晶胞含有12个25HC3S钠分子，则
的式单位体积将比无水形式(形式XIII)的式单位体积大了约
这对应于
(±5％)的晶胞体积。体积差异提供了足够的空间来容纳至多2mol/mol的水。
通过TGA观察到在高达150℃的温度下5％和6％的重量损失(参见图24)。假设损失是由于水的挥发，重量损失分别对应于大约1.5和1.8mol/mol水。损失与DSC中的广泛脱水吸热同时发生(图25)。DSC曲线还显示了接近167℃和189℃的吸热。这些事件与分解有关。
形式II的循环DSC实验如图26所示。在至多130℃的第一个加热循环中观察到广泛的去溶剂化吸热(迹线1)，这与关于水合物的预期一致。但是，在冷却后(迹线2)或在第二次加热(迹线3)直到130℃后，未观察到事件。这表明脱水后没有发生形式变化，并且一旦再次加热到130℃，所述材料就不含水。然后样品继续分解，如在167℃和188℃附近的吸热所证实。通过在升高的温度下脱水的形式II的动力学稳定性，得到了大体上根据实施例19进行的可变温度x-射线粉末衍射实验的证实(图27)。在135℃仍然通过x-射线粉末衍射观察到形式II。因此，来自可变温度x-射线粉末衍射和循环DSC实验的结果表明，可以通过完全脱水来维持形式II。在相同的可变温度x-射线粉末衍射实验中，在170℃时发现了被鉴定为二硫酸氢三钠Na3H(SO4)2的分解产物。
在某些情况下，形式XI，包括基本上纯的形式XI，由结晶性25HC3S钠提供。形式XI是结晶性25HC3S钠的水合物，其可以如表1中所述制备。例如，形式XI可以如下制备：在乙醚中制浆并暴露于环境条件14天，过滤，并在氮气下干燥。因此它可以以稳定的形式制备。此外，实施例37显示了形式XI的制备。形式XI可以通过各种分析技术来表征，包括通过x-射线粉末衍射。形式XI的x-射线粉末衍射图样或其部分可以用于鉴定形式XI。形式XI包含各种x-射线粉末衍射峰，它们单独或一起可能有助于鉴定形式XI的存在。
在许多情况下，可以通过包含在约2.6°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式XI。除了在约2.6°2θ的峰以外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约3.1°2θ、约3.5°2θ和约14.5°2θ的一个或多个峰。形式XI的x-射线粉末衍射图样是在图6和图7中。图6或图7可以用于表征形式XI。
在某些情况下，本文提供了形式V，即25HC3S钠的易溶中间相(也被称作液晶)，包括基本上纯的形式V。易溶中间相由溶剂的存在诱导。此外，浓度和温度是它们相变的决定因素。可以如表1所述制备形式V。例如，透明的和粘稠的凝胶由水、具有高于0.73aw的水活度的水性溶剂混合物、甲醇和DMSO形成。特别由水、具有高于0.73aw的水活度的水性溶剂系统和甲醇形成为凝胶的形式V表现出无序的x-射线粉末衍射图样。当形式I或形式II暴露于75％RH或以上的相对湿度时，也会形成形式V。这些凝胶在偏振光显微术下通常不表现出双折射，直到施加剪切力，例如在两个载玻片之间滑动。光学双折射暗示至少具有一维秩序的有序相。还观察到材料的流动。此外，可以如例如实施例34、35和36中所述制备形式V。
中间相的特征在于它的双折射，这在无定形固体或各向同性液体中不存在，而在结晶固体的几乎所有情况下都存在。此外，材料在受到挤压后像液体一样流动，而不是像固体那样断裂和破裂。作为中间相的典型，形式V的x-射线粉末衍射图样显示出叠加在漫反射背景上的很少峰(图3)。
在许多情况下，可以通过包含在约2.2°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式V。除了在约2.2°2θ的峰以外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约4.4°2θ、约6.6°2θ和约8.8°2θ的一个或多个峰。
在许多情况下，可以通过包含在约2.2°2θ、约6.6°2θ的峰以及在约4.0°2θ和约6.0°2θ和在约4.0°2θ至约6.0°2θ之间的单个峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式V。在某些情况下，x-射线粉末衍射可以进一步包含在约8.8°2θ、约9.9°2θ和约14.9°2θ的一个或多个峰。形式V的x-射线粉末衍射图样见图3和图4。图3或图4中的任一个可以用于表征形式V。
通过TGA，形式V在高达147℃表现出7％的重量损失(图28)，这与DSC中的广泛脱水吸热同时发生(图29)。与分解相关的事件在148℃以上是明显的。
形式V的物理稳定性显示在环境条件下储存25天后通过x-射线粉末衍射没有观察到变化。此外，所述材料在暴露于55℃和真空1天后仍保持为形式V。因此，本文公开的也是稳定的形式V。下表7将产生形式V的实施例与相应的XRPD衍射图附图相关联。
表7-形式V XRPD实施例/附图
表8显示了在图56中发现的峰，而表8中的其它附图的峰呈现在附图本身上。
表8-图56峰列表
在许多情况下，提供了形式XIII结晶性25HC3S钠，包括基本上纯的形式XIII结晶性25HC3S钠。形式XIII是无水的，并通过形式I在暴露于130℃、70℃和真空或暴露于接近0％RH的湿度条件后的脱水观察到。在环境条件下，形式XIII快速地水合为形式I。形式XIII也可以如下看到：溶解在乙腈/H2O溶液中并干燥，如表1所示。例如，也可以如实施例25和26中所述制备形式XIII。
形式XIII的x-射线粉末衍射图样被成功索引，表明所述图样代表单个结晶相(图30)。索引结果具有含有六个25HC3S钠分子的单斜晶胞。因此，
(±5％)的式单位体积与无水形式一致，并且不能容纳任何额外的溶剂或水分子，晶胞体积为
(±5％)。
在许多情况下，可以通过包含在约2.3°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式XIII。除了在约2.3°2θ的峰以外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约4.6°2θ、约9.3°2θ、约14.3°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰(图8和图9)。
在许多情况下，可以通过包含在约2.3°2θ、约5.4°2θ、约9.3°2θ和约11.6°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式XIII。在某些情况下，x-射线粉末衍射图样可以进一步包含在约4.6°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰。图8或图9中的任一个可以用于表征形式XIII。
对主要由形式I和少量形式XIII组成的混合物进行的可变湿度x-射线粉末衍射实验呈现在图13中。在x-射线粉末衍射分析期间，所述材料暴露于先增加然后降低的湿度。这些结果提供了形式I和XIII快速相互转化的证据。形式I和形式XIII的混合物在14％RH下很明显。形式XIII显示在达到25％RH之前水合为形式I。相反，形式I显示在暴露于0％RH后几分钟内脱水成形式XIII，在那些条件下保持稳定。
在本公开内容的许多情况下，提供了结晶性25HC3S钠的溶剂化物，包括基本上纯的25HC3S钠的结晶性溶剂化物。
在许多情况下，提供了形式III结晶性25HC3S钠，包括基本上纯的形式III结晶性25HC3S钠。形式III是结晶性25HC3S钠的乙醇溶剂化物。形式III的X-射线粉末衍射图样如图35、图49和图50所示。形式III仅从涉及乙醇的实验中结晶。形式III是亚稳定的，并在环境条件下会去溶剂化为形式II。当暴露于58℃和真空过夜或130℃的温度时，它会去溶剂成另一种无水形式，即形式IX(图31)。在实施例38-39中进一步描述了形式III的制备。
表9显示了在图50中发现的峰，而图35和49的峰显示在图本身上。
表9-图50峰列表(形式III)
形式III的x-射线粉末衍射图样被成功索引，表明所述图样代表单个结晶相，如在图32中所见。索引结果具有包含两个25HC3S钠分子的三斜晶胞。因此，
的式单位体积与单乙醇化物一致。体积比无水形式(形式XIII)的式单位体积大了约
体积差异提供了足够的空间来容纳至多1mol/mol的乙醇，这进一步表明形式III是单乙醇化物。
在许多情况下，可以通过包含在约4.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式III。虽然在表9中没有出现在约4.9°2θ的峰，但在图52中的衍射图样的放大视图显示了在约4.9°2θ的峰的存在。除了在约4.9°2θ的峰以外，x-射线粉末衍射图样可以包含，例如，在约6.3°2θ、约7.8°2θ和约9.8°2θ的一个或多个峰。
在许多情况下，可以通过在约4.9°2θ和约6.3°2θ的峰来表征形式III。在某些情况下，x-射线粉末衍射图样可以进一步包含在约7.8°2θ、约9.8°2θ、约13.3°2θ和约15.5°2θ的一个或多个峰。可以通过图35的x-射线粉末衍射图样来表征形式III。
关于形式IX，在许多情况下，可以通过包含在约4.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式IX。X-射线粉末衍射图样可以包含例如，在约7.9°2θ、约11.2°2θ、约14.1°2θ、约16.1°2θ和约16.6°2θ的一个或多个峰。
在许多情况下，可以通过包含在约2.2°2θ、约4.9°2θ和约7.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样来表征形式IX。在某些情况下，x-射线衍射图样可以进一步包含在约14.1°2θ、约16.1°2θ和约16.6°2θ的一个或多个峰。可以进一步通过图5来表征形式IX。
没有观察到残留的有机溶剂，诸如乙醇。通过TGA在高达145℃观察到的1.6％重量损失可能是由于水的挥发。DSC显示一致的脱水吸热，并且在150℃以上的事件与分解有关。如实施例32和实施例33所述制备形式IX。图5对应于实施例32，且图51对应于实施例33。
表10显示了在图51中发现的峰，而图5的峰呈现在该图上。
表10-图51峰列表
本公开内容也涉及药物组合物，其含有如本文中公开的结晶性25HC3S钠。这样的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和如本公开内容中所述的结晶性25HC3S钠。这样的药物组合物可以口服施用或配置为以任何有效的常规剂量单位形式递送，包括例如，立即、缓慢和定时释放的口服制品、胃肠外、局部、鼻、眼部、光学上、舌下、直肠、阴道等递送。
本公开内容进一步包括25HC3S钠的形式(诸如结晶性25HC3S钠形式)与彼此和/或与25HC3S钠的易溶形式的混合物。例如，提供了结晶性25HC3S钠形式I、结晶性25HC3S钠形式II、液晶25HC3S钠形式V、结晶性25HC3S钠形式IX、结晶性25HC3S钠形式XI或结晶性25HC3S钠形式XIII中的两种或更多种的混合物。在这样的混合物中存在的每种形式的量的范围为，例如，按重量计约0.01％至约99.9％。其它范围包括按重量计约0.1％至约95％、约0.1％至约90％、约0.1％至约85％、约0.1％至约80％、约0.1％至约75％、约0.1％至约70％、约0.1％至约65％、约0.1％至约60％、约0.1％至约55％、约0.1％至约50％、约0.1％至约45％、约0.1％至约40％、约0.1％至约35％、约0.1％至约30％、约0.1％至约25％、约0.1％至约20％、约0.1％至约15％、和约0.1％至约10％。其它范围包括按重量计约0.1％至约9％、约0.1％至约8％、约0.1％至约7％、约0.1％至约6％、约0.1％至约5％、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.1％至约1％。另外的范围包括按重量计约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.1％至约0.3％、和约0.1％至约0.2％。其它范围包括按重量计约0.01％至约0.1％。另外的范围包括按重量计的约0.01％至约0.09％、约0.01％至约0.08％、约0.01％至约0.07％、约0.01％至约0.06％、约0.01％至约0.05％、约0.01％至约0.04％、约0.01％至约0.03％和约0.01％至约0.02％。这样的混合物也可以存在于包含一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中。
本公开内容进一步包括用有效量的本公开内容的结晶性25HC3S钠和/或包含结晶性25HC3S钠的药物组合物治疗人类疾病诸如高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症(例如，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化)中的一种或多种的方法和用途。
用于制备25-羟基-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐(25HC3S)的方法
如上面所总结的，本公开内容也提供了用于制备25-羟基-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐诸如25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐(25HC3S)的方法。尽管本文中的许多教导涉及3β位置的硫酸盐，但本公开内容的教导通常也适用于3α位置的硫酸盐。在本文描述的用于制备25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐的主题方法的每个步骤中使用的组分可以是纯化的组合物或粗制的组合物，根据需要而定。术语“纯化的”以其常规含义使用，是指其中已经进行了至少一些分离或纯化过程的组合物，例如，反应混合物的过滤或水性后处理(workup)。在某些情况下，纯化包括液相色谱法、重结晶、蒸馏(例如，共沸蒸馏)和其它类型的化合物纯化中的至少一种。例如，通过色谱方式，诸如高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)、薄层色谱法、快速柱色谱法和离子交换色谱法，可以纯化如本文中所述的化合物。可以使用任何合适的固定相，包括正相和反相以及离子树脂。流动相可以选自极性溶剂和非极性溶剂。在某些情况下，所述流动相包括极性溶剂。在某些情况下，所述极性溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、二氯乙烷、丙酮、二氧杂环己烷、乙酸乙酯、二甲基亚砜、苯胺、二乙胺、硝基甲烷、乙腈、吡啶、异丙醇、乙醇、甲醇、乙二醇、乙酸和水。在某些情况下，所述流动相包括非极性溶剂。在某些情况下，所述非极性溶剂选自乙醚、甲苯、苯、戊烷、己烷类、环己烷、石油醚和四氯化碳。参见，例如，Introduction to Modern Liquid Chromatography,第2版,L.R.Snyder和J.J.Kirkland编,John Wiley and Sons,1979；和Thin LayerChromatography,E.Stahl编,Springer-Verlag,New York,1969。
在某些情况下，将反应混合物在本文所述方法的后续步骤中作为粗制混合物使用，其中未对反应混合物进行纯化或其它后处理。在某些情况下，相对于粗制反应混合物(除了溶剂之外，当存在时)，所述粗制混合物包括足够纯度的目标化合物，诸如其中反应混合物包括70％或更大的纯度的目标化合物，诸如75％或更大，诸如80％或更大，诸如85％或更大，诸如90％或更大，诸如95％或更大，诸如97％或更大，诸如99％或更大，诸如99.5％或更大，诸如99.9％或更大，诸如99.99％或更大，且包括99.999％或更大，如通过色谱法(例如，HPLC或SFC)、核磁共振光谱法(例如，1H NMR或13C NMR)或它们的组合所确定的。在某些情况下，相对于粗制反应混合物(除了溶剂之外，当存在时)，目标化合物以30重量％或更大的量存在于反应混合物中，诸如相对于粗制反应混合物40重量％或更大，诸如50重量％或更大，诸如60重量％或更大，诸如70重量％或更大，诸如75重量％或更大，诸如80重量％或更大，诸如85重量％或更大，诸如90重量％或更大，诸如95重量％或更大，诸如97重量％或更大，诸如99重量％或更大，诸如99.5重量％或更大，诸如99.9重量％或更大，诸如99.99重量％或更大，且包括99.999重量％或更大，并且范围可以为从5重量％至99.999重量％，诸如30重量％至99.99重量％，40重量％至99.9重量％，50重量％至99重量％，70重量％至95重量％，75重量％至90重量％，80重量％至99重量％，或80重量％至95重量％。在某些情况下，相对于粗制反应混合物，目标化合物以30mol％或更大存在于粗制反应混合物中(除了溶剂之外，当存在时)，诸如40mol％或更大，诸如50mol％或更大，诸如60mol％或更大，诸如70mol％或更大，诸如75mol％或更大，诸如80mol％或更大，诸如85mol％或更大，诸如90mol％或更大，诸如95mol％或更大，诸如97mol％或更大，诸如99mol％或更大，诸如99.5mol％或更大，诸如99.9mol％或更大，诸如99.99mol％或更大，且包括99.999mol％或更大，并且范围可以为从30mol％至99.999mol％，诸如50mol％至99mol％、70mol％至95mol％、75mol％至90mol％、80mol％至99mol％、或80mol％至95mol％。
用于制备根据本公开内容的25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸金属盐([(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸金属盐)的方法包括：使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与硫酸化试剂接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐(方案Ia)。
方案Ia
方案IA1
通过与硫酸化试剂接触，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化(方案IA1)。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫复合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸盐化合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫二甲基甲酰胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在某些情况下，所述硫酸化试剂包括硫酸和乙酸酐和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂包括三氧化硫三乙胺和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自1)氯磺酸和吡啶和2)氯磺酸和2,6-二甲基吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂是氯磺酸乙酯。
可以将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇在从-10℃至50℃范围内的温度硫酸化，诸如从-5℃至45℃，诸如从-4℃至40℃，诸如从-3℃至35℃，诸如从-2℃至30℃，诸如从-1℃至25℃，且包括从0℃至20℃。可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇使用的硫酸化试剂的量可以变化，且可以是0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至5当量，0.5当量至10当量，0.5当量至8当量，0.5当量至5当量，0.9当量至10当量，0.9当量至8当量，0.9当量至5当量，1.3当量至10当量，1.3当量至8当量，1.3当量至5当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至5当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至5当量，或1当量至2当量，1当量至1.5当量，或1.1-1.2当量。
在某些情况下，方法包括在至少一种溶剂中硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物表现出低溶解度。在某些情况下，在至少一种溶剂中硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物表现出100mmol/L或更低的溶解度，诸如90mmol/L或更低，诸如80mmol/L或更低，诸如70mmol/L或更低，诸如60mmol/L或更低，诸如50mmol/L或更低，诸如40mmol/L或更低，诸如30mmol/L或更低，诸如20mmol/L或更低，诸如10mmol/L或更低，且包括在至少一种溶剂中硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物表现出5mmol/L或更低的溶解度。在某些情况下，在至少一种溶剂中硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物在形成后沉淀。在某些情况下，所述至少一种溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲苯、四氢呋喃和甲基四氢呋喃。
在某些情况下，方法包括以足以减少或消除25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的二硫酸化的方式硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇。在某些情况下，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化，且形成的二硫酸盐产物(即，5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐,结构IA)的量为通过使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与硫酸化试剂接触而形成的反应产物的10重量％或更低，诸如9重量％或更低，诸如8重量％或更低，诸如7重量％或更低，诸如6重量％或更低，诸如5重量％或更低，诸如4重量％或更低，诸如3重量％或更低，诸如2重量％或更低，诸如1重量％或更低，诸如0.5重量％或更低，诸如0.1重量％或更低，诸如0.01重量％或更低，诸如0.001重量％或更低，且包括这样的情况：将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化，且形成的二硫酸盐产物的量为0.0001重量％或更低，并且范围可以为从10重量％至0.001重量％，诸如10重量％至0.1重量％，10重量％至1重量％，10重量％至2重量％，8重量％至0.001重量％，8重量％至0.1重量％，8重量％至1重量％，8重量％至2重量％，6重量％至0.001重量％，6重量％至0.1重量％，6重量％至1重量％，6重量％至2重量％，4重量％至0.001重量％，4重量％至0.1重量％，4重量％至1重量％，4重量％至2重量％，3重量％至0.001重量％，3重量％至0.1重量％，3重量％至1重量％，2重量％至0.001重量％，2重量％至0.1重量％，或2重量％至1重量％。
在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是10:1或更多，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是109:1或更多，并且范围可以为从10:1的重量比至109:1的重量比，诸如10:1的重量比至106:1的重量比，10:1的重量比至103:1的重量比，10:1的重量比至100:1的重量比，100:1的重量比至109:1的重量比，100:1的重量比至106:1的重量比，100:1的重量比至103:1的重量比，250:1的重量比至109:1的重量比，250:1的重量比至106:1的重量比，250:1的重量比至103:1的重量比，500:1的重量比至109:1的重量比，500:1的重量比至106:1的重量比，500:1的重量比至103:1的重量比，103:1的重量比至109:1的重量比，103:1的重量比至106:1的重量比，或250:1的重量比至103:1的重量比。
在某些情况下，当硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇时形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐保持溶解在至少一种溶剂中。在某些情况下，所述5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐在至少一种溶剂中具有高溶解度。在某些情况下，所述5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐表现出在至少一种溶剂中500mmol/L或更大的溶解度，诸如600mmol/L或更大，诸如700mmol/L或更大，诸如800mmol/L或更大，诸如900mmol/L或更大，且包括在至少一种溶剂中1mol/L或更多的溶解度。
在某些情况下，方法进一步包括将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物与二硫酸盐产物(即，5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐)分离。在某些情况下，通过真空过滤将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物与二硫酸盐产物分离。在某些情况下，通过25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物的重结晶将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物与二硫酸盐产物分离。在某些情况下，通过色谱法(例如，硅胶柱)将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物与二硫酸盐产物分离。
在某些情况下，在具有从5.0至8.0范围内的pH的反应混合物中将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化，诸如从5.1至7.9的pH，诸如从5.2至7.8的pH，诸如从5.3至7.7的pH，诸如从5.4至7.6的pH，诸如从5.5至7.5的pH，诸如从5.6至7.4的pH，诸如从5.7至7.3的pH，诸如从5.8至7.2的pH，诸如从5.9至7.1的pH，且包括在具有从6.0至7.0的pH的反应混合物中将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化。
在某些情况下，在有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐存在下将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化。在某些情况下，所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐作为颗粒(例如，在前一反应或纯化的反应批中产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的晶种)存在。在某些情况下，与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐不存在时的溶解度相比，在有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(例如，作为颗粒)存在下将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化足以降低通过硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的反应产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的溶解度。在某些情况下，与加入的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐不存在时的溶解度相比，在反应混合物中产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的溶解度降低了5％或更多，诸如10％或更多，诸如25％或更多，诸如50％或更多，诸如75％或更多，诸如90％或更多，且包括使产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的溶解度降低了99％或更多。加入反应混合物中的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒的大小可以变化，且可以具有0.01mm或更大的尺寸(例如，长度、宽度或直径)，诸如0.025mm或更大，诸如0.05mm或更大，诸如0.075mm或更大，诸如0.1mm或更大，诸如0.25mm或更大，诸如0.5mm或更大，诸如0.75mm或更大，诸如1mm或更大，诸如2mm或更大，诸如3mm或更大，诸如4mm或更大，且包括5mm或更大。在某些情况下，在使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之后，立即将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入反应混合物中。在某些情况下，在使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之后1分钟或更久，诸如5分钟或更久，诸如10分钟或更久，诸如15分钟或更久，诸如20分钟或更久，诸如30分钟或更久，诸如40分钟或更久，诸如50分钟或更久，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入反应混合物中，且包括在使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之后60分钟或更久将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入反应混合物中。
在某些情况下，在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前表征所述硫酸化试剂。在某些情况下，表征所述硫酸化试剂包括在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前确定所述硫酸化试剂的降解程度。在某些情况下，确定所述硫酸化试剂的降解程度包括在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前确定所述硫酸化试剂中杂质的量。
在某些情况下，通过质子核磁共振光谱法(1H-NMR)确定所述硫酸化试剂的降解。可以在至少一种氘代溶剂中进行硫酸化试剂的质子NMR光谱法。在某些情况下，所述至少一种氘代溶剂是氘代丙酮((CD3)2CO)。在某些情况下，所述至少一种氘代溶剂不是氘代苯(C6D6)。在某些情况下，所述至少一种氘代溶剂不是氘代乙腈(CD3CN)。在某些情况下，所述至少一种氘代溶剂不是氘代氯仿(CD3Cl)。
在某些情况下，确定降解程度的方法包括在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分在1H-NMR谱中的一个或多个峰，和基于积分的峰计算硫酸化试剂的杂质水平。在某些情况下，确定降解程度的方法包括在约9.25ppm的化学位移积分在1H-NMR谱中的一个或多个峰，和基于积分的峰计算硫酸化试剂的杂质水平。在某些情况下，当硫酸化试剂的杂质水平低于预定阈值时，诸如当通过在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰确定的杂质水平是25％或更低时，诸如24％或更低，诸如23％或更低，诸如22％或更低，诸如21％或更低，诸如20％或更低，诸如19％或更低，诸如18％或更低，诸如17％或更低，诸如16％或更低，诸如15％或更低，诸如14％或更低诸如13％或更低，诸如12％或更低，诸如11％或更低，诸如10％或更低，诸如9％或更低，诸如8％或更低，诸如7％或更低，诸如6％或更低，诸如5％或更低，诸如4％或更低，诸如3％或更低诸如2％或更低，且包括这样的情况：通过在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰确定的杂质水平是1％或更低，使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触。在某些情况下，当杂质水平高于预定阈值时，诸如当通过在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰确定的杂质水平是25％或更多时，诸如26％或更多，诸如27％或更多，诸如28％或更多，诸如29％或更多，诸如30％或更多，诸如31％或更多，诸如32％或更多，诸如33％或更多，诸如34％或更多，且包括这样的情况：通过在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰确定的杂质水平是35％或更多，不使硫酸化试剂与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触。
在某些情况下，产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物包括一种或多种副产物。在某些情况下，所述副产物是5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐。在某些情况下，5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐副产物相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以10重量％或更低、诸如9重量％或更低、诸如8重量％或更低、诸如7重量％或更低、诸如6重量％或更低、诸如5重量％或更低、诸如4重量％或更低、诸如3重量％或更低、诸如2重量％或更低、诸如1重量％或更低、诸如0.5重量％或更低、诸如0.1重量％或更低、诸如0.01重量％或更低、诸如0.001重量％或更低的量存在于通过硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇而产生的组合物中，且包括这样的情况：5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐副产物以0.001重量％或更低的量存在于通过硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇而产生的组合物中，并且范围可以为从0.1重量％至50重量％，诸如0.5重量％至20重量％或1重量％至12重量％。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐副产物的重量比是10:1或更多，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是109:1或更多。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和形成的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比的范围为从10:1至109:1，诸如从100:1至108:1，诸如从1000:1至107:1，且包括从10000:1至106:1。
本公开内容的方面也包括具有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的组合物，所述5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以下述量存在于所述组合物中：10重量％或更低，诸如9重量％或更低，诸如8重量％或更低，诸如7重量％或更低，诸如6重量％或更低，诸如5重量％或更低，诸如4重量％或更低，诸如3重量％或更低，诸如2重量％或更低，诸如1重量％或更低，诸如0.5重量％或更低，诸如0.1重量％或更低，诸如0.01重量％或更低，诸如0.001重量％或更低，且包括0.001重量％或更低，并且范围可以为从10重量％至0.001重量％，诸如10重量％至0.1重量％，10重量％至1重量％，10重量％至2重量％，8重量％至0.001重量％，8重量％至0.1重量％，8重量％至1重量％，8重量％至2重量％，6重量％至0.001重量％，6重量％至0.1重量％，6重量％至1重量％，6重量％至2重量％，4重量％至0.001重量％，4重量％至0.1重量％，4重量％至1重量％，4重量％至2重量％，3重量％至0.001重量％，3重量％至0.1重量％，3重量％至1重量％，2重量％至0.001重量％，2重量％至0.1重量％，或2重量％至1重量％。
在某些情况下，组合物包括10:1或更多的重量比的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：所述组合物中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是109:1或更多。在某些情况下，组合物包括在从10:1至109:1范围内的重量比的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐，诸如从100:1至108:1，诸如从1000:1至107:1，且包括从10000:1至106:1。
在某些情况下，所述副产物是硫酸化的链甾醇(结构IB)。
在某些情况下，硫酸化的链甾醇([(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己-4-烯基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸盐)相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以10重量％或更低的量存在于通过硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇而产生的组合物中，诸如9重量％或更低，诸如8重量％或更低，诸如7重量％或更低，诸如6重量％或更低，诸如5重量％或更低，诸如4重量％或更低，诸如3重量％或更低，诸如2重量％或更低，诸如1重量％或更低，诸如0.5重量％或更低，诸如0.1重量％或更低，诸如0.01重量％或更低，诸如0.001重量％或更低，且包括这样的情况：硫酸化的链甾醇相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以0.001重量％或更低的量存在于通过硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇而产生的组合物中，并且范围可以为从0.1重量％至10重量％，诸如0.2重量％至5重量％或0.3重量％至3重量％。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的硫酸化的链甾醇的重量比是10:1或更多，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的硫酸化的链甾醇的重量比是109:1或更多。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的硫酸化的链甾醇的重量比范围为从10:1至109:1，诸如从100:1至108:1，诸如从1000:1至107:1，且包括从10000:1至106:1。
本公开内容的方面也包括具有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和硫酸化的链甾醇的组合物，所述硫酸化的链甾醇相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以10重量％或更低的量存在于所述组合物中，诸如9重量％或更低，诸如8重量％或更低，诸如7重量％或更低，诸如6重量％或更低，诸如5重量％或更低，诸如4重量％或更低，诸如3重量％或更低，诸如2重量％或更低，诸如1重量％或更低，诸如0.5重量％或更低，诸如0.1重量％或更低，诸如0.01重量％或更低，诸如0.001重量％或更低，且包括相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐为0.001％w/w或更低，并且范围可以为从10重量％至0.001重量％，诸如10重量％至0.1重量％，10重量％至1重量％，10重量％至2重量％，8重量％至0.001重量％，8重量％至0.1重量％，8重量％至1重量％，8重量％至2重量％，6重量％至0.001重量％，6重量％至0.1重量％，6重量％至1重量％，6重量％至2重量％，4重量％至0.001重量％，4重量％至0.1重量％，4重量％至1重量％，4重量％至2重量％，3重量％至0.001重量％，3重量％至0.1重量％，3重量％至1重量％，2重量％至0.001重量％，2重量％至0.1重量％，或2重量％至1重量％。
在某些情况下，组合物包括10:1或更多的重量比的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和硫酸化的链甾醇，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：所述组合物中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与硫酸化的链甾醇的重量比是109:1或更多。在某些情况下，组合物包括在从10:1至109:1范围内的重量比的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和硫酸化的链甾醇，诸如从100:1至108:1，诸如从1000:1至107:1，且包括从10000:1至106:1。
在某些情况下，存在于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐组合物中的硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的副产物是热降解产物。在某些情况下，在通过液相色谱法(例如，HPLC)分离25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐组合物的组分时，通过相对保留时间鉴定所述副产物。在某些情况下，所述副产物是硫酸化的链甾醇，当通过具有C8固定相的运行在约45℃的HPLC分离25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐组合物的组分并用包含缓冲液(例如，磷酸钠的水性缓冲液)的第一流动相和包含一种或多种有机溶剂(参见例如，下面表13和14)的第二流动相分离组合物的组分时，该化合物具有约18.3分钟的保留时间。在某些情况下，所述第一流动相是水性缓冲液。在某些情况下，所述第一流动相包括磷酸钠。在某些情况下，所述第二流动相选自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中的一种或多种。在某些情况下，所述第一流动相的流速是约1.0mL/分钟。在某些情况下，所述第二流动相的流速是约1.0mL/分钟或更大。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在相同HPLC条件下具有约7.7分钟的保留时间。在某些情况下，当通过具有C8固定相的运行在约45℃的HPLC分离25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐组合物的组分并用包含缓冲液(例如，磷酸钠的水性缓冲液)的第一流动相和包含一种或多种有机溶剂(参见例如，下面表13和14)的第二流动相分离组合物的组分时，所述副产物是具有约37.7分钟的保留时间的化合物。尽管不希望受理论约束，据信，具有约37.7分钟的保留时间的化合物是链甾醇。在某些情况下，所述第一流动相是水性缓冲液。在某些情况下，所述第一流动相包括磷酸钠。在某些情况下，所述第二流动相选自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中的一种或多种。在某些情况下，所述第一流动相的流速是约1.0mL/分钟。在某些情况下，所述第二流动相的流速是约1.0mL/分钟或更大。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在相同HPLC条件下具有约7.7分钟的保留时间，使得硫酸化的链甾醇具有约2.4(＝18.3/7.7)的相对保留时间，且被视作链甾醇的化合物具有约4.9(＝37.7/7.7)的相对保留时间。
本公开内容的方面也包括具有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的一种或多种副产物的组合物。在某些情况下，所述一种或多种副产物相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐以10重量％或更低的量存在于所述组合物中，诸如9重量％或更低，诸如8重量％或更低，诸如7重量％或更低，诸如6重量％或更低，诸如5重量％或更低，诸如4重量％或更低，诸如3重量％或更低，诸如2重量％或更低，诸如1重量％或更低，诸如0.5重量％或更低，诸如0.1重量％或更低，诸如0.01重量％或更低，诸如0.001重量％或更低，且包括0.001重量％或更低，并且范围可以为从0.1重量％至5重量％，诸如0.2重量％至10重量％或0.3重量％至15重量％。在某些情况下，组合物包括25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐和一种或多种副产物，所述副产物相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐的量的范围为从0.0001重量％至10重量％，诸如从0.005重量％至9.5重量％，诸如从0.001％至9.0重量％，诸如从0.05重量％至8.5重量％，诸如从0.1重量％至8.0重量％，诸如从0.5重量％至7.5重量％，诸如从1重量％至7重量％，诸如从1.5重量％至6.5重量％，且包括从2重量％至6重量％。
在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的一种或多种副产物的重量比是10:1或更多，诸如25:1或更多，诸如50:1或更多，诸如100:1或更多，诸如250:1或更多，诸如500:1或更多，诸如1000:1或更多，诸如2500:1或更多，诸如5000:1或更多，诸如10,000:1或更多，诸如25,000:1或更多，诸如50,000:1或更多，诸如100,000:1或更多，诸如106:1或更多，诸如107:1或更多，诸如108:1或更多，且包括这样的情况：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的一种或多种副产物的重量比是109:1或更多。在某些情况下，25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与形成的一种或多种副产物的重量比的范围为从10:1至109:1，诸如从100:1至108:1，诸如从1000:1至107:1，且包括从10000:1至106:1。
在某些情况下，所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐是25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐(方案IA2)。
方案IA2
在某些情况下，使硫酸化试剂在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前与酸酐接触。在某些情况下，所述酸酐选自乙酸酐、三氟乙酸酐和三氟甲基磺酸酐。酸酐相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的量可以变化，且可以是0.001当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量、0.1当量至8当量、0.1当量至5当量、0.5当量至10当量、0.5当量至8当量、0.5当量至5当量、0.9当量至10当量、0.9当量至8当量、0.9当量至5当量、1.3当量至10当量、1.3当量至8当量、1.3当量至5当量、1.5当量至10当量、1.5当量至8当量、1.5当量至5当量、2当量至10当量、2当量至8当量、2当量至5当量、0.1当量至1.5当量、0.5当量至1.1当量或0.1当量至1当量。
在某些情况下，方法包括在产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以后淬灭(即，灭活)未反应的硫酸化试剂。在某些情况下，淬灭硫酸化试剂包括将水加入反应混合物。相对于与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触的硫酸化试剂的量，加入反应混合物中的水的量可以变化，且可以是1当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，诸如6当量或更多，诸如7当量或更多，诸如8当量或更多，诸如9当量或更多，诸如10当量或更多，诸如15当量或更多，诸如20当量或更多，且包括25当量或更多。
在某些情况下，淬灭未反应的硫酸化试剂的反应性包括将水加入反应混合物，随后加入至少一种碱。在某些情况下，所述至少一种碱是三烷基胺，诸如三甲胺或三乙胺。在某些情况下，所述至少一种碱是2,6-二甲基吡啶。在某些情况下，所述至少一种碱是吡啶。可以在加入水以后1分钟或更久将吡啶加入反应混合物中，诸如5分钟或更久，诸如10分钟或更久，诸如15分钟或更久，诸如30分钟或更久，诸如45分钟或更久，诸如60分钟或更久，诸如90分钟或更久，诸如120分钟或更久，诸如150分钟或更久，诸如180分钟或更久，诸如210分钟或更久，且包括在将水加入反应混合物中以后240分钟或更久。在某些情况下，在加入水以后60分钟，将吡啶加入反应混合物中。相对于硫酸化试剂的量，加入反应混合物中的吡啶的量可以变化，且可以是0.001当量或更多，诸如0.005当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.05当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如1当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，诸如6当量或更多，且包括10当量或更多。
在某些情况下，在缓慢搅拌下淬灭所述反应混合物中未反应的硫酸化试剂。在某些情况下，在缓慢搅拌下淬灭未反应的硫酸化试剂包括以足以维持在反应混合物中的未反应的硫酸化试剂的附聚物的方式搅拌反应混合物。在某些情况下，反应混合物的缓慢搅拌足以使得未反应的硫酸化试剂的附聚物在淬灭过程中使尺寸减小10％或更低，诸如9％或更低，诸如8％或更低，诸如7％或更低，诸如6％或更低，诸如5％或更低，诸如4％或更低，诸如3％或更低，诸如2％或更低，诸如1％或更低，且包括这样的情况：缓慢地搅拌反应混合物，使得未反应的硫酸化试剂的附聚物在淬灭过程中使尺寸减小0.1％或更低。在某些情况下，反应混合物的缓慢搅拌足以使得未反应的硫酸化试剂的附聚物在淬灭过程中保持在反应烧瓶的底部。在某些情况下，反应混合物的缓慢搅拌足以使得几乎没有或根本没有未反应的硫酸化试剂的附聚物存在于搅拌的反应混合物的搅拌涡旋中。
在某些情况下，方法包括在使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触之前纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐具有97％或更大的纯度，诸如98％或更大的纯度，诸如99％或更大的纯度，诸如99.5％或更大的纯度，诸如99.7％或更大的纯度，诸如99.9％或更大的纯度，且包括99.99％或更大的纯度。在某些情况下，纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐具有一种或多种硫酸化副产物(例如，来自硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的副产物)，其中一种或多种副产物相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以5％w/w或更少的量存在，诸如4％w/w或更少，诸如3％w/w或更少，诸如2％w/w或更少，诸如1％w/w或更少，诸如0.9％w/w或更少的量，诸如0.8％w/w或更少，诸如0.7％w/w或更少，诸如0.6％w/w或更少，诸如0.5％w/w或更少，诸如0.4％w/w或更少，诸如0.3％w/w或更少，诸如0.2％w/w或更少，诸如0.1％w/w或更少，诸如0.05％w/w或更少，诸如0.01％w/w或更少，且包括相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以0.001％w/w或更少的量存在。在某些情况下，所述二硫酸化产物(即，5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐)相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以1％w/w或更少的量存在于纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐组合物中，诸如以0.9％w/w或更少的量，诸如0.8％w/w或更少，诸如0.7％w/w或更少，诸如0.6％w/w或更少，诸如0.5％w/w或更少，诸如0.4％w/w或更少，诸如0.3％w/w或更少，诸如0.2％w/w或更少，诸如0.1％w/w或更少，诸如0.05％w/w或更少，诸如0.01％w/w或更少，且包括相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以0.001％w/w或更少的量存在。
在某些情况下，通过液相色谱法纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使用硅胶固定相(例如，硅胶塞柱，≥5质量当量)的液相色谱法。在某些情况下，使用硅胶固定相和包括吡啶的流动相纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，所述流动相包括二氯甲烷、甲醇和吡啶。在某些情况下，所述流动相包括二氯甲烷-甲醇(85:15)和吡啶(1％)的混合物。
在某些情况下，可以合并从固定相收集的一种或多种级分。在某些情况下，可以浓缩合并的级分。在某些情况下，通过蒸馏将合并的级分浓缩。在某些情况下，将合并的级分在真空下浓缩。在某些情况下，通过在真空下蒸馏将合并的级分浓缩。
在某些情况下，使合并的级分与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的一个或多个颗粒(例如，来自先前纯化的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐样品的颗粒)接触。在某些情况下，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒与合并的级分接触足以沉淀合并的级分中的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒与合并的级分接触包括在蒸馏合并的级分的过程中加入所述颗粒。在某些情况下，在蒸馏合并的级分之前，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入合并的级分中。在某些情况下，在蒸馏合并的级分的同时，诸如在开始蒸馏以后1分钟或更久，诸如5分钟或更久，诸如10分钟或更久，诸如15分钟或更久，诸如20分钟或更久，诸如30分钟或更久，诸如40分钟或更久，诸如50分钟或更久，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入合并的级分中，且包括在开始蒸馏合并的级分以后60分钟或更久，将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒加入合并的级分中。在某些情况下，在恒定压强下蒸馏合并的级分，诸如其中压强变化了10％或更低，诸如9％或更低，诸如8％或更低，诸如7％或更低，诸如6％或更低，诸如5％或更低，诸如4％或更低，诸如3％或更低，诸如2％或更低，诸如1％或更低，且包括变化了0.1％或更低。在某些情况下，在蒸馏过程中的压强变化了10inHg或更低，诸如9inHg或更低，诸如8inHg或更低，诸如7inHg或更低，诸如6inHg或更低，诸如5inHg或更低，诸如4inHg或更低，诸如3inHg或更低，诸如2inHg或更低，诸如1inHg或更低，诸如0.5inHg或更低，诸如0.1inHg或更低，诸如0.05inHg或更低，且包括变化了0.01inHg或更低。在某些情况下，在减压下蒸馏合并的级分，其中将压强维持在15inHg至30inHg之间，诸如从17.5inHg至27.5inHg，诸如从20inHg至25inHg，诸如从21inHg至24inHg，且包括维持在从22inHg至23inHg的压强。
在某些情况下，将合并的级分在真空下浓缩，并使浓缩的合并的级分与含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒的组合物接触。在某些情况下，使浓缩的合并的级分与含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒的组合物和至少一种溶剂接触。在某些情况下，所述至少一种溶剂选自四氢呋喃类，诸如2-甲基四氢呋喃。可以使浓缩的合并的级分与含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒的组合物接触0.001分钟或更久的持续时间，诸如0.005分钟或更久，诸如0.01分钟或更久，诸如0.05分钟或更久，诸如0.1分钟或更久，诸如0.5分钟或更久，诸如1分钟或更久，诸如2分钟或更久，诸如3分钟或更久，诸如4分钟或更久，诸如5分钟或更久，诸如10分钟或更久，诸如15分钟或更久，诸如30分钟或更久，诸如45分钟或更久，且包括60分钟或更久。在某些情况下，将合并的级分逐滴加入在2-甲基四氢呋喃中的含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物中。
在某些情况下，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与金属盐接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐(方案IB1)。
方案IB1
在某些情况下，产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种钠盐接触。在某些情况下，所述至少一种钠盐选自醋酸钠、碘化钠、氯化钠、氢氧化钠和甲醇钠。可以在从-10℃至75℃范围内的温度使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与金属盐接触，诸如从-5℃至70℃，诸如从-4℃至65℃，诸如从-3℃至60℃，诸如从-2℃至55℃，诸如从-1℃至50℃，诸如从0℃至45℃，诸如从5℃至40℃，且包括从10℃至35℃。
可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐使用的金属盐的量可以变化，且可以是0.0001当量或更多，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，或2当量至3当量，1当量至100当量，1当量至5当量，1当量至2当量。
在某些情况下，方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与碘化钠接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸钠盐(方案IB2)。
方案IB2
在某些情况下，用于制备25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与三氧化硫-吡啶复合物接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与钠盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐(方案Ib)。
方案Ib
在某些情况下，用于制备25-羟基-3β-胆甾烯-5-烯-3-硫酸盐的方法包括使(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与硫酸化试剂接触以产生第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与有机碱接触以产生第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；在有至少一种表面活性剂存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐；通过脱氧从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐(方案IIa)。
方案IIa
在某些情况下，将胆固醇用硫酸化试剂硫酸化(方案IIA1)。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫复合物、硫酸化合物、磺酸化合物和磺酸盐/酯化合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂是三氧化硫-吡啶复合物。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自三氧化硫二甲基甲酰胺、三氧化硫三乙胺和三氧化硫三甲胺。在某些情况下，所述硫酸化试剂是硫酸和乙酸酐和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸和吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸和2,6-二甲基吡啶。在某些情况下，所述硫酸化试剂选自氯磺酸乙酯。
可以在从0℃至100℃范围内的温度硫酸化胆固醇，诸如从5℃至95℃，诸如从10℃至90℃，诸如从15℃至85℃，诸如从20℃至80℃，诸如从25℃至75℃，且包括从30℃至70℃。可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，且包括从0.7小时至18小时。相对于胆固醇使用的硫酸化试剂的量可以变化且可以是0.0001当量或更多，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，2当量至3当量，1当量至30当量，1当量至5当量，或1当量至2当量。
方案IIA1
在某些情况下，所述第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐是(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐(方案IIA2)。
方案IIA2
在某些情况下，使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(结构IIA)与有机碱接触以产生第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(结构IIB)(方案IIB1)。
方案VB1
在某些情况下，与第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触的有机碱选自氢氧化物碱。在某些情况下，所述氢氧化物碱选自氢氧化四乙基铵、氢氧化四丁基铵、氢氧化四丙基铵和氢氧化四甲基铵。在某些情况下，所述第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐选自四乙基铵阳离子盐、四丁基铵阳离子盐、四丙基铵阳离子盐和四甲基铵阳离子盐。在某些情况下，在从-10℃至75℃范围内的温度使所述有机碱与第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触，诸如从-5℃至70℃，诸如从-4℃至65℃，诸如从-3℃至60℃，诸如从-2℃至55℃，诸如从-1℃至50℃，且包括从0℃至15℃。可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。相对于第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐使用的有机碱的量可以变化，且可以是0.0001当量或更多，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，2当量至3当量，1当量至10当量，1当量至5当量，或1当量至2当量。
在某些情况下，方法包括使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与氢氧化四丁基铵接触以产生(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸四丁基铵阳离子盐(结构IIB1)(方案IIB2)。
方案VB1
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐(结构IIC)(方案IIC1)。
方案IIC1
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与组合物接触，所述组合物具有氧化剂和至少一种表面活性剂。
在某些情况下，所述至少一种表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性离子表面活性剂。非离子型表面活性剂可以选自聚氧乙烯二醇醚(例如，聚氧乙烯二醇辛基苯酚醚)、聚氧乙烯二醇脱水山梨糖醇烷基酯、脱水山梨糖醇烷基酯、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物，以及其它非离子型表面活性剂。阴离子表面活性剂可以选自具有阴离子官能头基的表面活性剂，诸如含有磺酸盐/酯、磷酸盐/酯、硫酸盐/酯或羧酸盐/酯头基的表面活性剂。例如，阴离子表面活性剂可以选自烷基硫酸盐/酯诸如月桂基硫酸铵、磺基琥珀酸二辛酯钠、全氟辛烷磺酸盐、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐、直链烷基苯磺酸盐、烷基-芳基醚磷酸盐、月桂基醚硫酸钠、木素磺酸盐或硬脂酸钠，以及其它阴离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可以选自具有阳离子官能头基的表面活性剂，诸如吡啶鎓或季铵头基。例如，阳离子表面活性剂可以选自鲸蜡基三甲基硫酸氢铵、四丁基硫酸氢铵、鲸蜡基三甲基溴化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵、四丁基溴化鏻、四辛基溴化铵、四辛基碘化铵、苄基三乙基氯化铵、苄基三乙基溴化铵、苄基鲸蜡基二甲基氯化铵或苄基鲸蜡基二甲基溴化铵。两性离子表面活性剂包括阳离子和阴离子中心，诸如磺基甜菜碱(例如，3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)或甜菜碱(例如，椰油酰氨基丙基甜菜碱)。在某些情况下，所述至少一种表面活性剂是Extran实验室肥皂、La Parisienne肥皂或DL-α-生育酚甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(例如，TPGS-750-M-2)。
相对于第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐使用的表面活性剂的量可以变化，其中在某些情况下，使用0.0001当量或更多的表面活性剂，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多的表面活性剂，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，2当量至3当量，0.1当量至5当量，0.15当量至1当量，或0.2当量至0.3当量。
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与氧化剂和至少一种酮接触。
在某些情况下，所述至少一种酮选自四氢噻喃-4-酮1,1-二氧化物和卤代酮。在某些情况下，所述卤代酮选自1,1,1-三氟-2-丁酮、4,4-二氟环己酮、2-2-2-4’-四氟乙酰苯和1,1,1-三氟丙酮。在某些情况下，所述至少一种酮是1,1,1-三氟-2-丁酮。在主题反应中相对于氧化剂使用的酮的量可以变化，并且可以是1当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，诸如6当量或更多，诸如7当量或更多，诸如8当量或更多，诸如9当量或更多，诸如10当量或更多，诸如15当量或更多，诸如20当量或更多，诸如25当量或更多，诸如30当量或更多，诸如35当量或更多，且包括50当量或更多的酮，并且范围可以为从1当量至50当量，诸如1当量至35当量，1当量至25当量，1当量至15当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至5当量，2当量至50当量，2当量至35当量，2当量至25当量，2当量至15当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至5当量，4当量至50当量，4当量至35当量，4当量至25当量，4当量至15当量，4当量至10当量，4当量至8当量，1当量至50当量，2当量至25当量，或5当量至10当量。
在某些情况下，在使用前进一步纯化所述酮。例如，可以在使用前通过蒸馏纯化所述酮。在某些情况下，测试所述酮的反应性(例如，通过1H-NMR测试杂质)，以便确定是否需要纯化。
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括在有至少一种表面活性剂和水存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与氧化剂和至少一种酮接触。存在的水的量可以变化，范围为反应混合物的0.0000001％w/v或更多，诸如0.000001％w/v或更多，诸如0.00001％w/v或更多，诸如0.0001％w/v或更多，诸如0.001％w/v，诸如0.01％w/v或更多，诸如0.1％w/v，诸如0.05％w/v或更多，诸如0.1％w/v或更多，诸如0.5％w/v或更多，诸如1％w/v或更多，诸如5％w/v或更多，诸如10％w/v或更多，诸如15％w/v或更多，且包括反应混合物的25％w/v或更多，并且范围可以为从0.0000001％w/v至25％w/v，诸如0.0000001％w/v至15％w/v，0.0000001％w/v至10％w/v，0.0000001％w/v至5％w/v，0.0000001％w/v至1％w/v，0.001％w/v至25％w/v，0.001％w/v至15％w/v，0.001％w/v至10％w/v，0.001％w/v至5％w/v，0.001％w/v至1％w/v，0.1％w/v至25％w/v，0.1％w/v至15％w/v，0.1％w/v至10％w/v，0.1％w/v至5％w/v，0.1％w/v至1％w/v，1％w/v至25％w/v，1％w/v至15％w/v，1％w/v至10％w/v，1％w/v至5％w/v，0.1％w/v至50％w/v，0.1％w/v至10％w/v，或0.5％w/v至1％w/v。
可以在从-25℃至50℃范围内的温度氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，诸如从-20℃至45℃，诸如从-15℃至40℃，诸如从-10℃至35℃，诸如从-5℃至30℃，诸如从-1℃至25℃，且包括从0℃至15℃。在某些情况下，在从0℃至5℃的温度氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在反应混合物包括一定量的水的情况下，可以在从-10℃至50℃的温度进行反应，诸如从-5℃至45℃，诸如从0℃至40℃，诸如从0℃至35℃，诸如从0℃至30℃，诸如从0℃至25℃，诸如从0℃至20℃，诸如从0℃至15℃，且包括从0℃至10℃。
可以在从5至7.5范围内的pH氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，诸如从5.5至7.0的pH，且包括从5.5至6.5的pH。在某些情况下，在反应混合物含有水的情况下(例如，在双相溶剂系统中)，pH范围为从5.0至6.0，诸如从5.0至5.9的pH，诸如从5.0至5.8的pH，诸如从5.0至5.7的pH，诸如从5.0至5.6的pH，且包括从5.0至5.5的pH。
可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。
在某些情况下，在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与具有过氧单硫酸钾和至少一种酮的组合物原位接触。在某些情况下，方法包括在有至少一种表面活性剂存在下使过氧单硫酸钾与至少一种酮接触以形成单独的氧化反应性混合物，和将所述氧化反应性混合物加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在这些情况下，在使氧化反应性混合物与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触之前，可以在有至少一种表面活性剂存在下使过氧单硫酸钾与至少一种酮接触0.1分钟或更久的持续时间，诸如1分钟或更久，诸如2分钟或更久，诸如3分钟或更久，诸如5分钟或更久，且包括10分钟或更久，且时间范围可以为从2分钟至180分钟，诸如3分钟至120分钟或4分钟至60分钟。在某些情况下，可以在有至少一种表面活性剂存在下使过氧单硫酸钾与至少一种酮接触以形成单独的氧化反应性混合物，并立即使氧化反应性混合物与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触。可以在从-10℃至50℃范围内的温度形成氧化反应性混合物，诸如从-5℃至45℃，诸如从-4℃至40℃，诸如从-3℃至35℃，诸如从-2℃至30℃，诸如从-1℃至25℃，且包括从0℃至15℃。在氧化反应性混合物不立即与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触的情况下，可以将氧化反应性混合物维持在从-10℃至50℃范围内的温度，诸如从-5℃至45℃，诸如从-4℃至40℃，诸如从-3℃至35℃，诸如从-2℃至30℃，诸如从-1℃至25℃，且包括从0℃至15℃。
在某些情况下，方法进一步包括将氧化反应性混合物加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，方法包括将氧化反应性混合物逐滴加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，将氧化反应性混合物以计量的量加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。可以连续地或以预定的时间间隔(例如，每30秒、1分钟、2分钟、3分钟、5分钟或某种其它间隔)加入所述计量的量。在某些情况下，通过受控添加，诸如用机械地或计算机控制的泵，例如，注射泵，将氧化反应性混合物加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，方法包括产生氧化反应性混合物，和将含有第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物加入氧化反应性混合物。在某些情况下，方法包括将第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐逐滴加入氧化反应性混合物。在某些情况下，将第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以计量的量加入氧化反应性混合物。可以连续地或以预定的时间间隔(例如，每30秒、1分钟、2分钟、3分钟、5分钟或某种其它间隔)加入计量的量。在某些情况下，通过受控添加，诸如用机械地或计算机控制的泵，例如，注射泵，将第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐加入氧化反应性混合物。
在某些情况下，氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种氧化物质接触。在某些情况下，所述至少一种氧化物质选自二氧杂环丙烷。在某些情况下，在具有第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物中原位产生二氧杂环丙烷。在某些情况下，单独产生二氧杂环丙烷(例如，在单独的反应容器例如烧瓶中)，并加入具有第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的组合物。
在某些情况下，在有至少一种碱存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在某些情况下，所述至少一种碱选自弱碱。在某些情况下，所述至少一种碱选自碳酸氢钾、碳酸氢钠、苯酚钾、柠檬酸钠缓冲剂、磷酸钠缓冲剂、甲酸钾和乙酸钾。在某些情况下，所述至少一种碱是碳酸氢钾。在某些情况下，可以随时间将至少一种碱加入反应混合物中，诸如以计量的量，其中以预定的时间间隔(例如，每30秒、1分钟、2分钟、3分钟、5分钟或某种其它间隔)加入碱。在某些情况下，所述至少一种碱可以是具有水的组合物，其中存在于所述组合物中的碱可以是组合物的0.0000001％w/v或更多，诸如0.000001％w/v或更多，诸如0.00001％w/v或更多，诸如0.0001％w/v或更多，诸如0.001％w/v或更多，诸如0.01％w/v或更多，诸如0.05％w/v或更多，诸如0.1％w/v或更多，诸如0.5％w/v或更多，诸如1％w/v或更多，诸如5％w/v或更多，诸如10％w/v或更多，诸如15％w/v或更多，且包括组合物的25％w/v或更多，并且范围可以为从0.0000001％w/v至25％w/v，诸如0.0000001％w/v至15％w/v，0.0000001％w/v至10％w/v，0.0000001％w/v至5％w/v，0.0000001％w/v至1％w/v，0.001％w/v至25％w/v，0.001％w/v至15％w/v，0.001％w/v至10％w/v，0.001％w/v至5％w/v，0.001％w/v至1％w/v，0.1％w/v至25％w/v，0.1％w/v至15％w/v，0.1％w/v至10％w/v，0.1％w/v至5％w/v，0.1％w/v至1％w/v，1％w/v至25％w/v，1％w/v至15％w/v，1％w/v至10％w/v，1％w/v至5％w/v，0.1％w/v至20％w/v，0.2％w/v至15％w/v，或0.3％w/v至10％w/v。在某些情况下，所述至少一种碱可以是水性碳酸氢钾组合物。
在某些情况下，如下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐：在有鲸蜡基三甲基硫酸氢铵(CTAHS)存在下与臭氧接触，随后加入三氟丁酮和硫酸氢钾以形成25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐(方案IIC2)。
方案IIC2
在某些情况下，方法包括与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐原位形成氧化物质，诸如在有鲸蜡基三甲基硫酸氢铵(CTAHS)存在下在反应混合物中使过氧单硫酸钾和三氟丁酮与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触。在某些情况下，与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐原位形成氧化物质包括与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐原位形成二氧杂环丙烷。
在某些情况下，方法包括在单独的反应中形成二氧杂环丙烷，和将二氧杂环丙烷加入第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。在这些情况下，可以在有鲸蜡基三甲基硫酸氢铵(CTAHS)存在下使过氧单硫酸钾与三氟丁酮接触0.1分钟或更久的持续时间，然后使反应性组合物与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触，诸如1分钟或更久，诸如2分钟或更久，诸如3分钟或更久，诸如5分钟或更久，且包括10分钟或更久)，且时间范围可以为从0.01分钟至120分钟，诸如0.1分钟至90分钟或0.5分钟至60分钟。在某些情况下，可以在有鲸蜡基三甲基硫酸氢铵(CTAHS)存在下使过氧单硫酸钾与三氟丁酮接触以形成氧化性反应性组合物，其立即与第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐接触。
将25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐脱氧以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(结构IID)(方案IID1)。
方案IID1
在某些情况下，从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括通过使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触进行脱氧。在某些情况下，在有至少一种卤化物和至少一种酸存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触。在某些情况下，所述至少一种卤化物选自碘和金属卤化物。在某些情况下，所述金属卤化物选自碘化钠和碘化锂。在某些情况下，所述至少一种酸选自弱酸。在某些情况下，所述至少一种酸选自乙酸、盐酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、甲酸和甲烷磺酸。
用于将25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐脱氧的试剂的量可以变化，其中在某些情况下，使用相对于25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐而言0.0001当量或更多的试剂，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，2当量至3当量，1当量至20当量，1当量至10当量，或4当量至6当量。
可以将25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐在从-10℃至75℃范围内的温度脱氧，诸如从-5℃至70℃，诸如从-4℃至65℃，诸如从-3℃至60℃，诸如从-2℃至55℃，诸如从-1℃至50℃，且包括从0℃至25℃。可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。
在某些情况下，方法包括在有碘和乙酸存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(方案IID2)。
方案IID2
在某些情况下，使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐(结构IID)与金属盐接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐(结构IIE)(方案IIE1)。
方案IIE1
在某些情况下，产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸金属盐的方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种钠盐接触。在某些情况下，所述至少一种钠盐选自醋酸钠、碘化钠、氯化钠、氢氧化钠和甲醇钠。可以在从-10℃至75℃范围内的温度使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与金属盐接触，诸如从-5℃至70℃，诸如从-4℃至65℃，诸如从-3℃至60℃，诸如从-2℃至55℃，诸如从-1℃至50℃，诸如从0℃至45℃，诸如从5℃至40℃，且包括从10℃至35℃。
可以进行反应持续从0.1小时至72小时的持续时间，诸如从0.2小时至48小时，诸如从0.3小时至24小时，诸如从0.4小时至21小时，诸如从0.5小时至20小时，诸如从0.6小时至19小时，诸如从0.7小时至18小时，诸如从0.8小时至17小时，诸如从0.9小时至16小时，且包括从1小时至15小时。相对于25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐使用的金属盐的量可以变化，且可以是0.0001当量或更多，诸如0.001当量或更多，诸如0.01当量或更多，诸如0.1当量或更多，诸如0.2当量或更多，诸如0.3当量或更多，诸如0.4当量或更多，诸如0.5当量或更多，诸如0.6当量或更多，诸如0.7当量或更多，诸如0.8当量或更多，诸如0.9当量或更多，诸如1当量或更多，诸如1.1当量或更多，诸如1.2当量或更多，诸如1.3当量或更多，诸如1.4当量或更多，诸如1.5当量或更多，诸如1.6当量或更多，诸如1.7当量或更多，诸如1.8当量或更多，诸如1.9当量或更多，诸如2当量或更多，诸如3当量或更多，诸如4当量或更多，诸如5当量或更多，且包括10当量或更多，并且范围可以为从0.001当量至10当量，诸如0.1当量至10当量，0.1当量至8当量，0.1当量至6当量，0.1当量至4当量，0.1当量至3当量，1当量至10当量，1当量至8当量，1当量至6当量，1当量至4当量，1当量至3当量，1.5当量至10当量，1.5当量至8当量，1.5当量至6当量，1.5当量至4当量，1.5当量至3当量，2当量至10当量，2当量至8当量，2当量至6当量，2当量至4当量，2当量至3当量，1当量至20当量，1当量至10当量，或1当量至7当量。
在某些情况下，方法包括使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与碘化钠接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸钠盐(方案IIE2)。
方案IIE2
条款
通过以下非限制性条款中的一条或多条可以进一步描述本公开内容。
条款1.结晶性25HC3S钠。
条款1.结晶性25HC3S钠。
条款2.结晶性25HC3S钠的水合物。
条款3.结晶性25HC3S钠的一水合物。
条款4.结晶性25HC3S钠的二水合物。
条款5.结晶性25HC3S钠的可变水合物。
条款6.结晶性25HC3S钠的形式I。
条款7.条款2-6中的任一条的结晶性水合物，其具有包含在约2.1°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款8.条款1或7的结晶性水合物，其进一步包含在约5.4°2θ、约6.5°2θ、约10.8°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰。
条款9.条款7-8和85-86中的任一条的结晶性水合物，其中当以10℃/min的速率从环境温度加热至130℃时，所述结晶性水合物具有约8％的重量损失。
条款10.条款2-9和条款85-86中的任一条的25HC3S钠的基本上纯的结晶性水合物。
条款11.条款2-10和条款85-86中的任一条的结晶性水合物，其具有约
的晶胞体积。
条款12.条款2-11和条款85-86中的任一条的结晶性水合物，其具有单斜晶胞。
条款13.条款2-12和条款85-86中的任一条的稳定结晶性水合物。
条款14.条款13的稳定结晶性水合物，其中所述稳定结晶性水合物在从约38％至约70％的相对湿度是稳定的。
条款15.结晶性25HC3S钠的形式II。
条款16.条款2或5的结晶性水合物，其中所述含水量不大于约3摩尔的水/摩尔的25HC3S钠。
条款17.条款2或5的结晶性水合物，其中所述含水量是从约2摩尔的水至约3摩尔的水/摩尔的25HC3S钠。
条款18.条款2或5的结晶性水合物，其中所述含水量是从约1摩尔的水至约3摩尔的水/1摩尔的25HC3S钠。
条款19.条款15-18中的任一条的结晶性水合物，其具有包含在约2.3°2θ的峰的x-射线图样。
条款20.条款2或19的结晶性水合物，其进一步包含x-射线图样，该图样包含在约4.5°2θ的一个或多个峰，在约5.0°2θ和约5.1°2θ和在约5.0°2θ至约5.1°2θ之间的峰，在约5.9°2θ和约6.1°2θ和在约5.9°2θ至约6.1°2θ之间的峰，和在约14.8°2θ和约15.1°2θ和在约14.8°2θ至约15.1°2θ之间的峰。
条款21.条款15-20和条款87-88中的任一条的25HC3S钠的基本上纯的结晶性水合物。
条款22.条款15-21和条款87-88中的任一条的稳定结晶性水合物。
条款23.条款22的稳定结晶性水合物，其中所述稳定结晶性水合物在从约21％至约30％范围内的相对湿度是稳定的。
条款24.结晶性25HC3S钠的形式XI。
条款25.条款2和24中的任一条的25HC3S钠的结晶性水合物，其具有包含在约2.6°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款26.条款2或25的结晶性水合物，其具有进一步包含在约3.1°2θ、约3.5°2θ和约14.5°2θ的一个或多个峰的x-射线粉末衍射图样。
条款27.条款24-26中的任一条的25HC3S钠的基本上纯的结晶性水合物。
条款28.条款24-27中的任一条的稳定结晶性水合物。
条款29.无水结晶性25HC3S钠。
条款30.形式XIII结晶性25HC3S钠。
条款31.条款1、29或30的结晶性25HC3S钠，其具有包含在约2.3°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款32.条款1或31的结晶性25HC3S钠，其具有包含在约4.6°2θ、约9.3°2θ、约14.3°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰的x-射线粉末衍射图样。
条款33.条款1、29或30的结晶性25HC3S钠，其中所述晶胞具有约
的体积。
条款34.条款29-33和条款91-92中的任一条的稳定结晶性25HC3S钠。
条款35.条款29-34和条款91-92中的任一条的结晶性25HC3S钠，其中所述结晶性25HC3S在从约0％至约14％RH范围内的相对湿度是稳定的。
条款36.条款29-35和条款91-92中的任一条的结晶性25HC3S钠，其中所述结晶性25HC3S在70℃或更大的温度是稳定的。
条款37.条款29-36和条款91-92中的任一条的结晶性25HC3S钠，其中所述晶胞是单斜的。
条款38.条款30-37和条款91-92中的任一条的基本上纯的结晶性25HC3S钠。
条款39.形式IX结晶性25HC3S钠。
条款40.条款1或39的结晶性25HC3S钠，其具有包含在约4.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款41.条款1或39的结晶性25HC3S钠,进一步包含在约7.9°2θ、约11.2°2θ、约14.1°2θ、约16.1°2θ和约16.6°2θ的一个或多个峰。
条款42.25HC3S钠的液晶。
条款43.25HC3S钠的中间相。
条款44.25HC3S钠的形式V。
条款45.条款1或44的液体结晶性材料，其具有包含在约2.2°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款46.条款1或45的结晶性材料，其进一步包含在约4.4°2θ、约6.6°2θ和约8.8°2θ的一个或多个峰。
条款47.条款42-46和条款89-90中的任一条的基本上纯的结晶性25HC3S钠。
条款48.条款42-46和条款89-90中的任一条的稳定结晶性25HC3S钠。
条款49.条款1或6的结晶性25HC3S钠，其具有与图1基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图11中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款50.条款1或6的结晶性25HC3S钠，其具有与图53基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图11中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款51.条款1或15的结晶性25HC3S钠，其具有与图2基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图24中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款52.条款1或15的结晶性25HC3S钠，其具有与图54基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图24中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款53.条款1或44的结晶性25HC3S钠，其具有与图3基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图28中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款54.条款1或44的结晶性25HC3S钠，其具有与图4基本上相同的x-射线粉末衍射图样和与在图28中所示基本上相同的TGA热分析图中的至少一种。
条款55.条款1或39的结晶性25HC3S钠，其具有与图5基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款56.条款1或24的结晶性25HC3S钠，其具有与图6基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款57.条款1或24的结晶性25HC3S钠，其具有与图7基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款58.条款1或30的结晶性25HC3S钠，其具有与图8基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款59.条款1或35的结晶性25HC3S钠，其具有与图9基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款60.治疗高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症中的一种或多种的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的条款1-59或64中的任一条的25HC3S钠的化合物。
条款61.一种药物组合物，其包含条款1-59、64、68-83和85-96中的任一条的25HC3S钠和至少一种药学上可接受的赋形剂。
条款62.治疗高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症中的一种或多种的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的条款61的25HC3S钠的药物组合物。
条款63.条款60或62的方法，其中与脂肪堆积和炎症有关的病症包含非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
条款64.稳定结晶性25HC3S钠。
条款65.条款60的方法，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的条款1-59、64、68-83和85-96中的任一条的25HC3S钠的化合物。
条款66.条款65的治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的条款61的25HC3S钠的药物组合物。
条款67.一种组合物，其包含形式I 25HC3S钠、形式II 25HC3S钠、形式III 25HC3S钠、形式V 25HC3S钠、形式IX 25HC3S钠、形式XI 25HC3S钠和形式XIII 25HC3S钠中的两种或更多种。
条款68.25HC3S钠的形式I，其具有与图1基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款69.25HC3S钠的形式I，其具有与图53基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款70.25HC3S钠的形式II，其具有与图2基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款71.25HC3S钠的形式II，其具有与图54基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款72.25HC3S钠的形式XI，其具有与图6或图7基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款73.25HC3S钠的形式V，其具有与图3基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款74.25HC3S钠的形式V，其具有与图4基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款75.25HC3S钠的形式XIII，其具有与图8基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款76.25HC3S钠的形式XIII，其具有与图9基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款77.25HC3S钠的形式III，其具有与图35基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款78.25HC3S钠的形式IX，其具有与图5基本上相同的x-射线粉末衍射图样。
条款79.结晶性25HC3S钠的形式III。
条款80.结晶性25HC3S钠的溶剂化物。
条款81.结晶性25HC3S钠的乙醇溶剂化物。
条款82.条款1或79的结晶性溶剂化物，其具有包含在约4.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款83.条款1或82的结晶性材料，其进一步包含在约6.3°2θ、约7.8°2θ和约9.8°2θ的一个或多个峰。
条款84.一种药物组合物，其包含形式I 25HC3S钠、形式II25HC3S钠、形式III25HC3S钠、形式V 25HC3S钠、形式IX 25HC3S钠、形式XI 25HC3S钠和形式XIII 25HC3S钠中的两种或更多种和至少一种药学上可接受的赋形剂。
条款85.结晶性25HC3S钠的形式I，其具有包含在约2.1°2θ、约6.5°2θ和约10.8°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款86.条款85的结晶性25HC3S钠的形式I，其进一步包含在约9.9°2θ、约15.0°2θ和约15.6°2θ的一个或多个峰。
条款87.结晶性25HC3S钠的形式II，其具有包含在约2.3°2θ和约5.0°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款88.条款87的结晶性25HC3S钠的形式II，其进一步包含在约4.5°2θ、约5.9°2θ、约9.1°2θ和约15.1°2θ的一个或多个峰。
条款89.结晶性25HC3S钠的形式V，其具有包含在约2.2°2θ、约6.6°2θ的峰和在约4.0°2θ和约6.0°2θ和在约4.0°2θ至约6.0°2θ之间的单个峰的x-射线粉末衍射图样。
条款90.条款89的结晶性25HC3S钠的形式V，其进一步包含在约8.8°2θ、约9.9°2θ和约14.9°2θ的一个或多个峰。
条款91.结晶性25HC3S钠的形式XIII，其具有包含在约2.3°2θ、约5.4°2θ、约9.3°2θ和约11.6°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款92.条款91的结晶性25HC3S钠的形式XIII，其进一步包含在约4.6°2θ和约15.0°2θ的一个或多个峰。
条款93.结晶性25HC3S钠的形式III，其具有包含在约4.9°2θ和约6.3°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款94.条款93的结晶性25HC3S钠的形式III，其进一步包含在7.8°2θ、约9.8°2θ、约13.3°2θ和约15.5°2θ的一个或多个峰。
条款95.结晶性25HC3S钠的形式IX，其具有包含在约2.2°2θ、约4.9°2θ和约7.9°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款96.条款95的结晶性25HC3S钠的形式IX，其进一步包含在约14.1°2θ、约16.1°2θ和约16.6°2θ的一个或多个峰。
条款97.一种药物组合物，其包含结晶性25HC3S钠或液晶25HC3S钠或二者和至少一种药学上可接受的赋形剂。
条款98.条款97的药物组合物，结晶性25HC3S钠或液晶25HC3S钠包含条款1-59、64、68-83和85-96中的任一条。
条款99.条款97的药物组合物，其中所述结晶性25HC3S钠或液晶25HC3S钠包含25HC3S钠的形式I和25HC3S钠的形式II的混合物。
条款100.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇-3-硫酸金属盐的方法，所述方法包括：在至少一种溶剂中使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与至少一种硫酸化试剂接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
条款101.根据条款100的方法，其中所述至少一种硫酸化试剂是三氧化硫复合物。
条款102.根据条款101的方法，其中所述至少一种硫酸化试剂是三氧化硫-吡啶复合物。
条款103.根据条款100-102中的任一条的方法，其中所述至少一种金属盐是醋酸钠。
条款104.根据条款100-102中的任一条的方法，其中所述至少一种金属盐是碘化钠。
条款105.根据条款100-104中的任一条的方法，其中使至少一种硫酸化试剂在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前与乙酸酐接触。
条款106.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐的方法，所述方法包括：在至少一种溶剂中使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与三氧化硫-吡啶复合物接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与钠盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐。
条款107.根据条款106的方法，其中所述钠盐是醋酸钠。
条款108.根据条款106的方法，其中所述钠盐是碘化钠。
条款109.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐的方法，所述方法包括：使(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与至少一种硫酸化试剂接触以产生第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与有机碱接触以产生第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；在有至少一种表面活性剂存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐；通过脱氧从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
条款110.根据条款109的方法，其中所述至少一种硫酸化试剂是三氧化硫复合物。
条款111.根据条款110的方法，其中所述至少一种硫酸化试剂是三氧化硫-吡啶复合物。
条款112.根据条款109-111中的任一条的方法，其中所述有机碱是氢氧化四乙基铵。
条款113.根据条款109-112中的任一条的方法，其中氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与包含氧化剂的组合物接触。
条款114.根据条款113的方法，其中所述方法包括在有至少一种表面活性剂存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与包含氧化剂和至少一种酮的组合物接触。
条款115.根据条款114的方法，其中所述至少一种酮是1,1,1-三氟-2-丁酮。
条款116.根据条款114-115中的任一条的方法，其中所述包含氧化剂和至少一种酮的组合物进一步包含第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐和至少一种表面活性剂。
条款117.根据条款114-116中的任一条的方法，其中氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括在有至少一种表面活性剂存在下使包含氧化剂和至少一种酮的组合物与包含第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的第二种组合物接触。
条款118.根据条款114-117中的任一条的方法，其中所述方法包含在有至少一种碱存在下使第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与氧化剂接触。
条款119.根据条款118的方法，其中所述至少一种碱是碳酸氢钾。
条款120.根据条款113-119中的任一条的方法，其中所述氧化剂是过氧单硫酸钾。
条款121.根据条款109-120中的任一条的方法，其中所述至少一种表面活性剂是鲸蜡基三甲基硫酸氢铵。
条款122.根据条款109-121中的任一条的方法，其中从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐包括使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触。
条款123.根据条款122的方法，其中所述方法包括在有至少一种卤化物和至少一种酸存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐与锌接触。
条款124.根据条款123的方法，其中所述至少一种酸是乙酸。
条款125.根据条款123-124中的任一条的方法，其中所述至少一种卤化物是碘。
条款126.根据条款109-125中的任一条的方法，其中所述至少一种金属盐是醋酸钠。
条款127.根据条款109-125中的任一条的方法，其中所述至少一种金属盐是碘化钠。
条款128.一种组合物，其包含：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和硫酸化的链甾醇。
条款129.根据条款128的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与硫酸化的链甾醇的重量比是从100:1至10000:1。
条款130.根据条款128的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与硫酸化的链甾醇的重量比是从100:1至1000:1。
条款131.一种组合物，其包含：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐。
条款132.根据条款131的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是从100:1至10000:1。
条款133.根据条款131的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是从100:1至1000:1。
条款134.根据条款133的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是从250:1至500:1。
条款135.一种方法，其包括：在至少一种溶剂中将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和在所述溶剂中沉淀25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐。
条款136.根据条款135的方法，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在至少一种溶剂中具有100mmol/L或更低的溶解度。
条款137.根据条款136的方法，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在至少一种溶剂中具有10mmol/L或更低的溶解度。
条款138.根据条款135-137中的任一条的方法，其中所述至少一种溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲苯、四氢呋喃和甲基四氢呋喃。
条款139.根据条款135-138中的任一条的方法，其中将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化会产生5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐，该盐保持溶解在至少一种溶剂中。
条款140.根据条款139的方法，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与产生的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是从100:1至10000:1。
条款141.根据条款140的方法，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与产生的5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的重量比是从100:1至1000:1。
条款142.根据条款139-141中的任一条的方法，其中5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐在至少一种溶剂中具有高溶解度。
条款143.根据条款142的方法，其中5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐在至少一种溶剂中具有500mmol/L或更大的溶解度。
条款144.一种组合物，其包含：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和来自将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化的副产物，其包含具有约18.3分钟的高压液相色谱法(HPLC)保留时间的第一化合物、具有约37.7分钟的HPLC保留时间的第二化合物或它们的任意组合和具有约7.7分钟的HPLC保留时间的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，其中所述第一化合物、所述第二化合物和所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐能够通过包含C8固定相的HPLC分离，所述HPLC运行在约45℃、使用包含缓冲液的第一流动相和包含一种或多种有机溶剂的第二流动相。
条款145.根据条款144的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与所述副产物的重量比是从100:1至10000:1。
条款146.根据条款144的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与所述副产物的重量比是从100:1至1000:1。
条款147.根据条款144-146中的任一条的组合物，其中所述第一流动相的流速是约1.0mL/分钟
条款148.根据条款144-147中的任一条的组合物，其中所述第二流动相的流速是约1.0mL/分钟。
条款149.根据条款144-148中的任一条的组合物，其中所述第一流动相包含磷酸钠。
条款150.根据条款144-149中的任一条的组合物，其中所述第二流动相选自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中的一种或多种。
条款151.一种组合物，其包含：25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和来自将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化的副产物，其包含硫酸化的链甾醇、具有约37.7分钟的HPLC保留时间的第二化合物或它们的任意组合和具有约7.7分钟的HPLC保留时间的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，其中所述硫酸化的链甾醇、所述第二化合物和所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐能够通过包含C8固定相的HPLC分离，所述HPLC运行在约45℃、使用包含缓冲液的第一流动相和包含一种或多种有机溶剂的第二流动相。
条款152.根据条款151的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与所述副产物的重量比是从100:1至10000:1。
条款153.根据条款151的组合物，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐与所述副产物的重量比是从100:1至1000:1。
条款154.根据条款151-152中的任一条的组合物，其中所述第一流动相的流速是约1.0mL/分钟。
条款155.根据条款151-154中的任一条的组合物，其中所述第二流动相的流速是约1.0mL/分钟。
条款156.根据条款151-155中的任一条的组合物，其中所述第一流动相包含磷酸钠。
条款157.根据条款151-156中的任一条的组合物，其中所述第二流动相选自乙酸甲氧基丙酯、乙腈和甲醇中的一种或多种。
条款158.根据条款151-157中的任一条的组合物，其中所述第二化合物是链甾醇。
条款159.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇-3-硫酸金属盐的方法，所述方法包括：在至少一种溶剂中使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与至少一种硫酸化试剂接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
条款160.根据条款159的方法，其中在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前通过1H-NMR(质子核磁共振)光谱法表征所述硫酸化试剂。
条款161.根据条款160的方法，其中所述方法包含在与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇接触之前通过确定存在于硫酸化试剂中的杂质的量确定所述硫酸化试剂的降解程度。
条款162.根据条款161的方法，其中如下通过质子核磁共振光谱法确定所述硫酸化试剂的降解程度：在指示杂质在所述硫酸化试剂中的存在的化学位移处积分1H-NMR谱中的一个或多个峰。
条款163.根据条款162的方法，其中在至少一种氘代溶剂中进行所述硫酸化试剂的质子核磁共振光谱法。
条款164.根据条款163的方法，其中所述至少一种氘代溶剂是氘代丙酮。
条款165.根据条款164的方法，其中所述至少一种氘代溶剂不是氘代苯、氘代乙腈或氘代氯仿。
条款166.根据条款162-165中的任一条的方法，其中所述方法包括在从9.2ppm至9.3ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰和基于积分的峰计算硫酸化试剂的杂质水平。
条款167.根据条款166的方法，其中所述方法包括在约9.25ppm的化学位移积分质子NMR谱中的一个或多个峰。
条款168.根据条款159-167中的任一条的方法，其中在有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒存在下使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与所述硫酸化试剂接触。
条款169.根据条款168的方法，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒具有0.1mm或更大的平均颗粒宽度。
条款170.根据条款159-169中的任一条的方法，其中所述方法进一步包含淬灭未反应的硫酸化试剂。
条款171.根据条款170的方法，其中淬灭未反应的硫酸化试剂包含使反应混合物与水接触。
条款172.根据条款171的方法，其中使1当量或更多的水与反应混合物接触。
条款173.根据条款171-172中的任一条的方法，其中淬灭未反应的硫酸化试剂包括使反应混合物与水和吡啶接触。
条款174.根据条款173的方法，其中在使反应混合物与水接触后预定的时间段以后使吡啶与反应混合物接触。
条款175.根据条款170-174中的任一条的方法，其中在缓慢搅拌下淬灭未反应的硫酸化试剂的反应性。
条款176.根据条款159-175中的任一条的方法，其中所述方法进一步包括纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。
条款177.根据条款176的方法，其中通过液相色谱法纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐。
条款178.根据条款177的方法，其中通过液相色谱法纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，所述液相色谱法包含硅胶固定相和包含吡啶的流动相。
条款179.根据条款178的方法，其中所述流动相包含二氯甲烷、甲醇和吡啶。
条款180.根据条款178-179中的任一条的方法，其中将从液相色谱法收集的级分合并和通过蒸馏进行浓缩。
条款181.根据条款178-179中的任一条的方法，其中将从液相色谱法收集的级分合并和在真空下浓缩。
条款182.根据条款180-181中的任一条的方法，其中使浓缩的级分与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的一个或多个颗粒接触。
条款183.根据条款182的方法，其中在蒸馏合并的级分的过程中接触25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒。
条款184.根据条款182的方法，其中所述方法包括：
在真空下浓缩合并的级分；和
使浓缩的级分与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的颗粒和至少一种溶剂接触。
条款185.根据条款184的方法，其中所述至少一种溶剂选自2-甲基四氢呋喃、庚烷或它们的组合。
条款186.根据条款184-185中的任一条的方法，其中所述至少一种溶剂是2-甲基四氢呋喃。
条款187.条款2的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在小于约2.8°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款188.条款187的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约2.1°2θ至约2.6°2θ之间的峰的衍射图样。
条款189.条款188的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约2.1°2θ至约2.3°2θ之间的峰的衍射图样。
条款190.条款2、187或188中的任一条的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约4.3°2θ至约4.6°2θ之间的峰的x-粉末衍射图样。
条款191.条款2、187、188、189或190中的任一条的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约5.0°2θ至约5.5°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款192.条款2、187-191中的任一条的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约8.6°2θ至约9.1°2θ之间的峰的x-射线衍射图样。
条款193.条款2、187-192中的任一条的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约15.0°2θ至约15.3°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款194.条款2或188中的任一条的结晶性25HC3S钠的水合物，其具有包含在约9.9°2θ至约10.0°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款195.条款29、30或39中的任一条的无水结晶性25HC3S钠，其具有包含在约4.5°2θ至约4.8°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款196.条款29、30、39或195中的任一条的无水结晶性25HC3S钠，其具有包含在约9.8°2θ至约9.9°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款197.条款29、30、39、195或196中的任一条的无水结晶性25HC3S钠，其具有包含在约14.1°2θ至约14.3°2θ之间的峰的x-射线粉末衍射图样。
条款198.条款29、30、39、195、197或197中的任一条的无水结晶性25HC3S钠，其具有包含在约16.1°2θ的峰的x-射线粉末衍射图样。
实验部分
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，它们不旨在限制发明人视为他们的发明的范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已经做出努力来确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但是应当考虑一些实验误差和偏差。
实施例1-19与根据表1和实施例20、21、22、24、25、26、27、28、29、31、32、34、35、37和38制备的样品相关。按书写制备实施例23、30、33、36和39；根据实施例40收集XRPD图样，并且在这些实施例的公开内容中没有报告其它分析数据。
实施例1-在筛选中使用的25HC3S钠的分析
将大约10克25HC3S钠用于筛选。X-射线粉末衍射分析将所述材料鉴定为水合物(形式I和形式II)的物理混合物。溶液1H-NMR谱与化学结构一致(参见图34作为25HC3S的1H-NMR结构的一个例子)。通过卡尔·费歇尔滴定，混合物含有6.1重量％的水。这对应于大约1.8mol/mol的水。DVS等温线表明所述材料具有吸湿性。所述混合物在5-25％RH(1.5mol/mol水)增加了大约5重量％，在25-85％RH(1.8mol/mol水)增加了6重量％，并在85-95％RH增加了另外6重量％。回收所述材料并通过x-射线粉末衍射鉴定主要为形式I，在8.8°(2θ)附近有一个额外峰。所述峰被认为是由于形式V。
TGA提供了在高达128℃下的5.4％重量损失，这与DSC中的广泛脱水吸热同时发生。DSC曲线还显示在167℃和184℃附近的吸热。这些事件与分解有关。热台显微术与58℃至112℃之间的脱水一致，随后在163℃附近分解。
将混合物短暂暴露于130℃会产生形式I、II和XIII的混合物。此外，与形式II相关的峰发生偏移。向75％RH暴露10天导致通过x-射线粉末衍射确定主要为形式I和在4.4°2θ和8.8°2θ附近的两个额外峰，并且所述两个峰被认为是由于形式V。
实施例2–一般筛选方法
使用溶剂或溶剂混合物的方法包括冷却溶液、蒸发、添加抗溶剂和悬浮(浆)。这些方法的变化可以包括溶剂、溶剂混合物、抗溶剂、温度、冷却速度、浓度、添加速度和混合顺序的变化，仅举几种可能性。通过偏振光显微术观察和/或通过x-射线粉末衍射分析产生的固体。
具体的筛选方法在实施例3-7中给出。方法和结果总结在例如表1和本公开内容的附图中。
实施例3-添加抗溶剂
使溶液与抗溶剂接触。添加这些抗溶剂添加剂有助于降低溶剂系统的溶解度并诱导结晶。
实施例4-冷却和缓慢冷却
在选定的溶剂或溶剂/抗溶剂系统中制备溶液。将这些溶液在冰箱中冷却至室温以下保持不同的时间长度以试图诱导成核。记录固体的存在或不存在。在观察到足以分析的量的固体后，进行材料的分离。如果存在的量不足，则在冰箱中进行进一步冷却。分离样品以进行湿分析或作为干粉末进行分析。
实施例5-快速蒸发
在选定的溶剂中制备溶液并在等分试样添加之间搅拌以帮助溶解。如通过目视观察所判断，一旦混合物达到完全溶解，就将溶液通过0.2-μm尼龙过滤器过滤，并在环境条件下在未加盖的小瓶中或在环境温度下在氮气下蒸发。分离形成的固体用于评价。
实施例6–缓慢蒸发
在选定的溶剂中制备溶液并在等分试样添加之间搅拌以帮助溶解。如通过目视观察所判断，一旦混合物达到完全溶解，就将溶液通过0.2-μm尼龙过滤器过滤到样品瓶中。用箔覆盖瓶开口并刺穿3次，并在环境条件下使其蒸发。分离形成的固体用于评价。
实施例7-浆
通过将足够的固体添加到给定的溶剂中使得存在过量的固体，制备溶液。然后在环境温度或升高的温度在密封的小瓶中搅拌混合物。在给定量的时间后，分离固体用于分析。
实施例8-示差扫描量热法(DSC)
使用Mettler-Toledo DSC3+示差扫描量热仪进行示差扫描量热法分析。使用辛烷、水杨酸苯酯、铟、锡和锌进行温度校准。将样品放入气密密封的或开口的铝制DSC盘中，并记录重量。将配置为样品盘的称重铝盘放置在晶胞的参考侧。从-30至250℃以10℃/min的升温速率分析样品。虽然通过参考温度(x轴)绘制热分析图，但根据样品温度报告结果。
实施例9-动态蒸汽吸附/解吸(DVS)
在VTI SGA-100Vapor Sorption Analyzer上收集水分吸附/解吸数据。NaCl和PVP用作校准标准。在分析前未干燥样品。在氮气吹扫下以10％RH增量在从5％至95％RH范围内收集吸附和解吸数据。用于分析的平衡标准是在5分钟内重量变化小于0.0100％，最大平衡时间为3小时。未针对样品的最初含水量校正数据。
实施例10-热台显微术
使用安装在配有SPOT InsightTM彩色数码相机的Leica DM LP显微镜上的Linkam热台(FTIR 600)进行热台显微术。使用USP熔点标准进行温度校准。将样品放在盖玻片上，纯净地(neat)或用矿物油制备，并将第二个盖玻片放在样品的顶部。随着台被加热，使用具有正交偏振器和一阶红色补偿器的10x 0.22或20x 0.40数值孔径物镜目视观察每个样品。使用SPOT软件(v.4.5.9)捕获图像。
实施例11-卡尔·费歇尔
使用Mettler Toledo DL39 KF滴定计进行用于水测定的库仑测定卡尔·费歇尔(KF)分析。分析了NIST可溯源的水标准(Hydranal Water Standard 1.0)以检查库仑计的运行。在样品分析之前进行空白滴定。在环境条件下制备样品，其中将称重量的样品溶解在预先干燥的小瓶中的大约1mL Hydranal-Coulomat AD中。将整个溶液穿过隔膜加入到KF库仑计中并混合10秒。然后借助于发生器电极滴定样品，所述电极通过电化学氧化产生碘：2I-→I2+2e-。获得两次重复以确保重现性。
实施例12-偏振光显微术
使用Motic SMZ-168进行偏振光显微术。使用10倍物镜在0.75至5.0倍的放大倍率使用正交偏振器观察每个样品。
实施例13-1H NMR光谱法
在Spectral Data Solutions获得溶液1H NMR谱。
实施例14-热重量分析(TGA)
使用Mettler Toledo TGA/DSC3+分析仪进行热重量分析。使用水杨酸苯酯、铟、锡和锌进行温度校准。将样品置于铝盘中。将开口盘插入TG炉中。将炉在氮气下加热。以10℃/min的速度将每个样品从环境温度加热到350℃。虽然通过参考温度(x轴)绘制热分析图，但根据样品温度报告结果。
实施例15-X-射线粉末衍射(XRPD)
以透射或反射模式收集XRPD图样(也称为衍射图)
实施例16-透射
使用用长细聚焦源产生的Cu辐射的入射束，用PANalytical X'Pert PRO MPD或PANalytical Empyrean衍射仪收集X-射线粉末衍射图样。将椭圆渐变多层镜用于将Cu Kαx-射线聚焦穿过样本并到检测器上。在分析之前，对硅样本(NIST SRM 640e)进行分析以验证观察到的Si 111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本夹在3-μm厚的薄膜之间，并在透射几何中进行分析。使用光束停止、短抗散射延伸和抗散射刀刃来使空气产生的背景最小化。将入射光束和衍射光束的Soller狭缝用于最大限度地减少轴向发散引起的展宽和不对称。使用距离样本240mm的扫描位置敏感检测器(X'Celerator)和Data Collector软件v.2.2b或5.5收集衍射图样。无论使用何种仪器，所有图像均使用标记为X'Pert PROMPD的仪器产生。
实施例17-反射
使用用长细聚焦源和镍滤光片产生的Cu Kα辐射的入射束，用PANalytical X'Pert PRO MPD衍射仪收集X-射线粉末衍射图样。使用对称Bragg-Brentano几何配置衍射仪。在分析之前，对硅样本(NIST SRM 640e)进行分析以验证观察到的Si 111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本装入孔中。将抗散射狭缝用于使空气产生的背景最小化。将入射光束和衍射光束的Soller狭缝用于使轴向发散引起的展宽最小化。使用距离样品240mm的扫描位置敏感检测器(X'Celerator)和Data Collector软件v.2.2b收集衍射图样。
实施例18-可变湿度(VH-XRPD)
使用用长细聚焦源和镍滤光片产生的Cu Kα辐射的入射束，用PANalytical X’Pert PRO MPD衍射仪收集X-射线粉末衍射图样。使用对称Bragg-Brentano几何配置衍射仪。使用Data Collector软件v.2.2b收集和分析数据。在分析之前，对硅样本(NIST SRM640e)进行分析以验证观察到的Si 111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本装入镍包被的铜孔中。将抗散射狭缝用于使空气产生的背景最小化。将入射光束和衍射光束的Soller狭缝用于使轴向发散引起的展宽最小化。使用距离样品240mm的扫描位置敏感检测器(X'Celerator)和Data Collector软件v.2.2b收集衍射图样。
将Anton Paar温度-湿度腔室(THC)用于原位收集x-射线粉末衍射图样作为湿度的函数。样本的温度由位于样本架正下方的Peltier热电装置控制，并由位于样本架中的铂-100电阻传感器监测。热电装置由与Data Collector软件接口的Anton Paar TCU 50供电和控制。
湿度由VTI Inc.制造的RH-200产生并由氮气流携带。湿度和温度由位于THC内样本旁边的Rotronic HygroClip传感器监测。
实施例19-可变温度(VT-XRPD)
使用用长细聚焦源和镍滤光片产生的Cu Kα辐射的入射束，用PANalytical X’Pert PRO MPD衍射仪收集X-射线粉末衍射图样。使用对称Bragg-Brentano几何配置衍射仪。使用Data Collector软件v.2.2b收集和分析数据。在分析之前，对硅样本(NIST SRM640e)进行分析以验证观察到的Si 111峰的位置与NIST认证的位置一致。将样品的样本装入镍包被的铜孔中。将抗散射狭缝用于使空气散射产生的背景最小化。将入射光束和衍射光束的Soller狭缝用于使轴向发散引起的展宽最小化。使用距离样品240mm的扫描位置敏感检测器(X'Celerator)收集衍射图样。
将Anton Paar TTK 450台用于原位收集x-射线粉末衍射图样作为温度的函数。使用位于样品架正下方的电阻加热器加热样品，并使用位于样本架中的铂-100电阻传感器监测温度。加热器由与Data Collector软件接口的Anton Paar TCU 100供电和控制。
实施例20-形式I-制品1
将25HC3S钠(164.6mg)和甲醇(2mL)在设定于75℃的热板上加热直到得到澄清溶液。将溶液穿过0.2-μm尼龙过滤器过滤进20mL的二氯甲烷中。这导致凝胶的立即沉淀，将其通过水抽吸的真空过滤进行收获。凝胶在分离后结晶成形式I。图36是该制品的XRPD衍射图。
实施例21-形式I-制品2
用64.5mg的25HC3S钠和1mL的甲苯得到浆。将浆在大约400RPM在室温磁搅拌21天。通过使悬浮的固体沉降和从固体倾析多余的溶液，得到形式I。图37是该制品的XRPD衍射图。
实施例22-形式I-制品3
用41.9mg的25HC3S钠和12mL的丙酮得到浆。将浆在设定于85℃的热板上短暂加热并在大约200RPM磁力搅拌。将浆从热源取下，并加入1mL的水，同时在大约400RPM磁力搅拌。几乎完全溶解后形成絮状悬浮液，然后成核成细树枝状结晶。将浆搅拌4天。通过水抽吸的真空过滤收获形式I并在氮气下干燥大约10分钟。图38是该制品的XRPD衍射图。
实施例23-形式I-制品4
通过执行以下动态蒸汽吸附试验获得形式I：
使用SMS(表面测量系统)DVS Intrinsic测量动态蒸汽吸附(DVS)。DVS试验的参数列于表11。
表11 DVS的参数
从上述DVS试验，发现化合物是吸湿的，并且起始材料在30％RH以下可逆地吸收7.0％水分，且在95％RH吸收8.5％水。图355是该制品的XRPD衍射图。
实施例24-形式I+XIII
用586.6mg的25HC3S钠和10mL的97:03v/v乙腈/水得到浆。将浆在室温在大约250RPM磁搅拌4天。通过水抽吸的真空过滤收获形式I+XIII的混合物，并在氮气下干燥大约30分钟。图39是该混合物的XRPD衍射图。
实施例25-形式XIII-制品1
通过将形式I+XIII的混合物(得自实施例24)在真空下暴露于70℃2天，得到形式XIII。图40是该制品的XRPD衍射图。
实施例26-形式XIII-制品2
将在15％RH分离的形式I+XIII的混合物(得自实施例24)接连地暴露于25％、55％、75％、85％、75％、25％和0％RH。将材料在每种RH条件保持最小1小时，然后进行至下一种条件。一旦暴露于25％RH，混合物转化成形式I，并在55％、75％、85％、75％和25％RH保持形式I。在达到0％RH后，形式I转化成形式I+XIII的混合物。在继续暴露于0％RH的20分钟内，形式I+XIII的混合物转化成形式XIII。图41是该制品的XRPD衍射图。
实施例27-形式II-制品1
用75.4mg的25HC3S钠和20mL的丙酮得到浆。将浆在室温在大约400RPM磁搅拌14天。通过水抽吸的真空过滤收获形式II，并在氮气下短暂干燥。图42是该制品的XRPD衍射图。
实施例28-形式II-制品2
用66.9mg的25HC3S钠和19mL的乙腈得到浆。将浆在室温在大约400RPM磁搅拌14天。通过水抽吸的真空过滤收获形式II，并在氮气下短暂干燥。图43是该制品的XRPD衍射图。
实施例29-形式II-制品3
用75.4mg的25HC3S钠和8mL的乙醇得到浆。将浆穿过0.2-μm尼龙过滤器过滤，得到澄清溶液。将澄清溶液的4-mL等分试样在环境条件蒸发直到固体明显，且剩余大约0.1mL的母液。通过倾析收获形式II。图44是该制品的XRPD衍射图。
实施例30-形式II-制品4
通过添加抗溶剂(二甲基乙酰胺(DMA)溶剂和甲基异丁基酮(MIBK)抗溶剂)得到形式II。抗溶剂方法如下：在DMA中制备起始材料的浓缩原液。搅拌溶液并快速加入MIBK以诱导沉淀。离心和过滤后分离用于XRPD分析的固体产生形式II。图46是该制品的XRPD衍射图。
实施例31-形式III+形式IX
用46.6mg的25HC3S钠和0.5mL的乙醇得到浆。将浆在设定于75℃的热板上短暂加热，导致溶剂的吸收。将形式III+IX的混合物从热源移出并在氮气下干燥大约15分钟。图45是形式III和形式IX的混合物的XRPD衍射图。
实施例32-形式IX-制品1
通过将形式III+IX的混合物(得自实施例31)在真空下暴露于58℃1天而获得形式IX。图5是该制品的XRPD衍射图。
实施例33-形式IX-制品2
将20.3mg的25HC3S钠称量进3-mL瓶。将该3-mL瓶放入装有3-4mL乙醇的20mL瓶中，并密封外瓶。将系统在室温保持12小时，并将分离的固体通过XRPD进行分析。图51是该制品的XRPD衍射图。
实施例34-形式V-制品1
用85.1mg的25HC3S钠和7mL的甲醇得到浑浊悬浮液。将悬浮液穿过0.2-μm尼龙过滤器过滤以提供澄清溶液。通过蒸发溶液直到在环境条件下目测干燥来提供形式V。图47是该制品的XRPD衍射图。
实施例35-形式V-制品2
用70.4mg的25HC3S钠和20mL的水得到浆。将浆在大约400RPM磁搅拌14天。通过水抽吸的真空过滤，收获不透明的凝胶。凝胶在分离后转化为形式V。图48是该制品的XRPD衍射图。
实施例36-形式V-制品3
通过添加抗溶剂(MeOH溶剂和EtOAc抗溶剂)得到形式V。抗溶剂方法如下：在MeOH中制备起始材料的浓缩原液。搅拌溶液并快速加入EtOAC以诱导沉淀。离心和过滤后分离用于XRPD分析的固体产生形式V。图56是该制品的XRPD衍射图。
实施例37-形式XI
用97.5mg的25HC3S钠和20mL的乙醚得到浆。将浆在大约400RPM磁搅拌14天。通过水抽吸的真空过滤收获形式XI并在氮气下干燥。图6和7是该制品的XRPD衍射图。
实施例38-形式III-制品I
用97mg的25HC3S钠和8mL的乙醇得到浑浊悬浮液。将悬浮液在环境温度沉降约1天。将悬浮液离心，并通过倾析收获湿固体。图49是该制品的XRPD衍射图。
实施例39-形式III-制品2
将25HC3S钠(1.98mg)称量进3-mL玻璃瓶。在室温将EtOH(3mL)加入玻璃瓶以产生悬浮液并加热至50℃。将溶液用0.45-μm PTFE过滤器在50℃过滤，并将滤液收集进干净管形瓶中。将溶液冷却至室温并然后在-20℃储存。通过在14,000RPM离心5分钟分离固体，然后收集并通过XRPD分析。图50是该制品的XRPD衍射。
实施例40-实施例23、30、33、35和36的XRPD分析.
使用Panalytical X’Pert3 Powder XRPD在Si零背景支架上进行XRPD。相对于Panalytical 640Si粉末标准，校准2θ位置。为大多数样品使用4-min方法。使用80-min方法分析喷雾干燥的分散稳定性样品。在实验中使用的XRPD的细节列于下表12中。
表12 XRPD参数
用于制备25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐的一般合成程序
可以通过各种方法制备25HC3S。本文包含制备25HC3S的示例性方法。
所有温度以摄氏度(℃)为单位并且未经校正。试剂级化学品和无水溶剂购自商业来源，且除非另外提及，否则不经进一步纯化地使用。使用在Biovia电子实验室笔记本中所包含的命名软件确定产物名称。在Teledyne Isco仪器上使用预包装的一次性的SiO2固定相柱进行硅胶色谱法，洗脱液流速为15-200mL/min。使用带有DAD检测器(190nm至300nm)的Agilent 1100系列仪器进行分析型HPLC色谱图。用Waters Micromass ZQ检测器在130℃记录质谱图。给质谱仪配备以阳离子模式运行的电喷射离子源(ESI)，并设置为在m/z 150-750之间扫描，扫描时间为0.3秒。如下通过HPLC/MS分析产物和中间体：在Gemini-NX(5μM,2.0x 30mm)上使用5％至100％的MeCN在H2O(0.03％(NH4)2CO3/0.375％NH4OH)中的高pH缓冲液梯度，在1.8mL/min历时2.5min，运行3.5min(B05)，和在EVO C18(5μM,3.0x 50mm)上使用5％至100％的MeCN在H2O(0.1％HCOOH)中的低pH缓冲液梯度，在2.2mL/min历时2.5min，运行3.5min(A05)。在Bruker UltraShield 500MHz/54mm仪器(BZH 43/500/70B,D221/54-3209)上记录1H NMR谱。化学位移是参考溶剂峰，在1H NMR中，对于CDCl3，溶剂峰出现在7.26ppm，对于DMSO-d6溶剂峰出现在2.50ppm，和对于CD3OD溶剂峰出现在3.31ppm。
[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,
4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸钠的合成
给干燥的3-颈烧瓶装入吡啶三氧化硫复合物(12.45g,78mmol)，并将固体悬浮于甲苯(1.5L)和乙酸酐(7.2mL,74.5mmol)中。将混合物在20℃搅拌40min，并加入吡啶(60mL,745mmol)。将混合物在20℃搅拌20min。在单个部分中加入作为固体的(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(30g,74.5mmol)。将混合物在20℃搅拌23h。在剧烈搅拌下历时5min逐滴加入醋酸钠水溶液(10重量％,123mL,149mmol)。将得到的混合物在20℃搅拌1h。将溶剂泵出反应器，将任何固体收集在玻璃料(glass frit)上。加入ACN(700mL)，并将浆剧烈搅拌3h。将浆泵出反应器到相同玻璃料上，并将反应器中的剩余固体再次悬浮于ACN(700mL)中，并搅拌1h，然后将反应器的内容物泵出至玻璃料。将玻璃料中的固体用乙醚(750mL)冲洗，并然后悬浮于DMF(800mL)中。将混合物在20℃搅拌1h。将悬浮液过滤，并收集滤液。在搅拌下向滤液中加入乙醚(3.2L)。将得到的固体通过真空过滤进行收集，并将滤饼用乙醚(1L)冲洗。将固体在减压下干燥以提供作为固体的标题化合物(15g,40％)。1H NMR(500MHz,MeOD)δ5.56-5.32(m,1H),4.17(tt,J＝11.5,4.8Hz,1H),2.55(dd,J＝4.9,2.2Hz,1H),2.47-2.29(m,1H),2.14-2.06(m,2H),2.01(ddd,J＝12.4,7.7,5.1Hz,1H),1.97-1.85(m,2H),1.73-1.22(m,15H),1.20(s,6H),1.19-1.08(m,4H),1.07(s,3H),1.04-0.95(m,1H),1.00(d,J＝6.5Hz,3H),0.76(s,3H)；m/z:ES-[M]-481.3；LCMS(B05)；tR＝1.18m。
[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,
4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸钠的合成
给干燥的3-颈烧瓶装入三氧化硫吡啶复合物(4.74g,29.8mmol)。将固体悬浮于甲苯(500mL)中，并将乙酸酐(2.61mL,27.67mmol)在单个部分中加入。将得到的混合物在23℃搅拌1h。加入吡啶(20mL,248.4mmol)，并将混合物在23℃搅拌5min。在单个部分中加入作为固体的(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(10g,24.83mmol)。将混合物在23℃搅拌23h。将反应物用MeOH(2.01mL,49.7mmol)稀释和在23℃搅拌1h。将悬浮液过滤，并将固体用甲苯(2x 200mL)洗涤。将固体收集和在高真空下干燥以提供固体。将固体部分地溶解在ACN(600mL)中，并加入碘化钠(14.9g,99.3mmol)。将混合物在23℃搅拌10min，然后用冰浴冷却至0℃并搅拌1.5h。将悬浮液过滤，并将固体用冷ACN(2x 275mL)和丙酮(2x200mL)洗涤。将固体收集和在高真空下干燥以提供作为固体的标题化合物(7.24g,57％)。1H NMR(500MHz,MeOD)δ5.56-5.32(m,1H),4.17(tt,J＝11.5,4.8Hz,1H),2.55(dd,J＝4.9,2.2Hz,1H),2.47-2.29(m,1H),2.14-2.06(m,2H),2.01(ddd,J＝12.4,7.7,5.1Hz,1H),1.97-1.85(m,2H),1.73-1.22(m,15H),1.20(s,6H),1.19-1.08(m,4H),1.07(s,3H),1.04-0.95(m,1H),1.00(d,J＝6.5Hz,3H),0.76(s,3H)；m/z:ES-[M]-481.3；LCMS(B05)；tR＝1.18m。
[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,
4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸钠的合成
将15L夹套反应器加热至60℃并用氮气净化1.5h。将夹套温度设定至30℃并装入2-MeTHF(7L)。装入(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(495g,1.23mol)，并将人孔/玻璃器皿用2-MeTHF(6L)冲洗。将溶液冷却至25℃，加入额外的2-MeTHF(1L)，并加入三氧化硫吡啶复合物(234.8g,1.47mol)。将混合物在28℃搅拌24h。加入2-MeTHF(2L)，将混合物搅拌另外16h，冷却至20℃并过滤。将固体用2-MeTHF(3.5L)冲洗。将固体溶解于NaOH(118g,2.95mmol)在MeOH(6L)中的溶液中。将混合物在25℃搅拌1h，并然后在硅藻土塞上过滤。将滤液浓缩至3.5L并用乙醚(8L)稀释。将悬浮液冷却至15℃并过滤以提供作为固体的标题化合物(146.8g,24％)。将滤液浓缩至1L并再次与乙醚(4L)混合。将固体通过真空过滤进行收集以提供作为固体的标题化合物(68.5g,11％)。将硅藻土用MeOH(2L)萃取，将其浓缩至500mL并用乙醚(3L)稀释，并将固体通过真空过滤进行收集以提供作为固体的标题化合物(53.3g,8.6％)。将第四批从滤液分离(11.88g,2％)。总收率：280.5g，45％。1H NMR(500MHz,MeOD)δ5.56-5.32(m,1H),4.17(tt,J＝11.5,4.8Hz,1H),2.55(dd,J＝4.9,2.2Hz,1H),2.47-2.29(m,1H),2.14-2.06(m,2H),2.01(ddd,J＝12.4,7.7,5.1Hz,1H),1.97-1.85(m,2H),1.73-1.22(m,15H),1.20(s,6H),1.19-1.08(m,4H),1.07(s,3H),1.04-0.95(m,1H),1.00(d,J＝6.5Hz,3H),0.76(s,3H)；m/z:ES-[M]-481.3；LCMS(B05)；tR＝1.18m。
[(3S,10R,13R,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,
4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸铵的合成
在0℃将三氧化硫二甲基甲酰胺复合物(42mg,0.273mmol)加入(3S,10R,13R,17R)-17-(5-羟基-1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(100mg,0.25mmol)在无水DCM(20mL)中的搅拌溶液中。将混合物在0℃搅拌5h，并然后将反应物温热至20℃。将混合物在减压下浓缩以提供粗制的固体，将其通过硅胶上的柱色谱法(12g筒)纯化，用DCM和MeOH(0-20％)的混合物洗脱，以提供不纯的标题化合物。m/z:ES-[M-H]-481。
[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,
3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸吡啶-1-鎓的合
成
在烘干的圆底烧瓶中，将三氧化硫吡啶复合物(4.53g,28.5mmol)悬浮于甲苯(240mL)中。加入乙酸酐(2.44mL)，随后加入吡啶(20.8mL)。将反应物在23℃搅拌1h，并在单个部分中加入作为固体的胆固醇(10g,25.9mmol)。将悬浮液在23℃搅拌18h，并在玻璃料上过滤，并将固体用甲苯(100mL)冲洗，随后用己烷类(100mL)冲洗。将固体悬浮于氯仿(400mL)中并在相同玻璃料上过滤。将玻璃料用氯仿(200mL)冲洗并收集滤液。将滤液用己烷类稀释至1.8L并冷藏1h。将悬浮液过滤；将固体用乙醚(100mL)冲洗并在高真空下干燥以提供作为固体的标题化合物(10.06g,71％)。1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.89(dd,J＝6.6,1.4Hz,2H),8.79-8.61(m,1H),8.27-8.05(m,2H),5.38(d,J＝5.3Hz,1H),4.13(tt,J＝11.5,4.7Hz,1H),2.53(ddd,J＝13.3,5.0,2.3Hz,1H),2.43-2.28(m,1H),2.12-2.02(m,2H),2.01-1.94(m,1H),1.94-1.80(m,2H),1.70-0.83(m,20H),1.03(s,3H),0.95(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(dd,J＝6.6,1.9Hz,6H),0.72(s,3H)；m/z:ES-[M]-465.3；LCMS(B05)；tR＝1.40m。
[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,
3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸吡啶-1-鎓的合
成
通过在30℃将三氧化硫吡啶复合物(4.53g,28.5mmol)加入胆固醇(10g,25.9mmol)在2-MeTHF(250mL)中的溶液中并将混合物搅拌16h，制备胆固醇硫酸吡啶鎓盐。然后过滤悬浮液，并将固体用2-MeTHF(50mL)冲洗以提供标题化合物。
[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,
3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸钠的合成
在分子筛上将氯磺酸(0.03mL,0.45mmol)加入2,6-二甲基吡啶(0.08mL,0.69mmol)在丙酮(2.5mL)中的溶液中。将溶液在20℃搅拌2min，然后冷却至0℃。逐滴加入预先经分子筛干燥的胆固醇(100mg,0.26mmol)在丙酮(5mL)中的溶液。将混合物在0℃搅拌2h，然后历时16h温热至20℃。将混合物过滤并将固体收集。然后将固体悬浮于丙酮(10mL)中，并加入碳酸氢钠水溶液直到鼓泡消退。将悬浮液过滤并将固体与MeOH(10mL)和DCM(10mL)一起研磨。在减压下除去溶剂以提供固体。将固体与ACN(30mL)一起研磨，过滤，并将滤液低压冻干以提供作为固体的标题化合物(7.3mg,5.8％)。1HNMR(500MHz,DMSO)δ5.31-5.19(m,1H),4.10(s,1H),3.87-3.78(m,1H),2.42-2.31(m,1H),2.13(dd,J＝14.5,7.6Hz,1H),2.02-1.69(m,5H),1.62-0.95(m,20H),0.94(s,3H),0.89(d,J＝6.5Hz,4H),0.84(dd,J＝6.6,2.5Hz,7H),0.65(s,3H)。
[(3S,5S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-
2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸铵的合成
将三氧化硫吡啶复合物(300mg,1.88mmol)加入胆甾烷醇(300mg,0.772mmol)在吡啶(5.00mL)中的溶液中，并将悬浮液在20℃搅拌16h。将残余物用在DCM中的MeOH(5％NH4OH)通过硅胶色谱法(24g筒)纯化，用DCM和MeOH(0-30％)的混合物洗脱，以提供作为固体的标题化合物(314mg,84％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.08(s,4H),3.97-3.86(m,1H),1.91(dd,J＝12.5,3.5Hz,1H),1.86-1.71(m,2H),1.69-1.55(m,3H),1.55-1.41(m,3H),1.38-1.25(m,5H),1.25-0.90(m,15H),0.88(d,J＝6.6Hz,4H),0.84(dd,J＝6.6,2.4Hz,7H),0.74(s,3H),0.62(s,3H)；m/z:ES[M-NH4]-467.3；HPLC(BEH Ambicarb/ACN5-100％)tR＝7.48min.
[(3R,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,
3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸铵的合成
将三氧化硫吡啶复合物(206mg,1.29mmol)加入(3R,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-1,5-二甲基己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(200mg,0.517mmol)在吡啶(5.00mL)中的溶液中。将悬浮液在20℃搅拌16h，然后在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(24.0g筒)纯化，用DCM和5％的NH4OH在MeOH(0-30％)中的溶液的混合物洗脱，以提供作为固体的标题化合物(160mg,64％)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.07(s,4H),5.18-5.14(m,1H),4.32-4.27(m,1H),2.40-2.29(m,1H),2.16(dt,J＝14.9,2.4Hz,1H),2.01-1.72(m,4H),1.60-0.96(m,22H),0.94(s,3H),0.90(d,J＝6.5Hz,3H),0.84(dd,J＝6.6,2.4Hz,6H),0.65(s,3H)；m/z:ES[M-NH4]-465.6；HPLC(BEH AmForm/ACN 5-100％)tR＝2.76min.
[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二
甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]硫酸吡啶鎓
的合成
将乙酸酐(0.0704mL,0.745mmol)加入三氧化硫吡啶复合物(125mg,0.782mmol)在无水甲苯(15.0mL)中的悬浮液中。将悬浮液在20℃搅拌40min，并加入吡啶(0.600mL)。将悬浮液在20℃搅拌20min。在单个部分中加入作为固体的(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(1R)-5-羟基-1,5-二甲基-己基]-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-醇(300mg,0.745mmol)。将悬浮液在20℃搅拌20h。将混合物在玻璃料上过滤以提供作为固体的标题化合物(329mg,92％纯度,72％收率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.99-8.88(m,2H),8.65-8.53(m,1H),8.13-7.97(m,2H),5.30-5.20(m,1H),3.93-3.71(m,1H),2.41-2.32(m,1H),2.18-2.08(m,1H),2.02-1.71(m,5H),1.59-0.95(m,20H),1.05(s,6H),0.94(s,3H),0.90(d,J＝6.4Hz,3H),0.65(s,3H)；m/z ES+[M+H]+481.32；HPLC(DUR B)tR＝1.36min.
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐(1,作为钠盐)的合成
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐的制备-途径1
将3β,25-二羟基胆甾-5-烯(4.6g,0.011mol)和三乙胺(1.7ml,0.023mol)悬浮于吡啶(57ml)中并加热至50℃。加入三氧化硫三甲胺复合物(3.2g,0.023mol)，并将混合物搅拌24小时。加入另一份三氧化硫三甲胺复合物(0.77g,0.006mol)，并将混合物搅拌另外4小时。用在50℃的夹套，将反应混合物蒸馏至最初体积的-20％。将残余物通过硅胶色谱法(110g)纯化，用乙酸乙酯/甲醇/三乙胺(90/9/1v/v)混合物洗脱；使用磷钼酸染料通过TLC(4:1二氯甲烷:甲醇)分析级分。将含有3-和25-硫酸盐位置异构体的级分组合并蒸发(浴温度<35℃)。将残余物(4.2g,0.0072mol)在乙腈(25g)中制浆，用1N氢氧化钠(7.2ml，从30％氢氧化钠溶液稀释)处理1小时，并然后过滤。将固体用乙腈(25g)彻底冲洗并干燥至恒重(2.77g)。将含有3-和25-硫酸钠盐的混合物(2.77g)的固体与乙醇(27.7g,10S)一起在50℃研磨1小时，并然后在5℃过滤。将分离的固体干燥至恒重(1.2g)。将固体(1.2g)在30℃悬浮于6:1乙腈/水(10S)中30分钟，并然后过滤。过滤需要约40分钟。将固体干燥至恒重(0.86g)并分析。
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐的制备-途径2-过量的硫酸化试剂
使用过量的三氧化硫三甲胺复合物来驱动反应朝向二硫酸盐的形成。3β,25-二羟基胆甾-5-烯的3-羟基基团朝向硫酸化的反应性是25-羟基的约6倍。提供过量的硫酸化试剂并使反应进行到高转化率将提供更高位置异构纯度的单硫酸盐。在该合成过程中观察到该结果。将3β,25-二羟基胆甾-5-烯(4.1g)在吡啶(75ml)中的溶液真空蒸馏以将体积减小至50ml。进行此以除去异丙醇(来自二醇的重结晶)和任何存在的水分。在50℃历时18小时向反应物中加入三乙胺(2当量)，并然后逐份(1.0,0.5和0.25当量)加入共1.75当量的三氧化硫三甲胺复合物，并使反应进行共43小时。将反应混合物通过真空蒸馏进行浓缩，并将残余物吸附到SiO2(10g)上。将负载的SiO2放在SiO2柱上并用2-50％甲醇/乙酸乙酯/1％三乙胺洗脱。将来自柱的适当级分合并和蒸发以产生二硫酸盐(3.1g,39.7％)和单硫酸盐(2.6g,44.7％)。得到的单硫酸盐为3-硫酸盐和25-硫酸盐的22:1混合物。将固体悬浮于乙腈(25g)中，用1N氢氧化钠(4.44mL)处理，并然后过滤。形成稠凝胶，其难以操作且不能过滤。将产物悬浮于乙腈/水中。通过在40℃旋转蒸发而除去溶剂，并将残余物在40℃在真空干燥箱中干燥。将固体与丙酮一起研磨，产生白色固体：1.27g，24.9％。该产物仅显示3β-硫酸化的产物，但是被在RRT 8.18(未知，2.0％)、RRT 15.17(二醇，2.2％)和RRT 16.70(未知，1.8％)的峰污染。
制备规模合成
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐(1,作为钠盐)的合成
给具有顶置式搅拌器的2L三颈圆底烧瓶装入3β,25-二羟基胆甾-5-烯(34)(30g,74.5mmol)和干燥的吡啶(500mL,Sigma-Aldrich,目录号270970-1L，批号SHBC6287V)。一次性加入三氧化硫-三甲胺复合物(12.2g,89.4mmol,Sigma-Aldrich,目录号135879-100G，批号MKBH5585V)。将悬浮液在室温搅拌过夜。将反应混合物浓缩，并将残余物通过柱色谱法纯化以产生25.9g(59％)的作为三乙胺盐的白色固体(HPLC:98.6％纯度)。向三乙胺盐34.1(64g,110.1mmol)在ACN(1L)中的悬浮液中加入1N NaOH(110mL,110.1mmol,NaOH,Fisher,目录号318-3，批号034906)，并将混合物在室温搅拌1h。将固体过滤，用ACN(1L)洗涤，且在真空下干燥(P2O5)过夜,收率：51.5g,93％(HPLC:98.6％纯度)。
过夜搅拌以后，反应物为凝胶状混合物。TLC显示作为主要斑点的预期产物(TLC:20％MeOH在DCM中,Rf＝0.4)，起始材料(Rf>0.9)和3b-25-羟基胆甾醇二硫酸盐(Rf<0.1)作为次要斑点。填充硅胶(1kg,Sorbent Technologies,目录号40930-2.5kg)以形成10cm x42cm尺寸的柱。用在DCM(2.8L)中的1％三乙胺(Et3N,Fisher,目录号04885-4，批号062833)完成柱平衡。将粗残余物溶解在DCM(200mL)和Et3N(20mL)中，将其直接加载到柱中。在该阶段使用三乙胺以避免分解产物和二硫酸盐(其形成烯烃，后者则非常难以从产物除去)。最初洗脱为DCM(1％Et3N)(2L)，随后是1％MeOH在DCM(1％Et3N)中(1L)，2％MeOH在DCM(1％Et3N)中(3L)，5％MeOH在DCM(1％Et3N)(1L)中。产物开始在2％MeOH于CH2Cl2(1％Et3N)中的溶液中洗脱。将收集的级分通过在36℃以下旋转蒸发进行浓缩(如果温度高于45℃，观察到在有MeOH存在下产物的分解)。TLC和NMR检查所选的级分。HPLC(Zorbax SB-18,4.6x150mm,5μm,202nm,流速0.8mL/min):溶剂A:MeOH/5％ACN/7.4mM NH4OAc；溶剂B:H2O/5％ACN/7.4mM NH4OAc。梯度75％A和25％B至100％A。产物：98.6％纯度；1.4％(起始材料34)。HPLC:Durashell C18(Agela Technologies,4.6x50 mm,3mm,
)；溶剂A：MeOH/5％ACN/7.4mM NH4OAc；溶剂B：H2O/5％ACN/7.4mM NH4OAc。产物：98.6％纯度；1.4％(起始材料34)。
大规模合成
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐(1,作为钠盐)的合成
千克规模制备的总结
将3β,25-二羟基胆甾-5-烯(34)(2.6kg)和吡啶(39.2kg)合并，并将混合物在两个50L反应器中在搅拌下加热至40℃。将三氧化硫-三甲胺(1.1kg)加入混合物并在40℃搅拌6-12小时直到反应结束。将混合物在真空蒸馏下浓缩至最小搅拌体积，并然后用二氯甲烷和三乙胺稀释。
将在二氯甲烷中的粗制反应混合物加载到填充了硅胶的2.33ft3不锈钢柱(C-105)上并用二氯甲烷(含有1％甲醇和1％三乙胺)洗脱。将含有不希望产物的级分收集在废圆筒中。将含有期望产物的级分收集，并在反应器中浓缩。
将乙腈、水和氢氧化钠加入含有期望产物的反应器，并将混合物搅拌直到认为反应结束。将得到的浆冷却至10-15℃并过滤以分离化合物1。将分离的化合物1的饼用乙腈洗涤，并然后在40℃在真空下干燥直到达到恒重。
将固体过滤，用乙腈(1L)洗涤，并在真空下干燥(P2O5)过夜，收率：51.5g,93％(HPLC:98.6％纯度)。
讨论
在6小时后通过HPLC分析反应混合物，显示44.1％的剩余起始材料。认为反应结束并在真空下蒸馏至最小搅拌体积(步骤5.3)。向所得稠残余物中加入二氯甲烷和三乙胺，并将溶液转移至干净的5加仑玻璃瓶。将溶液保持过夜后，稠固体沉淀在玻璃瓶中。使用台式过滤器过滤掉固体。将大约1/3的澄清滤液装入C-105柱的顶部。将C-105柱中的硅胶预先用乙酸乙酯和甲醇冲洗，并然后用1％三乙胺在二氯甲烷中的洗脱液平衡。
一旦将粗制溶液加载到柱的顶部，就加入洗脱液以维持约10psi的压强。将洗脱液在每10-15分钟离开柱时取样。吡啶和3β,25-二羟基胆甾-5-烯存在于前两个样品中，但除了吡啶和3β,25-二羟基胆甾-5-烯以外在第三个样品中还检测到了3β-三乙胺盐和25-硫酸盐位置异构体。由于发生的分离极少，所有剩余材料都使用极性洗脱液(1％MeOH、1％NEt3和98％DCM)从柱洗脱。将滤液浓缩并与来自瓶的剩余三分之二粗制溶液合并。在蒸馏后，将粗制溶液转移到干净的瓶中。分析离开柱的洗脱液，且所述洗脱液含有1.7％甲醇(1H NMR面积％)。用洗脱液(在二氯甲烷中的1％三乙胺)平衡柱，并分析甲醇(0.25％甲醇，1H NMR面积％)。在该时间期间，在瓶中固体开始形成。过滤浆，并将滤液收集在干净的瓶中。
将大约三分之一的粗制溶液加载到第二个C-105柱上。向柱中加载洗脱液以维持<5psi。通过薄层色谱法(TLC)分析离开柱的洗脱液，表明分离正在发生。一旦通过TLC不再检测到3β,25-二羟基胆甾-5-烯，则通过1H NMR分析洗脱液以确保3β-三乙胺盐与25-硫酸盐位置异构体分离。从含有洗脱液的圆筒中取出样品，3β-三乙胺盐的纯度为85％，存在15％的25-硫酸盐位置异构体(1H NMR)。HPLC重量百分比测定显示，在圆筒中收集了127g的3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体(85％3β-三乙胺盐)。将纯化的物质放在一边，并将剩余的三分之二粗制溶液通过色谱法纯化。将在C-105柱中的硅胶用甲醇冲洗，并然后用在二氯甲烷中的1％三乙胺平衡(在再生后在洗脱液中0.2％甲醇，通过1H NMR面积％)。
通过1H NMR分析从瓶中沉淀的固体，并鉴定为从二氯甲烷与三乙胺(来自SO3NMe3试剂)和二氯甲烷与三乙胺的反应产生的季铵盐。通过过滤分离二氯甲烷-三乙胺复合物，而在色谱中形成二氯甲烷-三乙胺复合物。盐的形成发生在环境条件下，并且在某些情况下在加压环境中是快速的。建立平衡，其中3β-三乙胺盐的三乙铵部分可以与季铵盐交换以产生季铵复合物和三乙胺盐酸盐。平衡有利于季铵复合物的形成，因为存在更多的二氯甲烷-三乙胺复合物。分离并表征了三乙胺盐酸盐。
在瓶中剩余的三分之二粗制混合物中，对三分之一在第四个柱上进行色谱法。在整个纯化过程中将压强维持在0-1psi。成功地从25-硫酸盐位置异构体中分离出3β-三乙胺盐：通过HPLC，圆筒中3β-三乙胺盐的纯度为99.79％。从柱中分离出大约0.050kg的34.1(HPLC重量％测定)。将硅胶用甲醇清洗并用在二氯甲烷中的1％三乙胺再生。在再生后存在的甲醇量为0.44％(1H NMR面积％)。该柱没有发生分离。没有对来自第四柱的材料进行进一步纯化。对来自第三柱的洗脱液(约50g的3β-三乙胺盐)进行阳离子交换，从溶剂交换到乙腈开始。加入乙腈、水和30％氢氧化钠后，搅拌浆，并然后保持过夜。在搅拌后阶段以后，在反应器中存在固体。将混合物冷却并使用新的8.5”台式过滤器过滤。将滤饼用新鲜乙腈洗涤并干燥。通过1H NMR分析样品，并且在波谱中存在与季铵盐一致的峰。通过HPLC确定25-硫酸盐位置异构体存在。
将来自第二个柱的洗脱液在真空下浓缩并干燥至恒重。通过1HNMR对黄色粉末(540g)的分析显示二氯甲烷-三乙胺季铵盐与单硫酸盐化合物的比率(3:1)。将所有粗制物质(540g)装入3L夹套反应器中。装入乙腈(1400g)，并将浆加热至50±5℃保持30分钟。将浆冷却至26℃，并然后过滤。分析湿饼，并且3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体与季铵盐的比率为约1:1。将纯化的固体和新鲜乙腈(1400g)装回反应器。在45分钟后加入水(200g)，搅拌15分钟，并然后过滤。将颗粒状粉末在真空干燥箱中在40℃干燥过夜。将滤液浓缩至干燥，并将残余物与干燥的材料合并，并将两者装入3L反应器中。将乙腈(1500g)、1N氢氧化钠(600g)和30％氢氧化钠(40g)依次加入反应器中。将浆搅拌48小时，并然后在环境温度过滤。将滤饼干燥至恒重(173g)并通过HPLC分析。
纯化以将25-硫酸盐位置异构体与化合物1分离
探索了几种溶剂以从化合物1中清除25-硫酸钠盐。将不纯的化合物1溶解在极性溶剂中并然后加入抗溶剂(表13中的条目1和2)以后，没有回收到固体。将材料溶解在甲醇中并然后加入乙腈(表13中的条目3)以后，形成最少的固体。使用2-丙醇(表13中的条目4)以及甲醇和水的混合物导致形式变化，这造成材料变成不能转移或过滤的粘稠糊状物。在40-50℃与乙醇一起研磨不纯的化合物1足以清除大部分25-硫酸盐位置异构体(表13中的条目6)。将化合物1(1g)和乙醇(10mL)的混合物加热至回流、冷却并过滤。分离的物质(55％回收率)的纯度为99.6％，其中25-硫酸盐和3β,25-二羟基胆甾-5-烯产物分别降低至0.1％和0.3％。
表13-化合物1的研磨/重结晶
3β-三乙胺盐的纯化
纯化3β-三乙胺盐以消除二氯甲烷，由于其具有与三甲胺和三乙胺的反应性。使用包括90％乙酸乙酯、9％甲醇和1％三乙胺的等度溶剂系统实现纯化。
SO3NMe3当量的优化
确定完全消耗3β,25-二羟基胆甾-5-烯或达到使二硫酸盐和未反应的起始材料副产物最少的点所需的加入的SO3NMe3复合物的量。将含有三乙胺(0.5S)的3β,25-二羟基胆甾-5-烯(0.5g,1.0S)在吡啶(18.6S)中的溶液加热至50℃。每30分钟从反应中取出样品，随后加入SO3NMe3复合物。在最后加入SO3NMe3复合物以后，将瓶在50℃搅拌总共24小时(表14)。大约1.75当量的SO3NMe3复合物足以消耗86.6％的起始材料3β,25-二羟基胆甾-5-烯(样品7,表14)。在加入2.5当量的SO3NMe3复合物后，3β,25-二羟基胆甾-5-烯完全消耗。随着反应进行，二硫酸盐的形成将竞争胜过3β,25-二羟基胆甾-5-烯的单硫酸化。3β-三乙胺盐在24小时后完全转化成二硫酸盐。
表14-三氧化硫-三甲胺复合物的当量
3β-25-羟基胆甾-5-烯硫酸盐(1,作为钠盐)的100克规模合成
将3β,25-二羟基胆甾-5-烯(100g,1.0S)和三乙胺(0.5S)在吡啶(15.6S)中的浆加热至50℃。一次性加入SO3NMe3复合物(1.75当量,0.6S)。将混合物搅拌5小时，并然后通过HPLC分析反应结束(样品1-3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体(67.1％)；3β,25-二羟基胆甾-5-烯(12.2％)；二硫酸盐(20.8％))。将夹套设定至70℃并将反应物浓缩至小于最初体积的20％。取出样品并通过HPLC分析稳定性(样品2-3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体(60.5％)；3β,25-二羟基胆甾-5-烯(10.0％)；二硫酸盐(29.5％))。单硫酸盐的量在蒸馏过程中从67.1％减少到60.5％，而硫酸氢盐的量增加了约9％。3β,25-二羟基胆甾-5-烯的量在蒸馏过程中没有减少很多。
在48小时搅拌后阶段以后在反应器中存在固体，且甲醇(0.5S)的添加没有溶解固体。对粗制物质(300g)通过硅胶色谱法进行纯化，用90％乙酸乙酯、9％甲醇和1％三乙胺洗脱。将硅胶(2.4kg)在洗脱液中制浆，并装填以形成5.25”x 28”柱。将粗制混合物转移至柱，并进行纯化历时3天。将洗脱液以1L级分收集。级分1-7不含通过TLC检测到的物质；级分8-11含有吡啶和3β,25-二羟基胆甾-5-烯；级分12-20不含通过TLC检测到的物质；级分21-22含有未确定的化合物，且级分23-59含有3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体。
在通过重量百分比分析确定柱后，分离出大约82g的3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体(56.5％收率)。在色谱法之后，将含有3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体的混合物的洗脱液浓缩成浆并转移到2升反应器中。将溶剂换成乙腈，将浆冷却至10℃，并历时10分钟加入1N氢氧化钠(1.8S,1当量，基于82g的3β-三乙胺盐/25-硫酸盐位置异构体)。将浆搅拌1小时，并然后过滤。过滤非常快，需要<5分钟。将固体在40℃在真空下干燥至恒重(70g，对于阳离子交换为99％收率)。通过HPLC分析样品(样品1，表15)，其表明25-硫酸盐位置异构体以5.1％存在。将白色粉末(70g)转移到2升反应器中并在50℃用乙醇(700g)制浆1小时。搅拌30分钟后通过浆混合物的增稠观察到形式变化。将浆冷却至10℃，搅拌1小时，并然后在10℃过滤。将反应器用乙醇(170g)冲洗，冷却至10℃，并然后作为饼洗涤物转移至过滤器。将固体干燥至恒重(64.6g,92.3％回收率)并通过HPLC分析(样品2，表15)。在研磨以后，化合物1的纯度提高到97.4％，但25-硫酸盐位置异构体为1.6％。将不纯的化合物1(64.6g,1.0S)在乙醇(581g,9S)中在55℃制浆1.5小时。将浆冷却至10℃，并然后过滤。将反应器和饼在10℃用乙醇(84g)冲洗，并将所得固体在40℃在真空下下干燥至恒重(60.4g，乙醇以5.9％存在，87.9％回收率)。
通过HPLC分析在乙醇研磨后的化合物1的样品(样品3，表15)。净化25-硫酸盐位置异构体，但未知1的量增加到0.9％。在1升反应器中，在30℃将纯化的物质(56.8g)在乙腈(5S)和水(0.9S)中制浆30分钟。在该时间期间，浆形成僵硬(stiff)的峰，但使用FMI泵容易将糊状物转移到过滤装置中。将反应器和饼用新鲜乙腈(30g)冲洗，并将材料干燥至恒重(54.5g,90.2％回收率)。通过1H NMR的分析表明不存在乙醇，但存在1.2重量％的水。最终材料的纯度提高到>99％(样品4，表15)。在RRT 1.68和1.85的未知杂质分别以0.6％和0.2％存在。考虑到残留水，在100g示范运行中化合物1的最终分离产率为43.2％。
表15-粗制化合物1的纯化
从3β,25-二羟基胆甾-5-烯中共沸除去水
将3β,25-二羟基胆甾-5-烯(5g,1.0S)和吡啶(15.6S,0.016％水,条目1,表16)的浆加热至50℃。取出反应样品用于含水量分析(0.29％，条目2，表16)。将反应体积减少50％并取样用于水含量分析(0.042％，条目3，表16)。在馏出液中收集的吡啶量(39g)被反应器中的新鲜吡啶替代，并再次取样用于水分析(0.027％，条目4，表16)。一旦内部温度达到50℃，将三乙胺(0.5S)和SO3NMe3(0.6S)装入反应器。稀薄的白色浆在15分钟内变成澄清溶液，并将反应物在50℃搅拌。在2小时和3小时取出样品用于IPC分析(条目1和2，表17)。在2小时后仅剩下7.1％的3β,25-二羟基胆甾-5-烯。在添加SO3NMe3之前共沸除去水会提高起始材料的消耗。
表16-含水量分析
| 样品 | 注释 | ％水 |
| 1 | 吡啶溶剂 | 0.016 |
| 2 | 在吡啶蒸馏之前的反应溶液 | 0.285 |
| 3 | 在吡啶蒸馏之后的反应溶液 | 0.042 |
| 4 | 添加吡啶之后的反应溶液 | 0.027 |
表17–通过HPLC确定的反应结束特征
粗制化合物1的乙醇研磨
将粗制化合物1悬浮于乙醇中并加热至55℃和搅拌1小时。将浆混合物冷却，过滤并用乙醇洗涤。将得到的饼在50℃干燥过夜。将饼装回反应器并悬浮在乙腈和水中。将混合物加热至30℃并搅拌1小时。然后将混合物冷却至15℃，过滤并用乙腈和水(90:10)洗涤。将所得的饼在50℃干燥不超过24小时，直至达到恒重。通过HPLC确定纯化的化合物1中的杂质含量。(RRT 0.67<0.05％；RRT 0.77<0.05％；RRT 0.79<0.05％；RRT 0.95<0.05％；RRT1.13<0.05％；RRT1.22<0.05％；RRT 1.31<0.05％；RRT 1.95＝0.09％；RRT 2.09<0.05％；RRT 2.67<0.05％；RRT 2.75＝0.05％；RRT 3.04<0.05％；RRT 3.23＝0.09％；RRT 3.64＝0.3％；RRT 5.00<0.05％；总杂质＝1.1％。
来自将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-
3-硫酸盐的副产物的鉴定
将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇的组合物在甲苯中在23℃用三氧化硫吡啶复合物硫酸化1小时以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐。通过高效液相色谱法分析在制备25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐产物时在反应混合物中形成的化合物。表13和14提供了HPLC色谱法条件。表15列出了当用三氧化硫吡啶复合物硫酸化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇时被鉴定为在反应混合物中形成的化合物的保留时间。
表17-色谱条件
表18-色谱条件-梯度
| <u>时间(分钟)</u> | <u>％A</u> | <u>％B</u> |
| 0.0 | 62 | 38 |
| 35 | 0 | 100 |
| 45 | 0 | 100 |
| 45.1 | 62 | 38 |
| 50.0 | 62 | 38 |
表19-保留时间
| <u>化合物</u> | <u>保留时间(min)</u> |
| 吡啶 | 3.2 |
| 25-硫酸化的胆固醇 | 6.6 |
| 25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐 | 7.7 |
| 未知副产物#1 | 18.3 |
| 25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇 | 26.5 |
| 未知副产物#2 | 37.7 |
确定三氧化硫吡啶硫酸化试剂的纯度
对三氧化硫吡啶在氘代溶剂中的样品进行质子核磁共振光谱法(1H-NMR)。三氧化硫吡啶是一种无色固体，其可以由于水分的存在而降解，这可以影响将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化的总收率和再现性。将来自三批(A-C)的三氧化硫吡啶样品溶解在氘代丙酮((CD3)2CO)中，并使用500MHz Bruker波谱仪记录质子NMR谱(图57)。图58A-58C显示了在NMR谱中在8.1和9.3ppm之间的区域的增强。分别与图58B和58C中的批次B和C的NMR谱相比，图58A中批次A的NMR谱表现出在9.25ppm处的更小峰组。基于在每个谱中在9.25ppm处的积分峰，计算出批次A的硫酸化试剂的杂质水平为21％(图58A)，计算出批次B的硫酸化试剂的杂质水平为33％(图58B)，并且计算出批次C的硫酸化试剂的杂质水平为36％(图58C)。
将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化的工艺参数
进行了用于最小化和控制二硫酸化产物5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的形成的硫酸化反应研究。
在反应混合物中用25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇颗粒硫酸化
在硫酸化反应期间，观察到25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐在反应过程中沉淀为凝胶状固体。由于其颗粒尺寸，一些这种胶体材料可以溶解在反应混合物中。为了最小化这种溶解效应，试验了将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的晶种添加到反应物中以改变产物晶体形状。随着通过加入三氧化硫-吡啶复合物进行反应，在硫酸化反应过程中产生的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的凝胶状固体变成具有较大颗粒尺寸的无定形浆。这允许控制生成的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐在反应混合物中的溶解度。这也导致反应混合物中二硫酸化产物5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的形成最小化。
将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇用2-甲基四氢呋喃(30V)溶解；并加热至约35-40℃。将溶液冷却至约20±5℃并加入25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的晶种。将硫酸化试剂三氧化硫-吡啶复合物分四份加入，彼此间隔2小时。向浆中加入水(2当量)并保持1小时。在此时，将搅拌减少到最小涡旋深度。添加在2-甲基四氢呋喃中的吡啶(2当量)，并将浆保持12小时或更长时间。通过过滤收集粗制的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物，并用2-甲基四氢呋喃-吡啶(5％)洗涤。估计粗产物中二硫酸化产物5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的存在量为约2-5％。
未反应的三氧化硫-吡啶硫酸化试剂的淬灭
使用2当量的水和吡啶评价淬灭过量的未反应的三氧化硫吡啶硫酸化试剂以保持碱性条件并避免25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的水解。在表20的项目1-3中，将水和吡啶同时加入并保持1小时；然后，通过真空过滤分离产物。在表20的项目4中，延长保持时间以模拟时间扩展。为了控制试剂水解和二硫酸化之间的竞争反应，通过加入水并保持一小时来评价试剂水解。该方案使过量水解最大化。然后加入吡啶以最小化产物水解(项目5，表20)。如表20中总结的，加入水1小时，然后与吡啶混合过夜，得到25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的最高产率和最低量的二硫酸化产物和链甾醇杂质。
在过量未反应的硫酸化试剂的淬灭期间，确定搅拌速度可以在二硫酸化产物5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐的形成和试剂淬灭之间的竞争中发挥作用。在高搅拌速度下，未淬灭的三氧化硫-吡啶复合物附聚物破裂，从而允许与25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物进一步反应。在缓慢的搅拌速度下，附聚的复合物保留在反应器的底部，使这种副反应最小化。在这些反应条件下观察到在2-5％范围内的二硫酸化产物5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐形成。分离的粗制的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物对于进一步纯化足够稳定。
表20-未反应的三氧化硫-吡啶硫酸化试剂的淬灭
*IPC-过程中控制
25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的液相色谱法和重结晶
采用硅胶(≥质量当量)固定相以及二氯甲烷-甲醇(85:15)和吡啶(1％)流动相的混合物，使用塞柱纯化25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物。用1:2比例直径-硅胶，用硅胶(5质量当量)/DCM-吡啶(1％)制备色谱柱。仔细准备柱以避免扰乱硅胶顶层。将粗制的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物溶解在二氯甲烷-甲醇(1:1)-吡啶(1％)(2.4V)中，将溶液装入柱，并用二氯甲烷-甲醇(15％)-吡啶(1％)(2V)冲洗。用二氯甲烷-甲醇(15％)-吡啶(1％)(约75V)洗脱柱。取约10V的样品并通过薄层色谱法(流动相二氯甲烷-甲醇7:3，一滴吡啶和CAM染料)监测。合并含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的级分，并排除含有二硫酸化产物的级分。
将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物通过两种不同的过程从收集的级分中分离和纯化：
分离和重结晶过程(IP)-A。将来自塞柱的含有产物的级分在恒体积技术下浓缩。将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物溶液添加到2-甲基四氢呋喃-庚烷(1:2)的最初恒定体积(28V)混合物中——在同步蒸馏和添加的同时，添加25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的颗粒种子。将压强维持在20-25inHg之间。在这些条件下，产物立即沉淀出来，并在蒸馏过程中保持为浆状。将浆温度调节至20-25℃并保持至少1小时。通过过滤收集产物，并用2-甲基四氢呋喃-庚烷(1:2)冲洗，然后用庚烷冲洗。将收集的材料在真空下在30-35℃干燥24小时。
分离过程(IP)-B。将来自塞柱的含有产物的级分在真空下浓缩至约7V。如果溶液保持或变浑浊或观察到固体，则加入二氯甲烷直至获得澄清溶液。将该浓缩的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物溶液逐滴加入到含有25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐的种子的2-甲基四氢呋喃-庚烷(1:3)的混合物中约1小时至1.5小时。在容器中用二氯甲烷-甲醇(1:1)(0.5V)在20-25℃冲洗产物1小时。在使浆老化后，通过过滤收集产物并用2-甲基四氢呋喃-庚烷(1:3)冲洗，然后用庚烷冲洗。将固体在真空下在30-35℃干燥24小时。
通过每个分离和重结晶过程获得的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的纯度总结在表21中。
表21-分离和重结晶以后25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐产物的纯度
Claims (21)
1.结晶性25HC3S钠。
2.结晶性25HC3S钠的水合物。
3.结晶性25HC3S钠的形式I。
4.结晶性25HC3S钠的形式II。
5.结晶性25HC3S钠的形式XI。
6.无水结晶性25HC3S钠。
7.形式XIII结晶性25HC3S钠。
8.形式IX结晶性25HC3S钠。
9.治疗高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症中的一种或多种的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的权利要求1-8中的任一项的25HC3S钠的化合物。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中的任一项的25HC3S钠和至少一种药学上可接受的赋形剂。
11.治疗高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及与脂肪堆积和炎症相关的病症中的一种或多种的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的权利要求的10的25HC3S钠的药物组合物。
12.根据权利要求9所述的方法，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的权利要求1-8中的任一项的25HC3S钠的化合物。
13.根据权利要求11所述的方法，其用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性肝炎、急性肾损伤(AKI)、银屑病和动脉粥样硬化，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的权利要求的10的25HC3S钠的药物组合物。
14.一种组合物，其包含形式I 25HC3S钠、形式II 25HC3S钠、形式III 25HC3S钠、形式V25HC3S钠、形式IX 25HC3S钠、形式XI 25HC3S钠和形式XIII 25HC3S钠中的两种或更多种。
15.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇-3-硫酸金属盐的方法，所述方法包括：
在至少一种溶剂中使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与至少一种硫酸化试剂接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和
使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
16.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐的方法，所述方法包括：
在至少一种溶剂中使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与三氧化硫-吡啶复合物接触以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐，其中所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和
使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸吡啶鎓盐与钠盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸钠盐。
17.生产5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐的方法，所述方法包括：
使(3β)-胆甾-5-烯-3-醇与至少一种硫酸化试剂接触以产生第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；
使第一种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与有机碱接触以产生第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；
在有至少一种表面活性剂存在下氧化第二种(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐以产生25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐；
通过脱氧从25-羟基-(3β)-胆甾-(5,6-环氧)-3-硫酸有机阳离子盐产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐；和
使25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸有机阳离子盐与至少一种金属盐接触以产生5-胆甾烯-3β,25-二醇3-硫酸金属盐。
18.一种组合物，其包含：
25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和
硫酸化的链甾醇。
19.一种组合物，其包含：
25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和
5-胆甾烯-3β-25-二醇-二硫酸盐。
20.一种方法，其包括：
在至少一种溶剂中将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化以产生25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，其中25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐在至少一种溶剂中具有低溶解度；和
在所述溶剂中沉淀25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐。
21.一种组合物，其包含：
25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐；和
来自将25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-醇硫酸化的副产物，其包含具有约18.3分钟的高压液相色谱法(HPLC)保留时间的第一化合物、具有约37.7分钟的HPLC保留时间的第二化合物或它们的任意组合和具有约7.7分钟的HPLC保留时间的25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，
其中通过包含C8固定相的HPLC分离所述第一化合物、所述第二化合物和所述25-羟基-(3β)-胆甾-5-烯-3-硫酸盐，所述HPLC运行在约45℃、使用包含缓冲液的第一流动相和包含一种或多种有机溶剂的第二流动相。
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