KR20170030261A - 새로운 만니톨 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만니톨 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법, 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법, 및 이를 이용하여 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 만니톨 기반의 화합물을 이용하면 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이고, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하므로 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 막단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

Description

새로운 만니톨 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용{Novel mannitol-based amphiphiles and uses thereof}
본 발명은 새롭게 개발한 만니톨(mannitol) 기반의 양친매성 화합물, 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화용 조성물, 또는 전자현미경을 이용한 막단백질 구조 분석용 조성물, 상기 화합물의 제조방법, 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법, 상기 화합물을 이용하여 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법에 관한 것이다.
막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 지질 환경으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.
막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 막단백질은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 막단백질 연구에 이용할 수 있는 새로운 양친매성 화합물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화용, 또는 전자현미경을 이용한 막단백질 구조 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기일 수 있고; 그리고
상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.
상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있고, 보다 구체적으로 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성기인 당류 4개를 병렬로 연결하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다. 상기 화합물과 막단백질과의 복합체의 크기가 작으면 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있다 (G. G. Prive, Methods 2007, 41, 388-397).
또한, 상기 R1 및 R2는 소수성기로 작용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 만니톨(mannitol) 링커에 의해 소수성기와 친수성기가 연결되어 있을 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기일 수 있고; 상기 R1 및 R2는 동일할 수 있고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 화합물일 수 있으며, 이를 "MNAs(Mannitol-based amphiphiles)"로 명명하였다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9, 화학식 10 또는 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C7 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-1"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C8 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-2"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 3]
Figure pat00003
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C9 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-3"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 4]
Figure pat00004
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C10 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-4"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 5]
Figure pat00005
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C11 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-5"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 6]
Figure pat00006
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C12 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-6"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 7]
Figure pat00007
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C13 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-7"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure pat00008
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C14 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-8"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 9]
Figure pat00009
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C15 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 10으로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 10]
Figure pat00010
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2가 C16 알킬기이고, 상기 X1 내지 X4가 산소로 연결된 글루코스인 화합물을 "MNA-10"으로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 11]
Figure pat00011
본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질과 복합체를 형성하여 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석할 수 있는 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 존재하여 극성, 비극성 용매에 대해 2가지 성질 모두에 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 물에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수기가 내부로 집합하여 친수성기가 표면에 오는 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 증가한다.
CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 1 × 10-4 mM 내지 0.2 mM일 수 있으며, 구체적으로, 1 × 10-4 mM 이상이고, 0.17 mM 미만일 수 있고, 보다 구체적으로, 1 × 10-4 mM 내지 0.16 mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 170 μM인 것과 비교하여 본 구체예의 MNAs는 DDM과 비슷하거나 그 보다 작은 CMC 값을 가졌다. 따라서, MNAs는 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 유리함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화용, 또는 전자현미경을 이용한 막단백질 구조 분석용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 4.5 nm일 수 있고, 구체적으로, 2.1 nm 내지 4.4 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.
DDM의 경우 3.4 nm의 반지름을 가지는 것과 비교하여, 대부분의 MNAs 경우 그 미셀 크기가 더 작으므로, 이 양친매성 분자가 형성하는 미셀로부터 막단백질들을 더 손쉽게 분리할 수 있음을 확인할 수 있었다.
상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부에 막단백질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막 내부에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하거나, 또는 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화 또는 안정화에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 4)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)에 알킬레이션(alkylation) 반응을 수행하여 두 개의 알킬기를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 p-TSA(Toluene sulfonic acid), CH2Cl2 및 메탄올을 첨가하여 3,4-O-디-알킬-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-D-mannitols)을 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계.
[화학식 1]
Figure pat00012
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기일 수 있고; 그리고
상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기일 수 있고; 상기 R1 및 R2는 동일할 수 있고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9, 화학식 10 또는 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 구체예에서, 보호기가 부착된 만니톨(protected mannitol)을 출발물질로 사용해서 열을 가하지 않는 4단계의 합성단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있다. 이처럼 본 발명의 제조 방법에 의하면 화합물의 합성이 용이하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 도 1에 기재된 합성 스킴에 따라 하기의 단계를 수행하여 MNA-1 내지 MNA-10을 제조하였다:
1) (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)에 알킬 브로마이드(alkyl bromide), DMF 및 NaH를 넣고 알킬레이션(alkylation) 반응을 수행하여 3,4-O-디-알킬-1,2:4,5-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-1,2:4,5-di-O-isopropylidene-D-mannitols) (화합물 A)를 얻는다.
2) 화합물 A에 p-TSA(Toluene sulfonic acid), CH2Cl2 및 메탄올을 첨가하여 3,4-O-디-알킬-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-D-mannitols) (화합물 B)을 얻는다.
3) 화합물 B에 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide), AgOTf, 1,2-디메톡시에탄(dimethoxyethane) 및 CH2Cl2를 첨가하여 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 글루코스가 도입된 화합물 C를 얻는다.
4) 화합물 C에 NaOMe, MeOH를 첨가하고 탈보호기화(de-O-benzoylation) 반응하여 화합물 D(MNAs)를 얻는다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00013
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기일 수 있고; 그리고
상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기일 수 있고; 상기 R1 및 R2는 동일할 수 있고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9, 화학식 10 또는 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬, 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 Bor1 (Boron transporter), LeuT(Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor) 또는 ABC 수송체(transporters), 및 이들의 2이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 하기 1) 내지 3)의 단계를 포함하는 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법을 제공한다:
1) 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계;
2) 상기 화합물에 의해 용해된 막단백질을 염색하는 단계; 및
3) 전자현미경을 이용해 염색된 막단백질을 분석하는 단계:
[화학식 1]
Figure pat00014
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기일 수 있고; 그리고
상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기일 수 있고; 상기 R1 및 R2는 동일할 수 있고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 1)의 화합물은 본 발명의 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9, 화학식 10 또는 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 Bor1 (Boron transporter), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor) 또는 ABC 수송체(transporters), 및 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 1)에 의하여 막단백질-화합물 복합체(protein-detergent complex)가 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 2)의 염색은 막단백질을 전자현미경 분석이 가능하도록 염색하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 양친매성 분자에 의해 용해된 막단백질을 방전된 탄소 코팅된 그리드(glow-discharged carbon-coated grid)로 피펫팅한 후, 우라닐 포름산염(uranyl formate)로 염색하였다(M. Ohi et al., Biol . Proced . Online 2004, 6, 23-34.).
상기 단계 3)의 분석은 전자현미경을 이용하여 막단백질의 구조를 분석하는 것을 의미하며, 공지의 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "전자현미경을 이용한 막단백질의 구조 분석"이란 전자현미경을 사용하여 막단백질의 구조를 확인하고 분석하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체에들에 따른 만니톨 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.
막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이며, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하고 있으므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물이 막단백질과 형성하는 복합체는 크기가 작고, 막단백질의 안정성을 향상시켜 막단백질의 결정화를 통한 높은 해상도의 구조 분석이 가능하고 전자현미경을 통한 막단백질의 형태 분석에 적합하다.
또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 MNAs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예들에 따른 MNAs의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 MNA-1의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 MNA-1의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 MNA-2의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 MNA-2의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 7은 MNA-3의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 8은 MNA-3의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 9는 MNA-4의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 10은 MNA-4의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 11은 MNA-5의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 12는 MNA-5의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 13은 MNA-6의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 14는 MNA-6의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 15는 MNA-7의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 16은 MNA-7의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 17은 MNAs에 의해 형성된 미셀의 크기(D(diameter), nm) 분포도를 나타낸 도이다.
도 18은 CMC + 0.04 wt% 농도로 사용된 MNAs(MNA-4, MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM에 의한 Bor1(Boron transporter) 구조 안정성을 hFSEC(heat fluorescence size exclusion chromatography)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM에 의한 LeuT(Leucine transporter)의 구조 안정성을 SPA(scintillation proximity assay)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다:
(a) MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM를 CMC + 0.04 wt% 농도로 사용하였을 때 [3H]-Leu 결합도(%); 및
(b) MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM를 CMC + 0.2 wt% 농도로 사용하였을 때 [3H]-Leu 결합도(%).
도 20은 Full agonist (이소프레오테레놀 (ISO))의 존재유무, 또는 ISO와 G-단백질의 조합에 따른 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM에 용해된 mBBr-β2AR의 형광스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 21은 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM의 농도를 CMC의 50분의 일로 낮추었을 때 mBBr-β2AR의 형광스펙트럼의 변화를 나타낸 도이다.
도 22는 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM에 용해된 β2AR의 리간드([3H]-DHA) 결합 활성도 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 MNA(MNA-6 또는 MNA-7) 또는 DDM에 의해 형성된 β2AR 단백질-양친매성 분자 복합체 (PDC)의 사이즈를 확인하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 DDM (a), MNA-6 (b), 또는 MNA-7 (c)에 의해 용해된 β2AR 단백질의 전자현미경(electron microscopy; EM) 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 1> MNAs ( Mannitol -based amphiphiles )의 합성 방법
MNAs의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-4>의 합성 방법에 따라 MNAs(Mannitol-based amphiphiles) 10종을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<1-1> 3,4- O -디-알킬-1,2:4,5-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨의 합성을 위한 일반적인 합성 절차 (step a; 화합물 A의 합성)
보호기가 도입된 만니톨(protected mannitol)을 출발물질로 사용하여 화합물 A를 합성하였다.
구체적으로, 무수 DMF에 수소화 나트륨(sodium hydride)이 용해된 차가운 현탁액 (3 equiv.)에 출발물질인 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 첨가하고, 30분 동안 섞어주었다. 그 다음 알킬 브로마이드 (alkyl bromide)(2.2 equiv.)를 첨가하고, 반응 혼합물을 상온에서 4시간 동안 섞어주었다. 반응 후 남아 있는 수소화 나트륨은 메탄올 몇 방울로 제거하고, CH2Cl2로 유기 화합물을 추출하고, 증류수 (3x20mL)로 세척하였다. 수집된 유기층은 무수 Na2SO4 로 건조하고, 회전 농축기를 이용하여 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 실리카 겔에 생산물을 정제하여 순수한 3,4-O-디-알킬-1,2:4,5-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-1,2:4,5-di-O-isopropylidene-D-mannitols) (화합물 A)을 수득하였다.
<1-2> 3,4- O -디-알킬-D-만니톨을 합성하기 위한 일반적인 합성 절차 (step b; A→B)
200mg의 p-TSA가 용해된 메탄올 (25 mL) 및 CH2Cl2 (25 mL)의 1:1 혼합 용액에 상기 실시예 1-1에 의해 합성된 화합물 A를 첨가하고, 상온에서 밤새 섞어주었다. 반응이 완료된 후에, 고체 NaHCO3을 천천히 첨가하여 격렬하게 섞어주어 반응 혼합물을 중화시켰다. 이를 회전 농축기를 이용하여 여과 및 건조하고, 생산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/Hexane)로 정제하여 3,4-O-디-알킬-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-D-mannitols)(화합물 B)를 얻었다.
<1-3> 글리코실레이션 반응( Glycosylation reaction)을 위한 일반적인 합성 절차 (step c; B→C)
글리코실레이션은 P.S.Chae 등의 논문(Nat. Methods 2010, 7. 1003-1008.)에 기재된 방법을 일부 수정하여 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에 의해 합성된 알콜 유도체 화합물 B를 CH2Cl2 (15 mL)에 상온에서 용해시키고, 분자체 4Å (molecular sieves 4Å)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 AgOTf (6.9 equiv.)을 0 ℃에서 첨가하고, CH2Cl2 (2 mL)에 용해된 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) 용액 (6.8 equiv.)을 천천히 첨가하였다. 반응은 15분 동안 0 ℃에서 계속한 다음, 반응 혼합물을 상온에서 온도를 높인 후, 1시간 동안 섞어주었다. 반응이 완료된 후에 (TLC로 반응 완료 확인함), 피리딘을 첨가하여 반응을 종료하고, 혼합물을 CH2Cl2 (20 mL)로 희석한 다음, celite로 여과하였다. 여과액은 1 M Na2S2O3 수용액 (40 mL), 0.1 M HCl 수용액 (40 mL), 및 brine (3 x 40 mL)으로 연속하여 세척하였다. 유기층은 무수 Na2SO4로 건조시키고, 용매는 회전 농축기를 이용하여 제거하였다. 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/hexane)를 이용하여 잔여물을 정제하여 유리 같은(glassy) 고체상태의 화합물 C를 얻었다.
<1-4> Zemplen 조건에서 데-O- 벤조일레이션(De- O -benzoylation)을 위한 일반적인 합성 절차 (step d; C→D)
상기 실시예 1-3에 의해 합성된 O-벤조일화 화합물 C를 소량의 무수 CH2Cl2 에 용해시키고, 침전이 완전히 나타날 때까지 MeOH를 한방울씩 첨가하였다. 필요한 양의 메탄올성 용액 0.5 M NaOMe을 천천히 첨가하여, NaOMe의 최종 농도가 0.05 M이 되도록 하였다. 이 기간동안 메탄올을 규칙적인 간격으로 첨가하여 침전물이 나타나지 않도록 하였다. 반응 혼합물은 6시간 동안 상온에서 섞어준 다음, Amberlite IR-120 (H+ form) resin으로 중화시켰다. resin은 여과로 제거하고, MeOH로 세척하고, 용매는 혼합된 여과물로부터 진공에서 (in vacuo) 제거하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 잔여물을 정제하였다. 추가적인 정제 후에, CH2Cl2/MeOH/diethyl ether를 이용한 재결정화에 의하여 완전히 O-벤조일기가 제거된 생산물(de-O-benzoylated product)인 하얀색 고체의 화합물 D를 얻었다. 이렇게 얻은 화합물 D는 MNAs(Mannitol-based amphiphiles)로 명명하였다.
< 제조예 1> MNA -1의 합성
<1-1> 3,4- O -디-옥틸-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 1)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 옥틸 브로마이드(octyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-옥틸-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-octyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 1)을 90% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett. 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<1-2> 3,4- O -디-옥틸-D-만니톨 (화합물 11)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 1로부터 3,4-O-디-옥틸-D-만니톨 (3,4-O-Di-octyl-D-mannitol)(화합물 11)을 93% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett . 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<1-3> MNA -1a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 11로부터 MNA-1a를 75% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.24-8.21 (m, 4H), 8.12-7.98 (m, 4H), 7.97-7.92 (m, 8H), 7.91-7.89 (m, 6H), 7.87-7.79 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.41-7.35 (m, 32H), 7.34-7.27 (m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.42 (m, 4H), 5.41-5.30 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.01-3.91 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.68 (m, 2H), 1.24-1.12 (m, 20H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.9, 165.8, 165.6, 165.1, 165.0, 164.8, 133.6, 133.4, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 128.9, 128.5, 128.4, 128.3, 101.4, 100.3, 82.4, 73.3, 72.9, 72.8, 72.7, 72.3, 71.8, 71.6, 71.1, 69.9, 69.7, 63.1, 62.9, 32.0, 30.2, 29.6, 29.5, 26.1, 22.8, 14.2.
<1-4> MNA -1의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-1a로부터 보호기가 제거된 MNA-1을 95% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.55-4.53 (m, 2H), 4.31-4.30 (m, 2H), 4.13-4.11 (m, 2H), 4.00-3.97 (m, 4H), 3.79-3.72 (m, 4H), 3.70-3.64 (m, 3H), 3.63-3.56 (m, 10H), 3.30-3.21 (m, 15H), 3.20-3.10 (m, 5H), 1.47-1.43 (m, 4H), 1.21 (m, 20H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.1, 104.7, 82.5, 80.9, 78.2, 78.0, 77.8, 75.6, 75.3, 74.4, 71.6, 71.4, 71.2, 62.8, 62.6, 33.1, 31.4, 30.8, 30.6, 27.4, 23.8, 14.5; HRMS ( EI ): calcd. for C46H86O26[M+Na] + 1054.5407, found 1054.5406. MNA-1의 1H NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 4에 나타내었다.
< 제조예 2> MNA -2의 합성
<2-1> 3,4- O -디-노닐-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 2)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 노닐 브로마이드(nonyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-노닐-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-nonyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-d-mannitol)(화합물 2)을 90% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<2-2> 3,4- O -디-노닐-D-만니톨 (화합물 12)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 2로부터 3,4-O-디-옥틸-d-만니톨 (3,4-O-Di-nonyl-D-mannitol)(화합물 12)을 93% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett . 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<2-3> MNA -2a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 12로부터 MNA-2a를 74% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.23-8.20 (m, 4H), 8.09-8.01 (m, 4H), 8.00-7.97 (m, 8H), 7.90-7.79 (m, 6H), 7.72-7.65 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.40-7.35 (m, 32H), 7.34-7.27 (m, 4H), 5.82-5.74 (m, 2H), 5.61-5.51 (m, 4H), 5.49-5.33 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.09-3.95 (m, 2H), 3.58-3.45 (m, 5H), 3.42-3.34 (m, 2H), 3.29-3.19 (m, 4H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.45-1.12 (m, 24H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.8, 165.3, 165.2, 165.0, 133.8, 133.6, 133.4, 133.2, 130.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 128.6, 128.5, 101.5, 100.4, 82.5, 80.2, 73.4, 73.0, 72.9, 72.8, 72.4, 72.2, 72.0, 71.7, 71.2, 70.0, 69.9, 63.3, 63.1, 32.2, 30.3, 29.9, 29.8, 29.6, 26.3, 22.9.
<2-4> MNA -2의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-2a로부터 보호기가 제거된 MNA-2를 94% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.52-4.51 (m, 2H), 4.29-4.27 (m, 2H), 4.12-4.09 (m, 2H), 3.96-3.94 (m, 4H), 3.80-3.73 (m, 4H), 3.71-3.64 (m, 3H), 3.63-3.53 (m, 10H), 3.27-3.19 (m, 15H), 3.18-3.07 (m, 5H), 1.44-1.39 (m, 4H), 1.19 (m, 24H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.6, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.9, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C48H90O26[M+Na]+ 1082.5720, found 1082.5717. MNA-2의 1H NMR 스펙트럼은 도 5에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 6에 나타내었다.
< 제조예 3> MNA -3의 합성
<3-1> 3,4- O -디-데실-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 3)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 데실 브로마이드(decyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-decyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 3)을 90% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett. 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<3-2> 3,4- O -디-데실-D-만니톨 (화합물 13)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 3으로부터 3,4-O-디-데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-decyl-D-mannitol)(화합물 13)을 92% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett . 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<3-3> MNA -3a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 13으로부터 MNA-3a를 71% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.23-8.20 (m, 4H), 8.12-7.98 (m, 4H), 7.97-7.92 (m, 8H), 7.91-7.89 (m, 6H), 7.87-7.79 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.40-7.35 (m, 32H), 7.34-7.26 (m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.42 (m, 4H), 5.41-5.30 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.01-3.91 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.68 (m, 2H), 1.24-1.12 (m, 28H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 166.0, 165.8, 165.3 165.2, 165.0, 133.8, 133.6, 133.5133.4, 133.2, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 128.6, 128.5, 101.5, 100.4, 82.4, 73.4, 73.0, 72.8, 72.4, 72.0, 71.8, 71.2, 70.0, 69.9, 63.3, 63.1, 32.2, 30.3, 29.9, 29.7, 26.3, 22.9, 14.3.
<3-4> MNA -3의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-3a로부터 보호기가 제거된 MNA-3을 94% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.52-4.51 (m, 2H), 4.29-4.27 (m, 2H), 4.12-4.09 (m, 2H), 3.96-3.94 (m, 4H), 3.80-3.73 (m, 4H), 3.71-3.64 (m, 3H), 3.63-3.53 (m, 10H), 3.27-3.19 (m, 15H), 3.18-3.07 (m, 5H), 1.43-1.38 (m, 4H), 1.19 (m, 28H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.6, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.9, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C50H94O26[M+Na]+ 1110.6033, found 1110.6037. MNA-3의 1H NMR 스펙트럼은 도 7에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 8에 나타내었다.
< 제조예 4> MNA -4의 합성
<4-1> 3,4- O -디-운데실-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 4)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 운데실 브로마이드(undecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-운데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-undecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 4)을 90% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<4-2> 3,4- O -디-운데실-D-만니톨 (화합물 14)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 4로부터 3,4-O-디-운데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-undecyl-D-mannitol)(화합물 14)을 93% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett . 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<4-3> MNA -4a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 14로부터 MNA-4a를 70% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.23-8.20 (m, 4H), 8.09-8.01 (m, 4H), 8.00-7.97 (m, 8H), 7.90-7.79 (m, 6H), 7.72-7.65 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.51 (m, 16H), 7.48-7.35 (m, 32H), 7.33-7.21 (m, 4H), 5.82-5.74 (m, 2H), 5.61-5.51 (m, 4H), 5.49-5.33 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.09-3.95 (m, 2H), 3.58-3.45 (m, 5H), 3.42-3.34 (m, 2H), 3.29-3.19 (m, 4H), 1.83-1.74 (m, 2H), 1.45-1.12 (m, 32H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 166.0, 165.7, 165.3, 165.1, 164.9, 133.8, 133.6, 133.5, 133.4, 133.2, 129.9, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 128.6, 128.5, 101.5, 100.4, 82.5, 80.2, 73.4, 73.0, 72.8, 72.4, 72.0, 71.7, 71.2, 70.0, 69.9, 63.3, 63.0, 32.1, 30.3, 30.0, 29.8, 29.6, 26.3, 22.9, 14.3.
<4-4> MNA -4의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-4a로부터 보호기가 제거된 MNA-4를 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.51-4.50 (m, 2H), 4.31-4.28 (m, 2H), 4.12-4.09 (m, 2H), 3.98-3.96 (m, 4H), 3.82-3.74 (m, 4H), 3.71-3.64 (m, 3H), 3.64-3.55 (m, 10H), 3.28-3.20 (m, 15H), 3.19-3.06 (m, 5H), 1.49-1.41 (m, 4H), 1.19 (m, 32H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.6, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.4, 23.9, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C52H98O26[M+Na]+ 1138.6346, found 1138.6341. MNA-4의 1H NMR 스펙트럼은 도 9에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 10에 나타내었다.
< 제조예 5> MNA -5의 합성
<5-1> 3,4- O -디-도데실-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 5)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 도데실 브로마이드(dodecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-도데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-dodecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-d-mannitol)(화합물 5)을 90% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett. 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<5-2> 3,4- O -디-도데실-D-만니톨 (화합물 15)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 5로부터 3,4-O-디-도데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-dodecyl-D-mannitol)(화합물 15)을 92% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 J.Walton 등의 논문(Tetrahedron Lett . 2006, 47, 737-741.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<5-3> MNA -5a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 15로부터 MNA-5a를 65% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.24-8.21 (m, 4H), 8.12-7.98 (m, 4H), 7.97-7.92 (m, 8H), 7.91-7.89 (m, 6H), 7.87-7.79 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.41-7.35 (m, 32H), 7.34-7.27 (m, 4H), 5.78-5.74 (m, 2H), 5.57-5.42 (m, 4H), 5.41-5.30 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.01-3.91 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.78-1.65 (m, 2H), 1.30-1.10 (m, 36H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.0, 165.9, 165.7, 165.2, 165.1, 164.9, 133.7, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.6, 129.5, 129.3, 129.2, 129.0, 128.9, 128.5, 128.4, 101.4, 100.4, 82.4, 80.2, 73.4, 72.9, 72.8, 72.7, 72.4, 71.9, 71.6, 71.1, 69.9, 69.8, 63.2, 63.0, 32.0, 30.3, 29.9, 29.8, 29.7, 29.5, 26.2, 22.8, 14.2.
<5-4> MNA-5의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-5a로부터 보호기가 제거된 MNA-5를 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.57-4.55 (m, 2H), 4.35-4.33 (m, 2H), 4.15-4.02 (m, 2H), 4.00-3.97 (m, 4H), 3.86-3.77 (m, 4H), 3.76-3.69 (m, 3H), 3.67-3.59 (m, 10H), 3.33-3.22 (m, 15H), 3.21-3.13 (m, 5H), 1.51-1.46 (m, 4H), 1.23 (m, 36H), 0.90(t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.2, 78.1, 77.8, 75.6, 75.3, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.6, 33.2, 31.6, 30.9 30.6, 27.4, 23.8, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C54H102O26[M+Na]+ 1166.6659, found 1166.6658. MNA-5의 1H NMR 스펙트럼은 도 11에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 12에 나타내었다.
< 제조예 6> MNA -6의 합성
<6-1> 3,4- O -디-트리데실-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 6)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 트리데실 브로마이드(tridecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-트리데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-tridecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-d-mannitol)(화합물 6)을 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.25-4.20 (m, 2H), 4.19-4.05 (m, 2H), 3.97-3.91 (m, 2H), 3.61-3.51 (m, 4H), 3.34-3.31 (m, 2H), 1.57-1.53 (m, 4H), 1.41 (s, 6H), 1.34 (s, 6H), 1.25 (m, 40H), 0. 88 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 108.6, 80.6, 76.0, 73.6, 67.0, 58.7, 33.0, 32.1, 30.5, 29.9, 29.8, 29.7, 26.9, 26.3, 26.0, 25.6, 22.9, 14.3.
<6-2> 3,4- O -디-트리데실-D-만니톨 (화합물 16)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 6으로부터 3,4-O-디-트리데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-tridecyl-D-mannitol)(화합물 16)을 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.03-3.97 (m, 2H), 3.90-3.82 (m, 2H), 3.81-3.75 (m, 2H), 3.73-3.62 (m, 4H), 3.60-3.33 (m, 2H), 1.57-1.54 (m, 4H), 1.25 (m, 40H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 108.6, 80.4, 79.2, 76.1, 72.4, 71.7, 66.2, 63.4, 30.2, 29.8, 29.7, 29.6, 26.7, 26.3, 25.3, 22.9, 14.3.
<6-3> MNA -6a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 16으로부터 MNA-6a를 60% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.23-8.21 (m, 4H), 8.20-7.98 (m, 4H), 7.97-7.92 (m, 8H), 7.91-7.89 (m, 6H), 7.87-7.79 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.40-7.35 (m, 32H), 7.34-7.27 (m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.42 (m, 4H), 5.41-5.30 (m, 6H), 4.88-4.74 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.45-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.01-3.91 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.34 (m, 2H), 1.24-1.12 (m, 40H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.0, 165.9, 165.7, 165.2, 165.1, 164.9, 133.7, 133.6, 133.4, 133.3, 133.1, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.6, 129.5, 129.3, 129.2, 129.0, 128.9, 128.5, 128.4, 128.1, 101.4, 100.4, 98.4, 82.4, 80.1, 73.4, 72.9, 72.7, 72.4, 71.9, 71.6, 71.4, 71.1, 69.9, 69.8, 69.5, 63.2, 63.0, 62.6, 60.5, 32.0, 30.3, 29.9, 29.8, 29.7, 29.5, 26.2, 22.8, 14.2.
<6-4> MNA -6의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-6a로부터 보호기가 제거된 MNA-6을 90% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.55-4.53 (m, 2H), 4.31-4.30 (m, 2H), 4.13-4.11 (m, 2H), 4.00-3.97 (m, 4H), 3.79-3.72 (m, 4H), 3.70-3.64 (m, 3H), 3.63-3.56 (m, 10H), 3.30-3.21 (m, 15H), 3.20-3.10 (m, 5H), 1.46-1.44 (m, 4H), 1.20 (m, 40H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.8, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C56H106O26[M+Na]+ 1194.6972, found 1194.6968. MNA-6의 1H NMR 스펙트럼은 도 13에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 14에 나타내었다.
< 제조예 7> MNA -7의 합성
<7-1> 3,4- O -디-테트라데실-1,2:5,6-디- O -이소프로필리덴-D-만니톨 (화합물 7)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 테트라데실 브로마이드(tetradecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-테트라데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-tetradecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 7)을 92% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<7-2> 3,4- O -디-테트라데실-D-만니톨 (화합물 17)의 합성
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 7로부터 3,4-O-디-테트라데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-tetradecyl-D-mannitol)(화합물 17)을 92% 수율로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<7-3> MNA -7a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 17로부터 MNA-7a를 54% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.24-8.23 (m, 4H), 8.12-7.98 (m, 4H), 7.97-7.93 (m, 8H), 7.91-7.89 (m, 6H), 7.88-7.83 (m, 16H), 7.61-7.56 (m, 6H), 7.55-7.43 (m, 16H), 7.41-7.35 (m, 32H), 7.34-7.27 (m, 4H), 5.79-5.77 (m, 2H), 5.57-5.54 (m, 4H), 5.49-5.43 (m, 6H), 5.30-5.21 (m, 2H), 4.90-4.79 (m, 2H), 4.60-4.39 (m, 6H), 4.33-4.20 (m, 6H), 4.01-3.91 (m, 2H), 3.56-3.49 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.15 (m, 4H), 1.51-1.32 (m, 2H), 1.27-1.12 (m, 44H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.7, 165.2, 165.1, 164.9, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.3, 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8, 128.5, 128.4, 128.3, 128.1, 101.5, 100.4, 82.4, 80.2, 73.4, 73.0, 72.9, 72.8, 72.4, 71.9, 71.7, 71.1, 70.0, 69.9, 63.2, 63.0, 32.0, 30.3, 29.9, 29.8, 29.5, 26.2, 22.8, 14.2.
<7-4> MNA -7의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-7a로부터 보호기가 제거된 MNA-7을 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.29-4.27 (m, 2H), 4.11-4.09 (m, 2H), 3.98-3.96 (m, 2H), 3.80-3.77 (m, 4H), 3.67-3.63 (m, 4H), 3.62-3.59 (m, 3H), 3.58-3.53 (m, 10H), 3.27-3.17 (m, 15H), 3.16-3.08 (m, 5H), 1.55-1.46 (m, 4H), 1.21 (m, 44H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.6, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 30.9 30.6, 27.5, 23.9, 14.6; HRMS ( EI ): calcd. for C58H110O26[M+Na]+ 1222.7285, found 1222.7283. MNA-7의 1H NMR 스펙트럼은 도 15에 나타내었으며, 13C NMR 스펙트럼은 도 16에 나타내었다.
< 제조예 8> MNA -8의 합성
<8-1,2> 3,4- O -디-테트라데실-D-만니톨 (화합물 8)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 펜타데실 브로마이드(pentadecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-펜타데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-pentadecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 8)을 합성한 후 정제 없이 다음 단계를 진행하였다. 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 8로부터 3,4-O-디-테트라데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-pentadecyl-D-mannitol)(화합물 18)을 76% 수율 (두 단계)로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<8-3> MNA-8a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 18로부터 MNA-8a를 54% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.23-8.21 (m, 4H), 8.20-7.99(m, 4H), 7.98-7.93 (m, 8H), 7.92-7.88 (m, 6H), 7.87-7.78 (m, 16H), 7.56-7.38 (m, 6H), 7.37-7.34 (m, 16H), 7.33-7.29 (m, 32H), 7.27-7.25(m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.51 (m, 4H), 5.47-5.39 (m, 6H), 4.80-4.76 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.32-4.29 (m, 6H), 4.28-4.22 (m, 6H), 4.01-3.94 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.34 (m, 2H), 1.24-1.12 (s, 48H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.9, 165.8, 165.6, 165.1, 165.0, 164.8, 133.6, 133.4, 133.2, 133.1, 130.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 129.0, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 101.4, 100.3, 91.4, 82.4, 80.1, 73.3, 72.9, 72.8, 72.7, 72.3, 71.8, 71.6, 71.1, 69.9, 69.8, 63.2, 62.9, 60.5, 32.0, 30.2, 29.9, 29.8, 29.7, 29.4, 26.2, 22.8, 14.2.
<8-4> MNA-8의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-8a로부터 보호기가 제거된 MNA-8을 90% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.65-4.62 (m, 2H), 4.42-4.37 (m, 2H), 4.22-4.19(m, 2H), 4.13-4.04 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 4H), 3.85-3.72 (m, 4H), 3.71-3.68 (m, 3H), 3.67-3.65 (m, 10H), 3.37-3.25 (m, 5H), 3.28-3.19(m, 15H), 1.56-1.48 (m, 4H), 1.28 (s, 48H), 0.89 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.8, 14.6.
<제조예 9> MNA-9의 합성
<9-1,2> 3,4- O -디-헥사데실-D-만니톨 (화합물 19)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 헥사데실 브로마이드(hexadecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-헥사데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-hexadecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 9)을 합성한 후 정제 없이 다음 단계를 진행하였다. 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 9로부터 3,4-O-디-헥사데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-hexadecyl-D-mannitol)(화합물 19)을 76% 수율 (두 단계)로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<9-3> MNA-9a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 19로부터 MNA-9a를 52% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.23-8.21 (m, 4H), 8.20-7.99(m, 4H), 7.98-7.93 (m, 8H), 7.92-7.88 (m, 6H), 7.87-7.78 (m, 16H), 7.56-7.38 (m, 6H), 7.37-7.34 (m, 16H), 7.33-7.29 (m, 32H), 7.27-7.25(m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.51 (m, 4H), 5.47-5.39 (m, 6H), 4.80-4.76 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.32-4.29 (m, 6H), 4.28-4.22 (m, 6H), 4.01-3.94 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.34 (m, 2H), 1.24-1.12 (s, 48H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.9, 165.8, 165.6, 165.1, 165.0, 164.8, 133.6, 133.4, 133.2, 133.1, 130.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 129.0, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 101.4, 100.3, 91.4, 82.4, 80.1, 73.3, 72.9, 72.8, 72.7, 72.3, 71.8, 71.6, 71.1, 69.9, 69.8, 63.2, 62.9, 60.5, 32.0, 30.2, 29.9, 29.8, 29.7, 29.4, 26.2, 22.8, 14.2.
<9-4> MNA-9의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-9a로부터 보호기가 제거된 MNA-9을 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.65-4.62 (m, 2H), 4.42-4.37 (m, 2H), 4.22-4.19(m, 2H), 4.13-4.04 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 4H), 3.85-3.72 (m, 4H), 3.71-3.68 (m, 3H), 3.67-3.65 (m, 10H), 3.37-3.25 (m, 5H), 3.28-3.19(m, 15H), 1.56-1.48 (m, 4H), 1.28 (s, 48H), 0.89 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.8, 14.6.
<제조예 10> MNA-10의 합성
<10-1,2> 3,4- O -디-헵타데실-D-만니톨 (화합물 20)의 합성
상기 실시예 1-1의 방법에 따라, 출발물질로 (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)을 사용하고, 알킬 브로마이드로 헵타데실 브로마이드(heptadecyl bromide)를 사용하여, 3,4-O-디-헵타데실-1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-D-만니톨 (3,4-O-Di-heptadecyl-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-D-mannitol)(화합물 10)을 합성한 후 정제 없이 다음 단계를 진행하였다. 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 화합물 10으로부터 3,4-O-디-헵타데실-D-만니톨 (3,4-O-Di-heptadecyl-D-mannitol)(화합물 20)을 75% 수율 (두 단계)로 합성하였다. 분리된 생산물의 1H NMR 스펙트럼은 S.Roy 등의 논문(Colloids surf. A 2011, 377, 349-355.)에서 보고된 데이터와 일치하였다.
<10-3> MNA-10a의 합성
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 화합물 20로부터 MNA-10a를 50% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ8.23-8.21 (m, 4H), 8.20-7.99(m, 4H), 7.98-7.93 (m, 8H), 7.92-7.88 (m, 6H), 7.87-7.78 (m, 16H), 7.56-7.38 (m, 6H), 7.37-7.34 (m, 16H), 7.33-7.29 (m, 32H), 7.27-7.25(m, 4H), 5.77-5.74 (m, 2H), 5.57-5.51 (m, 4H), 5.47-5.39 (m, 6H), 4.80-4.76 (m, 2H), 4.48-4.46 (m, 2H), 4.32-4.29 (m, 6H), 4.28-4.22 (m, 6H), 4.01-3.94 (m, 2H), 3.54-3.41 (m, 5H), 3.40-3.32 (m, 2H), 3.31-3.14 (m, 4H), 1.81-1.34 (m, 2H), 1.24-1.12 (s, 48H), 0.87 (t, J = 7.6 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 165.9, 165.8, 165.6, 165.1, 165.0, 164.8, 133.6, 133.4, 133.2, 133.1, 130.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 129.0, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 101.4, 100.3, 91.4, 82.4, 80.1, 73.3, 72.9, 72.8, 72.7, 72.3, 71.8, 71.6, 71.1, 69.9, 69.8, 63.2, 62.9, 60.5, 32.0, 30.2, 29.9, 29.8, 29.7, 29.4, 26.2, 22.8, 14.2.
<10-4> MNA-10의 합성
상기 실시예 1-4의 방법에 따라 데-O-벤조일레이션 반응을 수행하여 화합물 MNA-10a로부터 보호기가 제거된 MNA-10을 92% 수율로 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.65-4.62 (m, 2H), 4.42-4.37 (m, 2H), 4.22-4.19(m, 2H), 4.13-4.04 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 4H), 3.85-3.72 (m, 4H), 3.71-3.68 (m, 3H), 3.67-3.65 (m, 10H), 3.37-3.25 (m, 5H), 3.28-3.19(m, 15H), 1.56-1.48 (m, 4H), 1.28 (s, 48H), 0.89 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 105.2, 104.8, 82.7, 81.0, 78.3, 78.1, 77.9, 75.7, 75.4, 74.5, 71.7, 71.5, 71.3, 62.8, 62.7, 33.2, 31.6, 31.0, 30.9 30.6, 27.5, 23.8, 14.6.
< 실시예 2> MNAs의 특성
상기 실시예 1의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 10의 MNAs의 특성을 확인하기 위하여, MNAs의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; Rh)을 측정하였다.
구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 소수성 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(Rh)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.
Detergent M.W . CMC ( mM ) CMC ( wt% ) R h (nm)
MNA-1 1055.2 ~0.15 ~0.016 2.3±0.13
MNA-2 1083.2 ~0.05 ~0.0054 2.5±0.05
MNA-3 1111.3 ~0.015 ~0.0017 2.7±0.04
MNA-4 1139.3 ~0.006 ~0.0007 2.9±0.12
MNA-5 1167.4 ~0.004 ~0.0005 3.0±0.01
MNA-6 1195.4 ~0.002 ~0.0002 3.3±0.04
MNA-7 1233.5 ~0.001 ~0.0001 3.3±0.08
MNA-8 1251.53 ~0.003 ~0.0003 3.5±0.1
MNA-9 1279.58 ~0.001 ~0.0001 3.8±0.1
MNA-10 1307.64 ~0.001 ~0.0001 4.1±0.2
DDM 510.1 ~0.17 ~0.0087 3.4±0.03
MNAs의 임계 미셀 농도(CMC)를 측정해본 결과, MNA-1은 150μM (0.016 wt%), MNA-2는 50μM (0.0054 wt%), MNA-3은 15μM (0.0017 wt%), MNA-4는 6μM (0.0007 wt%), MNA-5는 4μM (0.0005 wt%), MNA-6는 2μM (0.0002 wt%), MNA-7은 1μM (0.0001 wt%), MNA-8은 3μM (0.0003 wt%), MNA-9는 1μM (0.0001 wt%), MNA-10은 1μM (0.0001 wt%)의 CMC 값을 가졌다. 즉, MNA-1의 CMC 값은 150 μM로 DDM과 거의 유사하였으나, MNA-2 내지 MNA-10의 CMC 값은 1 내지 50 μM로 DDM이 170 μM인 것과 비교하여 더 작은 것으로 나타났다. 또한, 화합물의 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 CMC 값은 작아지는 경향을 보였는데, 가장 짧은 알킬 사슬(C8)을 가지는 MNA-1은 ~50 μM (~0.016 wt%)의 CMC 값을 가지고, 긴 알킬 사슬(C14, C16, C17)을 각각 가지는 MNA-7, MNA-9, MNA-10은 1 μM (~0.0001 wt%)의 CMC 값을 가지는 것으로 측정되었다. 따라서, MNAs는 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, DDM 보다 적은 양을 사용하여 막단백질을 연구할 수 있고, DDM 보다 물에 대한 용해성이 좋음을 확인할 수 있었다.
MNAs에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; Rh)을 측정해본 결과, 구체적으로 MNA-1은 약 2.3 nm, MNA-2는 약 2.5 nm, MNA-3은 약 2.7 nm, MNA-4는 약 2.9 nm, MNA-5는 약 3.0 nm, MNA-6는 약 3.3 nm, MNA-7은 약 3.3 nm, MNA-8은 약 3.5 nm, MNA-9는 약 3.8 nm, MNA-10은 약 4.1 nm로 측정되었다. 전반적으로 MNAs에 의해 형성된 미셀의 크기는 DDM과 비슷하거나 작았으며, 알킬 사슬 길이에 따라 증가하는 경향을 보였다. 가장 작은 미셀 크기는 MNA-1 (2.3 nm)이고, 가장 큰 미셀 크기는 MNA-10 (4.1 nm)였다.
한편, MNAs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 DLS를 이용해 측정해본 결과를 도 17에 나타내었다. MNAs는 1.0 wt%로 사용되었다. 그 결과, DDM과 유사하게 MNAs의 미셀은 하나의 군집을 가지는 것으로 측정되었다.
이러한 결과로부터 본 발명의 MNAs는 DDM 보다 낮은 CMC 값을 가져 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로 자가조립경향성이 DDM 보다 훨씬 크며, MNAs에 의해 형성된 미셀의 크기가 DDM 보다 작아서 본 발명에 따른 양친매성 분자의 미셀로부터 막단백질을 더욱 손쉽게 분리할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 3> MNAs의 막단백질 ( Bor1 ) 구조 안정화 능력 평가
MNAs에 의한 Bor1 (Boron transporter) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. Bor1의 구조적 안정성은 열 형광 크기 배제 크로마토그래피(heat fluorescence size exclusion chromatography; hFSEC)를 이용하여 측정하였으며, MNAs와 DDM 농도는 CMC + 0.04 wt%에서 측정하였다.
구체적으로, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 Bor1은 Saccharomyces cerevisiae FGY217 세포에서 C-terminal GFP-His tag를 가지는 융합 단백질로서 발현되었다. 세포는 0.1% 글루코스로 보충된 -URA 배지에서 성장하였다. 단백질 발현은 2% 갈락토스의 첨가로 유도된 후, 18시간 동안 20℃에서 배양되었으며, 이는 D.Drew 등의 논문(Nat. Protoc . 2008, 3, 784-798.)에 설명된 방법을 따랐다. 세포를 수득하여 멤브레인을 준비하기 위해 사용되었으며, 이는 J.Leung 등의 논문(Protein Expr . Purif . 2010, 72, 139-146.)에 설명된 방법을 따랐다. Bor1-GFP 융합 단백질을 포함하는 멤브레인은 최종 총 단백질 농도가 2.8 mg/ml이 되도록 PBS(pH 7.4)에 희석되었는데, 상기 PBS에는 각각 1 wt% DDM 또는 1 wt% MNAs(MNA-1, MNA-2, MNA-3, MNA-4, MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7)를 첨가하였다. 샘플은 1시간 동안 4℃에서 흔들면서 인큐베이트한 다음, 용해되지 않은 물질은 14,000g로 1시간 동안 4℃에서 원심분리하여 제거하였다. 용해된 단백질 샘플을 포함하는 상층액은 40℃에서 10분 동안 가열하고, 강하게 응집된 단백질은 14,000g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 제거하였다. 200 ㎕ 표본의 상층액을 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.03% DDM으로 평형화된 Superose 6 10/300 컬럼으로 주입하였다. 각각의 용출 분획물을 clear bottom 96-웰 플레이트 내의 200 ㎕ 분획물 내의 6.4 ml의 머무름 부피(retention volume)(즉, 6.4ml의 통과 후에)로부터 수집하였다. 각각의 분획물의 GFP 형광은 470 nm의 여기(excitation) 파장 및 512 nm의 방출 파장에서 측정하였다.
도 18에 측정 결과를 나타내었으며, 머무름 부피 (40 mL)에 나타나는 피크(peak)가 Bor1 단백질에 해당한다. DDM의 경우 40 mL에 나타나는 피크가 작고, 상당한 정도의 단백질 응집을 나타내는 피크(8 mL)가 보였다. 따라서, DDM으로 추출된 Bor1은 상당한 정도의 단백질 응집이 일어난 것으로 판단된다. MNA-4는 DDM의 이와 같은 경향성과 비슷하였고, MNA-5 및 MNA-6는 DDM 보다 Bor1 단백질 응집정도가 적었으며 Bor1에 해당하는 피크가 상당히 커서 그 특성이 월등함을 확인하였다. 또한, MNA-7 역시 DDM 보다 Bor1 단백질 응집정도가 적어서 우수한 효과를 보였으나, 단백질 응집정도와 타겟단백질에 해당하는 피크(peak)의 크기로 볼 때 MNAs 중에서는 MNA-6의 Bor1 단백질 안정화 효과가 가장 우수하였다. 이와 같은 높은 크기의 막단백질 피크(peak)를 볼 수 있으려면 단백질 추출 효율도 좋아야만 가능하다. 따라서, MNAs (MNA-5, MNA-6, MNA-7)은 막단백질 추출 효율도 우수함을 알 수 있었다. 실제로 MNA-5의 경우는 60%, MNA-6와 MNA-7의 경우에는 70-80%의 추출효율을 보여주어 80%의 DDM과 유사하였다.
이러한 결과로부터 MNAs는 기존의 DDM 보다 Bor1 구조 안정화 능력이 우수하여 막단백질을 추출하거나 안정화시키는 데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 4> MNAs의 막단백질 ( LeuT ) 구조 안정화 능력 평가
MNAs에 의한 LeuT (leucine transporter) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. LeuT 단백질 활성도를 리간드([3H]-Leu)를 활용한 SPA (scintillation proximity assay)에 의해 측정하였으며, MNAs 또는 DDM의 농도는 (a) CMC + 0.04 wt%, 또는 (b) CMC + 0.02 wt%를 사용하였다.
구체적으로, G.Deckert 등의 논문(Nature 1998, 392, 353-358.)에 게재된 방법에 따라, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)의 정제를 수행하였다. LeuT는 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41(DE3)에서 발현된다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA에 의해 제공받음). 요약하면, 단백질을 분리하고, 1.0 wt% DDM에 용해화한 후에, 단백질을 Ni2+-NTA resin (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05 % DDM 및 300 mM 이미다졸로 용출시킨다. 그 다음, 약 0.8 mg/ml 단백질 스톡(stock)을 DDM 및 이미다졸이 없으나 MNAs (MNA-5, MNA-6 또는 MNA-6) 또는 DDM (대조군)을 최종 농도가 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%가 되도록 보충한 동등한 버퍼에 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에 저장하고, 지정된 시간에 원심분리하였으며, 단백질 활성은 SPA (scintillation proximity assay) (M. Quick et al., Proc . Natl , Acad . Sci . U.S.A . 2007, 104, 3603-3608.)를 이용하여 [3H]-Leu 결합을 측정하였다. 450 mM NaCl 및 상기 농도의 각각의 테스트 화합물을 포함하는 버퍼에 녹아 있는 5 μL의 각각의 단백질 샘플, 20 nM [3H]-Leu 및 1.25 mg/ml copper chelate (His-Tag) YSi beads (둘 모두 PerkinElmer, Denmark 로부터 구매함)로 SPA를 수행하였다. [3H]-Leu 결합은 MicroBeta liquid scintillation counter (PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.
도 19에 나타난 결과와 같이, 시간 경과에 따른 각 MNA에 녹아 있는 LeuT의 리간드 결합 능력을 측정한 결과, CMC + 0.04 wt% 농도에서는 MNA-6가 가장 우수하였으며, CMC + 0.2 wt% 농도에서는 MNA-5가 가장 우수하였다. 각 농도에서 MNA-7은 DDM과 비슷한 수준의 LeuT 안정화 능력을 보여주었다.
이러한 결과로부터 본 발명의 MNA-5 및 MNA-6는 DDM 보다 LeuT 단백질 안정화 능력이 우수하고, MNA-7은 DDM과 동등 수준의 LeuT 단백질 안정화 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 본 발명에 따른 화합물의 막단백질 ( β 2 AR ) 구조 안정화 능력 평가
MNAs에 의한 인간 β2 아드레날린성 수용체 (β2AR), G-단백질 연결 수용체(GPCR) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다.
<5-1> Full agonist (ISO) 존재 유무 또는 ISO와 G-단백질 조합에 따라 MNAs와 DDM 미셀에 녹아 있는 mBBr-β 2 AR의 측정
Full agonist인 이소프레오테레놀 (Isopreoterenol; ISO) 존재 유무 또는 ISO와 G-단백질 조합에 따른 MNAs(MNA-5, MNA-6, MNA-7)와 DDM에 의한 mBBr-β2AR 구조적 변화 및 그 구조적 안정성을 측정하는 실험을 하였다.
구체적으로, 0.1% DDM에 용해된 β2AR을 D. M. Rosenbaum 등의 논문(Science 2007, 318, 1266-1273.)에 기재된 방법에 따라 정제한 다음, 약 1 mg/ml으로 농축했다. 0.1% DDM에 50 μM로 용해된 0.5 ㎕ 비리간드 상태의 BI(agonist)-결합된 monobromobimane (mBBr)-라벨된 β2AR를 500 ㎕의 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt% 농도의 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7) 버퍼 (최종적으로 50 nM 농도 수용체)로 희석하였다. 30분 동안 배양하고 mBBr 스펙트럼을 측정하여, 0.1% DDM에 용해된 mBBr-라벨된 수용체의 스펙트럼과 비교하였다. mBBr-라벨된 β2AR 형광은 370 nm에서 측정되었고, 결과는 430 내지 510 nm 방출을 1-nm 단위에서 1nm s-1로 Spex FluoroMax-3 분광기(Jobin Yvon Inc.)를 이용하여 측정하였고, 광자계수 모드 설정은 4-nm 방출 대역폭 통과로 하였다. DDM에 용해된 mBBr이 양성 대조군(positive control)으로 사용되었다.
한편, G 단백질 커플링 시험은 다음과 같은 방법을 이용했다. Monobromobimane (mBBr)로 표지된 β2AR (주로 Cys265에서)를 사용하여 TM6(Transmembrane helix 6) 근처의 국부 구조적 변화에 의해 영향 받는 형광의 변화를 측정하였다. 이는 S. E. Mansoor 등의 방법(Biochemistry 2002, 41, 2475-2484.)에 따랐다. 50 μM의 비리간드 mBBr-라벨된 수용체 0.5 ㎕을 500 ㎕ 20xCMC MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7 버퍼 (최종적으로 50 nM 농도 수용체)로 10분 동안 RT에서 희석시켰다. 그리고 2 μM 이소프레오테레놀 (Isopreoterenol; ISO)을 첨가하고 다시 10분 동안 배양하였다. 250 nM Gs를 추가적으로 첨가하고 RT에서 15분 배양한 후, mBB-β2AR 형광을 370 nm에서 측정하였다. 결과는 430 내지 510 nm 방출을 1-nm 단위에서 1nm s-1로 Spex FluoroMax-3 분광기(Jobin Yvon Inc.)를 이용하여 측정하였고, 광자계수 모드 설정은 4-nm 방출 대역폭 통과로 하였다. DDM에 용해된 mBBr이 양성 대조군(positive control)으로 사용되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험 결과의 평균을 나타낸다.
도 20에 나타난 결과와 같이, full agonist인 이소프레오테레놀 (ISO)이 존재할 때 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 수용체의 bimane 스펙트럼은 DDM에 의해 용해된 수용체의 스펙트럼과 유사했다. 그리고 ISO 및 G-단백질의 조합이 사용되었을 때, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 mBBr-β2AR은 DDM에 의해 용해된 β2AR의 bimane 형광 스펙트럼과 유사하였으나, MNA-5의 경우는 DDM 보다 형광 세기가 조금 강했다.
이 결과는 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7을 사용하였을 때 수용체의 구조 및 기능이 잘 유지됨을 나타낸다. 이와 같이 ISO 및 G-단백질 존재 하에서 형광 강도의 감소 및 최대 방출 파장의 변화는 이 분자들(ISO 및 G-단백질)의 결합에 의해 수용체가 비활성으로부터 활성 상태로의 구조적 변화가 발생했음을 의미하며, 이는 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7에 녹아있는 β2AR의 구조가 세포막에 존재하는 수용체와 비슷한 양상으로 거동함을 시사한다.
<5-2> CMC 이하의 농도에서 mBBr - β 2 AR의 측정
양친매성 분자의 CMC 이하의 농도에서 MNAs와 DDM에 의한 β2AR 단백질의 구조 변화를 비교하기 위한 실험을 하였다.
구체적으로, 20 x CMC 농도의 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7에 50 μM로 용해된 0.5 ㎕ 비리간드 mBBr-라벨된 수용체를 500 ㎕ NH 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 희석했다. 단백질은 30분 동안 배양하고, bimane 스펙트럼을 측정했다. 0.1% DDM에 용해된 수용체가 NH 버퍼로 희석되어 컨트롤(control)로 사용되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 21에 나타난 결과와 같이, 양친매성 분자의 농도를 CMC 농도의 50분의 1로 묽혀 β2AR 단백질의 안정성을 측정했을 때 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7은 모두 DDM 보다 더 오랫동안 수용체의 안정성을 확보해주었다. 이는 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7이 막단백질 표면에 매우 강하게 결합하여 막단백질 표면에서 떨어지는 속도가 훨씬 더 느리다는 것을 의미한다.
<5-3> 방사성 리간드 결합 시험을 이용한 mBBr - β 2 AR의 리간드( DHA ) 결합 활성 측정
DDM 또는 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7)에 용해되어 있는 수용체(mBBr-β2AR) 활성도를 [3H]-디하이드로알프레놀올 ([3H]-DHA)의 결합에 의해 측정하였다.
구체적으로, 방사성 리간드 결합 시험은 다음과 같은 방법을 이용하였다. 0.1% DDM에 용해된 β2AR는 D. M. Rosenbaum 등의 논문(Science 2007, 318, 1266-1273.)에 설명된 방법에 따라 정제하여, 최종농도가 약 5 mg/ml (대략 100 μM)이 되도록 하였다. 2 mM CaCl2 의 존재 하에 M1 Flag 컬럼에 재로딩한 후에, 컬럼은 MNA 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 및 0.2% MNA)로 세척하였다. 그리고 수용체는 5 mM EDTA 및 0.2 mg/ml free Flag 펩티드로 20xCMC 농도의 MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7에서 각각 용출시켰다. DDM 또는 MNAs(MNA-5, MNA-6 또는 MNA-7)에 용해된 0.1 pmol의 정제된 β2AR은 10 nM의 방사성 DHA [3H]-Dihydroalprenolol (DHA)로 30분 동안 상온(RT)에서 각각 배양했다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 통과액을 바인딩 버퍼 (0.5 mg/ml BSA로 보충된 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 수집하고, 그리고 15 ml 섬광 유체(scintillation fluid)로 채웠다. 수용체-결합된 [3H]-DHA는 scintillation counter (Beckman)로 측정했다. [3H]-DHA의 비특이적 결합은 같은 결합 반응에서 2 μM의 alprenolol (Sigma)를 첨가함으로써 측정하였다. [3H]-DHA의 결합도는 컬럼 그래프로 측정되었다. 각각의 실험을 3번 수행하였다.
도 22에 나타난 결과와 같이, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 수용체의 리간드 결합 활성도가 DDM에 의해 용해된 수용체의 활성도와 비슷하거나 보다 우수하였다.
이러한 결과로부터 MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 β2AR 단백질은 양친매성 분자 치환시 그 단백질 기능이 잘 유지됨을 확인할 수 있었다.
<5-4> 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC) 분석
DDM, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 형성된 단백질-양친매성 분자 복합체인 PDC(protein-detergent complex)의 사이즈를 확인하기 위하여 SEC 분석을 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 5-3에서 이용한 것과 동일하게 DDM, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 β2AR를 실험 샘플로 사용하였다. 샘플은 Superdex-200 10/300 GL 컬럼 (GE healthcare)에 0.5 ml/min으로 적용하고, 고유의 트립토판 형광 시그널을 295 nm 여기 파장 및 345 nm 방출 파장을 이용하여 측정하였다. 러닝 버퍼(running buffer)는 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 및 20×CMC MNA-6 또는 MNA-7을 포함한다. 단백질 샘플의 머무름 부피(retention volume)의 차이는 양친매성 분자의 존재 하에 형성되는 PDC(protein-detergent complex)의 사이즈가 다른 것을 의미한다.
도 23에 나타난 결과와 같이, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 형성된 PDCs는 DDM에 의해 형성된 PDC 보다 크기가 작았다. 이와 같은 MNA-6 또는 MNA-7의 향상된 막단백질의 안정성, 작은 PDC 크기 형성과 같은 우수한 특성들은 막단백질 결정 형성을 촉진화하여 x-ray 결정학을 통한 막단백질 구조분석에 유용하리라 판단된다. 또한, MNA-6 또는 MNA-7는 단백질 표면과의 강한 결합, 작은 PDC 사이즈 및 향상된 단백질 안정성과 같은 성질을 가지므로, 막단백질의 전자 현미경 분석에도 이용하기에 적합할 것이라는 판단을 하였다. 따라서, MNA-6 또는 MNA-7를 이용하여 전자현미경을 통한 막단백질 분석 실험을 하였다.
<5-5> 전자현미경(Electron microscopy; EM ) 분석
DDM, MNA-6 또는 MNA-7를 이용하여 전자현미경을 통한 β2AR 단백질 분석 실험을 하였다.
구체적으로, M. Ohi 등의 논문(Biol . Proced . Online 2004, 6, 23-34.)에 설명된 종래 음성 염색법(negative staining) 프로토콜을 이용하여 샘플을 준비하였다. 요약하면, DDM, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 3 ㎕의 β2AR을 글로우 방전된(glow-discharged) 탄소 코팅된(carbon-coated) 그리드(grid)로 피펫팅하고, 1% (w/v) 우라닐 포름산염(uranyl formate)으로 염색했다. 상온에서 Morgagni 268(D) 투과 전자현미경 (FEI Company)로 100kV로 작동하여 이미징을 수행했다. Orius SC200W CCD 카메라 (Gatan Inc.)로 30,416X의 교정 배율(calibrated magnification)에서 이미지를 기록했다.
도 24에 나타난 결과와 같이, MNA-6 또는 MNA-7에 의해 용해된 β2AR은 균일하고 DDM에 의해 용해된 단백질과 비교하여 적은 배경 클러터(clutter)를 가졌다.
이러한 결과로부터 MNAs는 전자현미경(EM)을 통한 막단백질의 구조 분석을 위해 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00015

    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기이고; 그리고
    상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기이고; 상기 R1 및 R2는 동일하고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9, 화학식 10 또는 화학식 11로 표시되는 화합물:
    [화학식 2]
    Figure pat00016

    [화학식 3]
    Figure pat00017

    [화학식 4]
    Figure pat00018

    [화학식 5]
    Figure pat00019

    [화학식 6]
    Figure pat00020

    [화학식 7]
    Figure pat00021

    [화학식 8]
    Figure pat00022

    [화학식 9]
    Figure pat00023

    [화학식 10]
    Figure pat00024

    [화학식 11]
    Figure pat00025
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질과 복합체를 형성하여 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석할 수 있는 양친매성 분자인 화합물.
  8. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는, 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화용, 또는 전자현미경을 이용한 막단백질 구조 분석용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자 제형인 것인 조성물.
  10. 1) (1R,2R)-1,2-비스((S)-2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)에탄-1,2-디올 ((1R,2R)-1,2-bis((S)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)ethane-1,2-diol)에 알킬레이션(alkylation) 반응을 수행하여 알킬기를 도입하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 생성물에 p-TSA(Toluene sulfonic acid), CH2Cl2 및 메탄올을 첨가하여 3,4-O-디-알킬-D-만니톨 (3,4-O-Di-alkyl-D-mannitols)을 생성하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00026

    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기이고; 그리고
    상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기이고; 상기 R1 및 R2는 동일하고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 방법.
  12. 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00027

    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기이고; 그리고
    상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기이고; 상기 R1 및 R2는 동일하고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 막단백질은 Bor1 (Boron transporter), LeuT (Leucine transporter) 또는 β2AR (human β2 adrenergic receptor), 및 이들의 2 이상의 조합인 방법.
  15. 1) 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계;
    2) 상기 화합물에 의해 용해된 막단백질을 염색하는 단계; 및
    3) 전자현미경을 이용해 염색된 막단백질을 분석하는 단계;를 포함하는, 전자현미경을 이용해 막단백질의 구조를 분석하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00028

    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C5-C20의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C5-C20의 아릴기이고; 그리고
    상기 X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 C7-C16 알킬기이고; 상기 R1 및 R2는 동일하고; 그리고 상기 X1 내지 X4는 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 막단백질은 Bor1 (Boron transporter), LeuT (Leucine transporter) 또는 β2AR (human β2 adrenergic receptor), 및 이들의 2 이상의 조합인 방법.
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