WO2019057961A1 - Bestimmung des dipolmoments von makromolekülen - Google Patents

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WO2019057961A1
WO2019057961A1 PCT/EP2018/075780 EP2018075780W WO2019057961A1 WO 2019057961 A1 WO2019057961 A1 WO 2019057961A1 EP 2018075780 W EP2018075780 W EP 2018075780W WO 2019057961 A1 WO2019057961 A1 WO 2019057961A1
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macromolecule
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radiation
self
dipole moment
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Raphael A. SEIDEL
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Universitätsklinikum Jena
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    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
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    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes
    • H01J49/34—Dynamic spectrometers
    • H01J49/42—Stability-of-path spectrometers, e.g. monopole, quadrupole, multipole, farvitrons
    • H01J49/4205—Device types
    • H01J49/4245—Electrostatic ion traps
    • H01J49/425—Electrostatic ion traps with a logarithmic radial electric potential, e.g. orbitraps
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/007—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the electric dipolar moment
    • H—ELECTRICITY
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    • H01J49/34—Dynamic spectrometers
    • H01J49/36—Radio frequency spectrometers, e.g. Bennett-type spectrometers, Redhead-type spectrometers
    • H01J49/38—Omegatrons ; using ion cyclotron resonance

Definitions

  • the present invention relates to the characterization and in particular to the determination of the spatial arrangement of macromolecules from biological samples.
  • the characterization and structure determination of macromolecules is of scientific as well as medical and technological reasons of interest and great importance. As the number of atoms in the molecule increases, so does the number of possible spatial configurations and makes structure determination more difficult. At the same time, with the number of atoms, the effort to predict the structure of the macromolecule by numerical methods increases. As the size of the molecule increases, so does the number of energetically favored spatial arrangements that differ from the theoretical energy minimum and may functionally differ from each other and may coexist in biological samples.
  • the spatial configuration of the atoms can affect the physical properties of the molecule, such as the dipole moment, the moment of inertia, or the charge distribution. By measuring the physical properties such as the dipole moment conclusions can be drawn on the structure of the macromolecule and identification, characterization or structural prediction of the macromolecules can be improved. In particular, different spatial arrangements of the same macromolecule can be distinguished from each other.
  • the dipole moment is determined by numerical calculation on the basis of a predetermined molecular configuration. If it is possible to isolate a major amount of the macromolecule, an experimental estimate of the measurable permittivity, refractive index, or Stark effect can be made. However, the presence of a solvent often leads to large inaccuracies of the method, and mixtures of substances such as biological samples generally have a multiplicity of different macromolecules, so that experimental values are not structure-specific.
  • Patent Application US 2006/0214096 Ai discloses an electrode arrangement for producing a hexapole field whose stable trajectory depends on the ratio of the dipole moment to the mass of an uncharged molecule. To do this, the molecules must be captured in a small space element, subjected to very high alternating voltages and their temperature greatly reduced.
  • the invention relates to a determination of the Dipolmoments of macromolecules with a method and a device according to the independent claims.
  • the dependent claims relate to preferred embodiments of the invention. The different design features of these embodiments can be combined and can work together to achieve the object of the invention.
  • the invention in a first aspect, relates to a method for determining a dipole moment of a macromolecule having a mass greater than 1 ku.
  • the method according to the invention comprises exciting a self-rotation of the macromolecule by interacting the dipole moment with an electromagnetic field, measuring a radiation absorption and / or a radiation emission of the macromolecule as a result of the self-rotation and determining the dipole moment from the measured radiation absorption and / or radiation emission.
  • both the enrichment and the direct measurement of the dipole moment compared to macromolecules can be simpler.
  • the rotational vibration spectrum of a light molecule can be directly picked up by spectroscopy. However, these measurements can be technically difficult, especially in the case of macromolecules.
  • the energetic separation of rotational states decreases with increasing mass (moment of inertia) of the molecule, while at the same time the linewidth of the transitions may increase by an increasing variety of vibrational states, so that the necessary temperature of the molecule which allows the states to dissolve should be greatly reduced .
  • the coupling of the dipole moment to the electromagnetic field or the determinability of a spectroscopic signal can be enhanced by exciting a self-rotation.
  • the coupling quantity of the self-rotation to the electromagnetic field can depend directly on the value of the dipole moment and thus allow the determination of the dipole moment due to the self-rotation.
  • Macromolecules in the sense of the disclosure may be molecules which have a secondary structure and / or a tertiary structure and / or a quaternary structure and / or have a mass of more than 1 ku or more than 10 ku. Molecules with such a structure can have very different physical properties due to their conformation, and the conformation can not arise directly from the chemical composition of the macromolecule.
  • macromolecules are biopolymers such as nucleic acids, carbohydrates, polyphenols or proteins or non-polymeric molecules such as fats or macrocycles (such as the protein hemoglobin with a mass of 64 ku and a dipole moment of 520 Debye).
  • a field may apply, which comprises a magnetic and / or an electrical component.
  • An electromagnetic field may thus comprise a static electric field and / or a static magnetic field and / or an electrodynamic field, such as a radiation field.
  • an electrodynamic field such as a radiation field.
  • both static electrical and static magnetic fields can be used to stimulate self-rotation of the macromolecule.
  • time varying electrical and / or magnetic fields and / or combinations of electric and magnetic fields may be used to generate excitation.
  • an at least section-wise high vacuum or ultra-high vacuum is established at a pressure below 10-7 mbar.
  • the macromolecule may be an electrically charged molecule, in particular an ionized molecule.
  • the method additionally comprises ionizing the macromolecule.
  • a certain amount of elementary charges is added or removed from the macromolecule, so that the macromolecule receives a finite electrostatic charge.
  • the ionization of the macromolecule can be done on the basis of a special evaporation process and / or a targeted ionization process, such as impact ionization and / or photoionization.
  • the method additionally comprises evaporating and / or ionizing the macromolecule from a sample.
  • the method additionally comprises evaporating and / or ionizing the macromolecule from a sample with a substantially conformation preserving process, in particular by electrospray ionization, laser desorption ionization, such as Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALD) ionization or SELD- Ionization (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), or APC (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) or APP (Athmospheric Pressure Photoionization) ionization.
  • MALD Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
  • SELD- Ionization Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
  • APC Atmospheric Pressure Chemical Ionization
  • APP Advanced Pressure Photoionization
  • the macromolecule may be nebulized via an applied electric field, a local electromagnetic excitation such as a laser, or due to a gas flow (such as due to a nitrogen gas flow) and may be due to evaporation and / or upstream or upstream interaction be ionized with an electromagnetic field and / or a charged particle and / or a chemical reaction.
  • chromatographic and / or electrophoretic separation methods may also be used to spatially separate the macromolecule from matrix constituents and other components.
  • the separation processes can be upstream and / or downstream of the evaporation and / or ionization of the macromolecule and can be carried out in a gas phase and / or a liquid phase of the macromolecule or a medium.
  • capillary electrophoresis and / or gas chromatography and / or liquid chromatography and / or supercritical fluid chromatography can be used to filter the macromolecule.
  • the method additionally comprises filtering the macromolecule according to its mass-to-charge ratio.
  • the method additionally comprises filtering the macromolecule according to its shape factors by means of its trajectory and / or mobility in gas-filled drift cells, in which static and / or oscillating electrical or magnetic fields can be applied.
  • the shape factors may include the size, geometry and / or collision cross-section of the macromolecule.
  • the shape factors may also be determined depending on an orientation and / or trajectory due to the applied electric and / or magnetic fields and / or used in accordance with the filtering of the macromolecule.
  • a method such as ion mobility spectroscopy can be used to filter the macromolecule according to its size and / or geometry and / or collision cross-section.
  • an electrode assembly having an electrical DC and / or alternating field and / or a magnetic field is used, wherein a stable trajectory and / or a collision-free trajectory depend on the mass-to-charge ratio .
  • quadrupole traps or multipole traps such as hexapole traps, octopole traps, etc.
  • time of flight measurements may be used to filter the macromolecule according to its mass-to-charge ratio.
  • the various methods to filter the macromolecule can be used in any order and combination to macromolecules with a To isolate the corresponding mass-to-charge ratio and provide for the determination of the Dipolmoments.
  • exciting the self-rotation of the macromolecule comprises exciting a bound rotation of the macromolecule on a binding trajectory.
  • a binding trajectory or bound path in the sense of the disclosure may be a trajectory in which a particle, when viewed from a certain direction, passes over a finite angle, in particular of at least 2 ⁇ , with respect to an axis along the determined direction.
  • a binding trajectory may comprise a circular path, an ellipse, a spiral path, a rotation oscillation or combinations of the aforementioned paths / oscillations or the like.
  • a binding trajectory in the sense of the disclosure does not necessarily require that, after sweeping an angle of 2 ⁇ , the macromolecule is viewed at the same location, at the same projection when along the particular direction, or at the same distance from the axis, although in FIG some embodiments is so.
  • the sweeping of the finite angle in an inhomogeneous force field and / or due to an inhomogeneous effect of the force field on the macromolecule leads to a rotation of the macromolecule about an axis of inertia.
  • An effect on the macromolecule may be inhomogeneous if it is suitable for exciting rotation about the axis of inertia on a binding trajectory.
  • the bounded rotation of the moon around the earth can be considered, in which, due to the stronger gravitational attraction to the nearer side of the (slightly elliptical) moon, always shows the same side of the moon in the direction of the earth. Due to the effect of the bound rotation, stimulation of the self-rotation of the macromolecule can be achieved by influencing the trajectory of the macromolecule.
  • exciting the bounded rotation of the macromolecule comprises interacting the macromolecule with an electric field in an electrode assembly.
  • the electrode assembly includes a spindle electrode that effects an attractive force action on an ionized macromolecule so that a binding trajectory of the macromolecule can occur.
  • the electric field may couple to the dipole moment of the macromolecule and result in at least partial alignment of the macromolecule along a connecting line between the malcromolecule and the spindle electrode such that bound rotation of the macromolecule can be produced.
  • the electrode assembly may also include a barrel electrode, which causes a repulsive force on the macromolecule and thus may favor the binding trajectory.
  • the drum electrode can enclose the spindle electrode, for example in an arrangement of an inner spindle electrode and an outer drum electrode.
  • the electrode assembly may include portions in which the barrel electrode is coaxially disposed about the inner spindle electrode and thus forms a cylindrical capacitor.
  • a cylinder is understood to mean a mathematical cylinder or truncated cone with an arbitrary base surface, and therefore in particular does not assume a circular cross section of the electrodes, in order to excite a binding trajectory.
  • the electrode arrangement may also include grooves and / or fins and / or projections in the electrodes in order to define the binding trajectory more closely and / or have rounded surfaces.
  • exciting the bound rotation comprises increasing a rotational frequency of the binding trajectory of the macromolecule, in particular by increasing a curvature of the binding trajectory.
  • Increasing the curvature may include, for example, reducing a radius of curvature of the binding trajectory.
  • the coupling of the macromolecule to an electrodynamic field may depend on the absolute value of the rotational frequency.
  • a pulsed increase in the curvature of the binding trajectory can be used to overcome technical limitations.
  • the achievable curvature of the binding trajectory may be limited by a maximum DC voltage, electric field density, minimum electrode radius, etc.
  • the curvature may be increased by applying a voltage pulse to an element of the electrode assembly.
  • the curvature of the binding trajectory may be increased by adjusting the cross-section of the spindle electrode (eg, by tapering) and / or correspondingly adjusting the cross-section of the barrel electrode.
  • exciting the bound rotation and / or increasing the curvature involves interacting the macromolecule with a magnetic field.
  • An ionized macromolecule can be deflected in a magnetic field due to the Lorentz force and can be brought to a binding trajectory.
  • the Lorentz force can cause opposite directions of force on the poles of the dipole, and thus lead to a bound rotation of the macromolecule on the binding trajectory.
  • the magnetic field may be used to further determine the binding trajectory in the electrode assembly and / or to cause the curvature to increase by static and / or pulsed magnetic fields in a portion of the electrode assembly.
  • the macromolecules can be released axially and / or tangentially after exciting the bound rotation from the electrode arrangement.
  • the macromolecules may be focused and directed into a particular volume of space to measure the radiation absorption and / or radiation emission.
  • exciting the self-rotation of the macromolecule comprises an electromagnetic excitation, in particular a microwave excitation, of the macromolecule, preferably by radiation absorption.
  • a dipole may align along the electric field direction.
  • the orientation can be reversed, and in particular can be caused by cyclic reversal of the plate capacitor, a rotational movement of the macromolecule.
  • a radiated alternating electric field such as a radiation field, cause a rotation of the macromolecule.
  • the radiation field couples to the rotation states of the macromolecule and can self-rotation of the macromolecule stimulate. The classical and / or quantum-mechanical consideration can result from the size and temperature of the macromolecule.
  • the excitation of the macromolecule may be followed and / or combined by a binding trajectory and by an electromagnetic radiation excitation. In this way, a certain rotational frequency of the self-rotation for the detection of the dipole moment can be achieved.
  • molecular density may be constrained along the binding trajectory and / or during excitation by electromagnetic radiation excitation due to collision cross-sections and / or molecular flows and / or interactions.
  • the molecular density which may be proportional to the measured magnitude of the radiation emission and / or radiation absorption, may be limited after exciting the self-rotation.
  • the method comprises slowing down a propagation velocity of the macromolecule, in particular for compressing a plurality of macromolecules.
  • the electrode assembly may comprise brake electrodes which slow down the rate of propagation of the macromolecules and increase the molecular density in a given volume of space.
  • the measuring comprises measuring the radiation absorption and / or emission at a frequency of self-rotation of the macromolecule.
  • the property of the rotating macromolecule can be exploited to implement a charge pair oscillating at the intrinsic rotational frequency.
  • measuring comprises measuring a frequency dependent and / or polarization dependent absorption cross section of the macromolecule.
  • the modification of the occupation states of the rotational vibrations of the macromolecule can be exploited by the excitation of the self-rotation in order to identify and / or analyze the dipole moment of the macromolecule coupling radiation transitions.
  • the invention in a second aspect, relates to a device for determining a dipole moment of a macromolecule with a mass of more than 1 ku, which comprises an excitation element for exciting a self-rotation of the macromolecule by interacting the dipole moment with an electromagnetic field, a detection element for Measuring a radiation absorption and / or a radiation emission of the macromolecule as a result of the self-rotation and an analysis element for determining the dipole moment from the measured radiation absorption and / or radiation emission.
  • the excitation element is arranged to excite a bound rotation of the macromolecule on a binding trajectory.
  • the excitation element is set up to increase a rotational frequency of the binding trajectory, in particular by increasing a curvature of the binding trajectory.
  • the excitation element comprises an electrode assembly that, in particular, limits the binding trajectory of the macromolecule and / or is configured to excite the bounded rotation by an electric field.
  • an inner spindle electrode can cause an attractive force on the macromolecule and / or an outer enclosing rim electrode a repulsive force on the macromolecule.
  • the excitation element comprises means for generating a magnetic field in order to excite the binding trajectory.
  • Suitable means may be current-carrying conductors, in particular in the form of a coil, and / or materials having a magnetic remanence.
  • the excitation element comprises a radiation source, and in particular a microwave source, for exciting the self-rotation of the macromolecule.
  • the device additionally comprises means for generating an electromagnetic field for compressing a plurality of macromolecules.
  • the electrode arrangement may comprise electrodes for decelerating the macromolecules, which are arranged in particular following the excitation by the excitation element in order to concentrate the rotating macromolecules in a specific volume of space.
  • the device additionally comprises a mass spectrometer for filtering the macromolecule.
  • the mass spectrometer may be connected upstream of the excitation element in order to filter a multiplicity of macromolecules, for example from a biological sample, and to limit their number in the excitation element.
  • the mass spectrometer can filter the malcromolecule according to its mass-to-charge ratio as in any of the methods previously described.
  • the device additionally comprises an evaporation element for providing and / or ionizing the macromolecule from a sample, in particular by electrospray ionization, laser desorption ionization, such as MALD ionization or SELD ionization, or APC ionization or APP ionization.
  • an evaporation element for providing and / or ionizing the macromolecule from a sample, in particular by electrospray ionization, laser desorption ionization, such as MALD ionization or SELD ionization, or APC ionization or APP ionization.
  • a previously described substantially conformation-preserving method can be used so that the conformation of the macromolecule is at least partially retained after the evaporation.
  • the detection element comprises means for measuring the radiation absorption and / or radiation emission at a frequency of self-rotation of the macromolecule.
  • Suitable means may include radiation detectors or detectors of electromagnetic fields, such as diodes, antennas and / or coils coupled to signal amplifiers and / or semiconductor circuits, in conjunction with radiation sources such as diodes, lasers, maser, resonant circuits, etc.
  • the detection element comprises means for measuring a frequency-dependent and / or a polarization-dependent absorption cross section of the macromolecule.
  • Suitable means may include the detectors described above in conjunction with polarization-dependent transmitters, reflectors and / or absorbers and corresponding radiation sources with controllable radiation frequency and / or polarization.
  • the devices may be further configured to implement the method steps of the various previously described embodiments of the method and / or include means or devices configured to implement the method steps of the various previously described embodiments of the method.
  • Fig. 1 illustrates a schematic device for measuring the dipole moment
  • Fig. 2 is a schematic drawing illustrating the excitation of self-rotation in a cylindrical capacitor geometry
  • FIGURE 3 illustrates an exemplary binding trajectory of a molecule having a dipole moment about a spindle electrode
  • Fig. 4 illustrates an exemplary binding trajectory of a molecule on a pathway with increasing curvature and subsequent axial dislodgement
  • FIG. 5 illustrates a flow chart for an exemplary method for determining the dipole moment.
  • a device 10 for determining the dipole moment may be implemented by a sequential arrangement of different elements.
  • a plurality 12 of macromolecules 14 are preferably provided in a vacuum region of the device 10.
  • macromolecule ions 14 charged from a medium by electrospray ionization may be provided.
  • Electrospray ionization and comparable methods preferably generate multiply charged ions in order to facilitate manipulation of the macromolecules by electromagnetic fields.
  • the macromolecules 14 can then be separated in a mass spectrometer 16, for example implemented by a quadrupole trap of suitable frequency and voltage, according to the mass-to-charge ratio.
  • the molecules 14 to be examined with a mass-to-charge ratio selected at the mass spectrometer 16 can then be provided with self-rotation in the excitation element 18.
  • the self-rotation couples via the dipole moment of the macromolecules 14 to electrodynamic fields 20 and thus leads to the emission of electromagnetic radiation and to a variation of the absorption spectrum of the macromolecules 14 due to the modified occupation states.
  • a detection element 22 can measure emitted radiation and / or determine a variation of an absorption cross section due to the self-rotation of the macromolecules 14. The determined experimental values may then be used by an analysis element 24 to determine the value of the dipole moment.
  • the macromolecules 14 may be released from the excitation element 18 to decouple an interaction of the macromolecules 14 with electromagnetic fields 20 due to the self-rotation of an interaction due to the excitation by the excitation element 18 by spatial separation.
  • suitable electrical and magnetic fields can be used to capture the macromolecules 14 and to focus in a specific volume of space in the area of the detection element 22.
  • the rate of propagation of the macromolecules 14 can be reduced to increase a molecular density in the volume of the space so that detection of radiation emission and / or absorption by the macromolecules 14 is facilitated.
  • the device 10 can be realized in a vacuum or a low pressure environment.
  • collisions with other molecules can be minimized and thus the intrinsic rotation and / or propagation speed can be obtained.
  • control over the trajectory and self-rotation of the macromolecules 14 can thereby be increased.
  • an at least partial increase in pressure to effect relaxation and / or deceleration and / or measurement of other parameters, such as the impact cross-section may be desirable.
  • a C-trap in device 10 with a collision gas and with an electrode assembly to which DC and / or AC voltages can be applied, an ion packet in a limited volume of space can be deployed.
  • the exemplary excitation element 18 includes a inner spindle electrode 26 and outer barrel electrode 28 which are electrically charged with opposite signs.
  • the spindle electrode 26 has a positive charge while the barrel electrode 28 has a negative charge.
  • An exemplary path of the macromolecule 14 in the electrode assembly is illustrated with the macromolecules 14a and 14b in two positions.
  • an ionized (negatively charged) macromolecule 14a of finite propagation velocity and initially random spatial orientation enters the excitation element 18 and becomes in the electric field between the spindle electrode 26 and the barrel electrode 28 by the Coulomb force FEI on a binding trajectory towards the Position of the rotating macromolecule 14b directed.
  • the rotational frequency ⁇ is through
  • the binding trajicctorie need not have an elliptical shape and need not necessarily be a closed trajectory, but may generally comprise a complex combination of ellipses and rotational vibrations, and may further be modified by deviation of the electrode geometry become. However, this does not significantly change the fundamental considerations.
  • macromolecule 14a aligns such that the dipole moment of macromolecule 14a is substantially parallel to the electric field direction (as shown for macromolecule 14b). In this way, performs the macromolecule I4a, i4b on the circular path a self-rotation whose frequency is equal to the frequency of the circular path.
  • the electric field is greater than the quotient of the thermal rotational energy and the absolute value of the dipole moment in order to achieve a satisfactory alignment of the macromolecule 14a, 14b.
  • the spindle electrode 26 may have an elongated (cylindrical) shape so that the macromolecule 14a is directed to a spiral path due to the electric field and is set in self-rotation during propagation in the longitudinal direction. Subsequently, the rotating macromolecule 14b can be released axially or tangentially and directed by electromagnetic fields to the detection element 22. In this case, due to the inertia of the macromolecule 14, the self-rotation is maintained and can be decoupled in this way from the binding trajectory.
  • a similar spiral path can also be achieved with a static magnetic field via a Lorentz force, where an angular frequency of the spiral path is given by ⁇ (2), where B is the magnetic field in the region of the spiral path.
  • electrical and magnetic fields can be combined as desired and / or magnetic fields can be used to at least partially define and / or modify the binding trajectory in more detail.
  • the electromagnetic field can be modified by magnetic fields and / or electrode elements and / or the shape of the electrode elements and / or voltage curves so that the binding trajectory as the spiral path in the longitudinal direction has an increasing curvature so that the self-rotation frequency is further increased according to equation (1) with decreasing radius r.
  • a high absolute value of the self-rotation frequency may be preferable for the determination of the dipole moment.
  • the rotating dipole can be seen as a superposition of two vertically oscillating charge oscillations with the frequency ⁇ . After electrodynamic calculation, therefore, the rotation leads to a transmission of a radiation power P at the frequency ⁇
  • the values determined from equation (3) may require rotation frequencies of several MHz in order to exceed conventional detection thresholds. To achieve the highest possible radiation power P, therefore, a pulsed increase in the curvature of the binding trajectory can be advantageous in order to generate a high rotational frequency ⁇ .
  • microwave radiation can also be used to increase the self-rotation frequency or to generate the self-rotation.
  • a specific radiation frequency can be determined and / or a course of different radiation frequencies can be used for excitation.
  • circularly polarized radiation can be used to improve an excitation of self-rotation.
  • RNA ribonucleic acid
  • a mass m of 13.7 ku and a dipole moment p 0 of 280 Debye can be obtained via an ionization process a charged molecule with a charge q of 16 e.
  • an electrode assembly reducing the radii of the electrodes
  • an outer electrode radius r a of 1 cm and an inner electron radius r; of 100 ⁇ ⁇ ⁇ at the top of the electrode a track radius r of, for example 200 ⁇ can be achieved. It follows from equation (l) for an applied voltage U of 100 kV, a rotation frequency ⁇ of 250 MHz.
  • a radiant power P of icr3 follows 6 W per molecule.
  • a molecule number of 1 molecule corresponding to 1 ⁇ g of RNA
  • the interaction with electromagnetic fields 20 can be considered quantum mechanically.
  • the transition elements for rotational vibrations can be equally proportional to the square of the absolute value of the Dipolmoments.
  • the frequency of the radiation may differ from the intrinsic rotation frequency of the macromolecules 14 and of the Depend on occupation of the rotational vibration states. Stimulating self-rotation can modify the occupation of states and, as a result, cause emission of electromagnetic radiation by relaxation in the direction of thermal occupation.
  • electromagnetic radiation may be used to create a population of rotational vibration states away from an equilibrium distribution.
  • the excitation element 18 shown in FIG. 1 may for this purpose comprise radiation emitters in order to provide microwave radiation for the excitation of the macromolecules 14.
  • the excitation element 18 may be combined with the detection element 22 so that an excitation of the self-rotation of the molecules 14 is generated by electromagnetic radiation and the absorption of the electromagnetic radiation as a function of the radiation frequency is measured by the detection element 22.
  • the occupation of the rotational vibration states may be modified by the self-rotation excitation so that the absorption cross-section of the macromolecules 14 is a function of the adjusted frequency and / or radiation power.
  • a higher excitation frequency can also be used via a Raman process in order to determine the absorption cross section of the macromolecules 14 as a function of the excitation of the intrinsic rotation and / or to excite the intrinsic rotation.
  • isomeric and / or conformal molecules having different dipole moments may be spectroscopically separated due to a different absorption cross section for electromagnetic excitation over different population numbers.
  • the detection element 22 may comprise a radiation detector, wherein the selection of the detected radiation frequency can be achieved in any way.
  • a radiation detector such as a semiconductor detector and / or a signal amplifier.
  • the electromagnetic radiation can also be recorded with an antenna and / or a coil and measured with a detector.
  • the selection of the frequency and / or the detection of the radiation can be further improved by homodyne / heterodyne detection.
  • Polarization component have.
  • the dichroism is a polarization dependence of the radiation absorption, in particular the difference of absorption of left / right circularly polarized radiation. Measurement of dichroism may improve identification of rotational transitions.
  • the measured experimental values may then be used by the analysis element 24 to calculate the dipole moment of the macromolecule 14.
  • the analysis element 24 may be, for example, a microprocessor or a specialized circuit such as an ASIC or FPGA.
  • the analysis element 24 may also include software or firmware that uses the measured values to determine the dipole moment as a function of the set mass-to-charge ratio, the particle density in the volume of the detection element 22, and the instrumental parameters of the excitation element 18 and the detection element 22 to calculate.
  • the instrumental parameters may be the applied voltage, the applied magnetic field, the generated radiant power and / or a modulation of the instrumental parameters and / or the particle density.
  • the particle density of the macromolecules 14 in portions of the device 10 may be limited due to technical limitations. It may therefore be preferable to increase the particle density in the volume of the detection element 22 by correspondingly shaping electrodes for generating decelerating electric fields and / or corresponding decelerating magnetic fields to facilitate the measurement of the radiation absorption and / or the radiation emission due to the self-rotation.
  • the particle density in the volume of space can be adjusted via a particle flow through the excitation element 18 and / or the configuration of the decelerating electric and / or magnetic fields. Additionally or alternatively, a collision gas can be used, which can absorb parts of the kinetic energy of the macromolecules.
  • the value of the particle density can be determined, for example, by measuring a radiation absorption, preferably selecting a radiation transition which is independent of the occupation of the rotational vibration states.
  • any type of inference to the particle density such as the induced mirror current due to the movement of the ionized macromolecules 14 in the device 10 and / or after exiting the device 10 and / or the total mass collected of the macromolecules 14 on a vibrating piezoelectric element, be used.
  • the plurality 12 of macromolecules 14 shown in FIG. 1 may be obtained by any method which is preferably compatible with a low pressure environment of the device 10.
  • the macromolecules 14 are evaporated from a (liquid) medium and ionized as a result of the evaporation process or by a downstream ionization process.
  • the ionized macromolecules 14 (which may be fragments of an original macromolecule) preferably retain their conformation and can then be accelerated by electromagnetic fields and / or directed into the device 10.
  • the method comprises exciting Sio of a self-rotation of the macromolecule by interaction of the dipole moment with an electromagnetic field, measuring S12 of a radiation absorption and / or a radiation emission of the macromolecule as a result of the self-rotation and determining S14 of the dipole moment from the radiation absorption and / or the radiation emission of the macromolecule Macromolecule due to the intrinsic rotation of the macromolecule.
  • the method can be implemented by any of the devices described above and allows the measurement of the dipole moment of macromolecules, whereby self-rotation of the macromolecule is excited and the resulting coupling sizes of the macromolecule are measured against an electromagnetic field.

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Abstract

Ein Verfahren zum Bestimmen eines Dipolmoments eines Makromoleküls mit einer Masse von mehr als l ku umfasst ein Anregen einer Eigenrotation des Makromoleküls durch Wechselwirken des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld, ein Messen einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls in Folge der Eigenrotation und ein Bestimmen des Dipolmoments aus der Strahlungsabsorption und/oder der Strahlungsemission des Makromoleküls aufgrund der Eigenrotation des Makromoleküls.

Description

Bestimmung des Dipolmoments von Makromolekülen
Gebiet der Erfindung
[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Charakterisierung und insbesondere auf die Bestimmung der räumlichen Anordnung von Makromolekülen aus biologischen Proben.
Hintergrund
[0002] Die Charakterisierung und Strukturbestimmung von Makromolekülen ist aus wissenschaftlichen wie auch aus medizinischen und technologischen Gründen von Interesse und großer Bedeutung. Dabei steigt mit der Anzahl der Atome in dem Molekül die Anzahl der möglichen räumlichen Konfigurationen und erschwert eine Strukturbestimmung. Gleichzeitig steigt mit der Anzahl der Atome der Aufwand, die Struktur des Makromoleküls durch numerische Verfahren vorherzusagen. Mit steigender Molekülgröße wächst auch die Anzahl energetisch begünstigter räumlicher Anordnungen, die vom theoretischen Energieminimum abweichen und sich funktionell voneinander unterscheiden können und in biologischen Proben nebeneinander vorliegen können. Die räumliche Konfiguration der Atome kann Auswirkungen auf die physikalischen Eigenschaften des Moleküls wie das Dipolmoment, das Trägheitsmoment oder die Ladungsverteilung haben. Durch die Messung der physikalischen Eigenschaften wie des Dipolmoments können somit Rückschlüsse auf die Struktur des Makromoleküls gezogen werden und eine Identifikation, Charakterisierung oder Strukturvorhersage der Makromoleküle verbessert werden. Insbesondere können verschiedene räumliche Anordnungen desselben Makromoleküls voneinander unterschieden werden.
[0003] Üblicherweise wird das Dipolmoment durch numerische Berechnung anhand einer vorgegebenen Molekülkonfiguration bestimmt. Wenn es möglich ist, eine größere Menge des Makromoleküls zu isolieren, kann eine experimentelle Abschätzung über die messbare Permittivität, den Brechungsindex oder über den Stark-Effekt erfolgen. Dabei führt jedoch die Anwesenheit eines Lösungsmittels häufig zu großen Ungenauigkeiten der Methode, und Substanzgemische wie biologische Proben weisen im Allgemeinen eine Vielzahl unterschiedlicher Makromoleküle auf, so dass experimentelle Werte nicht strukturspezifisch sind. Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung des Dipolmoments außerhalb eines Lösungsmittels und frei von anderen Matrixbestandteilen, bei denen die Moleküle isoliert und in geringer Anzahl analysiert werden können, ist daher für die Strukturanalyse von Gemischen von Makromolekülen und insbesondere für die Charakterisierung isomerer oder konformationsisomerer Moleküle, das heißt sich lediglich auf Grund der räumlichen Anordnung unterscheidende Molekülspezies, wünschenswert.
[0004] In der Patentanmeldung US 9,196,468 B2 konnte gezeigt werden, dass die Driftgeschwindigkeit von isomeren Molekülen in einem Transportgas bei einer angelegten Spannung unterschiedlich sein kann und dass der Unterschied in der Driftgeschwindigkeit auf das unterschiedliche Dipolmoment zurückgeführt werden kann. Der Wert des Dipolmoments wurde jedoch nicht experimentell bestimmt, sondern war durch numerische Berechnung bekannt.
[0005] Die Patentanmeldung US 7,170,053 B2 offenbart eine Technik, um Moleküle in einer Elektrodenanordnung durch elektrische Felder auszurichten und anhand der Driftgeschwindigkeit der Moleküle in einem Gasmedium Rückschlüsse auf die richtungs abhängige Kollisionsquerschnittfläche zu ziehen. Die Ausrichtung ist dabei abhängig von dem Dipolmoment der Moleküle.
[0006] In der Patentanmeldung US 2006/0214096 Ai wird eine Elektrodenanordnung zur Erzeugung eines Hexapolfelds offenbart, dessen stabile Trajektorie von dem Verhältnis des Dipolmoments zur Masse eines ungeladenen Moleküls abhängt. Dazu müssen die Moleküle in einem kleinen Raumelement eingefangen, sehr starken Wechselspannungen ausgesetzt und ihre Temperatur stark verringert werden.
[0007] Es ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Dipolmoment eines Makromoleküls aus einer biologischen Probe mit größerer Genauigkeit zu bestimmen.
Allgemeine Beschreibung der Erfindung
[0008] Die Erfindung betrifft eine Bestimmung des Dipolmoments von Makromolekülen mit einem Verfahren und einer Vorrichtung nach den unabhängigen Ansprüchen. Die abhängigen Ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Die unterschiedlichen Ausführungsmerkmale dieser Ausführungsformen sind dabei kombinierbar und können zusammenwirken, um die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen.
[0009] In einem ersten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Bestimmen eines Dipolmoments eines Makromoleküls mit einer Masse von mehr als 1 ku. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei ein Anregen einer Eigenrotation des Makromoleküls durch Wechselwirken des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld, ein Messen einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls in Folge der Eigenrotation und ein Bestimmen des Dipolmoments aus der gemessenen Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission. [0010] Bei leichteren Molekülen kann sowohl die Anreicherung als auch die direkte Messung des Dipolmoments verglichen mit Makromolekülen einfacher sein. Beispielsweise kann das Rotationsschwingungsspektrum eines leichten Moleküls durch Spektroskopie direkt aufgenommen werden. Diese Messungen können jedoch gerade im Fall von Makromolekülen technisch schwierig sein. Insbesondere nimmt die energetische Separation von Rotationszuständen mit steigender Masse (Trägheitsmoment) des Moleküls ab, während gleichzeitig die Linienbreite der Übergänge durch eine steigende Vielzahl von Schwingungszuständen zunehmen kann, sodass die notwendige Temperatur des Moleküls, welche ein Auflösen der Zustände erlaubt, stark verringert werden müsste. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann stattdessen die Kopplung des Dipolmoments an das elektromagnetische Feld bzw. die Bestimmbarkeit eines spektroskopischen Signals durch Anregen einer Eigenrotation verstärkt werden. Die Kopplungsgröße der Eigenrotation an das elektromagnetische Feld kann dabei direkt von dem Wert des Dipolmoments abhängen und damit das Bestimmen des Dipolmoments aufgrund der Eigenrotation erlauben.
[0011] Makromoleküle im Sinne der Offenbarung können Moleküle sein, die eine Sekundärstruktur und/oder eine Tertiärstruktur und/oder eine Quartärstruktur aufweisen und/oder eine Masse von über 1 ku bzw. über 10 ku aufweisen. Moleküle mit einer solchen Struktur können stark unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufgrund ihrer Konformation aufweisen, wobei die Konformation sich nicht direkt aus der chemischen Zusammensetzung des Makromoleküls ergeben kann. Beispiele für Makromoleküle sind Biopolymere wie Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Polyphenole oder Proteine oder nichtpolymere Moleküle, wie Fette oder Makrocyclen (wie z.B. das Protein Hämoglobin mit einer Masse von 64 ku und einem Dipolmoment von 520 Debye).
[0012] Als elektromagnetisches Feld im Sinne der Offenbarung kann ein Feld gelten, welches eine magnetische und/oder eine elektrische Komponente umfasst. Ein elektromagnetisches Feld kann damit ein statisches elektrisches Feld und/oder ein statisches magnetisches Feld und/oder ein elektrodynamisches Feld, wie ein Strahlungsfeld, umfassen. Insbesondere können im Falle einer endlichen Ausbreitungsgeschwindigkeit des Makromoleküls sowohl statische elektrische als auch statische magnetische Felder verwendet werden, um Eigenrotationen des Makromoleküls anzuregen. Gleichermaßen können zeitlich veränderliche elektrische und/oder magnetische Felder und/oder Kombinationen von elektrischen und magnetischen Feldern verwendet werden, um eine Anregung zu erzeugen.
[0013] Zur Kontrolle einer Teilchenbahn und einer Isolation der Makromoleküle kann eine
Niedrigdruckumgebung, ein Vakuum oder ein Teilvakuum (d.h. Abschnitte niedrigen
Drucks) verwendet werden. Bei einem niedrigen Umgebungsdruck kann aufgrund der
Abnahme von Stößen mit anderen Molekülen die freie Weglänge eines Moleküls derart erhöht sein, dass seine Trajektorie ballistisch wird. Dazu wird in Ausführungsformen ein zumindest abschnittweises Hochvakuum oder Ultrahochvakuum mit einem Druck unterhalb von 10-7 mbar eingerichtet. Infolgedessen kann die Teilchenbahn und/oder die Eigenrotation und/oder die Isolation der Makromoleküle besser kontrolliert werden.
[0014] Das Makromolekül kann ein elektrisch geladenes Molekül sein, insbesondere ein ionisiertes Molekül.
[0015] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich ein Ionisieren des Makromoleküls.
[0016] Dabei wird eine bestimmte Menge an Elementarladungen dem Makromolekül hinzugefügt oder entnommen, sodass das Makromolekül eine endliche elektrostatische Ladung erhält. Dies erlaubt die Kontrolle der Trajektorie und Ausbreitungsgeschwindigkeit des Makromoleküls durch Verwendung elektrischer und/oder magnetischer Felder. Das Ionisieren des Makromoleküls kann dabei aufgrund eines speziellen Evaporationsverfahrens und/oder eines gezielten Ionisierungsverfahrens, wie Stoßionisation und/oder Photoionisation geschehen.
[0017] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich ein Evaporieren und/oder Ionisieren des Makromoleküls aus einer Probe.
[0018] In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren zusätzlich ein Evaporieren und/oder Ionisieren des Makromoleküls aus einer Probe mit einem im Wesentlichen konformationserhaltenden Verfahren, insbesondere durch Elektrosprayionisation, Laser- Desorptionsionisation, wie MALD-Ionisation (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) oder SELD-Ionisation (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization), oder APC-Ionisation (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) bzw. APP-Ionisation (Athmospheric Pressure Photoionization) .
[0019] Ein im Wesentlichen konformationserhaltendes Verfahren führt zu einer Evaporation des Makromoleküls, wobei die Konformation des Makromoleküls oder von Bruchstücken des Makromoleküls erhalten bleibt. Dabei kann in einigen Ausführungsformen das Makromolekül über ein angelegtes elektrisches Feld, eine lokale elektromagnetische Anregung, wie einen Laser, oder aufgrund eines Gasflusses (wie zum Beispiel aufgrund eines Stickstoffgasstroms) zerstäubt werden und kann aufgrund des Evaporierens und/oder einer nach- bzw vorgeschalteten Interaktion mit einem elektromagnetischen Feld und/oder einem geladenen Teilchen und/oder einer chemischen Reaktion ionisiert werden. Auf diese Weise kann ein Makromolekül zur weiteren Analyse von einem Medium getrennt werden. [0020] In einigen Ausführungsformen können auch chromatographische und/oder elektrophoretische Trennverfahren verwendet werde, um das Makromolekül von Matrixbestandteilen und anderen Komponenten räumlich zu separieren.
[0021] Die Trennverfahren können der Evaporation und/oder Ionisation des Makromoleküls vor- und/oder nachgeschaltet sein und können in einer Gasphase und/oder einer flüssigen Phase des Makromoleküls bzw. eines Mediums durchgeführt werden. Beispielsweise können Kapillarelektrophorese und/oder Gaschromatographie und/oder Flüssigchromatographie und/oder Chromatographie mit überkritischen Fluiden verwendet werden, um das Makromolekül zu filtern.
[0022] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich ein Filtern des Makromoleküls entsprechend seines Masse-zu-Ladung- Verhältnisses.
[0023] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zusätzlich ein Filtern des Makromoleküls entsprechend seiner Formfaktoren anhand seiner Trajektorie und/oder Mobilität in mit Gas gefüllten Driftzellen, bei denen statische und/oder oszillierende elektrische bzw. magnetische Felder angelegt sein können. Die Formfaktoren können die Größe, die Geometrie und/oder den Stoßquerschnitt des Makromoleküls umfassen. Die Formfaktoren können außerdem abhängig von einer Ausrichtung und/oder Trajektorie bedingt durch die angelegten elektrischen und/oder magnetischen Felder bestimmt werden und/oder entsprechend zum Filtern des Makromoleküls verwendet werden.
[0024] Beispielsweise kann ein Verfahren wie Ionenmobilitätsspektroskopie verwendet werden, um das Makromolekül entsprechend seiner Größe und/oder Geometrie und /oder Stoßquerschnitt zu filtern.
[0025] In einigen Ausführungsformen wird zum Filtern des Makromoleküls eine Elektrodenanordnung mit einem elektrischen Gleich- und/oder Wechselfeld und/oder einem magnetischen Feld verwendet, wobei eine stabile Trajektorie und/oder eine kollisionsfreie Trajektorie von dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis abhängen. Beispielsweise können Quadrupolfallen (oder Multipolfallen, wie Hexapolfallen, Oktapolfallen, usw.), Flugzeitmessungen, Orbitrapfallen, gekrümmte Bahnen aufgrund eines Magnetfelds und/oder elektrischen Feldes usw. verwendet werden, um das Makromolekül entsprechend seines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses zu filtern.
[0026] Die verschiedenen Verfahren, um das Makromolekül zu filtern, können dabei in beliebiger Reihenfolge und Kombination verwendet werden, um Makromoleküle mit einem entsprechenden Masse-zu-Ladung-Verhältnis zu isolieren und für die Bestimmung des Dipolmoments bereitzustellen.
[0027] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls ein Anregen einer gebundenen Rotation des Makromoleküls auf einer bindenden Trajektorie.
[0028] Eine bindende Trajektorie oder gebundene Bahn im Sinne der Offenbarung kann eine Trajektorie sein, bei der ein Teilchen, wenn aus einer bestimmten Richtung betrachtet, gegenüber einer Achse entlang der bestimmten Richtung einen endlichen Winkel, insbesondere von mindestens 2π, überstreicht. Beispielsweise kann eine bindende Trajektorie eine Kreisbahn, eine Ellipse, eine Spiralbahn, eine Rotationsschwingung oder Kombinationen der vorgenannten Bahnen/Schwingungen oder Ähnliches umfassen. Eine bindende Trajektorie im Sinne der Offenbarung erfordert insbesondere nicht notwendigerweise, dass nach dem Überstreichen eines Winkels von 2π das Makromoleküle an dem selben Ort, an derselben Projektion wenn entlang der bestimmten Richtung betrachtet, oder in der gleichen Entfernung von der Achse ist, obwohl dies in einigen Ausführungsformen so ist. Für eine bindende Trajektorie im Sinne der Offenbarung kann außerdem eine Rotationsfrequenz definiert werden, die dem Kehrwert der Zeit (Umlaufzeit) entsprechen kann, die das Teilchen gegenüber der Achse entlang der bestimmten Richtung zum Überstreichen eines Winkels von 2π benötigt.
[0029] Dabei führt das Überstreichen des endlichen Winkels in einem inhomogenen Kraftfeld und/oder aufgrund einer inhomogenen Wirkung des Kraftfelds auf das Makromolekül zu einer Rotation des Makromoleküls um eine Trägheitsachse. Eine Wirkung auf das Makromolekül kann inhomogen sein, wenn sie zum Anregen der Rotation um die Trägheitsachse auf einer bindenden Trajektorie geeignet ist. Als analoger Effekt kann die gebundene Rotation des Mondes um die Erde betrachtet werden, bei der, aufgrund der stärkeren gravitationsbedingten Anziehungskraft auf die nähere Seite des (leicht elliptischen) Mondes, stets dieselbe Seite des Mondes in Richtung der Erde zeigt. Durch den Effekt der gebundenen Rotation kann ein Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls durch ein Beeinflussen der Trajektorie des Makromoleküls erreicht werden.
[0030] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregen der gebundenen Rotation des Makromoleküls ein Wechselwirken des Makromoleküls mit einem elektrischen Feld in einer Elektrodenanordnung. [0031] In einigen Ausführungsformen umfasst die Elektrodenanordnung eine Spindelelektrode, die eine anziehende Kraftwirkung auf ein ionisiertes Makromolekül bewirkt, sodass eine bindende Trajektorie des Makromoleküls erfolgen kann.
[0032] Das elektrische Feld kann an das Dipolmoment des Makromoleküls koppeln und zu einer, zumindest teilweisen, Ausrichtung des Makromoleküls entlang einer Verbindungslinie zwischen dem Malcromolekül und der Spindelelektrode führen, so dass eine gebundene Rotation des Makromoleküls erzeugt werden kann.
[0033] Die Elektrodenanordnung kann außerdem eine Fasselektrode umfassen, die eine abstoßende Kraftwirkung auf das Makromolekül bewirkt und damit die bindende Trajektorie begünstigen kann.
[0034] Dazu kann die Fasselektrode die Spindelelektrode umschließen, beispielsweise in einer Anordnung einer inneren Spindelelektrode und einer äußeren Fasselektrode.
[0035] In Ausführungsformen kann die Elektrodenanordnung Abschnitte umfassen, in der die Fasselektrode koaxial um die innere Spindelelektrode angeordnet ist und damit einen Zylinderkondensator bildet. Dabei wird unter einem Zylinder ein mathematischer Zylinder oder Kegelstumpf mit beliebiger Grundfläche verstanden und daher insbesondere kein kreisförmiger Querschnitt der Elektroden vorausgesetzt, um eine bindende Trajektorie anzuregen. Dazu kann außerdem die Elektrodenanordnung Rillen und/oder Finnen und/oder Vorsprünge in den Elektroden umfassen, um die bindende Trajektorie näher zu definieren, und/ oder abgerundete Flächen aufweisen.
[0036] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregen der gebundenen Rotation ein Erhöhen einer Rotationsfrequenz der bindenden Trajektorie des Makromoleküls, insbesondere durch Erhöhen einer Krümmung der bindenden Trajektorie. Das Erhöhen der Krümmung kann beispielsweise ein Verringern eines Krümmungsradius der bindenden Trajektorie umfassen.
[0037] Die Kopplung des Makromoleküls an ein elektrodynamisches Feld, wie die Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission, kann von dem absoluten Wert der Rotationsfrequenz abhängen. Zum Erhöhen der Rotationsfrequenz kann insbesondere ein gepulstes Erhöhen der Krümmung der bindenden Trajektorie verwendet werden, um technische Limitierungen zu überwinden. Beispielsweise kann die erreichbare Krümmung der bindenden Trajektorie durch eine maximale Gleichspannung, elektrische Felddichte, minimalen Elektrodenradius, usw. begrenzt sein. [0038] In Ausführungsformen kann die Krümmung erhöht werden, indem ein Spannungspuls an einem Element der Elektrodenanordnung angelegt wird.
[0039] In weiteren Ausführungsformen kann die Krümmung der bindenden Trajektorie durch Anpassen des Querschnitts der Spindelelektrode (bspw. durch Zuspitzen) und/oder entsprechendes Anpassen des Querschnitts der Fasselektrode erhöht werden.
[0040] In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Anregen der gebundenen Rotation und/oder des Erhöhens der Krümmung ein Wechselwirken des Makromoleküls mit einem magnetischen Feld.
[0041] Ein ionisiertes Makromolekül kann in einem Magnetfeld aufgrund der Lorentzkraft abgelenkt werden und kann auf eine bindende Trajektorie gebracht werden. Die Lorentzkraft kann entgegengesetzte Kraftrichtungen auf die Pole des Dipols bewirken, und damit zu einer gebundenen Rotation des Makromoleküls auf der bindenden Trajektorie führen.
[0042] Das Magnetfeld kann verwendet werden, um die bindende Trajektorie in der Elektrodenanordnung näher zu bestimmen und/oder durch statische und/oder gepulste magnetische Felder in einem Abschnitt der Elektrodenanordnung ein Erhöhen der Krümmung zu bewirken.
[0043] Die Makromoleküle können nach dem Anregen der gebundenen Rotation aus der Elektro denanordnung axial und/oder tangential entlassen werden.
[0044] In einigen Ausführungsformen können die Makromoleküle fokussiert und in ein bestimmtes Raumvolumen geleitet werden, um die Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission zu messen.
[0045] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls eine elektromagnetische Anregung, insbesondere eine Mikrowellenanregung, des Makromoleküls, vorzugsweise durch Strahlungsabsorption.
[0046] In einem Plattenkondensator kann ein Dipol sich entlang der elektrischen Feldrichtung ausrichten. Durch Umpolen des Plattenkondensators kann die Ausrichtung umgedreht werden, und insbesondere kann durch zyklisches Umpolen des Plattenkondensators eine Drehbewegung des Makromoleküls bewirkt werden. Analog kann ein eingestrahltes elektrisches Wechselfeld, wie ein Strahlungsfeld, eine Rotation des Makromoleküls bewirken. Quantenmechanisch betrachtet koppelt das Strahlungsfeld an die Rotationszustände des Makromoleküls und kann eine Eigenrotation des Makromoleküls anregen. Die klassische und/oder quantenmechanische Betrachtung kann sich dabei aus der Größe und Temperatur des Makromoleküls ergeben.
[0047] Zum Erhöhen der Rotationsfrequenz des Makromoleküls können in Ausführungsformen außerdem die Anregung des Makromoleküls durch eine bindende Trajektorie und durch eine elektromagnetische Strahlungsanregung nachgeschaltet und/oder kombiniert werden. Auf diese Weise kann eine bestimmte Rotationsfrequenz der Eigenrotation zur Detektion des Dipolmoments erreicht werden.
[0048] In einigen Ausführungsformen kann die Moleküldichte entlang der bindenden Trajektorie und/oder während des Anregens durch eine elektromagnetische Strahlungsanregung aufgrund von Stoßquerschnitten und/oder Molekülflüssen und/oder Wechselwirkungen eingeschränkt sein. Damit kann die Moleküldichte, welche proportional zur gemessenen Größe der Strahlungsemission und/oder Strahlungsabsorption sein kann, nach dem Anregen der Eigenrotation begrenzt sein.
[0049] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ein Abbremsen einer Ausbreitungsgeschwindigkeit des Makromoleküls, insbesondere zum Verdichten einer Vielzahl von Makromolekülen.
[0050] Beispielsweise kann die Elektrodenanordnung Bremselektroden umfassen, welche die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Makromoleküle abbremsen und die Moleküldichte in einem bestimmten Raumvolumen erhöhen.
[0051] In einigen Ausführungsformen umfasst das Messen ein Messen der Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission bei einer Frequenz der Eigenrotation des Makromoleküls.
[0052] Dabei kann die Eigenschaft des rotierenden Makromoleküls ausgenutzt werden, ein mit der Eigenrotationsfrequenz schwingendes Ladungspaar zu implementieren.
[0053] In einigen Ausführungsformen umfasst das Messen ein Messen eines frequenzabhängigen und/oder polarisationsabhängigen Absorptionsquerschnitts des Makromoleküls.
[0054] Dabei kann, beispielsweise für geringere Rotationsfrequenzen, die Modifikation der Besetzungszustände der Rotationsschwingungen des Makromoleküls durch die Anregung der Eigenrotation ausgenutzt werden, um an das Dipolmoment des Makromoleküls koppelnde Strahlungsübergänge identifizieren und/oder analysieren zu können. [0055] In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zum Bestimmen eines Dipolmoments eines Makromoleküls mit einer Masse von mehr als 1 ku, welche ein Anregungselement zum Anregen einer Eigenrotation des Makromoleküls durch Wechselwirken des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld, ein Detektionselement zum Messen einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls in Folge der Eigenrotation und ein Analyseelement zum Bestimmen des Dipolmoments aus der gemessenen Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission.
[0056] In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anregungselement zum Anregen einer gebundenen Rotation des Makromoleküls auf einer bindenden Trajektorie eingerichtet.
[0057] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Anregungselement eingerichtet, eine Rotationsfrequenz der bindenden Trajektorie zu erhöhen, insbesondere durch Erhöhen einer Krümmung der bindenden Trajektorie.
[0058] In einigen Ausführungsformen umfasst das Anregungselement eine Elektrodenanordnung, die insbesondere die bindende Trajektorie des Makromoleküls begrenzen und/oder eingerichtet sind, die gebundene Rotation durch ein elektrisches Feld anzuregen.
[0059] Insbesondere kann, wie zuvor beschrieben, eine innere Spindelelektrode eine anziehende Kraftwirkung auf das Makromolekül und/oder eine äußere umschließende Fasselektrode eine abstoßende Kraftwirkung auf das Makromolekül bewirken.
[0060] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregungselement Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes, um die bindende Trajektorie anzuregen. Geeignete Mittel können stromdurchflossene Leiter, insbesondere in Form einer Spule, und/oder Materialien mit einer magnetischen Remanenz sein.
[0061] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Anregungselement eine Strahlungs quelle, und insbesondere eine Mikrowellenquelle, zum Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls.
[0062] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zusätzlich Mittel zum Erzeugen eines elektromagnetischen Feldes zum Verdichten einer Vielzahl von Makromolekülen. [0063] In Ausführungsformen kann die Elektrodenanordnung Elektroden zum Abbremsen der Makromoleküle aufweisen, welche insbesondere nachfolgend der Anregung durch das Anregungselement eingerichtet sind, um die rotierenden Makromoleküle in einem bestimmten Raumvolumen zu konzentrieren.
[0064] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zusätzlich ein Massenspektrometer zum Filtern des Makromoleküls.
[0065] Das Massenspektrometer kann dem Anregungselement vorgeschaltet sein, um eine Vielzahl von Makromolekülen, bspw. aus einer biologischen Probe, zu filtern und deren Anzahl in dem Anregungselement zu begrenzen. Das Massenspektrometer kann das Malcromolekül entsprechend seines Masse-zu-Ladung-Verhältnisses wie in einem der zuvor beschriebenen Verfahren filtern.
[0066] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung zusätzlich ein Evaporationselement zum Bereitstellen und/oder Ionisieren des Makromoleküls aus einer Probe, insbesondere durch Elektrosprayionisation, Laserdesorptionsionisation, wie MALD- Ionisation oder SELD-Ionisation, oder APC-Ionisation bzw. APP-Ionisation.
[0067] Für das Bereitstellen und/oder Ionisieren des Makromoleküls kann insbesondere ein zuvor beschriebenes im Wesentlichen konformationserhaltendes Verfahren verwendet werden, sodass die Konformation des Makromoleküls nach der Evaporation zumindest teilweise erhalten bleibt.
[0068] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Detektionselement Mittel zum Messen der Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission bei einer Frequenz der Eigenrotation des Makromoleküls. Geeignete Mittel können Strahlungsdetektoren oder Detektoren elektromagnetischer Felder umfassen, wie beispielsweise Dioden, Antennen und/oder Spulen gekoppelt mit Signalverstärkern und/oder Halbleiterschaltungen, in Verbindung mit Strahlungsquellen wie Dioden, Laser, Maser, Schwingkreise, usw..
[0069] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Detektionselement Mittel zum Messen eines frequenzabhängigen und/oder eines polarisationsabhängigen Absorptionsquerschnitts des Makromoleküls. Geeignete Mittel können dabei die zuvor beschriebenen Detektoren in Verbindung mit polarisationsabhängigen Transmittern, Reflektoren und/oder Absorbern und entsprechende Strahlungsquellen mit kontrollierbarer Strahlungsfrequenz und/oder Polarisation umfassen. [0070] Die Vorrichtungen können weiterhin so konfiguriert sein, dass sie die Verfahrensschritte der verschiedenen zuvor beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens implementieren und/oder Mittel oder Vorrichtungen umfassen, welche so konfiguriert sind, dass sie die Verfahrensschritte der verschiedenen zuvor beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens implementieren.
Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen
[0071] Die erfindungsgemäßen Eigenschaften und die verschiedenen Vorteile der Verfahren und der Vorrichtungen erschließen sich am besten aus einer detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen mit Verweis auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei:
[0072] Fig. 1 eine schematische Vorrichtung zum Messen des Dipolmoments veranschaulicht ;
[0073] Fig. 2 eine schematische Zeichnung zur Veranschaulichung der Anregung der Eigenrotation in einer Zylinderkondensatorgeometrie darstellt;
[0074] Fig. 3 eine beispielhafte bindende Trajektorie eines Moleküls mit einem Dipolmoment um eine Spindelelektrode veranschaulicht;
[0075] Fig. 4 eine beispielhafte bindende Trajektorie eines Moleküls auf einer Bahn mit zunehmender Krümmung und anschließender axialer Entlassung veranschaulicht; und
[0076] Fig. 5 ein Flussdiagram für ein beispielhaftes Verfahren zur Bestimmung des Dipolmoments veranschaulicht.
[0077] Wie in Fig. 1 zu sehen, kann eine Vorrichtung 10 zur Bestimmung des Dipolmoments durch eine sequentielle Anordnung von verschiedenen Elementen implementiert werden. Dabei wird zuerst eine Vielzahl 12 von Makromolekülen 14 vorzugsweise in einem Vakuumbereich der Vorrichtung 10 bereitgestellt. Beispielsweise können aus einem Medium durch Elektrosprayionisation geladene Makromolekülionen 14 bereitgestellt werden. Elektrosprayionisation und vergleichbare Verfahren erzeugen dabei vorzugsweise mehrfach geladene Ionen, um eine Manipulation der Makromoleküle durch elektromagnetische Felder zu erleichtern.
[0078] Die Makromoleküle 14 können anschließend in einem Massenspektrometer 16, beispielsweise implementiert durch eine Quadrupolfalle mit geeigneter Frequenz und Spannung, entsprechend des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses getrennt werden. [0079] Die zu untersuchenden Moleküle 14 mit einem am Massenspektrometer 16 ausgewählten Masse-zu-Ladung- Verhältnis können dann in dem Anregungselement 18 mit einer Eigenrotation versehen werden. Die Eigenrotation koppelt über das Dipolmoment der Makromoleküle 14 an elektrodynamische Felder 20 und führt damit zur Aussendung von elektromagnetischer Strahlung sowie zu einer Variation des Absorptionsspektrums der Makromoleküle 14 aufgrund der modifizierten Besetzungszustände.
[0080] Ein Detektionselement 22 kann emittierte Strahlung messen und/oder eine Variation eines Absorptionsquerschnitts aufgrund der Eigenrotation der Makromoleküle 14 bestimmen. Die bestimmten experimentellen Werte können anschließend von einem Analyseelement 24 genutzt werden, um den Wert des Dipolmoments zu bestimmen.
[0081] Die Makromoleküle 14 können aus dem Anregungselement 18 entlassen werden, um ein Wechselwirken der Makromoleküle 14 mit elektromagnetischen Feldern 20 aufgrund der Eigenrotation von einem Wechselwirken aufgrund der Anregung durch das Anregungselement 18 durch räumliche Trennung zu entkoppeln. Dazu können geeignete elektrische und magnetische Felder verwendet werden, um die Makromoleküle 14 einzufangen und in einem bestimmten Raumvolumen im Bereich des Detektionselements 22 zu fokussieren. Insbesondere kann die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Makromoleküle 14 reduziert werden, um eine Moleküldichte in dem Raumvolumen zu erhöhen, sodass eine Detektion einer Strahlungsemission und/oder Strahlungsabsorption durch die Makromoleküle 14 erleichtert wird. Es ist jedoch auch möglich, das Detektionselement 22 mit dem Anregungselement 18 zu kombinieren.
[0082] Erfindungsgemäß kann die Vorrichtung 10 in einem Vakuum oder einer Niedrigdruckumgebung realisiert werden. Dadurch können Stöße mit anderen Molekülen minimiert werden und damit die Eigenrotation und/oder Ausbreitungsgeschwindigkeit erhalten werden. In einer Niedrigdruckumgebung kann dadurch die Kontrolle über die Trajektorie und Eigenrotation der Makromoleküle 14 erhöht werden. Jedoch kann in einigen Ausführungsformen eine zumindest abschnittsweise Druckerhöhung zur Bewirkung einer Relaxation und/oder einer Abbremsung und/oder einer Messung weiterer Parameter, wie des Stoßquerschnitts, wünschenswert sein. Beispielsweise kann durch Implementierung einer C-Falle in der Vorrichtung 10 mit einem Kollisionsgas und mit einer Elektrodenanordnung, an welche Gleichspannungen und/oder Wechselspannungen angelegt werden können, ein Ionenpaket in einem begrenzten Raumvolumen breitgestellt werden.
[0083] Zur Anregung der Eigenrotation der Makromoleküle 14 kann eine Elektrodenanordnung verwendet werden, wie sie in Fig. 2 in einer schematischen Schnittdarstellung gezeigt ist. Das beispielhafte Anregungselement 18 umfasst dabei eine innere Spindelelektrode 26 und eine äußere Fasselektrode 28, die mit entgegengesetzten Vorzeichen elektrisch geladen sind. Beispielsweise weist die Spindelelektrode 26 eine positive Ladung auf, während die Fasselektrode 28 eine negative Ladung aufweist. Eine beispielhafte Bahn des Makromoleküls 14 in der Elektrodenanordnung ist mit den Makromolekülen 14a und 14b in zwei Positionen veranschaulicht. In der Darstellung tritt ein ionisiertes (negativ geladenes) Makromolekül 14a mit endlicher Ausbreitungsgeschwindigkeit und anfangs zufälliger räumlicher Ausrichtung in das Anregungselement 18 ein und wird in dem elektrischen Feld zwischen der Spindelelektrode 26 und der Fasselektrode 28 durch die Coulombkraft FEI auf eine bindende Trajektorie hin zu der Position des rotierenden Makromoleküls 14b gelenkt. Im idealisierten Fall einer Kreisbahn ist die Rotationsfrequenz ω durch
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gegeben, wobei U die Spannung zwischen der Spindelelektrode 26 und der Fasselektrode 28, q die Ladung des Makromoleküls I4a,i4b, m die Masse des Makromoleküls I4a,i4b, ra der innere Radius der Fasselektrode 28, r; der äußere Radius der Spindelelektrode 26 und r der Radius der Kreisbahn ist. Aufgrund der logarithmischen Abhängigkeit des elektrischen Potenzials U vom Radius r der zylindrischen Elektrodenanordnung muss die bindende Trajelctorie keine elliptische Form haben und muss nicht notwendigerweise eine geschlossene Trajektorie sein, sondern kann allgemein eine komplexe Kombination von Ellipsen und Rotationsschwingungen umfassen und kann weiterhin durch Abweichung der Elektrodengeometrie modifiziert werden. Die grundlegenden Überlegungen werden dadurch jedoch nicht signifikant abgeändert.
[0084] Gleichzeitig wirkt auf das zunächst zufällig orientierte Makromolekül 14a ein Drehmoment aufgrund der Interaktion des Dipolmoments mit dem elektrischen Feld der Elektrodenanordnung. Daher richtet sich beim Durchlaufen der bindenden Trajektorie das Makromolekül 14a derart aus, dass das Dipolmoment des Makromoleküls 14a im Wesentlichen parallel zu der elektrischen Feldrichtung ist (wie gezeigt für das Makromolekül 14b). Auf diese Weise vollführt das Makromolekül I4a,i4b auf der Kreisbahn eine Eigenrotation, deren Frequenz gleich der Frequenz der Kreisbahn ist. Dabei ist es vorzugswürdig, dass das elektrische Feld größer als der Quotient aus der thermischen Rotationsenergie und dem Absolutwert des Dipolmoments ist, um eine zufriedenstellende Ausrichtung des Makromoleküls 14a, 14b zu erreichen. Diese Bedingung ist für elektrische Feldstärken von einigen kV/mm für übliche Werte von Dipolmomenten (100-4000 Debye) bei Raumtemperatur erfüllt und kann in einer Vakuumumgebung ohne Spannungsdurchbrüche gewährleistet werden. Jedoch wird auch bei geringeren Feldstärken eine (teilweise) Ausrichtung des Dipolmoments und damit eine Anregung der Eigenrotation erzeugt werden. Bei diesen Werten einer Feldstärke und einem inneren Radius einer Spindelelektrode von wenigen Millimetern können entsprechend den vorhergehenden Überlegungen Eigenrotationsfrequenzen des Makromoleküls 14a, 14b von einigen MHz erreicht werden.
[0085] Wie in Fig. 3 gezeigt, kann die Spindelelektrode 26 eine langgestreckte (zylindrische) Form haben, so dass das Makromolekül 14a aufgrund des elektrischen Feldes auf eine Spiralbahn gelenkt wird und während der Ausbreitung in longitudinaler Richtung in eine Eigenrotation versetzt wird. Anschließend kann das rotierende Makromolekül 14b axial oder tangential entlassen werden und durch elektromagnetische Felder zu dem Detektionselement 22 geleitet werden. Dabei bleibt aufgrund der Trägheit des Makromoleküls 14 die Eigenrotation erhalten und kann auf diese Weise von der bindenden Trajektorie entkoppelt werden.
[0086] Eine ähnliche Spiralbahn kann außerdem mit einem statischen magnetischen Feld über eine Lorentzkraft erreicht werden, wobei eine Kreisfrequenz der Spiralbahn nach ω (2) gegeben ist, wobei B das magnetische Feld im Bereich der Spiralbahn ist. Grundsätzlich können dabei elektrische und magnetische Felder beliebig kombiniert werden und/oder magnetische Felder verwendet werden, um die bindende Trajektorie zumindest abschnittsweise näher zu definieren und/oder zu modifizieren.
[0087] Wie in Fig. 4 gezeigt, kann das elektromagnetische Feld durch magnetische Felder und/oder Elektrodenelemente und/oder die Formgebung der Elektrodenelemente und/oder Spannungsverläufe so modifiziert sein, dass die bindende Trajektorie wie die Spiralbahn in longitudinaler Richtung eine zunehmende Krümmung aufweist, sodass die Eigenrotationsfrequenz nach Gleichung (1) mit abnehmendem Radius r weiter erhöht wird.
[0088] Ein hoher Absolutwert der Eigenrotationsfrequenz kann für die Bestimmung des Dipolmoments vorzugswürdig sein. Der rotierende Dipol kann, klassisch betrachtet, als eine Überlagerung zweier senkrecht aufeinander stehender Ladungsschwingungen mit der Frequenz ω gesehen werden. Nach elektrodynamischer Rechnung führt daher die Rotation zu einer Aussendung einer Strahlungsleistung P bei der Frequenz ω nach
_ μοΡο 2ω* ( . wobei μ0 die magnetische Feldkonstante, p0 das Dipolmoment des Moleküls und c die Lichtgeschwindigkeit ist. Wie aus Gleichung (3) zu erkennen, ist die Strahlungsleistung P abhängig von dem Quadrat des Dipolmoments p0 und lässt damit Rückschlüsse auf den Absolutwert des Dipolmoments zu.
[0089] Die aus Gleichung (3) bestimmten Werte können Rotationsfrequenzen von mehreren MHz voraussetzen, um übliche Detektionsschwellen zu überschreiten. Zum Erreichen einer möglichst hohen Strahlungsleistung P kann daher ein gepulstes Erhöhen der Krümmung der bindenden Trajektorie vorteilhaft sein, um eine hohe Rotationsfrequenz ω zu erzeugen. Zusätzlich oder alternativ kann auch eine Mikrowellenstrahlung verwendet werden, um die Eigenrotationsfrequenz zu erhöhen oder die Eigenrotation zu erzeugen. Dazu kann eine bestimmte Strahlungsfrequenz festgelegt werden und/oder ein Verlauf von verschiedenen Strahlungsfrequenzen zur Anregung verwendet werden. Dabei kann insbesondere aufgrund der Drehimpulserhaltung zirkulär polarisierte Strahlung verwendet werden, um eine Anregung der Eigenrotation zu verbessern.
[0090] Beispielsweise kann für das Makromolekül 14 Ribonukleinsäure (RNS) mit einer Masse m von 13,7 ku und einem Dipolmoment p0 von 280 Debye über einen Ionisationsprozess ein geladenes Molekül mit einer Ladung q von 16 e gewonnen werden. Durch Zuspitzen einer Elektrodenanordnung (Verringern der Radien der Elektroden) in der beispielhaften Koaxialzylindergeometrie 26, 28 aus Fig. 2 mit einem äußeren Elektrodenradius ra von 1 cm und einem inneren Elektronenradius r; von 100 μηι an der Spitze der Elektrode kann ein Bahnradius r von beispielsweise 200 μπι erreicht werden. Daraus folgt nach Gleichung (l) für eine angelegte Spannung U von 100 kV eine Rotationsfrequenz ω von 250 MHz.
[0091] Nach Gleichung (3) folgt für eine Rotationsfrequenz ω von 250 MHz und einem Dipolmoment p0 von 280 Debye eine Strahlungsleistung P von icr36 W pro Molekül. Bei einer Molekülzahl von ιο1 Molekülen (entspricht 1 μg RNS) folgt dabei eine Aussendung von los Photonen pro Sekunde. Durch weiteres Erhöhen der Frequenz, beispielsweise durch Einstrahlen einer Mikrowellenstrahlung auf die Makromoleküle I4,l4a,l4b, kann sowohl die Photonendichte erhöht als auch eine Hintergrundstrahlung verringert werden, um das Dipolmoment des Mal omoleküls 14 einfacher zu bestimmen.
[0092] Abhängig von der Temperatur und/oder Größe des Makromoleküls 14 kann die Interaktion mit elektromagnetischen Feldern 20 quantenmechanisch betrachtet werden. Die Übergangselemente für Rotationsschwingungen können dabei gleichermaßen proportional zu dem Quadrat des Absolutwertes des Dipolmoments sein. Die Frequenz der Strahlung kann jedoch von der Eigenrotationsfrequenz der Makromoleküle 14 abweichen und von der Besetzung der Rotationsschwingungszustände abhängen. Das Anregen der Eigenrotation kann die Besetzung der Zustände modifizieren und infolgedessen zu einer Aussendung von elektromagnetischer Strahlung durch Relaxation in Richtung einer thermischen Besetzung führen. Gleichermaßen kann elektromagnetische Strahlung verwendet werden, um eine Besetzung der Rotationsschwingungszustände weg von einer Gleichgewichtsverteilung zu erzeugen.
[0093] Das in Fig. 1 gezeigte Anregungselement 18 kann zu diesem Zweck Strahlungsemitter umfassen, um Mikrowellenstrahlung für die Anregung der Makromoleküle 14 bereitzustellen. In einigen Ausführungsformen kann das Anregungselement 18 mit dem Detektionselement 22 kombiniert sein, sodass eine Anregung der Eigenrotation der Moleküle 14 durch eine elektromagnetische Strahlung erzeugt wird und die Absorption der elektromagnetischen Strahlung als eine Funktion der Strahlungsfrequenz von dem Detektionselement 22 gemessen wird. Beispielsweise kann die Besetzung der Rotationsschwingungszustände durch die Anregung der Eigenrotation modifiziert sein, sodass der Absorptionsquerschnitt der Makromoleküle 14 eine Funktion der eingestellten Frequenz und/oder Strahlungsleistung ist. Dabei kann auch eine höhere Anregungsfrequenz über einen Ramanprozess verwendet werden, um den Absorptionsquerschnitt der Makromoleküle 14 abhängig von der Anregung der Eigenrotation zu bestimmen und/oder um die Eigenrotation anzuregen. Außerdem können in Ausführungsformen isomere und/oder konformere Moleküle mit unterschiedlichen Dipolmomenten aufgrund eines unterschiedlichen Absorptionsquerschnitts für elektromagnetische Anregung über unterschiedliche Besetzungszahlen spektroskopisch getrennt werden.
[0094] Das Detektionselement 22 kann einen Strahlungsdetektor umfassen, wobei die Auswahl der detektieren Strahlungsfrequenz auf beliebige Weise erreicht werden kann. Zum Beispiel kann ein Gitter, ein Prisma und/oder ein elektrooptischer/elektroakustischer Modulator usw. verwendet werden, um elektromagnetische Strahlung zu filtern. Die elektromagnetische Strahlung kann anschließend von einem Detektor, wie einem Halbleiterdetektor und/oder einem Signalverstärker, gemessen werden. Weiterhin kann die elektromagnetische Strahlung auch mit einer Antenne und/oder einer Spule aufgenommen und mit einem Detektor gemessen werden. In Ausfuhrungsformen kann die Auswahl der Frequenz und/oder die Detektion der Strahlung weiter durch homodyne/heterodyne Detektion verbessert werden.
[0095] Sowohl die Anregung der Eigenrotation als auch die Absorption von elektromagnetischer Strahlung kann infolge der Eigenrotation eine
Polarisationsabhängigkeit, und insbesondere eine Abhängigkeit von einer zirkulären
Polarisationskomponente, aufweisen. In einigen Ausführungsformen kann daher durch einen Dichroismus der Strahlungsabsorption in Abhängigkeit von der eingestrahlten Strahlungsleistung und/oder Strahlungsfrequenz und/oder der angeregten Eigenrotation Rückschluss auf das Dipolmoment des Makromoleküls 14 gezogen werden. Der Dichroismus ist eine Polarisationsabhängigkeit der Strahlungsabsorption, insbesondere der Unterschied einer Absorption von links-/rechtszirkular polarisierter Strahlung. Eine Messung des Dichroismus kann eine Identifikation von Rotationsübergängen verbessern.
[0096] Die gemessenen experimentellen Werte können anschließend von dem Analyseelement 24 zur Berechnung des Dipolmoments des Makromoleküls 14 verwendet werden. Das Analyseelement 24 kann beispielsweise ein Mikroprozessor oder eine spezialisierte Schaltung wie ein ASIC oder FPGA sein. Das Analyseelement 24 kann außerdem Software oder Firmware umfassen, welche die gemessenen Werte verwendet, um das Dipolmoment in Abhängigkeit des eingestellten Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, der Teilchendichte in dem Raumvolumen des Detektionselements 22, und den instrumenteilen Parametern des Anregungselement 18 und des Detektionselements 22 zu berechnen. Die mstrumentellen Parameter können die angelegte Spannung, das angelegte Magnetfeld, die erzeugte Strahlungsleistung und/oder eine Modulation der instrumenteilen Parameter und/oder der Teilchendichte sein.
[0097] Die Teilchendichte der Makromoleküle 14 in Abschnitten der Vorrichtung 10 kann aufgrund von technischen Limitationen begrenzt sein. Es kann daher vorzugswürdig sein, die Teilchendichte in dem Raumvolumen des Detektionselements 22 durch entsprechende Ausformung von Elektroden zur Erzeugung von abbremsenden elektrischen Feldern und/oder entsprechende abbremsende Magnetfelder zu erhöhen, um die Messung der Strahlungsabsorption und/oder der Strahlungsemission aufgrund der Eigenrotation zu erleichtern. Die Teilchendichte in dem Raumvolumen kann über einen Teilchenstrom durch das Anregungselement 18 und/oder die Konfiguration der abbremsenden elektrischen und/oder magnetischen Felder eingestellt werden. Zusätzlich oder alternativ kann auch ein Stoßgas verwendet werden, welches Teile der kinetischen Energie der Makromoleküle aufnehmen kann. Der Wert der Teilchendichte kann beispielsweise über die Messung einer Strahlungsabsorption bestimmt werden, wobei vorzugsweise ein Strahlungsübergang gewählt wird, der unabhängig von der Besetzung der Rotationsschwingungszustände ist. Jedoch kann grundsätzlich jede Art des Rückschlusses auf die Teilchendichte, wie beispielsweise der induzierte Spiegelstrom aufgrund der Bewegung der ionisierten Makromoleküle 14 in der Vorrichtung 10 und/oder nach Austritt aus der Vorrichtung 10 und/oder die aufgefangene Gesamtmasse der Makromoleküle 14 auf einem schwingenden Piezoelement, verwendet werden. [0098] Die in Fig. 1 gezeigte Vielzahl 12 von Makromolekülen 14 kann mit einem beliebigen Verfahren gewonnen werden, welches vorzugsweise kompatibel mit einer Niedrigdruckumgebung der Vorrichtung 10 ist. Übliche und bekannte Verfahren umfassen Elektrosprayionisation, Laserdesorptionsionisation (wie MALD-Ionisation oder SELD- Ionisation) oder APC-Ionisation. Dabei werden die Makromoleküle 14 aus einem (flüssigen) Medium evaporiert und infolge des Evaporationsprozesses oder durch einen nachgeschalteten Ionisationsprozess ionisiert. Die ionisierten Makromoleküle 14 (die Bruchstücke eines ursprünglichen Makromoleküls sein können) behalten dabei vorzugsweise ihre Konformation und können anschließend durch elektromagnetische Felder beschleunigt und/oder in die Vorrichtung 10 geleitet werden.
[0099] Alternativ zu den zuvor beschriebenen Filterverfahren oder zur weiteren Einschränkung der Molekülspezies können auch chromatographische und/oder elektrophoretische Trennverfahren verwendet werden, die in der flüssigen/fluiden Phase, bzw. in der Gasphase des Mediums ein vor- bzw. nachgeschaltetes Filtern der Bestandteile einer (biologischen) Probe erlauben können.
[0100] In Fig. 5 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Bestimmung des Dipolmoments skizziert. Das Verfahren umfasst das Anregen Sio einer Eigenrotation des Makromoleküls durch Wechselwirkung des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld, das Messen S12 einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls in Folge der Eigenrotation und das Bestimmen S14 des Dipolmoments aus der Strahlungsabsorption und/oder der Strahlungsemission des Makromoleküls aufgrund der Eigenrotation des Makromoleküls.
[0101] Das Verfahren kann durch eine der zuvor beschriebenen Vorrichtungen implementiert werden und erlaubt die Messung des Dipolmoments von Makromolekülen, wobei eine Eigenrotation des Makromoleküls angeregt wird und die resultierenden Kopplungsgrößen des Makromoleküls an ein elektromagnetisches Feld gemessen werden.
[0102] Die vorhergehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, Beispiele und Zeichnungen soll nur dazu dienen, die Erfindung und die damit verbundenen Vorteile zu veranschaulichen, und soll nicht so verstanden werden, dass sie den Schutzbereich einschränkt. Der Schutzbereich der Erfindung soll vielmehr ausschließlich anhand der beigefügten Ansprüche ermittelt werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Bestimmen eines Dipolmoments eines Makromoleküls (14,143,140) mit einer Masse von mehr als 1 ku, welches umfasst:
Anregen einer Eigenrotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) durch Wechselwirken des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld;
Messen einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls (l4,i4a,i4b) in Folge der Eigenrotation; und
Bestimmen des Dipolmoments aus der gemessenen Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) ein Anregen einer gebundenen Rotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) auf einer bindenden Trajektorie umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Anregen der gebundenen Rotation ein Erhöhen einer Rotationsfrequenz der bindenden Trajektorie des Makromoleküls (l4,l4a,l4b) umfasst, insbesondere durch Erhöhen einer Krümmung der bindenden Trajektorie.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Anregen der gebundenen Rotation des Makromoleküls ein Wechselwirken des Makromoleküls (14, 14a, 14b) mit einem elektrischen Feld in einer Elektrodenanordnung (26,28) und/oder ein Wechselwirken des Makromoleküls (l4,l4a,l4b) mit einem magnetischen Feld umfasst.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls (I4,i4a,i4b) eine elektromagnetische Strahlungsanregung, insbesondere eine Mikrowellenanregung, des Makromoleküls (i4,i4a,i4b) umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches zusätzlich ein Abbremsen einer Ausbreitungsgeschwindigkeit des Makromoleküls (l4,l4a,l4b) umfasst, insbesondere zum Verdichten einer Vielzahl von Makromolekülen (l4,l4a,l4b).
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Messen ein Messen der Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission bei einer Frequenz (ω) der Eigenrotation des Makromoleküls (l4,l4a,l4b) umfasst.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Messen ein Messen eines frequenzabhängigen und/oder polarisationsabhängigen Absorptionsquerschnitts des Makromoleküls (i4,i4a,l4b) umfasst.
9. Vorrichtung (10) zum Bestimmen eines Dipolmoments eines Makromoleküls (14, 14a, 14b) mit einer Masse von mehr als 1 ku, welche umfasst:
Anregungselement (18) zum Anregen einer Eigenrotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) durch Wechselwirken des Dipolmoments mit einem elektromagnetischen Feld;
Detektionselement (22) zum Messen einer Strahlungsabsorption und/oder einer Strahlungsemission des Makromoleküls (i4,i4a,l4b) in Folge der Eigenrotation; und
Analyseelement (24) zum Bestimmen des Dipolmoments aus der gemessenen Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission.
10. Vorrichtung (10) nach Anspruch 9, wobei das Anregungselement (18) zum Anregen einer gebundenen Rotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) auf einer bindenden Trajektorie eingerichtet ist.
11. Vorrichtung (10) nach Anspruch 10, wobei das Anregungselement (18) eingerichtet ist, eine Rotationsfrequenz der bindenden Trajektorie zu erhöhen, insbesondere durch Erhöhen einer Krümmung der bindenden Trajektorie.
12. Vorrichtung (10) nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Anregungselement (18) eine Elektrodenanordnung (26,28) umfasst, die insbesondere die bindende Trajektorie des Makromoleküls (14, 14a, 14b) begrenzt und/oder eingerichtet ist, die gebundene Rotation durch ein elektrisches Feld anzuregen.
13. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Anregungselement (18) Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes umfasst, um die bindende Trajektorie anzuregen.
14. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei das Anregungselement (18) eine Strahlungsquelle, und insbesondere eine Mikrowellenquelle, zum Anregen der Eigenrotation des Makromoleküls (i4,i4a,i4b) umfasst.
15. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 14, welches zusätzlich Mittel zum Erzeugen eines elektromagnetischen Feldes zum Verdichten einer Vielzahl von Makromolekülen (I4,i4a,i4b) umfasst.
16. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei das Detektionselement (22) Mittel zum Messen der Strahlungsabsorption und/oder Strahlungsemission bei einer Frequenz der Eigenrotation des Makromoleküls (14, 14a, 14b) umfasst.
17. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei das Detektionselement (22) Mittel zum Messen eines frequenzabhängigen und/oder eines polarisationsabhängigen Absorptionsquerschnitts des Makromoleküls (i4,i4a,i4b) umfasst.
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