WO2018154788A1 - 体細胞製造システム - Google Patents

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WO2018154788A1
WO2018154788A1 PCT/JP2017/007564 JP2017007564W WO2018154788A1 WO 2018154788 A1 WO2018154788 A1 WO 2018154788A1 JP 2017007564 W JP2017007564 W JP 2017007564W WO 2018154788 A1 WO2018154788 A1 WO 2018154788A1
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cell
somatic
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somatic cell
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剛士 田邊
健太 須藤
亮二 平出
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剛士 田邊
アイ・ピース，インコーポレイテッド
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Definitions

  • the present invention relates to a somatic cell induction technique, and more particularly to a somatic cell production system.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from early embryos of humans and mice. ES cells have pluripotency capable of differentiating into all cells present in a living body. Currently, human ES cells are available for cell transplantation therapy for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes, and leukemia. However, there are obstacles to transplantation of ES cells. In particular, transplantation of ES cells can elicit immune rejection similar to the rejection that occurs following unsuccessful organ transplantation. In addition, there are many criticisms and objections from the ethical point of view regarding the use of ES cells established by destroying human embryos.
  • iPS pluripotent stem cells
  • the method of inducing differentiation from iPS cells or embryonic stem cells (ES cells) into somatic cells involves combining hormones, growth factors, and low-molecular compounds that determine cell properties, and changing their quantitative ratios and concentrations over time. It has been carried out in a manner that mimics the process of development. However, it is difficult and inefficient to completely mimic the process of development in a test tube. Further, in humans, a very long differentiation induction period is required as compared with mouse somatic differentiation induction. For example, it takes 3 months or more to produce mature nerves. Furthermore, there is a problem that the efficiency of differentiation induction varies greatly depending on the ES / iPS cell line, and the properties of the induced somatic cells are not uniform.
  • somatic cells in the fetal stage at an early stage. Differentiation of mature human somatic cells is extremely difficult and requires long-term culture over several months. However, it is very important to create somatic cells that match the maturity of individuals in drug discovery and transplantation medicine for individuals whose development has been completed.
  • a method for producing a target somatic cell by directly introducing a gene that defines the properties of a specific somatic cell into a ES / iPS cell using a virus has been proposed.
  • a method using a virus can specifically produce a mature nerve cell in a very short period of time, such as 2 weeks, as compared with a method using a hormone or a chemical substance.
  • nerve cells are prepared by introducing a specific gene, for example, only excitatory nerves can be obtained uniformly. Therefore, drug screening specific to a specific nerve subtype is possible, and in transplantation medicine, it is considered that only specific cells having a disease can be concentrated and transplanted.
  • iPS cells when iPS cells are differentiated into somatic cells, undifferentiated iPS cells may remain in the differentiated somatic cells. Therefore, a method for differentiating from a somatic cell to another somatic cell without passing through an iPS cell has been established. Specifically, methods for differentiating fibroblasts into cardiomyocytes and nerve cells have been developed. These methods are called direct reprogramming and do not go through pluripotent stem cells such as iPS cells, so there is no risk that undifferentiated pluripotent cells remain at the time of transplantation.
  • Somatic cells are established by introducing an inducer such as a gene into the cells, expanded and cultured, and cryopreserved as necessary.
  • an inducer such as a gene
  • somatic cells for clinical use for example, GLP, GMP grade
  • Cost Somatic cells for clinical use must be prepared and stored in a clean room that is kept very clean. However, the cost of maintaining the required level of cleanliness is very high. For this reason, it is expensive to produce clinical somatic cells, which is a major obstacle to industrialization.
  • an object of the present invention is to provide a somatic cell production system capable of producing somatic cells.
  • the somatic cells are not limited to clinical somatic cells.
  • the pre-introduction cell liquid passage through which the solution containing the pre-introduction cells passes, and the pre-introduction cell liquid passage are connected, and the somatic inducer is introduced into the pre-introduction cells to introduce the induction factor.
  • a somatic cell production system comprising a factor introduction apparatus for producing cells and a cell preparation apparatus for producing somatic cells by culturing induced factor-introduced cells.
  • the above-described somatic cell production system may further include a housing for storing the pre-introduction cell liquid supply path, the factor introduction apparatus, and the cell preparation apparatus.
  • somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor may exclude pluripotent stem cells.
  • Somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor may contain differentiated cells.
  • Somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor may include somatic stem cells.
  • Somatic stem cells are also referred to as adult stem cells or tissue stem cells.
  • a somatic cell produced by introducing a somatic cell inducing factor may include a nervous system cell.
  • Somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor may include fibroblasts.
  • Somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor may include cardiomyocytes, keratinocytes, or retinal cells.
  • the pre-introduction cell may include a pluripotent stem cell.
  • Pluripotent stem cells may include ES cells and iPS cells.
  • the pre-introduction cell may contain somatic stem cells.
  • the pre-introduction cell may contain differentiated somatic cells.
  • the pre-introduction cell may contain blood cells.
  • the pre-introduction cell may contain a fibroblast.
  • the cell preparation device is a somatic cell culture device for cultivating the induced factor-introduced cells produced by the factor introduction device, and an expansion culture device for expanding and culturing somatic cells established by the somatic cell culture device
  • the somatic cell culture device is provided with a first culture medium supply device that replenishes the induction factor-introduced cell with a culture medium
  • the expansion culture device is provided with a second culture medium supply device that replenishes the somatic cell with the culture medium. May be.
  • the somatic cell culture device may further include a drug supply device that supplies a solution containing a drug that kills cells to which no drug resistance factor has been introduced.
  • the factor introduction device includes a factor introduction unit connected to the pre-introduction cell liquid supply path, a factor storage unit for storing the somatic cell induction factor, and the pre-introduction cell liquid supply path from the factor storage unit.
  • a factor feeding path for flowing the somatic cell inducing factor to the factor introducing section and a pump for flowing the liquid in the factor feeding path may be provided.
  • the somatic cell inducing factor may be DNA, RNA, or protein.
  • a somatic cell inducing factor may be introduced into the pre-introduction cell by RNA lipofection.
  • a somatic cell inducing factor may be incorporated into the vector.
  • the vector may be a Sendai virus vector.
  • the above-described somatic cell production system may further include a package device that packages somatic cells produced by the cell production device, and the housing may store the package device.
  • the above-described somatic cell production system is a solution replacement device including a cylindrical member and a liquid permeable filter disposed inside the cylindrical member, and the cell preparation device is provided on the cylindrical member on the liquid permeable filter.
  • a somatic cell introduction hole for introducing a solution containing somatic cells prepared in Step 1 a substitution solution introduction hole for introducing a substitution solution on a liquid permeation filter, and a substitution containing somatic cells on a liquid permeation filter
  • the above somatic cell manufacturing system further includes a waste liquid feeding path connected to the waste liquid outflow hole of the solution replacer, and the flow of the solution in the waste liquid feeding path is allowed when discarding the solution of the solution containing somatic cells.
  • the somatic cells When the somatic cells are dispersed in the replacement solution, the solution may not be allowed to flow in the waste liquid supply path.
  • the replacement solution may be a cryopreservation solution.
  • the above-described somatic cell production system may further include a separation device for separating the pre-introduction cells from the blood, and the solution containing the pre-introduction cells separated by the separation device may pass through the pre-introduction cell liquid supply path.
  • a somatic cell production system capable of producing somatic cells can be provided.
  • FIG. 4 is a photograph of cells according to Example 3.
  • the somatic cell production system is connected to a pre-introduction cell liquid supply path 20 through which a solution containing pre-introduction cells passes, and a pre-introduction cell liquid supply path 20,
  • a factor introduction device 30 that introduces a somatic cell-inducing factor into a pre-introduction cell to produce an induction factor-introduced cell
  • a cell preparation device 40 that cultures the induction factor-introduced cell to produce a somatic cell
  • a factor introduction device 30 that stores the cell preparation device 40.
  • the pre-introduction cell is, for example, a pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells ES cells and iPS cells can be used.
  • the pre-introduction cell is, for example, a differentiated cell.
  • differentiated cells somatic stem cells, blood cells, and differentiated somatic cells of fibroblasts can be used. Somatic stem cells are also referred to as adult stem cells or tissue stem cells.
  • Somatic cells produced by introducing a somatic cell inducing factor exclude pluripotent stem cells.
  • a somatic cell produced by introducing a somatic cell inducing factor is a differentiated cell.
  • differentiated cells include somatic stem cells, nervous system cells, fibroblasts, cardiomyocytes, hepatocytes, retinal cells, corneal cells, blood cells, keratinocytes (keratinocytes), and chondrocytes.
  • Neural cells may be any one of neural cells, neural stem cells and neural progenitor cells.
  • the nerve cell may be any of an inhibitory nerve cell, an excitatory nerve cell, and a dopaminergic nerve cell.
  • the nervous system cells may be motor neurons, oligodendrocyte precursor cells, oligodendrocytes, and the like.
  • the nervous system cell may be MAP2 positive or ⁇ -III Tubulin positive.
  • the somatic cell production system further includes an air cleaning device that cleans the gas in the housing 200, a temperature management device that manages the temperature of the gas in the housing 200, and the carbon dioxide (CO 2) in the housing 200.
  • a carbon dioxide concentration management device for managing the concentration may be provided.
  • the air cleaning device may include a cleanliness sensor that monitors the cleanliness of the gas in the housing 200.
  • the air cleaning device cleans the air in the housing 200 using, for example, a HEPA (High Efficiency Particulate Air) filter and a ULPA (Ultra Low Penetration Air) filter.
  • the air purifier sets the cleanliness of the air in the housing 200 to a class of ISO1 to ISO6 according to ISO standard 14644-1.
  • the temperature management device may include a temperature sensor that monitors the temperature of the gas in the housing 200.
  • CO 2 concentration control device may be provided with a CO 2 concentration sensor for monitoring the CO 2 concentration of the gas within the enclosure 200.
  • the housing 200 is provided with a door, for example, but when the door is closed, the inside is completely closed, and the cleanliness, temperature, and CO 2 concentration of the air inside can be kept constant. Is possible.
  • the housing 200 is preferably transparent so that the state of the internal device can be observed from the outside.
  • the housing 200 may be a glove box in which a glove such as a rubber glove is integrated.
  • the housing 200 may be provided with an introduction port that communicates with the pre-introduction cell liquid supply path 20.
  • a door or the like may be provided in the opening.
  • the introduction port may be sealable with a removable sealing material.
  • the pre-introduction cells are put into the pre-introduction cell liquid supply path 20 from the introduction port.
  • a pre-introduction cell storage container that stores pre-introduction cells that communicates with the pre-introduction cell liquid supply path 20 may be disposed in the housing 200.
  • the somatic cell manufacturing system may further include a separation device 10 disposed in the housing 200 for separating the pre-introduction cells from the blood.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20 is connected to the separation device 10.
  • a solution containing cells before introduction separated by the separation device 10 passes through the cell feeding path 20 before introduction.
  • the separation device 10 in the housing 200 receives a vial containing human blood, for example.
  • the separation device 10 includes an anticoagulant tank for storing an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and biological preparation reference blood preservation solution A (ACD-A solution, Terumo Corporation). I have.
  • the separation device 10 adds an anticoagulant to human blood from an anticoagulant tank using a pump or the like.
  • the separation apparatus 10 includes a separation reagent tank that stores a mononuclear cell separation reagent such as Ficoll-Paque PREMIUM (registered trademark, GE Healthcare Japan Co., Ltd.).
  • the separation apparatus 10 dispenses 5 mL of the mononuclear cell separation reagent from the separation reagent tank into, for example, two 15 mL tubes using a pump or the like.
  • a resin bag may be used instead of the tube.
  • the separation apparatus 10 includes a buffer solution tank for storing a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • the separation device 10 is diluted by adding 5 mL of buffer solution from a buffer solution tank to, for example, 5 mL of human blood using a pump or the like. Still further, the separation device 10 adds 5 mL of diluted human blood onto the mononuclear cell separation reagent in the tube using a pump or the like.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the separation device 10 further includes a centrifuge capable of setting the temperature.
  • the centrifuge is set at 18 ° C., for example.
  • the separation device 10 uses a moving device or the like to place a tube containing a mononuclear cell separation reagent and human blood into a centrifuge holder.
  • the centrifuge centrifuges the solution in the tube at, for example, 400 ⁇ g for 30 minutes. Instead of the tube, the resin bag may be centrifuged.
  • the separation device 10 collects a white turbid intermediate layer of the mononuclear solution in the tube with a pump or the like.
  • the separation device 10 sends the recovered mononuclear cell suspension to the pre-introduction cell liquid supply path 20 using a pump or the like.
  • the separation device 10 further adds, for example, 12 mL of PBS to 2 mL of the recovered mononuclear cell solution, and puts the tube into a centrifuge holder. The centrifuge centrifuges the solution in the tube at, for example, 200 ⁇ g for 10 minutes.
  • the separation device 10 uses a pump or the like to aspirate and remove the supernatant of the solution in the tube, and 3 mL of a mononuclear cell medium such as X-VIVO 10 (registered trademark, Lonza Japan Co., Ltd.) Suspend in addition to the mononuclear cell solution.
  • Blood cells may be cultured in a feeder-free manner using a basement membrane matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), or Laminin511 (nippi).
  • the separation device 10 sends out a suspension of mononuclear cells as pre-introduction cells to the pre-introduction cell liquid supply path 20 using a pump or the like.
  • the separation device 10 may separate mononuclear cells from blood using a dialysis membrane. Further, when using pre-introduced cells prepared in advance, the separation device 10 may not be provided.
  • Separation device 10 may separate cells suitable for induction by a method other than centrifugation. For example, if the cells to be separated are T cells, cells that are positive for CD3, CD4, or CD8 may be separated by panning. If cells to be separated are vascular endothelial progenitor cells, cells that are positive for CD34 may be separated by panning. If cells to be separated are B cells, cells that are positive for any of CD10, CD19, and CD20 may be separated by panning. Moreover, you may isolate
  • MCS magnetic cell separation method
  • the inner wall of the pre-introduction cell liquid supply path 20 may be coated with poly-HEMA (poly 2-hydroxyethyl methacrylate) so that the pre-introduction cells do not adhere to make the cells non-adhesive.
  • poly-HEMA poly 2-hydroxyethyl methacrylate
  • a material for which cells before introduction are difficult to adhere may be used as the material for the cell feeding path 20 before introduction.
  • the conditions in the cell feeding path 20 before introduction are controlled in the casing 200. Equal to the measured temperature and CO 2 concentration.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • the induction factor feeding mechanism 21 in the housing 200 includes, for example, an induction factor introduction reagent tank that stores an induction factor introduction reagent solution and the like.
  • the inducing factor feeding mechanism 21 uses a micropump or the like to transfer the inducing factor introduction reagent solution into the pre-introduction cell feeding path in the housing 200 so that the pre-introduction cell is suspended in the inducing factor introduction reagent solution. 20 or the factor introduction device 30.
  • the induction factor introduction reagent solution such as a gene introduction reagent solution includes, for example, a set of somatic cell induction factor RNA, RNA transfection solution, and RNA transfection medium.
  • RNA transfection includes RNA lipofection.
  • the set of somatic cell inducer RNA includes, for example, 100 ng each of ASCL1 mRNA, Myt1L mRNA, and neurogenin2 (Ngn2) mRNA.
  • Ngn2 neurogenin2
  • Ngn2 neurogenin2
  • the somatic cell inducer RNA may contain mRNA corresponding to the drug resistance gene.
  • the drug include antibiotics such as puromycin, neomycin, blasticidin, G418, hygromycin, and zeocin.
  • a cell into which mRNA corresponding to a drug resistance gene has been introduced exhibits drug resistance.
  • Somatic cell inducer RNA includes, for example, Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink). Cells transfected with Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink) produce neurogenin2 (Ngn2) and show puromycin resistance.
  • MRNA is capped with Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), polyadenylated, and may be substituted with 5-methylcytidine and pseudouridine. 5-methylcytidine and pseudouridine reduce the ability of antibodies to recognize mRNA.
  • ARCA Anti-Reverse Cap Analog
  • RNA transfection solution contains, for example, a small interfering RNA (siRNA) or a lipofection reagent.
  • siRNA small interfering RNA
  • lipofection reagents siRNA lipofection reagents and mRNA lipofection reagents can be used.
  • Lipofectamine registered trademark
  • RNAiMAX Thermo Fisher Scientific
  • Lipofectamine registered trademark
  • MessengerMAX ThermoFisher Scientific 3 registered trademark, Lipofect3 registered trademark, Lipofect3 registered trademark
  • NeonTransfection System Thermo Fisher scientific
  • Stemfect RNA transfection reagent Stemfect
  • NextFect registered trademark
  • RNA Transfection Reagent BiooScientific
  • the factor introduction device 30 may suspend the cells in the culture solution after introducing the somatic cell-inducing factor into the cells.
  • the factor introduction device 30 may perform transfection of a somatic cell induction factor a plurality of times.
  • the medium may be changed after a predetermined time such as 24 hours after introduction of the somatic cell inducing factor into the cell, and the cell may be transfected with the somatic cell inducing factor again.
  • the transfection of the somatic cell inducer into the cells and the cell culture for a predetermined time may be repeated a plurality of times, for example, 2 to 4 times.
  • the number of cells per well is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 8 , 5 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 , or 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 .
  • the bottom area of one well is 4 cm 2 .
  • the amount of somatic cell-inducing factor RNA during lipofection of somatic cell-inducing factor RNA is 200 ng to 5000 ng, 400 ng to 2000 ng, or 500 ng to 1000 ng per time.
  • the amount of the lipofection reagent at the time of lipofection of somatic cell inducer RNA is 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L, 1 ⁇ L to 50 ⁇ L, or 1.5 ⁇ L to 10 ⁇ L.
  • the medium used for lipofection of somatic cell inducer RNA is a low serum medium such as Opti-MEM (registered trademark, Gibco).
  • the medium used during and before and after somatic cell inducer RNA lipofection may contain B18R protein.
  • the B18R protein attenuates the cell's innate antiviral response.
  • B18R protein may be used to suppress cell death associated with an immune response associated with the insertion of RNA into cells.
  • the medium may not contain B18R protein, or may contain B18R protein at a thin concentration of 0.01% to 1%.
  • somatic cells differentiate into somatic cells within 10 days, 9 days, 8 days, or 7 days after lipofection with somatic cell inducer RNA.
  • somatic cell to be prepared is a nervous system cell
  • whether or not it has differentiated into a nervous system cell is confirmed by whether or not ⁇ -III Tubulin, MAP2, or PsA-NCAM is positive.
  • ⁇ -III Tubulin, MAP2, PsA-NCAM, and vGlu are markers for labeling nerve cells and are constituent proteins of microtubules in nerve cell processes.
  • the induction factor introduction reagent solution such as a gene introduction reagent solution may contain, for example, a Sendai virus vector solution.
  • Sendai virus-derived RNA is not integrated into host DNA, the gene of interest can be introduced into the host.
  • the set of Sendai virus vectors includes, for example, ASCL1 mRNA, Myt1L mRNA, and Ngn2 mRNA so that the MOI (multiplicity of effect) is 0.01 to 1000, 0.1 to 1, or 1 to 10.
  • the inducer Sendai virus vector may contain mRNA corresponding to the drug resistance gene.
  • the inducer RNA contained in the Sendai virus vector includes, for example, Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink).
  • Sendai virus may be introduced into the cells only once.
  • the factor introduction device 30 uses a pump or the like to send a solution containing cells into which the inducer has been introduced (induction factor-introduced cells) to the introduced cell feeding path 31.
  • Poly-HEMA may be coated on the inner wall of the introduced cell liquid supply path 31 in the housing 200 so that the inducer-introduced cells do not adhere to be non-adhesive.
  • a material that is difficult for the inducer-introduced cells to adhere to may be used as the material of the introduced cell liquid supply path 31.
  • the conditions in the introduced cell liquid supply path 31 are managed in the housing 200. Equivalent to temperature and CO 2 concentration.
  • the introduction cell liquid supply path 31 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • one or a plurality of wrinkles that change the inner diameter intermittently may be provided inside the introduced cell liquid supply path 31.
  • the inner diameter of the introduced cell liquid supply path 31 may be changed intermittently.
  • the cell preparation device 40 connected to the introduced cell liquid supply path 31 includes a somatic cell culture device 50 for culturing the induced factor-introduced cells produced by the factor introduction device 30, and somatic cells.
  • a first dividing mechanism 60 that divides a cell mass (cell colony) composed of somatic cells established by the culture apparatus 50 into a plurality of cell masses, an expansion culture apparatus 70 that expands and cultures somatic cells, and an expansion culture apparatus 70.
  • a second division mechanism 80 that divides a cell mass composed of expanded somatic cells into a plurality of cell masses, and a somatic cell transport mechanism 90 that sequentially sends the somatic cells to the package device 100 are provided.
  • the first division mechanism 60 and the second division mechanism 80 may be omitted.
  • the somatic cell culture apparatus 50 may include a culture container such as a well plate, a bag, and a tube inside.
  • the somatic cell culture apparatus 50 may include a pipetting machine.
  • the somatic cell culture device 50 receives a solution containing somatic cell induction factor-introduced cells from the introduced cell feeding path 31 and distributes the solution to the culture container with a pipetting machine.
  • the somatic cell culture apparatus 50 puts N6 medium (DMEM / F12, 25 ⁇ g), which is a neuronal differentiation medium, for example, on the 1st to 7th days after placing the inducer-introduced cells in the culture vessel.
  • N6 medium DMEM / F12, 25 ⁇ g
  • / ML insulin 50 ⁇ g / mL human transferrin, 30 nmol / L sodium selenite, 20 nmol / L progesterone, 100 nmol / L putrescine
  • a ROCK inhibitor (Selleck) may be added to the medium at a concentration of 10 ⁇ mol / L for several days.
  • the somatic cell culture apparatus 50 changes the medium after distributing the inducer-introduced cells to the culture container, for example, on the ninth day, and thereafter, until the target cell such as a nervous system cell is observed. It should be noted that exchanging the medium includes partially replacing the medium and supplying the medium.
  • drug selection for killing cells into which no drug resistance factor has been introduced may be performed.
  • the somatic cell inducer RNA contains mRNA corresponding to a drug resistance gene
  • an inducer-introduced cell exhibiting drug resistance selectively survives by supplying a solution containing the drug to the culture vessel.
  • the somatic cell inducer RNA contains mRNA corresponding to the puromycin resistance gene
  • the cells after lipofection are exposed to puromycin to kill cells other than the cells into which the somatic inducer RNA has been introduced. It is possible to select cells into which the somatic cell inducer RNA has been introduced.
  • the drug may be contained in the medium.
  • the concentration of the drug is, for example, 2 mg / L.
  • the induction factor-introduced cells are cultured using a medium containing a drug that kills cells to which a drug resistance factor has not been introduced for a predetermined period, and then induced using a medium not containing the drug.
  • Factor-introduced cells may be cultured.
  • the somatic cell culture apparatus 50 collects the somatic cell with a pipetting machine. Furthermore, the somatic cell culture apparatus 50 puts a container containing the collected somatic cells into an incubator, and reacts somatic cells with trypsin alternative recombinant enzyme at 37 ° C. and CO 2 5% for 10 minutes. In the case where the cell mass is physically broken, there is no need to use a trypsin alternative recombinant enzyme.
  • the somatic cell culture apparatus 50 crushes somatic cell masses by pipetting with a pipetting machine.
  • the somatic cell culturing apparatus 50 may pass the cell mass through a pipe provided with a filter or a pipe whose inner diameter is intermittently changed, similar to the introduced cell feeding path 31 shown in FIG. 3 or FIG. The lump may be crushed.
  • the somatic cell culture apparatus 50 then adds the neural differentiation medium as described above to the solution containing the crushed somatic cell mass.
  • the culture in the somatic cell culture apparatus 50 may be performed in a bag instead of the well plate.
  • the bag may be CO 2 permeable.
  • the culture may be an adhesion culture or a suspension culture. In the case of suspension culture, stirring culture may be performed. Further, the culture in the somatic cell culture apparatus 50 may be hanging drop culture.
  • the somatic cell culture device 50 may include a first medium supply device for supplying a culture medium containing a culture solution to a culture container such as a well plate, a bag, or a tube.
  • the first medium supply device may collect the culture solution in the culture container, filter the culture solution using a filter or a dialysis membrane, and reuse the purified culture solution. At that time, a growth factor or the like may be added to the culture medium to be reused.
  • the somatic cell culture device 50 may include a drug supply device that supplies a culture container with a solution containing a drug that kills cells to which no drug resistance factor has been introduced.
  • the somatic cell culture device 50 may further include a temperature management device that manages the temperature of the culture medium, a pH management device that manages the pH of the culture medium, a humidity management device that manages the humidity in the vicinity of the culture medium, and the like.
  • the cells are put into a culture medium permeable bag 301 such as a dialysis membrane as shown in FIG. 5 and the culture medium permeable bag 301 is put into a culture medium non-permeable bag 302. Then, the culture solution may be put in the bags 301 and 302. Bag 302 may be a CO 2 permeability, it may not be CO 2 permeability.
  • the somatic cell culture apparatus 50 prepares a plurality of bags 302 containing fresh culture solutions, and sets an outer bag 302 containing cells 301 containing cells into fresh culture solutions every predetermined period. The bag 302 may be exchanged.
  • the somatic cell culture apparatus 50 sends out a solution containing somatic cells to the first somatic cell liquid supply path 51 using a pump or the like.
  • the first somatic cell liquid supply path 51 has an inner diameter through which only induced cells having a size smaller than a predetermined size are passed, and is connected to a branch channel that removes non-induced cells having a predetermined size or larger. It may be.
  • the inner wall of the first somatic cell feeding path 51 may be coated with poly-HEMA so that the somatic cells do not adhere to be non-cell-adhesive.
  • a material that is difficult for somatic cells to adhere may be used as the material of the first somatic cell liquid supply path 51.
  • the conditions in the first somatic cell liquid supply path 51 can be controlled in the housing 200. Equal to the measured temperature and CO 2 concentration.
  • the first somatic cell liquid supply path 51 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • the first somatic cell liquid supply path 51 is connected to the first dividing mechanism 60.
  • the first dividing mechanism 60 includes, for example, a mesh. When the cell mass contained in the solution passes through the mesh by water pressure, it is divided into a plurality of cell masses having the size of each hole of the mesh. For example, if the size of each hole of the mesh is uniform, the size of the plurality of cell clusters after the division is also substantially uniform.
  • the first dividing mechanism 60 may include a nozzle. For example, by finely processing the inside of a substantially conical nozzle in a stepped manner, the cell mass contained in the solution is divided into a plurality of cell masses when passing through the nozzle.
  • An expansion culture device 70 is connected to the first dividing mechanism 60.
  • the solution containing the cell mass of the somatic cells divided by the first dividing mechanism 60 is sent to the expansion culture device 70.
  • the first somatic cell liquid supply path 51 is connected to the expansion culture device 70.
  • the expansion culture device 70 can store a well plate therein, for example.
  • the expansion culture apparatus 70 includes a pipetting machine.
  • the expansion culture apparatus 70 receives a solution containing somatic cells from the first dividing mechanism 60 or the first somatic cell liquid supply channel 51, and distributes the solution to the wells with a pipetting machine.
  • the expansion culture apparatus 70 distributes the somatic cells to the wells and then cultures the somatic cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 8 days, for example. Further, the expansion culture apparatus 70 performs medium exchange as appropriate.
  • the expansion culture apparatus 70 When a cell mass is formed, the expansion culture apparatus 70 adds a trypsin alternative recombinant enzyme such as TrypLE Select (registered trademark, Life Technologies) to the cell mass. Furthermore, the expansion culture apparatus 70 raises the temperature of the container containing the cell mass, and causes the cell mass to react with the trypsin alternative recombinant enzyme for 1 minute at 37 ° C. and 5% CO 2 . In the case where the cell mass is physically broken, there is no need to use a trypsin alternative recombinant enzyme. For example, the expansion culture apparatus 70 crushes the cell mass by pipetting with a pipetting machine.
  • a trypsin alternative recombinant enzyme such as TrypLE Select (registered trademark, Life Technologies)
  • the expansion culture device 70 may pass the cell mass through a pipe provided with a filter, or a pipe whose inner diameter is changed intermittently, similar to the introduced cell feeding channel 31 shown in FIG. 3 or FIG. May be crushed. Thereafter, the expansion culture apparatus 70 shown in FIGS. 1 and 2 adds a medium such as a maintenance culture medium to the solution containing the cell mass. Further, in the case of adhesion culture, the expansion culture apparatus 70 peels off the cell mass from the container with an automatic cell scraper or the like, and the solution containing the cell mass is transferred to the first dividing mechanism 60 via the expansion culture liquid supply path 71. Send to.
  • a medium such as a maintenance culture medium
  • the culture in the expansion culture apparatus 70 may be performed in a bag or a tube instead of the well plate.
  • the bag or tube may be CO 2 permeable.
  • the culture may be adhesion culture, suspension culture, or hanging drop culture. In the case of suspension culture, stirring culture may be performed.
  • the expansion culture device 70 may include a second medium supply device for supplying a culture solution to a culture container such as a well plate, a bag, or a tube.
  • the second culture medium supply device may collect the culture solution in the culture vessel, filter the culture solution using a filter or a dialysis membrane, and reuse the purified culture solution. At that time, a growth factor or the like may be added to the culture medium to be reused.
  • the expansion culture device 70 may further include a temperature management device that manages the temperature of the culture medium, a humidity management device that manages the humidity in the vicinity of the culture medium, and the like.
  • the cells are put in a culture medium permeable bag 301 such as a dialysis membrane as shown in FIG. 5, and the culture medium permeable bag 301 is put into a culture medium impermeable bag 302. Then, the culture solution may be put in the bags 301 and 302.
  • the bag 302 may be CO 2 permeable.
  • the expansion culture apparatus 70 prepares a plurality of bags 302 containing fresh culture solution, and the outer bag 302 containing cells 301 containing cells is filled with fresh culture solution every predetermined period. The bag 302 may be exchanged.
  • the somatic cell manufacturing system shown in FIG. 1 and FIG. 2 may further include a photographing device for photographing the culture in the somatic cell culture device 50 and the expansion culture device 70.
  • a photographing device for photographing the culture in the somatic cell culture device 50 and the expansion culture device 70.
  • a colorless medium is used as the medium used in the somatic cell culture apparatus 50 and the expansion culture apparatus 70
  • a pH indicator such as phenol red
  • the somatic cell manufacturing system captures the cells in the somatic cell culture device 50 and the expansion culture device 70.
  • an induction state monitoring device that calculates the ratio of induced cells may be further provided.
  • the induced state monitoring device may specify the ratio of induced cells by antibody immunostaining or RNA extraction.
  • the somatic cell production system may include an uninduced cell removal device that removes uninduced cells by a magnetic cell separation method, flow cytometry, or the like.
  • the cell mass divided by the first division mechanism 60 shown in FIGS. 1 and 2 is cultured again in the expansion culture apparatus 70.
  • the division of the cell mass in the first division mechanism 60 and the culture of the somatic cells in the expansion culture apparatus 70 are repeated until the necessary amount of cells is obtained.
  • the first dividing mechanism 60 may be omitted when the cell mass is not formed.
  • a second somatic cell feeding path 72 is connected to the expansion culture apparatus 70.
  • the expansion culture apparatus 70 sends out the solution containing the expanded cultured somatic cells to the second somatic cell feeding path 72 using a pump or the like. However, exfoliation is not necessary for suspension culture.
  • the second somatic cell liquid supply path 72 has an inner diameter through which only induced somatic cells having a size less than a predetermined size pass, and is connected to a branch channel that removes non-induced cells having a predetermined size or larger. May be.
  • the inner wall of the second somatic cell feeding path 72 may be coated with poly-HEMA so that the somatic cells do not adhere to be non-cell-adhesive.
  • a material that is difficult for somatic cells to adhere may be used as the material of the second somatic cell liquid supply path 72.
  • the conditions in the second somatic cell liquid supply path 72 can be controlled in the housing 200. Equal to the measured temperature and CO 2 concentration.
  • a backflow prevention valve may be provided in the second somatic cell liquid supply path 72 from the viewpoint of preventing contamination.
  • the second somatic cell liquid supply path 72 is connected to the second dividing mechanism 80.
  • the second dividing mechanism 80 includes, for example, a mesh. When the cell mass contained in the solution passes through the mesh by water pressure, it is divided into a plurality of cell masses having the size of each hole of the mesh. For example, if the size of each hole of the mesh is uniform, the size of the plurality of cell clusters after the division is also substantially uniform.
  • the second dividing mechanism 80 may include a nozzle. For example, by finely processing the inside of a substantially conical nozzle in a stepped manner, the cell mass contained in the solution is divided into a plurality of cell masses when passing through the nozzle.
  • a somatic cell transport mechanism 90 that sequentially feeds somatic cells to the package device 100 is connected to the second dividing mechanism 80 shown in FIG. Note that when the cell mass is not formed, the second dividing mechanism 80 may be omitted. In this case, the second somatic cell liquid supply path 72 is connected to the somatic cell transport mechanism 90.
  • a pre-package cell flow path 91 is connected between the somatic cell transport mechanism 90 in the housing 200 and the package device 100.
  • the somatic cell transport mechanism 90 sequentially sends somatic cells to the package device 100 via the pre-package cell flow path 91 using a pump or the like.
  • the pre-package cell channel 91 may be coated with poly-HEMA so that somatic cells do not adhere.
  • a material that is difficult for somatic cells to adhere may be used as the material of the pre-package cell flow path 91.
  • the conditions in the pre-package cell flow path 91 can be controlled by the controlled temperature and Equivalent to CO 2 concentration.
  • the pre-package cell flow path 91 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • the cryopreservation liquid feeding mechanism 110 is connected to the pre-package cell flow path 91.
  • the cryopreservation solution feeding mechanism 110 sends the cell cryopreservation solution into the pre-package cell flow path 91.
  • somatic cells are suspended in the cell cryopreservation solution in the pre-package cell flow path 91.
  • Package device 100 sequentially freezes somatic cells sent via pre-package cell flow path 91. For example, every time a somatic cell is received, the packaging apparatus 100 puts the somatic cell in a cryopreservation container such as a cryotube, and instantaneously freezes the solution containing the somatic cell at ⁇ 80 ° C. or lower.
  • a cryopreservation container having a small surface area per volume tends to be frozen
  • the shape of the cryopreservation container includes, but is not limited to, a capillary shape and a spherical shape. Further, depending on the required survival rate of the cells after thawing, it is not always necessary to freeze them instantly.
  • a vitrification method for example, a vitrification method is used.
  • DAP213 Cosmo Bio Inc.
  • Freezing Medium Reprocell Corp.
  • Freezing may be performed by a normal method other than the vitrification method.
  • CryoDefend-Stem Cell R & D System
  • STEM-CELLBANKER registered trademark, Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • Freezing may be performed with liquid nitrogen or with a Peltier element. When a Peltier element is used, it is possible to control temperature changes and suppress temperature unevenness.
  • the package device 100 carries the cryopreservation container out of the housing 200. When frozen cells are for clinical use, the cryopreservation container is preferably a fully closed system. However, the packaging device 100 may be packaged in a storage container without freezing somatic cells.
  • the solvent of the solution containing somatic cells may be replaced with a cryopreservation solution using a solution replacement device 101 as shown in FIG.
  • a filter 102 is provided on the bottom surface with pores through which somatic cells do not pass.
  • the solution replacement device 101 has a somatic cell introduction hole connected with a first liquid supply flow path 103 for supplying a medium containing somatic cells on an internal filter 102, and somatic cells on the internal filter 102.
  • a replacement solution introduction hole to which a second liquid supply flow path 104 for supplying a freezing liquid not included is connected, and a first discharge flow path 105 for discharging the frozen liquid containing somatic cells from the internal filter 102 are connected. Somatic outflow holes are provided.
  • the solution displacement device 101 is provided with a waste liquid outflow hole to which a second discharge channel 106 for discharging the solution that has passed through the filter 102 is connected.
  • a tube or the like can be used for each of the first liquid supply flow path 103, the second liquid supply flow path 104, the first discharge flow path 105, and the second discharge flow path 106.
  • cryopreservation solution is added and somatic cells are dispersed in the cryopreservation solution. Thereafter, as shown in FIG. 6G, the cryopreservation liquid containing somatic cells is discharged from the first discharge flow path 105.
  • the cryopreservation solution containing somatic cells is sent to a cryopreservation container or the like via the first discharge channel 105.
  • the sterilizer may further include a sterilizer for sterilizing the inside of the housing 200.
  • the sterilizer may be a dry heat sterilizer.
  • the wiring of the devices using electricity such as the separation device 10, the pre-introduction cell liquid supply path 20, the induction factor liquid supply mechanism 21, the factor introduction apparatus 30, the cell preparation apparatus 40, and the package apparatus 100 has heat resistance. It is preferable that the wiring has.
  • the sterilization apparatus may sterilize the inside of the housing 200 by releasing a sterilizing gas such as ozone gas, hydrogen peroxide gas, or formalin gas into the housing 200.
  • the separation apparatus 10 In the somatic cell production system, the separation apparatus 10, the pre-introduction cell liquid supply path 20, the induction factor liquid supply mechanism 21, the factor introduction apparatus 30, the cell preparation apparatus 40, the operation record of the package apparatus 100, etc., and the imaging apparatus photographed.
  • the image may be transmitted to an external server by wire or wireless.
  • the external server controls the separation device 10 of the somatic cell production system, the induction factor liquid feeding mechanism 21, the factor introduction device 30, the cell preparation device 40, the packaging device 100, and the like based on the standard work procedure (SOP). Depending on the SOP, whether or not each device is operating may be monitored, and an operation record of each device may be automatically generated.
  • SOP standard work procedure
  • somatic cells can be automatically induced.
  • the somatic cell production system is not limited to the configuration shown in FIGS.
  • blood is fed from the blood storage unit 201 to the mononuclear cell separation unit 203 via the blood feeding channel 202.
  • a tube can be used as the blood storage unit 201 and the mononuclear cell separation unit 203.
  • the blood liquid supply path 202 is, for example, a resin tube or a silicon tube. The same applies to other liquid feeding paths described later.
  • Blood information may be managed by attaching an identifier such as a barcode to the blood storage unit 201.
  • a pump 204 is used for liquid feeding. As the pump 204, a positive displacement pump can be used.
  • Examples of positive displacement pumps include reciprocating pumps including piston pumps, plunger pumps, and diaphragm pumps, or rotary pumps including gear pumps, vane pumps, and screw pumps.
  • Examples of the diaphragm pump include a tubing pump and a piezoelectric (piezo) pump.
  • Examples of the tubing pump include a peristaltic pump (registered trademark, Ato Corporation), and RP-Q1 and RP-TX (Takasago Electric Co., Ltd.).
  • Examples of piezoelectric pumps include SDMP304, SDP306, SDM320, and APP-20KG (Takasago Electric Co., Ltd.).
  • liquid can be fed without directly contacting the blood inside the blood feeding path 202.
  • a hermetic pump such as a peristaltic pump (registered trademark), a tubing pump, or a diaphragm pump
  • liquid can be fed without directly contacting the blood inside the blood feeding path 202.
  • a syringe pump may be used as the pump 204 and the pump 207, the pump 216, the pump 222, the pump 225, the pump 234, the pump 242, and the pump 252 described later.
  • Even pumps other than the hermetic pump can be reused by heat sterilization treatment or the like.
  • the red blood cell coagulant is sent to the mononuclear cell separation unit 203 from the separation agent storage unit 205 via the liquid feeding path 206 and the pump 207.
  • the separating agent storage unit 205 for example, a tube can be used.
  • the separating agent storage unit 205 may be managed by attaching an identifier such as a barcode to manage the separating agent information.
  • the erythrocyte coagulant for example, HetaSep (registered trademark, STEMCELL Technologies) or erythrocyte coagulant (Nipro) can be used.
  • erythrocytes are precipitated by the erythrocyte coagulant, and mononuclear cells are separated.
  • the supernatant containing the mononuclear cells in the mononuclear cell separation unit 203 is sent to the mononuclear cell purification filter 210 via the mononuclear cell feeding path 208 and the pump 209.
  • the mononuclear cell purification filter 210 components other than the mononuclear cells are removed, and a solution containing mononuclear cells as cells before introduction is obtained.
  • Purecell registered trademark, PALL
  • CellSorba E As the mononuclear cell purification filter 210, Purecell (registered trademark, PALL), CellSorba E (Asahi Kasei Corporation), Sepacel PL (Asahi Kasei Corporation), Adacolumn (registered trademark, JIMRO), and separation bag (Nipro Corporation) Etc.
  • PALL Purcell
  • CellSorba E Asahi Kasei Corporation
  • Sepacel PL Asahi Kasei Corporation
  • Adacolumn registered trademark, J
  • the mononuclear cell separation unit 203, the separation agent storage unit 205, the mononuclear cell purification filter 210, the pumps 204, 207, 209, and the like constitute a separation device.
  • the separation device may be omitted.
  • the solution containing the pre-introduction cells is sent to the factor introduction unit 213 via the pre-introduction cell liquid supply channel 211 and the pump 212.
  • a tube can be used as the factor introduction unit 213.
  • the somatic cell inducing factor is sent to the factor introducing unit 213 from the factor storage unit 214 including the somatic cell inducing factor via the factor feeding path 215 and the pump 216.
  • a tube can be used as the factor storage unit 214.
  • the factor storage unit 214 may be attached with an identifier such as a barcode to manage information on somatic cell induction factors.
  • the factor storage unit 214, the pump 216, and the like constitute an induction factor liquid feeding mechanism.
  • a somatic cell induction factor is introduced into a cell by, for example, an RNA lipofection method, and an induction factor introduction cell is produced.
  • the transfection method of the inducer is not limited to the RNA lipofection method.
  • a Sendai virus vector containing a somatic cell inducing factor may be used.
  • the somatic cell inducing factor may be a protein.
  • transfection of the inducer may be performed multiple times over several days.
  • Induced factor-introduced cells are sent to a somatic cell incubator 219 as a part of a cell preparation device via an introduced cell liquid supply path 217 and a pump 218.
  • the introduced cell liquid supply path 217 is, for example, temperature permeable and CO 2 permeable.
  • the somatic cell incubator 219 receives the drug from the cell medium storage unit 220 including the drug-containing cell medium for the first several days after the introduction of the somatic cell-inducing factor into the cell via the medium feeding path 221 and the pump 222. Contained cell culture medium.
  • the drug-containing cell culture medium contains a drug that kills cells into which no drug resistance factor has been introduced.
  • the medium feeding path 221 is, for example, temperature permeable and CO 2 permeable.
  • the drug-containing cell culture medium storage unit 220 may be managed with information on the drug-containing cell culture medium by attaching an identifier such as a barcode.
  • the drug-containing cell culture medium storage unit 220, the culture medium feeding path 221 and the pump 222 constitute a culture medium supply device.
  • the somatic cell culture device 219 is supplied with the somatic cell culture medium from the somatic cell culture medium storage unit 223 including the somatic cell culture medium suitable for the target somatic cell via the culture medium feeding path 224 and the pump 225.
  • the somatic cell culture medium storage unit 223 may be attached with an identifier such as a barcode to manage information on the somatic cell culture medium.
  • the medium feeding path 224 is, for example, temperature permeable and CO 2 permeable.
  • the somatic cell culture medium storage unit 223, the medium supply path 224, and the pump 225 constitute a medium supply device.
  • the drug-containing cell culture medium storage unit 220 and the somatic cell culture medium storage unit 223 may be refrigerated and stored at a low temperature such as 4 ° C. in the refrigerated storage unit 259, for example.
  • the medium sent from the drug-containing cell culture medium storage unit 220 and the somatic cell culture medium storage unit 223 may be sent to the incubator after being heated to 37 ° C. by a heater outside the refrigeration storage unit 259, for example. Or you may set the temperature around a liquid feeding path so that it may heat up to 37 degreeC while the culture medium preserve
  • the old medium in the somatic cell culture vessel 219 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid supply path 226 and the pump 227.
  • the waste liquid storage unit 228 may be managed by attaching an identifier such as a barcode to manage the information on the waste liquid.
  • the somatic cells cultured in the somatic cell culture device 219 are supplied to the first expansion culture device 232 as a part of the cell preparation device via the introduction cell liquid supply channel 229, the pump 230, and optionally the cell mass divider 231. Sent to. By passing through the cell mass divider 231, the cell mass is divided into smaller cell masses. If no cell mass is formed, the cell mass divider 231 may be omitted.
  • the first expansion incubator 232 is supplied with the somatic cell culture medium from the somatic cell culture medium storage unit 223 including the somatic cell culture medium via the medium feeding path 233 and the pump 234.
  • the introduced cell feeding path 229 and the medium feeding path 233 are, for example, temperature permeable and CO 2 permeable.
  • the somatic cell culture medium storage unit 223, the culture medium supply path 233, and the pump 234 constitute a culture medium supply device.
  • the old medium in the first expansion incubator 232 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid feed path 235 and the pump 236.
  • the somatic cells cultured in the first expansion incubator 232 pass through the introduction cell liquid supply channel 237, the pump 238, and optionally the cell clump divider 239, and then the second expansion incubator as a part of the cell preparation device. 240.
  • the cell clump divider 239 By passing through the cell clump divider 239, the cell clump is divided into smaller cell clumps. If a cell mass is not formed, the cell mass divider 239 may be omitted.
  • the second expansion incubator 240 is supplemented with the somatic cell culture medium from the somatic cell culture medium storage unit 223 including the somatic cell culture medium via the culture medium feeding path 241 and the pump 242.
  • the introduced cell feeding path 237 and the medium feeding path 241 are, for example, temperature permeable and CO 2 permeable.
  • the somatic cell culture medium storage unit 223, the culture medium supply path 241 and the pump 242 constitute a culture medium supply device.
  • the old medium in the second expansion incubator 240 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid supply path 243 and the pump 244.
  • the somatic cells cultured in the second expansion incubator 240 are sent to the solution replacement device 247 via the introduced cell liquid supply path 245 and the pump 246.
  • the solution replacer 247 may have, for example, the configuration shown in FIG. In the solution replacement device 247 shown in FIG. 7, somatic cells are held by a filter, and the culture medium is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid supply path 248 and the pump 249.
  • the solution replacement unit 247 After stopping the flow of the solution in the waste liquid feeding path 248 by stopping the driving of the pump 249 or closing the waste liquid feeding path 248 with a valve or the like, the solution replacement unit 247 includes a cryopreservation liquid containing a cryopreservation liquid.
  • the cryopreservation solution is put from the storage unit 250 through the liquid supply path 251 and the pump 252. Thereby, somatic cells are dispersed in the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation liquid in which the somatic cells are dispersed is sent into the cryopreservation container 255 via a liquid supply path 253 and a pump 254 as a part of the package device.
  • the cryopreservation container 255 is placed in a low temperature storage 256.
  • a low temperature storage 256 For example, -80 ° C. liquid nitrogen is sent from the liquid nitrogen storage 257 to the low temperature storage 256 through the liquid supply path 258.
  • the somatic cells in the cryopreservation container 255 are frozen.
  • freezing of somatic cells may not depend on liquid nitrogen.
  • the low temperature storage 256 may be a freezer such as a compression freezer, an absorption freezer, or a Peltier freezer. If freezing is unnecessary, somatic cells need not be frozen.
  • the container 247 and the like are stored in, for example, a cassette-shaped case 260 made of resin or the like.
  • the case 260 is made of a heat-resistant material that can be sterilized, for example.
  • the inside of the case 260 is set to an environment suitable for cell culture, for example, at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • the liquid supply path through which the medium flows is made of, for example, a CO 2 permeable material.
  • case 260 is not limited to a cassette shape.
  • a flexible bag may be used.
  • the above-described liquid supply path, mononuclear cell separation unit 203, mononuclear cell purification filter 210, factor introduction unit 213, somatic cell incubator 219, first expansion incubator 232, second expansion incubator 240, and The solution replacer 247 and the like may be divided and stored in a plurality of cases.
  • the case 260 is disposed in the housing 200.
  • the nitrogen storage 257 is disposed inside the housing 200 and outside the case 260.
  • the case 260 and the housing 200 include, for example, fitting portions that fit each other. For this reason, the case 260 is disposed at a predetermined position in the housing 200. Further, in the housing 200, a pump, a blood storage unit 201, a separation agent storage unit 205, a factor storage unit 214, a drug-containing cell culture medium storage unit 220, a somatic cell culture medium storage unit 223, a waste liquid storage unit 228, and a cryopreservation container 255.
  • the low temperature storage 256 and the liquid nitrogen storage 257 are disposed at predetermined positions.
  • the liquid supply path in the case 260 is a pump, a blood storage unit 201, a separation agent storage unit 205, a factor storage unit 214, a drug-containing cell culture medium storage unit. 220, the somatic cell culture medium storage unit 223, the waste liquid storage unit 228, the cryopreservation container 255, the low temperature storage unit 256, and the liquid nitrogen storage unit 257.
  • case 260 and its inclusions are disposable, and after freezing of the somatic cells, they may be discarded and replaced with new ones.
  • identifiers such as a barcode, may be attached to case 260, and the number of times of use etc. may be managed.
  • somatic cell manufacturing system it is possible to automatically manufacture somatic cells from pre-introduction cells without intervention of a person.
  • the factor introduction apparatus 30 may induce cells by transfection using a virus vector such as a retrovirus, a lentivirus, or a Sendai virus, a plasmid, or a protein transfection.
  • the factor introduction device 30 may induce cells by electroporation.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20, the introduced cell liquid supply path 31, the first somatic cell liquid supply path 51, the expanded culture liquid supply path 71, the second somatic cell liquid supply path 72, and the pre-package cell flow path 91 are It may be provided on the substrate by microfluidics technology.
  • the present invention includes various embodiments and the like not described herein.
  • Example 1 A 12-well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared, and ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase) inhibitor (Selleck) at a concentration of 10 ⁇ mol / L in each well. ) -Containing feeder-free medium (mTeSR (registered trademark) 1, STEMCELL Technologies). ROCK inhibitors suppress cell death.
  • mTeSR registered trademark
  • STEMCELL Technologies STEMCELL Technologies
  • iPS cells were dispersed in a tissue / cultured cell detachment / separation / dispersion solution (Accutase, Innovative Cell Technologies) and spread in a 12-well dish. Transfected cells were seeded at a density of 4 ⁇ 10 5 cells per well. The bottom area of 1 well was 4 cm 2 . Untransfected control cells were seeded at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well. Thereafter, the cells were cultured in feeder-free medium for 24 hours. At this time, the temperature was 37 ° C., the CO 2 concentration was 5%, and the oxygen concentration was 25% or less.
  • Green fluorescent protein (GFP) mRNA TriLink was prepared.
  • the mRNA was capped with Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), polyadenylated, and substituted with 5-methylcytidine and pseudouridine.
  • ARCA Anti-Reverse Cap Analog
  • microcentrifuge tube A and 1.5 mL of microcentrifuge tube B were prepared for each number of wells.
  • tube B 62.5 ⁇ L of low serum medium (Opti-MEM (registered trademark), Gibco) was added, 500 ng of GFP mRNA (Trilink) was added, and mixed well to obtain the second reaction solution.
  • Opti-MEM registered trademark
  • Gibco 500 ng of GFP mRNA
  • the second reaction solution was added to the first reaction solution in the tube A to obtain a mixed reaction solution, and then the tube A was tapped so that liposomes were formed at room temperature for 5 minutes. Next, the mixed reaction solution was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. overnight. This added 500 ng of GFP mRNA to each well.
  • Example 2 A 12-well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared, and ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase) inhibitor (Selleck) at a concentration of 10 ⁇ mol / L in each well. ) -Containing feeder-free medium (mTeSR (registered trademark) 1, STEMCELL Technologies). ROCK inhibitors suppress cell death.
  • mTeSR registered trademark
  • STEMCELL Technologies STEMCELL Technologies
  • iPS cells were dispersed in a tissue / cultured cell detachment / separation / dispersion solution (Accutase, Innovative Cell Technologies) and spread in a 12-well dish. Transfected cells were seeded at a density of 4 ⁇ 10 5 cells per well. Untransfected control cells were seeded at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well. Thereafter, the cells were cultured in feeder-free medium for 24 hours.
  • Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink) and green fluorescent protein (GFP) mRNA (Trilink) were prepared.
  • the mRNA was capped with Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), polyadenylated, and substituted with 5-methylcytidine and pseudouridine.
  • mRNA is purified by a silica membrane, and is made with a solution using 1 mmol / L sodium citrate having a pH of 6 together with a reagent for introducing mRNA (Lipofectamine MessengerMax (registered trademark), Invitrogen).
  • 1.5 mL of microcentrifuge tube A and 1.5 mL of microcentrifuge tube B were prepared for each number of wells.
  • the second reaction solution was added to the first reaction solution in the tube A to obtain a mixed reaction solution, and then the tube A was tapped so that liposomes were formed at room temperature for 5 minutes. Next, the mixed reaction solution was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. overnight. Thereby, 500 ng of Ngn2 mRNA and 100 ng of GFP mRNA were added to each well.
  • the medium is a neuronal differentiation medium (N2 / DMEM / N) containing a ROCK inhibitor (Selleck) at a concentration of 10 ⁇ mol / L and an antibiotic (puromycin) at a concentration of 1 mg / L.
  • N2 / DMEM / N a neuronal differentiation medium
  • F12 / NEAA, Invitrogen a ROCK inhibitor
  • F12 / NEAA, Invitrogen containing B18R recombinant protein-containing solution (eBioscience) at a concentration of 200 ng / mL.
  • B18R recombinant protein-containing solution eBioscience
  • the medium was removed from the wells and washed with 1 mL of PBS. Thereafter, 4% PFA was added and reacted at 4 ° C. for 15 minutes for fixation. After washing twice with PBS, the primary antibody was diluted with 5% CCS, 0.1% Triton in PBS medium, and 500 ⁇ L was added.
  • Tuj1 antibody As a primary antibody, rabbit anti-human Tuj1 antibody (BioLegend 845501) and mouse anti-rat and human Ngn2 antibody (R and D Systems) are used, and rabbit anti-human Tuj1 antibody (BioLegend 845501) is diluted 1/1000 with buffer, or Mouse anti-rat and human Ngn2 antibody (R and D Systems) diluted 1/75 with buffer, and further diluted with DAPI 1/1000 with buffer were added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Tuj1 antibody is an antibody against ⁇ -III Tubulin.
  • the cells were washed twice with PBS, observed with a fluorescence microscope, and the cells emitting fluorescence were counted.
  • FIG. 12 shows the introduction of Ngn2-T2A-Puro mRNA using lipofection, followed by culturing for 2 days after adding puromycin, further culturing for 5 days without adding puromycin, and staining with Tuji1 for fluorescence microscopy. It is the photograph observed in.
  • FIG. 13 shows the ratio of TUJ-1-positive cells on day 7 after transfection of Ngn2-T2A-Puro mRNA using the transfection reagents according to the above procedure. These results indicated that nerve cells were induced.
  • Example 3 A 12-well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared, and ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase) inhibitor (Selleck) at a concentration of 10 ⁇ mol / L in each well. ) -Containing feeder-free medium (mTeSR (registered trademark) 1, STEMCELL Technologies).
  • ROCK Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase inhibitor
  • iPS cells were dispersed in a tissue / cultured cell detachment / separation / dispersion solution (Accutase, Innovative Cell Technologies) and spread in a 12-well dish. Transfected cells were seeded at a density of 4 ⁇ 10 5 cells per well. Untransfected control cells were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 per well. Thereafter, the cells were cultured in feeder-free medium for 24 hours. At this time, the temperature was 37 ° C., the CO 2 concentration was 5%, and the oxygen concentration was 25% or less.
  • the feeder-free medium in each well was replaced with a B18R-containing transfection medium or a B18R-free transfection medium, and the cells were cultured at 37 ° C. for 2 hours.
  • Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink) and GFP mRNA (Trilink) were prepared.
  • the mRNA was capped with Anti-Reverse Cap Analog (ARCA), polyadenylated, and substituted with 5-methylcytidine and pseudouridine.
  • ARCA Anti-Reverse Cap Analog
  • microcentrifuge tube A and 1.5 mL of microcentrifuge tube B were prepared for each number of wells.
  • tube B put 62.5 ⁇ L of low serum medium (Opti-MEM (registered trademark), Gibco), add 500 ng of Ngn2-T2A-Puro mRNA (Trilink) and 100 ng of GFP mRNA (Trilink). A second reaction solution was prepared by mixing.
  • Opti-MEM registered trademark
  • Gibco low serum medium
  • Trilink 500 ng of Ngn2-T2A-Puro mRNA
  • Trilink 100 ng of GFP mRNA
  • the second reaction solution was added to the first reaction solution in the tube A to obtain a mixed reaction solution, and then the tube A was tapped so that liposomes were formed at room temperature for 5 minutes. Next, the mixed reaction solution was added to each well and allowed to stand at 37 ° C. overnight. Thereby, 500 ng of Ngn2 mRNA and 100 ng of GFP mRNA were added to each well. Moreover, as shown in FIG. 14, the transfection was performed once, twice, and three times.
  • the medium is a neuronal differentiation medium (N2 / DMEM / N) containing a ROCK inhibitor (Selleck) at a concentration of 10 ⁇ mol / L and an antibiotic (puromycin) at a concentration of 1 mg / L.
  • N2 / DMEM / N a neuronal differentiation medium
  • F12 / NEAA, Invitrogen a ROCK inhibitor
  • F12 / NEAA, Invitrogen containing B18R recombinant protein-containing solution (eBioscience) at a concentration of 200 ng / mL.
  • B18R recombinant protein-containing solution eBioscience
  • a primary antibody diluted with a permeation buffer containing 5% CCS and 0.1% Triton X in PBS was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the primary antibody is a mouse anti-human Tuj1 antibody (BioLegend 845501) diluted 1: 1000, and a mouse anti-human Ngn2 antibody (R and D Systems, MAB3314-SP) diluted 1: 150 with a permeation buffer.
  • DAPI was added to be 1: 10,000.
  • the cells were washed twice with PBS, observed with a fluorescence microscope, and the cells emitting fluorescence were counted. As a result, as shown in FIG. 15, GFP was hardly expressed on the 9th day in the case where mRNA was transfected only once. On the other hand, GFP was expressed on the 9th day after three transfections of mRNA. From this, it became clear that mRNA was degraded in cells and protein expression was transient.
  • RNA can be transfected and induced into neurons within a few days.
  • B18R protein which is usually used for suppressing cell death associated with immune reaction accompanying RNA insertion into cells, in the medium.

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Abstract

導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、導入前細胞送液路２０に接続され、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置４０と、を備える体細胞製造システム。

Description

体細胞製造システム
　本発明は体細胞誘導技術に関し、特に体細胞製造システムに関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。
　このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。また、近年、特定の遺伝子を細胞へ導入することで、特定の細胞から、別の細胞を作製できる技術も確立されている。このような技術は、ｉＰＳ細胞と同様、移植医療やドラッグスクリーニングに活用できると期待されている。
　従来、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させる方法は数多くある。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い分化誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を体細胞へと分化誘導するときに用いる技術を確立し、分化誘導の効率及び精度を向上させ、作製した体細胞の機能性などが移植治療に耐えうるものである必要がある。
　ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から体細胞へ分化誘導する方法は、細胞の性質を決定するホルモンや成長因子、並びに低分子化合物を組み合わせ、それらの量比や濃度を経時的に変える事で、発生の過程を模倣したような形で行なわれてきている。しかし、発生の過程を試験管内で完全に模倣することは難しく効率が悪い。また、マウスの体細胞分化誘導に比べてヒトの場合は非常に長い分化誘導期間が必要であり、例えば成熟した神経を作製するためには３ヶ月以上を要する。さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって分化誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。
　具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて分化誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞の分化誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の成熟度に一致する体細胞を作製することは非常に重要である。
　また、神経細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在するが、ホルモンや化学物質を利用する方法では、これらのサブタイプ神経を均一にＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化誘導できない。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植することができない。
　これに対し、ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を規定する遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。ウイルスを用いる方法は、ホルモンや化学物質を利用する方法に比べて、例えば２週間のような非常に短い期間で成熟した神経細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子導入により神経細胞を作製すると、例えば興奮性神経のみを均一に得ることができる。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であり、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植できると考えられている。
　また、ｉＰＳ細胞を体細胞に分化させた場合、分化した体細胞中に未分化なｉＰＳ細胞が残存する恐れがある。そこで、ｉＰＳ細胞を経由せず、体細胞から別の体細胞へと分化させる方法も確立されている。具体的には、繊維芽細胞を心筋細胞や神経細胞へと分化させる方法が開発されている。これらの方法は、ダイレクトリプログラミングと呼ばれ、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を経由しないため、移植時に未分化の多能性細胞が残存するというリスクがない。
特許第４１８３７４２号公報
　体細胞は、細胞に遺伝子等の誘導因子を導入することによって樹立され、拡大培養され、必要に応じて凍結保存される。しかし、例えば臨床用の体細胞（例えば、ＧＬＰ，ＧＭＰグレード）を作製し産業化するには、以下のような問題点がある。
　１）　コスト
　臨床用の体細胞は非常に綺麗に保たれたクリーンルームで作製、保存される必要がある。しかし、要求されるレベルの清潔度を維持するコストは非常に高額である。そのため、臨床用の体細胞を作るのにコストがかかり、産業化への大きな障害となっている。
　２）　品質
　体細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であり、手作業によるところが多い。また、体細胞の作製は、個人の技量に負っているところがある。そのため、作製者や実験バッチによって、臨床用体細胞の品質のばらつきが生じうる。
　３）　時間
　クリーンルームの中で特定のドナー以外の他人の細胞とのクロスコンタミネーションを防ぐために、一人の人間のみに由来する臨床用体細胞が所定の時間をかけてクリーンルーム内で作製される。また臨床用体細胞の樹立、品質評価には長時間を要する。しかし、臨床用体細胞は、クリーンルームで一度に一人の人間のためだけに作製されるので、多くの希望者の臨床用体細胞を作製するのに非常に長い時間を要する。
　４）　人材
　上述したように、現状、臨床用体細胞の作製は手作業によるところが大きい。しかし、臨床用体細胞を作製することができるのに必要な技術を有する技術者は少ない。
　これに対し、本発明は、体細胞を製造可能な体細胞製造システムを提供することを目的の一つとする。なお、体細胞は、臨床用体細胞に限定されない。
　本発明の態様によれば、導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路と、導入前細胞送液路に接続され、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、を備える、体細胞製造システムが提供される。
　上記の体細胞製造システムが、導入前細胞送液路、因子導入装置、及び細胞作製装置を格納する筐体をさらに備えていてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、多能性幹細胞を除いてもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、分化細胞を含んでいてもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、体性幹細胞を含んでもよい。体性幹細胞は、成体幹細胞又は組織幹細胞ともいう。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、神経系細胞を含んでもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、繊維芽細胞を含んでもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、心筋細胞、角化細胞（ケラチノサイト）、又は網膜細胞を含んでもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、導入前細胞が、多能性幹細胞を含んでもよい。多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を含んでもよい。導入前細胞が、体性幹細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、分化した体細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、血液細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、繊維芽細胞を含んでいてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、細胞作製装置が、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置と、体細胞培養装置で樹立された体細胞を拡大培養する拡大培養装置と、を備え、体細胞培養装置が、誘導因子導入細胞に培地を補給する第１の培地補給装置を備え、拡大培養装置が、体細胞に培地を補給する第２の培地補給装置を備えていてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞培養装置が、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置をさらに備えていてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、因子導入装置が、導入前細胞送液路に接続された因子導入部と、体細胞誘導因子を保存する因子保存部と、因子保存部から導入前細胞送液路又は因子導入部に体細胞誘導因子を流すための因子送液路と、因子送液路内の液体を流すためのポンプと、を備えていてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質であってもよい。
　上記の体細胞製造システムの因子導入部において、ＲＮＡリポフェクションにより、導入前細胞に体細胞誘導因子が導入されてもよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子がベクターに組み込まれていてもよい。ベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。
　上記の体細胞製造システムが、細胞作製装置で作製された体細胞をパッケージするパッケージ装置をさらに備え、筐体がパッケージ装置を格納してもよい。
　上記の体細胞製造システムが、筒状部材と、筒状部材の内部に配置された液体透過フィルターと、を備える溶液置換器であって、筒状部材に、液体透過フィルター上に、細胞作製装置で作製された体細胞を含む溶液を導入するための体細胞導入孔と、液体透過フィルター上に、置換溶液を導入するための置換溶液導入孔と、液体透過フィルター上に、体細胞を含む置換溶液を流出するための体細胞流出孔と、液体透過フィルターを透過した溶液が流出する廃液流出孔と、が設けられている溶液置換器をさらに備えていてもよい。
　上記の体細胞製造システムが、溶液置換器の廃液流出孔に接続された廃液送液路をさらに備え、体細胞を含む溶液の溶液を廃棄する際に廃液送液路における溶液の流動が許容され、置換溶液中に体細胞を分散させる際に廃液送液路における溶液の流動が許容されなくともよい。
　上記の体細胞製造システムにおいて、置換溶液が凍結保存液であってもよい。
　上記の体細胞製造システムが、血液から導入前細胞を分離する分離装置をさらに備え、分離装置で分離された導入前細胞を含む溶液が導入前細胞送液路を通過してもよい。
　本発明によれば、体細胞を製造可能な体細胞製造システムを提供可能である。
本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムで用いられる培養バッグの模式図である。 本発明の実施の形態に係る溶液置換器の模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 実施例１に係る細胞の写真である。 実施例１に係る細胞の写真である。 実施例１に係るトランスフェクション効率と生存率の割合を示したグラフである。 実施例２に係る細胞の写真である。 実施例２に係るＴＵＪ－１陽性細胞の割合を示したグラフである。 実施例２に係るＴＵＪ－１陽性細胞の割合を示したグラフである。 実施例３に係るトランスフェクションの方法の模式図である。 実施例３に係る細胞の写真である。
　以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
　なお、本開示は、米国で仮出願（６２／３５６，１９９）され、既に外国出願許可証が発せられた発明を含んでいる。
　本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムは、図１に示すように、導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、導入前細胞送液路２０に接続され、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置４０と、導入前細胞送液路２０、因子導入装置３０、及び細胞作製装置４０を格納する筐体２００と、を備える。
　導入前細胞は、例えば、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞が使用可能である。あるいは、導入前細胞は、例えば、分化細胞である。分化細胞としては、体性幹細胞、血液細胞、及び繊維芽細胞の分化した体細胞等が使用可能である。体性幹細胞は、成体幹細胞又は組織幹細胞ともいう。
　体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞は、多能性幹細胞を除く。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞は、分化細胞である。分化細胞としては、体性幹細胞、神経系細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、肝細胞、網膜細胞、角膜細胞、血液細胞、角化細胞（ケラチノサイト）及び軟骨細胞等が挙げられる。神経系細胞は、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞は、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞のいずれかであってもよい。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。神経系細胞は、ＭＡＰ２陽性であってもよいし、β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性であってもよい。
　体細胞製造システムは、さらに、筐体２００内の気体を清浄にする空気清浄装置、筐体２００内の気体の温度を管理する温度管理装置、及び筐体２００内の気体の二酸化炭素（ＣＯ2）濃度を管理する二酸化炭素濃度管理装置を備えていてもよい。空気清浄装置は、筐体２００内の気体の清浄度を監視する清浄度センサーを備えていてもよい。空気清浄装置は、例えば、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　Ａｉｒ）フィルター及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　Ａｉｒ）フィルター等を用いて、筐体２００内の空気を清浄化する。空気清浄装置は、例えば、筐体２００内の空気の清浄度を、ＩＳＯ基準１４６４４－１でＩＳＯ１からＩＳＯ６のクラスにする。温度管理装置は、筐体２００内の気体の温度を監視する温度センサーを備えていてもよい。ＣＯ2濃度管理装置は、筐体２００内の気体のＣＯ2濃度を監視するＣＯ2濃度センサーを備えていてもよい。
　筐体２００には、例えば扉等が設けられているが、扉が閉じられた状態では、内部が完全に閉鎖され、内部の空気の清浄度、温度、及びＣＯ2濃度を一定に保つことが可能である。筐体２００は、外部から内部の装置の状態を観察できるよう、透明であることが好ましい。また、筐体２００は、ゴム手袋等のグローブが一体化された、グローブボックスであってもよい。
　筐体２００には、導入前細胞送液路２０に連通する導入口が設けられていてもよい。当該開口には、扉等が設けられていてもよい。あるいは、当該導入口は、着脱可能な封止材で封止可能であってもよい。導入前細胞は、当該導入口から、導入前細胞送液路２０に入れられる。あるいは、筐体２００内に、導入前細胞送液路２０に連通する、導入前細胞を保存する導入前細胞保存容器が配置されていてもよい。
　またあるいは、体細胞製造システムは、図２に示すように、筐体２００内に配置された、血液から導入前細胞を分離する分離装置１０をさらに備えていてもよい。この場合、導入前細胞送液路２０は、分離装置１０に接続される。導入前細胞送液路２０には、分離装置１０で分離された導入前細胞を含む溶液が通過する。
　筐体２００内の分離装置１０は、例えばヒトの血液が入ったバイアルを受け取る。分離装置１０は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ液、テルモ株式会社）等の抗凝固剤を保存する抗凝固剤タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、抗凝固剤タンクから、ヒトの血液に、抗凝固剤を添加する。
　また、分離装置１０は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等の単核細胞分離用試薬を保存する分離用試薬タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、分離用試薬タンクから、例えば１５ｍＬチューブ２本に、単核細胞分離用試薬を５ｍＬずつ分注する。なお、チューブの代わりに、樹脂バッグを用いてもよい。
　さらに、分離装置１０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を保存する緩衝液タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、緩衝液タンクから、例えばヒトの血液５ｍＬに、緩衝液５ｍＬを加えて希釈する。またさらに、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、希釈されたヒトの血液を、チューブ中の単核細胞分離用試薬上に、５ｍＬずつ加える。
　分離装置１０は、温度設定可能な遠心機をさらに備える。遠心機は、例えば１８℃に設定される。分離装置１０は、移動装置等を用いて、単核細胞分離用試薬及びヒトの血液等が入れられたチューブを、遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば４００×ｇで３０分間遠心する。チューブの代わりに、樹脂バッグを遠心させてもよい。
　遠心後、分離装置１０は、チューブ中の溶液の単核球で白く濁った中間層をポンプ等で回収する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、回収した単核球の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。あるいは、さらに、分離装置１０は、回収した単核球溶液２ｍＬに対し、例えばＰＢＳ１２ｍＬを加えて、チューブを遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば２００×ｇで１０分間遠心する。
　遠心後、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、チューブ中の溶液の上清を吸引して除去し、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（登録商標、ロンザジャパン株式会社）等の単核球培地３ｍＬをチューブ中の単核球溶液に加えて懸濁する。血液細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１　（ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養してもよい。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、導入前細胞としての単核球の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。なお、分離装置１０は、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、予め用意された導入前細胞を使用する場合は、分離装置１０は無くともよい。
　分離装置１０は、遠心分離以外の方法で、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、分離すべき細胞がＴ細胞であればＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞が血管内皮前駆細胞であればＣＤ３４が陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞がＢ細胞であれば、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。また、パニングに限らず、磁気細胞分離方法（ＭＡＣＳ）やフローサイトメトリー等により分離してもよい。
　導入前細胞送液路２０の内壁には、導入前細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、導入前細胞送液路２０の材料に、導入前細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入前細胞送液路２０の材料に、例えば、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、導入前細胞送液路２０内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、導入前細胞送液路２０には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　筐体２００内の誘導因子送液機構２１は、例えば、誘導因子導入試薬溶液等を保存する誘導因子導入試薬タンクを備える。誘導因子送液機構２１は、マイクロポンプ等を用いて、誘導因子導入試薬溶液中に導入前細胞が懸濁されるように、誘導因子導入試薬溶液を、筐体２００内の導入前細胞送液路２０又は因子導入装置３０に送り出す。
　遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、体細胞誘導因子ＲＮＡ、ＲＮＡトランスフェクション溶液、及びＲＮＡトランスフェクション用培地のセットを含む。ＲＮＡトランスフェクションは、ＲＮＡリポフェクションを含む。体細胞誘導因子ＲＮＡのセットは、例えば、ＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、Ｍｙｔ１ＬのｍＲＮＡ、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）のｍＲＮＡをそれぞれ１００ｎｇ含む。Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）は、神経系細胞分化に必要なスイッチタンパク質である。
　体細胞誘導因子ＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等の抗生物質である。薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡが導入された細胞は、薬剤耐性を示す。体細胞誘導因子ＲＮＡは、例えば、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む。Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をトランスフェクトされた細胞は、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
　ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていてもよい。５－メチルシチジン及びプソイドウリジンは、抗体によるｍＲＮＡの認識力を低下させる。
　ＲＮＡトランスフェクション溶液は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）あるいはリポフェクション試薬を含む。ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬及びｍＲＮＡのリポフェクション試薬が使用可能である。より具体的には、ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＲＮＡ－ｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が使用可能である。
　例えば、因子導入装置３０は、細胞に体細胞誘導因子を導入した後に、細胞を培養液に懸濁してもよい。因子導入装置３０は、体細胞誘導因子のトランスフェクションを複数回実施してもよい。例えば、細胞に体細胞誘導因子を導入してから２４時間等の所定の時間の後、培地を交換し、細胞に、再度、体細胞誘導因子をトランスフェクションしてもよい。さらに、細胞への体細胞誘導因子のトランスフェクション、及び所定の時間の細胞培養を、複数回、例えば、２回から４回繰り返してもよい。
　体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に、例えば、１２ウェルプレートを利用する場合、１ウェルあたりの細胞の数は、１×１０４個から１×１０８個、５×１０４個から１×１０６個、あるいは１×１０５個から５×１０５個である。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ２である。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の体細胞誘導因子ＲＮＡの量は、１回あたり２００ｎｇから５０００ｎｇ、４００ｎｇから２０００ｎｇ、あるいは５００ｎｇから１０００ｎｇである。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際のリポフェクション試薬の量は、０．１μＬから１００μＬ、１μＬから５０μＬ、あるいは１．５μＬから１０μＬである。
　体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地は、例えばＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標、Ｇｉｂｃｏ）等の低血清培地である。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、短期間で細胞を体細胞に分化させる場合は、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。
　体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションから１０日以内、９日以内、８日以内、あるいは７日以内に動物細胞が体細胞に分化する。作製される体細胞が神経系細胞である場合、神経系細胞に分化したか否かは、β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、又はＰｓＡ－ＮＣＡＭが陽性であるか否かによって確認される。β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰｓＡ－ＮＣＡＭ、及びｖＧｌｕは、神経細胞を標識するマーカーであり、神経細胞突起中の微小管の構成タンパク質である。
　あるいは、遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、センダイウイルスベクター溶液を含んでいてもよい。センダイウイルス由来のＲＮＡは、宿主のＤＮＡにインテグレーションされないが、宿主において、目的の遺伝子を導入することが出来る。センダイウイルスベクターのセットは、例えば、ＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、Ｍｙｔ１ＬのｍＲＮＡ、Ｎｇｎ２のｍＲＮＡをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１から１０００、０．１から１、あるいは１から１０になるよう含む。誘導因子センダイウイルスベクターは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。センダイウイルスベクターに含まれる誘導因子ＲＮＡは、例えば、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む。なお、細胞へのセンダイウイルスの導入は１回でもよい。
　因子導入装置３０は、ポンプ等を用いて、誘導因子を導入された細胞（誘導因子導入細胞）を含む溶液を、導入細胞送液路３１に送り出す。
　筐体２００内の導入細胞送液路３１の内壁には、誘導因子導入細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、非接着性にしてもよい。あるいは、導入細胞送液路３１の材料に、誘導因子導入細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、例えば、導入細胞送液路３１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、導入細胞送液路３１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、導入細胞送液路３１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。また、図３に示すように、導入細胞送液路３１内部に、内径を断続的に変化させる一又は複数の襞を設けてもよい。またあるいは、図４に示すように、導入細胞送液路３１の内径を断続的に変化させてもよい。
　図１及び図２に示すように、導入細胞送液路３１に接続された細胞作製装置４０は、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置５０と、体細胞培養装置５０で樹立された体細胞からなる細胞塊（細胞コロニー）を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構６０と、体細胞を拡大培養する拡大培養装置７０と、拡大培養装置７０で拡大培養された体細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構８０と、体細胞をパッケージ装置１００に順次送る体細胞搬送機構９０と、を備える。ただし、例えば、細胞塊が形成されない場合、あるいは細胞塊を分割する必要がない場合は、第１の分割機構６０及び第２の分割機構８０は、省略されてもよい。
　体細胞培養装置５０は、内部にウェルプレート、バッグ、及びチューブ等の培養容器を備えていてもよい。また、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンを備えていてもよい。体細胞培養装置５０は、導入細胞送液路３１から体細胞誘導因子導入細胞を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液を培養容器に分配する。
　細胞を神経系細胞に分化させる場合、体細胞培養装置５０は、培養容器に誘導因子導入細胞を入れた後、例えば１から７日目に、神経分化培地であるＮ３培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２５μｇ／ｍＬインシュリン、５０μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、３０ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、２０ｎｍｏｌ／Ｌプロゲステロン、１００ｎｍｏｌ／Ｌプトレシン）を培養容器に加える。培地に数日間１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を添加してもよい。
　体細胞培養装置５０は、培養容器に誘導因子導入細胞を分配後、例えば９日目に、培地交換を行い、以降、神経系細胞等の目的の細胞が観察されるまで培地交換を行う。なお、培地を交換するとは、培地を一部置換することや、補給することも含む。
　体細胞培養装置５０においては、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤選択をおこなってもよい。体細胞誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、薬剤を含む溶液を培養容器に供給することにより、薬剤耐性を示す誘導因子導入細胞が選択的に生き残る。例えば、体細胞誘導因子ＲＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、リポフェクションの後の細胞をピューロマイシンに曝すことにより、体細胞誘導因子ＲＮＡが導入された細胞以外を死滅させ、体細胞誘導因子ＲＮＡが導入された細胞を選別することが可能である。薬剤は、培地に含まれていてもよい。薬剤の濃度は、例えば、２ｍｇ／Ｌである。
　体細胞培養装置５０においては、所定の期間、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む培地を用いて誘導因子導入細胞を培養し、その後、薬剤を含まない培地を用いて誘導因子導入細胞を培養してもよい。
　目的とする体細胞が形成されると、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンで体細胞を回収する。さらに、体細胞培養装置５０は、回収した体細胞が入っている容器をインキュベーターに入れて、３７℃、ＣＯ2５％で１０分間、体細胞と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。なお、物理的に細胞塊を砕ける場合は、トリプシン代替組み替え酵素はなくともよい。例えば、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンによるピペッティングにより、体細胞の細胞塊を砕く。またあるいは、体細胞培養装置５０は、フィルターが設けられたパイプや、図３又は図４に示した導入細胞送液路３１と同様に、内径を断続的に変化させるパイプに細胞塊を通して、細胞塊を砕いてもよい。
　例えば神経を誘導する場合はその後、体細胞培養装置５０は、砕かれた体細胞の細胞塊が入れられた溶液に、上述したような神経分化培地を加える。
　なお、体細胞培養装置５０における培養は、ウェルプレートではなく、バッグの中で行ってもよい。バッグは、ＣＯ2透過性であってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。さらに、体細胞培養装置５０における培養は、ハンギングドロップ培養であってもよい。
　体細胞培養装置５０は、ウェルプレート、バッグ及びチューブ等の培養容器に培養液を含む培地を補給する第１の培地補給装置を備えていてもよい。第１の培地補給装置は、培養容器内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。また、その際、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、体細胞培養装置５０は、培養容器に、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置を備えていてもよい。さらに、体細胞培養装置５０は、培地の温度を管理する温度管理装置、培地のｐＨを管理するｐＨ管理装置、及び培地近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。
　体細胞培養装置５０において、例えば、細胞を、図５に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。バッグ３０２は、ＣＯ2透過性であってもよいし、ＣＯ2透過性でなくてもよい。体細胞培養装置５０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れる外側のバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。
　図１及び図２に示す体細胞培養装置５０には、第１体細胞送液路５１が接続されている。体細胞培養装置５０は、体細胞を含む溶液を、ポンプ等を用いて、第１体細胞送液路５１に送り出す。また、第１体細胞送液路５１は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
　第１体細胞送液路５１の内壁には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第１体細胞送液路５１の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第１体細胞送液路５１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、第１体細胞送液路５１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、第１体細胞送液路５１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　第１体細胞送液路５１は、第１の分割機構６０に接続されている。第１の分割機構６０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第１の分割機構６０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
　第１の分割機構６０には、拡大培養装置７０が接続されている。第１の分割機構６０で分割された体細胞の細胞塊を含む溶液は、拡大培養装置７０に送られる。なお、細胞塊を形成しない場合は、第１の分割機構６０を省略してもよい。この場合、第１体細胞送液路５１は、拡大培養装置７０に接続されている。
　拡大培養装置７０は、例えば、内部にウェルプレートを格納可能である。また、拡大培養装置７０は、ピペッティングマシンを備える。拡大培養装置７０は、第１の分割機構６０又は第１体細胞送液路５１から体細胞を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液をウェルに分配する。拡大培養装置７０は、ウェルに体細胞を分配後、３７℃、ＣＯ2５％で体細胞を例えば８日前後培養する。また、拡大培養装置７０は、適宜培地交換を行う。
　細胞塊が形成される場合、拡大培養装置７０は、細胞塊にＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標、ライフテクノロジーズ社）等のトリプシン代替組み替え酵素を添加する。さらに、拡大培養装置７０は、細胞塊が入っている容器の温度を上昇させて、３７℃、ＣＯ2５％で１分間、細胞塊と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。なお、物理的に細胞塊を砕ける場合は、トリプシン代替組み替え酵素はなくともよい。例えば、拡大培養装置７０は、ピペッティングマシンによるピペッティングにより、細胞塊を砕く。またあるいは、拡大培養装置７０は、フィルターが設けられたパイプや、図３又は図４に示した導入細胞送液路３１と同様に、内径を断続的に変化させるパイプに細胞塊を通して、細胞塊を砕いてもよい。その後、図１及び図２に示す拡大培養装置７０は、細胞塊が入れられた溶液に、維持培養培地等の培地を加える。さらに、拡大培養装置７０は、接着培養である場合は、自動セルスクレーパー等で容器から細胞塊を剥がし、細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送る。
　なお、拡大培養装置７０における培養は、ウェルプレートではなく、バッグやチューブの中で行ってもよい。バッグやチューブはＣＯ2透過性であってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよいし、ハンギングドロップ培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。
　拡大培養装置７０は、ウェルプレート、バッグ及びチューブ等の培養容器に培養液を補給する第２の培地補給装置を備えていてもよい。第２の培地補給装置は、培養容器内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。また、その際、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、拡大培養装置７０は、培地の温度を管理する温度管理装置、及び培地近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。
　拡大培養装置７０においても、例えば、細胞を、図５に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。バッグ３０２は、ＣＯ2透過性であってもよい。拡大培養装置７０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れる外側のバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。
　図１及び図２に示す体細胞製造システムは、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０における培養を撮影する撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、体細胞製造システムは、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、体細胞製造システムは、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
　図１及び図２に示す第１の分割機構６０で分割された細胞塊は、再び拡大培養装置７０内で培養される。必要な細胞の量が得られるまで、第１の分割機構６０における細胞塊の分割と、拡大培養装置７０内での体細胞の培養が繰り返される。なお、上述したように、細胞塊を形成しない場合は、第１の分割機構６０を省略してもよい。
　拡大培養装置７０には、第２体細胞送液路７２が接続されている。拡大培養装置７０は、拡大培養された体細胞を含む溶液を、ポンプ等を用いて、第２体細胞送液路７２に送り出す。ただし、浮遊培養の場合は、剥離は不要である。第２体細胞送液路７２は、所定の大きさ未満の誘導された体細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
　第２体細胞送液路７２の内壁には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第２体細胞送液路７２の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第２体細胞送液路７２の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、第２体細胞送液路７２内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。さらに、第２体細胞送液路７２には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　第２体細胞送液路７２は、第２の分割機構８０に接続されている。第２の分割機構８０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第２の分割機構８０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
　図２に示す第２の分割機構８０に、体細胞をパッケージ装置１００に順次送る体細胞搬送機構９０が接続されている。なお、細胞塊を形成しない場合は、第２の分割機構８０を省略してもよい。この場合、第２体細胞送液路７２が、体細胞搬送機構９０に接続されている。
　筐体２００内の体細胞搬送機構９０と、パッケージ装置１００と、の間には、パッケージ前細胞流路９１が接続されている。体細胞搬送機構９０は、ポンプ等を用いて、体細胞を、パッケージ前細胞流路９１を介して、パッケージ装置１００に順次送る。
　パッケージ前細胞流路９１には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングしてもよい。あるいは、パッケージ前細胞流路９１の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、パッケージ前細胞流路９１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ2透過性の材料を用いることにより、パッケージ前細胞流路９１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ2濃度と同等になる。パッケージ前細胞流路９１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　パッケージ前細胞流路９１には、凍結保存液送液機構１１０が接続されている。凍結保存液送液機構１１０は、細胞凍結保存液をパッケージ前細胞流路９１に送り込む。これにより、パッケージ前細胞流路９１内で、体細胞が細胞凍結保存液で懸濁される。
　パッケージ装置１００は、パッケージ前細胞流路９１を介して送られてきた体細胞を順次凍結する。例えば、パッケージ装置１００は、体細胞を受け取るたびに体細胞をクライオチューブ等の凍結保存容器に入れ、体細胞を含む溶液を例えば－８０℃以下で瞬間的に凍結する。体積あたりの表面積が小さい凍結保存容器を用いると、凍結に時間がかかる傾向にあるため、体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることが好ましい。体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることにより、解凍後の細胞の生存率を高くすることが可能となる。凍結保存容器の形状としては、キャピラリー状及び球状が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要とされる解凍後の細胞の生存率によっては、必ずしも瞬間凍結をしなくともよい。
　凍結には、例えば、ガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いる。この場合、細胞凍結保存液としては、ＤＡＰ２１３（コスモバイオ株式会社）及びＦｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）が使用可能である。凍結は、ガラス化法以外の通常の方法で行ってもよい。この場合、細胞凍結保存液としては、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ－Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）や、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、日本全薬工業株式会社）等が使用可能である。凍結は、液体窒素によって行ってもよいし、ペルチェ素子によっておこなってもよい。ペルチェ素子を用いると、温度変化を制御したり、温度のムラを抑制したりすることが可能となる。パッケージ装置１００は、凍結保存容器を、筐体２００の外に搬出する。凍結細胞が臨床用途である場合は、凍結保存容器は完全閉鎖系であることが好ましい。ただし、パッケージ装置１００は、体細胞を凍結することなく、保存容器内にパッケージしてもよい。
　あるいは、パッケージ装置１００においては、図６に示すような溶液置換器１０１を用いて、体細胞を含む溶液の溶媒を培地から凍結保存液に置換してもよい。溶液置換器１０１の内部には、底面上に、体細胞が透過しない細孔が設けられたフィルター１０２が設けられている。また、溶液置換器１０１には、内部のフィルター１０２上に体細胞を含む培地を送液する第１の送液流路１０３が接続された体細胞導入孔、内部のフィルター１０２上に体細胞を含まない凍結液を送液する第２の送液流路１０４が接続された置換溶液導入孔、内部のフィルター１０２上から体細胞を含む凍結液を排出する第１の排出流路１０５が接続された体細胞流出孔が設けられている。さらに、溶液置換器１０１には、フィルター１０２を透過した溶液を排出する第２の排出流路１０６が接続された廃液流出孔が設けられている。第１の送液流路１０３、第２の送液流路１０４、第１の排出流路１０５、及び第２の排出流路１０６のそれぞれには、チューブ等が使用可能である。
　まず、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第１の送液流路１０３から溶液置換器１０１内部に、体細胞を含む培地を入れる。次に、図６（ｃ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を許容する状態にし、培地を溶液置換器１０１から排出する。この際、図６（ｄ）に示すように、体細胞は、フィルター１０２上に残る。さらに、図６（ｅ）及び図６（ｆ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第２の送液流路１０４から溶液置換器１０１内部に、凍結保存液を入れ、凍結保存液中に体細胞を分散させる。その後、図６（ｇ）に示すように、第１の排出流路１０５から、体細胞を含む凍結保存液を排出する。体細胞を含む凍結保存液は、第１の排出流路１０５を経由して、凍結保存容器等に送られる。
　図１及び図２に示す体細胞製造システムは、筐体２００内を滅菌する滅菌装置をさらに備えていてもよい。滅菌装置は、乾熱滅菌装置であってもよい。この場合、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の電気を使用する装置の配線は、耐熱性を有する配線であることが好ましい。あるいは、滅菌装置は、オゾンガス、過酸化水素ガス、又はホルマリンガス等の滅菌ガスを筐体２００内に放出して、筐体２００内を滅菌してもよい。
　体細胞製造システムは、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の動作記録、並びに撮影装置が撮影した画像を、有線又は無線により、外部のサーバーに送信してもよい。さらに、外部サーバーは、標準作業手順（ＳＯＰ）に基づいて、体細胞製造システムの分離装置１０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等を制御し、ＳＯＰに基づいて各装置が稼働しているか否かを監視し、各装置の稼働記録を自動的に生成してもよい。
　以上説明した体細胞製造システムによれば、自動で、体細胞を誘導することが可能となる。
　なお、実施の形態に係る体細胞製造システムは、図１及び図２に示す構成に限定されない。例えば、図７に示す実施の形態に係る体細胞製造システムにおいては、血液保存部２０１から単核球分離部２０３に、血液送液路２０２を経由して血液が送液される。血液保存部２０１及び単核球分離部２０３としては、例えばチューブが使用可能である。血液送液路２０２は、例えば、樹脂チューブやシリコンチューブ等である。後述する他の送液路も同様である。血液保存部２０１には、バーコード等の識別子を付けて、血液の情報を管理してもよい。送液には、ポンプ２０４が使用される。ポンプ２０４としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプの例としては、ペリスタポンプ（登録商標、アトー株式会社）、並びにＲＰ－Ｑ１及びＲＰ－ＴＸ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。圧電ポンプの例としては、ＳＤＭＰ３０４、ＳＤＰ３０６、ＳＤＭ３２０、及びＡＰＰ－２０ＫＧ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュール（高砂電気工業株式会社）を用いてもよい。ペリスタポンプ（登録商標）、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、血液送液路２０２内部の血液にポンプが直接接触することなく、送液することが可能である。後述する他のポンプにおいても同様である。あるいは、ポンプ２０４、並びに後述するポンプ２０７、ポンプ２１６、ポンプ２２２、ポンプ２２５、ポンプ２３４、ポンプ２４２、及びポンプ２５２としては、シリンジポンプを使用してもよい。密閉型ポンプ以外のポンプであっても、加熱滅菌処理等により再利用が可能である。
　単核球分離部２０３には、分離剤保存部２０５から、送液路２０６及びポンプ２０７を介して、赤血球凝固剤が送られる。分離剤保存部２０５としては、例えばチューブが使用可能である。分離剤保存部２０５には、バーコード等の識別子を付けて、分離剤の情報を管理してもよい。赤血球凝固剤としては、例えば、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）や赤血球凝固剤（ニプロ）等が使用可能である。単核球分離部２０３内において、赤血球凝固剤によって赤血球が沈降し、単核球が分離される。単核球分離部２０３内の単核球を含む上澄みは、単核球送液路２０８及びポンプ２０９を介して、単核球精製フィルター２１０に送られる。単核球精製フィルター２１０において、単核球以外の成分が除去され、導入前細胞としての単核球を含む溶液が得られる。単核球精製フィルター２１０としては、Ｐｕｒｅｃｅｌｌ（登録商標、ＰＡＬＬ）、セルソーバＥ（旭化成株式会社）、セパセルＰＬ（旭化成株式会社）、アダカラム（登録商標、ＪＩＭＲＯ）、及び分離バック（二プロ株式会社）等が使用可能である。
　図７においては、単核球分離部２０３、分離剤保存部２０５、単核球精製フィルター２１０、及びポンプ２０４、２０７、２０９等が、分離装置を構成している。ただし、上述したように、予め用意された導入前細胞を使用する場合は、分離装置は省略してもよい。
　導入前細胞を含む溶液は、導入前細胞送液路２１１及びポンプ２１２を介して、因子導入部２１３に送られる。因子導入部２１３としては、例えばチューブが使用可能である。因子導入部２１３には、体細胞誘導因子を含む因子保存部２１４から、因子送液路２１５及びポンプ２１６を介して、体細胞誘導因子が送られる。因子保存部２１４としては、例えばチューブが使用可能である。因子保存部２１４には、バーコード等の識別子を付けて、体細胞誘導因子の情報を管理してもよい。因子保存部２１４及びポンプ２１６等が、誘導因子送液機構を構成している。因子導入装置としての因子導入部２１３において、体細胞誘導因子が、例えばＲＮＡリポフェクション法によって細胞に導入され、誘導因子導入細胞が作製される。ただし、誘導因子のトランスフェクションの方法は、ＲＮＡリポフェクション法に限定されない。例えば、体細胞誘導因子を含むセンダイウイルスベクターを用いてもよい。あるいは、体細胞誘導因子がタンパク質であってもよい。また、誘導因子のトランスフェクションは、数日にわたって複数回行ってもよい。
　誘導因子導入細胞は、導入細胞送液路２１７及びポンプ２１８を介して、細胞作製装置の一部としての体細胞培養器２１９に送られる。導入細胞送液路２１７は、例えば、温度透過性かつＣＯ２透過性である。体細胞培養器２１９には、細胞に体細胞誘導因子が導入されてから最初の数日間、薬剤含有細胞培地を含む細胞培地保存部２２０から、培地送液路２２１及びポンプ２２２を介して、薬剤含有細胞培地が補給される。薬剤含有細胞培地は、薬剤耐性因子が導入されていない細胞を殺滅する薬剤を含んでいる。培地送液路２２１は、例えば、温度透過性かつＣＯ２透過性である。薬剤含有細胞培地保存部２２０には、バーコード等の識別子を付けて、薬剤含有細胞培地の情報を管理してもよい。薬剤含有細胞培地保存部２２０、培地送液路２２１、及びポンプ２２２は、培地補給装置を構成している。
　その後、体細胞培養器２１９には、目的とする体細胞に適した体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２２４及びポンプ２２５を介して、体細胞培地が補給される。体細胞培地保存部２２３には、バーコード等の識別子を付けて、体細胞培地の情報を管理してもよい。培地送液路２２４は、例えば、温度透過性かつＣＯ２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２２４、及びポンプ２２５は、培地補給装置を構成している。
　薬剤含有細胞培地保存部２２０及び体細胞培地保存部２２３は、例えば、冷蔵保存部２５９で４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。薬剤含有細胞培地保存部２２０及び体細胞培地保存部２２３から送られる培地は、例えば、冷蔵保存部２５９の外の加熱器で３７℃に昇温されてから培養器に送れてもよい。あるいは、低温保存されていた培地は、送液路を進む間に３７℃に昇温するよう、送液路の周囲の温度を設定してもよい。体細胞培養器２１９内の古くなった培地は、廃液送液路２２６及びポンプ２２７を介して、廃液保管部２２８に送られる。廃液保管部２２８には、バーコード等の識別子を付けて、廃液の情報を管理してもよい。
　体細胞培養器２１９で培養された体細胞は、導入細胞送液路２２９、ポンプ２３０、及び任意で細胞塊分割器２３１を介して、細胞作製装置の一部としての第１の拡大培養器２３２へ送られる。細胞塊分割器２３１を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。細胞塊が形成されない場合は、細胞塊分割器２３１は省略してもよい。第１の拡大培養器２３２には、体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２３３及びポンプ２３４を介して、体細胞培地が補給される。導入細胞送液路２２９及び培地送液路２３３は、例えば、温度透過性かつＣＯ２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２３３、及びポンプ２３４は、培地補給装置を構成している。
　第１の拡大培養器２３２内の古くなった培地は、廃液送液路２３５及びポンプ２３６を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　第１の拡大培養器２３２で培養された体細胞は、導入細胞送液路２３７、ポンプ２３８、及び任意で細胞塊分割器２３９を経て、細胞作製装置の一部としての第２の拡大培養器２４０へ送られる。細胞塊分割器２３９を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。細胞塊が形成されない場合は、細胞塊分割器２３９は省略してもよい。第２の拡大培養器２４０には、体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２４１及びポンプ２４２を介して、体細胞培地が補給される。導入細胞送液路２３７及び培地送液路２４１は、例えば、温度透過性かつＣＯ２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２４１、及びポンプ２４２は、培地補給装置を構成している。
　第２の拡大培養器２４０内の古くなった培地は、廃液送液路２４３及びポンプ２４４を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　第２の拡大培養器２４０で培養された体細胞は、導入細胞送液路２４５及びポンプ２４６を経て、溶液置換器２４７へ送られる。溶液置換器２４７は、例えば図６に示す構成を備えていてもよい。図７に示す溶液置換器２４７内において、体細胞はフィルターで保持され、培地は、廃液送液路２４８及びポンプ２４９を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　ポンプ２４９の駆動停止により廃液送液路２４８内の溶液の流動を停止した後、あるいは弁等で廃液送液路２４８を閉じた後、溶液置換器２４７には、凍結保存液を含む凍結保存液保存部２５０から、送液路２５１及びポンプ２５２を介して、凍結保存液が入れられる。これにより、凍結保存液中に体細胞が分散する。
　体細胞を分散させた凍結保存液は、パッケージ装置の一部としての送液路２５３及びポンプ２５４を介して、凍結保存容器２５５内に送られる。凍結保存容器２５５は、低温保管庫２５６に入れられている。低温保管庫２５６には、液体窒素保管庫２５７から送液路２５８を介して、例えば－８０℃の液体窒素が送られる。これにより、凍結保存容器２５５内の体細胞が凍結させられる。ただし、体細胞の凍結は、液体窒素に依らなくともよい。例えば、低温保管庫２５６が、圧縮式冷凍庫、吸収式冷凍庫、あるいはペルチェ式冷凍庫等の冷凍庫であってもよい。また、凍結が不要である場合は、体細胞を凍結しなくともよい。
　上述した送液路には、適宜、逆流防止弁を設けてもよい。上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、体細胞培養器２１９、第１の拡大培養器２３２、第２の拡大培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、樹脂等からなる例えばカセット状のケース２６０に格納されている。ケース２６０は、例えば、滅菌処理可能な耐熱性材料からなる。ケース２６０内は、例えば、３７℃、ＣＯ２濃度５％のように、細胞培養に適した環境にされる。培地が流れる送液路は、例えば、ＣＯ２透過性材料からなる。ただし、ケース２６０はカセット状に限られない。例えば、可撓性のバックであってもよい。また、上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、体細胞培養器２１９、第１の拡大培養器２３２、第２の拡大培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、複数のケースに分割されて格納されてもよい。
　ケース２６０は、筐体２００内に配置される。ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７は、筐体２００の内部かつケース２６０の外部に配置される。
　ケース２６０と、筐体２００は、例えば、互いに勘合する勘合部を備える。そのため、ケース２６０は、筐体２００内の所定の位置に配置される。また、筐体２００内において、ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７は、所定の位置に配置される。ケース２６０が筐体２００内の所定の位置に配置されると、ケース２６０内の送液路は、ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７と接する。
　例えば、ケース２６０及びその内包物は使い捨て可能であり、体細胞の凍結が完了した後は、廃棄して、新しいものと交換してもよい。あるいは、ケース２６０及びその内包物を再利用する場合は、ケース２６０にバーコード等の識別子を付け、使用回数等を管理してもよい。
　以上説明した実施の形態に係る体細胞製造システムによれば、人を介さずに、導入前細胞から自動的に体細胞を製造することが可能である。
　（他の実施の形態）
　上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施の形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、因子導入装置３０は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルス等のウイルスベクターや、プラスミドを用いるトランスフェクション、あるいはタンパク質トランスフェクションにより、細胞を誘導してもよい。あるいは、因子導入装置３０は、エレクトロポレーションにより細胞を誘導してもよい。また、導入前細胞送液路２０、導入細胞送液路３１、第１体細胞送液路５１、拡大培養送液路７１、第２体細胞送液路７２、及びパッケージ前細胞流路９１はマイクロフルイディクス技術により基板上に設けられていてもよい。この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
　（実施例１）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
　ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０５個の密度でまかれた。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ２であった。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ２濃度は５％、酸素濃度は２５％以下であった。
　１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
　緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ（ＴｒｉLｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。
　さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、をそれぞれウェルの数だけ用意した。
　チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
　チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＧＦＰ　ｍＲＮＡ　（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
　第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＧＦＰ　ｍＲＮＡが加えられた。
　その翌日に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察したところ、図８、図９に示すように、トランスフェクションした細胞の発色が確認された。さらに、図１０に示すように、細胞の生存率が確認された。このことから、リポフェクション試薬とＲＮＡを用いてｉＰＳ細胞にｍＲＮＡを導入し、タンパク質を発現させることが可能である事が示された。
　（実施例２）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
　ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０５個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。
　１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
　Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。また、ｍＲＮＡは、シリカ膜で精製されており、ｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ｐＨ６の１ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを溶媒とする溶液によってされる。さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。
　チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
　チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１５００ｎｇのＧＦＰ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
　第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡが加えられた。
　ｍＲＮＡ導入後、一日目に観察したところ、図１１に示すように、細胞の発色が確認された。
　その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。
　７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５分４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＣＣＳ，０．１％トライトン　ｉｎ　ＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、５００μＬ添加した。一次抗体としては、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　８４５５０１）及びマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ　ａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　８４５５０１）をバッファで１／１０００希釈、又はマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ　ａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）をバッファで１／７５希釈し、さらにＤＡＰＩをバッファで１／１００００希釈したものを各ウェルに添加し、室温で一時間反応させた。Ｔｕｊ１抗体は、β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎに対する抗体である。
　室温で一時間反応後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中に、１／１０００希釈のロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を１／１０００希釈のロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬずつ添加し、室温で３０分間反応させた。
　室温で３０分反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。
　図１２は、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡをリポフェクションを用いて導入し、その後、ピューロマイシンを添加し２日間培養後、さらにピューロマイシンを添加せず５日間培養して、Ｔｕｊｉ１で染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。図１３は上記の手順によって各トランスフェクション試薬を利用して、Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡをトランスフェクションし、７日目にＴＵＪ－１陽性細胞の割合を示したものである。これらの結果から、神経細胞が誘導されたことが示された。
　（実施例３）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。
　ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０５個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、１×１０５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ２濃度は５％、酸素濃度は２５％以下あった。
　１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ含有トランスフェクション培地を用意した。また、１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地を用意した。
　トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をＢ１８Ｒ含有トランスフェクション培地又はＢ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。
　Ｎｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、ＧＦＰ　ｍＲＮＡ　（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。
　さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。
　チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
　チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１００ｎｇのＧＦＰ　ｍＲＮＡ　（Ｔｒｉｌｉｎｋ）　を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
　第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２　ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰ　ｍＲＮＡが加えられた。また、図１４に示すように、トランスフェクションを１回、２回、３回行ったものを用意した。
　その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。
　７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５分４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳ中に５％のＣＣＳ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸを含む透過バッファで希釈した一次抗体を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。一次抗体は、マウス抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ　８４５５０１）を１：１０００で、マウス抗ヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ　ａｎｄ　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　ＭＡＢ３３１４－ＳＰ）を１：１５０でありとなるよう透過バッファで希釈したものであり、さらにＤＡＰＩが１：１０，０００になるよう添加した。
　一時間後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中にロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ－２１４２８）を１：１０００で、ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３１５７３）を１：１０００で含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。
　細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。その結果、図１５に示すように、ｍＲＮＡを一回だけトランスフェクションしたものは、９日目にはＧＦＰはほとんど発現していなかった。その一方で、ｍＲＮＡを３回トランスフェクションしたものは、９日目においてもＧＦＰが発現していた。このことから、ｍＲＮＡは細胞内で分解され、タンパク質の発現は一過性であることが明らかとなった。
　以上示したように、ｉＰＳ細胞を播種後、ＲＮＡをトランスフェクションして数日で神経細胞に誘導できることが示された。また、短期間で神経細胞に誘導できることから、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために通常使用されるＢ１８Ｒタンパク質を培地に含めなくともよいことが示された。
　２・・・チューブ、１０・・・分離装置、２０・・・導入前細胞送液路、２１・・・誘導因子送液機構、３０・・・因子導入装置、３１・・・導入細胞送液路、４０・・・細胞作製装置、５０・・・体細胞培養装置、５１・・・体細胞送液路、６０・・・分割機構、７０・・・拡大培養装置、７１・・・拡大培養送液路、７２・・・体細胞送液路、８０・・・分割機構、９０・・・体細胞搬送機構、９１・・・パッケージ前細胞流路、１００・・・パッケージ装置、１０１・・・溶液置換器、１０２・・・フィルター、１０３・・・送液流路、１０４・・・送液流路、１０５・・・排出流路、１０６・・・排出流路、１１０・・・凍結保存液送液機構、２００・・・筐体、２０１・・・血液保存部、２０２・・・血液送液路、２０３・・・単核球分離部、２０４・・・ポンプ、２０５・・・分離剤保存部、２０６・・・送液路、２０７・・・ポンプ、２０８・・・単核球送液路、２０９・・・ポンプ、２１０・・・単核球精製フィルター、２１１・・・導入前細胞送液路、２１２・・・ポンプ、２１３・・・因子導入部、２１４・・・因子保存部、２１５・・・因子送液路、２１６・・・ポンプ、２１７・・・導入細胞送液路、２１８・・・ポンプ、２１９・・・体細胞培養器、２２０・・・細胞培地保存部、２２１・・・培地送液路、２２２・・・ポンプ、２２３・・・体細胞培地保存部、２２４・・・培地送液路、２２５・・・ポンプ、２２６・・・廃液送液路、２２７・・・ポンプ、２２８・・・廃液保管部、２２９・・・導入細胞送液路、２３０・・・ポンプ、２３１・・・細胞塊分割器、２３２・・・拡大培養器、２３３・・・培地送液路、２３４・・・ポンプ、２３５・・・廃液送液路、２３６・・・ポンプ、２３７・・・導入細胞送液路、２３８・・・ポンプ、２３９・・・細胞塊分割器、２４０・・・拡大培養器、２４１・・・培地送液路、２４２・・・ポンプ、２４３・・・廃液送液路、２４４・・・ポンプ、２４５・・・導入細胞送液路、２４６・・・ポンプ、２４７・・・溶液置換器、２４８・・・廃液送液路、２４９・・・ポンプ、２５０・・・凍結保存液保存部、２５１・・・送液路、２５２・・・ポンプ、２５３・・・送液路、２５４・・・ポンプ、２５５・・・凍結保存容器、２５６・・・低温保管庫、２５７・・・液体窒素保管庫、２５８・・・送液路、２５９・・・冷蔵保存部、２６０・・・ケース、３０１・・・バッグ、３０２・・・バッグ
 

Claims (21)

  1. 　導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路と、
    　前記導入前細胞送液路に接続され、前記導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
    　前記誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、
    　を備える体細胞製造システム。
  2. 　前記導入前細胞送液路、前記因子導入装置、及び前記細胞作製装置を格納する筐体をさらに備える、請求項１に記載の体細胞製造システム。
  3. 　前記体細胞が、多能性幹細胞を除く、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  4. 　前記体細胞が、分化細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  5. 　前記体細胞が、体性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  6. 　前記体細胞が、神経系細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  7. 　前記導入前細胞が、多能性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  8. 　前記導入前細胞が、体性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  9. 　前記導入前細胞が、分化した体細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
  10. 　前記細胞作製装置が、
    　前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置と、
    　前記体細胞培養装置で樹立された体細胞を拡大培養する拡大培養装置と、
    　を備え、
    　前記体細胞培養装置が、前記誘導因子導入細胞に培地を補給する第１の培地補給装置を備え、
    　前記拡大培養装置が、前記体細胞に培地を補給する第２の培地補給装置を備える、
    　請求項１から９のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
  11. 　前記体細胞培養装置が、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置をさらに備える、請求項１０に記載の体細胞製造システム。
  12. 　前記因子導入装置が、
    　前記導入前細胞送液路に接続された因子導入部と、
    　前記体細胞誘導因子を保存する因子保存部と、
    　前記因子保存部から前記導入前細胞送液路又は前記因子導入部に前記体細胞誘導因子を流すための因子送液路と、
    　前記因子送液路内の液体を流すためのポンプと、
    　を備える、請求項１から１１のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
  13. 　前記体細胞誘導因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質である、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
  14. 　前記因子導入部において、ＲＮＡリポフェクションにより、前記導入前細胞に前記体細胞誘導因子が導入される、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
  15. 　前記体細胞誘導因子がベクターに組み込まれている、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
  16. 　前記ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１５に記載の体細胞製造システム。
  17. 　前記細胞作製装置で作製された前記体細胞をパッケージするパッケージ装置をさらに備え、前記筐体が前記パッケージ装置を格納する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
  18. 　筒状部材と、
    　前記筒状部材の内部に配置された液体透過フィルターと、
    　を備える溶液置換器であって、
    　前記筒状部材に、
    　前記液体透過フィルター上に、前記細胞作製装置で作製された前記体細胞を含む溶液を導入するための体細胞導入孔と、
    　前記液体透過フィルター上に、置換溶液を導入するための置換溶液導入孔と、
    　前記液体透過フィルター上に、前記体細胞を含む置換溶液を流出するための体細胞流出孔と、
    　前記液体透過フィルターを透過した溶液が流出する廃液流出孔と、
    　が設けられている溶液置換器
    　をさらに備える、請求項１から１７のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
  19. 　前記廃液流出孔に接続された廃液送液路をさらに備え、前記体細胞を含む溶液の溶液を廃棄する際に前記廃液送液路における溶液の流動が許容され、前記置換溶液中に前記体細胞を分散させる際に前記廃液送液路における溶液の流動が許容されない、請求項１８に記載の体細胞製造システム。
  20. 　前記置換溶液が凍結保存液である、請求項１８又は１９に記載の体細胞製造システム。
  21. 　血液から前記導入前細胞を分離する分離装置をさらに備え、前記分離装置で分離された前記導入前細胞を含む溶液が前記導入前細胞送液路を通過する、請求項１に記載の体細胞製造システム。
     
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