WO2018117044A1 - 抗エクオール抗体組成物及びその利用 - Google Patents

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WO2018117044A1
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seq
amino acid
equol
antibody
hypervariable region
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PCT/JP2017/045376
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陽介 瀧本
啓太郎 萩原
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株式会社ヘルスケアシステムズ
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • This specification relates to an anti-equol antibody composition and use thereof.
  • Equol is said to be a metabolite of isoflavones metabolized by intestinal bacteria such as humans. It is known that equol may improve various symptoms caused by a decrease in female hormones by an anti-estrogen effect.
  • Equol is produced by intestinal bacteria from soy products, etc.
  • equol production may vary depending on individual differences in the intestinal flora and the situation. In some cases, equol is taken directly. Although equol has an anti-estrogen effect, it is important to monitor the equol production ability (production amount) of an individual and the amount of equol in the body.
  • An object of the present specification is to provide an anti-equol antibody composition that can be used more practically and its use.
  • composition containing an anti-equol antibody having a more suitable crossing ability and affinity for equol. According to this specification, the following means are provided based on this knowledge.
  • an anti-equol antibody composition As the immunoglobulin heavy chain variable region, the heavy chain hypervariable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the hypervariable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 3 A hypervariable region CDR3 consisting of a sequence; As the immunoglobulin light chain variable region, the hypervariable region CDR1 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the hypervariable region CDR2 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 6 An anti-equol antibody or antibody fragment thereof having a hypervariable region CDR3 ′ comprising a sequence; As the immunoglobulin heavy chain variable region, the heavy chain hypervariable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the hypervariable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the
  • [3] The composition according to [1] or [2], wherein the crossover rate with respect to R-equol is 85% or more.
  • the cross-over rate for one or more isoflavones selected from the group consisting of daidzein, genistein and glycitein is 0.01% or less, according to any one of [1] to [3] Composition.
  • [5] The composition according to [4], wherein the crossover rate of daidzein, genistein and glycitein with respect to each isoflavone is 0.01% or less.
  • the crossover rate for one or more selected from the group consisting of ellagic acid dihydrate, catechin monohydrate and gallic acid is 1% or less, [1] to [5] The composition in any one of. [7] The composition according to [6], wherein the crossing rate with respect to ellagic acid dihydrate and catechin monohydrate is 0.01% or less. [8] An equol detection reagent comprising the composition according to any one of [1] to [7]. [9] As the immunoglobulin heavy chain variable region, represented by the heavy chain hypervariable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the hypervariable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • a hypervariable region CDR3 consisting of the amino acid sequence
  • the hypervariable region CDR1 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • the hypervariable region CDR2 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 6 An anti-equol antibody or antibody fragment thereof having a hypervariable region CDR3 ′ comprising a sequence.
  • the immunoglobulin heavy chain variable region represented by the heavy chain hypervariable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the hypervariable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 3 As the immunoglobulin heavy chain variable region, represented by the heavy chain hypervariable region CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the hypervariable region CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • a hypervariable region CDR3 consisting of the amino acid sequence As the immunoglobulin light chain variable region, the hypervariable region CDR1 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the hypervariable region CDR2 ′ comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the amino acid represented by SEQ ID NO: 9
  • a method for measuring equol in a biological sample Contacting the equol detection reagent according to [8] with equol in the biological sample, A method comprising: [12] An equol measurement device, A device comprising the detection reagent according to [8] bound to a solid phase carrier. [13] An equol measurement kit, A kit comprising the detection reagent according to [8]. [14] An expression vector having a polynucleotide encoding the antibody or antibody fragment thereof according to [9]. [15] An expression vector having a polynucleotide encoding the antibody or antibody fragment thereof according to [10].
  • the disclosure herein relates to an anti-equol antibody composition and use thereof.
  • the composition containing the anti-equol monoclonal antibody disclosed herein (hereinafter also simply referred to as the present antibody) (hereinafter simply referred to as the present antibody composition)
  • the present antibody composition it has high detection sensitivity and high accuracy. Equol can be measured by sex.
  • equol in a biological sample can also be measured accurately and accurately.
  • This antibody composition specifically binds to R-equol, but has a high binding ability to S-equol as a whole, and has high detection sensitivity for S-equol. Even in the case of a biological sample having a low equol content or a small amount of a biological sample, equol can be easily measured.
  • the antibody composition can contain two anti-equol monoclonal antibodies. Specific binding ability of the present antibody composition obtained by combining these antibodies can be enumerated as follows, for example.
  • the present antibody composition can have at least the specific binding ability (1). Any of the following (2) to (4) or two or more specific binding ability may be further provided.
  • “specific binding ability” or “specific binding” means binding ability and binding based on the antigen recognition ability of an antibody, that is, an immunoglobulin. .
  • the structures of R-equol and S-equol are shown below. Intestinal bacteria produce limited S-equol.
  • the crossing rate for S-equol is 100%
  • the crossing rate for R-equol is 80% or more.
  • the crossover rate with respect to R-equol may be 85% or more, 90% or more, and further 95% or more, for example, about 98%. .
  • it may be 105% or less.
  • the crossing rate for one or more isoflavones selected from the group consisting of daidzein, genistein and glycitein is 0.01% or less.
  • the crossover rate for daidzein, genistein, and glycitein may all be 0.01% or less. Further, such a crossing rate may be 0.005% or less.
  • the crossing rate for one or more selected from the group consisting of ellagic acid dihydrate, catechin monohydrate and gallic acid is 1% or less. Further, for example, the crossing rate with respect to ellagic acid dihydrate and catechin monohydrate may be 0.01% or less, or 0.005% or less.
  • the crossover rate with respect to apigenin and R—O-desmethylangolensin (DMA) is 0.01%. For example, the crossing rate is 0.005% or less.
  • crossing property and crossing rate can be measured by methods well known to those skilled in the art. For example, it can be measured by ELISA, competitive ELISA or the like.
  • the cross property of the present antibody is not particularly limited, but can be measured in any concentration range in which each isoflavone concentration is in the range of 0.1 ⁇ M to 75 ⁇ M.
  • the same concentration may be 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
  • the above-mentioned intersection rate can be acquired as follows, for example.
  • a calibration curve is created using S-equol. Prepare concentrations of the compound containing S-equol at 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, react with the antibody at each concentration, and calculate the S-equol concentration from the calibration curve. For example, when 10 ⁇ M daidzein is added and detected as a concentration of 10 ⁇ M from a calibration curve, 100% crossover property is detected. If detected, it is considered as 1% crossing.
  • the antibody composition can contain two types of monoclonal antibodies.
  • the amino acid sequences of the hypervariable regions of the heavy and light chains of these two monoclonal antibodies have been identified.
  • variable region (V H region) of the heavy chain (IgG) of the first antibody has hypervariable regions CDR1, CDR2 and CDR3 each consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the heavy chain variable region including three hypervariable regions can have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, for example.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the respective amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and 10 are represented by SEQ ID NOs: 13 to 15 and 16, respectively.
  • the variable region ( VL region) of the light chain of the first antibody has hypervariable regions CDR1 ′, CDR2 ′ and CDR3 ′ each consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4-6.
  • the light chain variable region including three hypervariable regions can have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, for example. It has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the light chain is a ⁇ chain.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the respective amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 6 and 11 are represented by SEQ ID NOs: 18 to 20 and 21, respectively.
  • variable region (V H region) of the heavy chain of the second antibody has hypervariable regions CDR1, CDR2 and CDR3 each consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the heavy chain variable region including three hypervariable regions can have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, for example.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the respective amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 and 10 are represented by SEQ ID NOs: 13 to 15 and 16, respectively.
  • the variable region ( VL region) of the light chain of the first antibody has hypervariable regions CDR1 ′, CDR2 ′ and CDR3 ′ each consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 7 to 9.
  • the light chain variable region including three hypervariable regions has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, for example.
  • the light chain is a ⁇ chain.
  • the nucleotide sequences of the polynucleotides encoding the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 7 to 9 and 12 are represented by SEQ ID NOs: 23 to 25 and 26, respectively.
  • the present antibody composition is an intact antibody having the ability to specifically bind to any antigen (for example, S-equol and the like in the present specification), or has the ability to bind in the known technique at the time of filing the present application. It can be referred to as a portion containing an antigen-binding portion.
  • This antibody can take various aspects based on the following contents in addition to the common general knowledge at the time of filing this application.
  • antigen-binding portion of an antibody is meant any antigen (eg, one or more fragments of an intact antibody that retains the ability to bind S-equol).
  • the “antigen-binding portion” is not particularly limited, and is a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of V L , V H , C L and CH1 domains; F (ab) 2 fragment, linked by a disulfide bridge at the hinge region A bivalent fragment comprising two Fab fragments (generally one from the heavy and light chains); an Fd fragment consisting of the V H and CH1 domains; an Fv fragment consisting of the VL and V H domains of a single arm of the antibody Single domain antibody (dAb) fragments consisting of VH domains; and various forms of fragments such as isolated complementarity determining regions (CDRs) or combinations thereof.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the antigen-binding portion can be linked by an artificial peptide linker that can be prepared as a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form a monovalent molecule using a recombinant method. it can.
  • the antigen-binding portion may be incorporated into a single domain antibody, maxibody, minibody, intrabody, diabody, triabody, tetrabody, v-NAR and bis-scFv.
  • the biological species from which this antibody is derived is not particularly limited, but it may be a human antibody, a mouse antibody, a goat antibody or the like, although it varies depending on the organism to be applied and the purpose.
  • human antibody means that both the antibody framework and the CDR region include an antibody having a variable region derived from a sequence of human origin.
  • the constant region is also meant to be derived from such a human sequence, eg, a human germline sequence or a mutated human germline sequence.
  • An antibody based on a fragment derived from two or more species can be referred to as a chimeric antibody.
  • the present antibody is a monoclonal antibody, stable binding performance to the antigen can be exhibited.
  • monoclonal antibodies are well known to those skilled in the art.
  • human monoclonal antibodies are obtained from transgenic non-human animals fused to immortalized cells (for example, transgenic mice having a genome containing a human heavy chain transgene and a light chain transgene). Produced by hybridomas containing B cells.
  • the antibody may be a recombinant antibody such as a recombinant human antibody.
  • Recombinant human anti-corporates are, for example, antibodies isolated from animals (eg, mice) or hybridomas produced therefrom that have been transfected or chromosomally transfected with human immunoglobulin genes; transformed to express human antibodies.
  • a host cell eg, a transfectoma
  • an antibody isolated from a recombinant combinatorial human antibody library e.g., an antibody isolated from a recombinant combinatorial human antibody library
  • Antibodies produced, expressed, produced or isolated by other means, including Such recombinant human antibodies have variable regions in which the framework and CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • this antibody is a variant as long as the antibody obtained by a known method has a binding ability to recognize and bind to RS-equol. It may be.
  • modifying such as introducing mutations into at least a portion of the starting antibody, such as full length heavy and / or light chain sequences, VH and / or VL sequences or constant regions attached thereto, etc.
  • New antibodies can also be obtained.
  • a so-called peg chain can be introduced into the obtained antibody.
  • Such techniques for modifying antibodies are well known to those skilled in the art.
  • the antibody can be provided with a labeling element as required.
  • the labeling element is not particularly limited, and a conventionally known labeling substance can be appropriately selected and used.
  • the labeling substance is not particularly limited, but typically, a labeling substance using fluorescence, radioactivity, enzyme (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), phosphorescence, chemiluminescence, coloring and the like can be mentioned.
  • This antibody may be provided with a substance capable of binding to the labeling element as the labeling element.
  • a molecule or substance capable of binding them so that the labeling substance can be finally identified may be provided.
  • protein-protein interaction, low molecular compound-protein interaction, and the like can be used.
  • the labeling substance that is finally used for detection is the other molecule or substance that interacts with a substance that binds to the labeling substance (for example, an antigen, ie, streptavidin, anti-FITC, etc.) It is modified so as to be provided as a site for binding with the labeling substance binding substance.
  • a substance that binds to the labeling substance for example, an antigen, ie, streptavidin, anti-FITC, etc.
  • labeling elements are commercially available, and methods for modifying antibodies with labeling elements are well known to those skilled in the art. Therefore, those skilled in the art can obtain various labeling elements and appropriately perform the antibody via a functional group such as an amino group or a carboxyl group.
  • the antibody production method disclosed in the present specification comprises a step of immunizing an animal using a complex in which a carrier protein is conjugated to RS-equol (racemate), and a hybridoma derived from the spleen cell of the animal. Obtaining an antibody having specific binding ability to RS-equol.
  • the antibody obtaining step separates a hybridoma having the ability to produce an antibody having a specific binding ability to RS-equol from a hybridoma obtained by fusing spleen cells and myeloma cells isolated from the animal. And a step of producing the antibody using the hybridoma. According to this production method, the present antibody and the present antibody composition which are monoclonal antibodies can be efficiently obtained.
  • Carrier proteins for obtaining the complex include known carrier proteins such as mussel hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA), rabbit serum albumin (RSA), bovine thyroglobulin (THY), etc. Is appropriately selected.
  • the carrier protein may be derived from various vertebrate species such as humans, mice, rabbits, goats, and the like, as well as mutants.
  • the complex can be obtained, for example, by introducing a carrier protein such as KLH through a carboxyl group of a carboxymethyl group introduced into the hydroxyl group of RS-equol (racemate) according to a conventional method.
  • a carrier protein such as KLH can be introduced into RS-equol according to a conventional method.
  • a carboxyl group is introduced into both of the 4′-position and 7-position hydroxyl groups of equol, a 4′-position complex in which a carrier protein is introduced via a 4′-position hydroxyl group, a 7-position complex, There are both.
  • the R-form complex and the S-form complex are selected from the four types of complexes of the R-form 4′-position complex, R-form 7-position complex, S-form 4′-position complex, and S-form 7-position complex
  • it can be used as a carrier protein complex of RS-equol.
  • these four types of complexes are used in combination.
  • the antibody-producing ability is evaluated using the specific binding ability to RS-equol (racemate) as an index, so that a monoclonal antibody suitable for the antibody composition can be efficiently obtained. Can be obtained.
  • the vertebrates are immunized with the RS-equol-carrier protein complex thus obtained.
  • the type of vertebrate to be immunized (hereinafter also referred to as “immunized animal”) is not particularly limited, and examples thereof include non-human animals that have not been genetically modified or genetically modified. Preferable examples include mouse, rat, goat, rabbit and the like. As described above, in order to obtain a human antibody, a non-human vertebrate genetically modified so that a human antibody can be produced can be used.
  • the administration of the immunogen to the immunized animal is not particularly limited, but is appropriately selected from known methods such as intraperitoneal administration and intravenous administration.
  • a complete adjuvant or an incomplete adjuvant can be used as appropriate.
  • Administration of the complex can be performed repeatedly enough to be immunized. Usually, the complex is administered about 2 to 5 times.
  • Such an immunogen can be used to immunize vertebrates and evaluate the antibody titer against RS-equol to confirm the production of this antibody in the immunized animal. Whether or not the intended antibody is produced in the immunized animal is appropriately collected from the immunized animal and evaluated for antibody titer using RS-equol or the like. For the evaluation, a known method such as ELISA can be appropriately used.
  • the hybridoma After removing the spleen from an immunized animal that can confirm a high antibody titer to RS-equol, preparing spleen cells, cell fusion is performed by a known cell fusion method using mouse myeloma cells such as P3U1 cells and polyethylene glycol, After that, the hybridoma is claimed as a set.
  • the hybridoma can be selected, for example, by culturing the hybridoma in a normal medium (HAT medium), for example, for 10 to 14 days using the fact that the myeloma cell line is an 8-azaguanine resistant strain. it can.
  • the antibody titer of the antibody produced by the selected hybridoma is analyzed by the ELISA method using RS-equol, and the hybridoma producing the antibody having a high antibody titer is separated by a limiting dilution method or the like. From the culture supernatant obtained by culturing the separated hybridoma in an appropriate medium, the monoclonal antibody can be obtained by purification by an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation or affinity chromatography.
  • the monoclonal antibody (hybridoma) applied to the present antibody composition includes (1) cross-reactivity with S-equol and R-equol, as well as various isoflavones described above such as equol precursor (2) (4) A monoclonal antibody can be selected by evaluating its sex.
  • the amino acid sequences of the monoclonal antibody and the antibody fragment thus obtained can be obtained by analyzing the amino acid sequence of the antibody and / or by analyzing the base sequence of the antibody coding region obtained from the hybridoma.
  • Polynucleotides such as DNA encoding the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the monoclonal antibody thus obtained are also an aspect of the present disclosure.
  • a host cell carrying such an expression vector is also an embodiment of the present disclosure.
  • an expression vector such as a promoter or a terminator can also be appropriately selected depending on the type of host.
  • the polynucleotide is, for example, DNA or, for example, cDNA.
  • the heavy chain variable region, the hypervariable region thereof, the light chain variable region, and the hypervariable region thereof which can be contained in the present antibody composition are as described above.
  • the method for measuring equol disclosed in the present specification can comprise a step of bringing the antibody into contact with equol in a biological sample. This step binds to equol based on the specific binding ability of the antibody. This equol-antibody complex can be detected by various methods or via a labeling element attached to the antibody, and the presence or absence of equol and its concentration (amount) can be measured.
  • the method itself of detecting and measuring the bound antigen using an antibody based on its specific binding ability is well known to those skilled in the art.
  • This measurement method can be applied to such known methods.
  • Such well-known methods include ELISA, RIA, immunochromatography, immunoprecipitation based on complex precipitation reaction and precipitation reaction, one-way immunonucleic acid method, immunoelectronucleic acid method, cross-immunoelectrophoresis method; complex Examples include latex agglutination methods using the agglutination reaction, Western blotting methods (enzyme immunization methods and chemiluminescence methods etc. as detection methods), and immunohistochemical detection methods.
  • measurement conditions such as equol concentration and antibody concentration can be appropriately set by those skilled in the art depending on the type of measurement method. Since this antibody has a high antibody binding property, for example, in immunochromatography using a porous solid phase as a carrier, a detection limit value of 0.5 ⁇ M can be secured as the equol concentration.
  • the detection limit value is also 0.4 ⁇ M, for example, 0.3 ⁇ M, for example 0.2 ⁇ M, for example 0.1 ⁇ M, and for example 0.05 ⁇ M.
  • it is 0.04 ⁇ M, for example, 0.03 ⁇ M, for example, 0.02 ⁇ M, for example, 0.01 ⁇ M.
  • equol concentrations above the detection limit for example, equol quantitative values in the range of 0.01 ⁇ M to 180 mM are confirmed to be highly correlated with quantitative values using high performance liquid chromatography (HPLC). is doing. From the above, according to the present antibody, equol can be detected and quantified with high sensitivity and accuracy even with a simple device such as immunochromatography.
  • This measurement method can be applied to the measurement of equol in various biological samples.
  • a biological sample It can be set as the various samples derived from an animal, a plant, and microorganisms.
  • examples include urine, blood, saliva, tears, serum, plasma, stool, tissue or tissue extract.
  • examples include urine, blood, saliva, tears, serum, plasma, stool, tissue or tissue extract.
  • examples include urine, blood, saliva, tears, serum, plasma, stool, tissue or tissue extract.
  • foodstuffs etc. are mentioned.
  • culture supernatants, cell debris, cell extracts and the like can be mentioned.
  • the equol measurement device disclosed herein may comprise the present antibody bound to or capable of binding to a solid support. According to this device, since the present antibody composition having excellent detection sensitivity is provided, equol can be easily measured with high sensitivity and high accuracy.
  • Measurement device can take various forms.
  • the solid phase carrier include an immunochromatographic solid phase carrier such as a stick shape or a strip shape, a latex bead, a solid phase carrier for an array such as glass or plastic, and the like.
  • the equol measurement kit disclosed in the present specification can contain the antibody composition.
  • the kit can further include a reagent for detecting the equol-antibody complex.
  • reagents include, for example, the labeling elements described above, for example, a labeling element and a labeling substance and / or a labeling substance binding substance, a reagent for introducing these labeling substance and / or labeling substance binding substance, or a labeling substance And a reagent for a labeling substance (for example, a substrate in the case of using peroxidase as a labeling substance).
  • the kit can further include a blocking reagent intended for detection by ELISA or antibody chromatography, a washing solution, a buffer, and the like.
  • the antibody titer of the supernatant was measured by the ELISA method described above in the culture supernatant of the well in which the hybridoma cell colony was formed, and the hybridoma producing an antibody with a high antibody titer was separated by the limiting dilution method.
  • RS-equol was used as an antigen for screening for hybridoma separation.
  • the separated fused cells were cultured in 10% DMEM medium and purified using an IgG column to obtain a monoclonal antibody (anti-equol antibody).
  • the obtained monoclonal antibody was subjected to amino acid sequence analysis and base sequence analysis. However, two types ( ⁇ and ⁇ ) were detected as light chain variable regions, and one type of heavy chain variable region was detected. From these results, it was found that the obtained hybridoma was a mixture of two kinds of hybridomas, and the obtained antibody was also a mixture (composition) of two kinds of monoclonal antibodies.
  • the hypervariable region and the entire amino acid sequence of the ⁇ chain light chain variable region are shown in SEQ ID NOs: 4 to 6 and 11, and the base sequences encoding them are shown in SEQ ID NOs: 18 to 21, respectively.
  • hypervariable region of the ⁇ light chain variable region and the entire amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 and 12, and the base sequences encoding these are shown in SEQ ID NOs: 23 to 26.
  • hypervariable region of IgG heavy chain variable region and the entire amino acid sequence numbers 1 to 3 and 10 are shown, and the bases and sequences encoding these are shown in SEQ ID NOs: 13 to 16.
  • the obtained antibody composition was specific to R-equol in addition to S-equol, and the similar compound exhibited very low crossover properties.
  • the immunochromatography was performed on condition of the following using the immuno major (made by Aisin Seiki Co., Ltd.) as an immunochromatography device.
  • the standard solution buffer and colloidal gold anti-equol antibody were each brought to room temperature
  • the colloidal gold antibody was dissolved in 1400 ⁇ l of buffer to obtain an antibody solution having a predetermined concentration.
  • Take 96 ⁇ l of antibody solution in a microtube add 4 ⁇ l each of equol standard solution (0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 and 3 ⁇ M), urine sample and control urine and mix. Then, 75 ⁇ l of the mixed solution in the microtube was dropped onto a predetermined part of the immunochromatography device, allowed to stand in a humidified box for 20 minutes and developed, and then color development by the gold colloid was detected.

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Abstract

免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有し、免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１'、配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２'及び配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３'を有する抗エクオール抗体又はその抗体フラグメントと、免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有し、免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１'、配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２'及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３'を有する抗エクオール抗体又はその抗体フラグメントと、を含む、組成物を用いる。

Description

抗エクオール抗体組成物及びその利用
　本明細書は、抗エクオール抗体組成物及びその利用に関する。
　エクオールは、イソフラボンがヒトなどの腸内細菌によって代謝された代謝産物であるとされている。エクオールは抗エストロゲン効果により、女性ホルモンの低下に起因する種々の症状を改善することがあることが知られている。
　エクオールは、大豆製品等から腸内細菌によって生産されるが、大豆摂取量のほか、腸内細菌叢の個人差やその状況によってエクオール産生量は異なる場合がある。また、エクオールを直接摂取する場合もある。エクオールは、抗エストロゲン効果を奏するが、個体のエクオール産生能（産生量）ほか体内におけるエクオール量をモニタすることは重要である。
　ここで、エクオールは、既に尿中のエクオールを抗エクオール抗体を用いて測定する方法が提供されている（特許文献１）。
　しかしながら、従来の抗エクオール抗体は、その交差性や検出感度等に関し、必ずしも十分ではなかった。高感度でかつ高い正確性で、しかも簡易にエクオールを測定することが要請されている。
　本明細書は、より実用的に用いることができる抗エクオール抗体組成物及びその利用を提供することを１つの目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、エクオールに対するより好適な交差性や親和性等を有する抗エクオール抗体を含む組成物を取得した。本明細書によれば、この知見に基づき、以下の手段が提供される。
［１］抗エクオール抗体組成物であって、
　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗体フラグメントと、
　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗体フラグメントと、
を含む、組成物。
［２］全体として、Ｓ－エクオールに対する交差率を１００％としたとき、Ｒ－エクオール対する交差率が８０％以上である、組成物。
［３］Ｒ－エクオール対する交差率が８５％以上である、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］さらに、ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインからなる群から選択される１種又は２種以上のイソフラボンに対する交差率が０．０１％以下である、［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインの各イソフラボンに対する交差率が０．０１％以下である、［４］に記載の組成物。
［６］さらに、エラグ酸２水和物、カテキン１水和物及び没食子酸からなる群から選択される１種又は２種以上に対する交差率が１％以下である、［１］～［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］エラグ酸２水和物及びカテキン１水和物に対する交差率が０．０１％以下である、［６］に記載の組成物。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の組成物を含む、エクオール検出試薬。
［９］免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗体フラグメント。
［１０］免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗体フラグメント。
［１１］生体由来試料中のエクオールの測定方法であって、
　［８］に記載のエクオール検出試薬と前記生体由来試料中のエクオールとを接触させる工程、
を備える、方法。
［１２］エクオールの測定デバイスであって、
　固相担体に結合された［８］に記載の検出試薬を備える、デバイス。
［１３］エクオールの測定キットであって、
　［８］に記載の検出試薬を備える、キット。
［１４］［９］に記載の抗体又はその抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
［１５］［１０］に記載の抗体又はその抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
抗エクオールモノクローナル抗体の抗体価の評価結果を示す図である。 抗エクオールモノクローナル抗体のＨＰＬＣとイムノクロマトグラフィーによる測定結果を示す図である。
　本明細書の開示は、抗エクオール抗体組成物及びその利用に関する。本明細書に開示される抗エクオールモノクローナル抗体（以下、単に本抗体ともいう。）を含む組成物（以下、単に、本抗体組成物という。）によれば、高い検出感度で、しかも、高い正確性でエクオールを測定することができる。さらに、その優れた交差性によれば、生体試料中のエクオールも精度よくかつ正確に測定することができる。
　本抗体組成物は、Ｒ－エクオールにも特異的に結合するが、全体としてＳ－エクオールに対する高い結合能を有し、Ｓ－エクオールについての高い検出感度を有する。エクオール含有量が低い生体由来試料や少量の生体由来試料であっても、簡易にエクオールを測定することができる。
　以下では、本発明の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された抗エクオール抗体組成物及びその利用を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本発明を実施する際に必須のものではなく、特に本発明の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本発明の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
　以下、本明細書に開示される抗エクオール抗体組成物及びその利用に関する実施形態について詳細に説明する。
（抗エクオール抗体組成物）
　本抗体組成物は、２つの抗エクオールモノクローナル抗体を含有することができる。これらの抗体を組み合わせるで得られる本抗体組成物が備える特異的結合能は、例えば、以下のように列挙することができる。本抗体組成物は、少なくとも（１）の特異的結合能を有することができる。以下の（２）～（４）のいずれか又は２つ以上の特異的結合能をさらに有することができる。なお、本明細書において、「特異的結合能」または「特異的に結合する」とは、抗体、すなわち、免疫グロブリンが有する抗原認識能に基づいて結合する能力及び結合することを意味している。以下に、Ｒ－エクオール及びＳ－エクオールの構造を示す。なお、腸内細菌は、Ｓ－エクオールを限定的に生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（１）Ｓ－エクオールに対する交差率を１００％としたとき、Ｒ－エクオール対する交差率が８０％以上である。なお、Ｒ－エクオールに対する交差率は８５％以上であってもよいし、９０％以上であってもよいし、さらに、９５％以上であってもよく、また例えば９８％程度であってもよい。また例えば１０５％以下であってもよい。
（２）ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインからなる群から選択される１種又は２種以上のイソフラボンに対する交差率がいずれも０．０１％以下である。また例えば、ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインに対する交差率がいずれも０．０１％以下であってもよい。また、さらに、こうした交差率は０．００５％以下であってもよい。
（３）エラグ酸２水和物、カテキン１水和物及び没食子酸からなる群から選択される１種又は２種以上に対する交差率がいずれも１％以下である。また例えば、エラグ酸２水和物及びカテキン１水和物に対する交差率が０．０１％以下であってもよいし、０．００５％以下であってもよい。
（４）アピゲニン、Ｒ－Ｏ－デスメチルアンゴレンシン（ＤＭＡ）に対する交差率が０．０１％である。また例えば、同交差率が０．００５％以下である。
　上記した交差性及び交差率は、当業者において周知の方法で測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡなどによって測定することができる。
　本抗体の交差性は、特に限定するものではないが、各イソフラボン濃度が０．１μＭ以上７５μＭ以下の範囲における任意の濃度範囲で測定することができる。また、例えば、同濃度が１μＭ以上１０μＭ以下であってもよい。
　なお、上記した交差率は、例えば、以下のようにして取得することができる。まず、Ｓ－エクオールを用いて検量線を作成する。Ｓ－エクオールを含む化合物の濃度を１μＭと１０μＭとを用意し、それぞれの濃度で抗体と反応させて、検量線からＳ－エクオール濃度を算出する。例えば、１０μＭのダイゼインを添加し、検量線から１０μＭの濃度として検出された場合は１００％の交差性として、１μＭの濃度として検出された場合は１０％の交差性として、０．１μＭの濃度と検出された場合は１%の交差性としてみなす。
　本抗体組成物は２種のモノクローナル抗体を含有することができる。これらの２種のモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域のアミノ酸配列が特定されている。
　第１の抗体の重鎖（ＩｇＧ）の可変領域（ＶH領域）は、それぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を備えている。３つの超可変領域を含む重鎖可変領域は、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号１～３及び１０で表される各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１３～１５及び１６で表される。
　第１の抗体の軽鎖の可変領域（ＶL領域）は、それぞれ配列番号４～６で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’及びＣＤＲ３’を備えている。３つの超可変領域を含む軽鎖可変領域は、例えば、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列を有している。なお、当該軽鎖は、κ鎖である。配列番号４～６及び１１で表される各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１８～２０及び２１で表される。
　第２の抗体の重鎖の可変領域（ＶH領域）は、それぞれ配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を備えている。３つの超可変領域を含む重鎖可変領域は、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有することができる。配列番号１～３及び１０で表される各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１３～１５及び１６で表される。
　第１の抗体の軽鎖の可変領域（ＶL領域）は、それぞれ配列番号７～９で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’及びＣＤＲ３’を備えている。３つの超可変領域を含む軽鎖可変領域は、例えば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有している。なお、当該軽鎖は、κ鎖である。配列番号７～９及び１２で表される各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号２３～２５及び２６で表される。
　本抗体組成物は、本願出願時における公知技術において、特異的に任意の抗原（本明細書においては、例えば、Ｓ－エクオールなど）に対して結合能を有するインタクトな抗体又は当該結合能を有する抗原結合部分を含む部分ということができる。本抗体は、本願出願時における技術常識のほか以下に示す内容に基づいて各種態様を採ることができる。
　抗体の「抗原結合部分」とは、特異的に任意の抗原（例えば、Ｓ－エクオールに結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ以上のフラグメント）を意味する。「抗原結合部分」は、特に限定するものではなく、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメント（一般的に重鎖および軽鎖から１つ）を含む二価フラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）など各種形態のフラグメント又はその組合せを含むことができる。また、抗原結合部分は、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする人工ペプチドリンカーにより連結することができる。
　このほか、抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびビス－ｓｃＦｖに組み込まれていてもよい。
　本抗体の由来生物種は特に限定するものではないが、適用する生物体や目的によっても異なるが、ヒト抗体、マウス抗体、ヤギ抗体等とすることができる。なお、ヒト抗体というときには、抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意味している。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列または突然変異型のヒト生殖細胞系列配列に由来することを意味している。また、２以上の生物種に由来するフラグメントに基づく抗体をキメラ抗体ということができる。
　本抗体がモノクローナル抗体であれば、抗原に対して安定した結合性能を発揮することができる。モノクローナル抗体の取得は、当業者において周知である。後述する方法のほか、例えば、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
　また、本抗体は、例えば、組換えヒト抗体などの組換え抗体であってもよい。組換えヒト抗隊は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体；ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体；およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体はフレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。
　本抗体の製造方法については、後段にて詳述するが、本抗体は、公知の方法で取得された抗体がＲＳ－エクオールを認識して結合する結合能を有している限り、その変異体であってもよい。例えば、出発物質としての抗体の少なくとも一部、例えば、全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそれに結合した定常領域に変異を導入するなどの修飾することにより、新たな抗体を取得することもできる。また、取得した抗体に対していわゆるペグ鎖を導入するなどもできる。こうした抗体の改変の手法自体は、当業者において周知である。

　本抗体は、必要に応じて、標識要素を備えることができる。標識要素は、特に限定するものではないが、従来公知の標識物質を適宜選択して用いることができる。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。

　本抗体は、標識要素として、標識要素と結合可能な物質を備えていてもよい。最終的に標識物質による識別が可能にこれらを結合可能な分子ないし物質を備えていてもよい。こうした物質等としては、タンパク質－タンパク質相互作用、低分子化合物－タンパク質相互作用等を利用できる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン（ストレプトアビジン）－ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）－ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣシステムにおけるＦＩＴＣ等に代表されるハプテン類などが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、こうした標識物質に結合性を有する物質と相互作用する他方の分子又は物質（例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗ＦＩＴＣなど）を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように修飾される。
　こうした各種態様の標識要素は、商業的に入手できるほか、標識要素で抗体を修飾する方法も当業者において周知である。したがって、当業者であれば、種々の標識要素を取得して、抗体に対してアミノ基やカルボキシル基等の官能基を介して適宜可能である。
（抗エクオール抗体の製造方法）
　本明細書に開示される、本抗体の製造方法は、ＲＳ－エクオール（ラセミ体）にキャリアタンパク質を複合化した複合体を用いて動物を免疫する工程と、前記動物の脾臓細胞由来のハイブリドーマからＲＳ－エクオールに対して特異的結合能を有する抗体を取得する工程と、を備えることができる。
　また、前記抗体取得工程は、前記動物から分離した脾細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマから、ＲＳ－エクオールに対して特異的結合能を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマを分離する工程と、前記ハイブリドーマを用いて前記抗体を生産する工程と、を備えることができる。本製造方法によれば、モノクローナル抗体である本抗体及び本抗体組成物を効率的に取得することができる。
（免疫工程）
　以下、免疫工程について説明する。複合体を得るためのキャリアタンパク質としては、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、ウシチログロブリン（ＴＨＹ）等の公知のキャリアタンパク質から適宜選択される。キャリアタンパク質としては、さらに、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ等など各種脊椎動物種由来のもののほか変異体であってもよい。
　複合体は、例えば、ＲＳ－エクオール（ラセミ体）の水酸基に導入したカルボキシメチル基のカルボキシル基を介して常法に従い、ＫＬＨなどのキャリアタンパク質を導入して取得することができる。かかるＲＳ－エクオールに対してＫＬＨなどのキャリアタンパク質を常法に従い導入することができる。なお、エクオールの２つの４’位及び７位水酸基のうち双方にカルボキシル基が導入されるため、４’位の水酸基を介してキャリアタンパク質を導入した４’位複合体と、７位複合体と、の双方がある。すなわち、Ｒ体４’位複合体、Ｒ体７位複合体、Ｓ体４’位複合体、Ｓ体７位複合体の４種の複合体からＲ体の複合体及びＳ体の複合体を少なくとも各１種を組み合わせて用いることでＲＳ－エクオールのキャリアタンパク質複合体として用いることができる。好ましくは、これら４種の複合体を組み合わせて用いる。こうして得られる複合体で動物を免疫することで、ＲＳ－エクオール（ラセミ体）に対する特異的結合能を指標として本抗体産生能を評価することで、本抗体組成物に好適なモノクローナル抗体を効率的に取得することができる。
　こうして得られたＲＳ－エクオール－キャリアタンパク質複合体で脊椎動物を免疫する。免疫する脊椎動物（以下、免疫動物ともいう。）の種類は特に限定するものではないが、遺伝子組換又は遺伝子組換えされていない非ヒト動物が挙げられる。好適には、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。既述のとおり、ヒト抗体を得るには、ヒト型抗体を作製できるように遺伝的に改変された非ヒト脊椎動物を用いることができる。
　免疫原の免疫動物への投与は、特に限定するものではないが、腹腔内投与、静脈投与等、必要に応じて周知の方法から適宜選択される。また、複合体の投与にあたり、適宜、完全アジュバント、不完全アジュバントを適宜用いることができる。複合体の投与は、免疫される十分に繰り返して行うことができる。通常は、２回～５回程度、複合体が投与される。
　こうした免疫原を用いて、脊椎動物を免疫し、ＲＳ－エクオールに対する抗体価を評価することで、免疫動物における、本抗体の産生を確認することができる。免疫動物において、意図した抗体が産生されているか否かは、適宜、免疫動物から採血して、ＲＳ－エクオールなどを用いた抗体価を評価する。評価は、ＥＬＩＳＡなど公知の方法を適宜用いることができる。
　ＲＳ－エクオールに高い抗体価を確認できる免疫動物から脾臓を摘出して、脾細胞を調製後、Ｐ３Ｕ１細胞などのマウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどを用いた公知の細胞融合方法によって細胞融合を行い、その後、ハイブリドーマをセットなクレームする。なお、ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマがミエローマ細胞株が８－アザグアニン耐性株であることを利用して正常培地（ＨＡＴ培地）中で、例えば、１０～１４日間培養することにより選択することができる。さらに、選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を、ＲＳ－エクオールを用いてEＬＩＳＡ法で解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離する。分離したハイブリドーマを適当な培地で培養して得られる培養上清から、硫安分画、アフィニティクロマトグラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。
　本抗体組成物に適用するモノクローナル抗体（ハイブリドーマ）は、（１）Ｓ－エクオールのほか、Ｒ－エクオールに対する交差反応性ほか、エクオールの前駆体など既述の各種のイソフラボン類に対する交差反応（２）～（４）性を評価して、モノクローナル抗体を選択することができる。
　こうして得られるモノクローナル抗体及びその抗体フラグメントのアミノ酸配列は、抗体のアミノ酸配列の解析によって及び／又はハイブリドーマから得られる抗体コード領域の塩基配列解析によって得ることができる。
　こうして得られるモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドも、本開示の一態様である。また、こうした発現ベクターを保持する宿主細胞も、本開示の一態様である。なお、発現ベクターは、宿主の種類に応じて当業者に周知の適切な形態のほか、プロモーター、ターミネーター等の制御領域も適宜選択することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡであり、また例えば、ｃＤＮＡである。
　本抗体組成物が含むことのできるモノクローナル抗体の重鎖可変領域及びその超可変領域、軽鎖可変領域及びその超可変領域については既に説明したとおりである。
（生体由来試料中のエクオールの測定方法）
　本明細書に開示される、エクオールの測定方法は、本抗体と生体由来試料中のエクオールとを接触させる工程、を備えることができる。本工程により、本抗体の特異的結合能に基づきエクオールに結合する。このエクオール－抗体複合体を、種々の方法であるいは抗体に付与された標識要素を介して検出し、エクオールの存否やその濃度（量）を測定することができる。
　抗体を用いて、その特異的結合能に基づいて、結合する抗原を検知し、測定する方法自体は、当業者において周知である。本測定方法は、こうした周知の方法に適用することができる。こうした周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫クロマトグラフィーのほか、複合体の沈降反応及び沈降反応に基づく免疫電気泳動、一元平板免疫核酸法、免疫電気核酸法、交差免疫電気泳動法；複合体の凝集反応を利用したラテックス凝集法、ウエスタンブロット法（検出法としては、酵素免疫法やケミルネッセンス法等）、免役組織科学的検出法等が挙げられる。
　本測定方法における、エクオール濃度、抗体濃度等の測定条件は、測定方法の種類などに応じて当業者であれば適宜設定することができる。本抗体は、高い抗体結合性を有するため、例えば、多孔質性の固相を担体として用いた免疫クロマトグラフィーにおいて、エクオール濃度として０．５μＭの検出限界値を確保することができる。検出限界値は、また例えば、同０．４μＭであり、また例えば０．３μＭであり、また例えば０．２μＭであり、また例えば０．１μＭであり、また例えば、０．０５μＭである。また、例えば０．０４μＭであり、また例えば０．０３μＭであり、また例えば０．０２μＭであり、また例えば０．０１μＭである。
　また、こうした免疫クロマトグラフィーにおいて、検出限界以上のエクオール濃度、例えば、０．０１μＭ以上１８０ｍＭ以下の範囲でのエクオール定量値は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた定量値との高い相関を確認している。以上のことから、本抗体によれば、免疫クロマトグラフィーなどの簡易なデバイスによっても、高感度かつ正確にエクオールを検知し定量することができる。
　本測定方法は、各種の生体由来試料中のエクオールの測定に適用できる。生体由来試料としては、特に限定するものではないが、動物、植物及び微生物に由来する各種試料とすることができる。例えば、ヒトなどの動物の場合には、尿、血液、唾液、涙液、血清、血漿、便、組織又は組織抽出物等が挙げられる。また、植物の場合には、食材等が挙げられる。さらに、微生物の場合には、培養上清、細胞破砕物、細胞抽出物等が挙げられる。
　Ｓ－エクオールの検出又は測定は、エクオール－抗体複合体形成に基づく、ＥＬＩＳＡや抗体クロマトグラフィー等公知の方法を適宜採用することができる。本測定方法では、エクオール－抗体複合体の検出にあたって、適宜、本抗体に対する二次抗体を用いてもよい。
（エクオールの測定デバイス）
　本明細書に開示される、エクオールの測定デバイスは、固相担体に結合された又は結合可能な本抗体を備えることができる。本デバイスによれば、検出感度に優れる本抗体組成物を備えるために、高感度でかつ高い正確性で簡易にエクオールを測定することができる。
　測定デバイスは、各種形態を採ることができる。例えば、固相担体としては、スティック状、ストリップ状等の免疫クロマトグラフィー固相担体、ラテックスビーズ、ガラスやプラスチック等のアレイ用固相担体などが挙げられる。
（エクオールの測定キット）
　本明細書に開示される、エクオールの測定キットは、本抗体組成物を含むことができる。本キットは、さらに、エクオール－抗体複合体を検出するための試薬を含むことができる。かかる試薬は、例えば、既述の標識要素、例えば、標識要素や標識物質及び／又は標識物質結合物質のほか、これらの標識物質及び／又は標識物質結合物質を導入するための試薬、あるいは標識物質を備えていてもよい二次抗体、標識物質のための試薬（例えば、ペルオキシダーゼを標識物質とする場合の基質等）が挙げられる。
　さらに、本キットには、そのほか、ＥＬＩＳＡや抗体クロマトグラフィーによる検出を意図するブロッキング試薬、洗浄液、バッファ等を含めることができる。
　以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
（抗エクオールモノクローナル抗体の作製）
（１）免疫原の作製
　エクオールは低分子であるため、そのままでは抗原となり得ない。そのため、まず、ＲＳ－エクオール（ラセミ体）６６ｍｇ（トロントリサーチケミカル社製）、ベンジルブロモアセテート、炭酸カリウム９０ｍｇ、を室温下で一昼夜置いた後、パラジウムカーボンと接触還元によりエステルの加水分解を行ない、これにより、４位及び７位の炭素原子にカルボキシメチル基を導入し、エクオールを得た。このカルボキシメチルエクオールは、４位と７位にカルボキシ基が結合した２種類を得られた。この２つのカルボキシメチルエクオール２０ｍｇ、ＥＤＣ１５ｍｇ、ｓｕｌｆｏ-ＮＨＳ ２１ｍｇをＤＭＦ中で２４時間反応させたのち、スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin、ＫＬＨ）４６ｍｇのＰＢＳ溶液３ｍＬと２５℃で４時間反応させ、アミド結合によって結合したエクオール-ＫＬＨコンジュゲートを作製した。
（２）マウスへの免疫及びハイブリドーマの樹立
　エクオール-ＫＬＨコンジュゲート０．５ｍｇ/ｍＬ ＰＢＳを等量のアジュバンドとよく混和した後、０．１５ｍＬを雌性BALB/cマウス（６週齢）に腹腔内投与した。２週間ごとに２回追加免疫を行い、最終免疫を行った３日後に、当該マウスから脾臓を摘出し、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させることでハイブリドーマを作出した。 これら細胞の融合は、脾臓細胞とミエローマ細胞を１：５で混合し、常法に従いＰＥＧを用いて融合した。これをＨＡＴ培地で１０～１４日間培養後ハイブリドーマを選択した。
　ハイブリドーマの細胞コロニーが形成されたウェルの培養上清で上述したＥＬＩＳＡ法によって上清の抗体価を測定し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法により分離した。なお、ハイブリドーマの分離のためのスクリーニングには、抗原としてＲＳ－エクオールを用いた。分離した融合細胞を１０％ＤＭＥＭ培地で培養後、ＩｇＧカラムを用いて精製を行い、モノクローナル抗体（抗エクオール抗体）を得た。
（３）抗体の評価
　得られたモノクローナル抗体について、そのアミノ酸配列解析及び塩基配列解析を行った。ところ、軽鎖可変領域として２種（κ及びλ）を検出し、重鎖可変領域を１種検出した。これらのことから、得られたハイブリドーマには、２種類のハイブリドーマの混合物であり、得られた抗体も、２種のモノクローナル抗体の混合物（組成物）であることがわかった。κ鎖軽鎖可変領域の超可変領域及び全体のアミノ酸配列を配列番号４～６及び１１に示し、これらをコードする塩基配列を配列番号１８～２１に示す。また、λ軽鎖可変領域の超可変領域及び全体のアミノ酸配列を配列番号７～９及び１２に示し、これらをコードする塩基配列を配列番号２３～２６に示す。また、ＩｇＧ重鎖可変領域の超可変領域及び全体のアミノ酸配列番号１～３及び１０に示し、これらをコードする塩基及び配列を配列番号１３～１６に示す。
（抗エクオールモノクローナル抗体組成物の交差性の評価）
　得られた抗体組成物の交差性を調べるため、Ｓ－エクオールを含む９種類（Ｓ－エクオール、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、エラグ酸２水和物、カテキン１水和物、没食子酸、アピゲニン、ＤＭＡ）の化合物について反応性を検討した。まず、Ｓ－エクオールを用いて検量線を作成した。Ｓ－エクオールを含む９種類の化合物を１μＭと１０μＭ用意し、それぞれの濃度を本抗体と反応させて、検量線から交差性を算出した。結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すように、得られた抗体組成物は、Ｓ－エクオールのほかＲ－エクオールに特異的であり、類似化合物には極めて低い交差性しか呈さなかった。
（エクオール検量線の作製）
　得られた抗体組成物を用いて、最大濃度３μＭのＳ－エクオール標準液より希釈バッファーにて段階希釈し、それぞれ濃度３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０μＭの標準液を用いた免疫クロマトグラフィーで実施時の検量線を図１に示す。図１に示すように、検量範囲は０．０１μＭ～３μＭであった。実施例１で得た抗体組成物は、極めて高い検出感度を有していることがわかった。
　なお、免疫クロマトグラフィーは、イムノクロマトグラフィーデバイスとしてイムノメジャー（アイシン精機株式会社製）を用いて、以下の条件で行った。標準液、バッファー及び金コロイド抗エクオール抗体をそれぞれ室温とした後、金コロイド抗体を１４００μｌのバッファーで溶解して所定濃度の抗体溶液とした。抗体溶液９６μｌをマイクロチューブにとり、エクオール標準液（０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１及び３μＭ）、尿検体及びコントロール尿の各４μｌを加えて入れて混合し、マイクロチューブ内の混合液７５μｌを、イムノクロマトグラフィーデバイスの所定部位に滴下し、潤湿箱で２０分間静置して展開し、その後、金コロイドによる発色を検出した。
（免疫クロマトグラフィーによるエクオール測定結果のＨＰＬＣによる評価）
　従来の測定で用いられるＨＰＬＣ方法と実施例１で得た抗体組成物を実施例３と同一の条件で行ったイムノクロマト測定法の相関について、ヒト尿の３０検体について評価した。測定結果を比較したグラフを図２に示す。図２に示すように、測定法をＨＰＬＣ法の間には直線関係が認められ、近似曲線y＝０．４９７９ｘ－０．３６７７、相関係数Ｒ2＝０．９８２であった。
特開2010-169507号公報

Claims (15)

  1. 　抗エクオール抗体組成物であって、
    　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
    　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗エクオール抗体フラグメントと、
    　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
    　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗エクオール抗体フラグメントと、
    を含む、組成物。
  2. 　全体として、Ｓ－エクオールに対する交差率を１００％としたとき、Ｒ－エクオール対する交差率が８０％以上である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　Ｒ－エクオール対する交差率が８５％以上である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　さらに、ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインからなる群から選択される１種又は２種以上のイソフラボンに対する交差率が０．０１％以下である、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 　ダイゼイン、ゲニステイン及びグリシテインの各イソフラボンに対する交差率が０．０１％以下である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　さらに、エラグ酸２水和物、カテキン１水和物及び没食子酸からなる群から選択される１種又は２種以上に対する交差率が１％以下である、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
  7. 　エラグ酸２水和物及びカテキン１水和物に対する交差率が０．０１％以下である、請求項６に記載の組成物。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の組成物を含む、エクオール検出試薬。
  9. 　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
    　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗エクオール抗体フラグメント。
  10. 　免疫グロブリン重鎖可変領域として、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖超可変領域ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３を有し、
    　免疫グロブリン軽鎖可変領域として、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ１’、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ２’及び配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる超可変領域ＣＤＲ３’を有する、抗エクオール抗体又はその抗エクオール抗体フラグメント。
  11. 　生体由来試料中のエクオールの測定方法であって、
    　請求項８に記載のエクオール検出試薬と前記生体由来試料中のエクオールとを接触させる工程、
    を備える、方法。
  12. 　エクオールの測定デバイスであって、
    　固相担体に結合された請求項８に記載の検出試薬を備える、デバイス。
  13. 　エクオールの測定キットであって、
    　請求項８に記載の検出試薬を備える、キット。
  14. 　請求項９に記載の抗体又はその抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
  15. 　請求項１０に記載の抗体又はその抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
     
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