WO2018115407A1 - Extrait de fraisier des bois et utilisations - Google Patents

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WO2018115407A1
WO2018115407A1 PCT/EP2017/084317 EP2017084317W WO2018115407A1 WO 2018115407 A1 WO2018115407 A1 WO 2018115407A1 EP 2017084317 W EP2017084317 W EP 2017084317W WO 2018115407 A1 WO2018115407 A1 WO 2018115407A1
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WO
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extract
skin
weight
strawberry
fruit
Prior art date
Application number
PCT/EP2017/084317
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English (en)
Inventor
Virginie LEPLANQUAIS-PELLERIN
Carine Nizard
Emmanuelle LEBLANC
Valentin JERONIMO
Original Assignee
L V M H Recherche
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates in particular to a particular extract of leaves and strawberry fruit of the Fragaria vesca species and its use in a cosmetic composition, in particular for topical application to the skin, as a protective agent against oxidative stress and / or agent stimulating the cellular metabolism of the skin. It also relates to a cosmetic composition for topical application to keratin materials, in particular the skin, comprising an extract of leaves and strawberry fruit of the Fragaria vesca species obtained using a cosmetically acceptable polar solvent, preferably a hydro-alcoholic mixture, and at least one cosmetically acceptable excipient, and a cosmetic care method implementing it to protect the skin from the harmful effects of oxidative stress and / or to stimulate the cellular metabolism of the skin.
  • a cosmetic composition for topical application to keratin materials in particular the skin, comprising an extract of leaves and strawberry fruit of the Fragaria vesca species obtained using a cosmetically acceptable polar solvent, preferably a hydro-alcoholic mixture, and at least one cosmetically acceptable excipient, and
  • the skin is the first barrier of the human body. It protects the organs from differences in temperature, humidity, and aggressions of the external environment, such as UV rays or pollutants. It also plays an important role in homeostasis, for example to regulate body temperature.
  • excessive chemical and physical stimulation - exposure to the sun, light, UV, stress and pollution - deteriorates the normal functions of the skin and induces aging.
  • This extrinsic aging leads to the appearance of wrinkles and the formation of skin that has lost its firmness, suppleness and elasticity.
  • the intrinsic aging is the consequence of a programmed senescence in which endogenous factors intervene.
  • This intrinsic aging notably causes a slowing down of the renewal of the skin cells, the keratinocytes, which essentially results in the reduction of the subcutaneous adipose tissue, the appearance of fine lines or wrinkles, a loss of vertical fibers of the membrane. elastic tissue, and the presence of large irregular fibroblasts in the cells of this elastic tissue.
  • the present invention is particularly interested in extrinsic aging related to the attacks of the external environment (light, UV radiation, pollution ...), and seeks to prevent and / or mitigate its effects.
  • Oxidative stress is notably responsible for the acceleration of human skin aging. Free radicals and reactive oxygen species (EORs) are formed during normal cellular metabolism but also in response to physical and chemical stresses such as UVs or hydrogen peroxide (H 2 0 2 ). These effects of oxidative stress are harmful for all compartments and cellular constituents (DNA, proteins, lipids ). They can also lead to diffuse redness on the skin.
  • EORs reactive oxygen species
  • the search for new molecules or active ingredients used in cosmetics is a necessity to be able to develop effective products to give a younger appearance to the skin, a homogeneous complexion, without color irregularity in the pigmentation or microcirculation, a complexion reflecting his good health.
  • the inventors have just developed a new extract of leaves and strawberry fruit of the species Fragaria vesca, the Queen of the Valleys, and highlighted surprising performances, as shown by the tests carried out on normal human keratinocytes (KHN) and illustrated in the examples described below.
  • the leaf extract and strawberry fruit of the Fragaria vesca species according to the invention has six key actions: - Action on Nrf2 (Nuclear factor E2-related factor 2) in basal condition (without stress): the extract induces Nrf2 thus making it possible to anticipate the keratinocyte needs in terms of defenses and energy;
  • Nrf2 under stress conditions (H 2 0 2 or UVB): under these particular conditions, the extract induces Nrf2 more strongly, thus helping the cell to cope in terms of defenses and energy;
  • the extract significantly increases the production of ATP by keratinocytes
  • the extract significantly traps free radicals produced by keratinocytes stressed by H 2 0 2 ;
  • Action on the reinforcement of the skin barrier the extract significantly increases the amount of specific proteins involved in the cutaneous barrier; their presence is a guarantee of good barrier function; and
  • the extract limits the production of UV-mediated inflammation mediators and thus helps to reduce diffuse redness.
  • Nrf2 acts on the metabolism and the energy of the cell: involved in the modulation of the intermediate metabolism, Nrf2 facilitates glucose flow and increases the regeneration of NADPH (essential cofactor for enzymatic activities requiring energy) .
  • This metabolic reprogramming would in particular make it possible to better combat stress (Hayes et al., 2014, Trends in Biochemical Sciences 2014; 39 (4): 199-218).
  • Nrf2 He is also directly involved in anti-stress defense.
  • the fixation of Nrf2 on a specific area of the DNA (promoter region) induces the synthesis of numerous genes involved in the antioxidant response, the detoxification of cells.
  • Nrf2 thus also contributes to the repair and degradation processes of macromolecules damaged by stress.
  • Nrf2 is expressed in all layers of the epidermis and a link has been observed between its concentration and epidermal differentiation, the latter leading to the formation of the cutaneous barrier (Lee et al, 2014 Archives of Dermatological Research 2014; 306: 677 -82).
  • Nrf2 The role of Nrf2 is therefore major in cellular homeostasis and stress management. By activating it, we participate in the overall good functioning of the skin for a visible result on the outside.
  • a first object of the invention is a particular extract of leaves and strawberry fruit of the species Fragaria vesca, obtained using a cosmetically acceptable polar solvent, and as defined below in the description.
  • the extract according to the invention may be in powder form (freeze-dried) or in liquid form concentrated or diluted in a mixture of polar solvents (strawberry extract solution).
  • Another subject of the invention is a cosmetic composition for topical application to keratinous substances, in particular the skin, comprising as active agent a strawberry extract according to the invention and at least one cosmetically acceptable excipient.
  • the invention also relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, in particular for topical application, of a strawberry extract of the Fragaria vesca species according to the invention, as a active agent that protects against oxidative stress and / or stimulates cellular metabolism of the skin.
  • Another subject of the invention is a method for the cosmetic care of keratin materials, in particular the skin, comprising the application to said keratin materials, in particular the skin of the face and / or the body, of an effective amount of at least one cosmetic composition comprising the strawberry extract of the Fragaria vesca species according to the invention, for protecting the skin from the harmful effects of oxidative stress, in particular toxins and / or pollution, and / or to stimulate the cellular metabolism of the skin, aimed in particular at preparing the skin for the sun and / or preventing the signs of extrinsic skin aging, in particular preventing and / or reducing wrinkles and / or fine lines, and / or improving the radiance and / or the uniformity of the complexion, and / or to improve the radiance and / or the transparency of the skin, and / or to improve the suppleness and / or the elasticity of the skin.
  • Another subject of the invention is an extract of leaves and strawberry fruit of the Fragaria vesca species obtained using a cosmetically acceptable polar solvent, preferably a hydroalcoholic mixture, in particular an extract as defined herein. according to the invention or composition according to the invention, for preventing and / or limiting the harmful effects of UV.
  • a cosmetically acceptable polar solvent preferably a hydroalcoholic mixture, in particular an extract as defined herein. according to the invention or composition according to the invention, for preventing and / or limiting the harmful effects of UV.
  • the invention relates to a particular extract of leaves and strawberry fruit of the species Fragaria vesca, obtained by means of a cosmetically acceptable polar solvent.
  • the plant material consisting of strawberry leaves and fruits may have been dried and / or ground.
  • the extract may be prepared by various extraction methods known to those skilled in the art.
  • the strawberry extract of the Fragaria vesca species can be obtained by a process comprising the following steps:
  • the extraction is preferably carried out by contacting the selected plant material with a polar solvent or a mixture of polar solvents.
  • polar solvent means that the solvent has a Polarity Index value that is equal to or greater than a value of 4.
  • the polarity index is a quantity calculated on the basis of thermodynamic magnitudes. (of solubility and change of state) which highlights the more or less polar nature of a molecule.
  • indexes of polarity of solvents see the article by L. R. SNYDER: Classification of the solvent properties of common liquids; Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230.
  • Preferred polar solvents are those consisting of a compound comprising at least one polar covalent bond of O-H type.
  • a solvent or a mixture of solvents chosen from water, C 1 -C 4 alcohols, such as ethanol, glycols, such as ethylene glycol, glycerol, butylene glycol and propylene glycol, and mixtures thereof.
  • the plant material is extracted with a hydroalcoholic mixture, advantageously a mixture of water and ethanol.
  • the plant material is extracted using a solvent consisting of water and ethanol, the ethanol representing from 50% v / v to 99% v / v of the water / ethanol mixture.
  • the plant material is extracted using a mixture comprising 30% v / v of water and 70% v / v of ethanol.
  • the strawberry extract of the Fragaria vesca species is obtained by hydroalcoholic extraction of the leaves and fruits of said plant.
  • Extraction can be carried out under reflux or by maceration at room temperature. Ultrasound during extraction is advantageously used in order to improve the mass yield of said extraction.
  • the extraction process advantageously comprises a filtration step for separating the liquid phase from the spent plant material.
  • the extraction cycle can be reproduced and then filtered several times in order to exhaust the plant material of the substances having an affinity for the extraction solvent.
  • the extraction process may also comprise at least one fading and / or purification step, for example in the form of a treatment of the extract with a solution of at least one polar solvent in the presence of activated carbon particles. . This eliminates chlorophyll extracted by the solvent.
  • the extraction process may further be completed by a step of partial or total elimination of extraction solvents.
  • the extract can advantageously be concentrated by removing a part of the solvent or of the mixture of the extraction solvent. It is thus possible to obtain an aqueous concentrate that does not contain a significant quantity of organic solvents, or else, by eliminating all the extraction solvent, to obtain a dry residue.
  • the extract of leaves and strawberry fruits is concentrated by removing the ethanol, so as to obtain an aqueous extract which may comprise up to 35% by weight, in particular from 25% to 30% by weight of dry matter. relative to the total weight of the extract.
  • the extract of leaves and strawberry fruit of the woods of the Fragaria vesca species comprises from 10 to 35% by weight of dry matter, in particular from 10 to 20% by weight, and preferably from 10 to 15% by weight of dry matter relative to the total weight of the extract.
  • the leaf / fruit weight ratio in the dry extract of strawberry ranges from 15/1 to 5/1, preferably from 12/1 to 8/1, and is preferably 10/1, more preferably 9/1 (90% leaves and 10% fruit as illustrated in the examples).
  • the product of the extraction step may be freeze-dried or atomized to be in the form of a powder.
  • the polar plant extract as described above may be used in a cosmetic composition in the form of a powder or may be put back in solution or in suspension in at least one cosmetically acceptable solvent, which may be identical to or different from that which has served to extraction.
  • the concentrated extract of leaves and strawberry fruits is redissolved in a mixture of water and butylene glycol.
  • the strawberry extract solution according to the invention comprises a content of 7 to 15%, in particular of 10 to 15% by weight of dry matter in a mixture of water and butylene glycol.
  • a particular strawberry extract of the invention in the form of a solution of strawberry extract comprises 12.5% by weight of dry matter (and in particular 1.25% fruit and 11.25% leaf), 37.5% by weight. % water and 50% butylene glycol.
  • the strawberry extract according to the invention is characterized by an intrinsic composition comprising:
  • a high level of polyphenols (15 to 20% of the dry matter), among which glycosylated flavonoids such as quercetin and kaempferol; the quantification of these flavonoids would still be under analysis;
  • sugars including glucose, fructose, sucrose
  • Amino acids among which aspartic acid, glutamic acid, proline, alanine;
  • the powder, concentrated liquid or diluted liquid (extract solution) forms of leaf extract and strawberry fruit may alternatively be used in the preparation of cosmetic compositions.
  • the strawberry extract of the woods according to the invention will be used in the form of a solution of wood strawberry extract in the preparation of cosmetic compositions.
  • the invention also relates to a cosmetic composition, preferably for topical application, comprising as active agent a strawberry extract of the woods according to the invention and at least one cosmetically acceptable excipient.
  • cosmetically acceptable excipient is meant a substance devoid of cosmetic effect as such, but useful for the incorporation of the active agent into the cosmetic composition or the shaping of said composition.
  • the excipient is advantageously chosen from pigments, dyes, polymers, surfactants, rheology agents, perfumes, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, UV filters, preservatives and the like. any of their mixtures, and optionally additionally at least one other cosmetic active agent.
  • Said composition comprises an effective amount of strawberry extract of the woods according to the present invention to obtain the desired effect.
  • the strawberry extract of the woods according to the invention is advantageously present as an active agent in the composition in a content of between 0.1 and 5% by weight of raw material relative to the total weight of the composition, preferably of 0.5 to 2% by weight of raw material relative to the total weight of the total composition, for a preferred raw material comprising 12.5% solids and 87.5% polar solvent as described above (solution of strawberry extract).
  • the strawberry extract of the woods according to the invention is advantageously present as an active agent in the composition in a content of between 0.01 and 1% by weight of dry extract per relative to the total weight of the composition, preferably from 0.05 to 0.5%, and more preferably from 0.0625% to 0.25% by weight of dry extract relative to the total weight of the total composition.
  • composition according to the invention is advantageously intended for topical application to keratinous substances, in particular on the skin.
  • keratin materials is meant the lips, the skin and its integuments (nails, eyelashes, hair), in particular the skin.
  • composition according to the invention may especially be in the form of a water-in-oil emulsion, an oil-in-water emulsion, an aqueous gel, a serum, a lotion, a water-in-water emulsion or a cream of a mask, a stick, or a patch.
  • composition according to the invention may be a serum, a cream, a lotion or a mask.
  • composition according to the invention may be a skincare and / or make-up product for keratinous substances, in particular the skin.
  • compositions comprising the strawberry extract according to the invention advantageously comprise at least one other cosmetically acceptable active agent.
  • compositions which comprise the strawberry extract of the woods according to the invention may further comprise one or more other active agents which may be chosen from substances having a lightening activity of the skin; substances with moisturizing activity; substances having calming, soothing or relaxing activity; the substances having an activity stimulating cutaneous microcirculation to improve the radiance of the complexion, in particular of the face; substances having a sebo-regulating activity for the care of oily skin; substances intended to clean or purify the skin; substances with anti-radical activity; vitamins; substances intended to attenuate or delay the effects of aging of the skin, in particular the formation of wrinkles, by an activity intended to promote the maintenance of the structure of the skin and / or to limit the degradation of the extracellular matrix of the skin; superficial layers of the dermis and epidermis and / or to obtain a protective, corrective or restructuring effect of the skin, and mixtures thereof.
  • active agents which may be chosen from substances having a lightening activity of the skin; substances with moisturizing activity; substances having calming, soothing or relaxing activity;
  • the cosmetic composition of the invention comprises at least one strawberry extract of the woods according to the invention and at least one cosmetic active agent chosen from substances having a lightening activity of the skin, vitamins, and their mixture.
  • the invention also relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, as an active protective agent oxidative stress, in particular toxins and / or pollution, and / or to stimulate the cellular metabolism of the skin, aiming in particular at preparing the skin for the sun and / or and / or preventing the signs of extrinsic skin aging, in particular particularly prevent and / or reduce wrinkles and / or fine lines, and / or improve the radiance and / or uniformity of the complexion; and / or improve the radiance and / or the transparency of the skin; and / or improve the suppleness and / or the elasticity of the skin.
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, as an active agent that protects against oxidative stress, especially toxins and / or pollution.
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, as agent to stimulate the cellular metabolism of the skin.
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, for preparing the skin for the sun .
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, to prevent the signs of aging. extrinsic skin, in particular preventing and / or reducing wrinkles and / or fine lines.
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, to improve the brightness and / or the uniformity of the complexion; and / or improve the radiance and / or the transparency of the skin.
  • the invention relates to the use, in a cosmetic composition or for the preparation of such a composition, of a strawberry extract of the woods of the Fragaria vesca species according to the invention, to improve the flexibility and / or the elasticity of the skin.
  • Another subject of the invention is a method for the cosmetic care of keratinous substances, in particular the skin, characterized in that it comprises the application on said keratin materials, in particular the skin of the face and / or the body, an effective amount of at least one cosmetic composition according to the invention.
  • the cosmetic care method according to the invention aims in particular to protect the skin against oxidative stress, in particular toxins and / or pollution, and / or to stimulate the cellular metabolism of the skin, in particular to prepare the skin for sun and / or preventing the signs of extrinsic skin aging, in particular preventing and / or reducing wrinkles and / or fine lines, and / or improving the radiance and / or uniformity of the complexion; and / or improve the radiance and / or the transparency of the skin; and / or improve the suppleness and / or the elasticity of the skin.
  • Another subject of the invention is an extract of leaves and strawberry fruit of the Fragaria vesca species obtained using a cosmetically acceptable polar solvent, preferably a hydroalcoholic mixture, in particular an extract as defined herein. according to the invention or composition according to the invention, for preventing and / or limiting the harmful effects of UV.
  • Figure 1 Graphical representation of the effect of the extract of leaves and fruits of Fragaria vesca on the nuclear translocation of NRF2 under oxidative stress conditions.
  • Figure 2 Graphical representation of the effect of the production of H 2 0 2 on the production of EORs on the media tested without active agents (controls)
  • Figures 3 Graphical representation of the antioxidant effect (significant decrease in the production of EORs) of the leaf extract and fruits of Fragaria vesca, in oxidative stress condition.
  • Figure 4 Graphical representation of the anti-MMP effect of leaf extract and fruits of Fragaria vesca, in UV stress condition.
  • Figure 5 Graphical representation of the soothing effect (decrease in IL-8 production) of the leaves and fruit extract of Fragaria vesca under UV stress conditions.
  • Figure 6 Graphic representation of the soothing effect (reduction of the production of e TGF-a) of the extract of leaves and fruits of Fragaria vesca, in UV stress condition.
  • Figure 7 Graphical representation of the effect of leaf extract and fruit of Fragaria vesca, on ATP synthesis and mitochondrial activity in normal human keratinocytes.
  • Example 1 Preparation of extracts of leaves and fruits of Fragaria vesca. An extract was prepared from leaves and strawberry fruits of the species
  • a mixture of leaves and fruits comprising 90% by weight of leaves and 10% by weight of fruit (corresponding to a leaf / fruit weight ratio of 9/1) is used for the preparation of the extract, the percentages being expressed by relative to the weight of plant material to extract.
  • a solid-liquid extraction is carried out using a polar solvent.
  • the plant material is extracted at reflux for one hour with stirring in ethanol / water (70/30 v / v).
  • the extract is filtered to remove the plant residue, and the cycle is repeated a second time, in order to optimize the yield.
  • the spent plant residue is removed after the filtration step.
  • the mass yield after extraction is about 25% by weight relative to the weight of dry plant material used.
  • the extract obtained after filtration is decolorized with activated charcoal to remove chlorophyll, other pigments or metals.
  • the filtrate recovered is clear.
  • the extract is concentrated by removing ethanol to recover an aqueous concentrate.
  • the aqueous concentrate is filtered on a 1 micron plate to remove any solid residues.
  • said extract is dissolved in a mixture of butylene glycol and water until a solids content of between 10 and 15 is obtained. % in weight.
  • the strawberry extract solution evaluated in the tests described below comprises 12.5% dry matter, 37.5% water and 50% butylene glycol.
  • the extract according to the invention contains sugars (glucose, sucrose and fructose). It also contains polyphenols, minerals, and in smaller amounts of vitamins, amino acids.
  • the polyphenols are characterized by a chromatographic method (C18 grafted column, Agilent Pursuit XRS C18 250 * 4.6mm, diameter 5 ⁇ ) with UV detection at 280 nm and 365 nm).
  • the compounds detected are mainly ellagitannins and phenolic acids, but also flavonols and flavanolols.
  • the polyphenols constitute about 15% by weight of the dry extract.
  • Example 2 Protective effect of the extract of leaves and fruits of Fragaria vesca against external stresses (UV, pollution, oxidative stress ...) 2.1. Effect of the extract on certain metabolic pathways
  • the study is carried out on a monocellular culture of normal human keratinocyte (KHN) cells from abdominoplasty of a 31-year-old female donor.
  • KHN normal human keratinocyte
  • the cells were first seeded in complete Epilife (HKGS supplemented) medium (P5) at a density of 10,000 cells per well in 96-well plates and incubated at 37 ° C. 2 .
  • HKGS supplemented complete Epilife
  • the keratinocytes are pretreated with the leaf and fruit extract prepared in Example 1 (strawberry extract solution), used at concentrations of 0.025% or 0.05% for 16 hours, then treated with an oxidizing solution (extract 0.025% or 0.05% + H 2 0 2 100 ⁇ , 5minut.es 4 ° C) or subjected to UVB irradiation (50mJ / cm 2 ), and finally treated again with strawberry extract (0.025% or 0.05%) for 1 h and 2 h after oxidative stress H 2 0 2 , and 2 h after UVB irradiation. Immunological staining with NRF2 is then performed and analyzed by high throughput screening (measuring the intensity of NRF2 / core expression).
  • the strawberry extract according to the invention applied to the skin thus makes it possible to combat the effects of stress and reinforce the intrinsic defenses of the skin.
  • Anti-oxidant effect anti-free radicals
  • Example 1 The study of the anti-oxidant (free radical-scavenging) properties of the extract of leaves and strawberry fruits prepared in Example 1 was carried out using a method carried out using a Fluorescent H 2 DCF-DA probe, allowing quantification of reactive oxygen species EORs formed in the presence of oxidative stress at ⁇ 2 0 2 .
  • H 2 DCF-DA probe (Sigma) prepared at 50 ⁇ in Epilife medium without HKGS from a solution mother to 50mM in DMSO, are deposited in each of the wells.
  • the microplates are placed at 37 ° C. with stirring for 45 minutes.
  • the cells are treated with the active agents / reagents in the presence of H 2 0 2 100 ⁇ (Sigma)
  • the other half is treated with the assets without H 2 0 2 100 ⁇ .
  • the fluorescence results obtained (RFU) are then normalized by the amount of protein in each well (in ⁇ g).
  • the controls are those used in the analysis of the results of the reagents / actives tested in this study. Indeed, each active ingredient or reagent tested was compared to its respective excipient control. This study is validated by the significant induction of the production of EORs in the presence of H 2 0 2 in KHN compared to the control without H 2 0 2 .
  • MMP-2 is rather expressed by fibroblasts, especially during the development and regeneration phases cell or tissue. It preferentially degrades type IV collagen, a major component of the basement membrane and denatured collagen. MMP-1 is a central pivot that strongly responds to UV stress via the transcription factor AP-1, and is therefore involved in many cascade reactions, either in the dermis or the epidermis by paracrine effect between the cells that constitute them respectively.
  • Luminex technology to simultaneously measure the protein expression of 3 MMPs, namely MMP-1, MMP-2 and MMP-10, secreted by normal human keratinocytes, after stimulation. by UVB (24 or 48 hours of treatment).
  • KHN Normal human keratinocytes
  • P5 complete epilife medium
  • the cell supernatants are recovered and frozen at -20 ° C., in order to carry out the protein assays thereafter using Luminex technology using ELISA technology while using the operation of flow cytometry.
  • the 2 Combined techniques allow simultaneous determination of several protein targets of interest, in a minimum of sample volume.
  • antibodies specific to the analytes to be assayed are previously adsorbed on fluorescent microspheres.
  • the analytes present in the medium will bind to their antibodies.
  • a biotinylated detection antibody is added, followed by incubation with streptavidin-phycoerythrin which will interact with biotin.
  • the assay was performed using a Millipore assay kit according to the supplier's recommendations.
  • a range is prepared for each analyte to be assayed, in order to be able to perform calibration curves.
  • the system can then directly calculate the concentration of pg / mL of each analyte present in the culture supernatants.
  • the concentration is then expressed in picogram of MMP per milliliter of medium.
  • the Student's test is applied (the results are considered significant for p ⁇ 0.05). The results are shown in Figure 4:
  • the strawberry extract prepared in Example 1 exhibits a very strong inhibitory activity of the protein expression of MMP-1, regardless of the treatment condition achieved and still significantly (-80% and -68% at 24 hours, -91% and -75% at 48 hours). It is effective from 24 hours, and from the concentration of 0.025%.
  • the strawberry extract prepared in Example 1 exhibits an inhibitory activity of the protein expression of MMP-2, whatever the treatment conditions (-36% and - 32% at 24 hours, -71% and -64% at 48 hours).
  • Example 1 The strawberry extract prepared in Example 1 exhibits an inhibitory activity of the protein expression of MMP-10 at 0.05% and after 48 hours of treatment (-72% of the production of MMP-10). These results show that the strawberry extract according to the invention has an inhibitory activity of the production of 3 UV-induced metalloproteinases, namely MMP-1, MMP-2 and MMP-10, at a dose of 0.05%.
  • This ingredient is therefore interesting for its protective activity against environmental harmful effects like UVs, playing particularly a role on 3 major proteins involved in the degradation of the extracellular matrix.
  • Example 2 The effect of the strawberry leaf and fruit extract prepared in Example 1 on the expression of inflammation markers, cytokines, was measured in order to demonstrate a soothing activity via anti-inflammatory properties. -inflammatory.
  • Cytokines belong to a group of soluble proteins acting as regulators, whether under normal conditions, under pathological conditions or stress. These proteins are mediators of inflammation, acting on cellular interactions and inducing cascade reaction phenomena via different signaling pathways, especially following various stresses or external aggressions, such as UV radiation. They play a preponderant role in chronic inflammatory disorders and skin aging.
  • the efficacy of strawberry extract (0.05 and 0.025%) was evaluated using Luminex technology to simultaneously measure the protein expression of 3 cytokines, secreted by normal human keratinocytes, after UVB stimulation.
  • the KHNs derived from an abdominoplasty, are used at 60% confluence in the complete passageway Epilife medium (P5), with a seed density of 150,000 cells per well, in 12-well plates.
  • the normal human keratinocyte culture medium is removed and replaced with new medium.
  • the KHN culture medium is removed and replaced by PBS to achieve UVB irradiation 25 mJ / cm 2 .
  • New medium containing the various treatments extract, solvent control, positive control
  • the cell supernatants are recovered and frozen at -20 ° C., in order to carry out the protein assays with the aforementioned Luminex technology.
  • the assay was performed using a Millipore assay kit according to the high sensitivity protocol to optimize cytokine detection.
  • the cytokines analyzed are interleukin 8 (IL-8) and Transforming Growth Factor-alpha (TGF- ⁇ ).
  • IL-8 interleukin 8
  • TGF- ⁇ Transforming Growth Factor-alpha
  • the extract has always been tested after UVB stimulation, in order to measure the curative efficacy over 24 and 48 hours.
  • UVB significantly increased the expression of IL-8 at 24 hours (x5), this induction decreasing at 48 hours but still being significant compared to the basal production of keratinocytes (x2.8).
  • UVB significantly increased TGF- ⁇ expression, with increasing kinetics over time: + 42% at 24 hours and + 70% at 48 hours.
  • This target is therefore interesting to modulate because the harmful effect of UVBs seems prolonged.
  • the extract of leaves and strawberry fruits according to the invention is capable of significantly reducing the production of IL-8 and TGF- ⁇ ) by normal human keratinocytes after stimulation with UVB, at the concentration of 0.05% for 24 or 48 hours of treatment.
  • the strawberry extract according to the invention is therefore interesting for its protective activity against the harmful environmental effects type UVs, or its soothing effectiveness.
  • Example 1 A study on the transcriptional effect of the strawberry leaf and fruit extract prepared in Example 1 was evaluated using the TaqMan Low Density Array (TLDA) technology.
  • TLDA TaqMan Low Density Array
  • Normal human keratinocyte cells are treated with strawberry extract at two concentrations (0.025% and 0.05%) and the excipient control (butylene glycol BG / water).
  • RNAs After 24 hours of treatment, the cells are recovered in order to extract the total RNAs using the Nucleospin RNA trace kit (Macherey-Nagel). The total RNA solutions obtained are assayed, and their quality verified, using a microplate reader, the spectrostarNANO (BMG Labtech) coupled with MicrolabSTAR. This device is connected to the computer driving the robotic platform and has a specific software for analyzing results (MARS software). The technique requires a 384-well micro-plate (Greiner), a positive control (RNA 250 Thermofisher) to validate the pipetting performed by the robot and the values generated by the spectrostarNANO reader.
  • Macherey-Nagel Nucleospin RNA trace kit
  • the reverse transcription kit (RT) used is the High Capacity Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher) and was used according to the protocol provided.
  • control genes (called “endogenous” gene in the software) to be used for the normalization of the results are indicated before the launch of the PCR.
  • the latter is performed according to the protocol provided by Applied Biosystems in the ABI Prism 7900HT Sequence Sensor System.
  • Table 1 Percentages of expression variation of genes encoding proteins of the cutaneous barrier.
  • Example 3 Stimulating effect on the cell metabolism of the skin The effect of a leaf extract and strawberry fruit according to Example 1 was evaluated at 0.05%, 0.025% and 0.01% on the synthesis of ATP and mitochondrial activity in normal human keratinocytes. The KHNs were treated for 24 hours with the extract at different concentrations.
  • the cells were immediately lysed and intracellularly assayed by the ApoSENSOR Cell viability kit which uses bioluminescence.
  • the mitochondrial activity is measured by the XTT colorimetric test.
  • the KHNs from abdominoplasty are provided at confluence in Epilife medium, pass (P5), at a density of 10,000 cells per well per 96-well plate.
  • the decrease in ATP level is an indicator of cell death (apoptosis). On the contrary, cell proliferation can be recognized by an increase in the level of ATP.
  • the ApoSENSOR Cell viability kit uses bioluminescence to detect the ATP level for rapid simultaneous screening of apoptosis and proliferation.
  • the kit uses luciferase, which catalyzes light formation from ATP and luciferin, and the light is measured by a luminometer:
  • the measured RLUs are proportional to the concentration of ATP.
  • a standard range of 0.001 ⁇ g / mL to 1000 ⁇ g / mL is performed to calculate the intracellular ATP concentration.
  • the cell viability test is performed using the XTT test. It is a colorimetric test based on the reduction of tetrazolium salt XTT (yellow) to formazan (orange) by the mitochondrial dehydrogenases of living cells. The formazan derivative absorbs at 450 nm.
  • the 0.01% dose allows 24 and 48 hours to simultaneously increase ATP synthesis and mitochondrial activity.
  • the percentages are indicated by weight relative to the weight of the final composition.
  • This composition is a lotion applied to the skin of the face, daily to obtain the desired protective effect vis-à-vis stress environmental.
  • This composition is an oil-in-water emulsion.
  • the cream is applied on the skin of the face, daily to obtain the effect of prevention or mitigation of the signs of skin aging Anti-wrinkle foundation
  • UV filters 5.0%
  • micronized titanium oxide 2.0%
  • the foundation is applied to the skin of the face, daily to obtain the effect of prevention or mitigation of the signs of extrinsic cutaneous aging related to UV stress and / or pollution.

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Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau, comprenant à titre d'agent actif un extrait de feuilles et fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, en particulier un mélange hydroalcoolique et au moins un excipient cosmétiquement acceptable. Elle porte également sur ses utilisations notamment pour protéger la peau contre le stress oxydatif et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau.

Description

Extrait de fraisier des bois et utilisations
Domaine de l'invention
La présente invention concerne notamment un extrait particulier de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca et son utilisation dans une composition cosmétique, en particulier pour application topique sur la peau, en tant qu'agent protecteur contre le stress oxydant, et/ou agent stimulant le métabolisme cellulaire de la peau. Elle concerne également une composition cosmétique pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau, comprenant un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydro-alcoolique, et au moins un excipient cosmétiquement acceptable, ainsi qu'une méthode de soin cosmétique la mettant en œuvre pour protéger la peau des effets néfastes du stress oxydatif et/ou stimuler le métabolisme cellulaire de la peau.
La peau est la première barrière du corps humain. Elle protège les organes des différences de température, d'humidité, et des agressions de l'environnement extérieur, comme les rayons UV ou les agents polluants. Elle joue également un rôle important dans l'homéostasie, par exemple pour réguler la température corporelle. Cependant, des stimulations chimiques et physiques excessives - exposition au soleil, à la lumière, aux UV, le stress et la pollution - détériorent les fonctions normales de la peau et induisent son vieillissement. Ce vieillissement extrinsèque (vieillissement lié à des facteurs externes) entraîne l'apparition de rides et la formation d'une peau ayant perdu sa fermeté, sa souplesse et son élasticité.
De façon concomitante, le vieillissement intrinsèque, vieillissement « normal » ou chronobiologique, est la conséquence d'une sénescence programmée où interviennent des facteurs endogènes. Ce vieillissement intrinsèque provoque notamment un ralentissement du renouvellement des cellules de la peau, les kératinocytes, ce qui se traduit essentiellement par la réduction du tissu adipeux sous-cutané, l'apparition de fines rides ou ridules, une perte de fibres verticales de la membrane du tissu élastique, et la présence de grands fibroblastes irréguliers dans les cellules de ce tissu élastique. La présente invention s'intéresse en particulier au vieillissement extrinsèque lié aux agressions de l'environnement extérieur (lumière, rayonnements UV, pollution...), et cherche à en prévenir et/ou atténuer ses effets.
Le stress oxydant est notamment responsable de l'accélération du vieillissement cutané humain. Des radicaux libres et des espèces réactives de l'oxygène (EORs) sont formés au cours du métabolisme cellulaire normal mais également en réponse à des stress physiques et chimiques tels que les UVs ou le peroxyde d'hydrogène (H202). Ces effets du stress oxydant sont néfastes pour tous les compartiments et constituants cellulaires (ADN, protéines, lipides...). Ils peuvent également conduire à des rougeurs diffuses sur la peau.
La recherche de nouvelles molécules ou ingrédients actifs utilisables en cosmétique est une nécessité pour pouvoir développer des produits efficaces pour donner un aspect plus jeune à la peau, un teint homogène, sans irrégularité colorielle au niveau de la pigmentation ou de la microcirculation, un teint reflétant sa bonne santé. Les inventeurs ont justement développé un nouvel extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca, la Reine des Vallées, et mis en évidence des performances surprenantes, comme le montrent les tests réalisés sur kératinocytes humains normaux (KHN) et illustrés dans les exemples décrits ci-après. L'extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention a notamment six actions clés : - Action sur le Nrf2 (Nuclear factor E2-related factor 2) en condition basale (sans stress) : l'extrait induit le Nrf2 permettant ainsi d'anticiper les besoins des kératinocytes en termes de défenses et d'énergie ;
- Action sur le Nrf2 en condition de stress (H202 ou UVB) : dans ces conditions particulières, l'extrait induit plus fortement le Nrf2 permettant ainsi d'aider la cellule à faire face en termes de défenses et d'énergie ;
- Action sur la production d'énergie cellulaire : l'extrait augmente de façon significative la production d'ATP par les kératinocytes ;
- Action directe sur les espèces radicalaires : l'extrait piège de façon significative les radicaux libres produits par des kératinocytes stressés par H202 ; - Action sur le renforcement de la barrière cutanée : l'extrait augmente de façon significative la quantité de protéines spécifiques impliquées dans la barrière cutanée ; leur présence est un gage de bonne fonction barrière ; et
- Action sur les médiateurs de l'inflammation : l'extrait limite la production de médiateurs de l'inflammation induits par les UVs et contribue ainsi à limiter les rougeurs diffuses.
Etat de la technique
On connaît de l'art antérieur l'effet antioxydant d'extraits hydroalcooliques de fruits de fraisier de l'espèce Fragaria vesca, lié à leur teneur en composés phénoliques, qui diffère selon le génotype des plantes et les conditions de culture (Scaizo et al., Nutrition 21 (2005) 207-213 ; Cheel et al. 2007, Food Chemistry 102 (2007) 36-44). Ces publications scientifiques concluent à l'intérêt de ces extraits de fruits de Fragaria vesca pour la préparation de produits alimentaires antioxydants.
On connaît également de la demande JP H05 168684 un extrait hydroalcoolique de feuilles et de fruits de Fragaria vesca comme agent déodorant buccal dans des produits alimentaires tels que des chewing gum et dentifrices. On connaît encore de la demande RU2 249 977 une boisson à base de thé (produit alimentaire) comprenant des feuilles de fraise des bois et des fruits de fraise des bois comme agent aromatisant. Les extraits décrits dans ces documents sont adaptés à une application par voie orale dans des produits alimentaires mais nullement pour une application topique sur les matières kératiniques, en particulier sur la peau.
Donc à la connaissance de la Demanderesse, il n'existe pas dans l'art antérieur de composition cosmétique pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau, comprenant un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espère Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, ni de méthode de soin cosmétique la mettant en œuvre pour prévenir et/ou atténuer les effets du stress sur la peau, et/ou stimuler le métabolisme cellulaire de la peau. Il n'existe pas non plus dans l'art antérieur d'extrait particulier de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espère Fragaria vesca tel que défini selon l'invention ni leur utilisation dans la préparation d'une composition cosmétique à usage topique, comme agent pour prévenir et/ou atténuer les effets du stress sur la peau, et/ou stimuler le métabolisme cellulaire de la peau.
C'est également la première fois que l'on démontre autant de performances complémentaires pour un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca, et en particulier un effet sur le facteur de transcription Nrf2, participant ainsi au maintien de l'énergie cellulaire, à la protection contre les stress et au maintien d'une barrière épidermique fonctionnelle.
En effet, Nrf2 agit sur le métabolisme et l'énergie de la cellule : impliqué dans la modulation du métabolisme intermédiaire, Nrf2 facilite le flux du glucose et augmente la régénération de NADPH (co-facteur indispensable aux activités enzymatiques nécessitant de l'énergie). Cette reprogrammation métabolique permettrait en particulier de mieux lutter contre le stress (Hayes et al., 2014, Trends in Biochemical Sciences 2014;39(4):199-218).
Il est également directement impliqué dans la défense anti-stress. La fixation de Nrf2 sur une zone spécifique de l'ADN (région promotrice) induit la synthèse de nombreux gènes impliqués dans la réponse anti-oxydante, la détoxification des cellules. Nrf2 contribue ainsi également aux processus de réparation et la dégradation des macromolécules endommagées par les stress. Nrf2 est exprimé dans toutes les couches de l'épiderme et un lien a été observé entre sa concentration et la différenciation épidermique, cette dernière conduisant à la formation de la barrière cutanée (Lee et al, 2014 Archives of Dermatological Research 2014;306:677-82).
Le rôle de Nrf2 est donc majeur dans l'homéostasie cellulaire et la gestion du stress. En l'activant, on participe au bon fonctionnement global de la peau pour un résultat visible à l'extérieur.
Résumé de l'invention
Un premier objet de l'invention vise un extrait particulier de feuilles et fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, et tel que défini ci-après dans la description.
On parlera indifféremment dans la suite de la description d'extrait de fraisier ou d'extrait de fraisier des bois ou d'extrait de feuilles et de fruits de fraisier de l'espèce Fragaria vesca ou d'extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca.
L'extrait selon l'invention pourra être sous forme de poudre (lyophilisée) ou sous forme liquide concentrée ou diluée dans un mélange de solvants polaires (solution d'extrait de fraisier). Un autre objet de l'invention est une composition cosmétique pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau, comprenant à titre d'agent actif un extrait de fraisier selon l'invention et au moins un excipient cosmétiquement acceptable. L'invention porte encore sur l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, en particulier pour application topique, d'un extrait de fraisier de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, en tant qu'agent actif protecteur du stress oxydatif et/ou stimulant le métabolisme cellulaire de la peau.
On parlera indifféremment dans la description de stress oxydant ou de stress oxydatif.
Un autre objet de l'invention est une méthode de soin cosmétique des matières kératiniques, en particulier de la peau, comprenant l'application sur lesdites matières kératiniques, en particulier la peau du visage et/ou du corps, d'une quantité efficace d'au moins une composition cosmétique comprenant l'extrait de fraisier de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, pour protéger la peau des effets néfastes du stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution, et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau, visant notamment à préparer la peau au soleil et/ou prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules, et/ou améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint, et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau, et/ou améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau.
Un autre objet de l'invention est un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, en particulier un extrait tel que défini ci-après selon l'invention ou composition selon l'invention, pour prévenir et/ou limiter les effets néfastes des UV.
Description détaillée de l'invention
Extrait
Ainsi, selon un premier objet, l'invention concerne un extrait particulier de feuilles et fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable.
Préalablement à l'étape d'extraction elle-même, le matériel végétal constitué des feuilles et fruits de fraisier peut avoir été séché et/ou broyé.
L'extrait peut être préparé par différents procédés d'extraction connus de l'homme du métier. Selon un mode particulier, l'extrait de fraisier de l'espèce Fragaria vesca est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes :
- le broyage des feuilles et des fruits de la plante,
- la dispersion de la matière végétale broyée dans l'eau ou un mélange
hydroalcoolique,
- éventuellement l'hydrolyse enzymatique de la dispersion obtenue,
- la séparation des phases soluble et insoluble par filtration,
- l'ajout d'au moins un solvant polaire, de préférence un glycol et
- au moins une filtration.
Avantageusement, l'extraction est de préférence réalisée par mise en contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires. Selon la présente invention, l'expression « solvant polaire » signifie que le solvant a une valeur d'indice de Polarité qui est égale ou supérieure à une valeur de 4. L'indice de polarité est une grandeur calculée sur la base de grandeurs thermodynamiques (de solubilité et de changement d'état) qui met en évidence le caractère plus ou moins polaire d'une molécule. On se reportera, pour les indices de polarité des solvants, à l'article de L.R. SNYDER : Classification of the solvent properties of common liquids ; Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230.
Les solvants polaires préférés sont ceux constitués d'un composé comprenant au moins une liaison covalente polaire de type O-H.
A titre de solvant polaire particulièrement préféré, on choisit un solvant ou un mélange de solvants choisi(s) parmi l'eau, les alcools en C1 -C4, tel que l'éthanol, les glycols, tels que l'éthylène glycol, le glycérol, le butylèneglycol et le propylèneglycol, et leurs mélanges.
Selon une mise en œuvre préférée, on extrait le matériel végétal à l'aide d'un mélange hydroalcoolique, avantageusement un mélange d'eau et d'éthanol.
En particulier, on extrait le matériel végétal à l'aide d'un solvant constitué d'eau et d'éthanol, l'éthanol représentant de 50% v/v à 99% v/v du mélange eau/éthanol.
De préférence on extrait le matériel végétal à l'aide d'un mélange comprenant 30% v/v d'eau et 70%v/v d'éthanol. Selon un mode préféré de l'invention, l'extrait de fraisier de l'espèce Fragaria vesca est obtenu par extraction hydroalcoolique des feuilles et des fruits de ladite plante.
L'extraction peut être menée à chaud par reflux ou bien par macération à température ambiante. On utilise avantageusement les ultrasons en cours d'extraction afin d'améliorer le rendement massique de ladite extraction.
Le procédé d'extraction comprend avantageusement une étape de filtration visant à séparer la phase liquide du matériel végétal épuisé.
On peut reproduire le cycle d'extraction puis filtration, plusieurs fois afin d'épuiser le matériel végétal des substances ayant une affinité pour le solvant d'extraction
Le procédé d'extraction peut également comprendre au moins une étape de décoloration et/ou de purification, par exemple sous la forme d'un traitement de l'extrait par une solution d'au moins un solvant polaire en présence de particules de charbon actif. On élimine ainsi notamment la chlorophylle extraite par le solvant.
Le procédé d'extraction peut en outre être complété par une étape d'élimination partielle ou totale des solvants d'extraction.
On peut avantageusement concentrer l'extrait en éliminant une partie du solvant ou du mélange du solvant d'extraction. On peut ainsi obtenir un concentré aqueux dépourvu d'une quantité significative de solvants organiques ou bien encore, en éliminant tout le solvant d'extraction, obtenir un résidu sec.
De manière avantageuse, on concentre l'extrait de feuilles et fruits de fraisier en éliminant l'éthanol, de façon à obtenir un extrait aqueux pouvant comprendre jusqu'à 35% en poids, en particulier de 25 à 30% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'extrait.
En particulier, l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention comprend de 10 à 35% en poids de matière sèche, en particulier de 10 à 20% en poids, et de préférence de 10 à 15% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'extrait. En particulier, selon un mode particulier de l'invention, le ratio pondéral feuilles/fruits dans l'extrait sec de fraisier va de 15/1 à 5/1 , de préférence de 12/1 à 8/1 , et est de préférence de 10/1 , de préférence encore de 9/1 (90% de feuilles et 10% de fruits tel qu'illustré dans les exemples). De façon alternative, le produit de l'étape d'extraction peut être, lyophilisé ou atomisé pour se présenter sous la forme d'une poudre.
L'extrait végétal polaire tel que décrit précédemment peut être utilisé dans une composition cosmétique sous la forme d'une poudre ou bien être remis en solution ou en suspension dans au moins un solvant cosmétiquement acceptable, qui peut être identique ou différent de celui ayant servi à l'extraction.
Selon une variante préférée, l'extrait concentré de feuilles et fruits de fraisier est remis en solution dans un mélange d'eau et de butylène glycol. On parlera de solution d'extrait de fraisier selon l'invention.
Selon un mode préféré, la solution d'extrait de fraisier selon l'invention comprend une teneur de 7 à 15%, en particulier de 10 à 15% en poids de matière sèche dans un mélange d'eau et de butylène glycol.
Un extrait de fraisier particulier de l'invention sous forme de solution d'extrait de fraisier, comprend 12,5% en poids de matière sèche (et notamment 1 ,25% fruits et 1 1 ,25% de feuilles), 37,5% d'eau et 50% de butylène glycol.
L'extrait de fraisier selon l'invention est notamment caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) Des polyphénols en une teneur allant de 15 à 20% en poids par rapport au poids de la matière sèche ;
(ii) et au moins un composé choisi parmi des sucres, des minéraux et oligoéléments, des acides aminés, et leurs mélanges.
Selon un mode préféré, l'extrait de fraisier selon l'invention est caractérisé par une composition intrinsèque comprenant :
· un taux important de polyphénols (15 à 20 % de la matière sèche), parmi lesquels des flavonoïdes glycosylés tels que la quercétine et le kaempferol ; la quantification de ces flavonoïdes serait encore en cours d'analyse ;
• des sucres, parmi lesquels le glucose, le fructose, le saccharose ;
• des minéraux et d'oligo-éléments, parmi lesquels du calcium, du potassium, du magnésium ; · des vitamines, parmi lesquelles les vitamines B1 , B2, B3, B5, B6, et C ;
• des acides aminés, parmi lesquels l'acide aspartique, l'acide glutamique, la proline, l'alanine;
• des anthocyanes. On pourra utiliser alternativement les formes poudre, liquide concentré ou liquide dilué (solution d'extrait) de l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois dans la préparation de compositions cosmétiques. Selon un mode particulier et préféré de l'invention, on utilisera l'extrait de fraisier des bois selon l'invention sous forme de solution d'extrait de fraisier des bois dans la préparation de compositions cosmétiques.
Galénique
L'invention porte également sur une composition cosmétique, de préférence pour application topique, comprenant à titre d'agent actif un extrait de fraisier des bois selon l'invention et au moins un excipient cosmétiquement acceptable.
Par 'excipient cosmétiquement acceptable', on entend une substance dépourvue d'effet cosmétique en tant que telle, mais utile à l'incorporation de l'agent actif dans la composition cosmétique ou à la mise en forme de ladite composition.
L'excipient est avantageusement choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des filtres UV des conservateurs, et l'un quelconque de leurs mélanges, et de façon optionnelle en outre au moins un autre agent actif cosmétique.
Ladite composition comprend une quantité efficace d'extrait de fraisier des bois selon la présente invention pour obtenir l'effet recherché. L'extrait de fraisier des bois selon l'invention est avantageusement présent à titre d'agent actif dans la composition selon une teneur comprise entre 0,1 et 5% en poids de matière première par rapport au poids total de la composition, préférentiellement de 0,5 à 2 % en poids de matière première par rapport au poids total de la composition totale, pour une matière première préférée comprenant 12,5% d'extrait sec et 87,5% de solvant polaire comme décrit précédemment (solution d'extrait de fraisier).
L'extrait de fraisier des bois selon l'invention est avantageusement présent à titre d'agent actif dans la composition selon une teneur comprise entre 0,01 et 1 % en poids d'extrait sec par rapport au poids total de la composition, préférentiellement de 0,05 à 0,5 %, et de préférence encore de 0,0625% à 0,25% en poids d'extrait sec par rapport au poids total de la composition totale.
La composition selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique sur les matières kératiniques, en particulier sur la peau.
Par 'matières kératiniques', on entend les lèvres, la peau et ses phanères (ongles, cils, cheveux), en particulier la peau.
La composition selon l'invention peut notamment se présenter sous la forme d'une émulsion eau-dans-huile, d'une émulsion huile-dans-eau, d'un gel aqueux, d'un sérum, d'une lotion, d'une crème d'un masque, d'un stick, ou d'un patch.
En particulier, la composition selon l'invention pourra être un sérum, une crème, une lotion ou un masque.
La composition selon l'invention pourra être un produit de soin et/ou de maquillage des matières kératiniques, en particulier de la peau.
Les compositions comprenant l'extrait de fraisier selon l'invention, comprennent avantageusement au moins un autre agent actif cosmétiquement acceptable.
Ainsi, les compositions qui comprennent l'extrait de fraisier des bois selon l'invention peuvent en outre comprendre un ou plusieurs autres agents actifs pouvant être choisis parmi les substances ayant une activité éclaircissante de la peau ; les substances ayant une activité hydratante ; les substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; les substances ayant une activité stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; les substances ayant une activité sébo-régulatrice pour le soin des peaux grasses; les substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; les substances ayant une activité anti- radicalaire ; les vitamines ; les substances destinées à atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, en particulier la formation de rides, par une activité visant à favoriser le maintien de la structure de la peau et/ou à limiter la dégradation de la matrice extracellulaire des couches superficielles du derme et de l'épiderme et/ou à obtenir un effet protecteur, correcteur ou restructurant de la peau, et leurs mélanges.
Selon un mode particulier de l'invention, la composition cosmétique de l'invention comprend au moins un extrait de fraisier des bois selon l'invention et au moins un actif cosmétique choisi parmi les substances ayant une activité éclaircissante de la peau, des vitamines, et leur mélange.
Ainsi et pour compléter le bénéfice de l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois, on choisira préférentiellement l'association avec :
- des extraits de mûrier blanc (Morus alba), de concombre (Cucumis sativus) et d'hibiscus (Hibiscus sabdarifa) combinant les activités biologiques requises pour obtenir un teint plus clair et plus uniforme en agissant de concert pour diminuer la synthèse de mélanine, favoriser son transfert et accélérer son élimination ;
- un sel de phosphate de vitamine C et E, dérivé stable de ces 2 vitamines essentielles pour la peau,
et leurs mélanges..
Utilisations
L'invention porte encore sur l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, en tant qu'agent actif protecteur du stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution, et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau, visant notamment à préparer la peau au soleil et/ou et/ou prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules, et/ou améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint ; et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau; et/ou améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau.
Selon un mode particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, en tant qu'agent actif protecteur du stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution. Selon un autre mode particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, en tant qu'agent pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau. En particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, pour préparer la peau au soleil.
En particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, pour prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules.
En particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, pour améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint; et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau.
En particulier, l'invention vise l'utilisation, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une telle composition, d'un extrait de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca selon l'invention, pour améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau. Un autre objet de l'invention est une méthode de soin cosmétique des matières kératiniques, en particulier la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur lesdites matières kératiniques, en particulier la peau du visage et/ou du corps, d'une quantité efficace d'au moins une composition cosmétique selon l'invention.
La méthode de soin cosmétique selon l'invention vise notamment à protéger la peau contre le stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution, et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau, visant notamment à préparer la peau au soleil et/ou prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules, et/ou améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint ; et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau ; et/ou améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau. Un autre objet de l'invention est un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, en particulier un extrait tel que défini ci-après selon l'invention ou composition selon l'invention, pour prévenir et/ou limiter les effets néfastes des UV. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière des exemples, donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, la température est en degrés Celsius, sauf indication contraire.
FIGURES
Figure 1 : Représentation graphique de l'effet de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca sur la translocation nucléaire de NRF2, en conditions de stress oxydant.
Figure 2 : Représentation graphique de l'effet de la production de H202 sur la production d'EORs sur les milieux testés sans actifs (témoins)
Figures 3 : Représentation graphique de l'effet antioxydant (diminution significative de la production d'EORs) de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca, en condition de stress oxydant.
Figure 4 : Représentation graphique de l'effet anti-MMP de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca, en condition de stress UV.
Figure 5 : Représentation graphique de l'effet apaisant (diminution de la production d'IL-8) de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca, en condition de stress UV.
Figure 6 : Représentation graphique de l'effet apaisant (diminution de la production d'e TGF-a) de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca, en condition de stress UV.
Figure 7 : Représentation graphique de l'effet l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca, sur la synthèse d'ATP et l'activité mitochondriale dans des Kératinocytes Humains Normaux. EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'extraits de feuilles et de fruits de Fragaria vesca. On a préparé un extrait à partir de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce
Fragaria vesca.
Après récolte, cette matière végétale est séchée puis broyée.
On utilise pour la préparation de l'extrait, un mélange de feuilles et fruits comprenant 90% en poids de feuilles et 10% en poids de fruits (correspondant à un ratio pondéral feuilles/fruits de 9/1 ), les pourcentages étant exprimés par rapport au poids de matériel végétal à extraire.
On réalise une extraction solide-liquide à l'aide d'un solvant polaire. On extrait le matériel végétal à reflux pendant une heure sous agitation dans un mélange éthanol/eau (70/30 v/v).
L'extrait est filtré pour éliminer le résidu végétal, puis on reproduit à nouveau une deuxième fois le cycle, de façon à optimiser le rendement. Le résidu végétal épuisé est éliminé après l'étape de filtration.
Le rendement massique après extraction est d'environ 25% en poids par rapport au poids de matériel végétal sec mis en œuvre.
L'extrait obtenu après filtration est décoloré à l'aide de charbon actif, pour éliminer la chlorophylle, d'autres pigments ou encore des métaux. Le filtrat récupéré est limpide.
On concentre l'extrait en éliminant l'éthanol pour récupérer un concentré aqueux. Le concentré aqueux est filtré sur plaque 1 micromètre pour éliminer les résidus solides éventuels. Pour l'évaluation in vitro des activités de l'extrait de fraisier obtenu dans le présent exemple, on met en solution ledit extrait dans un mélange de butylène glycol et d'eau jusqu'à obtenir un taux de matière sèche compris entre 10 et 15% en poids.
La solution d'extrait de fraisier évaluée dans les tests décrits ci-après comprend 12,5% de matière sèche, 37,5% d'eau et 50% de butylène glycol.
L'extrait selon l'invention contient des sucres (glucose, saccharose et fructose). Il contient également des polyphénols, des minéraux, et en quantité plus faible des vitamines, des acides aminés. On caractérise les polyphénols par une méthode chromatographique (colonne greffée C18, Agilent Pursuit XRS C18 250*4.6mm, diamètre 5μηι) avec une détection UV à 280nm et 365nm). Les composés détectés sont principalement des ellagitanins et des acides phénoliques, mais aussi des flavonols et des flavanolols.
Les polyphénols constituent environ 15% en poids de l'extrait sec.
Exemple 2 : Effet protecteur de l'extrait de feuilles et fruits de Fragaria vesca contre les stress extérieurs (UV, pollution, stress oxydant...) 2.1. Effet de l'extrait sur certaines voies métaboliques
2.1.1 Effet sur l'expression NRF2 (défense contre les effets du stress)
L'étude est réalisée sur une culture monocellulaire des cellules de kératinocytes humains normaux (KHN) issues de plastie abdominale d'un donneur féminin de 31 ans. Les cellules ont d'abord été ensemencées dans du milieu Epilife complet (supplémenté en HKGS) à passage 5 (P5), à une densité de 10 000 cellules par puits, dans des plaques 96 puits et incubées à 37°C 5% de C02. A 80% de confluence,
Les kératinocytes sont prétraités par l'extrait de feuilles et de fruits préparé à l'exemple 1 (solution d'extrait de fraisier), utilisés à des concentrations de 0.025% ou 0.05% pendant 16 heures, puis traités avec une solution oxydante (extrait de fraisier à 0.025% ou 0.05% + H202 100μΜ, 5minut.es 4°C) ou soumises à une irradiation UVB (50mJ/cm2), et enfin traitées à nouveau par l'extrait de fraisier (0.025% ou 0.05%) pendant 1 h et 2h après le stress oxydant H202, et 2h après l'irradiation UVB. Un marquage immunologique au NRF2 est ensuite réalisé et analysé par criblage haut débit (mesure de l'intensité de l'expression de NRF2/ noyau).
Les résultats sont présentés à la Figure 1 . Le traitement des kératinocytes induit une augmentation significative de l'expression de NRF2 dans le noyau de façon dose dépendante (+4.9% et +10.5%) dans les cellules non soumises à un stress, comparativement aux cellules non traitées. Cette augmentation et significativement accentuée en condition de stress (oxydant H202 et irradiation UVB).
L'extrait de fraisier selon l'invention appliqué sur la peau permet donc de lutter contre les effets du stress et renforcer les défenses intrinsèques de la peau. 2.1.2 Effet anti-oxydant (anti- radicaux libres)
L'étude des propriétés anti-oxydantes (anti- radicaux libres) de l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier préparé à l'exemple 1 , a été réalisée à l'aide d'un effectué à l'aide d'une sonde H2DCF- DA fluorescente, permettant la quantification des espèces réactives de l'oxygène EORs formées en présence d'un stress oxydant à ΙΉ202.
La sonde Dichlorodihydrofluorescéine Diacétate (H2DCF-DA) est une sonde perméable et stable utilisée pour la détection des EORs. Lorsqu'elle est utilisée dans une application cellulaire, les groupements acétate sont clivés par les estérases membranaires. On obtient alors le produit dichlorodihydrofluorescéine (H2DCF) non fluorescent, mais dont le produit de réaction avec les EORs générera une entité fluorescente. La répartition de ce dérivé fluorescéine est cytoplasmique. Lorsque la sonde non fluorescente rencontre des EORs (non spécifique d'un type d'EORs) ou du NO, celle-ci est oxydée en un produit fluorescent, la dichlorofluorescéine (DCF). La fluorescence est détectée aux longueurs d'ondes suivantes : Aex=504nm et Aem=529nm.
Ce test permet donc de mettre en évidence le pouvoir antioxydant d'un actif, en montrant sa capacité à diminuer la production d'EORs au sein de la cellule, en situation de stress par rapport à un témoin non traité soumis à ce même stress. Les kératinocytes humains normaux sont prétraités pendant 24 heures par l'extrait de feuille et fruits de fraisier à la dose de 0,05%, ainsi que par 2 réactifs utilisés comme témoins positifs (Idebenone dans DMSO, Sigma, 10μΜ ; et (+)-Y-Tocopherol dans éthanol, Sigma, 25μΜ). En parallèle, les cellules sont également traitées avec le témoin excipient respectif de chaque actif/réactif testé.
Tous les traitements sont effectués en double ; en effet, une partie ne subira pas de stress H202 alors que l'autre subira ce stress.
Après 21 heures de traitement avec les différents actifs/réactifs et leur excipient associé, dans du milieu Epilife complémenté en HKGS, le milieu est éliminé, puis elles sont retraitées de la même façon dans du milieu sans HKGS pendant 3 heures (afin d'éviter la présence d'estérases qui déacétyleraient spontanément la sonde).
Après deux rinçages des microplaques avec du milieu Epilife sans HKGS, 200μί de la sonde H2DCF-DA (Sigma) préparée à 50μΜ en milieu Epilife sans HKGS à partir d'une solution mère à 50mM dans du DMSO, sont déposés dans chacun des puits. Les microplaques sont placées à 37°C sous agitation pendant 45 minutes.
A la suite de cette incubation, les cellules sont rincées 2 fois avec du milieu Epilife sans HKGS avant de recevoir le système générateur d'EORs :
- Les cellules sont traitées avec les actifs/réactifs en présence d'H202 100μΜ (Sigma)
L'autre moitié est traitée avec les actifs sans H202 100μΜ.
Les cellules sont placées à 37°C 5%C02 pendant 20 minutes. A la suite de cette incubation, une lecture de la fluorescence est effectuée à l'aide du FLUOstar BMGLabtech (Gain = 1500, 485- 535nm).
Après lecture des microplaques, elles sont rincées 2 fois au PBS pour un dosage protéique ultérieur par la méthode du BCA.
Les résultats de fluorescence obtenus (RFU) sont alors normalisés par la quantité de protéines dans chaque puits (en μg). Une analyse statistique est effectuée, consistant en un calcul de la moyenne, de l'écart type et de l'intervalle de confiance (a = 0,05) de la fluorescence mesurée (RFU) normalisée par la quantité de protéines par puits ^g).
Les résultats sont présentés en moyenne sur n=6 avec les intervalles de confiance. Le test t de Student a été utilisé pour comparer l'effet entre les cellules traitées et non traitées. Les résultats sont considérés comme significatifs pour p<0,05.
Les résultats sont présentés aux Figure 2 et Figure 3 :
L'induction de ROS sans traitements d'actifs est vérifiée. Les différents excipients des actifs/réactifs étudiés, sont testés. Le traitement des cellules par 100μΜ d'H202 induit significativement la production d'EORs par rapport à des KHN non stressés, quel que soit l'excipient utilisé et ce, avec une moyenne de 98%.
Les témoins sont ceux utilisés dans l'analyse des résultats des actifs/réactifs testés dans cette étude. En effet, chaque actif ou réactif testé a été comparé à son témoin excipient respectif. Cette étude est validée par l'induction significative de la production d'EORs en présence d'H202 dans des KHN par rapport au témoin sans H202.
De plus, les 2 témoins positifs antioxydants utilisés, permettent tous une diminution significative de la production d'EORs en condition de stress oxydant, par rapport au témoin H202. Ces résultats montrent que l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier à la dose de 0,05%, est capable de présenter une très bonne activité anti-oxydante en absence de stress oxydant (-47,5%) et encore plus en présence de stress oxydant (-74, 1 %).
2.1.3 Effet anti-MMP (fermeté et élasticité de la peau)
L'effet d'un extrait de feuilles et de fruits de fraisier a été évalué sur l'expression de différentes protéines responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire, les MMPs (Matrix Metalloproteinases), afin de mettre en évidence une activité protectrice anti-âge.
La MMP-2 est plutôt exprimée par les fibroblastes, notamment pendant les phases de développement et de régénération cellulaire ou tissulaire. Elle dégrade préférentiellement le collagène de type IV, constituant majeur de la membrane basale et du collagène dénaturé. La MMP-1 est un pivot central répondant fortement à un stress UV via le facteur de transcription AP-1 , et est donc impliquée dans de nombreuses réactions en cascade, que ce soit au niveau du derme ou de l'épiderme par effet paracrine entre les cellules qui les constituent respectivement.
Ces protéines impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire jouent un rôle important sur la structure de la peau et sa fermeté, notamment sous différents stimuli ou agressions extérieures comme les rayonnements UVs, ou encore avec l'âge.
Pour évaluer l'efficacité de cet extrait, nous avons utilisé la technologie Luminex pour doser simultanément l'expression protéique de 3 MMPs, à savoir la MMP-1 , MMP-2 et MMP-10, sécrétées par des kératinocytes humains normaux, après stimulation par les UVB (24 ou 48 heures de traitement).
Les Kératinocytes humains normaux (KHN), issus d'une plastie abdominale, sont utilisées à 60 % de confluence dans le milieu Epilife complet, à passage 5 (P5), avec une densité d'ensemencement de 150 000 cellules par puits, dans des plaques 12 puits.
Après 24 heures de culture des KHN, le milieu de culture est éliminé et remplacé par du PBS pour réaliser l'irradiation aux UVB 25 mJ/cm2. Du milieu neuf contenant les différents traitements (extrait, témoin solvant, témoin positif) est alors ajouté par la suite.
Après 24 ou 48 heures de traitement, les surnageants cellulaires sont récupérés et congelés à -20°C, afin de pouvoir réaliser les dosages protéiques par la suite par la technologie Luminex utilisant la technologie ELISA tout en utilisant le fonctionnement de la cytométrie en flux. Les 2 techniques combinées ensemble permettent de doser simultanément plusieurs cibles protéiques d'intérêt, dans un minimum de volume d'échantillons.
En effet, des anticorps spécifiques aux analytes à doser sont préalablement adsorbés sur des microsphères fluorescentes. Pendant l'incubation avec les surnageants de culture, les analytes présents dans le milieu vont se fixer sur leurs anticorps. Après rinçage, un anticorps de détection biotinylé est ajouté, suivie de l'incubation avec la streptavidine-phycoérythrine qui va interagir avec la biotine.
Après un second rinçage, l'ajout du liquide de gaine et aspiration d'un minimum de volume d'échantillon via l'aiguille du système d'analyse, deux lasers permettent de détecter d'une part la fluorescence spécifique de chaque bille (correspondant à un analyte particulier) et d'autre part la coloration de chaque anticorps marqué (coloration proportionnelle à la quantité fixée).
Le dosage a été réalisé au moyen d'un kit de dosage Millipore selon les préconisations du fournisseur.
Une gamme est préparée pour chaque analyte à doser, afin de pouvoir réaliser des courbes de calibration. Le système peut alors calculer directement la concentration en pg/mL de chaque analyte présent dans les surnageants de culture. La concentration est alors exprimée en picogramme de MMP par millilitre de milieu. Le test de Student est appliqué (les résultats sont considérés comme significatifs pour p<0,05) Les résultats sont présentés à la Figure 4 :
Nous avons pu démontrer une cinétique d'expression de la MMP-1 , son taux augmentant de 56% entre 24 et 48 heures après stimulation aux UVB.
L'extrait de fraisier préparé à l'exemple 1 présente une très forte activité inhibitrice de l'expression protéique de la MMP-1 , quelle que soit la condition de traitement réalisée et toujours de manière significative (-80% et -68% à 24 heures, -91 % et -75% à 48 heures). Il est efficace dès 24 heures, et dès la concentration de 0.025%.
De la même manière que pour la MMP-1 , l'extrait de fraisier préparé à l'exemple 1 présente une activité inhibitrice de l'expression protéique de la MMP-2, quelles que soient les conditions de traitement (-36% et -32% à 24 heures, -71 % et -64% à 48 heures).
Nous avons pu démontrer une cinétique d'expression de cette MMP-1 , son taux augmentant de 85% entre 24 et 48 heures après stimulation aux UVB. L'extrait de fraisier préparé à l'exemple 1 présente une activité inhibitrice de l'expression protéique de la MMP-10 à 0.05% et après 48 heures de traitement (-72% de la production de MMP-10). Ces résultats montrent que l'extrait de fraisier selon l'invention présente une activité inhibitrice de la production de 3 métalloprotéinases UV-induites, à savoir MMP-1 , MMP-2 et MMP-10, à la dose de 0.05%.
Cet ingrédient est donc intéressant pour son activité protectrice envers les effets néfastes environnementaux type UVs, en jouant tout particulièrement un rôle sur 3 protéines majeures impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire.
2.1.4 Effet inhibiteur cytokines (apaisant)
L'effet de l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier préparé à l'exemple 1 sur l'expression de marqueurs de l'inflammation, les cytokines, a été mesuré, afin de mettre en évidence une activité apaisante via des propriétés anti-inflammatoires.
Les cytokines appartiennent à un groupe de protéines solubles agissant comme des régulateurs, que ce soit en conditions normales, en conditions pathologiques ou de stress. Ces protéines sont des médiateurs de l'inflammation, agissant sur les interactions cellulaires et induisant des phénomènes de réaction en cascade via différentes voies de signalisation, notamment suite à différents stress ou agressions extérieures, comme les rayonnements UVs. Elles jouent un rôle prépondérant dans les désordres inflammatoires chroniques et dans le vieillissement cutané. L'efficacité de l'extrait de fraisier (0.05 et 0.025%) a été évaluée en utilisant la technologie Luminex pour doser simultanément l'expression protéique de 3 cytokines, sécrétées par des kératinocytes humains normaux, après stimulation par les UVB.
Les KHN, issus d'une plastie abdominale, sont utilisées à 60 % de confluence dans le milieu Epilife complet à passage 5 (P5), avec une densité d'ensemencement de 150 000 cellules par puits, dans des plaques 12 puits.
Dans le cas de l'étude en conditions basales, le milieu de culture des kératinocytes humains normaux est éliminé et remplacé par du milieu neuf. Dans le cas de l'étude en conditions stimulées, le milieu de culture des KHN est éliminé et remplacé par du PBS pour réaliser l'irradiation aux UVB 25 mJ/cm2. Du milieu neuf contenant les différents traitements (extrait, témoin solvant, témoin positif) est alors ajouté par la suite. Après 24 ou 48 heures de traitement, les surnageants cellulaires sont récupérés et congelés à - 20°C, afin de pouvoir réaliser les dosages protéiques avec la technologie Luminex précitée.
Le dosage a été réalisé au moyen d'un kit de dosage Millipore selon le protocole de haute sensibilité afin d'optimiser la détection des cytokines. Les cytokines analysées sont l'interleukine 8 (IL-8), et le Transforming Growth Factor-alpha (TGF-a). Afin de suivre l'évolution de la production des cytokines et visualiser l'impact des UVs, nous avons suivi leur taux selon une cinétique après stimulation aux UVB 25mJ/cm2 (24 et 48 heures) et comparé ce taux avec celui en conditions basales (pas de traitement).
L'extrait a toujours été testé après stimulation aux UVB, afin d'en mesurer l'efficacité curative sur 24 et 48 heures.
Les résultats sont présentés à la Figure 5 (IL-8) et la Figure 6 (TGF-a).
Les UVB ont augmenté très significativement l'expression de l'IL-8 à 24 heures (x5), cette induction diminuant à 48 heures mais étant toujours significative par rapport à la production basale des kératinocytes (x2.8).
Dans nos conditions expérimentales, nous avons pu observer une très forte inhibition dose dépendante de la production d'IL-8 avec l'extrait de fraisier, et notamment à la concentration de 0.05% (significatif à 24 et 48 heures).
Les UVB ont augmenté significativement l'expression de TGF-α, suivant une cinétique croissante au cours du temps : +42% à 24 heures et +70% à 48 heures. Cette cible est donc intéressante à moduler car l'effet néfaste des UVBs semble prolongé. Nous avons démontré que l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier selon l'invention est capable de diminuer significativement la production d'IL-8 et de TGF-α) par des kératinocytes humains normaux après stimulation aux UVB, à la concentration de 0.05% pendant 24 ou 48 heures de traitement. L'extrait de fraisier selon l'invention est donc intéressant pour son activité protectrice envers les effets néfastes environnementaux type UVs, ou encore son efficacité apaisante.
2.2. Effet de l'extrait sur la barrière physique cutanée (enveloppe cornée) : effet sur l'expression de gènes codant pour protéines de la barrière cutanée
Une étude sur l'effet transcriptionnel de l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier préparé à l'exemple 1 a été évaluée à l'aide de la technologie TLDA (TaqMan Low Density Array).
Les cellules de kératinocytes humains normaux sont traitées par l'extrait de fraisier, à deux concentrations (0.025% et 0.05%) ainsi que le témoin excipient (butylène glycol BG/eau).
Après 24 heures de traitement, les cellules sont récupérées afin d'en extraire les ARN totaux à l'aide du kit Nucleospin RNA trace (Macherey-Nagel). Les solutions d'ARN totaux obtenues sont dosées, et leur qualité vérifiée, à l'aide d'un lecteur de microplaques, le spectrostarNANO (BMG Labtech) couplé au MicrolabSTAR. Cet appareil est relié à l'ordinateur pilotant la plateforme robotique et possède un logiciel spécifique d'analyse des résultats (logiciel MARS). La technique nécessite une micro-plaque de 384 puits (Greiner), un contrôle positif (RNA 250 Thermofisher) permettant de valider les pipetages réalisés par le robot ainsi que les valeurs générées par le lecteur spectrostarNANO.
Le kit de reverse transcription (RT) utilisé est le High Capacity Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher) et a été employé selon le protocole fourni.
Les gènes contrôles (appelé « endogeneous » gene dans le logiciel) à utiliser pour la normalisation des résultats sont indiqués avant le lancement de la PCR. Cette dernière est réalisée selon le protocole fourni par Applied Biosystems dans l'appareil ABI Prism 7900HT Séquence détection System.
Aux deux doses testées, respectivement 0.05% et 0.025%, l'extrait de fraisier augmente significativement l'expression de gènes codant pour des protéines de la barrière cutanée / différenciation, comme présenté dans le tableau 1 ci-dessous : Gène Symbole Extrait Extrait
de de
fraisier fraisier
de l'ex.1 de l'ex.1
0.05% 0.025%
Fillagrine FLG +80% +1 14%
Transglutaminase 1 TGM1 +180% +182%
Kallikrein related peptidase 7 KLK7 +154% +167%
Small Prolin-Rich Protein 1 B (Cornifin) SPRR1 B +436% +447%
Céramide synthase CERS3 +72% -
N-acylsphingosine amidohydrolase (Acide ASAH1 +15%
céramidase) 1
Cytokératine 1 KRT1 +545% +430%
Cytokératine 5 KRT5 +46% -
Cytokératine 14 KRT14 +26% +30%
Zinc Finger Protein 750 ou Epigenin ZNF750 +382% +31 1 %
Tableau 1 : Pourcentages de variation d'expression de gènes codant pour des protéines de la barrière cutanée. Ces résultats montrent que l'extrait de fraisier selon l'invention stimule le niveau d'expression d'un grand nombre de gènes de la barrière cutanée.
Exemple 3 : Effet stimulant sur le métabolisme cellulaire de la peau L'effet d'un extrait de feuille et de fruits de fraisier selon l'exemple 1 a été évalué à 0.05%, 0.025% et 0.01 % sur la synthèse d'ATP et l'activité mitochondriale dans des Kératinocytes Humains Normaux. Les KHN ont été traités pendant 24 heures avec l'extrait aux différentes concentrations.
Après ce traitement, les cellules ont été immédiatement lysées et ΓΑΤΡ intracellulaire a été dosée par le kit ApoSENSOR Cell viability qui utilise la bioluminescence.
En parallèle l'activité mitochondriale est mesurée par le test colorimétrique du XTT. Les KHN issus d'une plastie abdominale, sont fournies à confluence dans le milieu Epilife, à passage 5 (P5), à une densité de 10,000 cellules par puits par plaque 96 puits.
Deux types de plaques différentes ont été utilisés :
- Des plaques blanches à fond blanc sont utilisées pour la détection de la luminescence
Des plaques standard pour la mesure de l'activité mitochondriale
La baisse du niveau d'ATP est un indicateur de la mort cellulaire (apoptose). Au contraire, la prolifération cellulaire peut être reconnue par une augmentation du niveau d'ATP.
Le kit ApoSENSOR Cell viability utilise la bioluminescence pour la détection du niveau d'ATP pour un rapide screening simultané de l'apoptose et de la prolifération. Le kit utilise la luciférase qui catalyse la formation de lumière à partir d'ATP et de luciférine, et la lumière est mesurée par un luminomètre :
ATP+luciferin + 02 -> Oxyluciferin+ AMP+PPi+ Co2+ light.
Les RLU mesuré sont proportionnelles à la concentration d'ATP.
Une gamme étalon allant 0.001 μg/mL to 1000μg/mL est réalisée afin de calculer la concentration d'ATP intracellulaire.
Le test de viabilité cellulaire est réalisé en utilisant le test XTT. C'est un test colorimétrique basé sur la réduction du sel de tetrazolium XTT (jaune) en formazan (orange) par les deshydrogenases mitochondriales des cellules vivantes. Le dérivé formazan absorbe à 450nm.
Le test statistique de Student a été utilisé (les résultats ont été considérés comme significatifs pour p<0.05 (*))
Les résultats sont présentés à la Figure 6.
Les résultats obtenus montrent que l'extrait de feuilles et de fruits de fraisier de l'exemple 1 a la capacité d'augmenter la synthèse d'ATP et l'activité mitochondriale.
La dose 0.01 % permet à 24 et 48 heures d'augmenter simultanément la synthèse d'ATP et l'activité mitochondriale.
Au vu des résultats obtenus nous pouvons donc considérer que l'extrait de fraisier selon l'invention possède des propriétés énergisantes. Exemple 4 : Formulations cosmétiques pour application topique
Les pourcentages sont indiqués en poids par rapport au poids de la composition finale.
Lotion hydratante
Solution d'extrait de feuilles et de fruits de Fragaria vesca* 2,0 %
Acétate de tocophérol 0,2 % Autres excipients (dont parfums, conservateurs) qs
Eau qsp 100%
*obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 1 (12,5%en poids de matière sèche) Cette composition est une lotion appliquée sur la peau du visage, quotidiennement pour obtenir l'effet de protection recherché vis-à-vis de stress environnementaux.
Crème pour peaux normales Solution d'extrait de feuilles et de fruits de Fragaria vesca* 0,75 %
Acide hyaluronique 1 ,0 %
Ascorbyl glycoside 0,4 %
Acétate de tocophérol 0,2 %
Glyccyrhizinate de potassium 0,05 % Excipients émulsionnés (dont parfums, conservateurs) qs
Eau purifiée qsp 100%
*obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 1 (12,5%en poids de matière sèche)
Cette composition est une émulsion huile-dans-eau. La crème est appliquée sur la peau du visage, quotidiennement pour obtenir l'effet de prévention ou d'atténuation des signes de vieillissement cutané Fond de teint antiride
Solution d'extrait de feuilles et de fruits de Fragaria vesca* 1 ,0 %
acide hyaluronique: 2,0 %
pigments : 3,0 %
beurre de karité: 0,8 %
filtres UV : 5,0 %
oxyde de titane micronisé : 2,0 %
excipient qsp 100 % *obtenue selon le procédé décrit à l'exemple 1 (12,5%en poids de matière sèche)
Le fond de teint est appliqué sur la peau du visage, quotidiennement pour obtenir l'effet de prévention ou d'atténuation des signes de vieillissement cutané extrinsèque lié aux stress UV et/ou de la pollution.

Claims
REVENDICATIONS
Composition cosmétique pour application topique sur les matières kératiniques, en particulier la peau, comprenant à titre d'agent actif un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, et au moins un excipient cosmétiquement acceptable, choisi notamment parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, des filtres UV, et l'un quelconque de leurs mélanges, et de façon optionnelle en outre au moins un autre agent actif cosmétique.
Composition cosmétique selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,01 à 1 % en poids d'extrait sec de fraisier des bois par rapport au poids total de la composition, préférentiellement de 0,05 à 0,
5 %, et de préférence encore de 0,0625% à 0,25% en poids d'extrait sec de fraisier des bois par rapport au poids total de la composition totale.
Composition cosmétique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une émulsion eau-dans-huile, d'une émulsion huile-dans-eau, d'un gel aqueux, d'un sérum, d'une lotion, d'une crème, d'un masque, d'un stick, d'un patch.
Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le ratio pondéral feuilles/fruits dans l'extrait sec de fraisier va de 15/1 à 5/1 , de préférence de 12/1 à 8/1 , et est de préférence de 10/1 , de préférence encore de 9/1.
Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait de feuilles et de fruits comprend de 10 à 35% en poids de matière sèche, en particulier de 10 à 20% en poids, et de préférence de 10 à 15% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'extrait.
6. Composition cosmétique selon la revendication précédente, caractérisée en ce que l'extrait de feuilles et de fruits comprend une teneur de 10 à 15% en poids de matière sèche dans un mélange d'eau et de butylène glycol.
7. Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait de feuilles et de fruits comprend :
(i) Des polyphénols en une teneur allant de 15 à 20% en poids par rapport au poids de la matière sèche ;
(ii) et au moins un composé choisi parmi des sucres, des minéraux et oligoéléments, des acides aminés, et leurs mélanges.
8. Méthode de soin cosmétique des matières kératiniques, en particulier de la peau, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur lesdites matières kératiniques, en particulier la peau du visage et/ou du corps, d'une quantité efficace d'au moins une composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour protéger la peau des effets néfastes du stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution, et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau, visant notamment à préparer la peau au soleil et/ou prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules, et/ou améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint, et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau, et/ou améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau.
9. Extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, caractérisé en ce que le ratio pondéral feuilles/fruits dans l'extrait sec de fraisier va de 15/1 à 5/1 , de préférence de 12/1 à 8/1 , et est de préférence de 10/1 , de préférence encore de 9/1 .
10. Extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois, obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, caractérisé en ce qu'il comprend de 10 à 35% en poids de matière sèche, en particulier de 10 à 20% en poids, et de préférence de 10 à 15% en poids de matière sèche par rapport au poids total de l'extrait.
1 1 . Extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend une teneur de 10 à 15% en poids de matière sèche dans un mélange d'eau et de butylène glycol.
12. Extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
(i) Des polyphénols en une teneur allant de 15 à 20% en poids par rapport au poids de la matière sèche ;
(ii) et au moins un composé choisi parmi des sucres, des minéraux et oligoéléments, des acides aminés, et leurs mélanges.
13. Utilisation, dans une composition cosmétique d'un extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, ou tel que défini dans l'une quelconque des revendications 9 à 12, en tant qu'agent actif protecteur du stress oxydatif, en particulier des toxines et/ou de la pollution, et/ou pour stimuler le métabolisme cellulaire de la peau, visant notamment à préparer la peau au soleil et/ou prévenir les signes du vieillissement cutané extrinsèque, en particulier prévenir et/ou diminuer les rides et/ou ridules, et/ou améliorer l'éclat et/ou l'uniformité du teint, et/ou améliorer la radiance et/ou la transparence de la peau, et/ou améliorer la souplesse et/ou l'élasticité de la peau.
14. Extrait de feuilles et de fruits de fraisier des bois de l'espèce Fragaria vesca obtenu au moyen d'un solvant polaire cosmétiquement acceptable, de préférence un mélange hydroalcoolique, en particulier extrait tel que défini dans l'une quelconque des revendications 9 à 12 ou composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour prévenir et/ou limiter les effets néfastes des UV.
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