WO2018112672A1 - Virus aav/igf2, metodo de tratamiento genetico y su uso en enfermedades relacionadas con mal plegamiento de proteinas tal como la enfermedad de huntington - Google Patents

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Paula HUERTA GARCIA
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    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Definitions

  • the present invention is applied in the field of medicine, specifically in the process of protein folding, by the use of adeno-associated viruses (AAV) that overexpress IGF2 growth factor in cells of the central nervous system (CNS) ), preferably in areas of motor and cognitive control, recovering and improving neuronal deterioration.
  • AAV adeno-associated viruses
  • EH is a neurodegenerative condition that is characterized in the first stage by a cognitive deterioration and changes in personality, accompanied in the most advanced stage of failure in motor control, preventing the performance of daily life tasks, concluding with premature death of the patient.
  • the disease is characterized by an expansion of more than 35 glutamine repeats within the huntingtin protein, giving it a dominant toxic function, which leads to the progressive accumulation of mutant huntingtin (mHtt) and the occurrence of neuronal loss in the striated body (striatum).
  • mHtt mutant huntingtin
  • striatum neuronal loss in the striated body
  • the ER stress triggers the activation of the unfolded protein response (UPR), a signaling pathway that allows, in the first place, to mediate cellular adaptation to recover proteostasis.
  • URR unfolded protein response
  • ER stress can induce cell death and neurodegeneration.
  • ER stress has been linked to several neurodegenerative diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD) (7-9).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • XBP1 binding protein 1
  • the deletion of XBP1 in neurons in mouse models with HD had a neuroprotective effect (5).
  • the animals were more resistant to developing the disease, associated with an improvement in neuronal survival and better motor performance. This phenotype was explained by a drastic decrease in mHtt levels possibly due to a positive regulation of autophagy (5). Similar observations were obtained in ELA (1 1) and EP (12) models.
  • IGF2 insulin-like growth factor II
  • IGF2 insulin-like growth factor II
  • IGF2 is expressed differentially in motor neurons resistant to the disease and its overexpression by gene therapy delays the progression of the same (19).
  • IGF2 levels decrease in the hippocampus of AD patients (17, 20), and it also shows alterations in CSF samples (21, 22).
  • IGF2 represents an interesting candidate to study in the context of HD that can provide new therapeutic routes for its treatment, in addition to its potential use as a biomarker to monitor the progression of the disease.
  • the invention seeks to generate genetic therapeutic agents, therapies, identification devices and uses to treat Huntington's disease.
  • the specific technical objectives or problems to be solved are listed below:
  • a first aspect of the present invention relates to a method for improving or curing Huntington's disease, preferably in humans, using a virus that allows overexpressing IGF2 and / or IGF2 / HA in the brain, preferably in the striatum (striatum) and cortex (cortex).
  • a virus that allows overexpressing IGF2 and / or IGF2 / HA in the brain, preferably in the striatum (striatum) and cortex (cortex).
  • a second aspect of the present invention provides a method of therapeutic treatment for improving or curing Huntington's disease.
  • the method comprises intravenous and / or intraperitoneal and / or intracranial and / or intramedullary and / or intranasal and / or intraneural administration and / or any route that introduces the virus to the brain by passing the blood-brain barrier of a patient or subject.
  • the virus induces neuronal overexpression of IGF2 and / or IGF2 / HA in a dose range of 1 6 to 1 30 viral units per individual.
  • a third aspect of the present invention is a form of intravenous and / or intraperitoneal and / or intracranial and / or intramedullary and / or intranasal and / or intraneural pharmaceutical composition and / or any form that conducts the virus that induces neuronal overexpression of IGF2. and / or IGF2 / HA to the brain, preferably to the hippocampus, passing the blood-brain barrier, with dose ranges as previously presented and a pharmaceutically acceptable vehicle for use in the optimization and improvement of a human patient from his memory to long-term, Huntington's disease.
  • a fourth aspect of the present invention is the use of a virus that induces neuronal overexpression of IGF2 and / or IGF2 / HA and its protein derivative compounds because it serves to prepare a medicament useful in the improvement of Huntington's disease.
  • a fifth aspect of the present invention is a virus of the adeno-associated type (AAV) having the same virus sequence and an insert with a nucleotide sequence described in Table II and Table III or any of its variants, contained in the strain of Escherichia coli transformed with the plasmids.
  • AAV adeno-associated type
  • a sixth aspect of the present invention is the plasmid with the nucleic acid fragment of the virus and an insert with a nucleotide sequence described in Tables II and III and contained in the strain of Escherichia coli transformed with the plasmids deposited in the international organism of biological deposit, Chilean Collection of Microbial Genetic Resources (CChRGM), with the deposit numbers RGM2336 and RGM2335 and / or any variant of this fragment, which encodes and overexpress the growth factor IGF2 and / or IGF2 / HA, respectively.
  • a seventh aspect of the present invention is to provide a method of diagnosing Huntington's disease.
  • An eighth aspect of the following invention is the use of a virus that induces overexpression IGF2 and / or IGF2 / HA and its protein derived compounds because it serves to prepare a medicament useful in the stabilization of physiological levels to patients with Huntington's disease.
  • the present patent also presents the sequence of the plasmid with the nucleic acid fragment of the virus and an insert with a nucleotide sequence described in Tables IV, V and VII or any variant of this fragment, which encodes and overexpresses the growth factor IGF2 and / or IGF2 / HA.
  • the reference to "one step”, “one stage” or “one mode”, is a reference to one or more steps, stages or modes and that may include sub steps, stages or modes, implicit and / or supervening. All the conjunctions used must be understood in their least restrictive and most inclusive sense possible. Thus, for example, the conjunction “o” must be understood in its logical orthodox sense, and not as an “or excluding”, unless the context or text expressly needs or indicates it.
  • the structures, materials and / or elements described must be understood to also refer to those functionally equivalent and thus avoid interminable exhaustive enumerations.
  • the present invention describes vectors based on the serotypes AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 or any serotype, hybrids and also adeno-associated viruses capable of efficiently mediating the transfer of genes to the brain, preferably AAV2, preferably AAV2 / 2. , preferably striatum (striatum) and cortex (cortex), when administered locally. ( Figures 10/19, 11/19 and 12/19) Systemic administration of these vectors also leads to efficient gene delivery to both the brain and the striatum and bark (cortex). Although the delivery of genes mediated by the vectors AAV2 and AAV2 / 2 are more efficient, delivery in the case of systemic administration is not restricted only to the brain or the striatum and bark (cortex).
  • the present invention presents that the vector of AAV2 and AAV2 / 2 with the gene that codes for the expression of the growth factor IGF2, allows the generation of a response in a cluster of factors of interest in the brain and in specific in striatum ( striatum) and bark (cortex).
  • local administration of the AAV2 / 2 vector comprising an expression cassette in which a fgf2 gene is under the control of the CAG promoter achieves an improvement in the treatment of Huntington's disease in vivo. (Fig. 1 1/19 and 12/9).
  • AAV virus AAV virion
  • AAV viral particle AAV particle
  • AAV particle refers to a compound viral particle. by at least one AAV capsid protein (preferably by all the capsid proteins of a particular AAV serotype) and a polynucleotide of the encapsidated AAV genome.
  • the particle comprises a heterologous polynucleotide (i.e., a polynucleotide other than a native AAV genome such as a transgene to be delivered to a mammalian cell) flanked by the inverted terminal repeats of the AAV, which is typically referred to as a "vector" of AAV particles "or" AAV vector ".
  • AAV refers to viruses belonging to the genus Dependovirus of Parvoviridae farriilia.
  • the AAV genome is approximately 4.7 kilobases in length and is composed of single chain deoxyribonucleic acid (ssDNA) that can be counted as positive or negative.
  • the genome comprises inverted terminal repeats (ITR) at both ends of the DNA strand, and two open reading frames (ORFs): REP and CAP (Replicase and Capside).
  • the REP framework consists of four overlapping genes that code for REP proteins (REP 78, REP 68, REP 52 and REP 40) required for the AAV life cycle.
  • the CAP framework contains overlapping nucleotides of 20 capsid protein sequences: VP1, VP2 and VP3, which interact with each other to form a capsid of icosahedral symmetry (30), as presented in Figure 15/19.
  • AAV ITR adeno-associated virus IRT
  • AAV ITR refers to the inverted terminal that is repeated and is present at both ends of the DNA strand of the genome of an adeno-associated virus. ITR sequences are required for efficient multiplication of the AAV genome. Another property of these sequences is their ability to form a fork. This characteristic contributes to its autocopy that allows the primary synthesis independent of the second strand of DNA. The IRTs also proved to be necessary both for the integration of the native AAV DNA into the host cell genome and the rescue thereof, as well as for the efficient encapsidation of the AAV DNA combined with the generation of its complete assembly (25). ).
  • AAV2 and "AAV2 / 2”, as used in the present invention, refers to serotype 2 of the adeno-associated virus with a genome sequence as defined in accession number GenBank J01901.1, which can be found on the website: https://www.ncbi.nlm.nih.gOv /nuccore/J01901.1 Of the eleven serotypes that have been characterized to date, the best characterized and most frequently used is AAV2. The difference between the different serotypes is due to its cellular tropism, with AAV2 being one of the ones with the highest "affinity" for infecting cells of the central nervous system.
  • AAV vector further refers to a vector comprising one or more polynucleotides of interest (or transgenes) that are flanked by terminal repeat sequences of AAV (ITR).
  • AAV vectors can be replicated and packaged into infectious viral particles when they are present in a host cell that has been transfected with a vector encoding and expressing the REP and CAP genes (ie the AAV proteins REP and CAP), and where the The host cell has been transfected with a vector that encodes and expresses a protein of the E4orf6 adenovirus reading frame.
  • an AAV vector When an AAV vector is incorporated into a larger polynucleotide (for example in a chromosome or in another vector such as a plasmid used for cloning or transfection), then the AAV vector is typically referred to as a "pro-vector".
  • the pro-vector can be "rescued” by replication and encapsidation in the presence of the packaging functions of the AAV and the necessary auxiliary functions provided by E4orf6.
  • CAP gene refers to a gene encoding a CAP protein.
  • CAP protein refers to a polypeptide having activity of at least one functional activity of the CAP protein of a native AAV (VP1, VP2, VP3) Examples of functional activities of the VP1, VP2 and VP3 proteins include the ability to induce the formation of a capsid, facilitate the accumulation of single-stranded DNA, facilitating the packaging of AAV DNA in the capsid (i.e., encapsidation), binding to cellular receptors and facilitating entry of the virion into a host.
  • capsid refers to the structure in which the viral genome is packaged.
  • a capsid consists of an oligomeric structure with structural subunits of CAP proteins.
  • the AAV has an icosahedral capsid formed by the interaction of three capsid proteins: VP1, VP2 and VP3.
  • cell composition refers to a composite type material comprising the cells of the invention and at least one other component.
  • the composition can be formulated as a single formulation or can be presented as separate formulations of each of the components, which can be combined for the joint use as a combined preparation.
  • the composition can be a kit of parts, where each of the components is formulated and packaged individually.
  • constitutive promoter refers to a promoter whose activity is maintained at a relatively constant level throughout an organism, or during most of the experimental steps, with little or no consideration at all. environmental and external conditions of the cell.
  • expression cassette refers to a construction of nucleic acids, generated by recombination or synthetically, with a series of specific elements of the nucleic acids, which allow the transcription of a particular nucleic acid, in a target cell.
  • helper functions refers to genes encoding polypeptides, which perform functions on which AAV is dependent for replication (ie, "helper functions").
  • Auxiliary functions include those functions necessary for the replication of AAV, including these fragments involved in the activation of AAV gene transcription, the specific splicing steps of AAV mRNA, the replication of AAV DNA, the synthesis of CAP products and the assembly of the AAV capsid.
  • Accessory viral functions can be derived from any of the known helper viruses such as adenovirus, herpes virus, lentivirus and vaccinia virus.
  • Auxiliary functions include, without limitation, WHV lentivirus.
  • the term "locally administered”, as used here, means that the polynucleotides, vectors, polypeptides, and / or pharmaceutical compositions of the invention are administered to the subject at or near a specific site.
  • pharmaceutically acceptable carriers refer to a non-toxic, semi-solid, or liquid filler, diluent or encapsulation material or an auxiliary formulation for any conventional type.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is essentially non-toxic to the containers used in the dosages and concentrations and is compatible with other ingredients of the formulation. The number and nature of pharmaceutically acceptable vehicles depend on the desired form of administration. Pharmaceutically acceptable carriers are known and can be prepared by methods well known in the art. (24)
  • promoter refers to a nucleic acid that functions to control the transcription of one or more polynucleotides, located upstream of the sequence of the polynucleotide (s), and which is structurally identified by the presence of a binding site for DNA-dependent RNA polymerase, transcription initiation sites, and any other DNA sequence, including, but not limited to, binding sites of transcription factors, repressor, and binding sites activator protein, and any other nucleotide sequences known in the art to act directly or indirectly to regulate the amount of transcription from the promoter.
  • a "tissue-specific" promoter is only activated in certain differentiated cell or tissue types.
  • polynucleotide refers to a nucleic acid molecule, either DNA or RNA, that contains deoxynucleotides or ribonucleotides, respectively.
  • the nucleic acid can be double stranded, single stranded, or contain both double stranded or single stranded sequence parts.
  • polynucleotide includes, but is not limited to, nucleic acid sequences with the ability to encode a polypeptide and nucleic acid sequences partially or wholly complementary to an endogenous polynucleotide of the cell or the subject treated therewith so that , after transcription thereof, generates an RNA molecule (for example, microRNA, shRNA, siRNA) capable of hybridizing and inhibiting the expression of the endogenous polynucleotide.
  • RNA molecule for example, microRNA, shRNA, siRNA
  • chain in this document refers to a sequence of continuous nucleotides (including or not including natural modified or unnatural nucleotides).
  • the two or more strands may be, or each forms a part of, separate molecules, or they may be covalently interconnected, for example, by a linkage, eg, a linker such as polyethylene glycol, to form a molecule.
  • a linkage eg, a linker such as polyethylene glycol
  • At least one of the chains can include a region that is sufficiently complementary to a target RNA.
  • recombinant viral genome refers to an AAV genome in which at least one cassette of foreign polynucleotide is inserted. to expression in the native AAV genome.
  • Rep gene refers to a gene encoding a Rep protein.
  • Rep protein refers to a polypeptide having the minus one functional activity of a native AAV rep protein (e.g., Rep 40, 52, 68, 78).
  • a "functional activity" of a Rep protein is any activity associated with the physiological function of the protein, including the facilitation of DNA replication through recognition, binding and cutting of the origin of the DNA replication of AAV, as well as the helicase activity of DNA.
  • subject refers to an individual, plant, mammal or animal, such as a human, a non-human primate (eg, chimpanzee or other ape and species of monkeys), an animal (eg, example, birds, fish, cattle, sheep, pigs, goats and horses), a mammal (for example, dogs and cats), or a laboratory animal (for example rodents, such as mice, rats, mice with silenced genes (mice knockout), mice that overexpress a gene (transgenic mice) and guinea pigs).
  • the term does not denote a particular age or sex.
  • subject includes an embryo and a fetus.
  • administered systemically means that the polynucleotides, vectors, polypeptides, or pharmaceutical compositions of the present invention are administered to a subject in a non-localized form.
  • the systemic administration of the polynucleotides, vectors, polypeptides, or pharmaceutical compositions of the invention can reach various organs or tissues throughout the body of the subject, or can reach new specific tissues or organs of the subject.
  • intravenous administration of a pharmaceutical composition of the invention can result in transduction in more than one tissue or organ in a subject.
  • the polynucleotides, vectors, polypeptides, or pharmaceutical compositions of the invention that act systemically, operate close to or with neuronal nerve cells or with non-neuronal nerve cells, as well as intra- or extracellularly.
  • transduction refers to the process by which a sequence of foreign nucleotides is introduced into the cell by a virus.
  • transfection refers to the introduction of DNA into the recipient eukaryotic cells.
  • vector refers to a construct capable of delivering, and optionally expressing, one or more polynucleotides of interest in a host cell.
  • vectors include, but are not limited to, viral vectors, DNA or naked RNA expression vectors, plasmid, vectors cosmids or phages, RNA or DNA expression vectors associated with cationic condensation agents, DNA or RNA expression vectors encapsulated in liposomes, and certain eukaryotic cells, such as producer cells.
  • Vectors can be stable and can be self-replicating. There are no limitations as to the type of vector that can be used.
  • the vector can be a cloning vector, suitable for propagation and for obtaining polynucleotides, gene constructs or expression vectors incorporated into various heterologous organisms.
  • Suitable vectors include prokaryotic expression vectors, phage and shuttle vectors and eukaryotic expression vectors based on viral vectors (eg, adenoviruses, adeno-associated viruses as well as retroviruses and lentiviruses), as well as non-viral vectors.
  • DARPP is a phosphoprotein regulated by dopamine that is used as a marker of medium-sized spiny neurons (MSNs), which are the major neurons affected by the expression of mHtt. Its expression is used as a viability marker.
  • MSNs medium-sized spiny neurons
  • IGF2 refers to the IGF2 polypeptide per se, but also to the variant attached to the HA epitope.
  • the methods and compositions of the invention for example the methods and compositions of the AAV virus with the IGF2-HA insert or simply IGF2, can be used with any dosage and / or formulation described in the present invention, as well as with any administration route. described in the present invention.
  • improved of Huntington's disease we refer to the improvement of psychiatric, behavioral and motor symptoms, as well as a decrease in huntingtin aggregates in different species and / or subjects as defined herein. invention.
  • cDNA or “complementary DNA” refers to a DNA sequence totally complementary to an RNA, from which it is synthesized by RT-PCR.
  • the term "complementary" is used to indicate a sufficient degree of complementarity such that a stable and specific binding occurs between a compound and a target RNA molecule, the specific binding requires a sufficient degree of complementarity to avoiding non-specific binding of the oligomeric compound to non-target sequences under conditions where specific binding is desired, i.e. under physiological conditions in the case of in vivo assays or therapeutic treatment, or in the case of in vitro assays, under conditions in which the tests have been carried out.
  • the properties of a virus can be influenced and tailored, for example, by the introduction of ligands.
  • the pharmacological properties of a viral agent can be improved by the incorporation of a ligand in a formulation of the agent and a virus.
  • Ligands can bind to a wide variety of entities, for example ligands that bind to a viral agent, or can be used as a conjugate or formulation additive, for example, with the vehicle of a monomeric subunit conjugated to the ligand. .
  • entities for example ligands that bind to a viral agent, or can be used as a conjugate or formulation additive, for example, with the vehicle of a monomeric subunit conjugated to the ligand.
  • the examples are described below in the context of a monomeric subunit conjugated with ligand, but which is only preferred, and entities can be coupled at other points with a virus.
  • a ligand alters the distribution, direction, or lifetime of a viral agent in which it is incorporated.
  • a ligand provides a better affinity for a selected target, e.g., a molecule, cell, or cell type, a compartment, e.g., a cell or organ compartment, a tissue, or region of the body, e.g. as compared to a species in which this ligand is absent.
  • the ligands may improve the transport, hybridization, and specificity properties of the target molecule, for the present invention, of the virus.
  • Ligands in general may include therapeutic modifiers, for example to improve the absorption of the molecule in the individual; diagnostic compounds or reporter groups, for example, to monitor distribution; crosslinking agents; fractions that confer resistance to immune reactions; and natural or unusual nucleobases.
  • General examples include lipophilic molecules, lipids, lectins, (e.g., hecigenin, diosgenin), terpenes (e.g., triterpenes, e.g., sarsasapogenin, friedelin, lithocholic acid derived from epifriedelanol), vitamins, carbohydrates (e.g., a dextran, pullulan, chitin, chitosan, synthetic polymers (eg, oligo-lactate 15-mer) and natural polymers (eg, low and medium molecular weight), inulin, cyclodextrin, or hyaluronic acid), proteins, protein binding agents, integrin targeting molecules, polytes, peptides
  • the ligand can be a molecule that occurs naturally or recombinantly or synthetically, such as a synthetic polymer, for example a synthetic poly-amino acid.
  • poly-amino acids include polylysine (PLL), poly-L-aspartic acid, poly-L-glutamic acid, styrene-maleic acid anhydride copolymer, poly (lactic-co-glycolic acid) copolymer, copolymer divinyl ether-maleic anhydride, copolymer of N- (2-hydroxy-propyl) -methacrylamide (HMPA), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl-vinyl alcohol (PVA), polyurethane, poly (2-ethyl-acrylic acid), N-isopropyl-acrylamide polymers, or polyphosphazine.
  • PLL polylysine
  • PEG polyethylene glycol
  • PVA polyvinyl-vinyl alcohol
  • polyurethane poly (2-e
  • polyamines examples include: polyethylene imine, polylysine (PLL), spermine, spermidine, polyamine, pseudo-peptide polyamine, polyamine peptide mimetic, dendrimer polyamine, arginine, amidine, protamine, cationic moieties, eg cationic lipid, cationic porphyrin, salt Quaternary of a polyamine, or an alpha-helical peptide.
  • the ligands may also include targeting groups, for example a targeting agent to a cell or tissue, for example a thyrotropin, melanotropin, surfactant protein A, mucin carbohydrate, a glycosylated polyamino acid, bisphosphonate, polyglutamate, polyaspartate, or a peptide of Arg-Gly-Asp (RGD), or a peptide mimic of RGD.
  • a targeting agent to a cell or tissue for example a thyrotropin, melanotropin, surfactant protein A, mucin carbohydrate, a glycosylated polyamino acid, bisphosphonate, polyglutamate, polyaspartate, or a peptide of Arg-Gly-Asp (RGD), or a peptide mimic of RGD.
  • a targeting agent to a cell or tissue for example a thyrotropin, melanotropin, surfactant protein A, mucin carbohydrate
  • the ligands can be proteins, for example glycoproteins, lipoproteins, for example low density lipoprotein (LDL), or albumins, for example, serum albumin, or peptides, for example molecules having a specific affinity for a co-ligand, or antibodies, for example an antibody that binds to a specified cell type.
  • the ligands may also include hormones and hormone receptors. They may also include non-peptidic species, such as cofactors, multivalent lactose, multivalent galactose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine, multivalent mannose, or multivalent fucose.
  • the ligand can be a substance, for example a drug, which can increase the absorption of the viral agent within the cell, for example by altering the cytoskeleton of the cell, for example by altering microtubules, microfilaments, and / or filaments intermediates of the cell.
  • the ligand is a lipid, or a lipid-based molecule.
  • This lipid or this lipid-based molecule is preferably linked to a whey protein, for example albumin serum.
  • the viruses will be packed.
  • PBS phosphate buffer saline
  • the control of the expression of the mutant version of huntingtin is key to improve or cure Huntington's disease.
  • the improvement or cure for Huntington's disease involves other aspects in the secretory pathway including the synthesis and trafficking of various membrane receptors and ion channels, increase in calcium signaling, the synthesis of membranes and the assembly of protein complexes.
  • a unique function of IGF2 was found preferentially but not exclusively, in the striatum (striatum) and cortex (cortex). The application example, described here, provides proof that IGF2 decreases the expression of mHtt and increases neuronal viability, slowing down the development of Huntington's disease.
  • the peptide polyQ79 or mHTTQ85-GFP was expressed in Neuro2a cells in the presence of a medium enriched with IGF2. Consistently, IGF2 reduced the aggregates of polyQ and mHtt ( Figures 6/19 and 7/19).
  • a natural continuation of the present development was the performance of preliminary experiments in vivo, using an adeno-associated virus of type AAV2 / 2 (26). Within the sequence of this virus, a version of IGF2 marked with the HA epitope was cloned in order to better detect the expression of the peptide.
  • viral particles expressing mHtt were injected in the presence or absence of IGF2. Two weeks later, the striatum of these animals was analyzed, showing a decrease in the expression levels of mutant huntingtin as shown in Figure 10/19.
  • transgenic animals that express mutated human huntingtin YAC128 models.
  • Neonatal animals 1-2 days of age were injected intraventricularly with AAV-IGF2 / HA. 6 months later the animals were sacrificed to obtain tissue.
  • AAV a marked decrease in mHtt expression was observed in animals injected with IGF2 / HA versus the control condition as shown in Figure 11/19.
  • adult individuals were treated; these animals were injected with AAV-IGF2 / HA at three months and sacrificed for obtaining tissue at 6 months of age.
  • treatment with IGF2 / HA reduced mHtt expression levels compared to the control condition.
  • Studies were also carried out within the same studies verify motor improvement in mice with HD exposed to the AAV modified with IGF2, as shown in Figure 13/19.
  • AAV adeno-associated virus
  • the viral recombinant genome comprising an expression cassette that includes a hippocampal specific tissue transcriptional regulatory region operatively linked to the polynucleotide of interest.
  • Adeno-associated viruses in general, correspond to 42 serotypes and are derived from parvoviruses.
  • the different serotypes of AAV are genomic sequences with a significant homology at the level of amino acids and nucleic acids, which provide identical genetic functions, provide vibrations that are essentially identical in functional and physical terms, and their replication, assembly uses practically the same mechanisms.
  • the AAV serotype 2/2 with accession number J0 90.1 (AAV2 / 2) was used in the present invention, as presented in Table I.
  • the AAV genome according to the present invention comprises a 5 ' cis actuator and a 3 ' inverted terminal repeat sequence and an expression cassette.
  • the ITR or LTR sequences are 141 base pairs long.
  • the entire sequence of the LTRs is used in the molecule and only slight modifications of the sequences are allowed.
  • the AAV recombinant genome comprises the 5 ' and 3 ' AAV LTRs.
  • the ITRs can come from other serotypes of
  • the AAV of the present invention comprises a capsid of any serotype.
  • the capsid derived from serotype 2 is preferred.
  • an AAV cap for use in the method of the invention can be generated by mutagenesis (i.e., insertions, deletions or substitutions) of one of the AAV caps or its encoding nucleic acids.
  • the AAV cap is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% or more similar to the said AAV cap.
  • the AAV cap is chimeric, it comprises the domains of two, three, four, or more of said AAV caps.
  • the AAV cap is a mosaic of monomers VP1, VP2, VP3 and derived from two or three different AAVs or a recombinant AAV (rAAV).
  • rAAV recombinant AAV
  • a rAAV composition comprises more than one of the aforementioned CAPS.
  • an AAV CAP for use in a rAAV composition is designed to contain a heterologous sequence or other modification.
  • a peptide or protein sequence that confers selective targeting or immune evasion can be engineered into a Cap protein.
  • the Cap can be chemically modified so that the surface of the rAAV presents specific chemical modifications, for example polyethylene glycol, which can facilitate immune evasion.
  • the Cap protein can also be generated mutagenized (for example, to remove its natural binding receptor, or to mask an immunogenic epitope).
  • the AAV vector contains a promoter with the addition of a sequence of IGF2 or IGF2-HA of murine origin that can be selected from the following tables: Table IV ⁇ Igf2) and Table V (Igf2-HA), NCBI reference sequences NM_010514.3, NM_001 122736.2, NM_001 22737.2, NM_00 315488.1 and NM_001315489.1, corresponding to transcriptional variants 1, 2, 3, 4 and 5 whose protein product is the same and is encoded by the sequence shown in the tables.
  • the AAV vector contains a promoter with the addition of a sequence of IGF2 or IGF2-HA of human origin that can be selected from the following table: Table VII (human Igf2), NCBI reference sequences NM_000612.5, NM_001007139.5, NM_001127598.2, NM_001291861.2, NM_00129 862.2 corresponding to the transcriptional variants 1, 2, 3, 4 and 5 whose protein product is the same and is encoded by the sequence shown in the table.
  • Table VII human Igf2
  • NM_001291861.2 NM_00129 862.2 corresponding to the transcriptional variants 1, 2, 3, 4 and 5 whose protein product is the same and is encoded by the sequence shown in the table.
  • the AAV vector contains a eukaryotic expression promoter with the addition of at least one Igf2 sequence, which can be selected from Table IV, remaining as shown in Table II. In one embodiment, the AAV vector contains a eukaryotic expression promoter with the addition of at least one sequence of Igf2-ha that can be selected from Table V, remaining as shown in Table III.
  • the AAV vector contains a eukaryotic expression promoter with the addition of at least one human Igf2 sequence, which can be selected from Table VII.
  • the AAV vector contains a promoter with the addition of at least one sequence having a homology of 85% with a sequence selected from the aforementioned lists, Table II and Table III. In one embodiment, the AAV vector contains a promoter with the addition of at least one sequence having a 70% homology to a sequence selected from the tables mentioned above.
  • the AAV vector contains a promoter with the addition of at least one sequence that is a functional equivalent to a sequence selected from the aforementioned tables.
  • the transcriptional regulatory region may comprise a promoter and, optionally, an enhancer region.
  • the promoter is a eukaryotic gene expression promoter, selected from the present listing: CAG (CAG is a promoter that contains sequences corresponding to the early enhancer element of cytomegalovirus (CMV), the promoter, the first exon and the first intron of the beta gene chicken actin, and the splicing acceptor of the rabbit beta-globin gene), CMV, b-globin, CBA, elFalpha, among others.
  • CMV cytomegalovirus
  • the enhancer does not need to be specific for neuronal tissue.
  • the promoter is specific, it is the cytomegalovirus or CMV promoter.
  • the promoter is specific, it is b-globin.
  • the promoter is specific, it is CAG. In one embodiment, the promoter is specific, that of human elongation Factor-1 alpha, also known as elFalpha.
  • the expression cassette forming part of the AAV of the invention further comprises a region of post-transcriptional regulation.
  • the post-transcriptional regulatory region is the post-transcriptional region of the marmot hepatitis virus (WPRE) or functional variants and fragments thereof and the PPT-CTS or functional variants and fragments themselves.
  • WPRE marmot hepatitis virus
  • the post-transcriptional regulatory region is WPRE.
  • the expression cassette forming part of the AAV according to the invention comprises a "polynucleotide of interest".
  • the polynucleotide of interest encodes a protein that acts systemically.
  • the polynucleotide of interest encodes a protein that acts within a neuron.
  • the protein that acts within said neuron is IGF2, including any its isoforms that vary in sub-cellular locations and including any of its isoforms labeled with any epitope.
  • the packaging size limit of AAV vectors is limited to the size of the wild-type AAV genome, which varies in size according to the AAV serotype (ie, between 4087 to 4767).
  • native AAV-2 has an approximate genome size of 4.7 kB.
  • the cloning capacity of the recombinant RNA vector may be limited and a desired coding sequence may involve the complete replacement of 4.8 kilobases the virus genome. Large-sized genes may, therefore, not be suitable for use in a standard recombinant AAV vector, in some cases. The average expert will appreciate that options are available in the art for overcoming a limited coding capability.
  • the AAV IRT of two genomes can hybridize to form the head to tail concatamers, almost doubling the capacity of the vector.
  • the insertion of the splice sites allows the removal of / F? 7 after transcription.
  • Other options for overcoming a limited cloning capacity will be evident to the expert in the field.
  • the routes of administration of the virus are subject to the fact that it can pass the blood-brain barrier to infect target neurons.
  • the first of these routes is the nasal (27), generally medicines administered through the nasal route can enter the blood through the general circulation, can penetrate the brain directly, or in some cases can follow both routes. However, many of the factors that control the flow of drug through each of these pathways are not completely defined.
  • the nasal routes there are three routes by which a drug administered in the Nasal cavity can travel These whores (27) include the entry into the systemic circulation directly from the nasal mucosa (28), the entry into the olfactory bulb by axonal transport through the neurons, and direct entry into the brain (29). ).
  • the evidence supporting the role of each of these routes for a variety of model substrates is summarized below for different types of viruses.
  • intrathecal (intra + teca, "within a sheath”) is an adjective that refers to something that occurs or is introduced into an anatomical space or potential space within a sheath, most commonly the arachnoid membrane of the brain or spinal cord.
  • titration of the vector requires a range between 10 9 to 10 13 genome copies (CG) per me with a proven dose between 10 10 -10 12 gc / ml.
  • CG genome copies
  • any rate of dilution of the vectors to titre must have a low-medium range of 10 11 gc / ml, which results in the disappearance of toxicity.
  • the dose range in humans would be in the range of between 10 9 to 0 30 viral units / Kg of weight, without restricting this range to the application in different age groups or with volumes of distribution modified by age or pathology.
  • the rAAV2 vectors were injected bilaterally into the striatum using a 5 ⁇ Hamilton syringe equipped with a glass capillary with a tip diameter of about 60-80 microns. Two microliters of buffer containing the appropriate concentrations of viral particles were injected at a rate of 0.4 ⁇ l / minute. The needle is removed slowly 5 minutes after the injection is finished.
  • This figure presents the set of prominent genes whose expression
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of the mHTT aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • specific Neuro2a cells were transiently transfected with vectors for polyQ79-EGFP and IGF2 or control. Subsequently, the aggregation of polyQ was evaluated and quantified.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of polyQ peptide aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • Neuro2a cells were transiently transfected with vectors for polyQ79-EGFP and IGF2 or control. Subsequently, the aggregation of polyQ was evaluated and quantified. This figure presents the photograph of the Western Blots and the quantification to its right, after 24 and 48 hours of the transfection.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of polyQ peptide aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • specific Neuro2a cells were transiently transfected with the vectors for polyQ79-EGFP and IGF2 or control. Subsequently, the aggregation of polyQ was evaluated and quantified.
  • This figure presents the photograph of the filter trap (filtration traps) and the quantification on its right, after 24 and 48 hours of the transfection.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of the mHTT aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • specific Neuro2a cells were transiently transfected with vectors for polyQ79-EGFP, mHTTQ85-GFP in the presence of a medium enriched in IGF2 or control. 24 hours later the protein aggregation was evaluated and quantified.
  • This figure presents the photograph by fluorescence microscopy and the quantification of that fluorescence on its right, after 24 hours of transfection.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of the mHTT aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • Neuro2a cells were transiently transfected with vectors for polyQ79-EGFP, mHTTQ85-GFP in the presence of a medium enriched in IGF2 or control. 24 hours later the protein aggregation was evaluated and quantified.
  • FIG. 8/19 This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of mHTT aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of mHTT aggregates in a Neuro2a cell model for Huntington's disease.
  • This figure presents the photograph of a filter trap (filter trap) and its quantification on the right, after 24 hours of the transfection.
  • This figure shows how the expression of IGF2 decreases the levels of the mHTT aggregates in a YAC128 murine model for Huntington's disease.
  • This figure presents the photograph of a Western Blot and its quantification on the right, after 2 weeks of transduction.
  • AAVs were injected expressing IGF2 or control in the striatum of YAC 28 adult mice of 90 days. Three months after the Injection, the levels of mHtt aggregation as well as DARPP-32 were evaluated as a reflection of the viability of the striatum neurons.
  • This figure shows how the expression of IGF2 from the AAV virus decreases the levels of the polyQ aggregates in a YAC 28 murine model for Huntington's disease.
  • AAVs were injected expressing IGF2 or intraventricularly control in YAC128 animals neonates of 1 or 2 days of age. Six months after the injection, the aggregation levels of mHtt were evaluated. In a manner similar to that observed in vitro, a decrease in mHtt expression was found.
  • FIG. 13/19 This figure shows how the expression of IGF2 in a murine model YAC128 for Huntington's disease manages to correct the motor problems generated by the disease.
  • the upper figure indicates instead of injection in neonatal mice.
  • the lower figure shows the place where the AAVs are injected intra-cerebrally into the striatum of an adult mouse.
  • the present figure shows a schema of the AAV genome.
  • REP Genes involved in the replication mechanism of AAV.
  • VP Genes involved in the formation and assembly of the capsid.
  • ITR It is the equivalent to LTR, terminal inverted repeated sequence.
  • This figure presents the AAV virus vector with the IGF2-HA insert with the following specific description according to Table II.
  • This figure presents the AAV virus vector with the IGF2 insert with the following specific description according to Table III.
  • This figure presents the confirmation of the expression of the viral constructs generated.
  • HEK cells were transfected with the different constructs, after 24 hours of transfection, the proteins that were evaluated by WB were extracted using anti-IGF2 and anti-HA antibodies.
  • FIG. 19/19 This figure shows the protein levels of IGF2 in patients with HD and with control individuals. It was found that in patients with HD, IGF2 is hardly expressed suggesting an involvement in the development of the pathology.
  • the figures on the left have a Western blot for IGF2, to the right of the figure shows the quantification of the brand and the marked low of it in patients with HD.
  • Neuro2a cells are derived from a murine neuroblastoma and are widely used as cellular models.
  • the cells were maintained in DMEM supplemented with 10% FBS, 100 U / ml glutamine penicillin and 100 pg / ml streptomycin in a 5% C02 atmosphere at 37 ° C.
  • the cells are stored frozen at -80 ° C in 0% FBS DMSO in the case of N2a.
  • passages were given every two or three days by trypsinizing the cells of the culture bottles and after collecting the cells and centrifuging, they were reseeded in passes 1: 3-1: 6 according to the needs.
  • Cellular transfections were given every two or three days by trypsinizing the cells of the culture bottles and after collecting the cells and centrifuging, they were reseeded in passes 1: 3-1: 6 according to the needs.
  • mice injected in adulthood were injected at 90 days of age. Mice injected in the neonate state were injected between postnatal days 1 and 2. Wild mice (WT) or YAC mice and their wild siblings were used as control according to the experiment. In all cases, the strain used was C57BL / 6. The mice were maintained in a light-dark cycle of 12:12 h and had free access to food and water. For all animal experiments presented in this development, the guidelines established by the animal care and use committee at the University of Chile, Chile were used.
  • the extraction of total proteins was done from cultures of N2a cells, or tissues dissected from wild or transgenic animals according to the case.
  • the cells were harvested in PBS-Triton 1% buffer with protease inhibitors and phosphatases.
  • the samples were prepared at the desired concentration in loading buffer. Between 25 and 100 ug of protein were loaded in polyacrylamide gels. Electrophoresis was developed in a mini-Protean 3 system in glycine electrophoresis buffer. After the electrophoretic separation, the proteins were transferred to PVDF membranes previously hydrated in methanol and equilibrated for 5 minutes in transfer buffer, using a mini-Trans Blot system.
  • the filter trap assays were performed from the same protein extracts prepared in SDS 1%. Between 25-50 ug of protein were loaded onto the filter trap support using a membrane whose pore is ⁇ 0.22 um.
  • Rotarod Briefly, the mice undergo training consisting of 4 days during which the animals make contact with the rotarod, the task and the experimenter. On day 5 the test is carried out where the time that the animal remains in the rotarod is measured with an acceleration of 4 to 40 rpm in 120s. The test continued until all the mice fell off the rod. The latency in falling and the rpm at the time of the fall were recorded for each mouse. Three trials were performed per mouse and averaged. Production of Adeno-associated vectors
  • Serotype 2 AAV virus particles were produced by the transfection of 293-AAV cells (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) and purified on a gradient of iodixanol followed by affinity column chromatography. The number of AAV particles that contain the genome in the suspension, as well as the infectivity of the vector suspension in HEK293T cells were determined by TaqMan qPCR assays.
  • the murine IGF2 sequence was cloned into the adenoviral plasmid pAAV-MCS, which expresses the transgene under the CAG promoter.
  • pAAV-MCS adenoviral plasmid pAAV-MCS
  • PCRs were performed that allowed us to obtain Igf2 e / gf2-HA to subclone in the vector pAAV-MCS.
  • the CDNA IGF2-HA which encodes C-terminal HA-tagged, was generated by PCR amplification of lgf2-EcoR1 SN2 and Igf2-HA-Bgl II AS
  • the sequence of the HA tag was included in the cloning strategy, which then allowed to identify the transduced cells and the expression of IGF2 (without excluding other epitope sequences to identify the cells transduced as FLAG, GFP, His and Myc, among others). Therefore, IGF2 was amplified with the HA tag sequence at the 3 'end. The obtained clones were confirmed by DNA sequencing. In this way, we generated the constructs pAAV-CAG-IGF2-HA and pAAV-CAG-IGF2 that code for the IGF2 fusion protein with and without the tag respectively. The empty adenoviral plasmid pAAV CAG was used as a control.
  • mice were anesthetized using ketamine / xylazine anesthesia (Ketamine: 100 mg / kg, xylazine: 10 mg / kg, Vetcom, Chile), and placed in a stereotaxic with mouth, nose and ears for mice (David Kopf Instruments , USA). According to the experiment, unilateral or bilateral injections of AAV-mHTT-RFP, AAV-IGF2-HA or AAV-vacuum (control) were made, with the following concentrations: 1.96 x 10 12 , 1 x 10 13 and 1.2 x 10 13 transduction units / ⁇ respectively.
  • mice were sacrificed by CO2 narcosis, the brains were removed, and the cortex and striatum of both hemispheres were rapidly dissected on a plate placed on ice.
  • the tissue was homogenized in phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) supplemented with a mixture of inhibitors of proteases and phosphatases (Roche applied science, USA). The homogenate was divided to obtain mRNA and protein extraction was followed by standard purification and quantification protocols.
  • PBS phosphate buffered saline
  • anti-Hsp90 (1: 3000, Santa Cruz
  • anti-IGF2 (1: 1000 Abcam
  • anti-polyQ (1: 1000 Sigma
  • anti-GFP (1: 1000 Sta Cruz
  • anti-DARPP32 (1: 1000 Cell Siganlling
  • anti-tubulin (1: 3000, Millipore).
  • the data are expressed as mean and SE. Based on the experiments, the results were statistically compared using the Student's T test or the Mann-Whitney test, two-way ANOVA followed by Holm-Sidack or Bonferroni as a post-hoc test or Kruskal-Wailis ANOVA one-way ranges followed by the Dunn or Bonferroni Method as a post-hoc test.
  • AAAGCCATTC 1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACCCGA 1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG
  • AACTCAACGA 1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC
  • ACCCGCCGTC 1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA 1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA 1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC 1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCT
  • IGF2 [1339: 1878-CW] F1 origin [3066: 2626 - CW] Stop [1339: 1878 - CW] UTR: [2430: 2528 - CW] R-ITR: [12: 106-CW] 13 origin: [2621 : 3076 - CW] ColE1 origin: [4472: 5100 -CW] AmpR: [3661: 4320 - CW]
  • IGF2 [1339: 1878- CW] F1 origin [3093: 2653 - CW] HA [1879: 1908 -CW] L-ITR [89: 196 -CW] R-ITR: [12: 106-CW] T7: [2587 : 2606 - CW] T7: [3532: 3551 - CW] 13 origin: [2648: 3103- CW] ColE1 origin: [4499: 5127 - CW]
  • IGF2 Human

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Abstract

La presente invención incluye la expresión de dos moléculas en vectores virales AAV/IGF2-HA y AAV/IGF2, su método y su uso en el mejoramiento de enfermedades relacionadas con mal plegamiento de proteínas, tal como la enfermedad de Huntington, como se presenta en los modelos in vivo en la figura 11/19.

Description

VIRUS AAV/IGF2. MÉTODO DE TRATAMIENTO GENÉTICO Y SU USO EN ENFERMEDADES RELACIONADAS CON MAL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS TAL COMO LA ENFERMEDAD DE HUNTINGTON CAMPO TÉCNICO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención se aplica en el campo de la medicina , específicamente en el proceso de plegamiento de proteínas, mediante el uso de los virus adeno-asociados (AAV) que sobre-expresan el factor de crecimiento IGF2 en células del sistema nervioso central (SNC), de preferencia en zonas de control motor y cognitivo, recuperando y mejorando el deterioro neuronal.
ANTECEDENTES Y DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DEL ARTE
La investigación científica sobre las enfermedades del SNC ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con alteraciones neurológicas degenerativas. El tratamiento de enfermedades relacionadas con el mal plegamiento de proteínas, tal como la enfermedad de Huntington, tiene enfoques con terapias alopáticas (antipsicóticos y antidepresivos) para disminuir los síntomas desencadenados por la muerte de neuronas como consecuencia de este mal plegamiento proteico, pero nada que frene la degeneración ni que revierta el daño ya causado.
Con respecto a la enfermedad de Huntington (EH), su causa genética fue descubierta hace más de 20 años, pero los mecanismos que conducen a la disfunción neuronal y muerte celular, recién se están empezando a determinar.
Dentro de la determinación de estos mecanismos, se ha planteado que la alteración general de la red de proteostásis, es un evento patológico importante dentro de la gestación de la EH, destacando la aparición de estrés del retículo endoplasmático (RE). En este organelo residen la proteínas responsables deactivar la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR, por sus siglas en inglés) una señal de reacción que controla el destino celular bajo estrés RE.
La EH es una afección neurodegenerativa que se caracteriza en la primera etapa por un deterioro cognitivo y cambios en la personalidad, acompañado en la etapa más avanzado de fallos en el control motor impidiendo la realización de tareas de la vida diarias, concluyendo con la muerte prematura del paciente. A nivel proteico, la enfermedad se caracteriza por una expansión de más de 35 repeticiones de glutamina dentro de la proteína huntingtina confiriéndole una función tóxica dominante, que conduce a la acumulación progresiva de la huntingtina muíante (mHtt) y la ocurrencia de la pérdida neuronal en el cuerpo estriado (striatum). Aunque los mecanismos de los efectos generados por la mHtt en la función neuronal todavía se discuten, diferentes publicaciones sugieren que las alteraciones globales a la homeostasis proteica (1) contribuyen a la patogénesis (2-5), incluyendo la alteración de la degradación de proteínas asociada al RE, del tráfico vesicular en RE y Golgi, del transporte axonal y las perturbaciones en la autofagia (6). Todos estos acontecimientos aumentan la carga proteica de las células, perturbando su correcto plegamiento y la maduración en el RE, generando estrés del RE crónico y disfunción neuronal (7). El estrés del RE desencadena la activación de la respuesta de la proteína desplegada (UPR), una vía de señalización que permite, en primer lugar, mediar la adaptación celular para recuperar la proteostasis.
Sin embargo, el estrés del RE crónico puede inducir muerte celular y neurodegeneración. Es importante destacar que, el estrés del RE se ha relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) (7-9). Dentro de esta señalización, la rama más conservada es controlada por el factor de transcripción X-box de la proteína de unión 1 (XBP1) que controla la expresión de un grupo de genes que participan en diferentes aspectos de la red de proteostasis (10). Se demostró previamente que la deleción de XBP1 en neuronas en modelos de ratón con EH tenía un efecto neuroprotector (5). En general, los animales eran más resistentes a desarrollar la enfermedad, asociado a una mejora en la supervivencia neuronal y mejor rendimiento motor. Este fenotipo se explicó por una drástica disminución en los niveles de mHtt posiblemente por una regulación positiva de la autofagia (5). Similares observaciones fueron obtenidas en modelos de ELA (1 1 ) y EP (12).
En la búsqueda para el tratamiento de estas enfermedades dependientes del plegamiento de proteico, se ha identificado el factor de crecimiento tipo insulina II, llamado IGF2, cuya función está involucrada en los mecanismos biológicos y moleculares de crecimiento fetal, al igual que está involucrado con algunos tumores cancerígenos. El IGF2 es un factor de crecimiento secretado con actividades neuroprotectoras interesantes en varios modelos. En resumen, algunos estudios recientes sugieren que los IGF en general, son posibles dianas para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, en particular teniendo en cuenta sus funciones como agentes neurogénicos y efectos neuroprotectores (13). De hecho, la entrega de IGF1 en modelos preclínicos de EA y ELA atenúa las características patológicas utilizando terapia génica (14-16). En contraste con IGF1 e insulina, IGF2 ha sido poco estudiada. Sólo unos pocos informes recientes sugieren un papel neuroprotector para el IGF2, donde reduce las placas amiloides y el deterioro cognitivo en modelos EA (17, 18). Del mismo modo, en ELA, IGF2 se expresa de forma diferencial en las neuronas motoras resistentes a la enfermedad y su sobreexpresión mediante terapia génica retrasa la progresión de la misma (19). Además, en los seres humanos, los niveles de IGF2 disminuyen en el hipocampo de los pacientes de EA (17, 20), y también muestra las alteraciones en las muestras de CSF (21 , 22).
Sin embargo, no hay estudios funcionales que hayan relacionado IGF2 con la EH.
En general, la dinámica entre la señalización de la UPR y la de los factores de crecimiento suponen un nuevo enfoque que relaciona la red de proteostasis con las señales de supervivencia que modulan la fisiología neuronal (23). Por estos motivos, IGF2 representa un candidato interesante para estudiarlo en el contexto de la EH que puede proporcionar nuevas vías terapéuticas para su tratamiento, además de su uso potencial como un biomarcador para vigilar la progresión de la enfermedad.
Existe un documento CL 3510-2014, con una presentación internacional WO2014/08562 , donde se presenta una proteína de fusión que comprende a IGF2 para el tratamiento de enfermedades asociadas a proteínas lisosomales, no se menciona un tratamiento genético para curar la EH.
También, hay un segundo documento ES 2442242 A1 , que menciona una composición en base a un extracto sacado de la sangre la cual comprende diferentes factores de crecimiento, donde no se menciona tampoco un tratamiento genético para curar la EH.
Por lo tanto, no existen documentos que utilicen terapia génica que relacione el gen de IGF2 y eUratamiento de la EH.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En general la invención busca generar agentes terapéuticos genéticos, terapias, dispositivos de identificación y usos para tratar la enfermedad de Huntington. Los objetivos o problemas técnicos específicos a solucionar se enumeran a continuación:
Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para mejorar o curar la enfermedad de Huntington, de preferencia en humanos, utilizando un virus que permite sobreexpresar IGF2 y/o IGF2/HA en el cerebro, de preferencia en el cuerpo estriado (stríatum) y corteza (cortex).
Un segundo aspecto de la presente invención provee un método de tratamiento terapéutico para mejorar o curar la enfermedad de Huntington. El método comprende la administración intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier vía que introduzca el virus al cerebro pasando la barrera hematoencefálica de un paciente o sujeto. El virus induce la sobreexpresión neuronal de IGF2 y/o IGF2/HA en un rango de dosis de 16 a 130 unidades virales por individuo.
Un tercer aspecto de la presente invención es una forma de composición farmacéutica intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier forma que conduzca el virus que induce la sobreexpresión neuronal de IGF2 y/o IGF2/HA al cerebro, de preferencia al hipocampo, pasando la barrera hemato-encefálica, con rangos de dosis como los presentados previamente y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en la optimización y mejora de un paciente humano de su memoria a largo plazo, la enfermedad de Huntington.
Un cuarto aspecto de la presente invención es el uso de un virus que induce la sobreexpresión neuronal de IGF2 y/o IGF2/HA y sus compuestos derivados proteicos porque sirve para preparar un medicamento útil en la mejora de enfermedad de Huntington. Un quinto aspecto de la presente invención es un virus del tipo adeno- asociado (AAV) que presenta la misma secuencia del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descrita en la Tabla II y en la Tabla III o cualquiera de sus variantes, contenido en la cepa de Escherichia coli transformada con los plásmidos. depositados en el organismo internacional de depósito biológico, Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), con los números de depósitos RGM2336 y RG 2335, donde se sobreexpresa el factor de crecimiento IGF2 y/o IG-2/HA, respectivamente, principalmente en el cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex).
Un sexto aspecto de la presente invención es el plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descritas en las Tablas II y III y contenido en la cepa de Escherichia coli transformada con los plásmidos depositados en el organismo internacional de depósito biológico, Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), con los números de depósitos RGM2336 y RGM2335 y/o cualquier variante de este fragmento, que codifique y sobre-exprese el factor de crecimiento IGF2 y/o IGF2/HA, respectivamente. Un séptimo aspecto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico de la enfermedad de Huntington.
Un octavo aspecto de la siguiente invención es el uso de un virus que induce la sobreexpresión IGF2 y/o IGF2/HA y sus compuestos derivados proteicos porque sirve para preparar un medicamento útil en la estabilización de los niveles fisiológicos a pacientes con la enfermedad de Huntington.
La presente patente presenta también, la secuencia del plásmido con el fragmento de ácido nucleico del virus y un inserto con una secuencia nucleotídica descritas en las Tablas IV, V y VII o cualquier variante de este fragmento, que codifique y sobreexprese el factor de crecimiento IGF2 y/o IGF2/HA.
DEPÓSITO DE M IC ROO RGAN IS MOS Los plásmidos pAAV-IGF2-HA y pAAV-IGF2 fueron depositados con fecha de 2016 en el organismo internacional de depósito biológico, contenido en la cepa de Escherichia coli transformada con los plásmidos depositados en el organismo internacional de depósito biológico, Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), con los números de depósitos RGM2335 y RGM2336, respectivamente.
DESCRI PC IÓN DETALLADA DE LA I NVE NC IÓ N
Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología particular, compuestos, materiales, técnicas de manufactura, usos y aplicaciones aquí descritas, pues éstas pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada aquí es usada con el solo propósito de describir una representación particular, y no intenta limitar la perspectiva y el potencial del presente invento. Debe notarse que el uso y método, aquí, éri el pliego de reivindicaciones y en todo el texto que el singular no excluye el plural, salvo que en el contexto claramente lo implique. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método", es una referencia a uno o más usos o métodos e incluye equivalentes conocidos por quienes conocen de la materia (el arte). Similarmente, como otro ejemplo, la referencia a "un paso", "una etapa" o a "un modo", es una referencia a uno o más pasos, etapas o modos y que puede incluir sub pasos, etapas o modos, implícitos y/o sobrevinientes. Todas las conjunciones usadas han de entenderse en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" debe entenderse en su sentido lógico ortodoxo, y no como un "o excluyente", salvo que el contexto o el texto expresamente lo necesite o indique. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos han de entenderse que también se refieren a aquellos equivalentes funcionalmente y así evitar enumeraciones taxativas interminables.
Las expresiones usadas para indicar aproximaciones o conceptualizaciones deben entenderse así, salvo que el contexto mande una interpretación distinta.
Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos aquí empleados tienen el significado común que le otorga una persona común, calificada en estas materias, salvo indicación expresa, distinta. Los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones son descritos aunque métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos pueden ser usados o preferidos en la práctica y/o pruebas de la presente invención.
Se incorporan todas las patentes y otras publicaciones como referencias, con el propósito de describir y/o informar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones, que puedan resultar útiles en relación con el presente invento.
Se incluyen estas publicaciones sólo por su información previa a la fecha de registro de la presente solicitud de patente.
A este respecto nada debe considerarse como una admisión o aceptación, rechazo o exclusión, de que los autores y/o inventores no estén legitimados de serlo, o de estar ante-fechadas dichas publicaciones en virtud de otras anteriores, o por cualquier otra razón.
La presente invención describe vectores basados en los serotipos AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4 o cualquier serotipo, híbridos y también de virus adeno- asociados capaces de mediar de manera eficiente la transferencia de genes al cerebro, de preferencia AAV2, de preferencia AAV2/2, de preferencia cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex), cuando se administra localmente. (Figuras 10/19, 11/19 y 12/19) La administración sistémica de estos vectores también conduce a un suministro de genes eficiente tanto al cerebro como al cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex). Aunque la entrega de genes mediada por los vectores AAV2 y AAV2/2 son más eficientes, la entrega en el caso de administración sistémica no está restringida solo al cerebro o al cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex). La presente invención presenta que el vector de AAV2 y AAV2/2 con el gen que codifica para la expresión del factor de crecimiento IGF2, permite la generación de una respuesta en un clúster de factores de interés en el cerebro y en específico en cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex). En particular, la administración local del vector AAV2/2 que comprende un cásete de expresión en el que un gen fgf2 está bajo el control del promotor CAG, logra una mejora en el tratamiento de la enfermedad de Huntington in vivo. (Fig. 1 1/19 y 12/ 9).
I. Definición de términos y expresiones generales
Los términos "virus adeno-asociado", "virus AAV", "virión de AAV", "partícula viral AAV", y "partícula de AAV", como se usa en el presente documento son intercambiables, se refieren a una partícula viral compuesta por ai menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo de AAV en particular) y un polinucleótido del genoma de AAV encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo nativo como un transgén para ser entregado a célula de mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del AAV, que se conoce típicamente como un "vector de partículas de AAV" o "vector de AAV". AAV se refiere a virus que pertenecen al género Dependovirus de la farriilia Parvoviridae. El genoma de AAV es de aproximadamente 4,7 kilobases de longitud y está compuesto por ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ssDNA) que puede ser censada como positiva o negativa. El genoma comprende repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la cadena de ADN, y dos marcos abiertos de lectura (ORFs): REP y CAP (Replicasa y Cápside). El marco REP está formado por cuatro genes superpuestos que codifican para proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) requeridas para el ciclo de vida del AAV. El marco CAP contiene nucleótidos de solapamiento de 20 secuencias de proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3, que ¡nteractúan entre sí para formar una cápside de una simetría icosaédrica (30), tal como se presenta en la figura 15/19.
El término "virus adeno-asociado IRT" o "AAV ITR", como se usa aquí, se refiere a la terminal invertida que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma de un virus adeno-asociado. Se requieren de las secuencias ITR para la multiplicación eficiente del genoma de AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocopia que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena de ADN. Los IRTs también mostraron ser necesario tanto para la integración del ADN del AAV de tipo nativo en el genoma de la célula hospedera y del rescate de ella, así como para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de su completo ensamblaje (25).
Los términos "AAV2" y "AAV2/2", como se usan en la presente invención, se refiere al serotipo 2 del virus adeno-asociado con una secuencia del genoma tal como se define en el número de acceso GenBank J01901.1 , que se encuentra en la página web: https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/J01901.1 De los once serotipos que han sido caracterizados hasta la fecha, el mejor caracterizado y usado con mayor frecuencia es el AAV2. La diferencia entre los distintos serotipos se debe a su tropismo celular siendo el AAV2 uno de los que presenta mayor "afinidad" por infectar células del sistema nervioso central. El término "vector de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere además a un vector que comprende uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminal de AAV (ITR). Tales vectores de AAV pueden ser replicados y empaquetados en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedera que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes REP y CAP (es decir las proteínas AAV REP y CAP), y donde la célula hospedera ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa una proteína del marco de lectura del adenovirus E4orf6. Cuando un vector de AAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido utilizado para la clonación o transfección), entonces el vector de AAV se denomina típicamente como un "pro-vector". El pro-vector puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del AAV y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6. El término "gen CAP' o "gen CAP de AAV", como se usa en la presente invención, se refiere a un gen que codifica para una proteina CAP. El término "protéína CAP", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un AAV nativo (VP1 , VP2, VP3). Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1 , VP2 y VP3 incluyen la capacidad para inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN de hebra sencilla, facilitar el empaquetamiento del ADN de AAV en la cápside (es decir, la encapsidación), unirse a receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un hospedero.
El término "cápside", como se usa en la presente invención, se refiere a la estructura en la que se envasa el genoma viral. Un cápside consta de una estructura oligomérica con subunidades estructurales de proteínas CAP. Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápside: VP1 , VP2 y VP3.
El término "composición de células", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material tipo compuesto que comprende las células de la invención y al menos otro componente. La composición puede formularse como una sola formulación o se puede presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para el uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, donde cada uno de los componentes se formula y se empaqueta individualmente. El término "promotor constitutivo", como se usa en la presente invención, se refiere a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante en todo un organismo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con poca o ninguna consideración a las condiciones ambientales y externas de la célula.
El término "cásete de expresión", como se usa aquí, se refiere a una construcción de ácidos nucleicos, generados por recombinación o sintéticamente, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico en particular, en una célula diana.
El término "genes que proporcionan funciones de ayuda", como se usa aquí, se refiere a genes que codifican polipéptidos, que realizan funciones sobre las que AAV es dependiente para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen aquellas funciones necesarias para la replicación de AAV, incluyendo estos fragmentos involucrados en la activación de la transcripción de genes AAV, las etapas específicas del empalme (splicing) de mARN de AAV, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de CAP y el ensamblado de la cápside de AAV. Funciones virales accesorias se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos tales como adenovirus, virus herpes, lentivirus y el virus vaccinia. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, lentivirus WHV. El término "administrado localmente", como se usa aquí, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, y/o composiciones farmacéuticas de la invención se administran al sujeto en o cerca de un sitio específico.
Los términos "portadores farmacéuticamente aceptables", "diluyentes farmacéuticamente aceptables", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", son intercambiables en el presente documento, se refieren a un sólido no tóxico, semisólido, o líquido de relleno, diluyente o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional. Un portador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los recipientes empleados en las dosificaciones y concentraciones y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y la naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de administración deseada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. (24).
El término "promotor", como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situado aguas arriba de la secuencia del polinucleótido(s), y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para DNA dependiente de la ARN Polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción, y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero no limitado a, los sitios de unión de factores de transcripción, represor, y sitios de unión a proteína activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas en la técnica para actuar directamente o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "específico de tejido" sólo se activa en determinados tipos de células o tejidos diferenciados.
El término "polinucleótido", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene deoxinbonucleótidos o ribonucleótidos respectivamente. El ácido nucleico puede ser doble cadena, de cadena sencilla, o contener partes tanto de secuencia de doble cadena o de cadena sencilla. El término "polinucleótido" incluye, pero no está limitado a, secuencias de ácidos nucleicos con la capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarios a un polinucleótido endógeno de la célula o el sujeto tratado con la misma de modo que, tras la transcripción del mismo, genera una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN, siARN) capaz de hibridarse e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno. El término "cadena" en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (incluyendo o no incluyendo nucleótidos naturales modificados o no naturales). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una forma una parte de, moléculas separadas, o pueden ser covalentemente interconectadas, por ejemplo, mediante un enganche, por ejemplo, un enlazador como polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que es suficientemente complementaria a un ARN diana.
El término "genoma viral recombinante", como se usa aquí, se refiere a un genoma de AAV en el que se inserta al menos un cásete de polinucleótido ajeno a la expresión en el genoma de AAV nativo.
El término "gen rep" o "gen rep de AAV", como se usa aquí, se refiere a un gen que codifica una proteína Rep. El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína nativa rep de AAV (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78). Una "actividad funcional" de un proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, incluyendo la facilitación de la replicación del ADN a través del reconocimiento, unión y corte del origen de la replicación del ADN de AAV, así como la actividad helicasa de ADN. Las funciones adicionales incluyen modulación de la transcripción de AAV (u otros heterólogos) promotores y la integración sitio-específica del ADN de AAV en un cromosoma del huésped. El término "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, tal como un humano, un primate no humano (por ejemplo, chimpancé u otro simio y especies de monos), un animal (por ejemplo, pájaros, peces, ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos), o un animal de laboratorio (por ejemplo roedores, tales como ratones, ratas, ratones con genes silenciados (ratones knockout), ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos) y conejillos de indias). El término no denota una edad o sexo particular. El término "sujeto" incluye un embrión y un feto.
El término "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", como se usa en el presenté documento, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran a un sujeto en una forma no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la invención puede alcanzar varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a nuevos órganos o tejidos del sujeto específicos. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la invención puede dar lugar a la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto. Para la presente invención, también significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas de la invención que actúan sistémicamente, operan cerca o con las células nerviosas neuronales o con células nerviosas no neuronales, como también intra o extracelularmente. El término "transducción", como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de nucleótidos foráneos es introducida dentro de la célula por un virus.
El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucariotas destinatarias.
El término "vector", como se usa aquí, se refiere a un constructo capaz de entregar, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, ADN o vectores de expresión de ARN desnudos, plásmido, vectores cósmidos o fagos, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser auto-replicantes. No hay limitaciones en cuanto al tipo de vector que puede ser utilizado. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y para la obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión incorporados a varios organismos heterólogos. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión procariotas, fagos y vectores lanzadera y vectores de expresión de eucariotas basados en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adeno- asociados así como retrovirus y lentivirus), así como vectores no virales.
El término "DARPP", como se usa aquí, es una fosfoproteína regulada por dopamina que se utiliza como marcador de neuronas espinosas de tamaño medio (MSN), que son las principales neuronas afectadas por la expresión de mHtt. Su expresión se utiliza como marcador de viabilidad.
El término IGF2, usado en el documento, ser refiere al polipétido IGF2 per ser, pero también a las variante unida al epítope HA.
Los métodos y composiciones de la invención, por ejemplo los métodos y las composiciones del virus AAV con el inserto IGF2-HA o simplemente IGF2, se pueden utilizar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en la presente invención, así como con cualquierVía de administración descrita en la presente invención. Para el término "mejora de la enfermedad de Huntington", nos referimos a la mejora de los síntomas psiquiátricos, de comportamiento y motores, así como una disminución de los agregados de huntingtina en las diferentes especies y/o sujetos como está definida en la presente invención.
El término "ADNc" o "ADN complementario", se refiere a una secuencia de ADN totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual, se sintetiza por RT-PCR.
Como se usa en este documento, el término "complementario" se utiliza para indicar un grado suficiente de complementariedad tal que una unión estable y específica tiene lugar entre un compuesto y una molécula de ARN diana, la unión específica requiere un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto oligomérico a secuencias no-objetivo en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, o en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las que los ensayos se han realizado. Ligandos
Las propiedades de un virus, incluyendo sus propiedades farmacológicas, se pueden influenciar y hacer a la medida, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. En adición, las propiedades farmacológicas de un agente viral se pueden mejorar mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus.
Los ligandos, se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo ligandos que se unen a un agente viral, o se pueden utilizar como un conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunídad monomérica conjugada con el ligando. Los ejemplos se describen más adelante en el contexto de una subunídad monomérica conjugada con ligando, pero que es solamente la preferida, y las entidades se pueden acoplar en otros puntos con un virus.
Un ligando altera la distribución, dirección, o tiempo de vida de un agente viral en el que se incorpore. En las modalidades preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad para un objetivo seleccionado, por ejemplo una molécula, célula, o tipo de célula, un compartimiento, por ejemplo un compartimiento celular u órgano, un tejido, o región del cuerpo, por ejemplo, como se compare con una especie en la que esté ausente este ligando.
Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación, y especificidad de la molécula objetivo, para la presente invención, del virus.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos reporteros, por ejemplo, para monitorear la distribución; agentes reticulantes; fracciones que confieran resistencia a la reacciones inmunes; y nucleobases naturales o inusuales. Los ejemplos generales incluyen moléculas lipofílicas, lípidos, lectinas, (por ejemplo, hecigenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, oligo-lactato 15-mer) y naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico), proteínas, agentes de enlace de proteínas, moléculas de dirección de integrina, policatíones, péptidos, poliaminas, y miméticos de péptidos. Otros ejemplos incluyen los ligandos receptores de células epiteliales o de ácido fólico, tales como transferrina.
El ligando puede ser una molécula que se presente naturalmente o recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo un poli- aminoácido sintético. Los ejemplos de los poli-aminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli-ácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico, copolímero de estireno- anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli-(láctico-co-glicólico), copolímero de diviniléter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxi-propil)-metacril- amida (HMPA), polietilenglicol (PEG), polivinil-alcohol vinílico (PVA), poliuretano, poli-(ácido 2-etil-acrílico), polímeros de N-isopropil-acril-amida, o polifosfazina. Los ejemplos de las poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudo-peptídica, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa-helicoidal. Los ligandos también pueden incluir grupos de dirección, por ejemplo un agente de dirección a una célula o tejido, por ejemplo una tirotropina, melanotropina, proteína A de tensoactivo, carbohidrato de mucina, un poliaminoácido glicosilado, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD), o un mimético de péptido de RGD.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo glicoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo lipoproteína de baja densidad (LDL), o albúminas, por ejemplo, albúmina de suero, o péptidos, por ejemplo moléculas que tengan una afinidad específica para un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo un anticuerpo que se enlace con un tipo de célula especificado. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, mañosa multivalente, o fucosa multivalente.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo un fármaco, que pueda aumentar la absorción del agente viral dentro de la célula, por ejemplo mediante la alteración del citoesqueleto de la célula, por ejemplo mediante la alteración de microtúbulos, microfilamentos, y/o filamentos intermedios de la célula.
En un aspecto, el ligando es un lípido, o una molécula basada en lípido. Este lípido o esta molécula basada en lípido, de preferencia, se enlazan con una proteína de suero, por ejemplo suero de albúmina. En una modalidad alternativa, a las previamente nombradas, se empacarán los virus.
Para la preparación de las soluciones inyectables de virus se preparan diluyendo la concentración de virus necesaria en PBS (buffer fosfato salino) cuya formulación es la siguiente.
PBS 1x
1. - Disolver la dosis viral en 800 mi de agua destilada con:
8 g of NaCI
0,2 g of KCI
1 ,44 g of Na2HP04
Figure imgf000027_0001
2. Ajusfar el pH to 7,4 con HCI.
3. Ajustar el volume a 1 L con agua destilada adicional H20.
4. Esterilizar y autoclavar. Diseño y Selección
El control de la expresión de la versión mutante de la huntingtina es clave para mejorar o curar la enfermedad de Huntington.
En la célula existen varios mecanismos capaces de degradar proteínas mal plegadas incluyendo la degradación asociada al RE y la autofagia. Sin embargo, es muy difícil degradar de manera selectiva una proteína en concreto. Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha indican que IGF2 es capaz de reducir, de alguna manera, la expresión de huntingtina, reduciendo así su función tóxica.
Además de requerir la modulación de la síntesis local de proteínas, la mejora o cura para la enfermedad de Huntington implica otros aspectos en la ruta secretora incluyendo la síntesis y el tráfico de diversos receptores de membrana y canales iónicos, aumento en la señalización de calcio, la síntesis de membranas y el ensamblaje de complejos de proteínas. Sin embargo, se descubrió una singular función de IGF2 de manera preferencial pero no exclusiva, en el cuerpo estriado (striatum) y corteza (cortex). El ejemplo de aplicación, aquí descrito, proporciona la prueba de que IGF2 disminuye la expresión de la mHtt y aumenta la viabilidad neuronal, frenando el desarrollo de la enfermedad de Huntington.
Analizando los alcances biomédicos de la utilización como terapia, se proporcionó un método efectivo e innovador para mejorar o tratar la enfermedad de Huntington, en los que el uso de esta tecnología genera resultados sorprendentes en su aplicación.
Experimentalmente, se había visto que la sobreexpresión de IGF2 en el contexto de EH, disminuye de manera drástica los agregados de péptidos de poliglutaminas, así como huntingtina mutante. Además, se observó un efecto neuroprotector, con un aumento de la supervivencia de neuronas espinosas de tamaño medio. Estudios previos con un modelo de la EH concluyeron que la deficiencia del factor de transcripción XBP1 en neuronas del SNC tenía un efecto neuroprotector en esta enfermedad, disminuyendo la cantidad de agregados y mejorando la viabilidad neuronal. (Esto se puede ver en los ejemplos de aplicación).
Para definir los posibles mecanismos subyacentes a los efectos protectores observados en los animales deficientes en XBP1 en el sistema nervioso se realizó un análisis de perfil global de la expresión génica de 53 animales, incluyendo el cuerpo estriado y la corteza cerebral de ratones deficientes en XBP1 en un contexto de la EH usando el modelo de Huntington YAC128. De este estudio se obtuvo IGF2 como el gen cuya expresión se veía más afectada por la deleción de XBP1 , tal como se ve en la figura 1719. Además, fue el único que coincidió con un estudio llevado en paralelo donde se hizo una secuenciación del ARNm de ratones deficientes en XBP1.
Estos resultados se confirmaron midiendo por qPCR (PCR cuantitativo) los niveles de Igf2 en distintas regiones del cerebro de ratones deficientes de XBP1. Se observó que los niveles endógenos de ARNm de Igf2 se incrementaban significativamente en corteza (cortex) y en el cuerpo estriado (Striatum), tal como se presenta en la figura 2/19, respectivamente. Estos datos muestran que IGF2 está implicado de alguna manera en la protección observada en los ratones XBP1 KO.
Con el fin de estudiar la contribución de IGF2 a EH, se exploró su actividad en modelos celulares que expresan transitoriamente el péptido polyQ79 fusionado con GFP en células Neuro2a. La co-expresión de IGF2 y polyQ79- GFP en células Neuro2a logró disminuir drásticamente el número de inclusiones de proteínas y los agregados según la evaluación de tres metodologías diferentes, incluyendo imágenes fluorescentes, Western blot y filter trap (trampa de filtro), una técnica que permite evaluar agregados de gran tamaño (Figuras 3/19, 4/19, 5/19) respectivamente).
A continuación, se probó si los efectos observados se deben al IGF2 secretado o su acumulación intracelular. Así, se expresó el péptido polyQ79 o mHTTQ85-GFP en células Neuro2a en presencia de un medio enriquecido con IGF2. Consistentemente, IGF2 redujo los agregados de polyQ y mHtt (Figuras 6/19 y 7/19).
Por otro lado, se determinó si IGF2 es capaz de "deshacer" los agregados mHtt preexistentes. Con este objetivo, se trataron células Neuro2a que ya expresan polyQ79-GFP o GFP-mHTTQ85 con un medio enriquecido en IGF2. Tal y como se había observado en los anteriores escenarios experimentales, IGF2 disminuyó significativamente la agregación de proteínas en ambos parámetros experimentales (Figura 8/19, 9/19). Tomados en conjunto los resultados obtenidos previamente demuestran un potente efecto anti-agregación en los ensayos de cultivo celular.
Una continuación natural del presente desarrollo fue la realización de experimentos preliminares in vivo, utilizando un virus adenoasociado del tipo AAV2/2 (26). Dentro de la secuencia de este virus se clonó, con el fin de detectar mejor la expresión del péptido, una versión de IGF2 marcada con el epitopo HA. En la primera aproximación se inyectaron partículas virales que expresaban mHtt en presencia o ausencia de IGF2. Dos semanas después se analizó el estriado de estos animales observándose una disminución de los niveles de expresión de la huntingtina muíante como se observa en la figura 10/19.
En una aproximación más fisiológica se quisieron tratar animales transgénicos que expresan la huntingtina humana mutada (modelos YAC128). Animales neonatos de 1-2 días de edad fueron inyectados intraventricularmente con AAV-IGF2/HA. 6 meses después los animales se sacrificaron para obtener tejido. Tras el tratamiento con el AAV se observó una disminución notable de la expresión de mHtt en los animales inyectados con IGF2/HA versus la condición control como queda reflejado en la figura 11/19. De modo similar, se trataron individuos adultos; estos animales fueron inyectados con AAV-IGF2/HA a los tres meses y sacrificados para la obtención de tejido a los 6 meses de edad. Como se observa en la figura 12/19 el tratamiento con IGF2/HA redujo los niveles de expresión de mHtt comparado con la condición control. También dentro de los mismos estudios se realizaron estudios para verificar la mejora motora en ratones con EH expuestos al AAV modificado con IGF2, tal como se ve en la figura 13/19.
Por otro lado, se realizaron experimentos donde se midieron los niveles de IGF2 en extractos proteicos de caudado/putamen de pacientes de EH e individuos control. Los resultados entregaron que en los pacientes con EH, el contenido de IGF2 apenas se expresa sugiriendo su implicancia en el desarrollo de la patología. Conforme a lo propuesto en esta patente, consideramos que la presente patente, también logra la restauración de los niveles fisiológicos de IGF2 mejorando la sintomatología de la enfermedad, tal como se presenta en la figura 19/19.
Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (AAV), éste comprende al genoma recombinante viral que comprende un cásete de expresión que incluye una región regulatoria transcripcional tejido especifica hipocampal operativamente unida al polinucleótido de interés.
Los virus adenoasociados (AAV), en general, corresponden a 42 serotipos y son derivados de los parvovirus. En general los diferentes serotipos de AAV son secuencias genómicas con una homología significativa a nivel de aminoácidos y ácidos nucleicos, los cuales proveen idénticas funciones genéticas, proveen vibriones que son esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación, ensamblaje utiliza prácticamente los mismos mecanismos. En particular en la presente invención se utilizó el AAV serotipo 2/2 con el número de acceso J0 90 .1 (AAV2/2), tal como se presenta en la Tabla I.
El genoma de los AAV de acuerdo a la presente invención, comprenden 5 un actuador en cis 5' y una secuencia de repetición terminal invertida en 3' y un cásete de expresión. Las secuencias ITR o LTR tienen 141 pares de bases de largo. Preferiblemente, la secuencia completa de los LTRs es usada en la molécula y solo se permiten leves modificaciones de las secuencias. En una forma preferente del presente invento, el genoma recombinante del AAV í o comprende los 5' y 3' AAV LTRs.
Por otro lado, los ITRs pueden provenir desde otros serotipos de
AAV.
15 El AAV de la presente invención comprende una cápside de cualquier serotipo. En particular para la presente invención se prefiere la cápside derivada del serotipo 2.
En algunas realizaciones, una cap del AAV para uso en el método de la 20 invención puede ser generada por mutagénesis (es decir, inserciones, deleciones o sustituciones) de uno de los AAV caps o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la cap de AAV es de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% o más similar al mencionado casquillo de AAV.
25 En algunas realizaciones, el cap de AAV es quimérico, comprende los dominios de dos, tres, cuatro, o más de los mencionados AAV caps. En algunas realizaciones, el cap del AAV es un mosaico de los monómeros VP1 , VP2, VP3 y procedentes de dos o tres AAV diferentes o un AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, una composición de rAAV comprende más de uno de los mencionados CAPS.
En algunas realizaciones, un CAP AAV para su uso en una composición de rAAV está diseñado para contener una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, una secuencia de péptido o proteína que confiere focalización selectiva o la evasión inmune puede ser por ingeniería genética en una proteína Cap. Alternativamente, o además, la Cap puede ser modificada químicamente de manera que la superficie de la rAAV presente modificaciones químicas específicas, a modo de ejemplo polietileno glicolado, lo que puede facilitar la evasión inmune. La proteína Cap también puede generarse mutagenizado (por ejemplo, para eliminar su receptor natural de unión, o para enmascarar un epítopo inmunogénico).
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de una secuencia de IGF2 o IGF2-HA de origen murino que se pueden seleccionar de las siguientes tablas: Tabla IV {Igf2) y Tabla V (Igf2-HA), NCBI secuencias de referencia NM_010514.3, NM_001 122736.2, NM_001 22737.2, NM_00 315488.1 y NM_001315489.1 , correspondientes a las variantes transcripcionales 1 , 2, 3, 4 y 5 cuyo producto proteico es igual y esta codificado por la secuencia representada en las tablas. En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de una secuencia de IGF2 o IGF2-HA de origen humano que se pueden seleccionar de las siguiente tabla: Tabla VII (Igf2 humano), NCBI secuencias de referencia NM_000612.5, NM_001007139.5, NM_001127598.2, NM_001291861.2, NM_00129 862.2 correspondientes a las variantes transcripcionales 1 , 2, 3, 4 y 5 cuyo producto proteico es igual y esta codificado por la secuencia representada en la tabla.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor de expresión eucariota con la adición de al menos una secuencia de Igf2, que se puede seleccionar de la tabla IV, quedando como se presenta en la tabla II. En una realización, el vector de AAV contiene un promotor de expresión eucariota con la adición de al menos una secuencia de Igf2-ha que se puede seleccionar de la tabla V, quedando como se presenta en la tabla III.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor de expresión eucariota con la adición de al menos una secuencia de Igf2 humano, que se puede seleccionar de la tabla VII.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia tiene una homología de 85% con una secuencia seleccionada de las listas mencionadas anteriormente, tabla II y tabla III. En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia que tiene una homología de 70% con una secuencia seleccionada de las tablas mencionadas anteriormente.
En una realización, el vector de AAV contiene un promotor con la adición de al menos una secuencia que es un equivalente funcional con una secuencia seleccionada de las tablas mencionadas. La región reguladora de la transcripción puede comprender un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora. Preferiblemente, el promotor es un promotor de expresión génica eucariota, seleccionado del presente listado: CAG (CAG es un promotor que contiene secuencias correspondientes al elemento potenciador temprano de citomegalovirus (CMV), el promotor, el primer exón y el primer intron del gen beta-actina de pollo, y el aceptor de splicing del gen de beta-globina de conejo), CMV, b-globina, CBA, elFalpha, entre otros. El potenciador no necesita ser específico para el tejido neuronal.
En una realización, el promotor es específico, es el promotor de citomegalovirus o CMV.
En una realización, el promotor es específico, es el b-globina.
En una realización, el promotor es específico, es CAG. En una realización, el promotor es específico, el de la Factor-1 alfa de elongación humana, también conocido como elFalpha.
En otra realización, el cásete de expresión que forma parte del AAV de la invención comprende además una región de regulación post-transcripcional. En una realización preferida, la región reguladora post-transcripcional es la región post-transcripcional del virus de hepatitis de la marmota (WPRE) o variantes funcionales y fragmentos de las mismas y el PPT-CTS o variantes funcionales y fragmentos mismos. En una realización particular, la región regulatoria post- transcripcional es WPRE.
El cásete de expresión que forma parte del AAV de acuerdo con la invención comprende un "polinucleótido de interés". En una realización preferida, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa sistémicamente. En otra realización, el polinucleótido de interés codifica una proteína que actúa dentro de una neurona. En una realización preferida, la proteína que actúa dentro de dicha neurona es IGF2, incluyendo cualquiera sus isoformas que varían en localizaciones sub-celulares e incluyendo cualquiera de sus isoformas marcadas con cualquier epitopo.
El límite de tamaño de los envases de los vectores de AAV es limitado al tamaño del genoma de AAV de tipo silvestre, que varía en tamaño según el serotipo de AAV (es decir, entre 4087 a 4767). Por ejemplo, AAV-2 nativo tiene un tamaño de genoma aproximado de 4,7 kB. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante pueden ser limitados y una secuencia de codificación deseada pueden implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases el genoma del virus. Genes de gran tamaño pueden, por lo tanto, no ser adecuados para uso en un vector de AAV recombinante estándar, en algunos casos. El experto medio apreciará que las opciones están disponibles en la técnica para la superación de una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, el AAV IRTde dos genomas puede hibridar para formar la cabeza a la cola concatámeros, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de empalme permite la remoción del /F?7después de la transcripción. Otras opciones para la superación de una capacidad de clonación limitada serán evidentes para el experto en la materia.
Vías de administración
Las vías de administración del virus están supeditadas a que el mismo pueda pasar la barrera hemato-encefálica para infectar las neuronas objetivo.
Para lograr este propósito en la presente invención se han definido principalmente 2 vías de administración. La primera de estas vías es la nasal (27), generalmente los medicamentos administrados por vía nasal pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, puede penetrar al cerebro directamente, o en algunos casos puede seguir ambas vías. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo de fármaco a través de cada una de estas vías no están completamente definidos. En general hay tres rutas por las que un fármaco administrado en la cavidad nasal puede viajañ Estas Putas (27) incluyen la entrada en la circulación sistémica directamente de la mucosa nasal (28), la entrada en el bulbo olfatorio por el transporte axonal a través de las neuronas, y la entrada directa en el cerebro (29). La evidencia que apoya el papel de cada una de estas rutas para 5 una variedad de sustratos modelo se resume a continuación para diferentes tipos de virus.
Figure imgf000039_0001
Esta tabla no pretende ser exhaustiva en la naturaleza, sino más bien para o resaltar algunos de los solutos de diferentes clases han demostrado seguir una o más vías.
Otras vías de administración a las células en el SNC han incluido (28): 5 La inyección directa en espacios fluidos, como el humor vitreo en el ojo; o en el fluido cerebral de la columna vertebral a través de diferentes rutas, intraventricular o intratecal (**) para su entrega al plexo coroideo, las capas ependimarias/meníngeas, y desde allí en el cerebro adyacente a través de procesos que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la 0 barrera sangre-cerebro o barreras sangre-tumorales mediante inyección intra- arterial combinada con una interrupción osmótica o farmacológica temporal. El término (**) Intratecal (intra + teca, "dentro de una vaina") es un adjetivo que se refiere a algo que ocurre o es introducido en un espacio anatómico o espacio potencial dentro de una funda, más comúnmente la membrana aracnoides del cerebro o la médula espinal.
Cálculo de Dosis
Según Ulusoy et al (29), la titulación del vector requiere un rango entre 109 a 1013 copias de genoma (CG) por mi con una dosis probada entre 1010-1012 gc/ml. Por otra parte, en cualquier tasa de dilución de los vectores a titular tienen que tener un rango bajo-medio de 1011 gc/ml, lo cual resulta en la desaparición de la toxicidad. Dosis en humanos:
El rango de dosis en humanos se encontraría en el rango de entre 109 a 030 unidades virales/Kg de peso, sin restringir este rango a la aplicación en grupos etarios diferentes o con volúmenes de distribución modificados por edad o patología.
La máxima concentración o nivel de una sustancia, hallada experimentalmente o por observación, que no causa alteraciones adversas detectables en la morfología, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguibles de los observados en organismos normales (control) de la misma especie y cepa, bajo condiciones definidas de exposición.
Método de aplicación
Los vectores rAAV2 se inyectaron bilateralmente en el estriado usando una jeringa Hamilton de 5μΙ equipada con un capilar de vidrio con un diámetro de la punta de alrededor de 60-80 mieras. Dos microlitros de tampón que contiene las concentraciones apropiadas de partículas virales se inyectaron a una velocidad de 0,4 μΙ/minuto. La aguja se retira lentamente 5 minutos después de la finalización de la inyección.
Descripción de Figuras Figura 1/19
Esta figura presenta el conjunto de genes destacados cuya expresión
i
varió en el estudio de expresión génica que se hizo en los animales deficientes para XBP1 en el contexto de la EH. Los niveles de Igf2, Mmp14, Lrp4 y Uhrf, cambiaron en los distintos grupos tanto en corteza (cortex) como en el cuerpo estriado (striatum), en ratones transgénicos con huntingtina muíante humana (YAC128) en carnadas deficientes de XBP1 y animales de control.
Claramente se aprecia que tanto en corteza (cortex) como en el cuerpo estriado (striatum), se ve una regulación al alza para el gen Igf2. Figura 2/19
Los resultados obtenidos en el estudio presentando en la Figura 1/19 fueron confirmados por PCR cuantitativa (qPCR). Esta figura presenta a la izquierda resultados en corteza (Cortex) y a la derecha resultados en cuerpo estriado (Striatum), la regulación al alza del ARNm de Igf2 en modelos de ratones deficientes en XBP1 en su cerebro. Mediante esta técnica se observó que los niveles de ARNm de Igf2 endógenos son significativamente incrementados en corteza (cortex) y cuerpo estriado (striatum) en los animales deficientes en XBP .
Para todos los experimentos in vivo se utilizó un n=5, t-student **p<0,05.
Figura 3/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de mHTT en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington. En específico células Neuro2a fueron transfectadas transientemente con vectores para polyQ79-EGFP y IGF2 o control. Posteriormente se evaluó y cuantificó la agregación de polyQ.
Esta figura presenta la fotografía por microscopía por fluorescencia y la cuantificación de esa fluorescencia a su derecha, luego de 24 y 48 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in vitro se utilizó un n=3, t-student ***p<0,001. Figura 4/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de péptidos polyQ en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington.
En específico células Neuro2a fueron transfectadas transientemente con vectores para polyQ79-EGFP y IGF2 o control. Posteriormente se evaluó y cuantificó la agregación de polyQ. Esta figura presenta la fotografía de los Western Blot y la cuantificación a su derecha, luego de 24 y 48 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in vitro se utilizó un n=3, t-student ***p<0,001. Figura 5/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de péptidos de polyQ en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington. En específico células Neuro2a fueron transfectadas transientemente con la vectores para polyQ79-EGFP y IGF2 o control. Posteriormente se evaluó y cuantificó la agregación de polyQ. Esta figura presenta la fotografía del filter trap (trampas de filtración) y la cuantificación a su derecha, luego de 24 y 48 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in vitro se utilizó un n=3, t-student***p<0,001. Figura 6/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de mHTT en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington. En específico células Neuro2a fueron transfectadas transientemente con vectores para polyQ79-EGFP, mHTTQ85-GFP en presencia de un medio enriquecido en IGF2 o control. 24 horas después se evaluó y cuantificó la agregación proteica. Esta figura presenta la fotografía por microscopía por fluorescencia y la cuantificación de esa fluorescencia a su derecha, luego de 24 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in vitro se utilizó un n=3, t-student ***p<0,001. Figura 7/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de mHTT en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington.
En específico células Neuro2a fueron transfectadas transientemente con vectores para polyQ79-EGFP, mHTTQ85-GFP en presencia de un medio enriquecido en IGF2 o control. 24 horas después se evaluó y cuantificó la agregación proteica.
Esta figura presenta la fotografía por Western Blot y la cuantificación a su derecha, luego de 24 horas de la transfección. Para todos los experimentos in Vitro se utilizó un n=3, t-student
***p<0,00t
Figura 8/19 Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de mHTT en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington.
En específico para testear si IGF2 era capaz de reducir las inclusiones previamente formadas de polyQ o mHTTQ85-GFP, células que expresaban inclusiones detectables fueron tratadas con un medio enriquecido con IGF2 o control. 24 horas después se evaluó y cuantificó la agregación proteica.
Esta figura presenta la fotografía por Western Blot y su cuantificación a la derecha, luego de 24 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in Vitro se utilizó un n=3, t-student ***p<0,001. Figura 9/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye lós niveles de los agregados de mHTT en un modelo celular Neuro2a para la enfermedad de Huntington.
En específico para testear si IGF2 era capaz de reducir las inclusiones previamente formadas de polyQ o mHTTQ85-GFP, células que expresaban inclusiones detectables fueron tratadas con un medio enriquecido con IGF2 o control. 24 horas después se evaluó y cuantificó la agregación proteica.
Esta figura presenta la fotografía de un filter trap (trampa de filtro) y su cuantificación a la derecha, luego de 24 horas de la transfección.
Para todos los experimentos in Vitro se utilizó un n=3, t-student ***p<0,001. Figura 10/19
Esta figura presenta como la expresión de IGF2 disminuye los niveles de los agregados de mHTT en un modelo murino YAC128 para la enfermedad de Huntington.
En específico animales silvestres fueron co-inyectados por estereaotaxis en el estriado con AAVs que expresaban un fragmento de la mHtt con IGF2-HA o control. 2 semanas después se evaluó y cuantificó la agregación proteica de mHTT.
Esta figura presenta la fotografía de un Western Blot y su cuantificación a la derecha, luego de 2 semanas de la transducción.
Para todos los experimentos in vivo se utilizó un n=5, t-student **p<0,05. Figura 11/19 Esta figura presenta como la expresión IGF2 desde el virus AAV disminuye los niveles de los agregados de polyQ en un modelo murino YAC128 para la enfermedad de Huntington.
En específico, se inyectaron AAVs expresando IGF2 o control en el estriado de ratones YAC 28 adultos de 90 días. Tres meses después de la inyección, se evaluaron los niveles de agregación de mHtt asi como DARPP-32 como reflejo de la viabilidad de las neuronas del estriado.
De manera similar a lo observado in vitro, se encontró disminución en la expresión de mHtt y un aumento en los niveles de DARPP, donde esta proteína es representativa de la viabilidad de las neuronas principalmente afectadas por esta enfermedad de Huntington. Por lo que la existir mas DARPP, se concluye que hay menor muerte neuronal. Para todos los experimentos in vivo se utilizó un n=5, t-student **p<0,05.
Figura 12/19
Esta figura presenta como la expresión IGF2 desde el virus AAV disminuye los niveles de los agregados de polyQ en un modelo murino YAC 28 para la enfermedad de Huntington.
En específico, se inyectaron AAVs expresando IGF2 o control intraventricularmente en animales YAC128 neonatos de 1 o 2 días de edad. Seis meses después de la inyección, se evaluaron los niveles de agregación de mHtt. De manera similar a lo observado in vitro, se encontró disminución en la expresión de mHtt.
Figura 13/19 Esta figura presenta como la expresión de IGF2 en un modelo murino YAC128 para la enfermedad de Huntington logra corregir los problemas motores generados por la enfermedad.
En específico, se realizaron pruebas motoras en ratones YAC128 inyectados bilateralmente por estereotaxis con AAV-IGF2/HA o AAV-Control. Se tomaron registros cada dos semanas, durante dos meses. Esta figura presenta un gráfico del comportamiento en respuesta a la prueba de Rotarod en el tiempo bajo el efecto del AAV2/IGF2-HA.
Figura 14/19
La figura superior señala en lugar de inyección en ratones neonatos.
La figura inferior presenta el lugar donde se inyectan los AAVs intra- cerebralmente en el estriado de un ratón adulto.
Figura 15/19
La presente figura muestra un esquema del genoma de AAV.
REP: Genes envueltos en el mecanismo de replicación de AAV.
VP: Genes envueltos en la formación y armado de la cápside.
ITR: Es el equivalente a LTR, secuencia repetida invertida terminal. Figura 16/19
Esta figura presenta el vector del virus AAV con el inserto IGF2-HA con la siguiente descripción específica según la tabla II.
Figura 17/19
Esta figura presenta el vector del virus AAV con el inserto IGF2 con la siguiente descripción específica según la tabla III.
Figura 18/19
Esta figura presenta la confirmación de la expresión de los constructos virales generados. Para eso se transfectaron células HEK con los distintos constructos, luego de 24 horas de transfección se extrajeron las proteínas que fueron evaluadas mediante WB utilizando anticuerpos anti-IGF2 y anti-HA.
Finalmente, se detecta una banda del peso molecular esperado para IGF2 (17 kDa) e IGF2-HA (18kDa) en las células transfectadas con los plásmidos pAAV-IGF2 y pAAV-IGF2-HA respectivamente.
Figura 19/19 En esta figura se muestran los niveles proteicos de IGF2 en pacientes con EH y con individuos control. Se encontró que en los pacientes con EH, el IGF2 apenas se expresa sugiriendo una implicación en el desarrollo de la patología. Las figuras de la izquierda presentan un Western blot para IGF2, a la derecha de la figura se muestra la cuantificación de la marca y la marcada baja de la misma en pacientes con EH.
EJEMPLO DE APLICACIÓN PRUEBA EXPERIMENTAL 1
Se realizó un experimento in vivo en modelos de ratones jóvenes-adultos WT. Se co-inyectó el virus transformado de AAV que expresa un gran fragmento de la mHtt humana (588 bis) acoplado a RFP y AAV/IGF2-HA o control en el cuerpo estriado (Striatum) mediante estereotaxia cerebro (figura 14/18).
Después de dos semanas, los animales se sacrificaron y se diseccionó el cuerpo estriado. Tal y como se esperaba por los resultado in vitro previos, se observó una clara disminución de la agregación de mHtt después de la administración IGF2 (Figura 10/18).
PRUEBA EXPERIMENTAL 2
Para evaluar la efectividad del tratamiento con IGF2, se utilizó un modelo más fisiológico que expresa la mHtt humana bajo su propio promotor. En esta estrategia experimental se demostró que el tratamiento con AAV- IGF2, disminuía de manera notable de los niveles de huntingtina muíante. Además, se observó una mayor viabilidad neuronal como demuestra el aumento de los niveles de DARPP32. (Figura 11/18)
En específico, se probó si los AAVs que expresan IGF2-HA, en comparación con el control, inyectados por cirugía estereotaxica dentro del cuerpo estriado (striatum), lograban el efecto de disminuir la agregación mejorando así la viabilidad neuronal.
3 meses después se evaluó y cuantificó la expresión de mHtt y los niveles de expresión de la proteína DARPP-32. Se observo claramente una disminución de la expresión de mHtt y un aumento de los niveles de DARPP, donde esta proteína es representativa de la viabilidad de las neuronas principalmente afectadas por esta enfermedad de Huntington. Por lo que la existir mas DARPP, se concluyó que hay menor muerte neuronal.
Para todos los experimentos in vivo se utilizó al menos un n=4, t-student **p<0,05.
PRUEBA EXPERIMENTAL 3 En este experimento se buscó estudiar si el tratamiento con AAV-IGF2- HA, logra corregir los problemas motores generados por la enfermedad. (Figura 13/18). Con este objetivo los animales se inyectaron por estereotaxis bilateralmente en el estriado con AAV-IGF2-HA o AAV-control.
Durante tres meses y cada dos semanas, se les hizo esta prueba motora con el objetivo de cuantificar la progresión de la enfermedad. Se observó que los animales tratados con AAV-IGF2-HA mostraban una mejor actividad motora que sus hermanos tratados con el AAV-control.
Para todos los experimentos in vivo se utilizó un n=5, t-student **p<0,05.
Materiales y métodos
Cultivos celulares
Las células Neuro2a son derivadas de un neuroblastoma murino y son ampliamente utilizadas como modelos celulares. Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10%, glutamina 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina en atmósfera de C02 al 5% a 37°C. Las células se conservan congeladas a -80°C en FBS al 0% de DMSO en el caso de las N2a. Para el mantenimiento de la línea se dieron pases cada dos o tres días tripsinizando las células de las botellas de cultivo y tras recoger las células y centrifugar, se resembraron en pases 1 :3-1 :6 según las necesidades. Transfecciones celulares.
Las transfecciones celulares se realizaron utilizando el reactivo catiónico Effectene siguiendo las instrucciones del fabricante.
Animales y Procedimientos Quirúrgicos:
Los ratones inyectados en la edad adulta fueron inyectados a los 90 dias de edad. Los ratones inyectados en estado neonato se inyectaron entre los días postnatal 1 y 2. Según el experimento se utilizaron ratones silvestres (WT) o ratones YAC y sus hermanos silvestres como control. En todos los casos la cepa utilizada fue C57BL/6. Los ratones fueron mantenidos en un ciclo de luz- oscuridad de 12:12 h y tenían acceso libre a comida y agua. Para todos los experimentos en animales presentados en este desarrollo se utilizaron las directrices establecidas por el comité de cuidado y uso de animales en la Universidad de Chile, Chile.
Generación de ratones transgénicos YAC 28.
A partir de un cromosoma artificial de levaduras (YAC por sus siglas en inglés) que contenía el gen completo de la huntingtina humana, se modificó con una expansión de 128 repeticiones de glutamina en el exon 1. El constructo resultado, YAC128, se inyecto en pronúcleos de la cepa FVB/N. La línea fundadora número 53 se estableció como línea transgénica. Para obtener la cepa C57BL/6 se realizaron retrocruzas para asegurar el background del animal. Inmuno-transferencia o "Western blot".
La extracción de proteínas totales se hizo a partir de cultivos de células N2a, o tejidos disectados de animales silvestres o transgénicos según el caso. Las células se recogieron en tampón PBS-Triton 1% con inhibidores de proteasas y fosfatases.
Las muestras fueron preparadas a la concentración deseada en tampon de carga. Entre 25 y 100 ug de proteína fueron cargadas en geles de poliacrilamida. La electroforesis se desarrolló en un sistema mini-Protean 3 en tampón de electroforesis de glicina. Tras la separación electroforética, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF previamente hidratadas en methanol y equilibradas durante 5 minutos en tampón de transferencia, utilizando un sistema mini-Trans Blot.
Los ensayos de filter trap se realizaron a partir de los mismos extractos proteicos preparados en SDS 1%. Entre 25-50 ug de proteína se cargaron en el soporte de filter trap usando una membrane cuyo poro es <0,22 um.
Pruebas de comportamiento:
Todos los experimentos se realizaron a ciegas, y distintas cohortes de animales se utilizaron para cada ensayo de comportamiento.
Rotarod De manera resumida, los ratones se someten a un entrenamiento que consiste en 4 días durante los cuales los animales toman contacto con el rotarod, la tarea y el experimentador. El día 5 se lleva a cabo el test donde se mide el tiempo que el animal permanece en el rotarod con una aceleración de 4 a 40 rpm en 120s. La prueba continuó hasta que todos los ratones caen de la varilla. Se registró la latencia en caer y las rpm en el momento de la caída para cada ratón. Se realizaron tres ensayos por ratón y se promediaron. Producción de vectores Adeno-asociados
Las partículas del virus AAV serotipo 2 (AAV2/2) fueron producidos por la transfección de células 293-AAV (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se purificaron en un gradiente de iodixanol seguido por cromatografía de afinidad en columna. El número de partículas de AAV que contiene el genoma en la suspensión, así como la infectividad de la suspensión del vector en células HEK293T se determinaron mediante ensayos TaqMan qPCR.
Preparación del plásmido adenoviral (pAAV) para IGF2-HA.
Para el desarrollo de este objetivo, la secuencia de IGF2 murino fue clonada en el plásmido adenoviral pAAV-MCS, el cual expresa el transgen bajo el promotor CAG. A partir del ADNc clonado en un vector pSPORT6 amablemente cedido por el Dr. Oliver Bracko se realizaron PCRs que nos permitieron obtener Igf2 e /gf2-HA para subclonar en el vector pAAV-MCS. El ADNc IGF2-HA, que codifica C-terminal HA-etiquetados, se generó mediante amplificación por PCR de lgf2-EcoR1 SN2 y Igf2-HA-Bgl II AS
-partidor sentido
5'GGCGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTG3';
-partidor anti-sentido-HA
5'ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTGATG GTTGCTGG3'
-partidor anti-sentido
GGCAGATCTTCACTGATGGTTGCTGG
Debido a la poca eficiencia de los anticuerpos que reconocen IGF2 en tejido murino, se incluyó la secuencia del tag HA en la estrategia de clonamiento, que luego permitió identificar las células transducidas y la expresión de IGF2 (Sin excluir otras secuencias epitopo para identificar las células transducidas como FLAG, GFP, His y Myc, entre otras). Por lo tanto, se amplificó IGF2 con la secuencia del tag HA en el extremo 3'. Los clones obtenidos fueron confirmados mediante secuenciación de ADN. De esta forma, generamos los constructos pAAV-CAG- IGF2-HA y pAAV-CAG- IGF2 que codifican para la proteína fusión IGF2 con y sin el tag respectivamente. El plásmido adenoviral vacío pAAV CAG vacío fue utilizado como control.
Para confirmar la expresión de los constructos generados transfectamos células HEK con los distintos constructos, luego de 24 horas de transfección realizamos la extracción de proteínas que fueron evaluadas mediante WB utilizando anticuerpos anti-IGF2 y anti-HA.
Finalmente, como se observa en la figura 18/18, detectamos una banda del peso molecular esperado para IGF2 (17 kDa) e IGF2-HA (18kDa) en las células transfectadas con los plásmidos pAAV-IGF2 y pAAV-IGF2-HA respectivamente.
Inyecciones estereotáxicas
Los ratones se anestesiaron usando anestesia ketamina/xilazina (Ketamina: 100 mg/kg, xilazina: 10 mg/kg, Vetcom, Chile), y se colocaron en un estereotáxico con sujeción en boca, nariz y orejas para los ratones (David Kopf Instruments, EE.UU.). Según el experimento, se realizaron inyecciones uni o bilaterales de AAV-mHTT-RFP, AAV-IGF2-HA o AAV-vacío (control), con las siguientes concentraciones: 1 ,96 x 1012, 1x1013 y 1 ,2 x1013 unidades de transducción/μΙ respectivamente. Se inyectaron 2μΙ de AAV se realizó en un solo punto, en la región del estriado utilizando una jeringa Hamilton de 5 μΙ (Hamilton, EE.UU.) en las siguientes coordenadas: AP: +0,07 cm, ML: -0,2 cm, DV: -0,31cm (de acuerdo con el atlas de Paxinos y Franklin, 1997). La inyección se llevó a cabo a una velocidad de 0,5 μΙ/min y la aguja se deja en su lugar durante 5 min antes de la retracción de la aguja. La expresión de mHTT se estudió por WB tal como muestra la figura 10/18. La expresión de IGF2 se verifico por PCR convencional. Preparación de tejidos para el análisis bioquímico
Los ratones fueron sacrificados por narcosis de CO2, los cerebros se retiraron, y la corteza y el estriado de ambos hemisferios se diseccionaron rápidamente en una placa colocada sobre hielo. El tejido se homogeneizó en tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,4) suplementado con una mezcla de inhibidores de la proteasas y fosfatasas (Roche ciencia aplicada, EE.UU.). El homogeneizado fue dividido para obtener ARNm y la extracción de proteínas fue seguida por protocolos de purificación y cuantificación estándar.
Extracción de ARN, PCR en tiempo real y PCR convencional
El ARN total fue aislado de la corteza y el estriado. Después de la homogeneización en PBS se siguió el protocolo de extracción de ARN Trizol recomendado por el fabricante. El ADNc se sintetizó con un kit de ADNc de transcripción reversa de alta capacidad (Applied Biosystems). Para el RT-PCR cuantitativo se empleó Eva Green y el equipo Mx3005P de Stratagene. La cantidad relativa de ADNc se calculó por el método de ciclo umbral comparativo con β-actina como control. Para el PCR convencional se utilizó el master mix Go Taq Green de Promega. Los primers de las secuencias se obtuvieron a partir del PrimerBank (Tabla VI).
Tabla VI
Objetivo Sentido Anti-sentido igf≥ GTC GCA TGC TTG CCA AAG AG GGT GGT AAC ACG ATC AGG GG
Igf2-HA GTC GCA TGC TTG CCA AAG AG TAG ACG TAA TCT GGA ACA TCG
Actina TAC CAC CAT GTA CCC AGC A CTC AGG AGGAGC AAT GAT CTT
GAT
Western blot. La extracción de proteínas a partir del tejido de ratón se llevó a cabo en tampón RIPA (20 mM Tris pH 8,0, NaCI 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato, 0,5% de Tritón X-100) que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa y una mecía de inhibidores de la fosfatasa (Sigma, EE.UU.). La extracción de proteínas a partir de líneas celulares se llevó a cabo en Tritón al 1% en PBS conteniendo inhibidores de proteasas y fosfatasas. Las muestras se cuantificaron con el kit de ensayo BCA (Pierce, EE.UU.). Extractos celulares totales se separaron por SDS-PAGE y fueron transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el análisis de inmunoblot: anti-Hsp90 (1 :3000, Santa Cruz), anti-IGF2 (1 :1000 Abcam), anti-polyQ (1 :1000 Sigma), anti-GFP (1 :1000 Sta Cruz), anti-DARPP32 (1 :1000 Cell Siganlling), anti-tubulin (1 :3000, Millipore).
Cultivos y transfecc iones neuronales Las células Neuro2A se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio
DMEM suplementado con 5% de suero bovino y antibióticos (10000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina), a 37°C y 5% de CO2. Estadísticas
Los datos se expresan como media y SE . En función de los experimentos, los resultados fueron comparados estadísticamente utilizando la prueba T de Student o la prueba de Mann-Whitney, de dos vías ANOVA seguido por Holm-Sidack o Bonferroni como prueba post-hoc o Kruskal-Wailis ANOVA de una vía en rangos seguidos por el Método de Dunn o Bonferroni como prueba post-hoc.
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Características y secuencia del plásmido pAAV/2-MCS.
GenBank: AF043303.1
Origen
1 TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 61 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG 121 GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG 181 GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT
241 GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA 301 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG 361 ACCTTGACGA GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG 421 AATGGGAGTT GCCGCCAGAT TCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA 481 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC
541 CGGAGGCCCT TTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC 601 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG 661 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG 721 TCACAAAGAC CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAACAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC 781 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC
841 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA 901 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC 961 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA 1021 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATAC ATCTCCTTCA 1081 ATGCGGCCTC CAACTCGCGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCG GGAAAGATTA
1141 TGAGCCTGAC TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTG GAGGACATTT 1201 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAA TATGCGGCTT 1261 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATC TGGCTGTTTG 1321 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACT GTGCCCTTCT 1381 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTC GACAAGATGG
1441 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCC AAAGCCATTC 1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACCCGA 1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG AACTCAACGA 1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC ACCCGCCGTC 1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA 1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA 1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC 1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTAC CAAAACAAAT 1921 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGC GAGAGAATGA 1981 ATCAGAATTG AAATATCTGC TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAG TGCTTTCCCG 2041 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTCGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTG TGCTACATTC 2101 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTC AATGTGGATT 2161 TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGA TTTAAATCAG GTATGGCTGC CGATGGTTAT 2221 CTTCCAGATT GGCTCGAGGA CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTG GAAGCTCAAA 2281 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAG GGGTCTTGTG 2341 CTTCCTGGGT ACAAGTACCT CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGA GCCGGTCAAC 2401 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCT CGACAGCGGA 2461 GACAACCCGT ACCTCAAGTA CAACCACGCC GACGCGGAGT TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA 2521 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAA GAGGGTTCTT 2581 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAA GAGGCCGGTA 2641 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGG CCAGCAGCCT 2701 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGACT GGAGACGCAG ACTCAGTACC TGACCCCCAG 2761 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGAT GGCTACAGGC 2821 AGTGGCGCAC CAATGGCAGA CAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCGGGA 2881 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCA TCACCACCAG CACCCGAACC 2941 TGGGCCCTGC CCACCTACAA CAACCACCTC TACAAACAAA TTTCCAGCCA ATCAGGAGCC 3001 TCGAACGACA ATCACTACTT TGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGA CTTCAACAGA 3061 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAA CTGGGGATTC 3 21 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGT CACGCAGAAT 3181 GACGGTACGA CGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG 3241 GAGTACCAGC TCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCC GCCGTTCCCA 3301 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGG GAGTCAGGCA 3361 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCT GCGTACCGGA 3421 AACAACTTTA CCTTCAGCTA CACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC 3481 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTA TTACTTGAGC 3541 AGAACAAACA CTCCAAGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTC TCAGGCCGGA 3601 GCGAGTGACA TTCGGGACCA GTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG 3661 CGAGTATCAA AGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC 3721 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GCCCGGCCAT GGCAAGCCAC 3781 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGG GAAGCAAGGC 3841 TCAGAGAAAA CAAATGTGGA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGA GGAAATCAGG 3901 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCT CCAGAGAGGC 3961 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGG CATGGTCTGG 4021 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCÁÁ AGATTCCACA CACGGACGGA 4081 CATTTTCACC CCTCTCCCCT CATGGGTGGA TTCGGACTTA AACACCCTCC TCCACAGATT 4141 CTCATCAAGA ACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT 4201 GCTTCCTTCA TCACACAGTA CTCCACGGGA CAGGTCAGCG TGGAGATCGA GTGGGAGCTG 4261 CAGAAGGAAA ACAGCAAACG CTGGAATCCC GAAATTCAGT ACACTTCCAA CTACAACAAG 4321 TCTGTTAATG TGGACTTTAC TGTGGACACT AATGGCGTGT ATTCAGAGCC TCGCCCCATT 4381 GGCACCAGAT ACCTGACTCG TAATCTGTAA TTGCTTGTTA ATCAATAAAC CGTTTAATTC 4441 GTTTCAGTTG AACTTTGGTC TCTGCGTATT TCTTTCTTAT CTAGTTTCCA TGGCTACGTA 4501 GATAAGTAGC ATGGCGGGTT AATCATTAAC TACAAGGAAC CCCTAGTGÁT GGAGTTGGCC 4561 ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC 4621 CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAA
T a b l a I I
Secuencia del vector pAAV2-IGF2
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCC GCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATG TTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCA GTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATG CCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATG CGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACG TCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGG GAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACA AAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATAC [ I I I I I GTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT AATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT ATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCC AGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATC ATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCA AAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCT CATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGT TGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAG CCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCG CCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGT TCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGC CGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCA CCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTGAAGATCTACGGGTGGCATC CCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAA ATTMGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAG GGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATC TTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAG GCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTT'I I I I GGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTC CAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCC TTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGG CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCC CGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCA TCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCG GGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCT TCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTG CTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGT TTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTA TCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAA AATTT CGCGMTTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCG CATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCC GCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCG AGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGG CACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTAT TCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATC AGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGA ACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGG ATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGG GAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTG CGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAG TTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTG GGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGA GTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTC AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTT TTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGG TTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACT GTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAAT CCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGAT AAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAA GCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTC GGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT Características:
IGF2 [1339: 1878-CW] F1 origin [3066 : 2626 - CW] Stop [1339 : 1878 - CW] UTR : [2430 : 2528 - CW] R-ITR :[12: 106-CW] 13 origin : [2621 : 3076 - CW] ColE1 origin : [4472 : 5100 -CW] AmpR : [3661 : 4320 - CW]
Amp Prom : [3393 : 3421 - CW]
Señal hGH polyA : [1889: 2369 - CW]
CMV promotor temprano : [170 : 721 - CW] b Glob interno y potenciador CAG :[820: 1312 - CW]
T a b l a I I I
Secuencia del vector AAV2-IGF2-HA
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGG TCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCC GCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTT ACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATG TTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCA GTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATG CCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATG CGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACG TCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAA TGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGAC GCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGG GAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACA AAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAAT AATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT ATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCC AGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATC ATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCA AAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCT CATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGT TGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTGTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAG CCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCG CCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGT TCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGC CGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCA CCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGAT TACGTCTAAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTC CAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGG GGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAA CCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTC AGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGG TTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGG GATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCC GCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAA AGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCG CCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGC CCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTA GCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGG GGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACG TAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGT TCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATMGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATT GGTTAAAAMTGAGCTGATTTMCAAAAATTTMCGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCAC TCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTG ACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTT TTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAA TAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGMCCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATA CATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGT ATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCC I I I I I I GCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTG GTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGA TCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGMGMCGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTA TCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCAC CAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAA CACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGAT CATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATG CCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCA CTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTT TTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGT CAGACCCCGTAGAAMGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAA AAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCA GCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTG GACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAG AAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAAC GCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGG GGCGGAGCCTATGGAAAMCGCCAGCMCGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACAT GT Características:
IGF2 [1339: 1878- CW] F1 origin [3093 : 2653 - CW] HA [1879: 1908 -CW] L-ITR [89 : 196 -CW] R-ITR :[12:106-CW] T7 : [2587 : 2606 - CW] T7 : [3532 : 3551 - CW] 13 origin : [2648: 3103- CW] ColE1 origin : [4499: 5127 - CW]
AmpR : [3688 : 4347 - CW]
Amp Prom : [3420 : 3448 - CW]
Señal hGH polyA : [1916: 2396 - CW]
CMV promotor temprano : [170: 721 - CW] b Glob interno y potenciador CAG : [820: 1312- CW]
T a b l a I V
Igf2 (Murino)
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTA CGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTA CTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCG ACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTAC TTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCC TGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGA GAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATG TCCAGCAACCATCAG
T a b l a V
Igf2-HA (Murino)
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTA CGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTA CTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCG ACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTAC TTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCC TGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGA GAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATG TCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAA
Tabla VII
IGF2 (Humano)
ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTT ACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTC TACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGT GACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCGACCCCTCCGACCGT GCTTCCGGACAACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAAGCAGTCCACCCAGCG CCTGCGCAGGGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCACGTGCTCGCCAAGGAGCTCGAGGCGTTC AGGGAGGCCAAACGTCACCGTCCCCTGATTGCTCTACCCACCCAAGACCCCGCCCACGGGGGCGCCCCCCCAGA GATGGCCAGCAATCGGAAGTGA

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Un virus adenoasociado (AAV o VAA), CARACTERIZADO porque comprende un genoma viral recombinante donde dicho genoma comprende un cásete de expresión que comprende una región reguladora de la transcripción específica de tejido neuronal unido operativamente a un polinucleótido de interés, Igf2 o Igf2-HA.
2. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el serotipo del VAA está seleccionado de un grupo que comprende VAA1 , VAA2, VAA3, VAA4 y VAAs pseudotipados.
3. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque la región reguladora comprende una región de promotor seleccionada del grupo que comprende CAG, CMV, b-globina, CBA, elFalpha, PGK, entre otros.
4. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 3, CARACTERIZADO porque la región de promotor seleccionada del grupo es CAG.
5. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo HA, FLAG, GFP, His y Myc, entre otras.
6. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con las reivindicación 5, CARACTERIZADO porque la región codificante para un sitio de respuesta inmune es HA.
7. - Un virus adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el serotipo del virus adenoasociado entrega la especificidad del tipo celular que expresará el trasgen dado el tropismo de cada serotipo.
8 - Un virus adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del virus adenoasociado presenta mayor afinidad por células del sistema nervioso.
9.- Un virus adenoasociado, de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el tipo de serotipo del virus adenoasociado es del número 2 y/o un virus pseudotipado 2/2.
10. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende una región regulatoria post-transcripcional.
11. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque la región regulatoria post-transcipcional es el elemento de regulación post-transcipcional del virus de la hepatitis de la marmota americana (WPRE).
12. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 11 , CARACTERIZADO donde los IRTs del virus adenoasociado son IRTs derivados de VAA1 , VAA2, VAA3 y VAA4, de preferencia VAA2.
13. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 1 a 12, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir comprenden Igf2 o Igf2-HA.
14. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es Igf2.
15. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 13 CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es Igf2-HA.
16. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicaciones 1 a 15, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica proteínas dentro del grupo, que comprende IGF2 o IGF2-HA, las cuales actúan sistémicamente cerca o con células nerviosas neuronales o células nerviosas no neuronales, como también intra o extracelularmente.
17. - Un virus adenoasociado, de acuerdo a la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica la proteína IGF2.
18.- Un virus adenoasocíado, de acuerdo á la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica la proteína IGF2- HA.
19 - Un virus adenoasocíado, de acuerdo a la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés actúa sobre células neuronales.
20. - Una composición farmacéutica, CARACTERIZADA porque comprende un virus adenoasocíado descrito en las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
21. - Una composición farmacéutica, según la reivindicación 20, CARACTERIZADA porque comprende una dosis del virus en un rango entre 109 a 1013 copias de genoma (CG) por mi de composición.
22. - Uso de una composición farmacéutica, según la reivindicación 20, CARACTERIZADO porque es útil en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Huntington, en mamíferos.
23. - Uso de un virus adenoasocíado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque es útil en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la enfermedad de Huntington, en mamíferos.
Uso de un virus adenoasocíado, según la reivindicación CARACTERIZADO porque ése mamífero, es un humano.
25. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque el virus adenoasociado o la composición farmacéutica es administrada sistémicamente o localmente.
26. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 23, CARACTERIZADO porque el virus adenoasociado o la composición farmacéutica requiere la expresión del poiinucleótido de interés en el tejido nervioso.
27. - Método de aplicación terapéutico con un virus adenoasociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque comprende: a: el contacto de las células nerviosas con el virus adenoasociado descrito en las reivindicaciones 1 a 20; y b: expresión del virus en las células nerviosas.
28.- Método de aplicación terapéutico con un virus adenoasociado, según la reivindicación 27, CARACTERIZADO, porque las vías de administración están supeditadas al paso del virus de la barrera hemato-encefálica y comprenden la vía nasal; por inyección directa intraventrícular, intracerebral y/o intratecal, entre otras.
29. - Un polinucleótido CARACTERIZADO, porque comprende un cásete de expresión flanqueado por los ITRs de un virus adenoasociado, donde dicho cásete de expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés, ¡gf2 o Igf2-HA.
30. - Un polinucleótido, según la reivindicación 29, CARACTERIZADO, porque la región del promotor es seleccionado del grupo que comprende CAG, C V, b- globina, CBA, elFalpha, PGK entre otros.
31.- Un polinucleótido, según la reivindicación 30, CARACTERIZADO porque la región de promotor seleccionada del grupo es CAG.
32. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 29, CARACTERIZADO porque comprende una región codificante para un sitio de respuesta inmune seleccionada del grupo HA, FLAG, GFP, His y yc.
33. - Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 32, CARACTERIZADO porque comprende la región codificante para un sitio de respuesta inmune tipo HA.
34.- Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 29, CARACTERIZADO porque la región reguladora de la transcripción de tejido neuronal comprende una región de promotor.
35.- Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 34, CARACTERIZADO porque la región reguladora de la transcripción de tejido neuronal que comprende una región de promotor seleccionada del grupo que comprende de CAG, CMV, b-globina, CBA, elFalpha, entre otros.
36.- Un polinucleótido, de acuerdo con las reivindicación 36, CARACTERIZADO porque la región reguladora de la transcripción de tejido neuronal comprende una región de promotor CAG.
37. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 30 a 36, CARACTERIZADO porque el cásete de expresión comprende además una región regulatoria post-transcripcional.
38. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 37, CARACTERIZADO porque la región regulatoria post-transcipcional es el elemento de regulación post-transcipcional del virus de la hepatitis de la marmota americana (WPRE).
39. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 29, CARACTERIZADO porque las secuencias objetivo a transcribir comprende a las secuencias Igf2 y Igf2-HA.
40. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 41 , CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es Igf2.
41. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 39, CARACTERIZADO porque la secuencia objetivo a transcribir es Igf2-HA.
42. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicaciones 29 a 41 , CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica proteínas dentro del grupo que comprende IGF2 e IGF2-HA, las cuales actúan sistémicamente cerca o con células neuronales.
43. - Un polinucleótido, desacuerdo a la reivindicación.42, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de intérés, codifica la próteína IGF2.
44.- Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 42,' CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés, codifica la próteína IGF2-HA.
45. - Un polinucleótido, de acuerdo a la reivindicación 29, CARACTERIZADO porque el polinucleótido de interés actúa sistémicamente cerca o con células neuronales, es especificó ' ara -células en la- corteza, cortex y en el nervio estriado, striatum.
46. - Un plásmido, CARACTERIZADO porque comprende las. secuencias de un vector adenoasociado, un cásete de expresión flanqueado por los ITRs del virus adenoasociado, donde dicho cásete dé expresión comprende un promotor, una región codificante para respuesta inmune y un polinucleótido de interés, tal como los depositados en el organismo internacional de depósito biológico, contenido en la cepa de Escheríchia coli transformada con los plásmidos depositados en el organismo internacional de depósito biológico, Colección Chilena de. Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), con los números de depósitos RGM2335 y RGM2336, respectivamente.
47.- Un virus adenoasociado, CARACTERIZADO porque comprende el genoma viral descrito en las reivindicaciones 29 a 45.
48 - Un método para obtener un virus adenoasociado, CARACTERIZADO porque comprende los pasos de: a. - proveer una célula que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 46, con las proteínas VAA Cap, con las proteínas VAA Rep y las proteínas virales de las cuales depende VAA para su replicación; b. - mantener las células bajo condiciones adecuadas para el ensamblaje del VAA; y c- purificar el vector viral adenoasociado producido por la célula.
49. - Un método, de acuerdo a la reivindicación 48, CARACTERIZADO porque el VAA es dependiente de la replicación derivada desde el adenovirus.
50. - Un método, de acuerdo a las reivindicaciones 48 y 49, CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado son derivadas desde un VAA seleccionado de los serotipos VAA 1 , VAA2, VAA3, VAA4 y y AAVs pseudotipados.
51.- Un método, de acuerdo a las reivindicación 50, CARACTERIZADO porque las proteínas Cap y Rep del virus adenoasociado es derivado desde el serotipo VAA2.
52. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque es útil en la preparación de un medicamento para la nivelación de la concentración fisiológica de IGF2 en pacientes mamíferos con la enfermedad de Huntington.
53. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque ese mamífero, es un humano.
54. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque el virus adenoasociado o la composición farmacéutica es administrada sistémicamente o localmente.
55. - Uso de un virus adenoasociado, según la reivindicación 52, CARACTERIZADO porque el virus adenoasociado o la composición farmacéutica requiere la expresión del polinucleótido de interés en el tejido nervioso.
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