CN110741079A

CN110741079A - 病毒aav/igf2、基因治疗方法及其在亨廷顿氏病等蛋白质折叠错误相关疾病中的应用

Info

Publication number: CN110741079A
Application number: CN201780087076.4A
Authority: CN
Inventors: 克劳迪奥·安德烈斯·黑茨·弗洛里斯; 保拉·韦尔塔·格雷西亚
Original assignee: Universidad de Chile
Current assignee: Universidad de Chile
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2020-01-31
Also published as: EP3560519A4; JP2023098943A; CL2016003282A1; JP2020501613A; EP3560519A1; WO2018112672A1; US20200030391A1

Abstract

本发明涉及两个分子在病毒载体AAV/IGF2‑HA和AAV/IGF2中的表达、相关方法及其在改善蛋白质错误折叠相关疾病、例如，如图11/19中活体模型中所示亨廷顿氏病中的应用。

Description

病毒AAV/IGF2、基因治疗方法及其在亨廷顿氏病等蛋白质折叠错误相关疾病中的应用

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是在蛋白质折叠过程中，通过使用在中枢神经系统(CNS)细胞中过度表达IGF2生长因子的腺相关病毒(AAV)，优选在运动和认知控制区域，恢复和改善神经元退化。

背景技术

近年来，对中枢神经系统(CNS)疾病的科学研究备受关注，尤其是与退行性神经系统疾病有关的疾病。与蛋白质错误折叠相关的疾病、如亨廷顿氏病的治疗已经采用了对抗疗法(抗精神病药和抗抑郁药)，以减少因蛋白质错误折叠导致神经元死亡而引发的症状，但没有一种方法能够减缓退化或逆转已经造成的损害。

关于亨廷顿氏病(HD)，其遗传原因是20多年前发现的，但导致神经元功能障碍和细胞死亡的机理才刚刚开始确定。

在确定这些机理的过程中，有人提出，蛋白质内稳态网络的一般改变是HD妊娠期的一个重要病理事件，其中内质网(ER)应激的出现尤为突出。在这个细胞器中，存在着负责激活未折叠蛋白相应(UPR)的蛋白质，这是一种在ER应激下控制细胞命运的反应信号。

HD是一种神经退行性疾病，其特征是在第一阶段出现认知恶化和人格改变，以及在更高级阶段的运动控制失败，这妨碍了进行日常生活任务，最终导致患者过早死亡。在蛋白质水平上，这种疾病的特点是亨廷顿蛋白中谷氨酰胺的重复扩增超过35次，使其具有显性毒性功能，从而导致突变的亨廷顿蛋白(mHtt)的累积和纹状体神经元的丢失的发生。虽然mHtt对神经元功能影响的机理仍在讨论中，但不同的出版物表明，蛋白质稳态(1)的整体改变促进发病机制(2-5)，包括蛋白质恶化的改变。与内质网、内质网和高尔基体的囊泡运输、轴突运输和自噬紊乱有关(6)。所有这些因素都会增加细胞的蛋白质负荷，干扰细胞在内质网中的正确折叠和成熟，产生慢性内质网应激和神经元功能障碍(7)。内质网应激触发未折叠蛋白反应(UPR)的激活，这是一种信号通路，首先允许调节细胞适应以恢复蛋白内稳态。

然而，慢性内质网应激可导致细胞死亡和神经变性。值得注意的是，ER应激与几种神经变性疾病有关，包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)(7-9)。在这种信号中，最保守的分支由结合蛋白1(XBP1)的X-盒转录因子控制，其控制一组参与蛋白质内稳态网络不同方面的基因的表达(10)。先前的研究表明，HD小鼠模型神经元中的XBP1缺陷具有神经保护作用(5)。总的来说，这些动物对疾病的发展有更强的抵抗力，这与神经元存活率的提高和更好的运动性能有关。这种表型是由mHtt水平的急剧下降所解释的，可能是由于自噬(5)的阳性调节。在ALS(11)和PD(12)模型中获得了类似的观察结果。

在寻找治疗这些蛋白质错误折叠疾病方法中，发现了胰岛素样生长因子II，称为IGF2，其功能涉及胎儿生长的生物学和分子机制，以及一些癌症肿瘤。

IGF2是一种分泌生长因子，在一些模型中具有有趣的神经保护活性。总之，最近的一些研究表明，一般来说，IGF是治疗神经退行性疾病的可能靶点，特别是考虑到其作为神经源性药物的功能和神经保护作用(13)。事实上，在AD和ALS的临床前模型中，通过使用基因疗法，IGF1的传递减弱了病理特征(14-16)。与IGF1和胰岛素相比，胰岛素样生长因子IGF2的研究很少。最近只有少数报告表明，IGF2具有神经保护作用，在AD模型中它可以减少淀粉样斑块和认知障碍(17，18)。同样，在ALS中，IGF2在抵抗疾病的运动神经元中的表达也存在差异，而通过基因治疗的过度表达则会延迟疾病的进展(19)。此外，在人类中，AD患者(17，20)的海马体中的IGF2水平降低，CSF样本也发生了变化(21，22)。

然而，目前还没有将IGF2与HD联系起来的功能性研究。

一般来说，UPR信号和生长因子信号之间的动力学假设了一种新的方法，将蛋白稳态网络与调节神经生理学的生存信号联系起来(23)。基于这些原因，除了作为监测疾病进展的生物标记物的潜在用途外，IGF2是一个有趣的候选研究对象，可以在HD的背景下为其治疗提供新的治疗途径。

在国际申请号为WO2014/085621的文献CL 3510-2014中，提出了一种包含IGF2的融合蛋白用于治疗溶酶体蛋白相关疾病，但没有提及治疗HD的基因治疗。

此外，还有第二份文献ES 2442242A1，其中提到了一种基于从血液中提取的提取物的成分，该提取物包含不同的生长因子，其中没有提到治疗HD的基因治疗。

因此，目前还没有使用基因疗法将IGF2基因与HD治疗联系起来的文献

发明内容

总的来说，本发明的目的在于产生基因治疗剂、疗法、识别装置和治疗亨廷顿氏病的用途。具体技术目标或需要解决的问题如下：

本发明的第一个方面涉及一种改进或治疗亨廷顿氏病的方法，优选在人类中，通过使用在大脑中、优选在纹状体和皮质中允许IGF2和/或IGF2/HA过度表达的病毒。

本发明的第二方面提供用于改善或治疗亨廷顿氏病的治疗方法。该方法包括静脉和/或腹膜内和/或颅内和/或髓内和/或鼻内和/或神经内给药和/或通过穿过患者或受试者的血脑屏障将病毒引入大脑的任何途径。该病毒在每个个体16到130个病毒单位的剂量范围内诱导神经元过度表达IGF2和/或IGF2/HA。

本发明的第三个方面是静脉和/或腹膜内和/或颅内和/或髓质内和/或鼻内和/或神经内药物组成和/或将病毒诱导的IGF2和/或IGF2/HA神经元过度表达传递到大脑的任何形式，优选穿过血脑屏障的海马体，剂量范围如前所述，以及用于优化和改善亨廷顿氏病患者长期记忆的药物上可接受的载体。

本发明的第四个方面是利用病毒诱导IGF2和/或IGF2/HA及其蛋白衍生物的神经元过度表达，因为它用于制备用于改善亨廷顿氏病的药物。

本发明的第五个方面是腺相关病毒(AAV)，其具有相同的病毒序列和插入物，所述插入物具有表II和表III中所述的核苷酸序列或其任何变体，包含在用保存在国际保存机构的智利微生物遗传资源中心(CChRGM)、保存编号为RGM2336和RGM2235的质粒转化的大肠杆菌菌株中，其中IGF2和/或IGF2/HA生长因子分别过度表达，主要在纹状体和皮质。

本发明的第六个方面是具有病毒核酸片段的质粒和具有如表II和III所述的核苷酸序列的插入物，所述插入物包含在用保存在国际保存机构的智利微生物遗传资源中心(CChRGM)、编号为RGM2336和RGM2235的质粒转化的大肠杆菌菌株中和/或该片段的任何变体，分别编码和过度表达IGF2和/或IGF2-HA生长因子。

本发明的第七个方面是提供诊断亨廷顿氏病的方法。

以下本发明的第八个方面是使用病毒诱导IGF2和/或IGF2/HA及其蛋白衍生物的过度表达，因为它用于制备用于稳定亨廷顿氏病患者生理水平的药物。

本专利还公开了具有病毒核酸片段的质粒序列和具有如表IV、V和VII所述的核苷酸序列的插入物或该片段的任何变体，其编码和过度表达IGF2和/或IGF2/HA生长因子。

微生物保存

质粒pAAV-IGF2-HA和pAAV-IGF2于2016年保存在国际保藏机构，包含在用存放在国际保藏机构、智利微生物遗传资源中心(CChRGM)的质粒转化的大肠杆菌菌株中，保存编号分别为RGM2335和RGM2336。

发明详细说明

应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、化合物、材料、制造技术、用途和应用，因为这些方法、化合物、材料、制造技术、用途和应用可能变化。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施例，并不旨在限制本发明的观点和潜力。

必须指出的是，如本文所用，在所附权利要求书和全文中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式包括复数引用。因此，例如，关于“一种用途或方法”包括关于一种或多种用途或方法，并且包括本领域技术人员已知的等效物。同样，作为进一步的示例，对“步骤”、“阶段”或“模式”的引用包括对一个或多个步骤、阶段或模式的引用，这些步骤、阶段或模式可能包括隐式和/或超宽的子步骤、阶段或模式。

所使用的每一个连词都必须理解为其限制性较低、包含性更强的可能含义。例如，连词“或”应理解为其正统逻辑意义，而不是作为排除的“或”，除非上下文或文本明确要求或说明。应理解，所述结构、材料和/或元件也参考了功能等效的结构、材料和/或元件，从而避免了无尽的列举。

用于表示近似值或概念的表达应理解其本质含义，除非上下文表达的是不同的解读。

本文中使用的所有技术和/或科学名称和术语具有本领域普通技术人员给出的通常含义，除非清楚地表达了不同的含义。

尽管与已描述的方法、技术、元素、化合物和组合物类似和/或等效的方法、技术、元素、化合物和组合物已经描述，其可在本发明的实践和/或试验中使用或优选。

作为参考，包括所有专利和其他出版物，目的是描述和/或告知，例如，所述出版物中描述的可能对本发明有用的方法。

本说明书所载的出版物仅是为了提供本说明书申请日前的公开。

在这方面，不应将任何内容解释为承认或接受、拒绝或排除作者和/或发明人无权将上述出版物的日期早于其他之前的出版物，或因任何其他原因。

本发明描述了基于血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4或任何血清型、杂交和腺相关病毒的载体，这些病毒在局部给药时能够有效地促进基因转移到大脑，优选AAV2、优选AAV2/2、优选纹状体和皮层(皮层)。(图10/19，图11/19，和图12/19)。

对这些载体的系统管理也会导致有效的基因向大脑、纹状体和皮质的传递。虽然受载体AAV2和AAV2/2影响的基因的传递效率更高，但在全身给药的情况下，传递不仅限于大脑或纹状体和皮质。本发明表明，具有为生长因子IGF2的表达编码的基因的载体AAV2和AAV2/2允许在大脑和特别是纹状体和皮质中的一组感兴趣的因子中产生反应。尤其是，局部施用包含表达盒的AAV2/2载体，其中一个Igf2基因在CAG启动子的控制下，可获得在活体内的亨廷顿氏病的治疗的改善(图11/19和图12/19)。

一、一般术语和表现的定义

如本文件中所用，术语“腺相关病毒”、“AAV病毒”、“AAV病毒”、“AAV病毒颗粒”和“AAV颗粒”是可互换的，并且指一种病毒颗粒，由至少一种AAV衣壳蛋白(优选由特定AAV血清型的所有衣壳蛋白)和包封AAV基因组的多核苷酸组成。如果该粒子包含侧面具有AAV反向末端重复(通常称为“AAV载体粒子”或“AAV载体”)的异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如将被传递到哺乳动物细胞的转基因)。AAV是一种属于细小病毒科的依赖性病毒属的病毒。AAV基因组约4.7千碱基长，由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，可以是阳性或阴性。基因组包括DNA链两端的倒置末端重复序列(ITR)和两个开放阅读框(ORFs)：REP和CAP(复制酶和衣壳)。REP框架由四个重叠基因组成，它们编码AAV生命周期所需的REP蛋白(REP 78、REP 68、REP 52和REP 40)。CAP框架包含20个衣壳蛋白序列的重叠核苷酸：VP1、VP2和VP3，它们相互作用形成具有二十面体对称性的衣壳(30)，如图15/19所示。

如本文所用，术语“腺相关病毒ITR”或“AAV ITR”是指重复存在于腺相关病毒基因组的DNA链两端的倒置末端。需要ITR序列有效增殖AAV基因组。这些序列的另一个特性是它们形成分叉的能力。这一特性有助于其复制，从而使初级合成与第二链DNA分离。事实证明，无论是为了将野生型AAV DNA整合到宿主细胞基因组中并拯救宿主细胞基因组，还是为了有效地将AAV DNA包封并生成完整的装配体(25)，ITRs都是必要的。

在本发明中，术语“AAV2”和“AAV2/2”是指腺相关病毒的血清型2，其具有，如登记号基因库Genbank J01901.1中所定义的基因组序列，位于网站：https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/j01901.1。

从迄今为止已鉴定的11种血清型中，最具特征和最常用的是AAV2。不同血清型之间的差异是由它们的细胞倾向性决定的，AAV2是感染中枢神经系统细胞的“亲和力”最高的血清型之一。

如本发明中所用，术语“AAV载体”进一步指包含一个或多个感兴趣的(或转基因)多核苷酸的载体，所述多核苷酸(或转基因)在AAV末端重复(ITR)序列的两侧。当所述AAV载体存在于已用编码和表达REP和CAP基因(如AAV蛋白REP和CAP)的载体转染的宿主细胞中，并且宿主细胞已用编码和表达e4或者f6的腺病毒阅读框的蛋白质的载体转染时，所述AAV载体可被复制并包装成感染性病毒颗粒。当AAV载体并入更大的多核苷酸(例如，在染色体中或在另一载体、诸如用于克隆或转染的质粒)中时，则AAV载体通常称为“前载体”。在存在AAV的包装功能和E4或F6提供的必要辅助功能的情况下，通过复制和封装可以“挽救”前载体。

如在本发明中所用，术语“CAP基因”或“AAV CAP基因”是指编码CAP蛋白的基因。本文所用术语“CAP蛋白”是指具有野生型AAV(VP1、VP2、VP3)的CAP蛋白的至少一种功能活性的多肽。VP1、VP2和VP3蛋白的功能活性的示例包括诱导衣壳的形成、促进单链DNA的积累、促进衣壳中AAV DNA的包装(即，包封)、结合细胞受体并促进病毒进入宿主。

如在本发明中所用，术语“衣壳”是指病毒基因组在其中包装的结构。衣壳由具有CAP蛋白结构亚单位的寡聚体结构组成。例如，AAV有一个二十面体衣壳，由三种衣壳蛋白：VP1、VP2和VP3相互作用形成。

如在本发明中所用，术语“细胞组合物”是指包含本发明细胞和至少另一个其他成分的复合型材料。所述组合物可以单一配方配制，或者作为每种组分的单独配方呈现，所述组分可以组合以作为组合制剂共同使用。该组成物可以是一个零件套件，其中每个组件都是单独配制和包装的。

如在本发明中所用，术语“组成型启动子”是指很少或不考虑细胞的环境和外部条件，其活性在整个有机体内或在大多数实验步骤中维持在相对恒定水平的启动子。

如在本发明中所用，术语“表现盒”是指通过重组或合成产生的具有一系列核酸的特定元素的核酸结构，其允许在靶细胞中转录特定的核酸。

如本文所用，术语“提供辅助功能的基因”是指编码执行AAV依赖于复制的功能的多肽的基因(即“辅助功能”)。辅助功能包括AAV复制所必需的功能，包括参与激活AAV基因转录的片段、AAV mRNA的特定剪接步骤、AAV DNA的复制、CAP产物的合成和AAV衣壳的装配。辅助病毒功能可来源于任何已知的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒、慢病毒和牛痘病毒。辅助功能包括但不限于WHV慢病毒。

如本文所用，术语“局部施用”意指将本发明的多核苷酸、载体、多肽和/或药物组合物投与在特定位置或附近的个体。

在本文件中，术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是可互换的，指无毒、半固体或液体填充物、稀释剂或封装材料，或常规类型的用于任何药物的辅助制剂。药学上可接受的载体对在剂量和浓度中使用的受体基本上无毒，并且与制剂的其他成分相容。药物上可接受的载体的数量和性质取决于所需的给药形式。已知医药上可接受的载体是已知的且可藉由本领域已知方法来制备(24)。

如本文所用，术语“启动子”是指用于控制位于多核苷酸序列上游的一个或多个多聚核苷酸的转录的核酸，其在结构上通过存在DNA依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活蛋白结合位点)以及本领域已知的直接或间接调节启动子转录量的序列的任何其他核苷酸识别。“组织特异性”启动子只在某些类型的分化细胞或组织中被激活。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指分别含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子，即DNA或RNA。核酸可以是双链、单链，或者包含双链或单链序列的部分。术语“多核苷酸”包括但不限于能够编码多肽的核酸序列和部分或全部与细胞或用其治疗的个体的内源性多核苷酸互补的核酸序列，以便在转录后生成RNA分子(例如，microRNA、shRNA，siRNA)能够杂交和抑制内源性多核苷酸的表达。

在本文中，术语“链”是指连续的核苷酸序列(包括或不包括经修饰的天然核苷酸或非天然核苷酸)。两条或两条以上的链可以是，或者每一条都可以形成单独分子的一部分，或者它们可以共价连接，例如，通过偶合，例如，聚乙二醇等连接体来形成分子。所述链中的至少一个可以包括与目标RNA充分互补的区域。

如本文所用，术语“重组病毒基因组”是指插入至少一个与野生型AAV基因组中的表达无关的多核苷酸盒的AAV基因组。

如本文所用，术语“rep基因”或“AAV rep基因”是指编码rep蛋白质的基因。本文所用术语“Rep蛋白质”是指具有AAV本地rep蛋白质(例如Rep 40、52、68、78)的至少一种功能活性的多肽。Rep蛋白质的“功能活性”(例如Rep 40、52、68、78)是与蛋白质的生理功能有关的任何活性，包括通过对AAV DNA复制起源的识别、结合和分裂以及DNA螺旋酶活性促进DNA复制。其他特征包括调节AAV(或其他异源)转录启动子，以及AAV DNA与宿主染色体的位点特异性整合。

如本文所用，术语“受试者”是指个体、植物、哺乳动物或动物，例如人类、非人类灵长类动物(例如，黑猩猩或其他类人猿和猴子物种)、动物(例如，鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马)、哺乳动物(例如，狗和猫)或实验动物(例如，啮齿动物，例如，老鼠、小白鼠、具有沉默基因(敲除小鼠)、过度表达基因的小鼠(转基因小鼠)和豚鼠。该术语不表示特定的年龄或性别。“受试者”一词包括胚胎和胎儿。

如本文所用，术语“系统地施用”和“系统性的施用”意指以非定位形式将本发明的多核苷酸、载体、多肽或药物组合物投与个体。本发明的多核苷酸、载体、多肽或药物组合物的系统性施用可到达受试者全身的各种器官或组织，或到达受试者的新的特定组织或器官。例如，静脉注射本发明的药物组合物可导致受试者的多个组织或器官中的转导。对于本发明，它还意味着本发明的多核苷酸、载体、多肽或药物组合物系统地作用，接近或与神经元神经细胞或与非神经元神经细胞以及细胞内或细胞外一起作用。

如本文所用，术语“转导”是指病毒将一系列外源核苷酸引入细胞的过程。

如本文所用，术语“转染”是指将DNA引入到受体真核细胞中。

如本文所用，术语“载体”是指能够递送并任选地表现一个或多个对宿主细胞感兴趣的多核苷酸的结构。载体之实例包括(但不限于)病毒载体、DNA或裸RNA表现载体、质粒、黏粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的RNA或DNA表现载体、封装于脂质体中的DNA或RNA表现载体及某些真核细胞，如生产细胞。载体可以是稳定的，并且可以自我复制。对于可以使用的载体类型没有限制。该载体可以是一种克隆载体，适用于繁殖和获得多核苷酸、基因构建或表达载体，这些载体并入各种异源生物中。适宜载体包括原核表达载体、噬菌体及穿梭载体、基于病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒、以及逆转录病毒及慢病毒)之真核表达载体及非病毒载体。

如本文所用，术语“DARPP”是一种多巴胺调节的磷蛋白，用作中等多刺神经元(MSNs)的标记物，MSNs是受mHtt表达影响的主要神经元。它的表达被用作一个生存标记。

文件中使用的术语IGF2本身是指IGF2多肽，但也指结合到HA表位的变体。

本发明的方法和组成，例如具有插入物IGF2-HA或简单IGF2的AAV的方法和组成，可与本发明中所述的任何剂量和/或配方以及本发明中所述的任何给药途径一起使用。

对于术语“改善亨廷顿氏病”，我们指精神、行为和运动症状的改善，以及本发明中定义的不同物种和/或受试者中亨廷顿聚集物的减少。

术语“cDNA”或“互补DNA”是指完全互补于RNA的DNA序列，通过RT-PCR合成。

如本文件中所用，“互补”一词用于表示这样一种充分的互补性，即化合物与靶RNA分子之间发生稳定的特异性结合，特异性结合需要足够的互补性，以避免低聚物与非靶序列的非特异性结合。在需要特异性结合的条件下，即在生理条件下进行体内分析或治疗，或在进行分析的条件下进行体外分析。

配体

例如，通过引入配体，病毒的特性，包括其药理学特性，可以受到影响和调整。此外，病毒剂的药理学性质可以通过在该药剂和病毒的配方中加入配体来增强。

配体可以结合到各种各样的实体，例如结合到病毒剂的配体，或者可以用作共轭或配方添加剂的配体，例如，与配体共轭单体亚单位的载体结合。下面在配体共轭单体亚单位的上下文中描述了这些示例，但这只是优选的，并且实体可以在其他点与病毒耦合。

配体改变了它所结合的病毒剂的分布、方向或寿命。在较佳实施例中，与不存在该配体的物种相比，配体对所选目标(例如分子、细胞或细胞类型)、间隔(例如细胞或器官间隔)、组织或身体区域，提供更好的亲和力。

对于本发明，配体可以改善病毒的靶分子的转运、杂交和特异性。

配体，一般来说，可以包括治疗性调节剂，例如，提高分子在个体中的吸收；诊断化合物或报告者组，例如，监测分布；交联剂；赋予免疫反应抗性的部分；和天然或不寻常的核碱基。

一般实例包括亲脂性分子、脂类、凝集素(例如，海奇菌素、薯蓣皂苷元)、萜类(例如，三萜类，例如，沙参皂苷、木栓酮、表弗里德蓝醇衍生石胆酸)、维生素、碳水化合物(例如，葡聚糖、普鲁兰、几丁质、壳聚糖、合成聚合物[例如，低乳酸15-mer]和天然聚合物[例如，低分子量和中等分子量]、菊粉、环糊精或透明质酸)、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、多聚体、肽、多胺和肽模拟物。其他实例包括上皮细胞或叶酸受体配体，例如转铁蛋白。

配体可以是以自然、重组、合成形式呈现的分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚胺基酸之实例包括聚-L-赖氨酸(PLL)、聚-L-天冬氨酸、聚-L-麸胺酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(乳酸-co-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HMPA)共聚物、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸A)CID)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸(PLL)、精素、精胺、多胺、假肽多胺、肽型多胺、树状大分子多胺、精氨酸、酰胺、鱼精蛋白、阳离子部分，例如阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季铵盐或α螺旋肽。

配体还可以包括靶向基团，例如，靶向剂到细胞或组织，例如，促甲状腺激素、促黑素、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、糖基化聚氨基酸、二磷酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸或Arg-Gly-Asp(RGD)肽或RGD肽模拟物。

配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，脂蛋白，例如，低密度脂蛋白(LDL)；或者例如，血清白蛋白，或多肽，例如，对共配体具有特定亲和力的分子；或抗体，例如与特定细胞类型结合的抗体。配体也包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类物质，例如辅助因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖、多价甘露糖或多价岩藻糖。

配体可以是一种物质，例如，一种药物，可以通过改变细胞的细胞骨架(例如，通过改变细胞的微管、微丝和/或丝状中间物)来增加病毒剂在细胞内的吸收。

在一个方面，配体是脂类或脂类分子。这种脂质或这种基于脂质的分子优选与乳清蛋白(例如血清白蛋白)连接。

在另一个实施例中，对于那些先前命名的实施例，病毒将被包装。

通过稀释PBS(磷酸盐缓冲液)中所需浓度的病毒制备病毒注射溶液，其配方如下：

PBS 1X

1.将病毒剂量以及以下溶解在800毫升蒸馏水中：

8克氯化钠

0.2克氯化钾

1.44克Na2HPO4

0.24g KH2PO4

2.用盐酸将pH值调整到7.4。

3.用另外的蒸馏水H2O将体积调节到1L。

4.消毒和高压釜。

设计和选择

控制亨廷顿突变型的表达是改善或治疗亨廷顿病的关键。

在细胞中，有几种机制能够降解错误折叠的蛋白质，包括与内质和自噬相关的降解。然而，很难选择性地降解特定的蛋白质。尽管如此，迄今为止的研究表明，IGF2能够以某种方式减少亨廷顿蛋白的表达，从而降低其毒性功能。

除了需要调节局部蛋白质合成外，改善或治愈亨廷顿病还涉及分泌途径的其他方面，包括各种膜受体和离子通道的合成和运输、钙信号的增加、膜的合成和蛋白质复合物的组装。然而，在纹状体和皮质中优先发现了一种独特的IGF2功能，但并非唯一。

本文所述的应用实例证明IGF2降低了mHtt的表达并增加了神经元的活性，减缓了亨廷顿氏病的发展。

在分析其作为治疗的生物医学应用范围时，为改善或治疗亨廷顿氏病提供了一种有效和创新的方法，在该技术的应用中产生了令人惊讶的结果。

实验表明，在HD背景下，IGF2的过度表达可显著降低聚谷氨酰胺肽和突变亨廷顿蛋白的聚集。此外，还观察到了一种神经保护作用，以及中棘神经元存活率的增加。

以往的使用HD模型的研究得出结论，中枢神经系统神经元转录因子XBP1的缺乏对这种疾病具有神经保护作用，减少聚集物的数量，提高神经元的生存能力(这可以在实施例中看到)。

为了确定神经系统中XBP1缺陷的动物中观察到的保护作用的可能机制，采用亨廷顿Yac128模型，对53只动物、包括XBP1缺陷小鼠的纹状体和大脑皮层，在HD环境下的基因表达进行了全谱分析。从本研究中，获得了作为基因的IGF2，其表达受XBP1缺陷得到影响最大，如图1/19所示。此外，这是唯一一个与同时进行的XBP1缺陷小鼠的mRNA测序研究相一致的研究。

用qPCR(定量PCR)测定XBP1缺陷小鼠脑内不同区域的Igf2水平，证实了上述结果。观察到皮质和纹状体中Igf2mRNA的内源性水平显著增加，如图2/19所示。这些数据表明，IGF2在某种程度上参与了XBP1-KO小鼠的保护作用。

为了研究IGF 2对HD的作用，对其在神经2a细胞中短暂表达融合有GFP的polyQ79肽的细胞模型中的活性进行了研究。根据三种不同方法的评价，神经2a细胞中的IGF2和polyQ79-GFP的共表达显著减少了蛋白质包涵体和聚集物的数量，包括荧光图像、蛋白质印迹和过滤陷阱，这是一种能够评估大尺寸聚集物的技术(分别见图3/19、图4/19、图5/19)。

接下来，测试观察到的影响是否是由于分泌的IGF2或其细胞内积累。因此，肽polyQ79或mHTTQ85-GFP在富含IGF2的培养基的存在下在神经2a细胞中表达。一贯地，IGF2减少了PolyQ和mHtt的聚集物(图6/19和图7/19)。

另一方面，确定了IGF2是否能够“撤销”现有的mHtt聚集物。为此，已经表达polyQ79-GFP或GFp-mHTTQ85的神经2a细胞用富含IGF2的培养基处理。正如在以前的实验场景中观察到的，IGF2显著降低了两个实验参数中的蛋白质聚集(图8/19、图9/19)。

综上所述，在细胞培养试验中，上述结果显示出很强的抗聚集作用。

目前研究的自然延续是使用AAV2/2型腺相关病毒在体内进行初步实验(26)。在这种病毒的序列中，克隆了一个标记有HA表位的IGF2版本，以便更好地检测肽的表达。在第一种方法中，在存在或不存在IGF2的情况下注射表达mHtt的病毒颗粒。两周后，分析这些动物的纹状体，观察到突变的亨廷顿蛋白表达水平下降，如图10/19所示。

在一种更为生理学的方法中，治疗了表达突变的人类亨廷顿蛋白(YAC128模型)的转基因动物。将1-2天大的新生动物脑室内注射AAV-IGF2-HA。六个月后，处死这些动物以获得组织。在用AAV治疗后，与对照组相比，注射了IGF2/HA的动物的mHtt表达显著降低，如图11/19所示。同样，对成年个体进行治疗；这些动物在3个月大时注射AAV-IGF2/HA，在6个月大时处死以获得组织。如图12/19所示，与对照组相比，用IGF2/HA治疗可降低mHtt的表达水平。

此外，在所述研究中，进行了一些研究以验证暴露于经IGF2调整的AAV的HD小鼠的运动改善，如图13/19所示。

另一方面，进行了实验，在HD患者和对照个体的尾状核/壳核蛋白提取物中测量IGF2水平。结果表明，在HD患者中，IGF2的含量几乎不表达，表面其在病理学发展中的意义。根据本专利的建议，我们认为本专利还可以达到恢复IGF2生理水平，改善疾病的症状，如图19/19所示。

关于腺相关病毒(AAV)的发展，其包含病毒重组基因组，所述病毒重组基因组包含表达盒，所述表达盒包括可操作地连接到感兴趣的的多核苷酸的海马组织特异性转录调控区。

腺相关病毒(AAV)通常相当于42个血清型，来源于细小病毒。一般来说，不同的AAV血清型是在氨基酸和核酸水平具有显著同源性的基因组序列，其提供相同的遗传功能，提供在功能和物理方面基本相同的振动，复制和装配差不多使用相同的机制。

具体而言，本发明中使用具有访问号I01901.1(AAV2/2)的AAV血清型2/2，如表一所示。

根据本发明的AAV基因组包括顺式5'调节器和3'中的倒置末端重复序列和表达盒。ITR或LTR序列长141个碱基对。优选地，在分子中使用整个LTRs序列，并且只允许对序列进行轻微修改。在本发明的优选实施例中，AAV重组基因组包含5’和3’AAV LTRs。

另一方面，ITRs可能来自其他AAV血清型。

本发明的AAV包括任何血清型的衣壳。特别地，对于本发明，来自血清型2的衣壳是优选的。

在一些实施例中，用于本发明方法的AAV cap可通过其中一个AAV cap或其编码核酸的诱变(即插入、删除或替换)生成。在一些实施例中，AAV cap至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或更多，类似于所述AAV cap。

在一些实施例中，AAV cap是嵌合的，它包含所述AAV cap中的两个、三个、四个或更多个的范围。在一些实施例中，AAV cap是单体VP1、VP2、VP3的镶嵌体，并且衍生自两个或三个不同的AAVs或重组AAV(rAAV)。在一些实施例中，rAAV组成包含上述caps中的一个以上。

在一些实施例中，用于rAAV组合物中的AAV CAP被设计为包含异源序列或其他改性。例如，遗传工程师可以将具有选择性靶向或免疫逃逸功能的肽或蛋白质序列修改为Cap蛋白。或者，另外可以对Cap进行化学改性，使rAAV的表面呈现特定的化学改性，例如聚乙二醇，这可以促进免疫逃避。Cap蛋白也可以被诱变(例如，去除其天然结合受体，或掩盖免疫原表位)。

在一个实施例中，AAV载体包含一个启动子，该启动子添加了一个来自小鼠的Igf2或Igf-HA序列，该序列可从下表中选择：表IV(Igf2)和表V(Igf2-HA)、NCBI参考序列NM_010514.3,NM_001122736.2、NM_001122737.2,NM_001315488.1,和NM_001315489.1，与转录变体1、2、3、4和5相对应，其蛋白质产物相同，并由表中所示序列编码。

在一个实施例中，AAV载体包含一个启动子，其添加了一个人类起源的Igf2或Igf2-HA序列，该序列可从下表中选择：表VII(人类Igf2)、NCBI参考序列NM_000612.5、NM_001007139.5、NM_001127598.2、NM_001291861.2和NM_001291862.2，其对应于转录变体1、2、3，4和5，其蛋白质产物相同，并由表中所示的序列编码。

在一个实施例中，AAV载体包含真核表达启动子，并且添加至少一个Igf2序列，该序列可从表IV中选择，获得如表II所示的序列。

在一个实施例中，AAV载体包含真核表达启动子，并且添加至少一个可以从表V中选择的Igf2-ha序列，获得如表III所示的序列。

在一个实施例中，AAV载体包含真核表达启动子，并且添加至少一个人类Igf2序列，可从表VII中选择。

在一个实施例中，AAV载体包含一个启动子，其添加至少一个序列，该序列与从上述列表、表II和表III中选择的序列具有85％的同源性。

在一个实施例中，AAV载体包含一个启动子，其中至少一个序列与从上述表中选择的序列具有70％的同源性。

在一个实施例中，AAV载体包含具有至少一个序列的启动子，该序列与从上述表中选择的序列具有功能等效性。

转录调控区可包括启动子和增强子区(可选)。优选地，该启动子系真核基因表达启动子，选自下表：CAG(CAG是包含与巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强因子、启动子、第一外显子及鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子、兔β-珠蛋白基因的剪接受体相对应的序列的启动子)、CMV、b-珠蛋白、CBA、真核启动因子(eIFalpha)等。增强剂不需要对神经组织有特异性。

在一个实施例中，启动子是特异的，它是巨细胞病毒或CMV启动子。

在一个实施例中，启动子是特异的，它是b-珠蛋白。

在一个实施例中，启动子是特异的，它是CAG。

在一个实施例中，启动子是特异性的，它是人类延伸因子-1α，也称为真核启动因子(eIFalpha)。

在另一实施例中，构成本发明AAV一部分的表达盒还包含转录后调控区。在优选实施例中，转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录后调控区(WPRE)或其功能变体和片段以及PPT-CTS或功能变体和片段本身。在特定实施例中，转录后调控区是WPRE。

构成本发明AAV一部分的表达盒包含“感兴趣的多核苷酸”。在优选实施方案中，感兴趣的多核苷酸编码系统性作用的蛋白质。在另一实施例中，感兴趣的多核苷酸编码在神经元内起作用的蛋白质。在优选实施方案中，作用于所述神经元内的蛋白质是IGF2，包括其在亚细胞位置变化的任何异型，并包括其用任何表位标记的任何异型。

AAV载体的包装大小限制为野生型AAV基因组的大小，其大小根据AAV血清型而变化(即介于4087到4767之间)。例如，野生型AAV-2的基因组大小大约为4.7kB。在一些实施例中，重组RNA载体的克隆能力可能受到限制，并且所需的编码序列可能涉及完全替换病毒基因组的4.8千碱基。因此，在某些情况下，大型基因可能不适用于标准重组AAV载体。一个普通的专家会理解，在本领域中有克服有限编码能力的选项。例如，两个基因组的AAV-IRT可以杂交形成头对尾的聚集体，几乎使载体的容量翻倍。剪接位点的插入允许转录后去除ITR。对于该领域的专家来说，克服有限克隆能力的其他选择是显而易见的。

给药途径

病毒的给药途径受其穿过血脑屏障感染目标神经元的影响。

为了达到这一目的，本发明定义了两种给药途径。

第一种途径是鼻腔(27)；通常，通过鼻腔途径服用的药物可以进入血液到全身循环，能够直接进入大脑，或者在某些情况下可以沿着这两种途径。然而，许多控制药物流经这些途径的因素还没有完全确定。一般来说，有三种途径可以让药物在鼻腔中传播。这些途径(27)包括通过鼻粘膜直接进入系统循环(28)，通过神经元的轴浆运输进入嗅球以及直接进入大脑(29)。支持这些途径对各种模型基质的作用的证据总结如下，适用于不同类型的病毒。

该表的本质并非详尽无遗，而是强调不同类别的某些溶质已显示出遵循一个或多个路径。

进入中枢神经系统细胞的其他给药途径包括(28)：

直接注射到液体空间，如眼睛的玻璃体；或通过不同途径进入脑脊液，如脑室内或鞘内(**)，将其输送至脉络丛、室管膜/脑膜层，并通过这些层内延伸的过程从邻近的大脑中输送至脑脊液；以及穿过血脑屏障或脑屏障。动脉内注射结合暂时性渗透性或药物性破坏形成的肿瘤屏障。

鞘内(**)一词(intra+teca，“within a sheath”)是一个形容词，指在鞘内发生或被引入解剖空间或潜在空间的东西，最常见的是大脑或脊髓的蛛网膜。

剂量计算

根据Ulusoy等人(29)，载体的滴定要求在每毫升10⁹到10¹³份基因组(CG)之间，测试剂量在10¹⁰-10¹²gc/ml之间。另一方面，在任何稀释载体滴定的速率下，它们必须具有10¹¹gc/ml的低介质范围，从而导致毒性消失。

人体剂量

人体的剂量范围将在10⁹到10³⁰病毒单位/千克之间，而不限制该范围适用于不同年龄组或随年龄或病理改变分布量。

一种物质的最大浓度或水平是通过实验或观察发现的，并且不会对目标生物体的形态、功能能力、生长、发育或寿命造成可检测到的不利变化，与在规定的暴露条件下在同一物种和菌株的正常(对照)生物体中观察到的生物有区别。

应用方法

利用配备有尖端直径约为60-80微米的玻璃毛细管的5μl的汉密尔顿注射器，将rAAV2载体双向注入纹状体。以0.4μl/min的速率注射两微升含有适当浓度病毒颗粒的缓冲液。注射5分钟后慢慢取下针。

附图说明

图1/19

该图显示了一组杰出的基因，在研究XBP1缺陷动物在HD环境下的基因表达中，这些基因的表达有所不同。在具有人类突变亨廷顿蛋白(YAC128)的转基因小鼠、XBP1缺陷的小鼠和对照动物的皮质和纹状体中，不同组的Igf2、Mmp14、Lrp4和Uhrf水平都发生变化。

在皮质和纹状体中都能清楚地看到Igf2基因的上调。

图2/19

图1/19所示的研究结果经定量PCR(qPCR)证实。这个图出现在左侧皮质结果，右侧纹状体结果，XBP1缺陷小鼠大脑中Igf2mRNA的上调。通过这项技术，我们观察到在XBP1缺陷动物的皮质和纹状体中，内源性Igf2的mRNA水平显著增加。

在所有体内实验中，采用n＝5，t-student**p<0.05。

图3/19

该图显示了IGF2表达如何降低亨廷顿氏病的神经2a细胞模型中mHTT聚集体的水平。

特别是，神经2a细胞短暂地用载体转染polyQ79-EGFP和IGF2或对照。随后，对polyQ的聚集体进行评估和量化。

该图显示了荧光显微镜下的照片，以及在转染24小时和48小时后右侧所述荧光的定量。

对于所有的体内实验，采用n＝3，t-student**p<0001。

图4/19

该图显示了IGF2表达如何降低亨廷顿氏病的神经2a细胞模型中ployQ肽聚集体的。

该图显示了蛋白质印迹的照片，并在转染后24小时和48小时定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图5/19

该图显示了IGF2表达如何降低亨廷顿氏病的神经2a细胞模型中polyQ肽聚集体的水平。

该图显示了陷波滤波器的照片以及在转染后24和48小时在右侧的定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图6/19

特别地，神经2a细胞在富含IGF2的培养基或对照物的存在下短暂地用polyQ79-EGFP、mHTTQ85-GFP的载体进行转染。24小时后评估和定量蛋白质聚集体。

该图显示了荧光显微镜下的照片以及24小时转染后右侧荧光的定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图7/19

该图显示了IGF2表达如何降低亨廷顿氏病的神经2a细胞模型中，mHTT聚集体的水平。

该图显示了经蛋白质印迹处理的照片以及在24小时转染后右侧的定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图8/19

特别是，为了测试IGF2是否能够减少先前形成的polyQ或mHTTQ85-GFP包涵体，用富含IGF2的培养基或对照物处理表达可检测包涵体的细胞。24小时后评估和定量蛋白质聚集体。

该图显示了经24小时转染后，用蛋白质印迹拍摄的照片及在右侧的定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图9/19

该图显示了IGF2表达如何降低用于亨廷顿氏病的神经2a细胞模型中mHTT聚集体水平。

特别是，为了测试IGF2是否能够减少先前形成的polyQ或mHTQ85GFP包涵体，用富含IGF2的培养基或对照物处理表达可检测包涵体的细胞。24小时后评估和定量蛋白质聚集体。

这张图显示了经24小时转染后的陷波滤波器的照片及在右侧的定量。

在所有体外实验中，采用n＝3，t-student**p<0.001。

图10/19

该图显示了IGF2表达如何降低用于亨廷顿氏病的YAC128小鼠模型中mHTT聚集体的水平。

特别是，通过立体定向将野生动物与AAVs共注射到纹状体中，AAVs与IGF2-HA或对照组表达mHtt片段。2周后评估和定量mHTT的蛋白聚集体。

该图显示了转染两周后蛋白质印迹的照片及其在右侧的定量分析。

在所有活体实验中，采用n＝5，t-student**p<0.05。

图11/19

该图显示了来自AAV病毒的IGF2表达如何降低用于亨廷顿氏病的YAC128小鼠模型中polyQ聚集体的水平。

特别是在90天的成年YAC128小鼠纹状体中注射表达IGF2或对照的AAVs。注射3个月后，评估mHTT聚集体水平和DARPP-32，以反映纹状体神经元的活性。

以与体外观察相似的方式，mHtt表达减少，DARPP水平增加，其中该蛋白代表主要受亨廷顿氏病影响的神经元的生存能力。因此，可以得出结论，DARPP越多，发生的神经元死亡就越少。

在所有活体实验中，采用n＝5，t-student**p<0.05。

图12/19

该图显示了来自AAV病毒的IGF2表达如何降低用于亨廷顿氏病的YC128小鼠模型中polyQ聚集体的水平。

特别是，在1或2天大的YAC128新生动物的心室内注射表达IGF2或对照的AAVs。注射6个月后评估mHtt的聚集体水平。以类似于体外观察的方式，发现mHtt表达降低。

图13/19

该图显示了在一个用于亨廷顿氏病的YAC128小鼠模型中的IGF2的表达是如何纠正由该病引起的运动问题的。

特别是，用AAV-IGF2-HA或AAV对照对双侧立体定向注射的YAC128小鼠进行运动试验。每两周记录一次，持续两个月。该图显示了在AAV2/IGF2-HA作用下，随着时间的推移对转棒试验的响应的行为图。

图14/19

上图显示新生小鼠注射部位。

下图显示了将AAV注入成年小鼠纹状体的大脑内的位置。

图15/19

该图显示了AAV基因组的方案。

REP：参与AAV复制机制的基因。

VP：参与衣壳形成和装配的基因。

ITR：相当于LTR，反向终端重复序列。

图16/19

该图展示了根据表II具有以下具体描述的带有IGF2-HA插入物的AAV病毒载体。

图17/19

该图展示了根据表III具有以下具体描述的带有IGF2插入物的AAV病毒载体。

图18/19

该图显示了对所产生的病毒结构的表达的确认。为此，用不同的结构转染HEK细胞，转染24小时后，用抗-IGF2和抗-HA抗体提取被WB评价的蛋白。

最后，在分别用质粒pAAV-IGF2和pAAV-IGF2-HA转染的细胞中检测到预期的IGF2(17kDa)和IGF2-HA(18kDa)分子量带。

图19/19

该图显示了HD患者和对照组患者的IGF2的蛋白水平。研究发现，在HD患者中，IGF2几乎没有表达，表明其参与了病理学的发展。

左边的数字有一个IGF2的蛋白印迹，右边的数字显示了类别的量化和在HD患者中的显著低的水平。

具体实施方式

实验测试1

对成年野生幼鼠模型进行了体内实验。通过脑立体定位将表达人mHtt(588bis)大片段的AAV转化病毒与RFP和AAV/IGF2-HA或对照物结合共同注入纹状体(图14/18)。

两周后，处死动物，解剖纹状体。正如先前体外实验结果所预期的那样，在给予IGF2后观察到mHtt聚集明显减少(图10/18)。

实验测试2

为了评价IGF2治疗的有效性，采用了一种在自身启动子作用下表达人mHtt的生理模型。

在这一实验策略中，证明用AAV-IGF2处理能显著降低突变亨廷顿蛋白的水平。此外，观察到更大的神经元活性，如DARP32水平的增加所示(图11/18)。

特别是通过立体定向手术注射到纹状体中的表达IGF2-HA的AAVs与对照组相比，是否达到了降低聚集的效果，从而提高了神经元的生存能力。

三个月后，评估和定量mHtt表达和DARPP-32蛋白表达水平。

可以清楚地观察到mHtt表达的降低和DARPP水平的增加，其中该蛋白代表了主要受亨廷顿氏病影响的神经元的生存能力。因此，我们得出结论，DARPP越多，发生的神经元死亡就越少。

对于所有的体内实验，至少使用一个n＝4，t-student**p<0.05。

实验测试3

在本实验中，研究用AAV-IGF2-HA治疗是否能够纠正由疾病引起的运动问题(图13/18)。为此，采用AAV-IGF2-HA或AAV对照，通过立体定向将动物注射到纹状体中。

他们每两周接受一次运动测试，为期三个月，以定量疾病的进展。观察到，用AAV-IGF2-HA治疗的动物比用AAV对照治疗的兄弟姐妹表现出更好的运动活性。

在所有活体实验中，采用n＝5，t-student**p<0.05。

材料和方法

细胞培养

神经2a细胞来源于小鼠成神经细胞瘤，被广泛用作细胞模型。将细胞保存在添加了10％FBS、100U/ml谷氨酰胺青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中，并在37℃的5％CO₂气氛中保存。在N2a的情况下，将细胞保存在-80℃的10％FBS DMSO中。为了维持细胞系，每隔两到三天通过使培养液中的细胞进行胰蛋白酶化来给予细胞通道。收集细胞并离心后，根据需要按1:3-1:6的顺序重新接种。

细胞转染

按照制造商的说明，使用阳离子试剂进行细胞转染。

动物和外科手术：

成年后注射的小鼠在90天大时注射。在出生后第1天到第2天之间注射处于新生儿状态的小鼠。根据实验结果，以野生小鼠(WT)或YAC小鼠及其野生兄弟姐妹为对照。在所有情况下，所用菌株均为C57BL/6。将小鼠置于12:12h的明暗循环中，并且可以自由获得食物和水。

本发明研究过程中提出的所有动物实验使用智利的智利大学动物护理和使用委员会制定的指南。

YAC128转基因小鼠的产生

从含有完整人类亨廷顿蛋白基因的酵母人工染色体(YAC)中，它被外显子1中128个谷氨酰胺重复的扩增修饰。将所得结构YAC128注射到FVB/N株的原核中。建立了53号基因的转基因系。为了获得c57BL/6菌株，我们进行了回交以确保动物的背景。

免疫印迹或“蛋白质印迹”。

总蛋白的提取是从N2a细胞的培养中进行的，或从野生或转基因动物(视情况而定)的组织中分离出来的。用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在1％PBS-Triton缓冲液中提取细胞。

在装载缓冲液中以所需浓度制备样品。聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质含量在25-100ug之间。在甘氨酸电泳缓冲液中的小型蛋白酶3体系中建立了电泳。电泳分离后，将蛋白质转移到之前在甲醇中水合的PVDF膜上，并在转移缓冲液中使用微型反式印迹系统平衡5分钟。

从在1％SDS中制备的相同蛋白质提取物进行过滤陷阱分析。使用孔径小于0.22um的膜将25-50ug的蛋白质加载到滤器支架上。

行为测试

所有实验都是盲法进行的，每个行为测试使用不同的动物队列。

旋转法

总之，小鼠接受了4天的训练，在此期间，动物与转棒、任务和实验者接触。在第5天，进行试验，测量在120秒内以4到40转/分的加速度下，动物停留在转棒内的时间。试验继续进行，直到所有的老鼠从棒上掉下来。记录每只小鼠的跌落潜伏期和跌落时的转速。每只小鼠进行三次分析并取平均值。

腺相关载体的产生

通过转染293-AAV细胞(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)，产生AAV血清型2(AAV2/2)颗粒，并在碘克沙醇梯度上纯化，随后进行柱亲和色谱。采用TaqMan-qPCR法测定了悬浮液中含有基因组的AAV颗粒数以及载体悬浮液在HEK293T细胞中的传染性。

用于IGF2-HA的腺病毒质粒(pAAV)的制备

为了实现这一目标，将小鼠的IGF2序列克隆到腺病毒质粒pAAV-MCS中，该质粒在CAG启动子下表达转基因。从奥利弗·布拉科博士捐赠的pSPORIT6载体克隆的cDNA中，我们进行了PCRs，使我们能够获得Igf2和Igf2-HA，从而将其亚克隆到pAAV-MCS载体中。编码HA标记c-末端的IGF2-HA cDNA是通过对Igf2-EcoR1、SN2和Igf2-HA-Bgl II AS的PCR扩增产生的。

正义引物

5'GGCGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTG3'；

反义HA引物

5'ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTGATGGTTGCTGG3'

反义引物

GGCAGATCTTCACTGATGGTTGCTGG

由于在小鼠组织中识别IGF2抗体的效率较低，因此将HA标记的序列纳入克隆策略，从而可以识别转导细胞和表达IGF2(不排除其他表位序列以识别转导细胞,如FLAG、GFp、His和Myc等)。因此，在3'端用HA标记序列扩增IGF2。通过DNA测序对获得的克隆进行了确认。通过这种方法，我们分别生成了编码有和无标记的IGF2融合蛋白的PAAV-CAG-IGF2-HA和PAAV-CAG-IGF2结构。使用空的腺病毒质粒pAAV-cag作为对照。

为了证实所产生的结构物的表达，我们用不同的结构物转染了HEK细胞，在24小时的转染后，我们用抗-IGF2和抗-HA抗体提取了由WB评估的蛋白质。

最后，如图18/18所示，我们在分别用质粒pAAV-IGF2和pAAV-IGF2-HA转染的细胞中检测到一条预期的IGF2(17kDa)和IGF2-HA(18kDa)分子量带。

立体定向注射

小鼠采用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉(氯胺酮：100mg/kg，甲苯噻嗪：10mg/kg，VETCOM，智利)，并放置在立体定向架上，将其嘴、鼻子和耳朵固定(David Kopf Instruments，美国)。根据实验，分别进行了AAV-MHTT-RFP、AAV-IGF2-HA或AAV空白(对照)的单侧或双侧注射，浓度分别为：1.96x10¹²、1x10¹³和1.2x10¹³单位的转导/μL。在纹状体区域的单点用5μl的汉密尔顿注射器(美国汉密尔顿)在以下坐标下注射2μl AAV:AP:+0.07cm，ML:-0.2cm，DV:-0.31cm(根据atlas of Paxinos和Franklin，1997)。注射以0.5μl/min的速度进行，针在回缩前保持原位5min。用白细胞研究mHtt的表达，如图10/18所示。用常规聚合酶链反应(PCR)证实了IGF2的表达。

生化分析用组织的制备

小鼠被二氧化碳麻醉后处死，大脑被移除，两个半球的皮层和纹状体在冰上的一个板上被迅速剥离。组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中均匀化，辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(美国罗氏应用科学公司)。将匀浆分为两部分，分别提取mRNA和蛋白质，然后进行标准纯化和定量分析。

RNA提取、实时PCR和常规PCR

从皮层和纹状体中分离出总RNA。PBS均化后，遵循制造商推荐的三唑RNA提取方案。用大容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统)合成cDNA。定量RT-PCR时，使用来自Stratagene的Eva Green和MX3005P设备。以β肌动蛋白为对照，采用比较阈值循环法计算cDNA的相对含量。对于传统的PCR，我们使用Promega的

Green Master Mix。引物序列从PrimerBank获得(表VI)。

表VI

目标	正义	反义
			IGF2	GTC GCA TGC TTG CCA AAG AG	GGT GGT AAC ACG ATC AGG GG
IGF2-HA	GTC GCA TGC TTG CCA AAG AG	TAG ACG TAA TCT GGA ACA TCG
			Actin	TAC CAC CAT GTA CCC AGC A	CTC AGG AGGAGC AAT GAT CTT GAT

蛋白质印迹

在含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物(西格玛，美国)的RIPA缓冲液(20mM Tris ph8.0，150mM NaCl，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐，0.5％Triton X-100)中从小鼠组织中提取蛋白质。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的PBS中，用1％Triton提取细胞系中的蛋白质。用BCA分析试剂盒(美国皮尔斯)对样品进行定量。通过SDS-PAGE分离细胞总提取物，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。免疫印迹分析使用以下抗体：抗Hsp90(1:3000，SantaCruz)、抗IGF2(1:1000Abcam)、抗polyQ(1:1000Sigma)、抗GFP(1:1000Santa Cruz)、抗DARPP32(1:1000细胞Siganlling)、抗tubulin(1:3000，Millipore)。

神经元培养和转染

神经2A细胞是从ATCC获得的、并在DMEM培养基中添加5％牛血清和抗生素(10000U/ml青霉素，10mg/ml链霉素)，在37℃和5％CO2下培养。

统计

数据表示为平均值和SEM。在实验的基础上，采用Student t检验或Mann-Whitney检验、双向方差分析、Holm-Sidak检验或Bonferroni检验作为事后检验或者Kruskal-Wallis检验、范围内的单向方差分析作为事后检验进行统计学比较。

参考资料

1.W.E.Balch,R.I.Morimoto,A.Dillin,J.W.Kelly,Science.319,916–919(2008).

2.J.Leitman et al.,PLoS One.9,e90803(2014).

3.H.Lee et al.,Hum.Mol.Genet.21,101–114(2012).

4.J.R.Naranjo et al.,J.Clin.Invest.126,627–638(2016).

5.R.L.Vidal et al.,Hum Mol Genet.21,2245–2262(2012).

6.R.Vidal,B.Caballero,A.Couve,C.Hetz,Curr.Mol.Med.11,1–12(2011).

7.C.Hetz,B.Mollereau,Nat Rev Neurosci.15,233–249(2014).

8.H.L.Smith,G.R.Mallucci,Brain(2016),doi:10.1093/brain/aww101.

9.W.Scheper,J.J.M.Hoozemans,Acta Neuropathol.130,315–31(2015).

10.P.Walter,D.Ron,Science(80-.).334,1081–1086(2011).

11.C.Hetz et al.,Genes Dev.23,2294–2306(2009).

12.P.Valdés et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,6804–9(2014).

13.A.M.Fernandez,I.Torres-Alemán,Nat.Rev.Neurosci.13,225–239(2012).

14.E.Carro et al.,Neurobiol.Aging.27,1250–1257(2006).

15.B.K.Kaspar,J.Lladó,N.Sherkat,et al,Science.301,839–42(2003).

16.C.K.Franz et al.,Neurobiol.Dis.33,473–81(2009).

17.M.Pascual-Lucas et al.,EMBO Mol.Med.6,1246–1263(2014).

18.T.J.Mellott,S.M.Pender,R.M.Burke,et al,PLoS One.9,e94287(2014).

19.I.Allodi et al.,Sci.Rep.6,25960(2016).

20.E.J.Rivera et al.,J.Alzheimers.Dis.8,247–68(2005).

21.W.E.Heywood et al.,Mol.Neurodegener.10,64(2015).

22.D.et al.,J.Alzheimers.Dis.48,637–46(2015).

23.P.Garcia-Huerta,P.Troncoso-Escudero,C.Jerez,C.Hetz,R.L.Vidal,BrainRes.(2016),doi:10.1016/j.brainres.2016.02.052.

24.FaulíTrillo C,"Tratado de Farmacia Galénica"(Ed Luzán 5,SA,Madrid,ES,1993.)and Gennaro A,Ed.,"Remington:The Science and Practice de Farmacia"20a ed.(Lippincott Williams Wilkins,Philadelphia,PA,Estados Unidos,2003).

25.Product Data Sheet Paav-MCS Expression vector,Catalog Number:VPK-410.

26.A.Zuleta,R.L.Vidal,D.Armentano,G.Parsons,C.Hetz,Biochem BiophysRes Commun.420,558-563(2012).

27.Candace et al(2005)Journal of Pharmaceutical Sciences,volume94number(6),pages 1187-1195.

28.Constantini et al(2000)Gene Therapy volume 7,pages 93–10.

29.Ulusoy et al(1999)Molecular Theraphy volume 17,no 9,pages 1574-1584.

30.Carter B,asociados-A.deno para la entrega de genes,Lassic D,et al,Eds,"Gene"Therapy:Mecanismos y estrategias terapéuticas"..(Marcel Dekker,Inc.,Nueva York,NY,Estados Unidos,2000)and Gao et al.,J.Virol.2004；78(12):6381-6388.

表I

pAAV/2-MCS质粒的特征及序列。

基因组：AF043303.1

起源

1TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC

61CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG

121GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG

181GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT

241GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA

301 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG

361 ACCTTGACGA GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG

421 AATGGGAGTT GCCGCCAGAT TCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA

481 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC

541 CGGAGGCCCT TTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC

601 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG

661 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG

721 TCACAAAGAC CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAACAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC

781 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC

841 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA

901 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC

961 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA

1021 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATACATCTCCTTCA

1081 ATGCGGCCTC CAACTCGCGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCGGGAAAGATTA

1141 TGAGCCTGAC TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTGGAGGACATTT

1201 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAATATGCGGCTT

1261 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATCTGGCTGTTTG

1321 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACTGTGCCCTTCT

1381 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTCGACAAGATGG

1441 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCCAAAGCCATTC

1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAGATAGACCCGA

1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGGAACTCAACGA

1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTCACCCGCCGTC

1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTCCGGTGGGCAA

1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGAGCCAAGAAAA

1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAGTCAGTTGCGC

1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTACCAAAACAAAT

1921 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGCGAGAGAATGA

1981 ATCAGAATTC AAATATCTGC TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAGTGCTTTCCCG

2041 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTCGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTGTGCTACATTC

2101 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTCAATGTGGATT

2161 TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGA TTTAAATCAG GTATGGCTGCCGATGGTTAT

2221 CTTCCAGATT GGCTCGAGGA CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTGGAAGCTCAAA

2281 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAGGGGTCTTGTG

2341 CTTCCTGGGT ACAAGTACCT CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGAGCCGGTCAAC

2401 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCTCGACAGCGGA

2461 GACAACCCGT ACCTCAAGTACAACCACGCC GACGCGGAGT TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA

2521 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAAGAGGGTTCTT

2581 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAAGAGGCCGGTA

2641 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGGCCAGCAGCCT

2701 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGACT GGAGACGCAG ACTCAGTACCTGACCCCCAG

2761 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGATGGCTACAGGC

2821 AGTGGCGCAC CAATGGCAGACAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCGGGA

2881 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCATCACCACCAG CACCCGAACC

2941 TGGGCCCTGC CCACCTACAACAACCACCTC TACAAACAAATTTCCAGCCA ATCAGGAGCC

3001 TCGAACGACAATCACTACTT TGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGACTTCAACAGA

3061 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAACTGGGGATTC

3121 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGTCACGCAGAAT

3181 GACGGTACGACGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG

3241 GAGTACCAGC TCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCCGCCGTTCCCA

3301 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGGGAGTCAGGCA

3361 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCTGCGTACCGGA

3421 AACAACTTTA CCTTCAGCTACACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC

3481 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTATTACTTGAGC

3541 AGAACAAACA CTCCAAGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTCTCAGGCCGGA

3601 GCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG

3661 CGAGTATCAAAGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC

3721 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GCCCGGCCATGGCAAGCCAC

3781 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGGGAAGCAAGGC

3841 TCAGAGAAAA CAAATGTGGA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGAGGAAATCAGG

3901 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCTCCAGAGAGGC

3961 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGGCATGGTCTGG

4021 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCAA AGATTCCACACACGGACGGA

4081 CATTTTCACC CCTCTCCCCT CATGGGTGGA TTCGGACTTA AACACCCTCCTCCACAGATT

4141 CTCATCAAGAACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT

4201 GCTTCCTTCA TCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCG TGGAGATCGA GTGGGAGCTG

4261 CAGAAGGAAAACAGCAAACG CTGGAATCCC GAAATTCAGT ACACTTCCAA CTACAACAAG

4321 TCTGTTAATG TGGACTTTAC TGTGGACACT AATGGCGTGT ATTCAGAGCCTCGCCCCATT

4381 GGCACCAGAT ACCTGACTCG TAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAAC CGTTTAATTC

4441GTTTCAGTTG AACTTTGGTC TCTGCGTATT TCTTTCTTAT CTAGTTTCCA TGGCTACGTA

4501GATAAGTAGC ATGGCGGGTT AATCATTAAC TACAAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC

4561ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC

4621CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAA

表II

pAAV2–IGF2载体序列

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTGAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

特征:

表III

AAV2–IGF2-HA载体序列

CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

特征:

表IV

Igf2(小鼠)

TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAG

表V

Igf2-HA(小鼠)

TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAA

表VII

IGF2(人类)

ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCGACCCCTCCGACCGTGCTTCCGGACAACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAAGCAGTCCACCCAGCGCCTGCGCAGGGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCACGTGCTCGCCAAGGAGCTCGAGGCGTTCAGGGAGGCCAAACGTCACCGTCCCCTGATTGCTCTACCCACCCAAGACCCCGCCCACGGGGGCGCCCCCCCAGAGATGGCCAGCAATCGGAAGTGA

Claims

1.一种腺相关病毒(AAV)，其特征在于，包含重组病毒基因组，其中所述基因组包含一个表达盒，所述表达盒包含一个神经组织的特异转录的调控区，所述神经组织可操作地连接到一个感兴趣的多核苷酸，Igf2或Igf2-HA。

2.根据权利要求1所述的腺相关病毒，其特征在于，所述AAV血清型是从包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4及伪型AAVs的组中选出的。

3.根据权利要求1及2所述的腺相关病毒，其特征在于，所述调控区包括一个从包含CAG、CMV、b-珠蛋白、CBA、eIFalpha、PGK等的组中选择的启动子区域。

4.根据权利要求3所述的腺相关病毒，其特征在于，选自所述组的启动子区域为CAG。

5.根据权利要求1和2所述的腺相关病毒，其特征在于，其包括选自HA、FLAG、GFP、His和Myc等免疫应答位点的编码区。

6.根据权利要求5所述的腺相关病毒，其特征在于，所述免疫应答位点的编码区是HA。

7.根据权利要求2所述的腺相关病毒，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型提供了在给定每种血清型的趋向性的情况下表达转基因的细胞类型的特异性。

8.根据权利要求8所述的腺相关病毒，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型类型对神经系统细胞具有更高的亲和力。

9.根据权利要求2所述的腺相关病毒，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型类型为2号和/或伪型病毒2/2。

10.根据前述权利要求所述的腺相关病毒，其特征在于，所述表达盒包含一个转录后调控区。

11.根据权利要求10所述的腺相关病毒，其特征在于，所述转录后调节区是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

12.根据权利要求1至11所述的腺相关病毒，其中腺相关病毒的ITR是衍生自AAV1、AAV2、AAV3和AAV4的ITR，优选衍生自AAV2的ITR。

13.根据权利要求1至12所述的腺相关病毒，其特征在于，待转录的靶序列包含Igf2或Igf2-HA。

14.根据权利要求13所述的腺相关病毒，其特征在于，待转录的靶序列是Igf2。

15.根据权利要求13所述的腺相关病毒，其特征在于，待转录的靶序列是Igf2-HA。

16.根据权利要求1至15所述的腺相关病毒，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸编码包含IGF2或IGF2-HA的组内的蛋白质，其系统地作用，接近或与神经元神经细胞或与非神经元神经细胞以及细胞内或细胞外一起作用。

17.根据权利要求16所述的腺相关病毒，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸编码IGF2蛋白。

18.根据权利要求16所述的腺相关病毒，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸编码IGF2-HA蛋白。

19.根据权利要求16所述的腺相关病毒，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸作用于神经元细胞。

20.一种药物组合物，其特征在于，其包含如前述权利要求所述的腺相关病毒和药物上可接受的赋形剂。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，包含一剂病毒，范围在每毫升组合物中的基因组拷贝(GC)为10⁹到10¹³之间。

22.一种根据权利要求20所述的药物组合物的用途，其特征在于，是制备用于预防或治疗哺乳动物的亨廷顿氏病的药物。

23.一种根据权利要求1所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，是制备用于预防或治疗哺乳动物的亨廷顿氏病的药物。

24.根据权利要求23所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人类。

25.根据权利要求23所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，所述腺相关病毒或药物组合物全身或局部给药。

26.根据权利要求23所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，所述腺相关病毒或药物组合物需要在神经组织中表达感兴趣的多核苷酸。

27.一种使用根据权利要求1的腺相关病毒的治疗方法，其特征在于，包括：

a.使神经细胞与权利要求1至20所述的腺相关病毒接触；以及

b.在所述神经细胞中表达所述病毒。

28.根据权利要求27所述的使用腺相关病毒的治疗方法，其特征在于，给药途径通过血脑屏障施加到病毒通道，并包括鼻腔途径、通过颅内、脑内和/或鞘内直接注射等。

29.一种多核苷酸，其特征在于，其包含位于腺相关病毒的ITRS两侧的表达盒，其中所述表达盒包含一个启动子、一个免疫应答编码区和一个感兴趣的多核苷酸，IGF2或IGF2-HA。

30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子区域选自包含CAG、CMV、b-珠蛋白、CBA、elFalpha、PGK等的组。

31.根据权利要求30所述的多核苷酸，其特征在于，选自该组的启动子区域是CAG。

32.根据权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，其包含选自HA、FLAG、GFP、His和Myc的免疫应答位点的编码区。

33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其特征在于，其包含HA型免疫应答位点的编码区。

34.根据权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，神经元组织转录的调节区包含启动子区域。

35.根据权利要求34所述的多核苷酸，其特征在于，神经组织转录的调节区包含选自CAG，CMV，b-珠蛋白，CBA，elFα等的启动子区域。

36.根据权利要求36所述的多核苷酸，其特征在于，神经组织转录的调节区包含CAG启动子区域。

37.根据权利要求30至36所述的多核苷酸，其特征在于，表达盒还包含转录后调节区。

38.根据权利要求37所述的多核苷酸，其特征在于，所述转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

39.根据权利要求29所述的多核苷酸，其特征在于，待转录的靶序列包含Igf2和Igf2-HA序列。

40.根据权利要求41所述的多核苷酸，其特征在于，待转录的靶序列是Igf2。

41.根据权利要求39所述的多核苷酸，其特征在于，待转录的靶序列是Igf2-HA。

42.根据权利要求29至41所述的多核苷酸，其特征在于，感兴趣的多核苷酸编码包含IGF2和IGF2-HA的组内的蛋白质，其系统性作用，接近或与神经元细胞一起作用。

43.根据权利要求42所述的多核苷酸，其特征在于，感兴趣的多核苷酸编码IGF2蛋白。

44.根据权利要求42所述的多核苷酸，其特征在于，感兴趣的多核苷酸编码IGF2-HA蛋白。

45.根据权利要求29的多核苷酸，其特征在于，感兴趣的多核苷酸系统性作用，靠近神经元细胞或与神经元细胞一起作用，对皮层和纹状体中的细胞是特异性的。

46.一种质粒，其特征在于，包含一个腺相关载体的序列、一个位于腺相关病毒的ITRs两侧的表达盒，其中所述表达盒包含一个启动子、一个免疫应答的编码区和一个感兴趣的多核苷酸，例如在国际生物保藏机构中保存的、包含在国际生物保藏机构、智利微生物遗传资源收藏(CChRGM)保存的质粒转化而成的大肠杆菌菌株中，其保存编号分别为RGM2335和RGM2336。

47.一种腺相关病毒，其特征在于，包含在权利要求29至45中所述的病毒基因组。

48.一种获取腺相关病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提供一种细胞，其包含如权利要求30至46中任一项所述的多核苷酸、AAV Cap蛋白、AAV Rep蛋白以及AAV复制所依赖的病毒蛋白；

b.保持细胞在AAV组装的适当条件下；以及

c.纯化细胞产生的腺相关病毒载体。

49.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，AAV依赖于源自腺病毒的复制。

50.根据权利要求48和49所述的方法，其特征在于，腺相关病毒的Cap和Rep蛋白衍生自选自血清型AAV1，AAV2，AAV3，AAV4和伪型AAV的AAV。

51.根据权利要求50所述的方法，其特征在于，腺相关病毒的Cap和Rep蛋白来源于血清型AAV2。

52.一种根据权利要求1的腺相关病毒的用途，其特征在于，其可用于制备用于平衡患有亨廷顿氏病的哺乳动物患者中IGF2的生理浓度的药物。

53.根据权利要求52所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，所述哺乳动物是人。

54.根据权利要求52所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，腺相关病毒或药物组合物全身或局部给药。

55.根据权利要求52所述的腺相关病毒的用途，其特征在于，腺相关病毒或药物组合物需要在神经组织中表达感兴趣的多核苷酸。