WO2018101454A1 - 新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ - Google Patents

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WO2018101454A1
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華子 伊藤
泰典 小野
健介 中村
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第一三共株式会社
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    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/785—Mucor

Definitions

  • the present invention relates to endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase that retains activity under high temperature conditions, a gene encoding the enzyme, a recombinant plasmid, a transformant transformed with the plasmid, and the like.
  • Glycoproteins are widely present in animal and plant tissues, cell membranes and walls of eukaryotic microorganisms.
  • sugar chains of glycoproteins play an important role in the mechanisms such as cell differentiation, canceration, and intercellular recognition. Research on the correlation is ongoing.
  • attempts such as sugar chain remodeling in which sugar chains contained in glycoproteins such as antibodies are replaced with sugar chains of a uniform structure, and sugar chains modification of peptides and low-molecular compounds are being advanced.
  • a sugar chain cut out from a naturally occurring glycoprotein / glycopeptide having a uniform sugar chain using an enzyme such as endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is used. .
  • Typical examples of sugar chains contained in animal glycoproteins include N-linked sugar chains that bind to asparagine side chains.
  • N-linked sugar chains are classified into a high mannose type, a hybrid type and a complex type depending on the structure, but have a chitobiose structure in which two GlcNAc are linked to the reducing end as a common structure.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is an enzyme having both the activity of hydrolyzing the glycosidic bond between the chitobiose structures and the transglycosylation activity for binding the cut sugar chain to an acceptor having a specific structure.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is isolated from various biological species, has different substrate specificities, and is selectively used according to the purpose. Among them, the following have been reported as endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase using a complex type sugar chain as a substrate.
  • Endo-M is an enzyme derived from Mucor himalis, and its substrate specificity is 4.4 with respect to a complex type biantennary sugar chain when the activity against high mannose Man8GlcNAc2 is 100%.
  • Non-Patent Document 1 Fujita et al., (2004) Arch Biochem Biophy. 432: p41-49.
  • the expression of Endo-M using Escherichia coli was all insoluble aggregates in the expression induction at 37 ° C., and the enzyme activity of the soluble fraction was weak when the induction temperature was changed to 20 ° C.
  • yeast was examined, and proper expression in E. coli was considered difficult.
  • Endo-Om is an enzyme derived from yeast Ogataea minuta (Patent Document 1: WO2013 / 051608 or US2014-0313246), and uses a complex type sugar chain as a substrate, and an optimum temperature in a hydrolysis reaction. Is reported to be 50 ° C. There is no known expression outside of yeast.
  • Endo-F2 and Endo-F3 are enzymes derived from Elizabethkingia miracola (Non-Patent Document 2: Tarentino AL et al., (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708), and Endo-F2 is a high mannose type.
  • the 2-branch complex type sugar chain is hydrolyzed, there is no hydrolysis activity of the hybrid sugar chain.
  • Endo-F3 hydrolyzes a 2-branch or 3-branch complex type sugar chain, but has no hydrolyzing activity of a high-mannose type, mixed sugar chain.
  • Endo-S is an enzyme derived from Streptococcus pyogenes, which hydrolyzes only two-branch complex type sugar chains, but has no hydrolytic activity of high mannose type, mixed sugar chains (Non-patent Document 3: Goodfellow JJ et al. (2012) J Am Chem Sci. 134: p8030-8033).
  • Endo-CE is an enzyme derived from Caenorhabditis elegans, which hydrolyzes high mannose type and biantennary complex type sugar chains, but it is unclear whether it can cleave mixed sugar chains (Non-Patent Document 4: Kato). T et al., (2002) Glycobiology 12: p581-587). The optimum temperature in the hydrolysis reaction is reported to be 20 ° C.
  • Endo-CC is an enzyme that has been reported as being capable of expression in E. coli as compared to Endo-M and Endo-Om, which have been known in the past.
  • Non-Patent Document 5 Y. Eshima et al., (2015) PLoS One.21; 10 (7): e0132859
  • the optimum temperature for the hydrolysis reaction is reported to be 35 ° C.
  • an enzyme that retains activity at a high temperature of about 50 ° C. is desired from the viewpoint of improving reaction efficiency and preventing contamination with bacteria.
  • the safety problem of pharmaceuticals can be reduced by arranging the host species. Escherichia coli is often selected as the host for such raw materials, and it is desirable that E. coli has a production capacity of a certain amount or more.
  • no endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase using a known complex-type sugar chain as a substrate has been known to maintain its activity under high temperature conditions and exhibit good production ability in E. coli.
  • Rhizomucor pusillus (R. pusilllus), a kind of thermophilic fungus, has an optimum growth temperature of 35 to 45 ° C. and is known as a bacterium for producing rennet for cheese production.
  • R. For the genome sequence of pusillus see R. Sequence information derived from the Pusillus CBS 183.67 strain is published on the database of Genozymes Project (Concordia University). In the same database, a gene having 41.56% homology with Endo-M and the amino acid sequence encoded by it (SEQ ID NO: 7) were registered, but no annotation on activity was described so far.
  • SEQ ID NO: 7 a gene having 41.56% homology with Endo-M and the amino acid sequence encoded by it
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (hereinafter referred to as “known deduced sequence”) estimated to be endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase on the database has the amino acid sequence of positions 191 to 198 represented by Leu-Ala-Asn. -Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg (LANTYYIR).
  • An object of the present invention is to provide a novel endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase that can be produced by Escherichia coli and retains hydrolysis activity for complex sugar chains under high temperature conditions.
  • the present invention provides the following inventions.
  • polypeptide of (1) having the following characteristics (A) and (B): (A) an amino acid comprising an amino acid sequence having 75% or more identity and 95% or more similarity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and corresponding to the amino acid sequences of amino acid numbers 191 to 195 of SEQ ID NO: 1
  • the sequence is Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL);
  • the hydrolysis activity for complex sugar chains shows 40% or more of the maximum activity value at any temperature of 45-60 ° C.
  • polypeptide of (1) comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • polypeptide according to any one of (1) to (6) which has an amino acid sequence satisfying the characteristic (A) and has at least one of the mutations shown in SEQ ID NO: 23.
  • N172 is a mutation substituted with Gln, Asp, Gly, Ala, Phe, Cys, His, Ile, Ser, Thr, Val or Met
  • D176 is substituted with Arg
  • Y214 is substituted with Phe
  • S216 Is a mutation in which L is replaced with Val
  • L245 is replaced with Ser
  • N246 is replaced with Asp
  • T275 is replaced with Ile
  • F283 is replaced with Ser
  • L306 is replaced with Ile
  • a mutation in which F307 is replaced with Tyr
  • a mutation in which A310 is replaced with Asp
  • E314 is replaced with Gln.
  • the novel endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase of the present invention retains good hydrolysis activity for complex-type sugar chains under high-temperature reaction conditions of 50 ° C. or higher, so that bacteria can be proliferated in pharmaceutical production using the enzyme. It is possible to obtain sugar chains safely and efficiently under high temperature conditions that can be prevented and high reaction efficiency can be expected.
  • the enzyme of the present invention can be produced with a good amount of enzyme by a heterologous expression system using Escherichia coli. When raw materials other than the enzyme (bioactive peptides / proteins, other enzymes, etc.) are produced by Escherichia coli, the final product safety is ensured by aligning the host species of the biological material. This makes it easier to evaluate the influence of the raw material host species on sex.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a hydrolysis reaction using SGP as a substrate by Endo-Rp.
  • FIG. 2 is a chart of LC-MS analysis results of the SGP pre-enzyme solution (upper) and the crude enzyme-treated solution (lower) under analysis condition A. The large peak detected at 3-4 minutes indicates SGP, and the peak detected at around 4.5-5 minutes indicates SG (10).
  • FIG. The temperature dependence of hydrolysis activity against SGP of the crude enzymes (NBRC 9740 ( ⁇ ), NBRC 9741 ( ⁇ ), NBRC 9742 ( ⁇ ) and NBRC 9743 ( ⁇ )) and Endo-M ( ⁇ ) derived from the pusillus strain It is a graph to show.
  • the X axis represents the reaction temperature (° C.), and the Y axis represents the hydrolysis rate.
  • FIG. 4 shows the alignment of the amino acid sequences of Endo-Rp and its various homologues, Endo-Rm, and known deduced sequences.
  • FIG. 5 is a graph showing time-dependent changes in hydrolysis activity of Endo-Rp ( ⁇ ), Endo-M ( ⁇ ), Endo-S ( ⁇ ) and Endo-Om (() with respect to SGP.
  • the X axis represents the elapsed time after the start of the reaction, and the Y axis represents the hydrolysis rate.
  • FIG. 6 is a graph showing the temperature dependence of the hydrolysis activity of Endo-Rp on SGP.
  • FIG. 7 is a graph showing the pH dependency of hydrolysis activity of Endo-Rp on SGP.
  • the X axis represents the pH value of the reaction solution, and the Y axis represents the hydrolysis rate.
  • FIG. 8 is a chart of LC-MS analysis results of an Endo-Rp reaction solution of SGP alone (top) and SGP + acceptor ((GlcNAc ⁇ ) Asn) (bottom).
  • a large peak detected in the vicinity of 1 minute indicates SGP
  • a peak detected in the vicinity of 4 to 5 minutes indicates SG (10)
  • a peak detected in the vicinity of 3 minutes indicates (SG ⁇ ) Asn.
  • FIG. 1 minute indicates SGP
  • a peak detected in the vicinity of 4 to 5 minutes indicates SG (10)
  • a peak detected in the vicinity of 3 minutes indicates (SG ⁇ ) Asn.
  • FIG. 9 is a graph showing the time course of the transglycosylation activity of Endo-Rp ( ⁇ ) and Endo-Rp N172Q ( ⁇ ).
  • the X axis shows the elapsed time (hours) after the start of the enzyme reaction, and the Y axis shows the rate of sugar transfer (%).
  • the present invention provides the following characteristics (A) and (B): (A) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having 75% or more identity and 95% or more similarity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 ⁇ Endo-Rp amino acid sequence >> and differing from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 An array; (B) Hydrolysis activity and / or transglycosylation activity for complex-type sugar chains shows 40% or more of the maximum activity value in the range of 45-60 ° C; Provided is endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase, a polypeptide having
  • “complex type sugar chain” means a sugar chain having a basic structure consisting of the following formulas (I) and (II) among human type N-linked sugar chains.
  • the sugar chain has a structure having GlcNAc in two branched chains (1-3 chain, 1-6 chain) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located close to the reducing end, on the non-reducing end side
  • GlcNAc in two branched chains (1-3 chain, 1-6 chain) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located close to the reducing end, on the non-reducing end side
  • ⁇ -mannose mannose
  • SGP sialyl glycopeptide
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is an enzyme that recognizes a sugar chain as a substrate and has both hydrolysis activity and transglycosylation activity.
  • Natural-type endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase has both activities. By modifying the amino acid sequence, the activity is adjusted, and either mutants that enhance or attenuate one of the activities. By eliminating such activity, an enzyme that retains only hydrolysis activity or transglycosylation activity can also be produced.
  • the present invention includes not only natural types but also these mutant enzymes.
  • the hydrolysis activity of the enzyme of the present invention is the activity of specifically hydrolyzing the ⁇ 1,4 glycosidic bond contained in the core chitobiose composed of two consecutive GlcNAc on the reducing end side of the above-mentioned complex type sugar chain (this specification) Unless otherwise specified, "hydrolysis activity” means this activity.) For example, in the hydrolysis reaction with endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase using SGP as a substrate, as shown in FIG. 1, SG (10) having a structure excluding GlcNAc at the reducing end of SG (the following formula (V ) And (VI) structure).
  • the transglycosylation activity of the enzyme is a molecule having only GlcNAc as a sugar or a molecule containing a sugar chain having GlcNAc at the non-reducing end (hereinafter referred to as “acceptor molecule”), and having a GlcNAc at the reducing end and serving as a sugar chain donor. This is an activity of binding the reducing end of the derived sugar chain to ⁇ 1,4 glycoside (hereinafter referred to as “glycosyl transfer activity”).
  • SG (10) derived from SGP is transferred to GlcNAc of the acceptor molecule.
  • (SG-) Asn represented by the following formula (VIII) is generated.
  • SG-A represented by the following formula (X) is generated by a sugar transfer reaction using GlcNAc-AcA having the structure of the following formula (IX) as an acceptor molecule and SGP as a donor molecule.
  • the enzyme of the present invention is not limited to the enzyme having the specific sequence obtained in the examples as long as it has the above-described characteristics, and even an enzyme isolated from nature can be used.
  • the enzyme may be artificially prepared or modified based on the sequence information of the enzyme.
  • the biological species as the separation source is not particularly limited, but is preferably a fungus, more preferably a thermophilic fungus, still more preferably a fungus belonging to the genus Rhizomucor, and even more preferably Rhizomucor pusillus. Alternatively, it is a fungus belonging to Rhizomucor miehei.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase having this property has been cloned from a plurality of strains belonging to the thermophilic fungus Rhizomucor pusilllus (R. pusilllus).
  • Endo-Rp (amino acid sequence: SEQ ID NO: 1, strain-derived nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 8), and enzyme derived from NBRC 9740 strain: Endo-Rp2 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 2, strain) Derived nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 10), enzyme derived from NBRC 9741 strain, Endo-Rp3 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 3, strain-derived nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 12), and enzyme derived from NBRC 9743 strain, Endo-Rp4 ( Amino acid sequence: SEQ ID NO: 4, strain-derived nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 14).
  • All strains of pusillus can be obtained from NBRC, all of which are from Japan.
  • SEQ ID NO: 7 (presumed nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 20), which was disclosed as the deduced amino acid sequence of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase, based on the sequence information of the publicly available strain of pusilllus, When the expression system was optimized and expressed in E. coli, almost no enzyme expression was confirmed, and the enzyme activity was very low (Example 3).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 the amino acid corresponding to the 193rd Lys of SEQ ID NO: 1 is substituted with the amino acid of Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg (see FIG. 4).
  • Endo-Rp5 consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) in which Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg from 193 to 198 of SEQ ID NO: 7 is substituted with Lys in the same manner as SEQ ID NO: 1 is appropriately expressed in E. coli.
  • the enzyme having this amino acid sequence was named Endo-Rp5. From this, the sequence corresponding to positions 191 to 195 of SEQ ID NO: 1 is identified as a very important region for the properties of the enzyme of the present invention.
  • Endo-Rp and its homologues Endo-Rp2, Endo-Rp3, Endo-Rp4 and Endo-Rp5 have an amino acid sequence identity of 99% or more, and Endo-Rp2 has mutations of A128T and K569T in SEQ ID NO: 1.
  • Endo-Rp3 is a homolog having the mutations of D333G, I434L, I527V, K569T, F610S and H626R in SEQ ID NO: 1
  • Endo-Rp4 is a homolog having the mutations of V460A and K569T in SEQ ID NO: 1.
  • Endo-Rp5 is a homologue having the K569T mutation in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of Endo-Rm shows 96% similarity and 77% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the regions 54 to 340 have high identity (identity: 89%, similarity: 97%)), and the 190th to 195th His-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (HLAKLL) is It is completely identical and satisfies the characteristic (A) of the enzyme of the present invention.
  • the protein When the enzyme of the present invention is an enzyme derived from a fungus, the protein may be isolated from a fungal culture supernatant or a cell disruption solution, and using a heterologous expression system such as Escherichia coli or yeast. It may be an expressed enzyme. While many of known endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases are known to be produced in a heterogeneous expression system using E. coli, the amino acid sequence of the enzyme of the present invention uses E. coli. It has the characteristic of showing good production efficiency in the expression system. When a protein derived from a fungus is expressed in E. coli, the nucleic acid sequence is generally optimized to a sequence suitable for E. coli expression.
  • Endo-M N175Q one amino acid variant
  • Escherichia coli was 3.7 mg / L culture.
  • Endo-CC has been reported to be 0.4 mg / L culture.
  • the expression level of the enzyme of the present invention in E. coli is 10 mg / L culture or more (preferably 12 mg / L culture or more, more preferably 15 mg / L culture or more, which is higher than that of conventional enzymes.
  • the amino acid sequence of the enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence showing 75% or more identity and 95% or more similarity to the full-length amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is different from SEQ ID NO: 7 (preferably,
  • the amino acid corresponding to amino acid number 193 of SEQ ID NO: 1 is Lys (preferably the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of amino acid numbers 192 to 194 is Ala-Lys-Leu (AKL), more preferably the amino acids of amino acid numbers 191 to 195
  • the amino acid sequence corresponding to the sequence is Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL))).
  • the amino acid sequence identity is a value obtained by quantifying the amino acid matching ratio with respect to the full-length sequence, assuming that the corresponding amino acids are completely identical amino acids.
  • similarity of amino acid sequences means that the relationship between two amino acid sequences is quantified in consideration of the similarity if the corresponding amino acids have similar properties. .
  • the sequence identity and similarity in the present invention is calculated using GENETYX-SV / RC (Genetics Co., Ltd.), which is a sequence analysis software, and this algorithm is usually used in the art. It is.
  • Endo-Rp The active domain of Endo-Rp is based on sequence comparison with Endo-A (Zhenlian Ling et al, Journal of Molecular Biology (2009), Vol. 389, No. 1, Pages 1-9) for which crystal structure analysis has been performed. This region was estimated to be a region of amino acid numbers 1 to 374 of SEQ ID NO: 1. In fact, the sequence identity between the amino acid sequence of the enzyme of the present invention (Endo-Rp1-5, Endo-Rm) and SEQ ID NO: 1 is 75% or more in comparison with the full-length sequence, but it is a region presumed to be an active domain The identity in the region of amino acid numbers 54 to 341 in SEQ ID NO: 1 was 89%, indicating a very high identity.
  • the identity of the full-length amino acid sequence is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more.
  • the identity of the region of amino acid numbers 54 to 341 of SEQ ID NO: 1 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and even more preferably 98%. %, Most preferably the amino acid sequence of this region is completely identical.
  • the notation of the amino acid contained in the molecule is in accordance with the convention of this field, and in the case of showing the mutation site, the one-letter code of the wild type amino acid (or nucleic acid) and its number (for example, the 172nd Asn If there is, it is represented by “N172”).
  • the mutation the one-letter code of the wild-type amino acid (or nucleic acid), its number and the one-letter code of the amino acid (or nucleic acid) after the mutation (for example, “N172Q” is a mutation in which 172nd Asn is substituted with Gln) ).
  • a specific mutant having a mutation is represented by a molecular name and a mutation (for example, a mutant in which 172nd Asn of Endo-Rp is substituted with Gln is “Endo-Rp N172Q”) and has a plurality of mutations.
  • the mutation is separated by “/” (for example, in Endo-Rp N172Q, a mutant having an additional mutation in which the 278th Trp is substituted with Phe is “Endo-Rp N172Q / W278F”) and To express.
  • the enzyme of the present invention may have amino acid mutations (substitutions), deletions, insertions and / or additions as long as it retains a certain level of identity / similarity to SEQ ID NO: 1.
  • the sequence corresponding to 193 to 198 of SEQ ID NO: 7 is a sequence different from Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg, preferably the 193rd of SEQ ID NO: 1 (preferably 192 to 194, more preferably
  • the portion corresponding to the 191st to 195th amino acids has an amino acid sequence completely identical to SEQ ID NO: 1.
  • the region showing the completely same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1 is preferably the region of amino acid numbers 118 to 332, more preferably the region of 54 to 341, and further preferably the region of 1 to 374. is there.
  • the sequence identity / similarity described above is maintained, and in any region of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6 except for the above-described completely identical region (preferably 5 sites or less, More preferably 3, 2 or 1 position) several amino acids per position (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, still more preferably 5, 4, 3, 2 or 1) are substituted, It may be deleted, inserted and / or added.
  • Such amino acid deletion can be achieved by, for example, removing several amino acids from the N-terminal and / or C-terminal of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 as the enzyme of the present invention. It is conceivable that polypeptides that retain the properties can be obtained.
  • the enzyme having a mutation in at least one of the positions represented by Xaa in SEQ ID NO: 23 retains at least one of hydrolytic activity and transglycosylation activity. ing.
  • amino acid numbers 1 to 374 of SEQ ID NO: 1 are presumed to be active domains.
  • the enzyme has a mutation in the active domain. Variants that retain activity or are tuned to the desired activity can be designed.
  • amino acid substitutions are allowed in A128, D333, I434, V460, I527, K569, F610 and H626 of SEQ ID NO: 1 from the results of various homologues.
  • many mutants in which amino acids in the active domain were substituted were produced, and many of them had a decreased apparent activity compared to wild-type Endo-Rp, but they were not modified to sugar chains. It was confirmed that the hydrolytic activity and / or transglycosylation activity of a certain level that can be used was retained (at least the specific activity value of either activity was 0.5% or more of wild-type Endo-Rp). It was confirmed that certain amino acid substitutions are allowed even in the region. Specifically, the following amino acid mutations are allowed.
  • N172 is considered to be an active residue that contacts the substrate.
  • substitution is to an amino acid other than Trp, Arg, and Tyr, the activity is retained, so that an amino acid other than an amino acid having a bulky side chain is introduced. Replacement is widely acceptable.
  • substitution with a highly polar amino acid such as Gln and Asp, or Gly, Ala, Phe, Cys, His, Ile, Ser, Thr, Val, Met, etc., results in a transfer activity ratio (transfer activity / hydrolysis). It was confirmed that the decomposition activity was enhanced.
  • D176 is considered to allow substitution with many amino acids because the activity was maintained even when substituted with Arg.
  • substitution with Arg is useful for the production of mutants with enhanced transfer activity ratios.
  • Y214 accepts an amino acid having a relatively large side chain, since both activities are greatly reduced with a small side chain amino acid such as Ala. Substitution with Phe is useful for the production of mutants with enhanced ratio of metastasis activity.
  • S216 is substituted with an amino acid having a small side chain (preferably Ala or Val) to maintain the glycosyltransferase activity and reduce the hydrolytic activity
  • these mutations are mutations that enhance the ratio of metastasis activity. Useful for the production of the body.
  • L245 is considered to allow substitution with many amino acids since the activity was maintained even when substituted with Ser. Substitution with Ser is also useful for the production of mutants with enhanced transfer activity ratio.
  • N246 is considered to be difficult to tolerate large changes, but the substitution of Asp greatly reduced the hydrolysis activity while maintaining the transfer activity, so such a mutation is a mutant mutant with an increased transfer activity ratio. Useful for production.
  • T275 is considered to allow substitution with many amino acids because the activity was maintained even after substitution with Ile.
  • substitution with Ile is useful for the production of mutants with enhanced transfer activity ratio.
  • W278 is considered that hydrophobic interaction with the substrate sugar chain contributes to activity, and is considered to allow amino acids having highly hydrophobic side chains such as Tyr, Phe, Ala, Leu, and Ile.
  • F283 is considered to allow substitution with many amino acids because the activity was maintained even after substitution with Ser. Substitution with Ser is also useful for the production of mutants with enhanced transfer activity ratio.
  • L306 has no significant fluctuation in activity due to substitution with Ile, but it has a tendency to maintain glycosyltransferase activity and reduce hydrolysis activity, so it is useful for the production of mutants with enhanced transposition activity ratio. it is conceivable that. Moreover, from the presumed three-dimensional structure, an amino acid having a bulky side chain or an amino acid having a charged side chain may not be preferable.
  • F307 is considered to allow various amino acids such as His and Tyr. This substitution to His or Tyr greatly reduces the hydrolysis activity over the transglycosylation activity, and thus is useful for the production of a mutant with an enhanced transposition activity ratio.
  • A310 is substituted with an amino acid (preferably Asp, Glu, Lys, Ser, etc.) having a polar residue or a charged residue in the side chain, thereby reducing hydrolysis activity more greatly than transglycosylation activity. These mutations are useful for the production of mutants with an enhanced metastasis activity ratio.
  • an amino acid preferably Asp, Glu, Lys, Ser, etc.
  • E314 is considered to allow substitution without significant fluctuation in activity even when substituted with Gln.
  • the mutation (A128, N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275 of SEQ ID NO: 1) that satisfies the characteristic (A) of the present invention and is shown in SEQ ID NO: 23 is preferable.
  • At least selected from A128T (Rp2), D333G (Rp3), I434L (Rp3), V460A (Rp4), I527V (Rp3), K569T (Rp2-4), F610S (Rp3) and H626R (Rp3) in SEQ ID NO: 1 Has one mutation In the amino acid sequence, or an amino acid sequence thereof having a mutation in at least one amino acid of N172, D176, Y214, S216, L245, N246, T275, W278, F283, L306, F307, A310 and E314 Yes, a plurality of mutations may occur simultaneously, and those containing all mutations are also included in the enzyme of the present invention.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase has both hydrolytic activity and transglycosylation activity, an enzyme that retains strong hydrolytic activity hydrolyzes the sugar chain transferred to the acceptor molecule by the translocation activity as a substrate. Therefore, the desired glycosyl transferase may not be appropriately obtained. Therefore, in the synthesis of the sugar chain modifying compound, such a transfer mutant enzyme is also important.
  • SEQ ID NO: 1 a mutation in which N172 is substituted with Gln or Asp, a mutation in which D176 is substituted with Arg, a mutation in which Y214 is substituted with Phe, or S216 in Val Substituted mutations, mutations with L245 replaced with Ser, mutations with T275 replaced with Ile, mutations with W278 replaced with Phe or Tyr, mutations with F283 replaced with Ser, L306 replaced with Ile Mutation, F307 is replaced with Tyr, and A310 is replaced with Asp.
  • E314 is substituted with Gln.
  • the mutation employed in the glycosyltransferase of the present invention at least one of these may be employed, whether it is a single mutation or a multiple mutant containing a plurality of these mutations. good.
  • Preferred variants are N172Q, N172D, W278F, N172Q / W278F, N172D / W278F, or Y214 / L306I / F307Y.
  • the enzyme of the present invention has an activity to hydrolyze and / or transfer sugar to a complex type sugar chain, and the activity shows 40% or more of the maximum activity value at any temperature of 45 to 60 ° C.
  • the enzyme of the present invention has an activity to hydrolyze various complex sugar chains as substrates, but as an index for specifying the enzyme, SGP is hydrolyzed as a substrate by the following method, and SG (10) Is evaluated by the activity to produce.
  • the hydrolysis reaction is a reaction solution (total volume) containing a final concentration of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, and 0.02 ⁇ M enzyme (the same amount of buffer is added to blank). 100 ⁇ L) and incubate at a predetermined temperature for 18 hours.
  • the obtained reaction solution and blank solution are analyzed by LC-MS to quantify SGP and SG (10), and the hydrolysis rate and specific activity are calculated by the following equations.
  • the enzyme of the present invention has an activity of recognizing various sugar chain donors and acceptor molecules and transferring the sugar chain.
  • the sugar chain is transferred using SGP as a substrate by the following method. And evaluated by the activity of producing SG-A.
  • reaction solution a final concentration of 1.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, 690 mM GlcNAc-AcA, and 1.0 ⁇ M enzyme (the same amount of buffer is added to the blank).
  • a reaction solution total volume: 30 ⁇ L is prepared and incubated at a predetermined temperature.
  • the reaction solution and blank solution of the reaction for 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 hours, and 96 hours were analyzed by LC-MS to quantify SGP, SG (10) and SG-A.
  • the hydrolysis rate and specific activity are calculated by the following formula.
  • Transfer rate SG-A concentration after reaction (M) / SGP concentration of blank (M) ⁇ 100
  • the hydrolysis activity and / or transglycosylation activity measurement by the above method is performed by appropriately changing the temperature (eg, at intervals of 2, 3, 5 or 10 ° C.) between 10 ° C. and 70 ° C., for example.
  • the relative activity value at any temperature (preferably 50 ° C.) between 45 ° C. and 60 ° C. when the maximum value of the activity value calculated under all temperature conditions is 100% is 40 % Or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 80% or more, and most preferably the maximum activity value in the temperature range.
  • the specific activity is usually measured under optimum temperature conditions of the enzyme.
  • the enzyme of the present invention exhibits a high specific activity.
  • Endo-Rp shows a specific activity of 0.21 ⁇ mol / min / ⁇ g when 69 mM SGP is used as a substrate at 50 ° C., which is the specific activity of Endo-M at 37 ° C. (0.0071 ⁇ mol). / Min / ⁇ g), which is an excellent activity of 30 times.
  • the enzymes of the present invention are not limited to the enzymes and mutants specifically described in the examples of the present specification, and various polypeptides can be used as long as the characteristics (A) and (B) are satisfied.
  • various polypeptides can be used as long as the characteristics (A) and (B) are satisfied. include.
  • at least one of the hydrolytic activity and the transglycosylation activity shows an activity of a certain level or higher compared to the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 under the above temperature conditions, preferably 0 0.5% or more, more preferably 1% or more, further preferably 5% or more, still more preferably 10% or more, and most preferably 30% or more.
  • the present invention further provides a gene having a nucleic acid sequence encoding the enzyme of the present invention.
  • R.P. Pusillus or R Based on genetic information of Miehei, it can also be cloned from the natural world (for example, thermophilic fungi, preferably fungi belonging to the genus Rhizomucor, more preferably R. pusillus or R. miehei). Moreover, based on the amino acid sequence of an enzyme, it can produce as a recombinant gene according to a well-known genetic engineering method.
  • the nucleic acid sequence encoding the enzyme of the present invention includes an amino acid sequence having 75% or more identity and 95% or more similarity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 A sequence encoding a polypeptide having a different amino acid sequence.
  • a nucleic acid sequence for example, the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14, 16 or 18 (including the stop codon) and held by the fungus itself may be used.
  • GeneArt Strings DNA Fragments can be used to produce a nucleic acid having a nucleic acid sequence optimized for expression in E. coli.
  • the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17 and 19 are SEQ ID NOs: 1 (Endo-Rp), 2 (Endo-Rp2), 3 (Endo-Rp3), 4 (Endo-Rp4), 5 This is a nucleic acid sequence optimized for expression in E.
  • nucleic acid sequence encoding the enzyme of the present invention include nucleotide numbers 1 to 2088 of SEQ ID NOs: 8 to 17 and nucleotide numbers 1 to 2091 of SEQ ID NOs: 18 to 19 (preferably encoding Endo-Rp or a homolog thereof) 80% or more, preferably 95% or more, more preferably 95%, even more preferably 98% or more of identity with the nucleic acid sequence described in any one of nucleotide numbers 1 to 2088) of SEQ ID NOs: 8 to 17
  • nucleic acid sequence include a nucleic acid encoding Leu-Ala-Lys-Leu-Leu in the region from 570 to 585 in each nucleic acid sequence.
  • the present invention further includes a gene construct such as a plasmid or expression vector containing a recombinant gene encoding the above-described enzyme of the present invention, a host cell transformed with the gene construct, and a culture of the host cell.
  • a method for producing the enzyme of the present invention and the like including the step of recovering are provided.
  • Host cells transformed by introduction of the gene encoding the enzyme of the present invention animal cells, plant cells, Escherichia coli, yeast, etc., cells normally used for protein production, etc.
  • the target cell is transformed with the plasmid / expression vector, the transformed cell is cultured under appropriate conditions, and the enzyme of the present invention can be recovered from the culture. .
  • a vector or plasmid known in the field of genetic engineering is usually selected according to the cell type in which the plasmid is expressed, and can be constructed according to a known technique.
  • a pET vector, a pCold vector, a pFLAG vector, etc. can be employed for expression in E. coli, but is not limited thereto.
  • E. coli examples include BL21 (DE3), Origami (DE3) and the like.
  • the transformed bacterial solution is inoculated into 25 mL TB medium (50 ug / mL Kanamycin) in a 100 mL flask and shaken at 37 ° C. overnight. Incubate (160 rpm, O / N).
  • Recovery of the enzyme of the present invention is performed by appropriately combining ordinary purification methods using the physical properties of the enzyme.
  • a tag peptide such as His tag or GST is linked to the enzyme in advance.
  • the tag peptide may be removed after purification, but if the enzyme activity is not affected, an enzyme with the tag peptide linked may be used for a reaction such as hydrolysis.
  • the enzyme of the present invention includes an enzyme having an amino acid sequence in which such tag peptides are linked, and specific examples thereof include a His tag (His x 6) at the C-terminus of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6. It is a combined amino acid sequence.
  • the enzyme of the present invention has good production efficiency in E. coli due to the characteristics of its amino acid sequence.
  • the enzyme of the present invention exhibits an expression efficiency of 2 mg or more per 1 L culture in production in E. coli using the above culture conditions, preferably 4 mg or more per 1 L culture, more preferably 8 mg or more, still more preferably Is 12 mg or more, and even more preferably 15 mg or more.
  • the protein concentration described in the present specification was quantified using an ultra-trace spectrophotometer NanoDrop1000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) or NanoDrop2000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • Example 1 Discovery of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase from pusilllus pusillus NBRC 9740, NBRC 9741, NBRC 9742, and NBRC 9743 strain GSYFe slant (5% Glucose, 2% Soytone , 1% Yeast extract, 0.05% FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1.5% agar) to planting Inoculated and cultured at 40 ° C. for 5 days. The bacterial cells were collected, crushed in 2 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25) using a glass homogenizer, and sterilized by filtration to obtain a crude enzyme solution.
  • GSYFe slant 5% Glucose, 2% Soytone , 1% Yeast extract, 0.05% FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1.5% agar
  • the gene encoding endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase was amplified using primer 1 (SEQ ID NO: 22) and 3′-Full RACE Core Set (Takara Bio Inc.), and was used as a pUC19 vector. Cloned.
  • This gene consists of 2091 bases (SEQ ID NO: 8) including a stop codon and encodes a protein with a molecular weight of 78,874 consisting of 696 amino acid residues (SEQ ID NO: 1). This protein was named Endo-Rp. .
  • R.D. Endo-Rp2 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 2), Endo-Rp3 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) and Endo-Rp4 (SEQ ID NO: 4) are also homologues of Endo-Rp from strains of pusillus NBRC 9740, 9741 and 9743. Amino acid sequence) has been cloned. Only Endo-Rp2 was detected from NBRC 9740, but two types of Endo-Rp2 and Endo-Rp3 were detected from NBRC 9741, and two types of Endo-Rp3 and Endo-Rp4 were detected from NBRC 9743. It was done. In all cases, the amino acid sequence identity with Endo-Rp was 99%.
  • Example 3 Expression of Endo-Rp using Escherichia coli Using GeneArt Strings DNA Fragments of Thermo Fisher Scientific for the fungal-derived endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase gene obtained in Example 2, using Escherichia coli.
  • a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 15) optimized for heterologous expression was designed, and a gene encoding a polypeptide having a 6 ⁇ His tag added to the C-terminus of Endo-Rp was prepared using the sequence. This was cloned into the pET24b (+) vector. E. coli BL21 (DE3) was transformed.
  • the transformed bacterial solution was inoculated into 25 mL TB medium (50 ⁇ g / mL Kanmycin) in a 100 mL flask, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight (160 rpm, O / N). 20 mL of this preculture was inoculated into 1 L TB medium (50 ⁇ g / mL Kanamycin, 0.01% antifoam 204, 2 mM MgSO 4 ) in a 2.5 L baffled flask and cultured at 37 ° C. with shaking. (200 rpm, 2 hours). After incubator temperature was lowered to 16 ° C. and culturing for 3 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.2 mM, followed by culturing for 24 hours.
  • TB medium 50 ⁇ g / mL Kanmycin
  • 1 L TB medium 50 ⁇ g / mL Kanamycin, 0.01% antifoam 204, 2 mM MgSO 4
  • the collected cells are suspended in 100 mL of binding buffer (50 mM HEPES (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole, 5% Glycerol), subjected to ultrasonic disruption and centrifugation. Kiyo was purified on Ni Sepharose 6 Fast Flow and HiLoad 16/60 Superdex 200 pg columns (GE Healthcare). The yield ( A280 , extinction coefficient conversion) was 16.9 mg / L broth.
  • binding buffer 50 mM HEPES (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole, 5% Glycerol
  • Endo-Rp Escherichia coli expression vector containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 according to the standard protocol of PrimeSTA Mutageness Basal Kit (Takara Bio Inc.) (Endo-Rp2: SEQ ID NO: 16, Endo-Rp3: SEQ ID NO: 17, Endo-Rp4: SEQ ID NO: 18, Endo-Rp5: SEQ ID NO: 19).
  • Expression induction was performed under the above-mentioned conditions, and only main culture was performed in 100 mL TB medium in a 500 mL baffled flask.
  • the collected cells were suspended in 6 mL of a binding buffer, and the supernatant obtained by sonication and centrifugation was purified with a His GraviTrap column (GE Healthcare).
  • Endo-Rp 2.067 mg (20.67 mg / L culture)
  • Endo-Rp2 2.139 mg (21.39 mg / L culture)
  • Endo-Rp3 2.765 mg. (27.65 mg / L culture)
  • Endo-Rp4 2.301 mg (23.01 mg / L culture)
  • Endo-Rp5 2.187 mg (21.87 mg / L culture)
  • Endo-Rm It was 1.650 mg (16.50 mg / L culture).
  • Example 4 Hydrolysis Activity on Endo-Rp Complex-type Sugar Chain
  • the enzyme obtained in Example 3 was measured for hydrolysis activity by the method described above.
  • Endo-M manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • EndoS and Endo-Om were used as comparative objects.
  • reaction solution (total volume 100 ⁇ L) containing 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, and 0.02 ⁇ M final concentration, and a reaction containing Endo-Rp and Endo-Om.
  • the solution was incubated at 50 ° C., and the reaction solution containing Endo-M and Endo-S was incubated at 37 ° C.
  • the reaction liquids for 1 hour, 2 hours, 6 hours, 12 hours, 18 hours, and 24 hours were sampled and subjected to LC-MS analysis under the analysis condition A described above.
  • the time course of the reaction yield is shown in FIG.
  • Endo-Rp 0.21 ⁇ mol / min / ⁇ g
  • Endo-M 0.0071 ⁇ mol / min / ⁇ g
  • Endo-S 0.0022 ⁇ mol / min / ⁇ g
  • Endo-Om 0.060 ⁇ mol. / Min / ⁇ g.
  • the specific activity of Endo-Rp is 30 times that of Endo-M, 100 times that of Endo-S, and 4 times that of Endo-Om, and has a very strong hydrolysis activity against SGP compared to known enzymes. Was confirmed.
  • Example 3 The activity of the Endo-Rp homolog expressed and purified in Example 3 was also measured.
  • a reaction solution (total volume: 30 ⁇ L) containing a final concentration of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, and 0.2 ⁇ M enzyme was prepared and incubated at 50 ° C. for 1 hour.
  • reaction temperature was examined by preparing a reaction solution (total volume: 100 ⁇ L) containing a final concentration of 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, and 0.02 ⁇ M enzyme. It incubated at each temperature of 50, 52, 55, 57, 60, and 63 degreeC for 18 hours, and calculated the hydrolysis rate. The results are shown in FIG. Examination of the reaction pH was performed at pH 4.5, 5.0, 5.5, 5.8, including a final concentration of 200 mM sodium acetate or potassium phosphate buffer, 69 mM SGP, and 0.02 ⁇ M enzyme. 6.0, 6.2, 6.5, 7.0, and 7.5 reaction solutions (volume 100 ⁇ L) were prepared, incubated at 50 ° C. for 23 hours, and the hydrolysis rate was calculated. The results are shown in FIG.
  • Reaction solution containing a final concentration of 1.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, 690 mM (GlcNAc-) Asn (Watanabe Chemical Co., Ltd.) and 0.1 ⁇ M enzyme ( (Total volume: 30 ⁇ L) was prepared and incubated at 50 ° C. for 4 hours.
  • Example 7 Production of Endo-Rp N172Q
  • the 172nd asparagine (N) that is the active center is glutamine.
  • An N172Q variant substituted with (Q) was prepared.
  • the N172Q variant was prepared by the method described in Example 3 by substituting CAA for the 514th to 516th AACs in the nucleotide sequence encoding Endo-Rp shown in SEQ ID NO: 9.
  • glycosyl transfer activity was performed as follows. Prepare a reaction solution (total volume: 30 ⁇ L) containing a final concentration of 1.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, 690 mM (GlcNAc ⁇ ) Asn and 1.0 ⁇ M enzyme. And incubated at 50 ° C. Reaction liquids of 20 minutes, 40 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 20 hours, 24 hours, and 48 hours were sampled and subjected to LC-MS analysis under the conditions described in Example 6.
  • FIG. 9 shows the change over time in the reaction yield. Endo-Rp WT (SG-) Asn, which is a transglycosylation product, is rapidly hydrolyzed, while N172Q variant suppresses hydrolysis and produces (SG-) Asn in high yield. Was confirmed.
  • Example 8 Modification of Endo-Rp Modification was examined in order to obtain an enzyme having a higher transglycosylation activity than the modified Endo-Rp N172Q. Based on the structures of Endo-A (PDB ID: 3FHQ) and Endo-D (PBD ID: 2W92), various mutants shown in Table 1 were designed, and their hydrolytic activity and transglycosylation activity for SGP were measured.
  • glycosyl transfer activity was performed as follows. Prepare a reaction solution (total volume: 30 ⁇ L) containing a final concentration of 1.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SGP, 690 mM GlcNAc-AcA and 1.0 ⁇ M enzyme, 50 Incubated at 0 ° C. The reaction liquids for 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 hours, and 96 hours were sampled and analyzed under the above-mentioned LC-MS analysis condition B.
  • hydrolytic activity was performed as follows. A reaction solution (total volume 20 ⁇ L) containing a final concentration of 1.6 M potassium phosphate buffer (pH 6.25), 69 mM SG-A, and 0.2 ⁇ M enzyme was prepared and incubated at 50 ° C. The reaction liquids of 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours were sampled and analyzed under the above-mentioned LC-MS analysis condition B.
  • Table 1 shows the relative values of specific activity (hydrolysis and sugar transfer) of each modified product, assuming that the specific activity of transfer and hydrolysis of Endo-Rp is 100.
  • the hydrolysis activity was suppressed while maintaining the transfer activity, and it was confirmed that the transfer activity ratio (transfer activity / hydrolysis activity; transfer / hydrolysis ratio in the table) was improved.
  • the modified form into which the mutations W278F and W278Y were introduced both the transfer activity and the hydrolysis activity were improved, while the transfer activity ratio was decreased.

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Abstract

本発明は、Rhizomucor属の真菌から単離された高温条件下で活性を保持する新規なエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、その多様な変異酵素、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体等を提供する。

Description

新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ
　本発明は、高温条件下で活性を保持するエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体等に関する。
　糖タンパク質は動植物の組織、真核微生物の細胞膜、壁などに広く存在している。近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化、癌化、細胞間の認識などの機構に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあり、その機構解明のため糖鎖の構造と機能との相関について研究が進められている。創薬研究においては、抗体など糖タンパク質に含まれる糖鎖を均一な構造の糖鎖に置き換える糖鎖リモデリングや、ペプチドや低分子化合物を糖鎖修飾するなどの試みが進められている。このような創薬研究においては、天然に存在する均一な糖鎖を有する糖タンパク質／糖ペプチドからエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼなどの酵素を用いて切り出された糖鎖が用いられる場合が多い。
　動物の糖タンパク質に含まれる糖鎖の代表的なものとして、アスパラギン側鎖に結合するＮ結合型糖鎖が挙げられる。Ｎ結合型糖鎖は、その構造によって、高マンノース型、混成型及び複合型に分類されるが、共通の構造として還元末端にＧｌｃＮＡｃが２つ連結したキトビオース構造を有する。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、このキトビオース構造の間のグリコシド結合を加水分解する活性と切り出した糖鎖を特定の構造を有するアクセプターに結合させる糖転移活性を併せ持つ酵素である。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、様々な生物種から分離され、それぞれ異なる基質特異性を有しており、目的に応じて使い分けられている。その中で複合型糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼとしては以下のものが報告されている。
　Ｅｎｄｏ－Ｍは、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ由来の酵素であり、その基質特異性は高マンノース型のＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２に対する活性を１００％とした際に、複合型２分岐糖鎖（ａｇａｌａｃｔｏ　ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ　ＰＡｓｕｇａｒ）に対して４．４％である（非特許文献１：Ｆｕｊｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，（２００４）Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙ．４３２：ｐ４１－４９）。同文献において、Ｅｎｄｏ－Ｍの大腸菌を用いた発現については、３７℃での発現誘導では全て不溶性凝集体となり、誘導温度を２０℃に変更すると、可溶性画分の酵素活性が弱いものであったため、酵母による発現を検討したことが報告されており、大腸菌での適切な発現は難しいと考えられていた。また、４０℃以上で失活することが知られている。
　Ｅｎｄｏ－Ｏｍは、酵母であるＯｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ由来の酵素（特許文献１：ＷＯ２０１３／０５１６０８号公報又はＵＳ２０１４－０３１３２４６号公報）であり、複合型糖鎖を基質とすること、加水分解反応における至適温度は、５０℃と報告されている。酵母以外での発現については知られていない。
　Ｅｎｄｏ－Ｆ２及びＥｎｄｏ－Ｆ３は、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ　ｍｉｒｉｃｏｌａ由来の酵素であり（非特許文献２：Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ　ＡＬ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ９７０２－９７０８）、Ｅｎｄｏ－Ｆ２は高マンノース型および２分岐複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖の加水分解活性はない。一方、Ｅｎｄｏ－Ｆ３は、２分岐または３分岐複合型糖鎖を加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない。
　Ｅｎｄｏ－Ｓは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の酵素であり、２分岐複合型糖鎖のみを加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない（非特許文献３：Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ　ＪＪ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１２）Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｃｉ．１３４：ｐ８０３０－８０３３）。
　Ｅｎｄｏ－ＣＥ　は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐の複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖を切断できるかどうかは不明である（非特許文献４：Ｋａｔｏ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　１２：ｐ５８１－５８７）。加水分解反応における至適温度は、２０℃と報告されている。
　Ｅｎｄｏ－ＣＣは、従来知られていたＥｎｄｏ－ＭやＥｎｄｏ－Ｏｍと比較して、大腸菌における発現が可能であるとして報告された酵素であるが、非特許文献５（Ｙ．　Ｅｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１５）　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２１；１０（７）：ｅ０１３２８５９）においては、大腸菌での発現量が０．１　ｍｇ／２５０　ｍＬ　培養（＝　０．４　ｍｇ／Ｌ　培養）として報告されている。加水分解反応における至適温度は、３５℃と報告されている。
　切り出した糖鎖を医薬品原料として用いる場合、反応効率の向上や雑菌混入防止の観点から５０℃程度の高温で活性を保持する酵素が望まれている。また、医薬品の原材料として、複数種の遺伝子組み換え材料が用いられる場合に、宿主生物種を揃えることで、医薬品の安全性の問題が低減されるとされている。このような原材料の宿主として大腸菌が選択される場合が多く、大腸菌で一定量以上の生産能を有することが望ましい。しかしながら、公知の複合型糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼについて高温条件で活性を維持し、且つ、大腸菌で良好な生産能を示すものは知られていなかった。
　好熱性真菌の一種であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ（Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）は、至適生育温度が３５～４５℃であり、チーズ製造用レンネットの生産菌として知られている。Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓのゲノム配列については、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＣＢＳ　１８３．６７株由来の配列情報がＧｅｎｏｚｙｍｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｃｏｎｃｏｒｄｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のデータベース上に公開されている。同データベースには、Ｅｎｄｏ－Ｍと４１．５６％の相同性を持つ遺伝子及びそれにコードされるアミノ酸配列（配列番号７）が登録されていたが、活性に関するアノテーションは記載されておらず、これまでにＲ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを実際に取得した報告はない。また、データベース上でエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼと推定された配列番号７のアミノ酸配列（以下、「公知推定配列」という）は、１９１位～１９８位のアミノ酸配列が、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇ（ＬＡＮＴＹＹＩＲ）であった。
ＷＯ２０１３／０５１６０８号公報又はＵＳ２０１４－０３１３２４６号公報
Ｆｕｊｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，（２００４）Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙ．４３２：ｐ４１－４９ Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ　ＡＬ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６８：ｐ９７０２－９７０８ Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ　ＪＪ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１２）Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｃｉ．１３４：ｐ８０３０－８０３３ Ｋａｔｏ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　１２：ｐ５８１－５８７ Ｙ．　Ｅｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１５）　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．２１；１０（７）：ｅ０１３２８５９
　本発明は、大腸菌によって生産が可能な、高温条件下で複合型糖鎖に対する加水分解活性を保持する新規なエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓに属する複数の菌株の培養上清が高温条件下で複合糖鎖に対して良好な加水分解活性を有すること、当該菌株からクローニングされたエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼが、大腸菌を用いた産生系で良好な発現効率を示し、産生された酵素が当該加水分解活性を保持することを見出し、さらに研究を進めることにより、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の発明を提供する。
（１）　以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有するポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５～６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
（２）　　以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する（１）のポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１のアミノ酸番号１９１～１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）である；
（Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性が、４５～６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
（３）　５０℃における複合糖鎖に対する加水分解活性が、最大活性値の６０％以上を示すことを特徴とする、（１）のポリペプチド。
（４）　（Ａ）及び（Ｂ）の特性に加えて、更に（Ｃ）大腸菌を用いた遺伝子組み換え発現において、１０　ｍｇ／Ｌ培養以上を示すことを特徴とする、（１）～（３）のいずれかのポリペプチド。
（５）　配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸番号５４～３４１の領域における配列同一性が、８５％以上であることを特徴とする、（１）～（４）のいずれかのポリペプチド。
（６）　Ｄ２７６、Ｖ２２３、Ｗ２２５、Ｙ２４７及びＷ２４８のアミノ酸のうち少なくとも一つが維持されていること（好ましくは、少なくともＤ２７６が維持されていること）を特徴とする（１）～（５）のいずれかのポリペプチド。
（７）　配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号1のアミノ酸配列において、Ａ１２８Ｔ、Ｄ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｖ４６０Ａ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒからなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、（１）～（３）のいずれかのポリペプチド。
（８）　配列番号1～６のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、（１）のポリペプチド。
（９）　特性（Ａ）を充足するアミノ酸配列を有し、配列番号２３に示される変異の少なくともひとつを有することを特徴とする、（１）～（６）のいずれかのポリペプチド。
（１０）　Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６、Ｔ２７５、Ｌ３０６、Ｆ３０７及びＡ３１０から選択される少なくともひとつのアミノ酸に変異を有し、増強された糖鎖転移活性を有することを特徴とする、（９）のポリペプチド。
（１１）　以下の群から選択される少なくともひとつの変異を有することを特徴とする（７）のポリペプチド；
Ｎ１７２がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＭｅｔに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｎ２４６がＡｓｐに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異、及び、Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異。
（１２）　Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異を有することを特徴とする（９）～（１１）のいずれかのポリペプチド。さらに具体的な変異体としては、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列において、Ｎ１７２Ｑ、Ｎ１７２Ｄ、Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｄ／Ｗ２７８Ｆ、又は、Ｙ２１４／Ｌ３０６Ｉ／Ｌ３０７Ｙの変異を有することを特徴とする。（１１）のポリペプチド。
（１３）　（１）～（１２）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１４）　配列番号８～１７のヌクレオチド番号１～２０８８のヌクレオチド配列、及び配列番号１８～１９のヌクレオチド番号１～２０９１のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列を有する、（１３）のポリヌクレオチド。
（１５）　（１３）又は（１４）のポリヌクレオチドを含む発現用プラスミド。
（１６）　（１５）のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
（１７）　配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７のヌクレオチド番号１～２０８８のヌクレオチド配列、又は、配列番号１９のヌクレオチド番号１～２０９１のヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された大腸菌である、（１６）の宿主細胞。
（１８）　（１６）又は（１７）の宿主細胞を培養し、得られた培養物から（１）～（１２）のいずれかのポリペプチドを回収する工程を含む、（１）～（１２）のいずれかのポリペプチドの製造方法。
（１９）　（１）～（１２）のいずれかのポリペプチドを含有する試薬。
　本発明の新規なエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、５０℃以上の高温反応条件において複合型糖鎖に対する良好な加水分解活性を保持するため、当該酵素を利用した医薬品製造においてバクテリアの増殖を防ぎ、高い反応効率が期待できる高温条件下で、糖鎖を安全且つ効率的に取得することが可能である。また、本発明の酵素は、大腸菌を用いた異種発現系により、良好な酵素量での生産が可能である。医薬品の製造に用いる場合に、当該酵素以外の原材料（生理活性ペプチド／タンパク質、別の酵素など）が大腸菌により産生されている場合に、生物材料の宿主生物種を揃えることで、最終製品の安全性に対する原料の宿主生物種による影響の評価が容易になる。
図１は、Ｅｎｄｏ－ＲｐによるＳＧＰを基質とした加水分解反応の模式図を示す。 図２は、ＳＧＰの酵素処理前溶液（上）及び粗酵素処理液（下）の、分析条件ＡによるＬＣ－ＭＳ分析結果のチャートである。３～４分に検出される大きいピークはＳＧＰを示し、４．５～５分付近に検出されるピークはＳＧ（１０）を示す。 図３は、各種Ｒ．ｐｕｓｉｌｌｕｓ株由来の粗酵素（ＮＢＲＣ　９７４０（△）、ＮＢＲＣ　９７４１（▲）、ＮＢＲＣ　９７４２（□）及びＮＢＲＣ　９７４３（■））及びＥｎｄｏ－Ｍ（●）の、ＳＧＰに対する加水分解活性の温度依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応温度（℃）、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。 図４は、Ｅｎｄｏ－Ｒｐとその各種ホモログ、Ｅｎｄｏ－Ｒｍ、及び、公知の推定配列のアミノ酸配列のアラインメントを表す。 図５は、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ（〇）、Ｅｎｄｏ－Ｍ（●）、Ｅｎｄｏ－Ｓ（■）及びＥｎｄｏ－Ｏｍ（▲）の、ＳＧＰに対する加水分解活性の経時変化を示すグラフである。Ｘ軸は反応開始後の経過時間、Ｙ軸は加水分解率を表す。 図６は、Ｅｎｄｏ－ＲｐのＳＧＰに対する加水分解活性の温度依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応温度（℃）、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。 図７は、Ｅｎｄｏ－ＲｐのＳＧＰに対する加水分解活性のｐＨ依存性を示すグラフである。Ｘ軸は反応液のｐＨ値、Ｙ軸は加水分解率、をそれぞれ表す。 図８は、ＳＧＰ単独（上）及びＳＧＰ＋アクセプター（（ＧｌｃＮＡｃ―）Ａｓｎ）（下）、のＥｎｄｏ－Ｒｐ反応液のＬＣ－ＭＳ分析結果のチャートである。１分付近に検出される大きいピークはＳＧＰを示し、４～５分付近に検出されるピークはＳＧ（１０）を示し、３分付近に検出されるピークは（ＳＧ－）Ａｓｎを示す。 図９は、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ（○）及びＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ（■）の糖転移活性の経時変化を示すグラフである。Ｘ軸は、酵素反応開始後の経過時間（時間）、Ｙ軸は糖転移率（％）を示す。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性；
（Ａ）配列番号１《Ｅｎｄｏ－Ｒｐアミノ酸配列》に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列である；
（Ｂ）複合型糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５～６０℃の範囲で最大活性値の４０％以上を示す；
を有するポリペプチドであるエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを提供する。
　本発明において、「複合型糖鎖」とは、ヒト型Ｎ結合糖鎖のうち下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる基本構造を有する糖鎖を意味する。当該糖鎖において、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）にＧｌｃＮＡｃを有する構造となっており、その非還元末端側におけるガラクトースの有無、シアル酸の有無、さらにこれらの結合異性や位置異性を含む多彩な構造を有するものである。また、この基本構造を有する限り、別の枝分かれ構造を有していても良いし、非還元末端側の糖の水酸基の一部あるいはシアル酸のカルボニル基に対して化学的に修飾を加えた構造を有していてもよい。このような化学修飾された複合型糖鎖の例として、ＳＧＰのシアル酸のジオールを酸化開裂後、オキシム化により修飾したＳＧＰが、Ｅｎｄｏ－Ｍの基質となることが報告されている（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１６，１４，９５０１－９５１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）
代表的な複合型糖鎖としては、鶏卵の卵黄から抽出されるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ：下記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ））に含まれる糖鎖部分（ＳＧ）を挙げることができる。ＳＧＰは、鳥類の卵黄から精製することができるが、精製されたＳＧＰが市販されており、例えば東京化成工業（株）などから購入することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＶ）
　本発明において、「エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ」とは、基質となる糖鎖を認識し、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つ酵素である。天然型のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、両方の活性を併せ持つが、アミノ酸配列を改変することにより、それらの活性を調整し、いずれか一方の活性を増強又は減弱させた変異体やいずれかの活性を消失させることで、加水分解活性又は糖転移活性のみを保持する酵素を作製することもできる。本発明は、天然型のみならず、これらの変異酵素も包含する。
　本発明の酵素の有する加水分解活性は、上記の複合型糖鎖の還元末端側の２つの連続したＧｌｃＮＡｃからなるコアキトビオースに含まれるβ１，４グリコシド結合を特異的に加水分解する活性（本明細書において、特に言及が無い限り、「加水分解活性」とは、この活性を意味する。）である。例えば、ＳＧＰを基質としたエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる加水分解反応においては、図１に示されるように、ＳＧの還元末端のＧｌｃＮＡｃを除く構造からなるＳＧ（１０）（下記式（Ｖ）及び（ＶＩ）の構造）が生成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　　　　　　　　　　　　　　　（ＶＩ）
　当該酵素の糖転移活性は、糖としてＧｌｃＮＡｃのみを有する分子又は非還元末端にＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を含む分子（以下、「アクセプター分子」という）に、還元末端にＧｌｃＮＡｃを有し糖鎖ドナーに由来する糖鎖の還元末端をβ１，４グリコシド結合させる活性（以下、「糖転移活性」という。）である。例えば、下記式（ＶＩＩ）の構造を有する（ＧｌｃＮＡｃ－）Ａｓｎをアクセプター分子、ＳＧＰをドナー分子とした糖転移反応においては、アクセプター分子のＧｌｃＮＡｃにＳＧＰに由来するＳＧ（１０）が転移することによって、下記式（ＶＩＩＩ）に示される（ＳＧ－）Ａｓｎが生成される。同様に、下記式（ＩＸ）の構造を有するＧｌｃＮＡｃ－ＡｃＡをアクセプター分子、ＳＧＰをドナー分子とした糖転移反応によって、下記式（Ｘ）に示されるＳＧ－Ａが生成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　　　　　　（ＶＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　　　　　　　　　　　　　　　　（ＶＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　　　　　（ＩＸ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｘ）
　＜酵素・アミノ酸配列＞
　本発明の酵素は、上記の特性を有するものであれば、実施例で取得された具体的な配列の酵素に限定されるものではなく、天然から分離された酵素であっても、本発明の酵素の配列情報に基づき人為的に作製又は改変された酵素であっても良い。天然から分離する場合、その分離源とする生物種は特に限定されないが、好ましくは真菌であり、より好ましくは好熱性真菌であり、更に好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の真菌であり、さらにより好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉに属する真菌である。
　本発明において、好熱性真菌であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ（Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）に属する複数の菌株から、本特性を有するエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼがクローニングされ、それぞれ、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４２株に由来する酵素をＥｎｄｏ－Ｒｐ（アミノ酸配列；配列番号１、菌株由来核酸配列：配列番号８）、ＮＢＲＣ　９７４０株に由来する酵素をＥｎｄｏ－Ｒｐ２（アミノ酸配列：配列番号２、菌株由来核酸配列：配列番号１０）、ＮＢＲＣ　９７４１株に由来する酵素をＥｎｄｏ－Ｒｐ３（アミノ酸配列：配列番号３、菌株由来核酸配列：配列番号１２）、ＮＢＲＣ　９７４３株に由来する酵素をＥｎｄｏ－Ｒｐ４（アミノ酸配列：配列番号４、菌株由来核酸配列：配列番号１４）、と命名した。上述した、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓの菌株は、全てＮＢＲＣから入手することができ、その原産地はいずれも日本である。
　一方で、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓのゲノム公開株の配列情報に基づき、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの推定アミノ酸配列として公開されていた配列番号７のアミノ酸配列（推定核酸配列：配列番号２０）について、その核酸配列を大腸菌発現系に最適化して大腸菌で発現させたところ、酵素の発現がほとんど確認できず、酵素活性も非常に低いものであった（実施例３）。この配列番号７のアミノ酸配列では、配列番号１の１９３番目のＬｙｓに相当するアミノ酸がＡｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇのアミノ酸に置換された配列（図４参照）である。この配列番号７の１９３～１９８のＡｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇを配列番号１と同じようにＬｙｓに置換したアミノ酸配列（配列番号５）からなるＥｎｄｏ－Ｒｐ５は大腸菌における適切な発現と加水分解活性が確認され、このアミノ酸配列を有する酵素をＥｎｄｏ－Ｒｐ５と命名した。このことから、配列番号１の１９１～１９５番目に相当する配列は、本発明の酵素の特性にとって非常に重要な領域であると同定される。
　また、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓの類縁種であるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ（Ｒ．　ｍｉｅｈｅｉ）の公開されているゲノム情報（Ｒ．　ｍｉｅｈｅｉ　ＣＡＵ４３２株）に対して、本発明で特定されたＥｎｄｏ－Ｒｐの配列情報に基づき関連配列を特定し、該当するタンパク質を、大腸菌発現用に核酸配列を最適化して大腸菌で発現させたところ、本発明の酵素活性を有する酵素が一定量産生されることが確認され、この酵素をＥｎｄｏ－Ｒｍ（アミノ酸配列：配列番号６、真菌由来核酸配列：配列番号１８）と命名した。
　Ｅｎｄｏ－ＲｐとそのホモログであるＥｎｄｏ－Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４及びＥｎｄｏ－Ｒｐ５のアミノ酸配列の同一性は９９％以上であり、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２は配列番号１にＡ１２８Ｔ及びＫ５６９Ｔの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３は配列番号１にＤ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４は配列番号１に、Ｖ４６０Ａ及びＫ５６９Ｔの変異を有するホモログであり、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５は配列番号１にＫ５６９Ｔの変異を有するホモログである。Ｅｎｄｏ－Ｒｍのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と９６％の類似性、７７％の同一を示すものである。この配列において５４～３４０番目の領域における同一性は高く（同一性：８９％、類似性：９７％））、１９０番目から１９５番目のＨｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ（ＨＬＡＫＬＬ）は完全同一であり、本発明の酵素の特性（Ａ）を充足するものである。
　本発明の酵素が真菌に由来する酵素である場合、そのタンパク質は、真菌の培養上清あるいは菌体破砕液から単離したものであってもよく、大腸菌、酵母等の異種発現系を用いて発現させた酵素であっても良い。公知のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの多くは大腸菌を用いた異種発現系での生産量が少ないことが知られているのに対して、本発明の酵素のアミノ酸配列は、大腸菌を用いた発現系において良好な生産効率を示すという特性を有する。真菌由来のタンパク質を大腸菌で発現させる場合、その核酸配列を大腸菌発現に適した配列に最適化することが一般的に行われる。このような最適化をした場合であっても、例えばＥｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ（１アミノ酸変異体）の大腸菌での生産量は、３．７ｍｇ／Ｌ培養であった。また、Ｅｎｄｏ－ＣＣでは０．４ｍｇ／Ｌ培養であることが報告されている。これに対して、本発明の酵素の大腸菌における発現量は、１０　ｍｇ／Ｌ培養以上（好ましくは、１２　ｍｇ／Ｌ培養以上、より好ましくは１５　ｍｇ／Ｌ培養以上であり、従来の酵素よりも優れた大腸菌での生産効率を示す。実施例４の公知推定配列（配列番号７）とＥｎｄｏ－Ｒｐ５（配列番号５）の大腸菌での生産効率の結果が示すとおり、この特性はアミノ酸配列（特に、配列番号１のアミノ酸番号１９１～１９５を含む領域であり、中でも１９２～１９４の配列、特に１９３番目のＬｙｓ）により付与される特性であると考えられる。
　本発明の酵素のアミノ酸配列は、配列番号１の全長アミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を示すアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７と異なるアミノ酸配列（好ましくは、配列番号１のアミノ酸番号１９３に相当するアミノ酸がＬｙｓ（好ましくはアミノ酸番号１９２～１９４のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（ＡＫＬ）、より好ましくはアミノ酸番号１９１～１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）））である。
　アミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、対応するアミノ酸が完全に一致するアミノ酸を同じアミノ酸として、全長配列に対するアミノ酸の一致割合を数値化したものである。一方で、アミノ酸配列の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）とは、対応するアミノ酸が類似した性質を有するアミノ酸であれば、その類似性を考慮して、２つのアミノ酸配列の関係性を数値化するものである。本発明における配列の同一性及び類似性は配列解析ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ－ＳＶ／ＲＣ（株式会社ゼネティックス製）を用いて算出されるものであり、このアルゴリズムは、当該技術分野で通常使用されるものである。
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの活性ドメインは、結晶構造解析が行われているＥｎｄｏ－Ａ（Ｚｈｅｎｌｉａｎ　Ｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９），Ｖｏｌ．３８９，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅｓ１－９）との配列比較から、配列番号１のアミノ酸番号１～３７４の領域であると推察された。実際、本発明の酵素（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ１～５、Ｅｎｄｏ－Ｒｍ）のアミノ酸配列と配列番号１との配列同一性として、全長配列の比較では７５％以上であるが、活性ドメインと推測される領域中の配列番号１のアミノ酸番号５４～３４１番目の領域における同一性は８９％であり非常に高い同一性を示した。また、全長のアミノ酸配列の同一性として、好ましくは、８０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらにより好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。また、配列番号１のアミノ酸番号５４から３４１の領域の同一性として、好ましくは８５％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらよりより好ましくは９８％以上であり、最も好ましくはこの領域のアミノ酸配列が完全同一である。
　本明細書において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、変異箇所を示す場合は野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記とその番号（例えば、１７２番目のＡｓｎであれば「Ｎ１７２」）により表す。また、変異については、野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記、その番号及び変異後のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記（例えば、１７２番目のＡｓｎがＧｌｎに置換された変異は「Ｎ１７２Ｑ」）により表す。また、変異を有する特定の変異体は、分子名と変異（例えば、Ｅｎｄｏ―Ｒｐの１７２番目ＡｓｎがＧｌｎに置換された変異体は、「Ｅｎｄｏ―Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ」）により表し、複数の変異を有する場合は、変異の間を「／」で区切る形（例えば、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑにおいて、２７８番目のＴｒｐがＰｈｅに置換された追加変異を有する変異体は、「Ｅｎｄｏ―Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ」）と表す。
　本発明の酵素は、配列番号１と一定以上の同一性・類似性を保持する限り、アミノ酸の変異（置換）、欠失、挿入及び／又は付加が起こっていても良いが、少なくとも配列番号１において配列番号７の１９３～１９８に相当する配列がＡｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇとは異なる配列であり、好ましくは配列番号１の１９３番目（好ましくは１９２～１９４番目、より好ましくは１９１～１９５番目）のアミノ酸に相当する部位が配列番号１と完全同一のアミノ酸配列を有するものである。また、実施例８の結果から、配列番号１のＤ２７６のアミノ酸を変異させた場合、加水分解活性及び糖転移活性の両方がほぼ消失し、また、Ｅ１２６Ａ、Ｖ２２３Ｒ、Ｗ２２５Ｈ、Ｙ２４７Ｆ、Ｗ２４８Ｎの各変異体については両方の活性が大幅に減弱した。このことから、これらのアミノ酸についても配列番号１と類似又は同一のアミノ酸であることが好ましい。この様に配列番号１と完全同一のアミノ酸配列を示す領域は、好ましくはアミノ酸番号１１８～３３２番目の領域、より好ましくは５４～３４１番目の領域であり、さらに好ましくは１～３７４番目の領域である。
　本発明の酵素において、上述の配列同一性／類似性を保持し、上述の完全同一領域を除いて、配列番号１～６のアミノ酸配列のいかなる領域においても、数箇所（好ましくは５箇所以下、より好ましくは３、２又は１箇所）において、１箇所当たり数個（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、更に好ましくは５、４、３、２又は１個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加していても良い。このようなアミノ酸の欠失は、例えば、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端から数個のアミノ酸を欠失させた場合にも、本発明の酵素としての特性を保持するポリペプチドが得られることが考えられる。特に、配列番号１の３７５よりもＣ末端側の領域は、活性ドメインではないため、多くのアミノ酸の変更（置換、欠失、挿入及び／又は付加）が許容される。また、アミノ酸の付加については、配列番号１～６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に活性に影響しないことが知られているアミノ酸又はペプチドを付加したポリペプチドを挙げることができ、このような付加ペプチドとしてはタンパク精製の目的で付加されるタグペプチド（Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグなど）を挙げることができる。
　本発明の酵素におけるアミノ酸変異の位置としては、少なくとも配列番号２３においてＸａａと表示される位置の少なくともひとつに変異を有する酵素が、加水分解活性及び糖転移活性の少なくともひとつを保持することが確認されている。本酵素は、配列番号１のアミノ酸番号１～３７４が活性ドメインと推測されるが、公知のＥｎｄｏ酵素の構造活性相関の知見、及び本発明の開示内容に基づき、活性ドメインに変異を有しながら、活性を保持又は所望の活性にチューニングされた変異体を設計することができる。
　本発明の酵素については、各種ホモログの結果から、配列番号１のＡ１２８、Ｄ３３３、Ｉ４３４、Ｖ４６０、Ｉ５２７、Ｋ５６９、Ｆ６１０及びＨ６２６において、アミノ酸の置換が許容される。また、実施例８に示されるように、活性ドメインのアミノ酸を置換した多くの変異体が作製され、その多くが野生型Ｅｎｄｏ－Ｒｐと比較して見た目の活性が低下したものの、糖鎖修飾に利用可能な程度の一定の加水分解活性及び／又は糖転移活性を保持（少なくとも、いずれか一方の活性の比活性値が野生型Ｅｎｄｏ－Ｒｐの０．５％以上）することが確認され、この領域においても一定のアミノ酸置換が許容されることが確認された。具体的には、以下のアミノ酸変異が許容される。
　Ｎ１７２は、基質と接触する活性残基と考えられるが、Ｔｒｐ、Ａｒｇ及びＴｙｒ以外のアミノ酸への置換であれば、活性が保持されたため、嵩高い構造の側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸への置換が広く許容される。また、Ｇｌｎ、Ａｓｐのような極性の高い側鎖を有するアミノ酸やＧｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｍｅｔなどへの置換により、転移活性比率（転移活性／加水分解活性）が増強されることが確認された。
　Ｄ１７６は、Ａｒｇへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ａｒｇへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｙ２１４は、Ａｌａのような小さな側鎖のアミノ酸では両方の活性が大きく低下するため、比較的大きな構造の側鎖を有するアミノ酸を許容する。Ｐｈｅへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｓ２１６は、小さな側鎖を有するアミノ酸（好ましくは、Ａla又はＶal）に置換することで、糖転移活性を維持し、加水分解活性を低下させるため、これらの変異は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｌ２４５は、Ｓｅｒへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｓｅｒへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｎ２４６は、大きな変化を許容しにくいと考えられるがＡｓｐへの置換により転移活性を維持したまま加水分解活性を大きく低下させたため、このような変異は転移活性比率を増強させた変異体変異体の作製に有用である。
　Ｔ２７５は、Ｉｌｅへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｉｌｅへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｗ２７８は、基質糖鎖との疎水的相互作用が活性に寄与すると考えられており、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどの疎水性の高い側鎖を有するアミノ酸を許容すると考えられる。
　Ｆ２８３は、Ｓｅｒへ置換しても活性が維持されたため、多くのアミノ酸への置換を許容すると考えられる。また、Ｓｅｒへの置換は転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用である。
　Ｌ３０６は、Ｉｌｅへの置換により大きく活性の変動は見られないが、糖転移活性を維持し、加水分解活性を低下させる傾向が見られたため、転移活性比率を増強させた変異体の作製に有用と考えられる。また、推測される立体構造から、嵩高い側鎖を有するアミノ酸や荷電した側鎖のアミノ酸は好ましくない可能性がある。
　Ｆ３０７は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ等さまざまなアミノ酸を許容すると考えられる。このＨｉｓ、Ｔｙｒへの置換により糖転移活性よりも加水分解活性を大きく低下させるため、転移活性比率を増強した変異体の作製に有用である。
　Ａ３１０は、極性残基又は荷電残基を側鎖に有するアミノ酸（好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ，Ｌｙｓ、Ｓｅｒなど）に置換することで、糖転移活性よりも、加水分解活性をより大きく低下させるため、これらの変異は、転移活性比率を増強した変異体の作製に有用である。
　Ｅ３１４は、Ｇｌｎに置換しても大きな活性の変動はなく、置換を許容すると考えられる。
　アミノ酸の置換／変異について、好ましくは、本発明の特性（Ａ）を充足し,且つ、配列番号２３に示される変異（配列番号１のＡ１２８、Ｎ１７２、Ｄ１７６、Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｗ２７８、Ｆ２８３、Ｌ３０６、F３０７，Ａ３１０、Ｅ３１４、Ｄ３３３、Ｉ４３４、Ｖ４６０、Ｉ５２７、Ｋ５６９、Ｆ６１０及びＨ６２６）から選択される少なくとも一つ又は複数のアミノ酸において置換を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号1においてＡ１２８Ｔ（Ｒｐ２）、Ｄ３３３Ｇ（Ｒｐ３）、Ｉ４３４Ｌ（Ｒｐ３）、Ｖ４６０Ａ（Ｒｐ４）、Ｉ５２７Ｖ（Ｒｐ３）、Ｋ５６９Ｔ（Ｒｐ２－４）、Ｆ６１０Ｓ（Ｒｐ３）及びＨ６２６Ｒ（Ｒｐ３）から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列、或いは、それらのアミノ酸配列においてさらにＮ１７２、Ｄ１７６、Ｙ２１４、Ｓ２１６、Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｗ２７８、Ｆ２８３、Ｌ３０６、F３０７、Ａ３１０及びＥ３１４、の少なくともひとつのアミノ酸に変異を有するアミノ酸配列であり、複数の変異が同時に起こっていてもよく、全ての変異を含むものも本発明の酵素に含まれる。
　エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、加水分解活性と糖転移活性を併せ持つため、強い加水分解活性を保持する酵素は、転移活性によりアクセプター分子に転移させた糖鎖をも基質として加水分解してしまうため、所望の糖転移体を適切に取得できない場合がある。そのため、糖鎖修飾化合物の合成においては、このような転移型変異酵素も重要である。
　上述のとおり配列番号１の、Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６、Ｌ２４５、Ｎ２４６，Ｔ２７５、Ｆ２８３、Ｌ３０６、Ｆ３０７，Ａ３１０及びＥ３１４における変異のいくつかは、本発明の酵素の糖転移活性を向上させる、又は、糖転移活性と比較して加水分解活性をより大きく低下させることが確認されている。そのため、これらの変異は転移活性比率（転移活性／加水分解活性）を向上させた転移型変異酵素を設計するために有用であり、本発明はこのような転移型変異酵素をも提供する。具体的な転移型変異酵素における変異としては、配列番号1において、Ｎ１７２がＧｌｎ又はＡｓｐに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異。Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異、が挙げられる。本発明の糖転移型変異酵素に採用される変異としては、これらのうち少なくとも一つが採用されていれば良く、単独の変異であっても、これらの変異を複数含む多重変異体であっても良い。好ましい変異体は、Ｎ１７２Ｑ、Ｎ１７２Ｄ、Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｑ／Ｗ２７８Ｆ、Ｎ１７２Ｄ／Ｗ２７８Ｆ、又は、Ｙ２１４／Ｌ３０６Ｉ／Ｆ３０７Ｙである。
＜加水分解活性・糖転移活性＞
　本発明の酵素は、複合型糖鎖を加水分解及び／又は糖転移する活性を有し、その活性は、４５～６０℃のいずれかの温度において最大活性値の４０％以上を示すとの特性を有する。
　本発明の酵素は、様々な複合型糖鎖を基質として加水分解する活性を有するが、酵素を特定するための指標としては、以下の方法によって、ＳＧＰを基質として加水分解し、ＳＧ（１０）を産生する活性により評価される。
　加水分解反応は、終濃度２００　ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、および０．０２　μＭの酵素（ｂｌａｎｋには同量のバッファーを添加）を含む反応液（総容量　１００　μＬ）を調製し、所定の温度で１８時間インキュベートする。得られた反応液及びｂｌａｎｋ液をＬＣ－ＭＳで分析してＳＧＰおよびＳＧ（１０）を定量し、以下の式により加水分解率および比活性を算出する。
　［ＬＣ－ＭＳ分析条件Ａ］
ＭＳ装置：６１３０　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ－ＭＳ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　３　μｍ　φ３．０×５０　ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）
流速：０．６　ｍＬ／ｍｉｎ
　［加水分解率］
　加水分解率は、以下の式で算出される。
加水分解率（％）＝反応後のＳＧ（１０）濃度（Ｍ）／ｂｌａｎｋのＳＧＰ濃度（Ｍ）ｘ１００
　［比活性］
比活性は、以下の式で算出される。
比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）＝　生成したＳＧ（１０）量（μｍｏｌ）／反応時間（ｍｉｎ）／酵素量（μｇ）
　本発明の酵素は、様々な糖鎖ドナーやアクセプター分子を認識し糖鎖を転移させる活性を有するが、酵素を特定するための指標としては、以下の方法によって、ＳＧＰを基質として糖鎖を転移させＳＧ－Ａを産生する活性により評価される。
　転移反応は、終濃度１．６　Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、６９０　ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ－ＡｃＡおよび１．０　μＭの酵素（ｂｌａｎｋには同量のバッファーを添加）を含む反応液（総容量　３０　μＬ）を調製し、所定の温度でインキュベートする。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および９６時間の反応液およびｂｌａｎｋ液をＬＣ－ＭＳで分析してＳＧＰ、ＳＧ（１０）およびＳＧ－Ａを定量し、以下の式により加水分解率および比活性を算出する。
　［ＬＣ－ＭＳ分析条件Ｂ］
ＭＳ装置：６１３０　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ－ＭＳ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　２　μｍ　φ２．１×５０　ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０．８％（０分）、８％（０．１分）、８％（５分）
流速：０．７　ｍＬ／ｍｉｎ
　［転移率］
　転移率は、以下の式で算出される。
転移率（％）＝反応後のＳＧ－Ａ濃度（Ｍ）／ｂｌａｎｋのＳＧＰ濃度（Ｍ）ｘ１００
　［比活性］
比活性は、以下の式で算出される。
比活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）＝　生成したＳＧ－Ａ量（μｍｏｌ）／反応時間（ｍｉｎ）／酵素量（ｍｇ）
　本発明の酵素は、上記の方法による加水分解活性及び／又は糖転移活性測定を、例えば１０℃～７０℃の間で適宜温度を変化（例えば、２、３、５又は１０℃間隔）させて実施した場合において、全ての温度条件で算出された活性値の最大値を１００％とした場合の、４５℃～６０℃でのいずれかの温度（好ましくは５０℃）における相対活性値が、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、最も好ましくは当該温度範囲において最大活性値を示すことである。
　比活性は、通常は酵素の至適温度条件において測定される。本発明の酵素は、高い比活性を示す。例えば、Ｅｎｄｏ－Ｒｐは、５０℃で６９　ｍＭ　ＳＧＰを基質とした際、０．２１　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇの比活性を示し、これはＥｎｄｏ－Ｍの３７℃での比活性（０．００７１　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ）の３０倍という優れた活性である。
　本発明の酵素は、本明細書の実施例に具体的に記載された酵素及び変異体に限定されず、特性（Ａ）及び（Ｂ）を充足する限り、さまざまなポリペプチドが本発明の酵素に含まれる。その加水分解活性及び糖転移活性のうち少なくともいずれか一方が、配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素と上記の温度条件で比較して一定レベル以上の活性を示すものであれば良く、好ましくは０．５％以上であり、より好ましくは１％以上であり、さらに好ましくは５％以上であり、さらにより好ましくは１０％以上であり、最も好ましくは３０％以上である。
　＜遺伝子＞
　本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする核酸配列を有する遺伝子を提供する。
　これらの遺伝子は、本酵素の遺伝子としてＲ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲ．　ｍｉｅｈｅｉの遺伝子情報に基づき、自然界（例えば、好熱性真菌、好ましくはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属の真菌、より好ましくはＲ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ又はＲ．　ｍｉｅｈｅｉ）からクローニングすることもできる。また、酵素のアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子工学的手法に従って、組み換え遺伝子として作成することができる。
　本発明の酵素をコードする核酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列であるポリペプチドをコードする配列である。このような核酸配列の例としては、例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６又は１８（終止コドン含む）に記載された、真菌自体が保持する核酸配列であっても良い。また、酵素のアミノ酸配列を元に、例えばＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を利用して、大腸菌での発現に最適化された核酸配列を有する核酸を作製することができる。配列番号９、１１、１３、１５，１７及び１９の核酸配列は、それぞれ配列番号１（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ）、２（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２）、３（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３）、４（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４）、５（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５）及び６（Ｅｎｄｏ－Ｒｍ）のアミノ酸配列を元に設計された、Ｃ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓｘ６）を付加した酵素の大腸菌での発現用に最適化された核酸配列である。このような核酸配列を参考にすることで、例えば配列番号２３のアミノ酸配列のような、様々なアミノ酸の改変を施したポリペプチドを大腸菌で効率的に発現させる核酸配列を設計することができる。
　本発明の酵素をコードする核酸配列の具体例としては、配列番号８～１７のヌクレオチド番号１～２０８８及び配列番号１８～１９のヌクレオチド番号１～２０９１（好ましくは、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ又はそのホモログをコードする配列番号８～１７のヌクレオチド番号１～２０８８）のいずれかに記載された核酸配列と８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％以上の同一性を示す核酸配列であり、各核酸配列における５７０～５８５の領域においては、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕをコードする核酸、を挙げることができる。
＜酵素の製造・精製＞
　本発明は、さらに上記の本発明の酵素をコードする組み換え遺伝子を含むプラスミドや発現ベクター等の遺伝子構築物、当該遺伝子構築物により形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞の培養物から本発明の酵素を回収する工程を含む、本発明の酵素の製造方法などを提供する。本発明の酵素をコードする遺伝子の導入により形質転換された宿主細胞（動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる）は、細胞の種類に応じて適切なプラスミド／発現ベクターに導入され、当該プラスミド／発現ベクターにより対象細胞を形質転換し、当該形質転換細胞を適切な条件下で培養し、その培養物から本発明の酵素を回収することができる。
　形質転換のための遺伝子構築物の作成には、通常遺伝子工学の分野で知られているベクター、プラスミドを発現させる細胞種に応じて選択し、公知の手法に従って構築することができる。例えば、大腸菌へ発現させる際には、ｐＥＴベクター、ｐＣｏｌｄベクター、ｐＦＬＡＧベクター等を採用することができるが、これに限定されない。
　大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）等が挙げられる。
　本発明の酵素を産生させるための大腸菌の培養条件としては、例えば、形質転換した菌液を１００　ｍＬフラスコ中の２５　ｍＬ　ＴＢ培地（５０　ｕｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養する（１６０　ｒｐｍ，　Ｏ／Ｎ）。この前培養液２０　ｍＬを２．５　Ｌバッフル付きフラスコ中の１　Ｌ　ＴＢ培地（５０　ｕｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．０１％　ａｎｔｉｆｏａｍ　２０４、２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４）に植菌し、３７℃で振とう培養（２００　ｒｐｍ、２時間）し、インキュベーターの温度を１６℃に下げて３時間培養した後、終濃度０．２　ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２４時間培養する等の方法を用いることができるが、これに限定されない。培地としては、ＴＢ培地のほか、ＬＢ培地、Ｍ９培地等一般的な培地を使用することができる。
　本発明の酵素の回収は、当該酵素の物性を利用して、通常の精製手法を適宜組み合わせて行うが、簡便に回収するために、予めＨｉｓタグやＧＳＴ等のタグペプチドを酵素に連結させた形で発現させるように、遺伝子構築物を設計しておくことにより、当該タグペプチドの親和性を利用した回収を行うことができる。タグペプチドは、精製後に除去してもよいが、酵素活性に影響がない場合は、タグペプヂドを連結させたままの酵素を、加水分解等の反応に使用してもよい。本発明の酵素には、このようなタグペプチドが連結したアミノ酸配列を有する酵素を含み、その具体例としては、配列番号１～６のアミノ酸配列のＣ末端に、Ｈｉｓタグ（Ｈｉｓ　ｘ　６）が結合したアミノ酸配列である。
　本発明の酵素は、そのアミノ酸配列の特性上、大腸菌における産生効率が良好である。本発明の酵素は、上記培養条件を用いた大腸菌での産生において、１Ｌ培養当たり２ｍｇ以上の発現効率を示すが、好ましくは１Ｌ培養当たり４ｍｇ以上であり、より好ましくは８ｍｇ以上であり、更に好ましくは１２ｍｇ以上であり、さらにより好ましくは１５ｍｇ以上である。
　以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
　本明細書に記載されているタンパク濃度は、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）あるいはＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて定量した。
　本実施例において、酵素のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼとしての加水分解活性の測定において、反応液中のＳＧＰ及びＳＧ（１０）の検出は上述のＬＣ－ＭＳ分析条件Ａを採用し、上述の算出式により加水分解率、比活性を算出した。
＜実施例１＞　Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの発見
　Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４０、ＮＢＲＣ　９７４１、ＮＢＲＣ　９７４２、およびＮＢＲＣ　９７４３株をＧＳＹＦｅスラント（５％　Ｇｌｕｃｏｓｅ，　２％　Ｓｏｙｔｏｎｅ，　１％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　０．０５％　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，　１．５％　ａｇａｒ）に植菌し、４０℃で５日間培養した。菌体を採取し、ガラス製ホモジナイザーを用いて２　ｍＬの１００　ｍＭ　カリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）中で破砕後、フィルター滅菌したものを粗酵素液とした。
　粗酵素液５０　μＬにＳＧＰ　３　ｍｇを添加（終濃度２１　ｍＭ）し、５０℃でインキュベートした。反応液をＬＣ－ＭＳで解析したところ、ＳＧＰの消失とＳＧ（１０）の生成が確認された（図２）ため、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４２はエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを有すると考えられた。
　また、反応温度を変化させて加水分解反応を行い、各サンプルについて、最も反応が進行した温度における活性を１００％として相対活性を算出した。結果を図３に示す。比較対象に用いたＥｎｄｏ－Ｍ（東京化成工業（株）製）は４５℃で失活しているのに対し、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来の粗酵素は至適温度が５５℃以上であることが確認できた。
＜実施例２＞　Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング
　以下の方法により、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４２株からエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子のクローニング及びゲノム公開配列からの関連配列の抽出を行った。
　（１）微生物からの遺伝子クローニング
　まず、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４２株をＧＳＹＦｅスラントに植菌し、４０℃で５日間培養した。菌体を採取し、メタルコーンと一緒にスクリューキャップ付き２　ｍＬマイクロチューブに入れ、－８０℃で凍結した。凍結したサンプルをマルチビーズショッカー（安井器機械社）で４℃に冷却しながら、２，０００ｒｐｍ、オンタイム３０秒、オフタイム３０秒で５サイクル繰り返し菌体を破砕した。このサンプルから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ　Ｐｌａｎｔ（マッハライ・ナーゲル社）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｍＲＮＡ溶液を得た。
　得られたｍＲＮＡを鋳型に、プライマー１（配列番号２２）と３’－Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（タカラバイオ社）を用いてエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子を増幅し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングした。この遺伝子は終止コドンを含めて２０９１塩基（配列番号８）からなり、６９６アミノ酸残基（配列番号１）からなる分子量７８，８７４のタンパク質をコードしており、このタンパク質をＥｎｄｏ－Ｒｐと命名した。
　同様にして、Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４０、９７４１、および９７４３株からもＥｎｄｏ－ＲｐのホモログであるＥｎｄｏ－Ｒｐ２（配列番号2のアミノ酸配列）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３（配列番号３のアミノ酸配列）及びＥｎｄｏ－Ｒｐ４（配列番号４のアミノ酸配列）がクローニングされた。ＮＢＲＣ　９７４０からはＥｎｄｏ－Ｒｐ２のみが検出されたが、ＮＢＲＣ　９７４１からは、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２およびＥｎｄｏ－Ｒｐ３の2種類、ＮＢＲＣ　９７４３からはＥｎｄｏ－Ｒｐ３およびＥｎｄｏ－Ｒｐ４の2種類の配列が、それぞれ検出された。いずれも、Ｅｎｄｏ－Ｒｐとのアミノ酸配列の同一性は９９％であった。
　（２）ゲノム公開配列との比較
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３、およびＥｎｄｏ－Ｒｐ４の配列とＧｅｎｏｚｙｍｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔのデータベースで公開されている推定配列を比較したところ、配列番号１の１９３番目のＬｙｓに相当するアミノ酸が、配列番号７ではＡｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇに置換され、タンパクの長さが異なっていた（図４）。Ｒ．　ｐｕｓｉｌｌｕｓ　ＮＢＲＣ　９７４２株からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ遺伝子のＯＲＦ全長配列をＰＣＲ増幅して解析したところ、ゲノム公開株の推定配列ではイントロンの予測位置が異なっていることが示唆され、このために上記のアミノ酸配列の相違が発生していると考えられた。
　また、Ｅｎｄｏ－Ｒｐのアミノ酸配列を用いて、ＮＣＢＩのデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行った結果、近縁種のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ　ＣＡＵ４３２株のゲノム配列中に対応する配列がヒットしたため、この配列情報からエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼをコードすると思われる核酸配列（配列番号１８）、及びアミノ酸配列（配列番号６）を特定し、このアミノ酸配列からなるタンパク質をＥｎｄｏ－Ｒｍと命名した。Ｅｎｄｏ－Ｒｐとの相同性は６７％であった。
＜実施例３＞　大腸菌を用いたＥｎｄｏ－Ｒｐの発現
　実施例２で得た真菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子に対してＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓを利用し、大腸菌での異種発現用に最適化した核酸配列（配列番号１５）を設計し、当該配列を用いてＥｎｄｏ－ＲｐのＣ末端に６×Ｈｉｓタグを付加したポリペプチドをコードする遺伝子を作製した。これをｐＥＴ２４ｂ（＋）ベクターにクローニングし、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換後の菌液を１００　ｍＬフラスコ中の２５　ｍＬ　ＴＢ培地（５０　μｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養を行った（１６０　ｒｐｍ，　Ｏ／Ｎ）。この前培養液２０　ｍＬを２．５　Ｌバッフル付きフラスコ中の１　Ｌ　ＴＢ培地（５０　μｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．０１％　ａｎｔｉｆｏａｍ　２０４、２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４）に植菌し、３７℃で振とう培養した（２００　ｒｐｍ、２時間）。インキュベーターの温度を１６℃に下げて３時間培養した後、終濃度０．２　ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２４時間培養した。
　集菌した菌体を１００　ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　８．０）、０．５　Ｍ　ＮａＣｌ、２０　ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行った上清を、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　ＦｌｏｗおよびＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラム（ＧＥヘルスケア社）で精製した。収量（Ａ２８０、吸光係数換算）は１６．９　ｍｇ／Ｌ　ｂｒｏｔｈであった。
　また、Ｅｎｄｏ－Ｒｐホモログ及びＥｎｄｏ－Ｒｍについても同様に異種発現を実施した。Ｅｎｄｏ－Ｒｐのホモログとしては実施例２で同定された酵素に加え、配列番号７の１９３番目から１９８番目のＡｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ａｒｇを他のホモログ同様のＬｙｓ残基に置換した配列（Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５、配列番号５）の発現についても検討した。大腸菌用に最適化したＥｎｄｏ－Ｒｍ遺伝子の配列は、配列番号６のアミノ酸配列に基づきＧｅｎｅＡｒｔ　Ｓｔｒｉｎｇｓ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で入手した（配列番号２０）。その他の遺伝子は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）の標準プロトコルに従い配列番号１５の塩基配列を含むＥｎｄｏ－Ｒｐの大腸菌発現用ベクターに変異を導入することで入手した（Ｅｎｄｏ―Ｒｐ２：配列番号１６、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ３：配列番号１７、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ４：配列番号１８、Ｅｎｄｏ―Ｒｐ５：配列番号１９）。
　発現誘導は上述の条件で行い、本培養のみ５００　ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００　ｍＬ　ＴＢ培地で実施した。集菌した菌体を６　ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行った上清をＨｉｓ　ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア社）で精製した。
　精製の結果、配列番号７を除き、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで発現タンパクのバンドを確認した。各タンパクの収量は、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ：２．０６７　ｍｇ（２０．６７　ｍｇ／Ｌ　培養）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２：２．１３９　ｍｇ（２１．３９　ｍｇ／Ｌ　培養）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３：２．７６５　ｍｇ（２７．６５　ｍｇ／Ｌ　培養）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４：２．３０１　ｍｇ（２３．０１　ｍｇ／Ｌ　培養）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５：２．１８７　ｍｇ（２１．８７　ｍｇ／Ｌ　培養）、Ｅｎｄｏ－Ｒｍ：１．６５０　ｍｇ（１６．５０　ｍｇ／Ｌ　培養）であった。
＜実施例４＞　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの複合型糖鎖に対する加水分解活性
　実施例３で取得した酵素について、上述の方法により加水分解活性を測定した。この際、Ｅｎｄｏ－Ｍ（東京化成工業（株）製）、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏ－Ｏｍを比較対象に用いた。
　終濃度２００　ｍＭ　カリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、および０．０２　μＭの酵素を含む反応液（総容量　１００　μＬ）を調製し、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ及びＥｎｄｏ－Ｏｍを含む反応液は５０℃、Ｅｎｄｏ－Ｍ及びＥｎｄｏ－Ｓを含む反応液は３７℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、６時間、１２時間、１８時間、および２４時間の反応液をサンプリングし、上述の分析条件ＡでＬＣ－ＭＳ分析した。反応収率の経時変化を図５に示す。比活性はＥｎｄｏ－Ｒｐ：０．２１　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ－Ｍ：０．００７１　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ―Ｓ：０．００２２　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ：０．０６０　μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇであった。Ｅｎｄｏ－Ｒｐの比活性はＥｎｄｏ－Ｍの３０倍、Ｅｎｄｏ－Ｓの１００倍、Ｅｎｄｏ－Ｏｍの４倍であり、公知の酵素と比較してＳＧＰに対して非常に強い加水分解活性を有することが確認された。
　また、実施例３で発現・精製したＥｎｄｏ－Ｒｐホモログについても活性を測定した。終濃度２００　ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、および０．２　μＭの酵素を含む反応液（総容量　３０　μＬ）を調製し、５０℃で１時間インキュベートした。１時間後の加水分解率は、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ：８７％、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２：９１％、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３：８４％、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４：７９％、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５：９４％、Ｅｎｄｏ－Ｒｍ：２３％であり、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ２、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ３、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ４、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ５は、ＳＧＰに対して、Ｅｎｄｏ－Ｒｐとほぼ同等の加水分解活性を有することが確認された。
＜実施例５＞　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの至適反応条件の検討
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの至適反応温度およびｐＨを検討した。
　反応温度の検討は、終濃度２００　ｍＭのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、および０．０２　μＭの酵素を含む反応液（総容量：１００　μＬ）を調製し、４５、５０、５２、５５、５７、６０及び６３℃の各温度で１８時間インキュベートし、加水分解率を算出した。結果を図６に示す。
反応ｐＨの検討は、終濃度２００　ｍＭの酢酸ナトリウムバッファーもしくはカリウムリン酸バッファー、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、および０．０２　μＭの酵素を含む、ｐＨ４．５、５．０、５．５、５．８，６．０、６．２、６．５、７．０、及び、７．５の反応液（容量　１００　μＬ）を調製し、５０℃で２３時間インキュベートし、加水分解率を算出した。結果を図７に示す。
　この検討の結果、Ｅｎｄｏ－Ｒｐの至適反応温度は５５℃付近、至適反応ｐＨは５．８付近であった。
＜実施例６＞Ｅｎｄｏ－Ｒｐの糖転移活性
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐが糖転移活性を有するか、以下のように検討した。
　終濃度１．６　Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、６９０　ｍＭ　（ＧｌｃＮＡｃ－）Ａｓｎ（渡辺化学工業（株）製）および０．１　μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０　μＬ）を調製し、５０℃で４時間インキュベートした。
　反応液を下記の条件でＬＣ－ＭＳ分析した。
ＭＳ装置：６１３０　Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ－ＭＳ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　２　μｍ　φ２．１×５０　ｍｍ（ＧＬサイエンス社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：０．８％（０分）、２％（５分）、２％（６分）
流速：０．７　ｍＬ／ｍｉｎ
　結果を図８に示す。アクセプターを加えていない条件では、ドナーであるＳＧＰと加水分解物であるＳＧ（１０）のピークのみが検出された。アクセプターとして（ＧｌｃＮＡｃ－）Ａｓｎを加えた条件では、ＳＧ（１０）の他に糖転移反応生成物である（ＳＧ－）Ａｓｎのピークが観測された。この結果から、Ｅｎｄｏ－Ｒｐは糖転移活性を有することが確認された。
＜実施例７＞Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑの作製
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの糖鎖転移活性を維持したまま糖鎖加水分解活性を抑制した酵素を取得すべく、活性中心である１７２番目のアスパラギン（Ｎ)をグルタミン（Ｑ)に置換したＮ１７２Ｑ改変体を作製した。Ｎ１７２Ｑ改変体は、配列番号９に示すＥｎｄｏ－Ｒｐをコードする塩基配列において、５１４番目から５１６番目のＡＡＣをＣＡＡに置換し、実施例３に記載した方法で調製した。
　糖転移活性の評価は次のように行った。終濃度１．６　Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、６９０　ｍＭ　（ＧｌｃＮＡｃ－）Ａｓｎおよび１．０　μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０　μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応２０分、４０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２０時間、２４時間、および４８時間の反応液をサンプリングし、実施例６に記載した条件でＬＣ－ＭＳ分析した。
　反応収率の経時変化を図９に示す。Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　ＷＴでは糖転移反応生成物である（ＳＧ－）Ａｓｎは速やかに加水分解されるのに対し、Ｎ１７２Ｑ改変体では加水分解が抑制され、収率よく（ＳＧ－）Ａｓｎが生成することを確認できた。
＜実施例８＞Ｅｎｄｏ－Ｒｐの改変
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ改変体よりも糖鎖転移活性の高い酵素を取得すべく、改変検討を実施した。Ｅｎｄｏ－Ａ（ＰＤＢ　ＩＤ：３ＦＨＱ）およびＥｎｄｏ－Ｄ（ＰＢＤ　ＩＤ：２Ｗ９２）の構造に基づいて、表１に示す各種変異体をデザインし、そのＳＧＰに対する加水分解活性及び糖転移活性を測定した。
　糖転移活性の評価は次のように行った。終濃度１．６　Ｍのカリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧＰ、６９０　ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ－ＡｃＡおよび１．０　μＭの酵素を含む反応液（総容量：３０　μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および９６時間の反応液をサンプリングし、上述のＬＣ－ＭＳ分析条件Ｂで分析した。
　加水分解活性の評価は次のように実施した。終濃度１．６　Ｍ　カリウムリン酸バッファー（ｐＨ　６．２５）、６９　ｍＭ　ＳＧ－Ａ、および０．２　μＭの酵素を含む反応液（総容量　２０　μＬ）を調製し、５０℃でインキュベートした。反応１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間の反応液をサンプリングし、上述のＬＣ－ＭＳ分析条件Ｂで分析した。
　表１に、Ｅｎｄｏ－Ｒｐの転移および加水分解の比活性を１００とした時の、各改変体の比活性（加水分解及び糖転移）の相対値を示した。Ｎ１７２Ａ、Ｎ１７２Ｃ、Ｎ１７２Ｄ、Ｎ１７２Ｅ、Ｎ１７２Ｇ、Ｎ１７２Ｈ、Ｎ１７２Ｉ、Ｎ１７２Ｍ、Ｎ１７２Ｓ、Ｎ１７２Ｔ、Ｎ１７２Ｖ、Ｄ１７６Ｒ、Ｙ２１４Ｆ、Ｓ２１６Ｖ、Ｌ２４５Ｓ、Ｎ２４６Ｄ、Ｔ２７５Ｉ、Ｆ２８３Ｓ、Ｌ３０６Ｉ、Ｆ３０７Ｙ、Ｆ３０７Ｈ、Ａ３１０Ｄ、Ｅ３１４Ｑの変異を導入した改変体では、転移活性は維持したまま加水分解活性が抑制され、転移活性比率（転移活性/加水分解活性；表中では、転移／加水分解比）が向上していることが確認された。また、Ｗ２７８Ｆ、Ｗ２７８Ｙの変異を導入した改変体では、転移活性と加水分解活性がともに向上した一方、転移活性比率は低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013

Claims (19)

  1. 以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有するポリペプチド；
    （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号７のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列である；
    （Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖転移活性が、４５～６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
     
  2. 以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する請求項１のポリペプチド；
    （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性及び９５％以上の類似性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１のアミノ酸番号１９１～１９５のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列が、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ（ＬＡＫＬＬ）である；
    （Ｂ）複合糖鎖に対する加水分解活性が、４５～６０℃のいずれかの温度で最大活性値の４０％以上を示す。
     
  3. ５０℃における複合糖鎖に対する加水分解活性が、最大活性値の６０％以上を示すことを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
     
  4. （Ａ）及び（Ｂ）の特性に加えて、更に（Ｃ）大腸菌を用いた遺伝子組み換え発現において、１０　ｍｇ／Ｌ培養以上を示すことを特徴とする、請求項１～３のいずれかのポリペプチド。
     
  5. 配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸番号５４～３４１の領域における配列同一性が、８５％以上であることを特徴とする、請求項１～４のいずれかのポリペプチド。
     
  6. Ｄ２７６、Ｖ２２３、Ｗ２２５、Ｙ２４７及びＷ２４８のアミノ酸のうち少なくとも一つが維持されていること（好ましくは、少なくともＤ２７６が維持されていること）を特徴とする請求項１～５のいずれかのポリペプチド。
     
  7. 配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号1のアミノ酸配列において、Ａ１２８Ｔ、Ｄ３３３Ｇ、Ｉ４３４Ｌ、Ｖ４６０Ａ、Ｉ５２７Ｖ、Ｋ５６９Ｔ、Ｆ６１０Ｓ及びＨ６２６Ｒからなる群から選択される少なくとも一つの変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする、請求項１～３のいずれかのポリペプチド。
     
  8. 配列番号1～６のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１のポリペプチド。
     
  9. 特性（Ａ）を充足するアミノ酸配列を有し、配列番号２３に示される変異の少なくともひとつを有することを特徴とする、請求項１～６のいずれかのポリペプチド。
     
  10. Ｎ１７２、Ｄ１７６，Ｙ２１４、Ｓ２１６，Ｌ２４５、Ｎ２４６、Ｔ２７５、Ｌ３０６、Ｆ３０７及びＡ３１０から選択される少なくともひとつのアミノ酸に変異を有し、増強された糖鎖転移活性を有することを特徴とする、請求項９のポリペプチド。
     
  11. 以下の群から選択される少なくともひとつの変異を有することを特徴とする請求項７のポリペプチド；
    Ｎ１７２がＧｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＭｅｔに置換された変異、Ｄ１７６がＡｒｇに置換された変異、Ｙ２１４がＰｈｅに置換された変異、Ｓ２１６がＶａｌに置換された変異、、Ｌ２４５がＳｅｒに置換された変異、Ｎ２４６がＡｓｐに置換された変異、Ｔ２７５がＩｌｅに置換された変異、Ｆ２８３がＳｅｒに置換された変異、Ｌ３０６がＩｌｅに置換された変異、Ｆ３０７がＴｙｒに置換された変異、Ａ３１０がＡｓｐに置換された変異、及び、Ｅ３１４がＧｌｎに置換された変異。
     
  12. Ｗ２７８がＰｈｅ又はＴｙｒに置換された変異を有することを特徴とする請求項９～１１のいずれかのポリペプチド。
     
  13. 請求項１～１２のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
     
  14. 配列番号８～１７のヌクレオチド番号１～２０８８のヌクレオチド配列、及び配列番号１８～１９のヌクレオチド番号１～２０９１のヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド配列を有する、請求項１３のポリヌクレオチド。
     
  15. 請求項１３又は１４のポリヌクレオチドを含む発現用プラスミド。
     
  16. 請求項１５のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
     
  17. 配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７のヌクレオチド番号１～２０８８のヌクレオチド配列、又は、配列番号１９のヌクレオチド番号１～２０９１のヌクレオチド配列、を含むポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された大腸菌である、請求項１６の宿主細胞。
     
  18. 請求項１６又は１７の宿主細胞を培養し、得られた培養物から請求項１～１２のいずれかのポリペプチドを回収する工程を含む、請求項１～１２のいずれかのポリペプチドの製造方法。
     
  19. 請求項１～１２のいずれかのポリペプチドを含有する試薬。
     
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