WO2018097308A1 - リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子 - Google Patents

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention includes a ligand-binding molecule having at least one cleavage site, wherein the binding to the ligand is attenuated in a state in which the cleavage site is cleaved, a method for producing the ligand-binding molecule, and a pharmaceutical comprising the ligand-binding molecule A composition is provided.
  • Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in plasma and few side effects. Among them, many IgG-type antibody drugs are on the market, and many antibody drugs have been developed (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Document 3 As conventional cancer therapeutic agents using antibody drugs, Rituxan for CD20 antigen, cetuximab for EGFR antigen, Herceptin for HER2 antigen, etc. have been approved (Non-patent Document 3). These antibody molecules bind to antigens expressed in cancer cells and exert damaging activity against cancer cells by ADCC and signal inhibition.
  • a method of delivering a ligand to a solid cancer by an immunocytokine in which a biologically active ligand such as cytokine is fused to an antibody molecule that binds to a cancer antigen highly expressed in cancer cells.
  • Cytokines delivered to solid tumors by immunocytokines activate immunity to exert antitumor effects. Since cytokines such as IL2, IL12, and TNF are highly toxic, they are expected to increase their effects while reducing side effects by delivering these cytokines locally to the cancer in order to make these cytokines work locally.
  • Non-Patent Documents 4, 5, and 6 all of these have problems in that they are not clinically effective when administered systemically, therapeutic window is narrow, the toxicity is high, and systemic administration is not possible, and they are still used as pharmaceuticals Not approved.
  • Non-patent Document 7 A major cause of this is that even cytokines that are administered systemically are exposed to the whole body, even if they are immunocytokines, they can act systemically and exert toxicity, or they can only be administered at very low doses to avoid toxicity Is mentioned. There is also a report that the anti-tumor effect did not change between an immunocytokine in which IL2 is fused to an antibody that binds to a cancer antigen and an immunocytokine in which IL2 is fused to an antibody that does not bind to a cancer antigen (Non-patent Document 7).
  • a molecule in which a cytokine and a cytokine receptor are bound by a linker that is cleaved by a protease highly expressed in cancer has been reported. Cytokines are inhibited by a cytokine receptor bound by a linker, but when the linker is cleaved by a protease, the cytokine is released from the cytokine receptor and becomes an active form.
  • Non-patent Document 8 a molecule that binds TNF-alpha and TNF-R with a linker that can be cleaved with uPA (Non-patent Document 8) has been reported, and a molecule that binds IL2 and IL2R with a linker that can be cleaved with MMP2 (non-patent document) 9) has been reported.
  • cytokines have activity even before the linker is cleaved, and the activity is improved only about 10 times by the cleavage of the linker.
  • a molecule (non-patent document 9) in which anti-IL2 scFv is bound to IL2 via a linker cleaved by MMP-2 instead of IL2R has been reported.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and one of its purposes is to provide a ligand-binding molecule that selectively activates a ligand such as a cytokine or chemokine in a target tissue, and the ligand-binding molecule. It is in providing the pharmaceutical composition containing, the said pharmaceutical composition, and the manufacturing method of the said active ingredient.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to achieve the above object, and have created a ligand-binding molecule in which the binding activity to the ligand is attenuated by cleavage of the cleavage site.
  • the present inventors find that the ligand-binding molecule or a pharmaceutical composition containing the ligand-binding molecule is useful for treating a disease using the ligand, and administer the ligand-binding molecule. It has been found that the ligand-binding molecule is useful in the treatment of diseases including the above-mentioned diseases and in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases.
  • the present inventors have completed the present invention by creating a method for producing the ligand-binding molecule.
  • a molecule capable of binding to a ligand wherein the molecule is a polypeptide having at least one cleavage site, and the binding to the ligand is attenuated in a state where the molecule is cleaved at at least one cleavage site.
  • a ligand-binding molecule (2) The ligand-binding molecule according to (1), wherein the ligand is released from the ligand-binding molecule when the cleavage site is cleaved.
  • the protease cleavage sequence is a sequence comprising a sequence selected from the sequences described in SEQ ID NOs: 3, 34, 66, 70, 71, 72, 73, 35, 75, 76, and 345.
  • the ligand-binding molecule according to (1) (9) The ligand-binding molecule according to any one of (3) to (8), wherein a first movable linker is further added to one end of the protease cleavage sequence.
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are located in the antibody constant region.
  • the above-mentioned cleavage site, or the above-mentioned protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker and the second movable linker are the antibody heavy chain constant region amino acid 118 (EU numbering).
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are antibody light chain constant region amino acid 108 amino acid (EU numbering)
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are located in the antibody VH or the antibody VL.
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are numbered from antibody VH 7th amino acid (Kabat numbering) to number 16 From amino acid (Kabat numbering), amino acid number 40 (Kabat numbering) to amino acid number 47 (Kabat numbering), amino acid number 55 (Kabat numbering) to amino acid number 69 (Kabat numbering), amino acid number 73 (Kabat numbering) to 79 Amino acid (Kabat numbering), amino acid 83 (Kabat numbering) to amino acid 89 (Kabat numbering), amino acid 95 (Kabat numbering) to amino acid 99 (Kabat numbering), and amino acid 101 (Kabat numbering) ) To the 113th amino acid (Kabat numbering), the ligand-binding molecule according to the
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are antibody VL7 amino acid (Kabat numbering) to 19th From amino acids (Kabat numbering), from amino acid 39 (Kabat numbering) to amino acid 46 (Kabat numbering), from amino acid 49 (Kabat numbering) to amino acid 62 (Kabat numbering), and from amino acid 96 (Kabat numbering)
  • the ligand-binding molecule according to (17) which is inserted at an arbitrary position in a sequence selected from the group consisting of amino acids up to amino acid 107 (Kabat numbering).
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are near the boundary between the antibody constant region and the antibody VH.
  • the cleavage site, the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are anti-antibodies from the amino acid (Kabat numbering) of antibody VH109.
  • the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence, the first movable linker, and the second movable linker are antibodies from the amino acid (Kabat numbering) of antibody VL104.
  • the ligand-binding molecule according to (20) which is inserted at any position in the sequence up to the amino acid (EU numbering) (Kabat numbering position 113) of the light chain constant region No. 113.
  • the antibody VL and the antibody VH in the ligand-binding molecule are associated with each other, and the association is eliminated by cleaving the cleavage site, or the protease cleavage sequence is cleaved by a protease.
  • Ligand binding molecule The ligand-binding molecule according to any one of (1) to (24), wherein the ligand is CXCL10, IL12, PD1, or IL6R.
  • the ligand is CXCL10, and the ligand-binding molecule includes antibody VH and antibody VL, and the ligand-binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 374, H-CDR2 as SEQ ID NO: 375, antibody VH containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 376, L-CDR1 as SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: An antibody VL comprising L-CDR2 which is 378, L-CDR3 which is SEQ ID NO: 379; or (b) H-CDR1 as SEQ ID NO: 380, H-CDR2 as SEQ ID NO: 381, antibody VH containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 382, L-CDR1 as SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: An antibody VL comprising L-CDR2 which is 384, L-CDR3 which is SEQ ID NO: 385; or (c) having antibody VH and antibody VL competing with
  • the ligand binding molecule is an antibody heavy chain selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 14, 23 to 27, 33, 59, 60, 356, and 367, or the sequences represented by SEQ ID NOs: 15 to 22
  • the ligand is IL12
  • the ligand-binding molecule includes antibody VH and antibody VL
  • the ligand-binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 386, H-CDR2 as SEQ ID NO: 387, antibody VH containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 388, L-CDR1 as SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO:
  • the ligand is PD1, and the ligand binding molecule includes antibody VH and antibody VL, and the ligand binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 392, H-CDR2 as SEQ ID NO: 393, antibody VH containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 394, L-CDR1 as SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: An antibody VL comprising L-CDR2 which is 396, L-CDR3 which is SEQ ID NO: 397; or (b) having antibody VH and antibody VL competing with (a); or (c) The ligand-binding molecule according to (27), which has an antibody VH and an antibody VL that bind to the same epitope as (a).
  • the ligand-binding molecule is an antibody comprising an antibody heavy chain selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 304 and 305, or an antibody light chain selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 306 to 315 and 322.
  • the ligand is IL-6R (IL-6 receptor), and the ligand-binding molecule includes antibody VH and antibody VL, and the ligand-binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 398, H-CDR2 as SEQ ID NO: 399, antibody VH containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 400, L-CDR1 as SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: Having an antibody VL comprising L-CDR2 which is 402, L-CDR3 which is SEQ ID NO: 403; or (b) having antibody VH and antibody VL competing with (a); or (c) The ligand-binding molecule according to (27), which has an antibody VH and an antibody VL that bind to the same epitope as (a).
  • the ligand-binding molecule is an antibody heavy chain selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 153 to 156, 157 to 159, and 404 to 470, or an antibody light chain selected from the sequences represented by SEQ ID NOs: 471 to 535
  • the ligand-binding molecule according to (34), which is an antibody comprising (36) The ligand-binding molecule according to any one of (1) to (35), wherein the ligand-binding molecule is an IgG antibody.
  • the ligand is CXCL10
  • the ligand-binding molecule includes an antibody light chain and an antibody heavy chain
  • the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused with the ligand (38) to ( 41)
  • the ligand is CXCL10, and an antibody light chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and the ligand-binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 374, H-CDR2 as SEQ ID NO: 375, antibody heavy chain containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 376, L-CDR1 as SEQ ID NO: 377, sequence Having an antibody light chain comprising L-CDR2 being SEQ ID NO: 378, L-CDR3 being SEQ ID NO: 379; or (b) H-CDR1 as SEQ ID NO: 380, H-CDR2 as SEQ ID NO: 381, antibody heavy chain containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 382, L-CDR1 as SEQ ID NO: 383, sequence Having an antibody light chain comprising L-CDR2 being SEQ ID NO: 384, L-CDR3 being SEQ ID NO: 385, (42) or the ligand
  • the ligand is PD1
  • the ligand-binding molecule includes an antibody light chain and an antibody heavy chain, and the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused with the ligand.
  • 41) The ligand binding molecule according to any one of the above.
  • the ligand is PD1, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 395, L-CDR2 of SEQ ID NO: 396, L-CDR3 of SEQ ID NO: 397,
  • the ligand-binding molecule according to any one of (46) to (48), wherein the ligand is PD1 represented by SEQ ID NO: 320.
  • the ligand is PD1, the antibody heavy chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and a series of polypeptides fused with PD1 and the antibody heavy chain are represented by SEQ ID NOs: 323 and 324.
  • the ligand-binding molecule according to any one of (46) to (49), comprising a sequence selected from the sequences shown.
  • the ligand is PD1, an antibody light chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and a series of polypeptides in which PD1 and the antibody light chain are fused are SEQ ID NOs: 325 to 334.
  • the ligand-binding molecule according to any one of (46) to (49), comprising a sequence selected from the sequences shown.
  • the ligand is IL12
  • the ligand-binding molecule comprises an antibody light chain and an antibody heavy chain
  • the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused to the ligand.
  • 41) The ligand binding molecule according to any one of the above.
  • 53) The ligand-binding molecule according to (52), wherein the cleavage site is contained in the antibody light chain or the antibody heavy chain.
  • the ligand is IL12, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 389, L-CDR2 of SEQ ID NO: 390, L-CDR3 of SEQ ID NO: 391,
  • the ligand is IL-6R, the ligand-binding molecule includes an antibody light chain and an antibody heavy chain, and the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused to the ligand. (38) To (41).
  • the ligand is IL-6R, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 401, L-CDR2 of SEQ ID NO: 402, L-CDR3 of SEQ ID NO: 403,
  • the antibody heavy chain has H-CDR1 as SEQ ID NO: 398, H-CDR2 as SEQ ID NO: 399, and H-CDR3 as SEQ ID NO: 400,
  • (58) A complex formed by the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (36) bound to the ligand.
  • (59) A fusion protein in which the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (36) are fused.
  • (60) The fusion protein according to (59), wherein the ligand-binding molecule does not bind to another ligand when the ligand-binding molecule is fused with the ligand.
  • (61) The fusion protein according to (59) or (60), wherein the ligand-binding molecule is fused to the ligand via a linker.
  • the ligand is CXCL10, and an antibody light chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and the ligand-binding molecule is: (a) H-CDR1 as SEQ ID NO: 374, H-CDR2 as SEQ ID NO: 375, antibody heavy chain containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 376, L-CDR1 as SEQ ID NO: 377, sequence Having an antibody light chain comprising L-CDR2 being SEQ ID NO: 378, L-CDR3 being SEQ ID NO: 379; or (b) H-CDR1 as SEQ ID NO: 380, H-CDR2 as SEQ ID NO: 381, antibody heavy chain containing H-CDR3 as SEQ ID NO: 382, L-CDR1 as SEQ ID NO: 383, sequence Having an antibody light chain comprising L-CDR2 being SEQ ID NO: 384, L-CDR3 being SEQ ID NO: 385, (64) or the ligand
  • the ligand is PD1, the ligand-binding molecule includes an antibody light chain and an antibody heavy chain, and the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused with the ligand.
  • the ligand is PD1, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 395, L-CDR2 of SEQ ID NO: 396, L-CDR3 of SEQ ID NO: 397,
  • the ligand is PD1, the antibody heavy chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and a series of polypeptides fused with PD1 and the antibody heavy chain are represented by SEQ ID NOs: 323 and 324.
  • the ligand is PD1, the antibody light chain contained in the ligand-binding molecule is fused with the ligand, and a series of polypeptides in which PD1 and the antibody light chain are fused are SEQ ID NOs: 325 to 334.
  • the fusion protein according to any of (68) to (71) comprising a sequence selected from the sequences shown.
  • the ligand is IL12
  • the ligand-binding molecule comprises an antibody light chain and an antibody heavy chain
  • the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused with the ligand from (59)
  • ( 63) The fusion protein according to any one of (75)
  • the ligand is IL12, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 389, L-CDR2 of SEQ ID NO: 390, L-CDR3 of SEQ ID NO: 391, The fusion protein according to (74) or (75), wherein the weight chain has H-CDR1 as SEQ ID NO: 386, H-CDR2 as SEQ ID NO: 387, and H-CDR3 as SEQ ID NO: 388.
  • the ligand is IL-6R, the ligand-binding molecule includes an antibody light chain and an antibody heavy chain, and the antibody light chain or the antibody heavy chain is fused to the ligand. (59) To (63).
  • the ligand is IL-6R, and the antibody light chain has L-CDR1 of SEQ ID NO: 401, L-CDR2 of SEQ ID NO: 402, L-CDR3 of SEQ ID NO: 403, The fusion protein according to (77) or (78), wherein the antibody heavy chain has H-CDR1 as SEQ ID NO: 398, H-CDR2 as SEQ ID NO: 399, and H-CDR3 as SEQ ID NO: 400.
  • a pharmaceutical composition comprising the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (57).
  • a pharmaceutical composition comprising the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (37) and a ligand.
  • a pharmaceutical composition comprising the complex according to (58).
  • a pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of (59) to (79).
  • a method for producing the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (57). which comprises introducing a protease cleavage sequence into a molecule capable of binding to a ligand.
  • (87) A polynucleotide encoding the ligand-binding molecule according to any one of (1) to (57).
  • (88) A vector comprising the polynucleotide according to (87).
  • (89) A host cell comprising the polynucleotide according to (87) or the vector according to (88).
  • (90) A method for producing a ligand-binding molecule according to any one of (1) to (57), comprising a step of culturing the host cell according to (89).
  • (91) A polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of (59) to (79).
  • (92) A vector comprising the polynucleotide according to (91).
  • a host cell comprising the polynucleotide according to (91) or the vector according to (92).
  • FIG. 3 is a diagram showing a fusion protein of an IgG antibody and a ligand containing a ligand-linker-antiligand antibody VH molecule specifically released in a target tissue, and one mode of activation thereof.
  • the ligand and the anti-ligand antibody are linked by a linker. It is a figure which shows the IgG antibody which liberates a ligand specifically in a target tissue, and its activation mode.
  • An anti-ligand antibody having a protease cleavage sequence inserted near the boundary between VH and CH1 and the ligand are mixed and administered to the individual. It is a figure which shows the IgG antibody which liberates a ligand specifically in a target tissue, and its activation mode.
  • An anti-ligand antibody having a protease cleavage sequence inserted near the boundary between VH and CH1 is administered to the individual.
  • the administered antibody binds to a ligand originally present in the body, and the subsequent operation is the same as in the activation mode of FIG.
  • a band generated near 15 kDa is a band derived from VH
  • a band appearing at a position of 25-50 kDa is a band derived from the constant region.
  • Continuation of (A), and (B) Protease (MT-SP1) treatment of the antibody molecule created by inserting a protease cleavage sequence into the variable and constant regions of the light chain of MabCXCL10 It is a figure which shows the result evaluated by -PAGE.
  • Two new bands are derived from the light chain cleaved by protease treatment. It is a figure which shows the continuation of (B).
  • FIG. The insertion site is indicated by [insert]. It is a figure which shows the result of having evaluated the interaction of the antibody molecule and human CXCL10 which were created by inserting the protease cleavage sequence and the movable linker sequence near the boundary between the variable region and the constant region of the heavy chain of MabCXCL10 using Biacore.
  • the insertion site is indicated by [insert].
  • the amino acid residue indicated by the strikethrough in the “insertion position and modification position” column is removed when the insertion sequence is inserted, that is, the amino acid at the C-terminal side of the insertion sequence is substituted.
  • Antibody molecules created by substituting part of the amino acid sequence near the boundary between the variable region and the constant region of MabCXCL10 with a protease cleavage sequence and a movable linker are treated with protease (uPA, MT-SP1) and then run on reduced SDS-PAGE And it is a figure which shows the result of having evaluated the grade of the cutting
  • a band generated near 15 kDa is a band derived from VH
  • a band appearing at a position of 25-50 kDa is a band derived from the constant region. It is a figure showing luciferase activity (luminescence value). It is a result of SDS-PAGE before and after cleaving the CXCL10-anti-CXCL10 antibody fusion protein with protease. It is a figure showing luciferase activity (luminescence value).
  • the Protease (+) lane is a protease-treated antibody
  • the protease (-) lane is a protease-untreated antibody.
  • a black thick line indicates a protease-treated antibody
  • a gray thin line indicates a protease-untreated antibody.
  • the X axis represents the measurement time (second), and the measurement start was set to 0 second.
  • the Y axis shows the bond.
  • each graph indicates the antibody used, and the None graph uses only PBS buffer and no antibody.
  • a black thick line indicates a sample that has been subjected to protease treatment, and a gray thin line indicates a sample that has not been subjected to protease treatment.
  • the X axis represents the measurement time (second), and the measurement start was set to 0 second.
  • the Y axis shows the bond.
  • each graph indicates the antibody contained in the sample, and the “antigen and protease” graph includes only PD1 in the sample and does not include the antibody.
  • a black thick line indicates a sample that has been subjected to protease treatment, and a gray thin line indicates a sample that has not been subjected to protease treatment.
  • the X axis represents the measurement time (second), and the measurement start was set to 0 second.
  • the Y axis shows the bond.
  • the name of each graph indicates the fusion protein.
  • the fusion protein was not used as an evaluation sample, but only the antigen PD1 was used.
  • the Protease (+) lane is a protease-treated fusion protein
  • the protease (-) lane is a protease-untreated fusion protein.
  • the polypeptide in the present invention usually refers to peptides and proteins having a length of about 4 amino acids or more.
  • the polypeptide in the present invention is usually a polypeptide comprising an artificially designed sequence, but is not particularly limited, and may be, for example, a biological polypeptide.
  • any of natural polypeptide, synthetic polypeptide, recombinant polypeptide, etc. may be sufficient.
  • fragments of the above polypeptides are also included in the polypeptides of the present invention.
  • a cell-free translation system (Clover Direct (Protein Express) in which a tRNA with a non-natural amino acid linked to a complementary amber suppressor tRNA of the UAG codon (amber codon), which is one of the stop codons, is also suitable. Used.
  • the meaning of the term “and / or” used in representing an amino acid modification site includes any combination in which “and” and “or” are appropriately combined.
  • “the 37th, 45th, and / or 47th amino acids are substituted” includes the following amino acid modification variations; (a) 37, (b) 45, (c) 47, (d) 37 and 45, (e) 37 and 47, (f) 45 and 47, (g) 37 And 45 and 47.
  • an expression representing an amino acid modification an expression in which a one-letter code or a three-letter code of an amino acid before and after modification is written before and after a numeral representing a specific position may be used as appropriate.
  • the modification F37V or Phe37Val used for adding an amino acid substitution contained in an antibody variable region represents substitution of Phe at position 37 represented by Kabat numbering to Val. That is, the number represents the position of the amino acid represented by Kabat numbering, and the one-letter code or three-letter code of the amino acid described before is the amino acid before substitution, the one-letter code of the amino acid described thereafter or 3
  • the letter code represents the amino acid after substitution.
  • the modification of P238A or Pro238Ala used when adding an amino acid substitution to the Fc region contained in the antibody constant region represents substitution of Pro at position 238 represented by EU numbering to Ala. That is, the number represents the position of the amino acid represented by EU numbering, and the one-letter code or three-letter code of the amino acid described before it is the amino acid before substitution, the one-letter code of the amino acid described after that or 3 The letter code represents the amino acid after substitution.
  • the present invention relates to a ligand-binding molecule which has a cleavage site and whose binding to the ligand is attenuated in a state where the cleavage site is cleaved.
  • the ligand binding molecule of the present invention is a polypeptide and refers to a molecule capable of binding to a ligand.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is a molecule that can bind to a ligand, particularly a molecule that can bind to a ligand in an uncut state.
  • “Coupling” here usually refers to coupling by interaction mainly consisting of non-covalent bonds such as electrostatic force, van der Waals force, and hydrogen bond.
  • Preferable examples of the ligand-binding mode of the ligand-binding molecule of the present invention include, but are not limited to, for example, antigen-antibody reaction in which an antigen-binding region, antigen-binding molecule, antibody, antibody fragment and the like bind to an antigen. .
  • Bindable to ligand means that the ligand-binding molecule can bind to the ligand even if the ligand-binding molecule and the ligand are separate molecules, and means that the ligand-binding molecule and the ligand are linked by a covalent bond. do not do. For example, the fact that a ligand and a ligand-binding molecule are covalently bonded via a linker does not mean that the ligand can be bound.
  • binding to a ligand is attenuated means that the ability to bind is attenuated.
  • the ligand-binding molecule may be connected to the ligand via a linker or the like.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is limited only by binding to a ligand in an uncleaved state, and a molecule having any structure can be used as long as it can bind to a target ligand in an uncleaved state.
  • ligand binding molecules include, but are not limited to, antibody heavy chain variable region (VH) and antibody light chain variable region (VL), single domain antibody (sdAb), and cell membrane proteins present in vivo.
  • Avimer contains a module called the A domain of about 35 amino acids (International Publications WO2004 / 044011, WO2005 / 040229), Adnectin containing a 10Fn3 domain that binds to the protein in fibronectin, a glycoprotein expressed on the cell membrane (International (Publication WO2002 / 032925), Affibody with IgG binding domain comprising 3 helix bundles consisting of 58 amino acids of ProteinA as scaffold (International Publication WO1995 / 001937), Turn containing 33 amino acid residues and 2 reverses Exposed to the molecular surface of ankyrin repeat (AR) with a structure in which subunits of parallel helices and loops are repeatedly stacked 8 antiparallel strands that are highly conserved in lipocalin molecules such as the domain DARPins (Designed Ankyrin Repeat protein) (International Publication WO2002 / 020565) and Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin (NGAL) Variable loops that
  • Recessed leucine-rich repeat (leucine-rich-repeat (LRR)) module of the sphere receptor (variable lymphocyte receptor (VLR)) is a recessed area of a parallel sheet structure inside a horseshoe-shaped structure repeatedly stacked (International Publication WO2008 / 016854).
  • antibody is used in the broadest sense and is not limited thereto as long as it exhibits a desired antigen-binding activity, but is not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, Various antibody structures are included, including bispecific antibodies) and antibody fragments.
  • a method for producing an antibody having a desired binding activity is known to those skilled in the art.
  • a method for producing an antibody that binds to IL-6R (anti-IL-6R antibody) is exemplified.
  • Antibodies that bind to antigens other than IL-6R can be appropriately prepared according to the following examples.
  • the anti-IL-6R antibody can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal can be suitably prepared.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by host cells transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the antibodies mentioned in the present application include “humanized antibodies” and “chimeric antibodies”.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared, for example, as follows by using known techniques. That is, a mammal is immunized according to a normal immunization method using IL-6R protein as a sensitizing antigen. The resulting immune cells are fused with known parental cells by conventional cell fusion methods. Next, hybridomas that produce anti-IL-6R antibodies can be selected by screening monoclonal antibody-producing cells by conventional screening methods.
  • IL-6R protein used as a sensitizing antigen for antibody acquisition can be obtained by expressing the IL-6R gene. That is, an appropriate host cell is transformed by inserting a gene sequence encoding IL-6R into a known expression vector.
  • the desired human IL-6R protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • soluble IL-6R is expressed in order to obtain soluble IL-6R from the culture supernatant.
  • Purified natural IL-6R protein can also be used as a sensitizing antigen as well.
  • the purified IL-6R protein can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • a partial peptide of IL-6R can also be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can also be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human IL-6R. It can also be obtained by incorporating a part of the IL-6R gene into an expression vector for expression.
  • the region and size of IL-6R peptide used as a partial peptide are not particularly limited to a specific embodiment.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 5 or more, for example 6 or more, or 7 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein obtained by fusing a desired partial polypeptide or peptide of IL-6R protein with a different polypeptide can be used as a sensitizing antigen.
  • an antibody Fc fragment or a peptide tag can be suitably used.
  • a vector that expresses a fusion protein can be prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into the expression vector as described above. The method for producing the fusion protein is described in Molecular® Cloning® 2nd® ed.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not limited to a specific animal, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodent animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys and the like are preferably used.
  • the above animals are immunized with a sensitizing antigen.
  • immunization is performed by administering a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously to a mammal.
  • a sensitized antigen diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio is mixed with a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and emulsified, if desired.
  • the sensitizing antigen is administered to the mammal several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a low molecular weight when used as a sensitizing antigen, it may be desirable to immunize the sensitizing antigen peptide bound to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a hybridoma that produces a desired antibody can be prepared as follows using DNA immunization.
  • DNA immunization a sensitizing antigen is expressed in vivo in the immunized animal to which the vector DNA constructed in such a manner that the gene encoding the antigen protein can be expressed in the immunized animal.
  • This is an immunization method in which immune stimulation is given.
  • the following advantages are expected in DNA immunization. -Maintains the structure of membrane proteins such as IL-6R and can be given immune stimulation-No need to purify immune antigens
  • DNA expressing IL-6R protein is administered to an immunized animal.
  • DNA encoding IL-6R can be synthesized by a known method such as PCR.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be suitably used.
  • a method for administering a vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization is performed by introducing gold particles adsorbed with an expression vector into cells of an immunized animal individual using a gene gun.
  • the production of an antibody that recognizes IL-6R can also be produced using the method described in International Publication WO 2003/104453.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Spleen cells can be used as preferred immune cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as the cells fused with the immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient or TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • 5 'bromodeoxyuridine normal cells that incorporate these pyrimidine analogs into DNA die.
  • cells deficient in these enzymes that cannot take up these pyrimidine analogs can survive in selective media.
  • G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) by a neomycin resistance gene.
  • gentamicin analogs gentamicin analogs
  • myeloma cells suitable for cell fusion are known.
  • Examples of such myeloma cells include P3 (P3x63Ag8.653) (J.JImmunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1- 7), NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2 / 0 ( Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194 / 5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133) and the like can be suitably used.
  • P3x63Ag8.653 J.JImmunol. (1979) 123 (4)
  • cell fusion between the immune cells and myeloma cells is performed according to a known method such as the method of Köhler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). More specifically, for example, the cell fusion can be performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is optionally added to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture are used. Serum replacement fluid such as fetal serum (FCS) can be suitably added.
  • FCS fetal serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preheated to about 37 ° C. is usually 30 to 60%. It is added at a concentration of (w / v).
  • a desired fused cell is formed by gently mixing the mixture.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas can be removed by repeating the operation of adding the appropriate culture solution listed above and removing the supernatant by centrifugation.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culture using the HAT culture solution can be continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fused cells) to die (usually, sufficient time is several days to several weeks).
  • screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can selectively proliferate in the HAT medium.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • a desired hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody can be performed by conventional limiting
  • Desired antibody screening and single cloning can be suitably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • a monoclonal antibody that binds to IL-6R can bind to IL-6R expressed on the cell surface.
  • Such monoclonal antibodies can be screened, for example, by FACS (fluorescence-activated cell sorting).
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • cells expressing IL-6R are prepared.
  • Preferred cells for screening are mammalian cells in which IL-6R is forcibly expressed.
  • a non-transformed mammalian cell used as a host cell as a control, the binding activity of the antibody to IL-6R on the cell surface can be selectively detected. That is, a hybridoma that produces an IL-6R monoclonal antibody can be obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody that does not bind to host cells but binds to IL-6R forced expression cells.
  • the binding activity of the antibody to the immobilized IL-6R-expressing cells can be evaluated based on the principle of ELISA.
  • IL-6R-expressing cells are immobilized in the well of an ELISA plate.
  • the culture supernatant of the hybridoma is brought into contact with the immobilized cells in the well, and an antibody that binds to the immobilized cells is detected.
  • the monoclonal antibody is derived from a mouse
  • the antibody bound to the cell can be detected by an anti-mouse immunoglobulin antibody.
  • a hybridoma that produces a desired antibody having an ability to bind to an antigen selected by these screenings can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method, and a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith and allowed to proliferate, and a monoclonal antibody can be obtained from the ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • An antibody encoded by an antibody gene cloned from antibody-producing cells such as the hybridoma can also be suitably used.
  • An antibody encoded by the gene is expressed by incorporating the cloned antibody gene into a suitable vector and introducing it into a host. Methods for isolation of antibody genes, introduction into vectors, and transformation of host cells are already established by, for example, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767- 775). As described below, methods for producing recombinant antibodies are also known.
  • cDNA encoding a variable region (V region) of an anti-IL-6R antibody is obtained from a hybridoma cell that produces the anti-IL-6R antibody.
  • V region variable region
  • RNA is extracted from the hybridoma.
  • the following method can be used. -Guanidine ultracentrifugation (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) -AGPC method (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
  • Extracted mRNA can be purified using mRNA “Purification” Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) or the like.
  • kits for extracting total mRNA directly from cells such as QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) are also commercially available.
  • mRNA can be obtained from the hybridoma.
  • CDNA encoding the antibody V region can be synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized by AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • the desired cDNA fragment is purified from the obtained PCR product and then ligated with vector DNA.
  • a desired recombinant vector can be prepared from Escherichia coli that has formed the colony. Then, whether or not the recombinant vector has the target cDNA base sequence is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • cDNA is synthesized using RNA extracted from a hybridoma cell as a template to obtain a 5'-RACE cDNA library.
  • a commercially available kit such as SMART RACE cDNA amplification kit is appropriately used.
  • the antibody gene is amplified by the PCR method using the obtained 5'-RACE ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cDNA library as a template.
  • Primers for amplifying mouse antibody genes can be designed based on known antibody gene sequences. These primers have different nucleotide sequences for each immunoglobulin subclass. Therefore, it is desirable to determine the subclass in advance using a commercially available kit such as IsoIStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).
  • primers capable of amplifying genes encoding ⁇ 1, ⁇ 2a, ⁇ 2b, ⁇ 3 as heavy chains and ⁇ chain and ⁇ chain as light chains are provided. Can be used.
  • a primer that anneals to a portion corresponding to a constant region close to the variable region is generally used as the 3 ′ primer.
  • the primer attached to the 5 ′ RACE cDNA library preparation kit is used as the 5 ′ primer.
  • an immunoglobulin comprising a combination of a heavy chain and a light chain
  • Desired antibodies can be screened using the reconstituted immunoglobulin binding activity to IL-6R as an index.
  • the binding of the antibody to IL-6R is more preferably specific.
  • Antibodies that bind to IL-6R can be screened, for example, as follows; (1) contacting an antibody containing a V region encoded by cDNA obtained from a hybridoma with IL-6R-expressing cells; (2) a step of detecting binding between an IL-6R-expressing cell and an antibody, and (3) a step of selecting an antibody that binds to the IL-6R-expressing cell.
  • a method for detecting the binding between an antibody and IL-6R-expressing cells is known. Specifically, the binding between the antibody and the IL-6R-expressing cell can be detected by a technique such as FACS described above. In order to evaluate the binding activity of the antibody, a fixed specimen of IL-6R-expressing cells can be appropriately used.
  • a panning method using a phage vector is also preferably used as an antibody screening method using binding activity as an index.
  • an antibody gene is obtained from a polyclonal antibody-expressing cell group as a heavy chain and light chain subclass library
  • a screening method using a phage vector is advantageous.
  • Genes encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain can form a single chain Fv (scFv) by ligating with an appropriate linker sequence.
  • scFv single chain Fv
  • the phage encoding the antigen can be recovered to recover the DNA encoding scFv having the desired binding activity. By repeating this operation as necessary, scFv having a desired binding activity can be concentrated.
  • the cDNA is digested with a restriction enzyme that recognizes restriction enzyme sites inserted at both ends of the cDNA.
  • a preferred restriction enzyme recognizes and digests a base sequence that appears infrequently in the base sequence constituting the antibody gene.
  • a restriction enzyme that gives a sticky end.
  • An antibody expression vector can be obtained by inserting the cDNA encoding the V region of the anti-IL-6R antibody digested as described above into an appropriate expression vector.
  • a chimeric antibody is obtained.
  • the chimeric antibody means that the origin of the constant region and the variable region are different.
  • a heterologous chimeric antibody such as mouse-human
  • a human-human homologous chimeric antibody is also included in the chimeric antibody of the present invention.
  • a chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting the V region gene into an expression vector having a constant region in advance.
  • a restriction enzyme recognition sequence for a restriction enzyme that digests the V region gene can be appropriately arranged on the 5 ′ side of an expression vector holding a DNA encoding a desired antibody constant region (C region).
  • a chimeric antibody expression vector is constructed by fusing both digested with the same combination of restriction enzymes in-frame.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of the expression control region.
  • An expression control region for expressing an antibody includes, for example, an enhancer and a promoter.
  • An appropriate signal sequence can also be added to the amino terminus so that the expressed antibody is secreted extracellularly.
  • a peptide having the amino acid sequence MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 536) can be used as the signal sequence, but other suitable signal sequences are added.
  • the expressed polypeptide can be cleaved at the carboxyl terminal portion of the sequence, and the cleaved polypeptide can be secreted extracellularly as a mature polypeptide.
  • an appropriate host cell is transformed with this expression vector, whereby a recombinant cell expressing a DNA encoding an anti-IL-6R antibody can be obtained.
  • Antibody fragment refers to a molecule other than the complete antibody, including a part of the complete antibody that binds to the antigen to which the complete antibody binds.
  • Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2, diabody, linear antibodies, single chain antibody molecules (eg, scFv) And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • full-length antibody “complete antibody”, and “total antibody” are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to or defined herein.
  • variable region refers to the heavy or light chain domain of an antibody involved in binding the antibody to an antigen.
  • Antibody heavy and light chain variable domains typically have a similar structure, with each domain containing four conserved framework regions (FR) and three complementarity determining regions (CDR). Have (See, for example, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)).
  • One VH or VL domain will be sufficient to confer antigen binding specificity.
  • CDR complementarity determining region
  • hypervariable loop a structurally defined loop
  • antigen contact an antigen Contact residue
  • an antibody contains 6 CDRs: 3 in VH (H1, H2, H3) and 3 in VL (L1, L2, L3).
  • Exemplary CDRs herein include the following: (a) at amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3)
  • the resulting hypervariable loop Chothia and Lesk, J. Mol.
  • CDR residues and other residues in the variable domains are numbered herein according to Kabat et al., Supra.
  • “Framework” or “FR” refers to variable domain residues other than complementarity determining region (CDR) residues.
  • the FR of a variable domain usually consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Accordingly, CDR and FR sequences usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4.
  • variable region or “constant domain” refers to a part other than the variable region of an antibody.
  • an IgG antibody is an approximately 150,000 dalton heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide bonded, from the N-terminus toward the C-terminus, Each heavy chain has a variable region (VH) ⁇ ⁇ , also called a variable heavy chain domain or heavy chain variable domain, followed by a heavy chain constant region (CH) comprising a CH1 domain, a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain.
  • VH variable region
  • CH heavy chain constant region
  • each light chain has a variable region (VL) ⁇ ⁇ , also called a variable light chain domain or light chain variable domain, followed by a constant light chain (CL) domain.
  • VL variable region
  • CL constant light chain
  • the light chain of a natural antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
  • Class of an antibody refers to the type of constant domain or constant region provided in the heavy chain of the antibody.
  • IgA immunoglobulin
  • IgD immunoglobulin D
  • IgE immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgM immunoglobulin M
  • Fc region is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that includes at least a portion of the constant region.
  • the term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions.
  • the heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
  • lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) at the C-terminal of the Fc region may or may not be present.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, follow the EU numbering system (also called EU index) described in MD 1991.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is a polypeptide containing a cleavage site.
  • the cleavage site can be cleaved by, for example, an enzyme, can be reduced by a reducing agent, or can be photodegraded.
  • the cleavage site may be located anywhere in the polypeptide as long as it can be cleaved to reduce the binding of the ligand binding molecule to the ligand. Further, the cleavage site contained in the polypeptide may be one or plural.
  • the ligand-binding molecule of the present invention has weak (ie, attenuated) ligand binding in the cleaved state compared to the uncut state.
  • attenuation of the ligand binding can be assessed by the ligand binding activity of the ligand binding molecule.
  • Ligand binding molecule and ligand binding activity are evaluated by FACS, ELISA format, BIACORE method using ALPHA screen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) and surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, BLI (Bio-Layer Interferometry) method (Octet) ) And the like (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
  • the ALPHA screen is implemented according to the following principle by ALPHA technology using two beads of donor and acceptor. Only when the molecule bound to the donor bead interacts with the molecule bound to the acceptor bead and the two beads are in close proximity, a luminescent signal is detected.
  • a photosensitizer in the donor bead excited by the laser converts ambient oxygen into excited singlet oxygen.
  • Singlet oxygen diffuses around the donor bead, and when it reaches the adjacent acceptor bead, it causes a chemiluminescence reaction in the bead, and finally light is emitted.
  • the chemiluminescence reaction does not occur because the singlet oxygen produced by the donor bead does not reach the acceptor bead.
  • a ligand-binding molecule labeled with biotin is bound to donor beads, and a ligand tagged with glutathione S-transferase (GST) is bound to acceptor beads.
  • GST glutathione S-transferase
  • the ligand binding molecule and ligand interact to give a signal of 520-620 nm.
  • Untagged ligand binding molecules compete with the interaction between the tagged ligand binding molecule and the ligand.
  • Relative binding affinity can be determined by quantifying the decrease in fluorescence that results from competition. It is known that a ligand-binding molecule such as an antibody is biotinylated using Sulfo-NHS-biotin or the like.
  • a GST fusion ligand is expressed in a cell or the like holding a vector capable of expressing a fusion gene in which a polynucleotide encoding a ligand and a polynucleotide encoding GST are fused in frame
  • a method of purification using a glutathione column can be appropriately employed.
  • the obtained signal is suitably analyzed by fitting to a one-site competition model using nonlinear regression analysis using software such as GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
  • the Biacore system takes the shift amount, that is, the mass change at the sensor chip surface on the vertical axis, and displays the time change of mass as measurement data (sensorgram).
  • Kinetics association rate constant (ka) and dissociation rate constant (kd) are obtained from the sensorgram curve, and dissociation constant (KD) is obtained from the ratio of the constants.
  • an inhibition measurement method and an equilibrium value analysis method are also preferably used. Examples of inhibition measurement methods are described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010, and examples of equilibrium analysis methods are described in Methods Enzymol. 2000; 323: 325-40. Yes.
  • the ability of the ligand-binding molecule to bind to the ligand is reduced, for example, based on the measurement method described above, the amount of ligand binding per test ligand-binding molecule is 50% compared to the control ligand-binding molecule.
  • the amount of ligand binding per test ligand-binding molecule is 50% compared to the control ligand-binding molecule.
  • a binding activity index a desired index may be appropriately used.
  • a dissociation constant (KD) may be used.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the test ligand binding molecule is larger than the dissociation constant (KD) for the ligand of the control ligand binding molecule, It shows that the binding activity of the test ligand binding molecule to the ligand is weak compared to the control ligand binding molecule.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the test ligand-binding molecule is more than twice the dissociation constant (KD) for the ligand of the control ligand-binding molecule. , Preferably 5 times or more, 10 times or more, particularly preferably 100 times or more.
  • the control ligand-binding molecule include an uncleaved ligand-binding molecule.
  • the ligand-binding molecule of the present invention releases the ligand from the ligand-binding molecule by cleaving the cleavage site.
  • the linker has no cleavage site
  • the ligand is released while being connected to the part of the ligand binding molecule through the linker. (See, for example, FIG. 1).
  • the ligand is released together with a part of the ligand binding molecule, it can be said that the ligand is released from the ligand binding molecule as long as it is released from the majority of the ligand binding molecule.
  • a method for detecting release of a ligand from a ligand-binding molecule by cleavage of a cleavage site there is a method for detecting a ligand with a ligand detection antibody or the like that recognizes the ligand.
  • the ligand detection antibody preferably binds to the same epitope as the ligand binding molecule.
  • Ligand detection using ligand detection antibodies can be performed by FACS, ELISA format, ALPHA screen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) and BIACORE method using surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, BLI (Bio-Layer Interferometry) method (Octet) Etc.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody for a sample containing a ligand-binding molecule and a ligand before or after protease treatment, and the amount of ligand detected in the sample before and after protease treatment is measured. By comparison, release of the ligand can be detected.
  • a sample containing protease, ligand-binding molecule and ligand, and a sample containing ligand-binding molecule and ligand without containing protease the amount of ligand was measured using a ligand detection antibody, and a sample with or without protease.
  • Ligand release can be detected by comparing the amount of ligand detected in the medium.
  • liberation of the ligand can be detected by the method in the examples of the present application.
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody on the sample containing the fusion protein before or after protease treatment, and then treated with protease.
  • Ligand release can be detected by comparing the amount of ligand detected in the samples before and after.
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody, and the amount of ligand detected in the sample with or without protease is determined. By comparison, release of the ligand can be detected. More specifically, liberation of the ligand can be detected by the method in the examples of the present application.
  • the release of the ligand is measured by measuring the biological activity of the ligand in the sample. Can be detected. Specifically, release of the ligand can be detected by measuring and comparing the physiological activity of the ligand with respect to a sample containing the ligand-binding molecule and the ligand before or after the protease treatment.
  • the release of the ligand can be detected by measuring and comparing the physiological activity of the ligand with respect to the sample containing the protease, the ligand-binding molecule and the ligand, and the sample containing the protease without the protease and containing the ligand-binding molecule and the ligand.
  • release of the ligand is measured by measuring and comparing the biological activity of the ligand against a sample containing the fusion protein before or after protease treatment. It can be detected.
  • the liberation of the ligand can be detected by measuring and comparing the physiological activity of the ligand with respect to the sample containing the protease and the fusion protein and the sample containing the fusion protein without the protease.
  • the cleavage site contains a protease cleavage sequence and is cleaved by a protease.
  • protease refers to enzymes such as endopeptidases or exopeptidases that hydrolyze peptide bonds, usually endopeptidases.
  • the protease used in the present invention is limited only by the ability to cleave the protease cleavage sequence, and the type thereof is not particularly limited. In some embodiments, a target tissue specific protease is used.
  • Target tissue specific proteases are, for example, (1) a protease expressed at a higher level in a target tissue than in a normal tissue; (2) a protease having higher activity in the target tissue than in normal tissue; (3) a protease expressed at a higher level in target cells than in normal cells; (4) a protease having higher activity in target cells than in normal cells; Can point to either.
  • cancer tissue specific proteases or inflammatory tissue specific proteases are used.
  • target tissue means a tissue containing at least one target cell.
  • the target tissue is cancerous tissue.
  • the target tissue is an inflammatory tissue.
  • cancer tissue means a tissue containing at least one cancer cell.
  • all cell types that contribute to the formation of tumor cells and tumor cells containing endothelial cells such as cancer tissue containing cancer cells and blood vessels.
  • a tumor refers to a tumor tissue nest (a foci of tumor tissue).
  • tumor is generally used to mean a benign or malignant neoplasm.
  • examples of the “inflammatory tissue” include the following. ⁇ Joints in rheumatoid arthritis and osteoarthritis ⁇ Lungs (alveoli) in bronchial asthma and COPD ⁇ Digestive organs in inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and ulcerative colitis ⁇ Fibrotic tissue in fibrosis in the liver, kidney, and lung ⁇ Tissue that has undergone rejection in organ transplantation ⁇ Vessels and heart in arteriosclerosis and heart failure (Myocardium) -Visceral fat in metabolic syndrome-Skin tissue in atopic dermatitis and other dermatitis-Spinal nerve in disc herniation and chronic low back pain
  • a protease that is specifically expressed or specifically activated in several types of target tissues or a protease (target tissue-specific protease) that is considered to be associated with a disease state of the target tissue is known.
  • target tissue-specific protease a protease that is considered to be associated with a disease state of the target tissue.
  • International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, etc. disclose proteases that are specifically expressed in cancer tissues.
  • proteases that are specifically expressed in the target tissue there are also proteases that are specifically activated in the target tissue.
  • proteases may be expressed in an inactive form and then become active.
  • active proteases may escape inhibition and be specifically activated.
  • the active protease can be measured by using an antibody that recognizes the activated protease (PNAS 2013 Jan 2; 110 (1): 93-98.) Or by labeling the peptide recognized by the protease with a fluorescent label. Although quenched (quenched), it can be measured using a method of emitting light after cleavage (Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep; 9 (9): 690-701. Doi: 10.1038 / nrd3053.).
  • target tissue-specific protease (i) a protease expressed at a higher level in the target tissue than in the normal tissue, (ii) a protease having higher activity in the target tissue than in normal tissue, (iii) a protease expressed at a higher level in target cells than in normal cells, (iv) a protease having higher activity in target cells than in normal cells, Can point to either.
  • proteases include, but are not limited to, cysteine protease (including cathepsin family B, L, S, etc.), aspartyl protease (cathepsin D, E, K, O, etc.), serine protease (Including matriptase (including MT-SP1), cathepsins A and G, thrombin, plasmin, urokinase (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), elastase, proteinase 3, thrombin, kallikrein, tryptase, chymase ), Metalloproteases (metalloproteases (MMP1-28), including both membrane-bound (MMP14-17 and MMP24-25) and secreted (MMP1-13 and MMP18-23 and MMP26-28), A disintegration of proteases) Re And metalloproteases (ADAM), metalloproteases with A disintegrin or thrombospondin motif (ADA
  • the target tissue-specific protease can refer to a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease.
  • cancer tissue-specific protease examples include proteases that are specifically expressed in cancer tissues disclosed in International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, and the like.
  • the cancer tissue-specific protease is preferably at least 5 times higher than that in normal tissue, more preferably at least 10 times higher, more preferably at least 100 times higher, and more preferably at least 500 times higher. Preferably, it is most preferably 1000 times higher.
  • the cancer tissue-specific protease preferably has an activity in cancer tissue that is 2 times or more higher than that in normal tissue, preferably 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 10 times or more higher. Is more preferably 100 times or more, particularly preferably 500 times or more, and most preferably 1000 times or more.
  • the cancer tissue-specific protease may be bound to the cell membrane of cancer cells, or may be secreted outside the cell membrane without being bound to the cell membrane. If the cancer tissue-specific protease is not bound to the cell membrane of the cancer cell, the cancer tissue-specific protease is present in or near the cancer tissue in order for the cytotoxicity by immune cells to be specific to the cancer cell. It is preferable that In the present specification, “in the vicinity of cancer tissue” means that the cancer tissue-specific protease cleavage sequence is cleaved and has a range in which the effect of reducing the ligand binding activity is exerted. However, a range that does not damage normal cells as much as possible is preferable.
  • cancer tissue specific proteases are (i) a protease expressed at a higher level in cancer tissue than in normal tissue, (ii) a protease having higher activity in cancer tissue than in normal tissue, (iii) a protease expressed at a higher level in cancer cells than in normal cells; (iv) a protease having higher activity in cancer cells than in normal cells, One of them.
  • One type of cancer tissue-specific protease may be used alone, or two or more types may be combined. The number of types of cancer tissue-specific protease can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the cancer type to be treated.
  • proteases serine protease and metalloprotease are preferable, and matriptase (including MT-SP1), urokinase (uPA) and metalloprotease are more preferable as the cancer tissue-specific protease.
  • MT-SP1 matriptase
  • uPA urokinase
  • MMP2 metalloprotease
  • MMP9 MMP9
  • the inflammatory tissue-specific protease is preferably at least 5 times higher than that in normal tissue, more preferably at least 10 times higher, more preferably at least 100 times higher, more preferably at least 500 times higher. Preferably, it is most preferably 1000 times higher.
  • the inflammatory tissue-specific protease preferably has an activity in the inflamed tissue more than twice as high as that in the normal tissue, preferably 3 times or higher, 4 times higher, 5 times higher, 10 times higher. Is more preferably 100 times or more, particularly preferably 500 times or more, and most preferably 1000 times or more.
  • the inflammatory tissue-specific protease may be bound to the cell membrane of inflammatory cells, or may be secreted outside the cell membrane without being bound to the cell membrane. If the inflammatory tissue-specific protease is not bound to the cell membrane of the inflammatory cell, the inflammatory tissue-specific protease is present in or near the inflammatory tissue in order for the cytotoxicity by the immune cells to be specific to the inflammatory cell. It is preferable that In the present specification, “in the vicinity of the inflamed tissue” means that the inflamed tissue-specific protease cleaving sequence is cleaved and within a range in which the effect of reducing the ligand binding activity is exerted. However, a range that does not damage normal cells as much as possible is preferable.
  • inflammatory tissue-specific proteases are (i) a protease expressed at a higher level in inflamed tissue than in normal tissue; (ii) a protease having higher activity in inflamed tissue than in normal tissue, (iii) a protease expressed at a higher level in inflammatory cells than in normal cells, (iv) a protease having higher activity in inflammatory cells than in normal cells, One of them.
  • One type of inflammatory tissue-specific protease may be used alone, or two or more types may be combined. The number of types of inflammatory tissue-specific protease can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the medical condition to be treated.
  • the inflammatory tissue-specific protease is preferably a metalloprotease among the proteases exemplified above, and among the metalloproteases, ADAMTS5, MMP2, MMP7, MMP9, and MMP13 are more preferable.
  • a protease cleavage sequence is a specific amino acid sequence that is specifically recognized by a target tissue-specific protease when the polypeptide is hydrolyzed by the target tissue-specific protease in aqueous solution.
  • the protease cleavage sequence is more specifically expressed in the target tissue / cell to be treated or is more specifically activated in the target tissue / cell to be treated in terms of reducing side effects
  • An amino acid sequence that is hydrolyzed with high specificity by a protease is preferred.
  • Specific protease cleavage sequences include, for example, proteases that are specifically expressed in the above-described cancer tissues disclosed in International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, etc. And target sequences that are specifically hydrolyzed by inflammatory tissue-specific proteases and the like. Artificially modified sequences such as appropriately introducing amino acid mutations into target sequences that are specifically hydrolyzed by known proteases can also be used.
  • the protease cleavage sequence may be one identified by a method known to those skilled in the art as described in Nature Biotechnology 19, 661-667 (2001). Furthermore, a naturally occurring protease cleavage sequence may be used.
  • a sequence that undergoes protease cleavage in a protein that changes its molecular form by undergoing protease cleavage such as TGF ⁇ that changes to a latent form by undergoing protease cleavage, can also be used.
  • protease cleavage sequences include, but are not limited to, International Publication WO2015 / 116933, International Publication WO2015 / 048329, International Publication WO2016 / 118629, International Publication WO2016 / 179257, International Publication WO2016 / 179285, International Publication WO2016. / 179335, International Publication WO2016 / 179003, International Publication WO2016 / 046778, International Publication WO2016 / 014974, US Patent Publication US2016 / 0289324, United States Patent Publication US2016 / 0311903, PNAS (2000) 97: 7754-7759 ., Biochemical Journal (2010) 426: 219-228., Beilstein J Nanotechnol.
  • the protease cleavage sequence is an amino acid sequence that is specifically hydrolyzed by a suitable target tissue-specific protease, as described above.
  • the amino acid sequences that are specifically hydrolyzed by the target tissue-specific protease the following amino acid sequences are preferred.
  • LSGRSDNH Sequence number: 3, MT-SP1
  • PLGLAG SEQ ID NO: 34
  • MMP9 VPLSLTMG
  • the following sequences can also be used as protease cleavage sequences.
  • TSTSGRSANPRG (Sequence number: 66, MT-SP1, can be cut by uPA)
  • ISSGLLSGRSDNH (Sequence number: 67, MT-SP1, can be cleaved by uPA)
  • AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 68, MT-SP1, can be cleaved by uPA)
  • GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 69, which can be cleaved by MMP1)
  • GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 70, can be cleaved by MMP2)
  • GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 71, can be cleaved by MMP2)
  • GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 72, can be cleaved by MMP2)
  • PLGLWA (SEQ ID NO: 73, can be cleaved by MMP2)
  • GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO
  • a mobile linker is further added to either or both ends of the protease cleavage sequence.
  • the movable linker at one end of the protease cleavage sequence can be referred to as the first movable linker, and the movable linker at the other end can be referred to as the second movable linker.
  • the protease cleavage sequence and the mobile linker comprise one of the following formulas: (Protease cleavage sequence) (First movable linker)-(protease cleavage sequence) (Protease cleavage sequence)-(Second movable linker) (First movable linker)-(protease cleavage sequence)-(second movable linker)
  • the movable linker in this embodiment is preferably a peptide linker.
  • the first movable linker and the second movable linker are each independently and optionally present, and are the same or different movable linkers including at least one flexible amino acid (such as Gly).
  • a sufficient number of residues (Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys such that the protease cleavage sequence provides the desired protease accessibility.
  • Gly, Ser, Asp, Asn, Ala, etc. amino acids, particularly Gly, Ser, Asp, Asn, Ala, especially Gly and Ser, especially Gly, etc.).
  • a movable linker suitable for use at both ends of a protease cleavage sequence is usually one that improves protease access to the protease cleavage sequence and increases protease cleavage efficiency.
  • Suitable mobile linkers are easily selectable, from 1 amino acid (eg Gly) to 20 amino acids, 2 amino acids to 15 amino acids, 4 amino acids to 10 amino acids, 5 amino acids to 9 amino acids, 6 amino acids to 8 amino acids or 7 amino acids From 8 amino acids and 3 amino acids to 12 amino acids and the like, suitable ones from different lengths can be selected.
  • the movable linker is a 1 to 7 amino acid peptide linker.
  • mobile linkers include, but are not limited to, for example, glycine polymer (G) n, glycine-serine polymers (eg, (GS) n, (GSGGS: SEQ ID NO: 45) n and (GGGS: SEQ ID NO: 36).
  • G glycine polymer
  • GSGGS glycine-serine polymers
  • GGGS SEQ ID NO: 36
  • Examples of mobile linkers composed of glycine-serine polymers include, but are not limited to: Ser Gly ⁇ Ser (GS) Ser ⁇ Gly (SG) Gly, Gly, Ser (GGS) Gly, Ser, Gly (GSG) Ser ⁇ Gly ⁇ Gly (SGG) Gly, Ser, Ser (GSS) Ser, Ser, Gly (SSG) Ser, Gly, Ser (SGS) Gly, Gly, Gly, Ser (GGGS, SEQ ID NO: 36) Gly, Gly, Ser, Gly (GGSG, SEQ ID NO: 37) Gly, Ser, Gly, Gly (GSGG, SEQ ID NO: 38) Ser, Gly, Gly, Gly (SGGG, SEQ ID NO: 39) Gly, Ser, Ser, Gly (GSSG, SEQ ID NO: 40) Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (GGGGS, SEQ ID NO: 41) Gly, Gly, Gly, Gly, Ser, Gly (GG
  • the ligand binding molecule comprises antibody VH and antibody VL.
  • ligand binding molecules comprising VH and VL include, but are not limited to, Fv, scFv, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2, complete antibodies, and the like.
  • the ligand binding molecule comprises an Fc region.
  • the type is not limited, and Fc regions such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 can be used.
  • Fc regions such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 can be used.
  • the ligand binding molecule comprises an antibody constant region.
  • the ligand binding molecule is an antibody.
  • binding to the ligand is achieved by the variable region.
  • the ligand binding molecule is an IgG antibody.
  • the type thereof is not limited, and IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc. can be used. Even when an IgG antibody is used as a ligand-binding molecule, the binding to the ligand is realized by the variable region, and the binding to the ligand can be realized by one or both of the two variable regions of the IgG antibody.
  • cleavage of the cleavage site / protease cleavage sequence in the ligand binding molecule disrupts the domain having ligand binding activity in the ligand binding molecule and attenuates binding to the ligand.
  • an IgG antibody is used as a ligand-binding molecule
  • a cleavage site / protease cleavage sequence is provided in the antibody variable region, and in the cleaved state, a complete antibody variable region cannot be formed, and binding to the ligand is attenuated.
  • association in the present specification can be translated into, for example, a state in which two or more polypeptide regions interact.
  • a hydrophobic bond, a hydrogen bond, an ionic bond, etc. are formed between polypeptide regions of interest to form an aggregate.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • VH and VL contained in the ligand binding molecule are associated.
  • the association between antibody VH and antibody VL can be eliminated by, for example, cleavage of the cleavage site / protease cleavage sequence.
  • the cancellation of the association can be said in other words that all or a part of the interaction state of two or more polypeptide regions is canceled.
  • the cancellation of the association between VH and VL may eliminate all of the interaction between VH and VL, or may cancel a part of the interaction between VH and VL.
  • the association between the antibody VL or a part thereof and the antibody VH or a part thereof in the ligand-binding molecule is eliminated by cleaving the cleavage site, or the protease cleavage sequence is a protease.
  • Ligand-binding molecules that are eliminated by being cleaved at are included.
  • the ligand binding molecule comprises antibody VH and antibody VL, and in the state where the cleavage site / protease cleavage sequence of the ligand binding molecule is not cleaved, antibody VH and antibody VL in the ligand binding molecule. And the cleavage of the cleavage site / protease cleavage sequence eliminates the association of antibody VH and antibody VL in the ligand binding molecule.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence in the ligand binding molecule may be located at any position in the ligand binding molecule as long as it can be cleaved to attenuate the binding of the ligand binding molecule to the ligand.
  • the ligand binding molecule comprises antibody VH, antibody VL, and antibody constant region.
  • Antibody VH and VL, CH and CL are linked via many amino acid side chains between domains as described by Rothlisberger et al. (J Mol Biol. 2005 Apr 8; 347 (4): 773-89.). It is known to interact. Although it is known that VH-CH1 and VL-CL can form a stable structure as a Fab domain, the amino acid side chain between VH and VL is generally 10 -5 as reported. It is considered that the rate of formation of an association state is small when the VH domain and the VL domain exist only when they interact with dissociation constants ranging from M to 10 ⁇ 8 M.
  • the ligand binding molecule comprising antibody VH and antibody VL is provided with a cleavage site / protease cleavage sequence, and prior to cleavage, all heavy chain-light chain interactions are duplicated in the Fab structure. Interaction between a peptide containing VH (or part of VH) and a peptide containing VL (or part of VL) when the cleavage site / protease cleavage sequence is cleaved, whereas it exists between two peptides A ligand-binding molecule was designed that attenuated and eliminated the association of VH and VL.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is located within the antibody constant region.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is located on the variable region side of the antibody heavy chain constant region at position 140 (EU numbering), preferably at position 122 (EU numbering) in the antibody heavy chain constant region. ) Located on the variable region side from the amino acid.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is any position in the sequence from antibody heavy chain constant region amino acid 118 (EU numbering) to antibody heavy chain constant region amino acid 140 (EU numbering). Inserted into.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is variable region side, preferably antibody light chain constant, from amino acid number 130 (EU numbering) (Kabat numbering number 130) in the antibody light chain constant region.
  • EU numbering amino acid number 130
  • No. 113 (EU numbering) Kabat numbering No. 113) in the region is located on the variable region side
  • No. 112 EU numbering
  • Kabat No. 112 EU numbering
  • the cleavage site / protease cleavage sequence ranges from antibody light chain constant region amino acid 108 (EU numbering) (Kabat numbering 108) to antibody light chain constant region amino acid 131 (EU numbering) (Kabat). Inserted at any position in the sequence up to numbering 131)
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is located in antibody VH or antibody VL.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is the antibody constant region side of antibody VH from the 7th (Kabat numbering) amino acid, preferably the antibody constant region side of antibody VH from the 40th (Kabat numbering) amino acid, More preferably, antibody VH from antibody 101 (Kabat numbering) amino acid to the antibody constant region side, more preferably antibody VH from antibody 109 (Kabat numbering) amino acid to the antibody constant region side, antibody VH antibody number 111 (Kabat numbering) ) Located on the antibody constant region side from the amino acid.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is the antibody constant region side from the 7th (Kabat numbering) amino acid of antibody VL, preferably the antibody constant region side from the 39th (Kabat numbering) amino acid of antibody VL, More preferably, the antibody constant region side from the 96th (Kabat numbering) amino acid of antibody VL, more preferably the antibody constant region side from the 104th (Kabat numbering) amino acid of antibody VL, and the 105th (Kabat numbering) amino acid of antibody VL. It is located on the antibody constant region side.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is inserted at a residue in the antibody VH or antibody VL that forms a loop structure and a residue close to the loop structure.
  • the loop structure in antibody VH or antibody VL refers to a part of antibody VH or antibody VL that does not form secondary structures such as ⁇ -helix and ⁇ -seed.
  • the positions of the residues forming the loop structure and the residues close to the loop structure are specifically: antibody VH from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 16 (Kabat numbering), from amino acid 40 (Kabat numbering) From amino acid 47 (Kabat numbering), amino acid 55 (Kabat numbering) to amino acid 69 (Kabat numbering), amino acid 73 (Kabat numbering) to amino acid 79 (Kabat numbering), amino acid 83 (Kabat numbering) To amino acid No. 89 (Kabat numbering), amino acid No. 95 (Kabat numbering) to amino acid No. 99 (Kabat numbering), amino acid No. 101 (Kabat numbering) to amino acid No.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence comprises antibody VH from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 16 (Kabat numbering), amino acid 40 (Kabat numbering) to amino acid 47 (Kabat).
  • the cleavage site / protease cleavage sequence comprises antibody VL from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 19 (Kabat numbering), amino acid 39 (Kabat numbering) to amino acid 46 (Kabat).
  • the amino acid is inserted at any position in the sequence from amino acid 49 (Kabat numbering) to amino acid 62 (Kabat numbering), amino acid 96 (Kabat numbering) to amino acid 107 (Kabat numbering).
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is located near the boundary between antibody VH and antibody constant region.
  • the vicinity of the boundary between antibody VH and antibody heavy chain constant region can refer to the region between the amino acid of antibody VH from antibody number 101 (Kabat numbering) to the amino acid of antibody heavy chain constant region number 140 (EU numbering), preferably antibody It can refer to between the amino acid of the 109th (Kabat numbering) amino acid of the VH to the amino acid of the antibody heavy chain constant region 122 (EU numbering), or from the amino acid of the 111th antibody (Kabat numbering) of the antibody VH to the antibody heavy chain constant region. It can refer to between the amino acids of No. 122 (EU numbering).
  • the vicinity of the boundary between the antibody VH and the antibody light chain constant region is the amino acid number 101 (Kabat numbering) of the antibody VH to the antibody light chain constant region 130.
  • EU numbering Kabat numbering No. 130
  • EU numbering preferably from the amino acid No. 109 (Kabat numbering) of antibody VH to antibody light chain constant region 113 (EU numbering) (Kabat numbering No. 113)
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is located near the boundary between antibody VL and antibody constant region.
  • the vicinity of the boundary between antibody VL and antibody light chain constant region refers to the region between the amino acid of antibody VL from the 96th (Kabat numbering) amino acid to antibody light chain constant region 130 (EU numbering) (Kabat numbering 130).
  • it can refer to the region between the amino acid of antibody No. 104 (Kabat numbering) of the antibody VL and the amino acid of the antibody light chain constant region No. 113 (EU numbering) (Kabat numbering No. 113), or No. 105 of the antibody VL.
  • a plurality of cleavage sites / protease cleavage sequences can be provided in the ligand molecule, for example, within antibody constant region, within antibody VH, within antibody VL, near the boundary between antibody VH and antibody constant region, antibody VL and antibody constant region It can be provided at a plurality of locations selected from the vicinity of the boundary. Further, those skilled in the art who have touched the present invention can change the shape of the molecule including the antibody VH, the antibody VL, and the antibody constant region by exchanging the antibody VH and the antibody VL. It does not depart from the scope of the invention.
  • ligand is a molecule having biological activity. Molecules with biological activity usually function by interacting with cell surface receptors, thereby biologically stimulating, inhibiting, or otherwise modulating, which normally carry said receptors It appears to be involved in intracellular signaling pathways.
  • a ligand includes a desired molecule that exhibits biological activity by interacting with a biomolecule.
  • a ligand means not only a molecule that interacts with a receptor, but also a molecule that exerts biological activity by interacting with the molecule.
  • a receptor that interacts with the molecule Binding fragments and the like are also included in the ligand.
  • a ligand including a ligand binding site of a protein known as a receptor or a site where the receptor interacts with other molecules is included in the ligand in the present invention.
  • soluble receptors, soluble fragments of receptors, extracellular domains of transmembrane receptors, polypeptides containing them, and the like are included in the ligand in the present invention.
  • the ligands of the present invention can typically exhibit desirable biological activity by binding to one or more binding partners.
  • the binding partner of the ligand can be an extracellular, intracellular, or transmembrane protein.
  • the binding partner of the ligand is an extracellular protein, such as a soluble receptor.
  • the ligand binding partner is a membrane-bound receptor.
  • the ligand of the present invention has 10 ⁇ M, 1 ⁇ M, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, It can specifically bind with a dissociation constant (KD) of 0.5 pM or less than 0.1 pM.
  • KD dissociation constant
  • molecules having biological activity include, but are not limited to, cytokines, chemokines, polypeptide hormones, growth factors, apoptosis inducers, PAMPs, DAMPs, nucleic acids, or fragments thereof.
  • interleukins, interferons, hematopoietic factors, TNF superfamily, chemokines, cell growth factors, TGF- ⁇ family, myokines, adipokines, or neurotrophic factors can be used as ligands.
  • the ligand is CXCL10, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN-g, MIG I-TAC, RANTES, MIP-1a, or MIP-1b can be used.
  • Chemokines are a family of homogeneous serum proteins between 7-16 kDa and were originally characterized by their ability to induce leukocyte migration. Most chemokines have four characteristic cysteines (Cys) and are classified into CXC, or alpha, CC or beta, C or gamma, and CX3C or delta chemokine classes, depending on the motif represented by the first two cysteines Has been. Two disulfide bonds are formed between the first and third cysteines and between the second and fourth cysteines.
  • CXC or alpha subfamily has been classified into two groups: ELR-CXC chemokines and non-ELR-CXC chemokines by the presence of the ELR motif (Glu-Leu-Arg) preceding the first cysteine (eg, Clark-Lewis, supra, and Belperio et al., “CXC Chemokines in Angiogenesis,” J. Leukoc. Biol. 68: 1-8, 2000).
  • Interferon-inducible protein-10 (IP-10 or CXCL10) is induced by interferon- ⁇ and TNF- ⁇ and produced by keratinocytes, endothelial cells, fibroblasts and monocytes. IP-10 is thought to play a role in the recruitment of activated T cells to sites of tissue inflammation (Dufour, et al., “IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10) -deficient mice) reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking (IFN ⁇ -inducible protein-10 (IP-10: CXCL10) -deficient mice reveal the role of IP-10 in the generation and transport of effector T cells ), "J Immunol., 168: 3195-204, 2002).
  • IP-10 may have a role in hypersensitivity reactions. It may also play a role in the development of inflammatory demyelinating neuropathies (Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10) Chemokines and chemokine receptors in neuropathy: the central role of IP-10), "Brain 125: 823-34, 2002).
  • IP-10 can be used for transplantation of stem cells following transplantation (Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72: 408-11, 2000), stem cell mobilization (Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10: 229-36, 2001; Hattori et al., Blood 97: 3354-59, 2001) and enhanced anti-tumor immunity (Nomura et al., Int. J. Cancer 91: 597-606, 2001; Mach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12: 571-75, 2000).
  • chemokines is discussed (Bruce, L.
  • CXCL10 Biological activities of CXCL10 include, for example, binding to the CXCL10 receptor (CXCR3), CXCL10-induced calcium flux, CXCL10-induced cell chemotaxis, CXCL10 binding to glycosaminoglycans and CXCL10 oligomerization.
  • Methods for measuring CXCL10 physiological activity include methods for measuring cell migration activity of CXCL10, Reporter assay using CXCR3 stably expressing cell line (see PLoS One. 2010 Sep 13; 5 (9): e12700.), GPCR signal Examples include PathHunter TM ⁇ -Arrestin recruitment assay using B-Arrestin recruitment induced in the early stage of transmission.
  • Interleukin 12 is a heterodimeric cytokine composed of 30 and 40 kD glycosylated polypeptide chains that are disulfide bonded. Cytokines are synthesized and secreted by antigen-presenting cells including dendritic cells, monocytes, macrophages, B cells, Langerhans cells and keratinocytes, and natural killer (NK) cells. IL-12 mediates various biological processes and is referred to as the NK cell stimulating factor (NKSF), T cell stimulating factor, cytotoxic T lymphocyte maturation factor and EBV-transformed B cell line factor. I came.
  • NKSF NK cell stimulating factor
  • T cell stimulating factor T cell stimulating factor
  • cytotoxic T lymphocyte maturation factor cytotoxic T lymphocyte maturation factor
  • EBV-transformed B cell line factor EBV-transformed B cell line factor
  • Interleukin 12 can bind to IL-12 receptors expressed on the cytoplasmic membrane of cells (eg, T cells, NK cells), thereby altering (eg, initiating, blocking) biological processes.
  • IL-12 binding to the IL-12 receptor stimulates proliferation of preactivated T cells and NK cells, and cytotoxic T cells (CTL), NK cells and LAK (lymphokine activation Killer) enhances cytolytic activity of cells, induces the production of ⁇ interferon (IFN ⁇ ) by T cells and NK cells, and of naive Th0 cells (Nive Th0 cell) to Th1 cells producing IFN ⁇ and IL-2 Induces differentiation.
  • CTL cytotoxic T cells
  • NK cells and LAK lymphokine activation Killer
  • IL-12 is absolutely necessary for generating cytolytic cells (eg NK, CTL) and setting cellular immune responses (eg Th1 cell mediated immune responses).
  • cytolytic cells eg NK, CTL
  • cellular immune responses eg Th1 cell mediated immune responses.
  • IL-12 is absolutely important in the generation and regulation of both prophylactic immunity (eg, eradication of infection) and pathological immune responses (eg, autoimmunity).
  • Methods of measuring IL12 physiological activity include measurement of IL12 cell proliferation activity, STAT4 reporter assay, cell activation by IL12 (cell surface marker expression, cytokine production, etc.), and method of measuring cell differentiation promotion by IL12, etc. Can be mentioned.
  • the protein Programmed Death 1 is an inhibitory member of the CD28 family receptor, and the CD28 family also includes CD28, CTLA-4, ICOS and BTLA.
  • PD-1 is expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells (Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82, Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8).
  • the first members of the family, CD28 and ICOS were discovered by functional effects on elevated T cell proliferation following addition of monoclonal antibodies (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266, Hansen et al. (1980) Immunogenics. 10: 247-260).
  • PD-1 was discovered by screening for differential expression in apoptotic cells (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11: 3887-95).
  • Other members of the family, CTLA-4 and BTLA were discovered by screening for differential expression in cytotoxic T lymphocytes and TH1 cells, respectively.
  • CD28, ICOS and CTLA-4 all have unpaired cysteine residues, which allow homodimerization.
  • PD-1 is thought to exist as a monomer and does not have the unpaired cysteine characteristic of other CD28 family members.
  • PD-1 gene is a 55 kDa type I transmembrane protein that is part of the Ig gene superfamily.
  • PD-1 contains a membrane proximal immune receptor tyrosine inhibition motif (ITIM) and a membrane tyrosine-based switch motif (ITSM).
  • ITIM membrane proximal immune receptor tyrosine inhibition motif
  • ITMS membrane tyrosine-based switch motif
  • PD-1 is structurally similar to CTLA-4 but lacks the MYPPPY motif (SEQ ID NO: 537) that is important for B7-1 and B7-2 binding.
  • Two ligands for PD-1, PD-L1 and PD-L2 have been identified and have been shown to negatively regulate T cell activation when bound to PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34, Latchman et al.
  • Both PD-L1 and PD-L2 are B7 homologs that bind to PD-1 but not to other CD28 family members.
  • PD-L1 a ligand of PD-1
  • the interaction of PD-1 and PD-L1 results in a decrease in tumor infiltrating lymphocytes, a decrease in T cell receptor-mediated proliferation, and immune evasion by cancerous cells (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7, Blank et al.
  • PD-1 is an inhibitory member of the CD28 family expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells.
  • PD-1-deficient animals develop various autoimmune phenotypes including autoimmune cardiomyopathy and lupus-like syndrome with arthritis and nephritis (Nishimura et al. (1999) Immunity 11: 141-51, Nishimura et al. (2001). ) Science 291: 319-22).
  • PD-1 has been found to play an important role in autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus lupus erythematosus, graft-versus-host disease (GVHD), type I diabetes and rheumatoid arthritis (Salama et al.
  • the ligand is a cytokine.
  • Cytokines are a family of secretory cell signaling proteins involved in immunoregulatory and inflammatory processes, which are secreted by glial cells of the nervous system and by many cells of the immune system. Cytokines can be classified as proteins, peptides or glycoproteins and encompass a large and diverse family of regulators. Cytokines bind to cell surface receptors and induce intracellular signal transduction, which can lead to regulation of enzyme activity, up- or down-regulation of several genes and their transcription factors, or feedback inhibition.
  • the cytokines of the invention include immunomodulators such as interleukin (IL) and interferon (IFN).
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • Suitable cytokines can include proteins from one or more of the following types: four ⁇ -helix bundle families (including the IL-2 subfamily, the IFN subfamily, and the IL-10 subfamily); IL-1 family (which includes IL-1 and IL-8), and IL-17 family.
  • Cytokines are type 1 cytokines that enhance cellular immune responses (e.g., IFN- ⁇ , TGF- ⁇ , etc.) or type 2 cytokines that favor antibody responses (e.g., IL-4, IL-10, IL-13, etc.) ) Can also be included.
  • the ligand is a chemokine.
  • Chemokines generally act as chemoattractants that recruit immune effector cells to chemokine expression sites. This is considered beneficial for the expression of specific chemokine genes, for example, with cytokine genes, for the purpose of mobilizing other immune system components to the treatment site.
  • chemokines include CXCL10, RANTES, MCAF, MIP1- ⁇ , MIP1- ⁇ .
  • cytokines are also known to have chemoattractant effects and can be classified by the term chemokine.
  • a variant such as cytokine, chemokine (eg, AnnuAnRev Immunol. 2015; 33: 139-67.) Or a fusion protein (eg, Stem Cells Transl Med) as a ligand in some embodiments of the present invention. . 2015 Jan; 4 (1): 66-73.) Can be used.
  • cytokine eg, AnnuAnRev Immunol. 2015; 33: 139-67.
  • a fusion protein eg, Stem Cells Transl Med
  • the ligand is selected from CXCL10, PD1, IL12, IL6R.
  • the CXCL10, PD1, IL12, and IL6R may have the same sequence as the naturally occurring CXCL10, PD1, IL12, and IL6R, and correspond to the naturally occurring CXCL10, PD1, IL12, and IL6R, although the sequences are different. It may be a variant having a physiological activity having a natural ligand.
  • a ligand sequence may be artificially added for various purposes.
  • a modified version of the ligand is obtained by applying a modification that does not undergo protease cleavage (protease resistance). .
  • the ligand binds to an uncleaved ligand binding molecule to inhibit its biological activity.
  • the biological activity of the ligand is inhibited include, but are not limited to, for example, binding of an uncleaved ligand binding molecule to a ligand substantially or significantly interferes or competes with the binding of the ligand to its binding partner. The embodiment which does is mentioned.
  • an antibody having a ligand neutralizing activity or a fragment thereof is used as the ligand binding molecule, the ligand binding molecule bound to the ligand exerts its neutralizing activity, whereby the biological activity of the ligand can be inhibited.
  • the uncleaved ligand-binding molecule can sufficiently neutralize the biological activity of the ligand by binding to the ligand. That is, it is preferred that the biological activity of the ligand bound to the uncleaved ligand binding molecule is lower than the biological activity of the ligand not bound to the uncleaved ligand binding molecule.
  • the biological activity of a ligand bound to an uncleaved ligand binding molecule is 90% less than the biological activity of a ligand not bound to an uncleaved ligand binding molecule.
  • the binding activity of the cleaved ligand-binding molecule to the ligand is lower than the binding activity of the natural binding partner to the ligand (for example, a natural receptor for the ligand) to the ligand.
  • the binding activity between a cleaved ligand-binding molecule and a ligand is 90% or less compared to the amount of binding between a natural binding partner and a ligand in vivo (per unit binding partner).
  • binding amount is 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • a binding activity index a desired index may be appropriately used.
  • a dissociation constant (KD) may be used.
  • the dissociation constant (KD) of the cleaved ligand-binding molecule relative to the ligand of the natural binding partner in vivo is compared with the dissociation constant (KD) of the natural binding partner.
  • a large value indicates that the binding activity of the cleaved ligand-binding molecule to the ligand is weak compared to the natural binding partner in vivo.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the cleaved ligand binding molecule is, for example, 1.1 times or more, preferably 1.5 times or more, compared to the dissociation constant (KD) for the natural binding partner ligand in vivo.
  • ligand-binding molecule after cleavage has low binding activity to the ligand or has almost no binding activity to the ligand, thereby ensuring that the ligand-binding molecule is released after cleavage; It can be expected to prevent rebinding with another ligand molecule.
  • the biological activity of the suppressed ligand is restored after the ligand binding molecule is cleaved.
  • the binding of the cleaved ligand binding molecule to the ligand is attenuated, so that the ligand biological activity inhibiting function of the ligand binding molecule is also attenuated.
  • One skilled in the art can confirm the biological activity of the ligand by known methods, for example, by detecting the binding between the ligand and its binding partner.
  • the uncut ligand binding molecule forms a complex with the ligand by antigen-antibody binding.
  • the complex of ligand binding molecule and ligand is formed by non-covalent binding, eg, antigen-antibody binding, between the ligand binding molecule and the ligand.
  • the uncleaved ligand binding molecule is fused with a ligand to form a fusion protein, and the ligand binding molecule portion and ligand portion in the fusion protein further interact by antigen-antibody binding. is doing.
  • the ligand binding molecule and the ligand can be fused via a linker or not. Even when the ligand binding molecule and the ligand in the fusion protein are fused through or without a linker, there is still a non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion.
  • the non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion is similar to embodiments where the ligand binding molecule and ligand are not fused. Cleavage of the ligand-binding molecule reduces its non-covalent bond. That is, the binding between the ligand binding molecule and the ligand is attenuated.
  • the ligand binding molecule and the ligand are fused via a linker.
  • linker used when fusing a ligand-binding molecule and a ligand it is disclosed in any peptide linker that can be introduced by genetic engineering or a synthetic compound linker (see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996). However, in this embodiment, a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene Glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), bis [2- (succinimideoxycarbonyloxy ) Ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition (drug) comprising the ligand binding molecule of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, and a pharmaceutical composition comprising the ligand binding molecule of the present invention, a ligand and a pharmaceutically acceptable carrier ( Drug), a pharmaceutical composition (drug) comprising a fusion protein in which the ligand binding molecule of the present invention and a ligand are fused and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • treatment is clinical that is intended to alter the natural course of the individual being treated. Means intervention and can be carried out either for prevention or during the course of clinical pathology. Desirable effects of treatment include but are not limited to prevention of disease occurrence or recurrence, reduction of symptoms, attenuation of any direct or indirect pathological effects of disease, prevention of metastasis, progression of disease Includes reduced speed, recovery or alleviation of disease state, and remission or improved prognosis.
  • the ligand binding molecules of the invention can control the biological activity of the ligand and are used to delay the onset of the disease or slow the progression of the disease.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the term “pharmaceutical composition containing a ligand-binding molecule” can be rephrased as “a method for treating a disease comprising administering a ligand-binding molecule to a treatment subject”. In other words, the use of a ligand binding molecule in the manufacture of a medicament for the treatment of ".
  • pharmaceutical composition comprising a ligand binding molecule can also be restated as “use of a ligand binding molecule to treat a disease”.
  • composition comprising a ligand-binding molecule and a ligand
  • a method of treating a disease comprising administering a ligand-binding molecule and a ligand to a subject to be treated” or “treating a disease”
  • pharmaceutical composition comprising a ligand binding molecule and a ligand can also be rephrased as “use of a ligand binding molecule and a ligand to treat a disease”.
  • composition comprising a fusion protein can be rephrased as “a method for treating a disease comprising administering a fusion protein to a subject to be treated”, or “manufacturing a medicament for treating a disease”. In other words, “use of fusion protein in”.
  • pharmaceutical composition comprising a fusion protein can also be rephrased as “use of a fusion protein to treat a disease”.
  • a composition comprising a ligand binding molecule can be administered to an individual.
  • the ligand-binding molecule administered to an individual binds to the ligand originally present in the individual in the individual, for example, in blood or tissue, and is further transported in vivo while being bound to the ligand.
  • the ligand-binding molecule delivered to the target tissue is cleaved by the target tissue, the binding to the ligand is attenuated, and the ligand bound in the target tissue can be released.
  • the released ligand exerts biological activity in the target tissue and can treat a disease caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically in the target tissue, without exerting the biological activity of the ligand during transport, Only after being cleaved at the target tissue, the biological activity of the ligand can be exerted to treat the disease, and systemic side effects can be suppressed.
  • a composition comprising a ligand binding molecule and a composition comprising a ligand can be administered to an individual separately or simultaneously.
  • a composition comprising both a ligand binding molecule and a ligand can also be administered to an individual.
  • the ligand binding molecule and the ligand in the composition may form a complex.
  • the ligand binding molecule binds to the ligand administered to the individual and is transported in vivo with the ligand bound.
  • the ligand-binding molecule delivered to the target tissue is cleaved by the target tissue, the binding to the ligand is attenuated, and the ligand bound in the target tissue can be released.
  • the released ligand exerts biological activity in the target tissue and can treat a disease caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically in the target tissue, without exerting the biological activity of the ligand during transport, Only after being cleaved at the target tissue, the biological activity of the ligand can be exerted to treat the disease, and systemic side effects can be suppressed.
  • a ligand-binding molecule administered to an individual can also bind to a ligand that is originally present in the individual in addition to the ligand that is administered to the individual. It can be transported in vivo while bound.
  • a fusion protein in which a ligand binding molecule and a ligand are fused can be administered to an individual.
  • the ligand binding molecule and the ligand in the fusion protein form a fusion protein with or without a linker, but the non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion is still Exists.
  • Non-covalent binding to is attenuated and the ligand and a portion of the ligand binding molecule are released from the fusion protein.
  • Some of the released ligands and ligand-binding molecules exert the biological activity of the ligand in the target tissue and can treat diseases caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically to the target tissue, the biological activity of the ligand in the fusion protein during delivery is exerted. Without the treatment, the biological activity of the ligand can be exhibited only after being cleaved by the target tissue, the disease can be treated, and systemic side effects can be suppressed.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated using methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or in the form of suspension injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative Or in combination with binders and the like as appropriate, and can be formulated by mixing in unit dosage forms generally required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is set so as to obtain an appropriate volume within the indicated range.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • a vehicle such as distilled water for injection.
  • the aqueous solution for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • Appropriate solubilizers such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) can be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol can be used in combination as a solubilizing agent. It can also be formulated with buffers (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (eg, procaine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), and antioxidants.
  • buffers eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, procaine hydrochloride
  • stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidants antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • parenteral administration for example, an injection, nasal administration, pulmonary administration, or transdermal administration composition is administered.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the ligand binding molecule can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per time. Alternatively, for example, a dose of 0.001 to 100000 mg per patient can be set, but the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can set an appropriate dose and administration method in consideration of these conditions.
  • the present invention also relates to a method for producing a ligand-binding molecule in which binding to a ligand is attenuated in a cleaved state, or a fusion protein in which the ligand-binding molecule and a ligand are fused.
  • a method for producing a ligand binding molecule or fusion protein comprising introducing a protease cleavage sequence into a molecule capable of binding to a ligand.
  • Examples of methods for introducing a protease cleavage sequence into a molecule that can bind to a ligand include a method of inserting a protease cleavage sequence into the amino acid sequence of a polypeptide that can bind to a ligand, and an amino acid sequence of a polypeptide that can bind to a ligand. And a method in which a part of is replaced with a protease cleavage sequence.
  • An example of a method for obtaining a molecule capable of binding to a ligand is a method for obtaining a ligand binding region having the ability to bind to a ligand.
  • the ligand binding region can be obtained, for example, by a method using a known antibody production method.
  • the antibody obtained by the production method may be used as it is in the ligand binding region, or only the Fv region may be used in the obtained antibody, and the Fv region is a single chain (also referred to as “sc”). In the case where the antigen can be recognized in the above, only the single chain may be used. Further, a Fab region including an Fv region may be used.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies.
  • non-human animals for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known.
  • General genetic recombination techniques for obtaining humanized antibodies are also known.
  • Overlap-Extension-PCR is known as a method for transplanting mouse antibody CDRs into human FRs.
  • FR amino acid residues can be substituted so that the CDR of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • Transgenic animals having all repertoires of human antibody genes are used as immunized animals, and a desired human antibody can be obtained by DNA immunization.
  • the Fv region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (also referred to as “scFv”) on the surface of the phage by the phage display method. Phages expressing scFv that bind to the antigen can be selected. By analyzing the gene of the selected phage, the DNA sequence encoding the Fv region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • scFv single chain antibody
  • the Fv region sequence is fused in-frame with the sequence of the desired human antibody C region, and then inserted into an appropriate expression vector, whereby an expression vector can be prepared.
  • the human antibody is obtained by introducing the expression vector into a suitable expression cell as described above and expressing the gene encoding the human antibody.
  • a molecule in which a protease cleavage sequence is introduced into a molecule that can bind to a ligand becomes the ligand-binding molecule of the present invention.
  • the ligand binding molecules are cleaved by treatment with the protease corresponding to the protease cleavage sequence. For example, whether the protease cleavage sequence was cleaved by contacting a molecule with a protease cleavage sequence introduced into a molecule capable of binding to the ligand with protease and confirming the molecular weight of the product after protease treatment by SDS-PAGE or other electrophoresis. You can check whether or not.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding a ligand-binding molecule whose binding to a ligand is attenuated in a cleaved state, or a polynucleotide encoding a fusion protein in which the ligand-binding molecule and a ligand are fused.
  • the polynucleotide in the present invention is usually carried (inserted) in an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted nucleic acid.
  • the cloning vector is preferably a pBluescript vector (Stratagene), but is commercially available.
  • Various vectors can be used.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the ligand-binding molecule or fusion protein of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a ligand-binding molecule in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • a pBEST vector manufactured by Promega
  • pET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GeneBank Accession No. AB009864
  • organisms pME18S vector (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)) Etc.
  • the DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current ⁇ ⁇ ⁇ protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section IV 11.4-11.11.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing a ligand-binding molecule or fusion protein include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells ( Examples: Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insect cells Examples: Drosophila S2, Spodoptera SF9
  • animal cells eg, CHO, COS, He
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9), lipofectamine method (GIBCO -BRL) and a known method such as a microinjection method.
  • an appropriate secretion signal is incorporated into the ligand binding molecule or fusion protein of interest. be able to. These signals may be endogenous to the ligand binding molecule or fusion protein of interest or may be heterologous signals.
  • the ligand-binding molecule or the fusion protein is collected when the polypeptide of the present invention is secreted into the medium.
  • the ligand-binding molecule or fusion protein of the present invention is produced in a cell, the cell is first lysed, and then the ligand-binding molecule or fusion protein is recovered.
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Known methods including affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography can be used.
  • Example 1 Issues of previously reported immunocytokines and protease-activated cytokines Immunocytokines targeting antigens expressed in cancer tissues have generally been prepared by fusing target cytokines to the ends of IgG or scFv to be targeted (Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul; 18 (7): 991-1000., Curr Opin Immunol. 2016 Jun; 40: 96-102.). Since cytokines such as IL2, IL12, and TNF are highly toxic, it is expected that these cytokines are delivered to the cancer locally by antibodies in order to make these cytokines work locally, reducing side effects and enhancing the effect.
  • Non-patent Documents 4, 5, and 6 all of these have problems in that they are not clinically effective when administered systemically, the therapeutic window is narrow, toxicity is high, and systemic administration is not possible.
  • the systemically administered cytokine is exposed to the whole body, so it can act systemically and exert toxicity, or it can be administered only at a very low dose to avoid toxicity, Can be mentioned.
  • the immunocytokine that binds to the cancer antigen is internalized by the cancer cells in the tumor and disappears, it may be difficult to expose the cytokine locally to the tumor in some cases.
  • Non-patent Document 7 There is also a report that the anti-tumor effect did not change between an immunocytokine in which IL2 is fused to an antibody that binds to a cancer antigen and an immunocytokine in which IL2 is fused to an antibody that does not bind to a cancer antigen.
  • Non-patent Document 8 molecules that bind TNFalpha and TNFR with a linker that can be cleaved with uPA
  • Non-patent Document 9 molecules that bind IL2 and IL2R with a linker that can be cleaved with MMP2
  • cytokines have biological activity even before the cleavage of the linker, and the activity is improved only about 10 times by the cleavage of the linker.
  • a molecule (non-patent document 9) in which anti-IL2 scFv is bound to IL2 via a linker cleaved by MMP-2 instead of IL2R has been reported.
  • IL2 affinity can be obtained by considering that IL2 is released upon linker cleavage. It is natural to use anti-IL2 scFv, which is not strong.
  • protease-activated cytokines do not have an Fc region, and are therefore expected to have a short half-life, making it difficult to maintain high exposure. There is no significant difference in the pharmacokinetics of cytokines before and after being activated by protease cleavage (both have a short half-life), making it difficult to widen the therapeutic window.
  • Chemokine (Nature Immunology 9, 949-952 (2008)) is a basic protein that expresses its action through a G protein-coupled receptor, and is a group of cytokines. It is. Acts on specific leukocytes expressing the receptor and has the activity (chemotaxis) to migrate leukocytes in the direction of the concentration gradient of the substance (Nat Cell Biol. 2016 Jan; 18 (1): 43-53.) . It is known that chemokines are produced in large quantities in the inflamed part and cause leukocyte migration from inside the blood vessels into the inflamed tissues. By controlling chemokines, leukocyte migration can be controlled, and it can be used for cancer immunotherapy.
  • T cells, antigen-presenting cells, M1 macrophages, and the like can be migrated locally in a solid cancer, it is considered possible to cause an antitumor effect.
  • Cytokines can exert their effects even when administered systemically, but chemokines cause cells to migrate to tissues with a high concentration due to a concentration gradient, so that even if chemokines are administered systemically, the expected effect cannot be obtained. Therefore, it is considered that cancer immunotherapy (chemokine therapy) by systemic administration of chemokine is not realistic.
  • Example 3 Concept of a ligand-binding molecule capable of releasing a target tissue-specific ligand into which a protease cleavage sequence has been introduced
  • the known cytokine / chemokine therapy has the following problems. 1. In immunocytokines, even if cytokines are targeted to solid tumors with antibodies, cytokines act systemically, resulting in side effects, or they can only be administered at low doses to avoid side effects, resulting in high exposure in the tumor I can't. 2.
  • Cytokines activated by proteases that link cytokine receptors (or antibodies) and cytokines with linkers that can be cleaved by proteases are not sufficiently neutralized, and cytokines have some activity even before protease cleavage. . 3.
  • cytokine receptors (or antibodies) can bind to cytokines, thus inhibiting the biological activity of cytokines. 4).
  • the half-life of inactive cytokines is short and the residence time in blood is short, so that a large dose is required.
  • ligands such as cytokines or chemokines are sufficiently inhibited by ligand-binding molecules (biological activity is minimized) 2. Biological activity of the ligand is restored by cleavage with protease (acts as an active ligand) 3. 3. Ligand binding molecule loses ligand binding activity due to cleavage by protease. Ligand that is activated by protease cleavage has a shorter half-life compared to ligand bound to the ligand binding molecule prior to cleavage by protease.
  • a ligand-binding molecule can be prepared by obtaining a binding molecule for the ligand and then inserting a cleavage site into the binding molecule.
  • FIGS. 1, 2, and 3 show examples of molecules using an antibody as a molecule that binds to a ligand.
  • a neutralizing antibody against the ligand is obtained.
  • a protease cleavage sequence is inserted in the vicinity of the boundary between the variable region (VH or VL) and the constant region (CH1 or CL) of the anti-ligand neutralizing antibody. It is confirmed that the anti-ligand antibody retains the ligand binding activity even after the protease cleavage sequence is inserted.
  • the ligand-antiligand antibody fusion has an Fc region and thus has a long half-life. Have.
  • the systemically administered ligand-antiligand antibody fusion releases the ligand-linker-antiligand antibody VH molecule when the protease cleavage sequence near the boundary between VH and CH1 is cleaved by a protease highly expressed in tumor tissue. . Since VH or VL alone cannot bind to the ligand (both VH and VL are required to bind to the ligand), neutralization of the ligand is released and biological effects can be exerted in the tumor tissue. It is.
  • the released ligand-linker-antiligand antibody VH molecule does not have an Fc region, has a low molecular weight, has a very short half-life, and rapidly disappears from the whole body. It is possible to minimize sexual side effects.
  • the ligand and the anti-ligand antibody are not bound by a linker as in FIG. 1, and the anti-ligand antibody and the ligand in which a protease cleavage sequence is inserted near the boundary between VH and CH1 are administered in a mixed manner. . If the affinity of the anti-ligand antibody for the ligand is sufficiently strong and the anti-ligand antibody is sufficient relative to the ligand concentration, the biological activity of the ligand is sufficiently inhibited.
  • the ligand-antiligand antibody complex has an Fc region and thus has a long half-life. Have.
  • the systemically administered ligand-antiligand antibody complex releases the anti-ligand antibody VH molecule when the protease cleavage sequence near the boundary between VH and CH1 is cleaved by a protease highly expressed in tumor tissue. Since VH or VL alone cannot bind to the ligand (both VH and VL are required to bind to the ligand), neutralization of the ligand is released and biological effects can be exerted in the tumor tissue. It is.
  • the released ligand molecule also has no Fc region and low molecular weight, so it has a very short half-life and disappears quickly from the whole body, minimizing systemic side effects from the ligand. Is possible.
  • an anti-ligand antibody having a protease cleavage sequence inserted near the boundary between VH and CH1 is administered systemically.
  • the administered antibody binds to a ligand originally present in the body, and the subsequent steps are the same as described above in FIG.
  • an anti-ligand antibody in which a protease cleavage sequence is inserted near the boundary between VH and CH1 it is possible to selectively release the ligand in the tissue expressing the protease and exert its biological action It becomes.
  • the cytokine can be selectively acted on in tissues where proteases are expressed. If the ligand is a chemokine, the chemokine is present in the protease-expressing tissue at a high concentration, and the chemokine concentration in the peripheral blood is low, so that cells expressing the chemokine receptor can migrate to the protease-expressing tissue. .
  • Example 5 Production and Evaluation of CXCL10 Release Antibody 5-1.
  • Introduction of Protease Cleavage Sequence into Anti-CXCL10 Neutralizing Antibody CXCL10 is one of chemokines that have a migrating effect on effector T cells.
  • MabCXCL10 dasheavy chain: EEIVH (SEQ ID NO: 1), light chain: EEIVL (SEQ ID NO: 2)), which is a neutralizing antibody against human CXCL10, was prepared by a method known to those skilled in the art, and FreeStyle 293 (Life Technology ) was used for expression and purification by methods known to those skilled in the art.
  • the CDR sequences contained in MabCXCL10 are as follows: H-CDR1 (NNGMH, SEQ ID NO: 380), H-CDR2 (VIWFDGMNKFYVDSVKG, SEQ ID NO: 381), H-CDR3 (EGDGSGIYYYGMDV, SEQ ID NO: 382), L-CDR1 (RASQSVSSSYLA, SEQ ID NO: 383), L-CDR2 (GASSRAT, SEQ ID NO: 384), L-CDR3 (QQYGSSPIFT, SEQ ID NO: 385).
  • H-CDR1 NGMH, SEQ ID NO: 380
  • H-CDR2 VIWFDGMNKFYVDSVKG, SEQ ID NO: 381
  • H-CDR3 EGDGSGIYYYYGMDV, SEQ ID NO: 382
  • L-CDR1 RASQSVSSSYLA, SEQ ID NO: 383
  • L-CDR2 GSSRAT, SEQ
  • R PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare) was immobilized on a CM3 sensor chip (BR100536, GE Healthcare) by the amine coupling method using NHS / EDC, and used as a running buffer.
  • CM3 sensor chip BR100536, GE Healthcare
  • nM human CXCL10 was flowed as an analyte while the antibody was captured, and the binding of the antibody to the antigen at 37 ° C. was evaluated.
  • FIG. 4 shows a sensorgram representing the amount of binding over time, taking the difference from the blank using only the running buffer as the analyte.
  • the starting time of the horizontal axis is the time when the analyte starts flowing.
  • the response (binding amount) at each time when the response at the time when the analyte starts flowing is 0 is the vertical axis.
  • Peptide sequence A SEQ ID NO: 3
  • uPA urokinase
  • MT-SP1 matriptase
  • Heavy chain variants EEIVHA (SEQ ID NO: 4), EEIVHB (SEQ ID NO: 5), EEIVHC (SEQ ID NO: 6), EEIVHD (SEQ ID NO: 7), EEIVHE (SEQ ID NO: 8), EEIVHF (SEQ ID NO: 8) : 9), EEIVHG (SEQ ID NO: 10), EEIVHBG (SEQ ID NO: 11), EEIVHCG (SEQ ID NO: 12), EEIVHDG (SEQ ID NO: 13), EEIVHEG (SEQ ID NO: 14), and light chain variants EEIVLA (SEQ ID NO: 15), EEIVLB (SEQ ID NO: 16), EEIVLC (SEQ ID NO: 17), EEIVLD (SEQ ID NO: 18), EEIVLE
  • FIG. 6 shows a sensorgram representing the amount of binding over time, taking the difference from the blank using only the running buffer as the analyte.
  • the starting time of the horizontal axis is the time when the analyte starts flowing.
  • the response (binding amount) at each time when the response at the time when the analyte starts flowing is 0 is the vertical axis.
  • EEIVHA / EEIVL, EEIVHE / EEIVL, EEIVHF / EEIVL, EEIVHG / EEIVL, EEIVHEG / EEIVL, and EEIVHBG / EEIVL produced a new band between 25 kDa and 50 kDa by protease treatment.
  • EEIVH / EEIVLEG, EEIVH / EEIVLF, and EEIVH / EEIVLG produced bands at 25 kDa or less by protease treatment.
  • Expression vectors encoding heavy chain variants EEIVHC002 (SEQ ID NO: 23), EEIVHC003 (SEQ ID NO: 24), EEIVHC004 (SEQ ID NO: 25), EEIVHC005 (SEQ ID NO: 26), EEIVHC006 (SEQ ID NO: 27) was prepared by methods known to those skilled in the art.
  • IgG1 antibody in which a protease cleavage sequence is inserted in the vicinity of the boundary between the variable region and the constant region of the heavy chain by combining these modified heavy chain and natural light chain: EEIVHC002 / EEIVL (heavy chain SEQ ID NO: 23, light chain) Chain sequence number: 2), EEIVHC003 / EEIVL (heavy chain sequence number: 24, light chain sequence number: 2), EEIVHC004 / EEIVL (heavy chain sequence number: 25, light chain sequence number: 2), EEIVHC005 / EEIVL (heavy A chain sequence number: 26, light chain sequence number: 2), EEIVHC006 / EEIVL (heavy chain sequence number: 27, light chain sequence number: 2) using FreeStyle 293 (Life Technologies) in a manner known to those skilled in the art It was expressed by sexual expression and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • FIG. 9 shows a sensorgram representing the amount of binding over time, taking the difference from the blank using only the running buffer as the analyte.
  • the starting time of the horizontal axis is the time when the analyte starts flowing.
  • the response (binding amount) at each time when the response at the time when the analyte starts flowing is 0 is the vertical axis.
  • EEIVHC002 / EEIVL, EEIVHC003 / EEIVL, EEIVHC004 / EEIVL, EEIVHC005 / EEIVL, and EEIVHEC006 / EEIVL produced a new band between 25 kDa and 50 kDa by protease treatment.
  • Analyte with antigen / protease treated with 20 nM recombinant human matriptase / ST14 catalytic domain (MT-SP1) (R & D Systems, 3946-SE-010) after binding antibody and human CXCL10 for 20 hours was used.
  • the antibody alone was treated with 20 nM recombinant human matriptase / ST14 catalytic domain (MT-SP1) (R & D Systems, 3946-SE-010) for 20 hours.
  • an antibody and human CXCL10 were combined.
  • CXCL10 was prepared as an antigen-only analyte as a system control for confirming that the response was due to CXCL10 binding.
  • Anti-CXCL10 antibody is immobilized on a CM5 sensor chip (BR100530, GE Healthcare) by a method known to those skilled in the art, and 20 mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 is used as a running buffer. Analyte with / protease, analyte with / without antigen, and antigen-only analyte were each run, and the binding of anti-CXCL10 antibody and human CXCL10 on the sensor chip at 25 ° C. was evaluated.
  • MabCXCL10a (heavy chain: EEIVHa (SEQ ID NO: 65), light chain: EEIVL (SEQ ID NO: 2)) having the same Fab region as antibody MabCXCL10 having no protease cleavage sequence is used to produce antibody EEIVHC006a / EEIVL.
  • an analyte with an antigen / protease was prepared, an analyte without an antigen / analyte with a protease, and an analyte with an antigen / without a protease.
  • an anti-CXCL10 antibody is immobilized on a CM5 sensor chip (BR100530, GE Healthcare) by a method known to those skilled in the art, 20 mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 is used as a running buffer, and an analyte with an antigen / with a protease is used. Analyte with no antigen / protease, analyte with / without antigen, and antigen-only analyte (CXCL10), and evaluate the binding of anti-CXCL10 antibody and human CXCL10 on the sensor chip at 25 ° C did.
  • FIG. 11 shows a sensorgram representing the binding amount over time, which is a difference from the flow cell in which the anti-CXCL10 antibody is not immobilized.
  • the start time of the vertical axis is the time when the analyte starts to flow.
  • the vertical axis represents the response at each time when the response when starting to flow the analyte is 100.
  • the heavy chain shown in FIG. Expression vectors encoding heavy chain variants EESVHA009 (SEQ ID NO: 59) and EESVHA012 (SEQ ID NO: 60) were prepared by methods known to those skilled in the art. By combining these heavy chain variants and natural light chains, the following IgG1 antibodies: EESVHA009 / EEIVL (heavy chain SEQ ID NO: 59, light chain SEQ ID NO: 2), EESVHA012 / EEIVL (heavy chain SEQ ID NO: 60, Light chain SEQ ID NO: 2) was expressed by transient expression using FreeStyle 293 (Life Technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • FreeStyle 293 Life Technologies
  • FIG. 13 shows the results of evaluation by protease-reduced SDS-PAGE after reaction for 20 hours under conditions of mL, PBS and 37 ° C.
  • EESVHA009 / EEIVL and EESVHA012 / EEIVL produced a new band between 25 kDa and 50 kDa by protease treatment. Therefore, it was confirmed that the antibody was cleaved by protease in EESVHA009 / EEIVL and EESVHA012 / EEIVL.
  • Example 6 Consideration of a Cleavage Sequence Insertion Permissive Site for Disrupting Antigen Binding Capability by Protease Cleavage Production of an Antibody with a Protease Cleavage Sequence Inserted Immediately Before the Heavy Chain No. 216 Aspartate of Human IgG1 Antibody and In Vitro Functional Evaluation
  • a report has been made (International Publication WO2004 / 021861A2). Although experimental data are not described, it is claimed that treatment of a medium containing the corresponding protease after mixing the antibody and antigen releases the antigen from the antigen-antibody complex.
  • the 216th amino acid of the heavy chain of the human IgG1 antibody claimed to have inserted the protease cleavage sequence in the report is the Kabat numbering and EU numbering described in Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th edition. It is not aspartic acid in any of the OU numbering systems.
  • the amino acid 216 of the heavy chain of human IgG1 antibody is considered to be aspartic acid immediately after cysteine in which a disulfide bond is formed between the heavy chain and the light chain (Nature 344, 667-670). (12 April 1990), Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th edition).
  • Example 7 Evaluation of migration activity associated with protease cleavage of anti-CXCL10 neutralizing antibody / CXCL10 complex introduced with protease cleavage sequence Complex formed by CXCL10 neutralizing antibody and CXCL10 introduced with protease cleavage sequence prepared in Example 5 Released CXCL10 by protease cleavage and evaluated whether CXCL10 exhibited cell migration activity.
  • the cell migration activity of CXCL10 was prepared by preparing Ba / F3 transfectant cells that express mouse CXCR3 (mCXCR3) (hereinafter referred to as BaF3 / mCXCR3) and HTS Transwell TM -96 Permeable Support with 5.0 ⁇ m Cat. 3387, Corning).
  • mouse MT-SP1 (mMT-SP1, Cat. 4735-SE-010, R & D Systems) is terminated after the reaction. Further addition was made to a concentration of 12.5 nM. 235 ⁇ L of each analyte was transferred to the Lower chamber, BaF3 / mCXCR3 cells were seeded at 75 ⁇ L / well at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well in the Upper chamber, and reacted for 6 hours. The reaction was carried out under conditions of 5% carbon dioxide and 37 ° C.
  • the luminescence intensity reflects the amount of migrated cells, it was found that EEIVHC006a / EEIVL formed a complex with CXCL10 and neutralized the action of CXCL10. On the other hand, when the EEIVHC006a / EEIVL + CXCL10 + protease analyte is added, the luminescence intensity is restored compared to when the EEIVHC006a / EEIVL + CXCL10 analyte is added, and the cells migrate as in the case of the CXCL10 + protease addition. It was shown that.
  • Example 8 Evaluation of migration activity associated with protease cleavage of anti-CXCL10 neutralizing antibody-CXCL10 fusion protein into which protease cleavage sequence was introduced 8-1 Production of anti-CXCL10 neutralizing antibody-CXCL10 fusion protein and evaluation of protease cleavage MabCXCL10_G7 (heavy chain: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 368), light chain: G7L-LT0 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 368) 369)), the human CXCL10 mutant hCXCL10R75A (SEQ ID NO: 370) mutated so as to be resistant to protease at the N-terminus of the light chain via a linker sequence comprising a glycine-serine polymer.
  • a fusion protein G7H-G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 (heavy chain SEQ ID NO: 368, ligand fusion light chain SEQ ID NO: 371) can be obtained by combining a ligand fusion light chain and G7H-G1T4 of MabCXCL10_G7 heavy chain. It was expressed by transient expression using Expi293 (Life Technologies) by a known method, and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • the CDR sequences of MabCXCL10_G7 are as follows: H-CDR1 (SFSIT, SEQ ID NO: 374), H-CDR2 (EITPMFGIANYAQKFQG, SEQ ID NO: 375), H-CDR3 (DGRFDVSDLLTDKPKVTINYNGMDV, SEQ ID NO: 376), L-CDR1 (SGSSIG SEQ ID NO: 377), L-CDR2 (NNDQRPS, SEQ ID NO: 378), L-CDR3 (ASWDDSLNGRV, SEQ ID NO: 379). It was verified whether this fusion protein was cleaved by protease.
  • Human protease urokinase (human uPA, huPA) (R & D Systems, 1310-SE-010) was used as a protease. Cleavage of the fusion protein by protease was assessed by reducing SDS-PAGE. After reacting 30 mg of huPA with 0.1 mg / ml of the fusion protein at 37 ° C. for 1 hour, cleavage of the fusion protein was evaluated by reducing SDS-PAGE. As a result, G7H-G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 was not cleaved by protease treatment (FIG. 15).
  • a histidine tag was added to the C-terminus of human CXCL10 mutant hCXCL10R75A (SEQ ID NO: 370) mutated to become resistant to protease to produce a histidine-tagged human CXCL10 mutant hCXCL10R75A-His (SEQ ID NO: 373).
  • hCXCL10R75A-His (SEQ ID NO: 373) was expressed by transient expression using Expi293 (Life Technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified by a method known to those skilled in the art using nickel sepharose.
  • Ba / F3 transfectant cells expressing mouse CXCR3 (mCXCR3) were prepared (hereinafter referred to as BaF3 / mCXCR3).
  • As an uPA (+) analyte hCXCL10R75A-His 0.15 ⁇ g / mL in 2.0 mL 96-well deep well plate (Cat.
  • G7H- fusion protein without protease cleavage sequence G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 ⁇ g / mL was prepared by adding recombinant huPA (Cat. 1310-SE, R & D systems) to a final concentration of 30 nM.
  • G7H-G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 ⁇ g / mL contains hCXCL10R75A equivalent to 0.15 ⁇ g / mL.
  • hCXCL10R75A-His 0.15 ⁇ g / mL and fusion protein G7H-G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 ⁇ g / mL without protease cleavage sequence were used.
  • 235 ⁇ L of each solution to be analyzed was transferred to the Lower chamber, BaF3 / mCXCR3 cells were seeded at 75 ⁇ L / well at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well in the Upper chamber, and reacted for 6 hours. The reaction was carried out under conditions of 5% carbon dioxide and 37 ° C.
  • G7H-G1T4 / hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 which does not have a cleavage sequence, showed no recovery of luminescence intensity even when protease treatment was performed.
  • protease urokinase human uPA, huPA
  • R & D Systems, 1310-SE-010 Human protease urokinase
  • Cleavage of the fusion protein by the protease is assessed by reducing SDS-PAGE. After reacting 0.1 mg / ml of the fusion protein with 30 nM huPA at 37 ° C. for 1 hour, cleavage of the fusion protein is evaluated by reducing SDS-PAGE.
  • hCXCL10R75A-His 0.15 ⁇ g / mL prepared in 8-2 in a 2.0 mL 96-well deep well plate (Cat. P-DW-20-CS, Axygen), or protease cleavage sequence Recombinant huPA (Cat. 1310-SE, R & D systems) is added to 1.5 ⁇ g / mL of the fusion protein into which is introduced to prepare a final concentration of 30 nM.
  • a fusion protein having a protease cleavage sequence 1.5 ⁇ g / mL contains 0.15 ⁇ g / mL equivalent of hCXCL10R75A.
  • the uPA ( ⁇ ) analyte uses hCXCL10R75A-His 0.15 ⁇ g / mL or a fusion protein 1.5 ⁇ g / mL with a protease cleavage sequence.
  • 235 ⁇ L of each solution to be analyzed is transferred to the Lower chamber, and BaF3 / mCXCR3 cells are seeded at 75 ⁇ L / well at 2.0 ⁇ 10 5 cells / well in the Upper chamber and allowed to react for 6 hours. The reaction is carried out under conditions of 5% carbon dioxide and 37 ° C. After 6 hours of reaction, 100 ⁇ L of the solution in the Lower chamber is transferred to OptiPlate-96 (Cat.
  • Example 9 Preparation of anti-IL-12 neutralizing antibody introduced with protease cleavage sequence and mobile linker sequence and evaluation of IL-12 activation associated with protease cleavage 9-1.
  • Preparation of anti-IL-12 neutralizing antibody into which protease cleavage sequence and movable linker sequence are introduced IL-12 is one of the cytokines having immunostimulatory action. IL-12 exerts an antitumor effect by activating immune cells, but at the same time, it has been reported that systemic exposure causes serious side effects (Nat Immunol. 2012 Jul 19; 13 (8): 722-8.).
  • Urokinase is located near the boundary between the variable region and the constant region of the heavy chain (UstkH-G1T4, heavy chain SEQ ID NO: 144) of the anti-IL12 antibody having the same variable region as Ustekinumab, a neutralizing antibody against human IL-12 And a peptide sequence A (SEQ ID NO: 3), which is reported to be cleaved by matriptase (MT-SP1), and a sequence containing a movable linker consisting of a glycine-serine polymer, and a modified heavy chain of Ustekinumab UstkH-G1T4CYTM1inP1 (SEQ ID NO: 146) was designed and combined with the light chain of Ustekinumab (UstkL-kT0, SEQ ID NO: 145), UstkH-G1T4CYTM1inP1 / UstkL-kT0 (heavy chain SEQ ID NO: 146, light chain SEQ ID NO
  • This Ustekinumab variant UstkH-G1T4CYTM1inP1 / UstkL-kT0 is expressed by transient expression using FreeStyle 293 (Life Technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using protein A. It was.
  • H-CDR1 TYWLG, SEQ ID NO: 386
  • H-CDR2 ISPVDSDIRYSPSFQG, SEQ ID NO: 387
  • H-CDR3 RRPGQGYFDF, SEQ ID NO: 388
  • L-CDR1 RASQGISSWLA, SEQ ID NO: 389
  • L-CDR2 AASSLQS, SEQ ID NO: 390
  • L-CDR3 QQYNIYPYT, SEQ ID NO: 391).
  • Protease treatment was performed using Ustekinumab (UstkH-G1T4 / UstkL-kT0) or Ustekinumab variant UstkH-G1T4CYTM1inP1 / UstkL-kT0 at a final concentration of 10.1, 16.9, 9.17 ⁇ M or hMT-SP1, mMT-SP1, or huPA.
  • the reaction was performed at 37 ° C. overnight.
  • NK92 cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 96-well cell culture plate.
  • Antibodies treated with 10 ng / mL IL-12 and protease (UstkH-G1T4 / UstkL-kT0 or UstkH-G1T4CYTM1inP1 / UstkL-kT0, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0054, 0.0013 ⁇ g / mL, respectively) Each concentration was added, and IFN- ⁇ production after 48 hours was measured by ELISA.
  • FIG. 18 shows the results of measuring the concentration of interferon gamma.
  • UstkH-G1T4 / UstkL-kT0 (without protease cleavage sequence) treated with various proteases suppresses interferon gamma production by IL-12 (referred to as neutralization), and IL-12 when the antibody is 0.8 ⁇ g / mL It became the same level as the case where No was added (No IL-12).
  • Example 10 Evaluation of an antibody having a protease cleavage sequence introduced into an anti-human CXCL10 neutralizing antibody 10-1.
  • Introduction of protease cleavage sequence into anti-human CXCL10 neutralizing antibody MabCXCL10 (heavy chain: EEIVH (SEQ ID NO: 1), light chain: EEIVL (SEQ ID NO: 2)) and MabCXCL10_G7 (heavy chain) that neutralize CXCL10 : G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 368) and light chain: G7L-LT0 (SEQ ID NO: 369)) are prepared by methods known to those skilled in the art, and FreeStyle293 cells (Invitrogen) or Expi293 cells (Life technologies) are prepared.
  • MabCXCL10 variant EldHA0003 (heavy chain SEQ ID NO: 356, light chain SEQ ID NO: 2) and MabCXCL10_G7 variant G7H.12aa (heavy chain SEQ ID NO: 367, light chain) SEQ ID NO: 369) was expressed by transient expression using FreeStyle293 cell (Invitrogen) or Expi293 cell (Life technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified by a method known to those skilled in the art using protein A. .
  • the CDR sequences of MRA are as follows: H-CDR1 (SDHAWS, SEQ ID NO: 398), H-CDR2 (YISYSGITTYNPSLKS, SEQ ID NO: 399), H-CDR3 (SLARTTAMDY, SEQ ID NO: 400), L-CDR1 (RASQDISSYLN , SEQ ID NO: 401), L-CDR2 (YTSRLHS, SEQ ID NO: 402), L-CDR3 (QQGNTLPYT, SEQ ID NO: 403).
  • Table 4 shows peptide sequences that are known to be cleaved by MMP-2, MMP-7, and MMP-9, and peptide sequences that include a movable linker composed of a glycine-serine polymer in the vicinity of these sequences.
  • 4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4 (SEQ ID NO: 155), MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4 (SEQ ID NO: 156), MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4 (SEQ ID NO: 157), MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4 (SEQ ID NO: 158) MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 (heavy chain SEQ ID NO: 159) was designed, and expression vectors encoding these modified heavy chains were prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the MRA variants shown in Table 5 are expressed by transient expression using FreeStyle293 cells (Invitrogen) or Expi293 cells (Life technologies) by methods known to those skilled in the art, Purification was performed by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • MMP-2 For MMP-2, MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4MP1MEHMP4M4MP1ME4 3-MEIVHMP2.3G1T4 / MRAL-k0 cut, MMP-7 with MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 / MRAL-k0 cut, MMP-9 with MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4MEMP4SG4SMP4 A k0 cleavage was observed.
  • Example 12 Evaluation of antibodies introduced with protease cleavage sequences at various positions in the heavy chain 12-1
  • uPA urokinase
  • MT-SP1 matriptase
  • MRA heavy chain variable region are respectively linked to MRA heavy chain constant region (G1T4, SEQ ID NO: 162) to produce MRA heavy chain variants, and expression vectors encoding the corresponding genes are known to those skilled in the art. It was made with.
  • the peptide sequence B (SEQ ID NO: 160) was inserted into different positions in the MRA heavy chain constant region (G1T4, SEQ ID NO: 162), respectively, to produce variants of the MRA heavy chain constant region shown in Table 7.
  • MRA heavy chain constant region variants are each linked to the MRA heavy chain variable region (MRAH, SEQ ID NO: 161) to produce MRA heavy chain variants, and expression vectors encoding the corresponding genes are known to those skilled in the art.
  • Tables 6 and 7 also show the protease cleavage sequence insertion positions in the prepared MRA heavy chain variable region variants and MRA heavy chain constant region variants.
  • the insertion position in Table 6 refers to the position adjacent to the constant region of the described position (Kabat numbering) in the antibody heavy chain variable region, and the insertion position in Table 7 refers to the position described in the antibody heavy chain constant region (EU numbering). Next to the variable region side.
  • the MRA variant after protease treatment has a heavy chain that is cleaved, compared to the heavy chain of the MRA variant that has not undergone protease treatment (a band that appears near 50 kDa in MT-SP1 (-) lane in the figure) A heavy chain band appears at a lower molecular weight. From this result, it was confirmed that the MRA variant prepared in 12-1 was cleaved by hMT-SP1.
  • Example 13 Evaluation of antibodies introduced with protease cleavage sequences at various positions in the light chain 13-1 Production of antibodies with protease cleavage sequences introduced at various positions in the light chain Peptide sequence B (SEQ ID NO: 160) that has been reported to be cleaved by urokinase (uPA) and matriptase (MT-SP1) Were inserted into different positions in the MRA light chain variable region (MRAL, SEQ ID NO: 230), respectively, to produce variants of the MRA light chain variable region shown in Table 9.
  • uPA urokinase
  • MT-SP1 matriptase
  • MRA light chain variable region variants are respectively linked to the MRA light chain constant region (k0, SEQ ID NO: 231) to produce MRA light chain variants, and expression vectors encoding the corresponding genes are known to those skilled in the art. It was made with.
  • the peptide sequence B (SEQ ID NO: 160) was inserted into different positions in the MRA light chain constant region (k0, SEQ ID NO: 231), respectively, to produce MRA light chain constant region variants shown in Table 10.
  • MRA light chain constant region variants are each linked to the MRA light chain variable region (MRAL, SEQ ID NO: 230) to produce MRA light chain variants, and expression vectors encoding the corresponding genes are known to those skilled in the art. It was produced by the method.
  • Tables 9 and 10 also show the protease cleavage sequence insertion positions in the prepared MRA light chain variable region variants and MRA light chain constant region variants.
  • the insertion site in Table 9 refers to the constant region side adjacent to the amino acid described in the antibody light chain variable region (Kabat numbering), and the insertion site in Table 10 refers to the amino acid described in the antibody light chain constant region (EU numbering). Next to the variable region side.
  • the MRA light chain variant prepared above and the MRA heavy chain are combined, and the MRA variant shown in Table 11 is transiently expressed using FreeStyle293 cell (Invitrogen) or Expi293 cell (Life technologies) in a manner known to those skilled in the art. And purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • the MRA variant cleaved after protease treatment has a lower molecular weight than the light chain of the MRA variant that has not undergone protease treatment (the band filed near 25 kDa of MT-SP1 (-) lane in the figure). A light chain band appears.
  • Example 14 Production of anti-human PD1 neutralizing antibody introduced with protease cleavage sequence and evaluation of binding to human PD1 14-1.
  • the peptide sequence (SEQ ID NO: 299) reported to be cleaved by matriptase (MT-SP1) is converted into the heavy chain 5C4H-G1T4 of the aforementioned antibody or Inserted into light chain 5C4L-KT0, the heavy chain variants shown in Table 12 and the light chain variants shown in Table 13 were prepared and expressed by methods known to those skilled in the art.
  • IgG1 antibodies (Table 14) in which a protease cleavage sequence is introduced by combining the heavy chain variant of Table 12 and the light chain 5C4L-KT0, or the light chain variant of Table 13 and the heavy chain 5C4H-G1T4 are known to those skilled in the art
  • the protein was expressed by transient expression using Expi293® (Life Technologies) and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • As a control antibody not containing the protease cleavage sequence 5C4H-G1T4 / 5C4L-KT0 (heavy chain SEQ ID NO: 297, light chain SEQ ID NO: 298) was expressed and purified.
  • Biotinylated Anti-human PD1 Neutralizing Antibody having the same variable region sequence as 5C4H-G1T4 / 5C4L-KT0 was prepared. Specifically, a gene encoding 5C4VH-G1dGSBAP (SEQ ID NO: 317) in which the heavy chain variable region 5C4H (SEQ ID NO: 300) is added with the antibody heavy chain constant region and biotin (AviTag sequence, SEQ ID NO: 316). Fragments were prepared and introduced into animal cell expression vectors by methods known to those skilled in the art.
  • the constructed expression vector and a vector expressing light chain 5C4L-KT0B were introduced into FreeStyle293 cells (Invitrogen) using 293fectin (Invitrogen).
  • a gene expressing EBNA1 SEQ ID NO: 318) and a gene expressing biotin ligase (BirA, SEQ ID NO: 319) were simultaneously introduced, and biotin was added for the purpose of biotin labeling.
  • Cells into which the gene was introduced were cultured at 37 ° C. and 8% CO 2 , and the target biotinylated anti-human PD1 neutralizing antibody (5C4-bio) was secreted into the culture supernatant.
  • 5C4-bio was purified from the culture supernatant by a method known to those skilled in the art.
  • Samples for binding evaluation, 5C4-bio, and PBS were dispensed into different wells of Tilted bottom (TW384) Micro plates (ForteBio, 18-5076).
  • a Streptavidin biosensor (ForteBio, 18-0009) was hydrated with PBS and measured with Octet RED 384 at a setting of 30 ° C. Baseline measurements were performed in wells containing PBS for 30 seconds, after which 5C4-bio was bound to the Streptavidin sensor for 200 seconds. Baseline measurement was performed again in wells containing PBS for 30 seconds, then binding was measured in wells containing samples for binding evaluation for 180 seconds, and dissociation was measured for 180 seconds in wells containing PBS.
  • FIG. 26 shows a real-time connection graph showing the state of connection.
  • an antibody having a protease cleavage sequence introduced it binds to 5C4-bio when measured with a binding evaluation sample containing a protease-treated antibody, compared to a binding evaluation sample containing a protease-untreated antibody.
  • Protein G sensor (ForteBio, 18-0022) was hydrated with PBS and measured with Octet RED 384 at a setting of 30 ° C. Baseline measurements were performed in wells containing PBS for 30 seconds, after which antibody was bound to the Protein G sensor for 200 seconds. Baseline measurements were performed again in wells containing PBS for 30 seconds, then binding was measured for 180 seconds in wells containing human PD1, and dissociation was measured for 180 seconds in wells containing PBS.
  • FIG. 28 shows a real-time connection graph showing the state of connection. As shown in FIG. 28, when each antibody into which a protease cleavage sequence was introduced was used, the amount of human PD1 bound to the protease-treated antibody was decreased as compared to the untreated protease antibody.
  • FIG. 29 shows a real-time connection graph showing the state of connection.
  • the amount of human PD1 bound to 5C4-bio increased in the protease-treated sample compared to the protease-untreated sample. That is, the protease treatment decreased the binding activity of each antibody to PD1, and PD1 was released from the antibody-PD1 complex and released.
  • Example 15 Production and Evaluation of Anti-human PD1 Neutralizing Antibody Introduced with Protease Cleavage Sequence and Human PD1 Fusion Protein (Anti-PD1 Neutralizing Antibody-PD1 Fusion Protein) 15-1.
  • a human PD1 sequence (SEQ ID NO: 320) was connected through a linker to prepare a PD1 fusion heavy chain (Table 15).
  • the human PD1 sequence (SEQ ID NO: 320) is attached to the N-terminus of the light chain or light chain variant of the antibody prepared in Example 14-1 via a movable linker consisting of a glycine-serine polymer (SEQ ID NO: 321). ) To produce a PD1 fusion light chain (Table 16).
  • anti-PD1 neutralizing antibody-PD1 fusion proteins combining the PD1 fusion heavy chain and light chain 5C4L-KT0 of Table 15 or the PD1 fusion light chain and heavy chain 5C4H-G1T4 of Table 16: hPD15C4HA12aa-G1T4 / 5C4L-KT0 (PD1 fusion heavy chain SEQ ID NO: 323, light chain SEQ ID NO: 298) hPD15C4HE12aa-G1T4E / 5C4L-KT0 (PD1 fusion heavy chain SEQ ID NO: 324, light chain SEQ ID NO: 298) 5C4H-G1T4 / hPD15C4LH12aa-KT0 (heavy chain SEQ ID NO: 297, light chain SEQ ID NO: 325) 5C4H-G1T4 / hPD15C4LI12aa-KT0 (heavy chain SEQ ID NO: 297, PD1 fusion light chain SEQ ID NO: 326)
  • 5C4H-G1T4 / 5C4L-KT0 (heavy chain SEQ ID NO: 297, light chain SEQ ID NO: 298)) was similarly expressed and purified as a control antibody not containing a protease cleavage sequence.
  • FIG. 30 shows a real-time connection graph showing the state of connection.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is transported in vivo with the ligand bound, and is cleaved in the diseased tissue to weaken the binding to the ligand, so that the ligand can be released specifically to the diseased tissue. Can be exposed to.
  • the ligand-binding molecule suppresses the biological activity of the ligand during transportation, the risk of the ligand acting systemically is reduced, and is extremely useful in the treatment of diseases.

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Abstract

本発明は、切断サイトが切断されることでリガンドへの結合活性が減弱するリガンド結合分子及びその製造方法、当該リガンド結合分子とリガンドで形成される複合体、当該リガンド結合分子とリガンドを含む融合タンパク質、リガンド結合分子またはリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。

Description

リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
　本発明は、少なくとも一つの切断サイトを有し、当該切断サイトが切断された状態でリガンドとの結合が減弱されるリガンド結合分子、当該リガンド結合分子の製造方法、ならびに当該リガンド結合分子を含む医薬組成物を提供する。
　抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、および非特許文献２）。
　抗体医薬を用いた癌治療薬として、これまでのCD20抗原に対するリツキサン、EGFR抗原に対するセツキシマブ、HER2抗原に対するハーセプチン等が承認されている（非特許文献３）。これらの抗体分子は、癌細胞に発現している抗原に対して結合し、ADCCやシグナル阻害等によって癌細胞に対する傷害活性を発揮する。
　また、癌細胞に高発現する癌抗原に結合する抗体分子にサイトカインなどの生理活性を有するリガンドを融合させたイムノサイトカインによって、リガンドを固形癌にデリバリーする方法が知られている。イムノサイトカインによって固形癌にデリバリーされたサイトカインが免疫を活性化させることで抗腫瘍効果を発揮する。IL2、IL12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが（非特許文献４、５、６）、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題があり、未だに医薬品として承認されていない。
　この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できないことが挙げられる。癌抗原に結合する抗体にIL2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある（非特許文献７）。
　上記の問題を回避する方法として、サイトカインとサイトカインレセプターの間を癌で高発現するプロテアーゼによって切断されるリンカーで結合させた分子が報告されている。サイトカインはリンカーで結合されたサイトカインレセプターによって阻害されているが、リンカーがプロテアーゼによって切断されるとサイトカインがサイトカインレセプターから遊離し、活性体になる。例としてTNF-alphaとTNF-RをuPAで切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献８）が報告され、IL2とIL2RをMMP2で切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献９）が報告されている。しかしながら、これらの分子はリンカーの切断前であってもサイトカインは活性を有しており、リンカーの切断によって活性が約10倍程度しか向上しない。また、IL2Rに代わり抗IL2 scFvをMMP-2で切断されるリンカーを介してIL2と結合させた分子（非特許文献９）が報告されている。
Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327 Cyclophosphamide and tucotuzumab (huKS-IL2) following first-line chemotherapy in responding patients with extensive-disease small-cell lung cancer. Gladkov O, Ramlau R, Serwatowski P, Milanowski J, Tomeczko J, Komarnitsky PB, Kramer D, Krzakowski MJ. Anticancer Drugs. 2015 Nov;26(10):1061-8. Defining the Pharmacodynamic Profile and Therapeutic Index of NHS-IL12 Immunocytokine in Dogs with Malignant Melanoma. Paoloni M, Mazcko C, Selting K, Lana S, Barber L, Phillips J, Skorupski K, Vail D, Wilson H, Biller B, Avery A, Kiupel M, LeBlanc A, Bernhardt A, Brunkhorst B, Tighe R, Khanna C. PLoS One. 2015 Jun 19;10(6):e0129954. Isolated limb perfusion with the tumor-targeting human monoclonal antibody-cytokine fusion protein L19-TNF plus melphalan and mild hyperthermia in patients with locally advanced extremity melanoma. Papadia F, Basso V, Patuzzo R, Maurichi A, Di Florio A, Zardi L, Ventura E, Gonzalez-Iglesias R, Lovato V, Giovannoni L, Tasciotti A, Neri D, Santinami M, Menssen HD, De Cian F. J Surg Oncol. 2013 Feb;107(2):173-9. Antigen specificity can be irrelevant to immunocytokine efficacy and biodistribution. Tzeng A, Kwan BH, Opel CF, Navaratna T, Wittrup KD. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):3320-5. Cancer Immunol Immunother. 2006 Dec;55(12):1590-600. Epub 2006 Apr 25. Target-selective activation of a TNF prodrug by urokinase-type plasminogen activator (uPA) mediated proteolytic processing at the cell surface. Gerspach J1, Nemeth J, Munkel S, Wajant H, Pfizenmaier K. Immunology. 2011 Jun;133(2):206-20. doi: 10.1111/j.1365-2567.2011.03428.x. Epub 2011 Mar 23. Development of an attenuated interleukin-2 fusion protein that can be activated by tumour-expressed proteases. Puskas J1, Skrombolas D, Sedlacek A, Lord E, Sullivan M, Frelinger J.
　本発明は、このような情況に鑑みて為されたものであり、その目的の一つは、サイトカインあるいはケモカイン等のリガンドを標的組織において選択的に活性化するリガンド結合分子、当該リガンド結合分子を含む医薬組成物、当該医薬組成物および当該有効成分の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を進めたところ、切断サイトが切断されることでリガンドへの結合活性が減弱するリガンド結合分子を創作した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子または当該リガンド結合分子を含む医薬組成物が、当該リガンドを用いて疾患を治療することに有用であることを見出すとともに、当該リガンド結合分子を投与することを含む疾患の治療に有用であること、及び疾患の治療のための医薬の製造において当該リガンド結合分子が有用であることを見出した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子の製造方法を創作して本発明を完成させた。
　本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する態様を包含するものである。
（１）リガンドに結合可能な分子であって、当該分子は切断サイトを少なくとも一つ有するポリペプチドであり、且つ当該分子が少なくとも一つの切断サイトで切断された状態でリガンドとの結合が減弱される、リガンド結合分子。
（２）前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、（１）に記載のリガンド結合分子。
（３）前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、（１）または（２）に記載のリガンド結合分子。
（４）前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、（３）に記載のリガンド結合分子。
（５）前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、（４）記載のリガンド結合分子。
（６）前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、（４）記載のリガンド結合分子。
（７）前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、（３）から（６）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（８）前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：３、３４、６６、７０、７１、７２、７３、３５、７５、７６、および３４５に記載の配列から選ばれる配列を含む配列である、（３）に記載のリガンド結合分子。
（９）前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、（３）から（８）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（１０）前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、（９）に記載のリガンド結合分子。
（１１）前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（９）に記載のリガンド結合分子。
（１２）前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（１０）に記載のリガンド結合分子。
（１３）前記リガンド結合分子は抗体VHと、抗体VLと、抗体定常領域を含む、（１）から（１２）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（１４）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域内に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（１５）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体重鎖定常領域１１８番アミノ酸（EUナンバリング）から抗体重鎖定常領域１４０番アミノ酸（EUナンバリング）までの配列中の任意の位置に挿入される、（１４）に記載のリガンド結合分子。
（１６）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体軽鎖定常領域１０８番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１０８番）から抗体軽鎖定常領域１３１番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１３１番）までの配列中の任意の位置に挿入される、（１４）に記載のリガンド結合分子。
（１７）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体VH内もしくは前記抗体VL内に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（１８）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、および１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、（１７）に記載のリガンド結合分子。
（１９）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、および９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までからなる群より選択される配列中の任意位置に挿入される、（１７）に記載のリガンド結合分子。
（２０）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、または／および前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、（１３）に記載のリガンド結合分子。
（２１）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VH１０９番のアミノ酸（Kabatナンバリング）から抗体重鎖定常領域１２２番のアミノ酸（EUナンバリング）までの配列中の任意位置に挿入される、（２０）に記載のリガンド結合分子。
（２２）前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、抗体VL１０４番のアミノ酸（Kabatナンバリング）から抗体軽鎖定常領域１１３番のアミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング113位）までの配列中の任意位置に挿入される、（２０）に記載のリガンド結合分子。
（２３）前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記切断サイトが切断されることにより解消される、または前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消される、（１３）から（２２）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２４）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、（１）から（２３）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２５）前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２６）前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２７）前記リガンドはCXCL10、IL12、PD1、またはIL6Rである、（１）から（２４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（２８）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３７４となるH-CDR1、配列番号：３７５となるH-CDR2、配列番号:３７６となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３７７となるL-CDR1、配列番号：３７８となるL-CDR2、配列番号：３７９となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b)　配列番号：３８０となるH-CDR1、配列番号：３８１となるH-CDR2、配列番号:３８２となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３８３となるL-CDR1、配列番号：３８４となるL-CDR2、配列番号：３８５となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(c)　（a）または（ｂ）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(d)　（a）または（ｂ）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（２９）前記リガンド結合分子は、配列番号：４～１４、２３～２７、３３、５９、６０、３５６、および３６７で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：１５～２２で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（２８）に記載のリガンド結合分子。
（３０）前記リガンドはIL12であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３８６となるH-CDR1、配列番号：３８７となるH-CDR2、配列番号：３８８となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３８９となるL-CDR1、配列番号：３９０となるL-CDR2、配列番号：３９１となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b)　（a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c)　（a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３１）前記リガンド結合分子は、配列番号：１４６で示す抗体重鎖を含む抗体である、（３０）に記載のリガンド結合分子。
（３２）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３９２となるH-CDR1、配列番号：３９３となるH-CDR2、配列番号：３９４となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：３９５となるL-CDR1、配列番号：３９６となるL-CDR2、配列番号：３９７となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b)　（a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c)　（a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３３）前記リガンド結合分子は、配列番号：３０４および３０５で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：３０６～３１５、および３２２で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（３２）に記載のリガンド結合分子。
（３４）前記リガンドはIL-6R（IL-6受容体）であり、前記リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含み、当該リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３９８となるH-CDR1、配列番号：３９９となるH-CDR2、配列番号：４００となるH-CDR3を含む抗体VH、配列番号：４０１となるL-CDR1、配列番号：４０２となるL-CDR2、配列番号：４０３となるL-CDR3を含む抗体VL有する；または
(b)　（a）と競合する抗体VHと抗体VLを有する；または
(c)　（a）と同一エピトープに結合する抗体VHと抗体VLを有する、（２７）に記載のリガンド結合分子。
（３５）前記リガンド結合分子は、配列番号：１５３～１５６、１５７～１５９、および４０４～４７０で示す配列から選ばれる抗体重鎖、または配列番号：４７１～５３５で示す配列から選ばれる抗体軽鎖を含む抗体である、（３４）に記載のリガンド結合分子。
（３６）前記リガンド結合分子はIgG抗体である、（１）から（３５）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（３７）前記リガンドと結合している（１）から（３６）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（３８）前記リガンドと融合されている（１）から（３６）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（３９）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、（３８）に記載のリガンド結合分子。
（４０）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（３８）または（３９）に記載のリガンド結合分子。
（４１）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（４０）に記載のリガンド結合分子。
（４２）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（３８）から（４１）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（４３）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（４２）に記載のリガンド結合分子。
（４４）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３７４となるH-CDR1、配列番号：３７５となるH-CDR2、配列番号:３７６となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号：３７７となるL-CDR1、配列番号：３７８となるL-CDR2、配列番号：３７９となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する；または
(b)　配列番号：３８０となるH-CDR1、配列番号：３８１となるH-CDR2、配列番号:３８２となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号：３８３となるL-CDR1、配列番号：３８４となるL-CDR2、配列番号：３８５となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
（４２）または（４３）に記載のリガンド結合分子。
（４５）前記リガンドは配列番号：３７０で示されるCXCL10改変体である、（４２）から（４４）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（４６）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（３８）から（４１）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（４７）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（４６）に記載のリガンド結合分子。
（４８）前記リガンドはPD1であり、前記抗体軽鎖は配列番号：３９５となるL-CDR1、配列番号：３９６となるL-CDR2、配列番号：３９７となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３９２となるH-CDR1、配列番号：３９３となるH-CDR2、配列番号：３９４となるH-CDR3を有する、（４６）または（４７）に記載のリガンド結合分子。
（４９）前記リガンドは配列番号：３２０で示されるPD1である、（４６）から（４８）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（５０）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号：３２３および３２４で示す配列から選ばれる配列を含む、（４６）から（４９）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（５１）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号：３２５～３３４で示す配列から選ばれる配列を含む、（４６）から（４９）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（５２）前記リガンドはIL12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（３８）から（４１）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（５３）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（５２）に記載のリガンド結合分子。
（５４）前記リガンドはIL12であり、前記抗体軽鎖は配列番号：３８９となるL-CDR1、配列番号：３９０となるL-CDR2、配列番号：３９１となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３８６となるH-CDR1、配列番号：３８７となるH-CDR2、配列番号：３８８となるH-CDR3を有する、（５２）または（５３）に記載のリガンド結合分子。
（５５）前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（３８）から（４１）のいずれかに記載のリガンド結合分子。
（５６）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（５５）に記載のリガンド結合分子。
（５７）前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号：４０１となるL-CDR1、配列番号：４０２となるL-CDR2、配列番号：４０３となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３９８となるH-CDR1、配列番号：３９９となるH-CDR2、配列番号：４００となるH-CDR3を有する、（５５）または（５６）に記載のリガンド結合分子。
（５８）前記リガンドと、前記リガンドと結合している（１）から（３６）のいずれかに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
（５９）前記リガンドと（１）から（３６）のいずれかに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
（６０）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では更に別のリガンドと結合しない、（５９）に記載の融合タンパク質。
（６１）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（５９）または（６０）に記載の融合タンパク質。
（６２）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（６１）に記載の融合タンパク質。
（６３）前記リンカーは、グリシン‐セリンポリマーからなるリンカーである、（６１）または（６２）に記載の融合タンパク質。
（６４）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（５９）から（６３）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（６５）前記切断サイトは前記リガンド結合分子の前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（６４）に記載の融合タンパク質。
（６６）前記リガンドはCXCL10であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、前記リガンド結合分子は：
(a)　配列番号：３７４となるH-CDR1、配列番号：３７５となるH-CDR2、配列番号:３７６となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号：３７７となるL-CDR1、配列番号：３７８となるL-CDR2、配列番号：３７９となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する；または
(b)　配列番号：３８０となるH-CDR1、配列番号：３８１となるH-CDR2、配列番号:３８２となるH-CDR3を含む抗体重鎖と、配列番号：３８３となるL-CDR1、配列番号：３８４となるL-CDR2、配列番号：３８５となるL-CDR3を含む抗体軽鎖を有する、
（６４）または（６５）に記載の融合タンパク質。
（６７）前記リガンドは配列番号：３７０で示されるCXCL10改変体である、（６４）から（６６）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（６８）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（５９）から（６３）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（６９）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（６８）に記載のリガンド結合分子。
（７０）前記リガンドはPD1であり、前記抗体軽鎖は配列番号：３９５となるL-CDR1、配列番号：３９６となるL-CDR2、配列番号：３９７となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３９２となるH-CDR1、配列番号：３９３となるH-CDR2、配列番号：３９４となるH-CDR3を有する、（６８）または（６９）に記載の融合タンパク質。
（７１）前記リガンドは配列番号：３２０で示されるPD1である、（６８）から（７０）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（７２）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体重鎖が前記リガンドと融合されており、PD1と抗体重鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号：３２３および３２４で示す配列から選ばれる配列を含む、（６８）から（７１）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（７３）前記リガンドはPD1であり、前記リガンド結合分子に含まれる抗体軽鎖が前記リガンドと融合されており、PD1と抗体軽鎖が融合された一連のポリペプチドは配列番号：３２５～３３４で示す配列から選ばれる配列を含む、（６８）から（７１）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（７４）前記リガンドはIL12であり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（５９）から（６３）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（７５）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（７４）に記載の融合タンパク質。
（７６）前記リガンドはIL12であり、前記抗体軽鎖は配列番号：３８９となるL-CDR1、配列番号：３９０となるL-CDR2、配列番号：３９１となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３８６となるH-CDR1、配列番号：３８７となるH-CDR2、配列番号：３８８となるH-CDR3を有する、（７４）または（７５）に記載の融合タンパク質。
（７７）前記リガンドはIL-6Rであり、前記リガンド結合分子は抗体軽鎖と抗体重鎖を含んでおり、前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖は前記リガンドと融合されている、（５９）から（６３）のいずれかに記載の融合タンパク質。
（７８）前記切断サイトは前記抗体軽鎖または前記抗体重鎖に含まれる、（７７）に記載の融合タンパク質。
（７９）前記リガンドはIL-6Rであり、前記抗体軽鎖は配列番号：４０１となるL-CDR1、配列番号：４０２となるL-CDR2、配列番号：４０３となるL-CDR3を有し、前記抗体重鎖は配列番号：３９８となるH-CDR1、配列番号：３９９となるH-CDR2、配列番号：４００となるH-CDR3を有する、（７７）または（７８）に記載の融合タンパク質。
（８０）（１）から（５７）のいずれかに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
（８１）（１）から（３７）のいずれかに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
（８２）（５８）に記載の複合体を含む、医薬組成物。
（８３）（５９）から（７９）のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
（８４）（１）から（５７）のいずれかに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
（８５）リガンドに結合可能な分子中に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含む、（８４）に記載の製造方法。
（８６）プロテアーゼ切断配列を有するリガンド結合分子とそのリガンドを融合させることを含む、（５９）から（７９）のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法。
（８７）（１）から（５７）のいずれかに記載のリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチド。
（８８）（８７）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（８９）（８７）に記載のポリヌクレオチドもしくは（８８）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（９０）（８９）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、（１）から（５７）のいずれかに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
（９１）（５９）から（７９）のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（９２）（９１）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（９３）（９１）に記載のポリヌクレオチドもしくは（９２）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（９４）（９３）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、（５９）から（７９）のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する方法。
標的組織で特異的に遊離されるリガンド－リンカー－抗リガンド抗体のVH分子を含むIgG抗体とリガンドの融合タンパク質、及びその活性化の一様式を示す図である。リガンドと抗リガンド抗体はリンカーで連結されている。 標的組織で特異的にリガンドを遊離させるIgG抗体、及びその活性化の一様式を示す図である。VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入された抗リガンド抗体とリガンドは混合されて個体に投与される。 標的組織で特異的にリガンドを遊離させるIgG抗体、及びその活性化の一様式を示す図である。VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入された抗リガンド抗体が個体に投与される。投与された抗体は体内に元々存在するリガンドに結合し、以降は図２の活性化様式と同様である。 MabCXCL10とヒトCXCL10の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を示す図である。 MabCXCL10の抗体可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することで作成した抗体分子のモデルを示す図である。 作成した各重鎖改変体の名前、プロテアーゼ切断配列を挿入した位置、挿入したアミノ酸配列を示す図である。挿入部位を [insert]で示す図である。 作成した各軽鎖改変体の名前、プロテアーゼ切断配列を挿入した位置、挿入したアミノ酸配列を示す図である。挿入部位を [insert]で示す図である。 MabCXCL10の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することで作成した抗体分子とヒトCXCL10の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を示す図である。 MabCXCL10の軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することで作成した抗体分子とヒトCXCL10の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を示す図である。 （A）MabCXCL10 の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することで作成した抗体分子をプロテアーゼ（MT-SP1）処理後、還元SDS-PAGEで泳動し、クマシーブリリアントブルー（CBB）で検出することによって切断の程度を評価した結果を示す図である。プロテアーゼ処理によって生じた2本の新たなバンドのうち、15 kDa 付近に生じたバンドがVHに由来するバンドであり、25-50 kDaの位置に現れたバンドが定常領域に由来するバンドである。 （A）の続き、および、（B）MabCXCL10 の軽鎖の可変領域と定常領域にプロテアーゼ切断配列を挿入することで作成した抗体分子をプロテアーゼ（MT-SP1）処理後、切断の程度を還元SDS-PAGEで評価した結果を示す図である。プロテアーゼ処理によって切断された軽鎖由来の2本の新たなバンドが生じている。 （B）の続きを示す図である。 MabCXCL10の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を挿入することで作成した各重鎖改変体の名前、プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を挿入した位置、挿入したアミノ酸配列を示す図である。挿入部位を [insert]で示す。 MabCXCL10 の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を挿入することで作成した抗体分子とヒトCXCL10の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を示す図である。 MabCXCL10 の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列とリンカー配列を挿入することで作成した抗体分子をプロテアーゼ（uPA, MT-SP1）処理後、還元SDS-PAGEで泳動し、CBBで検出することによって切断の程度を評価した結果を示す図である。プロテアーゼ処理によって生じた2本の新たなバンドのうち、15 kDa 付近に生じたバンドがVHに由来するバンドであり、25-50 kDaの位置に現れたバンドが定常領域に由来するバンドである。 図１０Ａの続きを示す図である。 MabCXCL10a とCXCL10の複合体をプロテアーゼ（MT-SP1）処理することによってCXCL10が遊離するかどうかを評価した結果を示す図である。 EEIVHC006a/EEIVLとCXCL10の複合体をプロテアーゼ（MT-SP1）処理することによってCXCL10が遊離するかどうかを評価した結果を示す図である。 MabCXCL10の可変領域と定常領域の境界付近のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列で置換することで作成した各重鎖の名前、アミノ酸を挿入及び改変した部位、挿入配列、挿入及び改変後のアミノ酸配列を示す図である。挿入部位を [insert]で示す。「挿入位置及び改変位置」の欄において取り消し線で示すアミノ酸残基は挿入配列を挿入時に除去されている、即ち、挿入配列の一番C末端側のアミノ酸に置換されている。 MabCXCL10の可変領域と定常領域の境界付近のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列と可動リンカーで置換することで作成した抗体分子をプロテアーゼ（uPA, MT-SP1）処理後、還元SDS-PAGEで泳動し、CBBで検出することによって切断の程度を評価した結果を示す図である。プロテアーゼ処理によって生じた2本の新たなバンドのうち、15 kDa 付近に生じたバンドがVHに由来するバンドであり、25-50 kDaの位置に現れたバンドが定常領域に由来するバンドである。 ルシフェラーゼ活性（発光値）を表す図である。 CXCL10-抗CXCL10抗体融合タンパク質をプロテアーゼで切断した前後のSDS-PAGEの結果である。 ルシフェラーゼ活性（発光値）を表す図である。 プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体のプロテアーゼによる切断を評価した還元SDS-PAGEの図である。 IL-12と抗体を添加した時のインターフェロンガンマの産生を示した図である。NoAbは抗体を添加せずIL-12のみを添加したサンプルであり、NoIL-12はIL-12も抗体も添加しなかったサンプルである。 抗体のプロテアーゼによる切断を示す図である。 抗体のプロテアーゼによる切断を示す図である。 各種プロテアーゼで切断した結果を示す図である。 各種プロテアーゼで切断した結果を示す図である。 各種プロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 MRA改変体をプロテアーゼで切断した結果を示す図である。 プロテアーゼ処理抗体／プロテアーゼ未処理抗体とPD1を含む結合評価用サンプル中のPD1の5C4-bioへの結合を示すリアルタイムグラフを比較した図である。黒色の太線はプロテアーゼ処理抗体を含む結合評価用サンプル、灰色の細線はプロテアーゼ未処理抗体を含む結合評価用サンプルである。X軸は測定時間（秒）を表し、測定開始を0秒とした。Y軸は結合を示す。各グラフの名前は評価用サンプル中に含まれる抗体を示しており、None（抗原のみ）のグラフでは評価用サンプルとして抗原のみを使用し、抗体を混合していない。 プロテアーゼ処理抗体とプロテアーゼ未処理抗体の電気泳動結果である。Protease(+)レーンはプロテアーゼ処理抗体であり、protease(-)レーンはプロテアーゼ未処理抗体である。 プロテアーゼ処理抗体とプロテアーゼ処理未処理抗体のPD1への結合を示すリアルタイムグラフを比較した図である。黒色の太線はプロテアーゼ処理抗体、灰色の細線はプロテアーゼ未処理抗体を示す。X軸は測定時間（秒）を表し、測定開始を0秒とした。Y軸は結合を示す。各グラフの名前は使用した抗体を示しており、NoneのグラフではPBS bufferのみを使用し、抗体を使用していない。 PD1存在下でプロテアーゼ処理を行ったサンプルとPD1存在下でプロテアーゼ処理を行わなかったサンプルに存在する遊離PD1の5C4-bioへの結合を示すリアルタイムグラフを比較した図。黒色の太線はプロテアーゼ処理を行ったサンプル、灰色の細線はプロテアーゼ処理を行わなかったサンプルを示す。X軸は測定時間（秒）を表し、測定開始を0秒とした。Y軸は結合を示す。各グラフの名前はサンプル中に含まれる抗体を示しており、「抗原とプロテアーゼ」のグラフではサンプル中にPD1のみを含み、抗体を含んでいない。 プロテアーゼ処理融合タンパク質とプロテアーゼ未処理タンパク質溶液中に存在する遊離PD1の5C4-bioへの結合を示すリアルタイムグラフを比較した図。黒色の太線はプロテアーゼ処理を行ったサンプル、灰色の細線はプロテアーゼ処理を行わなかったサンプルを示す。X軸は測定時間（秒）を表し、測定開始を0秒とした。Y軸は結合を示す。各グラフの名前は融合タンパク質中を示しており、None（抗原のみ）のグラフでは評価用サンプルとして融合タンパク質を使用せず、抗原PD1のみを使用した。5C4H-G1T4/5C4L-KT0と示すグラフは融合タンパク質を使用せず、5C4H-G1T4/5C4L-KT0抗体のみを使用した。 プロテアーゼ処理した抗体-PD1融合タンパク質の電気泳動結果である。Protease(+)レーンはプロテアーゼ処理融合タンパク質であり、protease(-)レーンはプロテアーゼ未処理融合タンパク質である。
　本発明におけるポリペプチドとは、通常、４アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。また、本発明におけるポリペプチドは通常、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、生物由来のポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
　本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
　ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる。
　本明細書において、アミノ酸の改変部位を表す際に用いられる「および/または」の用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「37番、45番、および/または47番のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含まれる；
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、(g) 37番および45番および47番。
　本明細書において、また、アミノ酸の改変を表す表現として、特定の位置を表す数字の前後に改変前と改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを併記した表現が適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域に含まれるアミノ酸の置換を加える際に用いられるF37VまたはPhe37Valという改変は、Kabatナンバリングで表される37位のPheのValへの置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の1文字コード又は3文字コードは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換後のアミノ酸を表す。同様に、抗体定常領域に含まれるFc領域にアミノ酸の置換を加える際に用いられるP238AまたはPro238Alaという改変は、EUナンバリングで表される238位のProのAlaへの置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換後のアミノ酸を表す。
　本発明は、切断サイトを有し、かつ当該切断サイトが切断された状態でリガンドとの結合が減弱されるリガンド結合分子に関する。本発明のリガンド結合分子はポリペプチドであり、リガンドに結合可能な分子を指す。
　本発明のリガンド結合分子は、リガンドに結合可能な分子、特に未切断の状態においてリガンドに結合可能な分子である。ここの「結合」は通常、静電力、ファンデルワールス力、水素結合等の非共有結合を主とした相互作用による結合をいう。本発明のリガンド結合分子のリガンド結合態様の好適な例として、それだけに限定されないが、例えば、抗原結合領域、抗原結合分子、抗体、および抗体断片等が抗原に結合するような抗原抗体反応が挙げられる。
　なおリガンドに結合可能とは、リガンド結合分子とリガンドがたとえ別分子であっても、リガンド結合分子はリガンドに結合可能であることを意味し、共有結合によりリガンド結合分子とリガンドを繋ぐことを意味しない。例えばリガンドとリガンド結合分子がリンカーを介して共有結合されていることをもって、リガンドに結合可能とは言わない。またリガンドとの結合が減弱されるとは、前記結合可能である能力が減弱されることを言う。例えばリガンドとリガンド結合分子がリンカーを介して共有結合されている場合に、そのリンカーが切断されることをもってリガンドとの結合が減弱されるとはみなせない。なお本発明においては、リガンド結合分子がリガンドに結合可能である限り、リガンド結合分子はリンカー等を介してリガンドとつながっていてもよい。
　本発明のリガンド結合分子は、未切断の状態でリガンドに結合することのみで制限され、未切断の状態で目的とするリガンドに結合できる限りどのような構造の分子も使用され得る。リガンド結合分子の例として、それだけに限定されないが、例えば、抗体の重鎖可変領域（VH）および抗体の軽鎖可変領域（VL）、単ドメイン抗体（sdAb）、生体内に存在する細胞膜タンパクであるAvimerに含まれる35アミノ酸程度のAドメインと呼ばれるモジュール（国際公開WO2004/044011、WO2005/040229）、細胞膜に発現する糖たんぱく質であるfibronectin中のタンパク質に結合するドメインである10Fn3ドメインを含むAdnectin（国際公開WO2002/032925）、ProteinAの58アミノ酸からなる3つのヘリックスの束（bundle）を構成するIgG結合ドメインをscaffoldとするAffibody（国際公開WO1995/001937）、33アミノ酸残基を含むターンと2つの逆並行ヘリックスおよびループのサブユニットが繰り返し積み重なった構造を有するアンキリン反復（ankyrin repeat：AR）の分子表面に露出する領域であるDARPins（Designed Ankyrin Repeat proteins）（国際公開WO2002/020565）、好中球ゲラチナーゼ結合リポカリン（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等のリポカリン分子において高度に保存された8つの逆並行ストランドが中央方向にねじれたバレル構造の片側を支える4つのループ領域であるAnticalin等（国際公開WO2003/029462）、ヤツメウナギ、ヌタウナギなど無顎類の獲得免疫システムとしてイムノグロブリンの構造を有さない可変性リンパ球受容体（variable lymphocyte receptor（VLR））のロイシン残基に富んだリピート（leucine-rich-repeat（LRR））モジュールが繰り返し積み重なった馬てい形の構造の内部の並行型シート構造のくぼんだ領域（国際公開WO2008/016854）が挙げられる。
　本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
　所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。以下に、IL-6Rに結合する抗体（抗IL-6R抗体）を作製する方法が例示される。IL-6R以外の抗原に結合する抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。
　抗IL-6R抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。抗IL-6R抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞によって産生されるもの等が含まれる。本願中に言及される抗体には、「ヒト化抗体」や「キメラ抗体」が含まれる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって、例えば以下のように作製され得る。すなわち、IL-6Rタンパク質を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。
　具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、IL-6R遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるIL-6Rタンパク質が取得され得る。すなわち、IL-6Rをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のヒトIL-6Rタンパク質が公知の方法で精製される。培養上清中から可溶型のIL-6Rを取得するためには、例えば、Mullbergら（J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968）によって記載されているような可溶型IL-6Rが発現される。また、精製した天然のIL-6Rタンパク質もまた同様に感作抗原として使用され得る。
　哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として当該精製IL-6Rタンパク質が使用できる。IL-6Rの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、当該部分ペプチドはヒトIL-6Rのアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、IL-6R遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解酵素を用いてIL-6Rタンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドとして用いるIL-6Rペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なくとも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8～50、好ましくは10～30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。
　また、IL-6Rタンパク質の所望の部分ポリペプチドやペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed. （Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989）Cold Spring Harbor Lab. press）に記載されている。感作抗原として用いられるIL-6Rの取得方法及びそれを用いた免疫方法は、WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等にも具体的に記載されている。
　当該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使用される。
　公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に投与によって投与されることにより免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫することが望ましい場合もある。
　また、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法である。蛋白質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。
－IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
－免疫抗原を精製する必要が無い
　DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、IL-6Rタンパク質を発現するDNAが免疫動物に投与される。IL-6RをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与される。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターが好適に利用され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用され得る。たとえば、発現ベクターが吸着した金粒子が、gene gunで免疫動物個体の細胞内に導入されることによってDNA免疫が行われる。さらに、IL-6Rを認識する抗体の作製は国際公開WO 2003/104453に記載された方法を用いても作製され得る。
　このように哺乳動物が免疫され、血清中におけるIL-6Rに結合する抗体力価の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用され得る。
　前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
　このようなミエローマ細胞として、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J. Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等が好適に使用され得る。
　基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液が好適に添加され得る。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から60％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去され得る。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、係る十分な時間は数日から数週間である）上記HAT培養液を用いた培養が継続され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施され得る。
　所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、IL-6Rに結合するモノクローナル抗体は、細胞表面に発現したIL-6Rに結合することができる。このようなモノクローナル抗体は、たとえば、FACS（fluorescence activated cell sorting）によってスクリーニングされ得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面に対する抗体の結合を測定することを可能にするシステムである。
　FACSによって本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、まずIL-6Rを発現する細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細胞は、IL-6Rを強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主細胞として使用した形質転換されていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のIL-6Rに対する抗体の結合活性が選択的に検出され得る。すなわち、宿主細胞に結合せず、IL-6R強制発現細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、IL-6Rモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが取得され得る。
　あるいは固定化したIL-6R発現細胞に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評価され得る。たとえば、ELISAプレートのウェルにIL-6R発現細胞が固定化される。ハイブリドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
　当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに好適なものである。
　当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコードされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 767-775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
　たとえば、抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗IL-6R抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
　抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA 増幅キット（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）が適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入され得る。
　得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
　可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使った5’-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出されたRNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’-RACE cDNAライブラリが得られる。5’-RACE cDNAライブラリの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットが適宜用いられる。
　得られた5’-RACE cDNAライブラリを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列である。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。
　具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリ作製キットに付属するプライマーが利用される。
　こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、IL-6Rに対する結合活性を指標として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえばIL-6Rに対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のIL-6Rに対する結合は、特異的であることがさらに好ましい。IL-6Rに結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
（２）IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
（３）IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
　抗体とIL-6R発現細胞との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFACSなどの手法によって、抗体とIL-6R発現細胞との結合が検出され得る。抗体の結合活性を評価するためにIL-6R発現細胞の固定標本が適宜利用され得る。
　結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法も好適に用いられる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv（scFv）を形成することができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。
　目的とする抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
　抗IL-6Rモノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子が発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。例えば、シグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：536）を有するペプチドが使用され得るが、これ以外にも適したシグナル配列が付加される。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗IL-6R抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。
　「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、それだけに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
　用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
　用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの相補性決定領域 (CDR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。
　本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「CDR」は、配列において超可変であり、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのCDRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なCDRは、以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　別段示さない限り、CDR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
　「フレームワーク」または「FR」は、相補性決定領域 (CDR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、CDRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
　本明細書で用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の可変領域以外の部分を言う。例えば、IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインを含む重鎖定常領域（CH）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。天然型抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
　抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
　本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG１の場合、重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
　本発明のリガンド結合分子は、切断サイトを含むポリペプチドである。切断サイトは、例えば酵素によって切断することが出来るか、また還元剤によって還元することが出来るか、または光分解することが出来る。切断サイトは、切断されることによってリガンド結合分子のリガンドへの結合を減弱できる限り、ポリペプチド中のどの位置に配置されても良い。また、ポリペプチド中に含まれる切断サイトは、一つであっても複数であっても良い。
　また、本発明のリガンド結合分子は、未切断状態と比べて、切断された状態でのリガンド結合が弱い（即ち、減弱されている）。リガンド結合分子とリガンドの結合が抗原抗体反応である実施態様において、リガンド結合の減弱はリガンド結合分子のリガンド結合活性により評価され得る。
　リガンド結合分子とリガンドの結合活性の評価は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法、BLI（Bio-Layer Interferometry）法（Octet）等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
　ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
　例えば、ドナービーズにビオチン標識されたリガンド結合分子が結合され、アクセプタービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたリガンドが結合される。競合するタグ化されていないリガンド結合分子の非存在下では、リガンド結合分子とリガンドは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ずる。タグ化されていないリガンド結合分子は、タグ化されたリガンド結合分子とリガンド間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減少を定量することによって相対的な結合親和性が決定され得る。抗体等のリガンド結合分子をSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。リガンドをGSTでタグ化する方法としては、リガンドをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターを保持した細胞等においてGST融合リガンドを発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適合させることにより好適に解析される。
　相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、センサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわちセンサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比から解離定数（KD）が求められる。BIACORE法では阻害測定法や平衡値解析法も好適に用いられる。阻害測定法の例はProc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010において、平衡値解析法の例はMethods Enzymol. 2000;323:325-40.において記載されている。
　リガンド結合分子がリガンドと結合する機能が減弱されているとは、例えば、上記の測定方法に基づいて、被験リガンド結合分子あたりのリガンド結合量が、対照のリガンド結合分子に比較して、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合量を示すことをいう。結合活性の指標は適宜所望の指標を用いてよいが、例えば解離定数（KD）を用いてよい。結合活性の評価指標として解離定数（KD）を用いる場合、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、対照のリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）に比較して大きいことが、被験リガンド結合分子のリガンドに対する結合活性が対照のリガンド結合分子に比較して弱いことを示す。リガンドと結合する機能が減弱されているとは、例えば、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、対照のリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）に比較して、2倍以上、好ましくは５倍以上、１０倍以上、特に好ましくは１００倍以上であることをいう。
　対照のリガンド結合分子としては、例えば、未切断型のリガンド結合分子が挙げられる。
　本発明の一実施態様において、本発明のリガンド結合分子は、切断サイトが切断されることにより、リガンド結合分子からリガンドが遊離する。ここで、リガンドがリンカーを介してリガンド結合分子の一部分と結合しており、該リンカーに切断サイトがない場合は、リガンドは、リガンド結合分子の該一部分とリンカーを介してつながったまま遊離することになる（例えば図１を参照）。このように、リガンドがリガンド結合分子の一部と共に遊離する場合であっても、リガンド結合分子の過半から遊離する限り、リガンド結合分子からリガンドが遊離したと言える。
　リガンド結合分子からリガンドが切断サイトの切断により遊離することを検出する方法として、リガンドを認識するリガンド検出用抗体等でリガンドを検出する方法がある。リガンド結合分子が抗体断片である場合、リガンド検出用抗体はリガンド結合分子と同様なエピトープに結合することが好ましい。リガンド検出用抗体を用いるリガンドの検出は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法、BLI（Bio-Layer Interferometry）法（Octet）等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
　例えば、Octetを用いてリガンドの遊離を検出する場合、リガンドを認識するリガンド検出用抗体をビオチン化し、バイオセンサーと接触させたのちに、サンプル中のリガンドに対する結合を測定することで、リガンドの遊離を検出することができる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。
　また、リガンド結合分子と結合するときにリガンドの生理活性が阻害される実施態様において、リガンド結合分子から遊離することを検出する方法として、サンプル中のリガンドの生理活性を測定することによりリガンドの遊離を検出できる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンドの生理活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル対して、リガンドの生理活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンドの生理活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプル対して、リガンドの生理活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。
　本発明の一実施態様において、切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含み、プロテアーゼによって切断される。
　本明細書において、用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼなどの酵素、通常はエンドペプチダーゼを言う。本発明に用いられるプロテアーゼは、プロテアーゼ切断配列を切断できることのみによって制限され、その種類は特に限定されない。いくつかの実施態様において、標的組織特異的プロテアーゼが使用される。標的組織特異的プロテアーゼは、例えば、
（１）標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
（２）標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
（３）標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
（４）標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
　本明細書で用語「標的組織」は、少なくとも一つの標的細胞を含む組織を意味する。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は癌組織である。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は炎症組織である。
　用語「癌組織」とは、少なくとも一つの癌細胞を含む組織を意味する。したがって、例えば癌組織が癌細胞と血管を含んでいるように、癌細胞および内皮細胞を含む腫瘤（tumor mass）の形成に寄与するすべての細胞型をいう。本明細書において、腫瘤とは腫瘍組織巣（a foci of tumor tissue）をいう。「腫瘍」という用語は、一般に、良性新生物または悪性新生物を意味するために用いられる。
　本明細書において、「炎症組織」とは、例えば、以下が例示的に挙げられる。
　・関節リウマチや変形性関節症における関節
　・気管支喘息やCOPDにおける肺（肺胞）
　・炎症性腸疾患やクローン病や潰瘍性大腸炎における消化器官
　・肝臓、腎臓、肺における線維化症における線維化組織
　・臓器移植における拒絶反応が起こっている組織
　・動脈硬化や心不全における血管、心臓（心筋）
　・メタボリック症候群における内臓脂肪
　・アトピー性皮膚炎その他皮膚炎における皮膚組織
　・椎間板ヘルニアや慢性腰痛における脊髄神経
　いくつかの種類の標的組織において、特異的に発現するもしくは特異的に活性化されるプロテアーゼまたは標的組織の疾患状態と関連すると考えられるプロテアーゼ（標的組織特異的プロテアーゼ）が知られている。例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが開示されている。また、また、J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul;6(7):541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4;17:23.、Dis Model Mech. 2014 Feb;7(2):193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):133-45.で炎症と関連すると考えられるプロテアーゼが開示されている。
　標的組織にて特異的に発現するプロテアーゼ以外に、標的組織で特異的に活性化されるプロテアーゼも存在する。例えば、プロテアーゼは不活性型で発現し、その後活性型となる場合があり、多くの組織では活性型プロテアーゼを阻害する物質が存在し、活性化のプロセスと阻害剤の存在によって活性がコントロールされている(Nat Rev Cancer. 2003 Jul;3(7):489-501.)。標的組織において、活性型プロテアーゼが阻害から逃れ、特異的に活性化されることがある。
　活性型プロテアーゼの測定方法は、活性化型のプロテアーゼを認識する抗体を用いる方法（PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.）やプロテアーゼが認識するペプチドを蛍光標識し、切断前は消光（クエンチ）しているが、切断後に発光する方法（Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.）を用いて測定されうる。
　一つの視点から、用語「標的組織特異的プロテアーゼ」は、
　(i) 標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(ii) 標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
　(iii) 標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(iv) 標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。
　限定して解釈されるものではないが、具体的なプロテアーゼとしては、システインプロテアーゼ（カテプシンファミリーＢ、Ｌ、Ｓなどを含む）、アスパルチルプロテアーゼ（カテプシンＤ、Ｅ、Ｋ、Ｏ等）、セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、カテプシンＡおよびＧ、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、エラスターゼ、プロテイナーゼ3、トロンビン、カリクレイン、トリプターゼ、キマーゼを含む）、メタロプロテアーゼ（膜結合型（ＭＭＰ１４－１７およびＭＭＰ２４－２５）および分泌型（ＭＭＰ１－１３およびＭＭＰ１８－２３およびＭＭＰ２６－２８）の両方を含むメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ１－２８）、プロテアーゼのＡディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、Ａディスインテグリンまたはトロンボスポンジンモチーフを有するメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、メプリン（メプリンα(meprin alpha)、メプリンβ（meprin beta）））、ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ）、ならびに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、レグマイン、TMPRSS3、TMPRSS4、好中球エラスターゼ（HNE）、ベータセクレターゼ（BACE）、線維芽細胞活性化蛋白質アルファ（FAP）、グランザイムB、 グアニジノベンゾアターゼ（GB）、ヘプシン、ネプリライシン、NS3/4A、HCV-NS3/4、カルパイン、ADAMDEC1、レニン、カテプシンC、カテプシンV/L2、カテプシン X/Z/P、クルジパイン、オツバイン2、カリクレイン関連ペプチダーゼ（KLKs（KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14））、骨形成タンパク質1（BMP-1）、活性化プロテインC、血液凝固関連プロテアーゼ（Factor VIIa、Factor IXa、Factor Xa、Factor XIa、Factor XIIa）、HtrA1、ラクトフェリン、マラプシン、PACE4、DESC1、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP-4）、TMPRSS2、カテプシンF、カテプシンH、カテプシンL2、カテプシンO、カテプシンS、グランザイムA、Gepsinカルパイン2、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2、AMSH-Like Proteases、AMSH、ガンマセクレターゼ、A抗プラスミン切断酵素（APCE）、Decysin 1、N-Acetylated Alpha-Linked Acidic Dipeptidase-Like 1（NAALADL1）、フーリン（furin）等が挙げられる。
　別の視点から、標的組織特異的プロテアーゼは、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼを指すことができる。
　癌組織特異的プロテアーゼとしては、例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で開示される癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが挙げられる。
　癌組織特異的プロテアーゼの種類は、治療対象の癌組織での発現の特異性が高いほど、副作用低減効果が得られる。癌組織特異的プロテアーゼは、癌組織における濃度が正常組織における濃度の５倍以上高いことが好ましく、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌組織における活性が正常組織における活性の２倍以上高いことが好ましく、３倍以上高いこと、４倍以上高いこと、５倍以上高いこと、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。
　また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が癌細胞に特異的であるためには、癌組織特異的プロテアーゼは癌組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「癌組織の近傍」とは、癌組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
　別の視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
　(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
　(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
　癌組織特異的プロテアーゼは、１種単独でもよく、２種以上が組み合せられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の癌種を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
　以上の観点から、癌組織特異的プロテアーゼとしては、上記例示したプロテアーゼの中でも、セリンプロテアーゼとメタロプロテアーゼが好ましく、マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、ウロキナーゼ（uPA）とメタロプロテアーゼがより好ましく、MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9が更に好ましい。
　炎症組織特異的プロテアーゼの種類は、治療対象の炎症組織での発現の特異性が高いほど、副作用低減効果が得られる。炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における濃度が正常組織における濃度の５倍以上高いことが好ましく、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における活性が正常組織における活性の２倍以上高いことが好ましく、３倍以上高いこと、４倍以上高いこと、５倍以上高いこと、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。
　また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が炎症細胞に特異的であるためには、炎症組織特異的プロテアーゼは炎症組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「炎症組織の近傍」とは、炎症組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
　別の視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
　(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
　(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
　炎症組織特異的プロテアーゼは、１種単独でもよく、２種以上が組み合せられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の病状を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
　以上の観点から、炎症組織特異的プロテアーゼとしては、上記例示したプロテアーゼの中でも、メタロプロテアーゼが好ましく、メタロプロテアーゼの中でも、ADAMTS5、MMP2、MMP7、MMP9、MMP13がより好ましい。
　プロテアーゼ切断配列は、水溶液中でポリペプチドが標的組織特異的プロテアーゼによって加水分解を受ける際に、該標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に認識される特定のアミノ酸配列である。
　プロテアーゼ切断配列は、副作用低減の点から、治療対象の標的組織／細胞においてより特異的に発現している、もしくは治療対象の標的組織／細胞においてより特異的に活性化されている標的組織特異的プロテアーゼにより、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列であることが好ましい。
　具体的なプロテアーゼ切断配列としては、例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で開示されている上記で例示した癌組織に特異的に発現するプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が挙げられる。既知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列に、適宜アミノ酸変異を導入する等、人工的に改変した配列も使用できる。また、プロテアーゼ切断配列は、Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)に記載のような当業者公知の方法で同定したものを用いてもよい。
　更に、天然に存在するプロテアーゼ切断配列を用いても良い。例えば、TGFβがプロテアーゼの切断を受けることで潜在型に変化するような、プロテアーゼの切断を受けることで分子形が変わるタンパク質中のプロテアーゼ切断を受ける配列を使用することもできる。
　プロテアーゼ切断配列の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015／116933号、国際公開WO2015／048329号、国際公開WO2016／118629号、国際公開WO2016／179257号、国際公開WO2016／179285号、国際公開WO2016／179335号、国際公開WO2016／179003号、国際公開WO2016／046778号、国際公開WO2016／014974号、米国特許公開US2016／0289324号、米国特許公開US2016／0311903号、PNAS (2000) 97: 7754-7759.、Biochemical Journal (2010) 426: 219-228.、Beilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373.中で示された配列を用いることができる。
　プロテアーゼ切断配列は、上述のように、好適な標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列であることがより好ましい。標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列の中でも、以下のアミノ酸配列が好ましい。
　LSGRSDNH（配列番号：３、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　PLGLAG（配列番号：３４、MMP2、MMP9により切断可能）
　VPLSLTMG（配列番号：３５、MMP7により切断可能）
　プロテアーゼ切断配列として、以下の配列を用いることもできる。
　TSTSGRSANPRG（配列番号：６６、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　ISSGLLSGRSDNH（配列番号：６７、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　AVGLLAPPGGLSGRSDNH（配列番号：６８、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　GAGVPMSMRGGAG（配列番号：６９、MMP1により切断可能）
　GAGIPVSLRSGAG（配列番号：７０、MMP2により切断可能）
　GPLGIAGQ（配列番号：７１、MMP2により切断可能）
　GGPLGMLSQS（配列番号：７２、MMP2により切断可能）
　PLGLWA（配列番号：７３、MMP2により切断可能）
　GAGRPFSMIMGAG（配列番号：７４、MMP3により切断可能） 
　GAGVPLSLTMGAG（配列番号：７５、MMP7により切断可能）
　GAGVPLSLYSGAG（配列番号：７６、MMP9により切断可能）
　AANLRN（配列番号：７７、MMP11により切断可能）
　AQAYVK（配列番号：７８、MMP11により切断可能）
　AANYMR（配列番号：７９、MMP11により切断可能）
　AAALTR（配列番号：８０、MMP11により切断可能）
　AQNLMR（配列番号：８１、MMP11により切断可能）
　AANYTK（配列番号：８２、MMP11により切断可能）
　GAGPQGLAGQRGIVAG（配列番号：８３、MMP13により切断可能）
　PRFKIIGG（配列番号：８４、pro-ウロキナーゼにより切断可能）
　PRFRIIGG（配列番号：８５、pro-ウロキナーゼにより切断可能）
　GAGSGRSAG（配列番号：８６、uPAにより切断可能）
　SGRSA（配列番号：８７、uPAにより切断可能）
　GSGRSA（配列番号：８８、uPAにより切断可能）
　SGKSA（配列番号：８９、uPAにより切断可能）
　SGRSS（配列番号：９０、uPAにより切断可能）
　SGRRA（配列番号：９１、uPAにより切断可能）
　SGRNA（配列番号：９２、uPAにより切断可能）
　SGRKA（配列番号：９３、uPAにより切断可能）
　QRGRSA（配列番号：９４、tPAにより切断可能）
　GAGSLLKSRMVPNFNAG（配列番号：９５、カテプシンＢにより切断可能）
　TQGAAA（配列番号：９６、カテプシンＢにより切断可能）
　GAAAAA（配列番号：９７、カテプシンＢにより切断可能）
　GAGAAG（配列番号：９８、カテプシンＢにより切断可能）
　AAAAAG（配列番号：９９、カテプシンＢにより切断可能）
　LCGAAI（配列番号：１００、カテプシンＢにより切断可能）
　FAQALG（配列番号：１０１、カテプシンＢにより切断可能）
　LLQANP（配列番号：１０２、カテプシンＢにより切断可能）
　LAAANP（配列番号：１０３、カテプシンＢにより切断可能）
　LYGAQF（配列番号：１０４、カテプシンＢにより切断可能）
　LSQAQG（配列番号：１０５、カテプシンＢにより切断可能）
　ASAASG（配列番号：１０６、カテプシンＢにより切断可能）
　FLGASL（配列番号：１０７、カテプシンＢにより切断可能）
　AYGATG（配列番号：１０８、カテプシンＢにより切断可能）
　LAQATG（配列番号：１０９、カテプシンＢにより切断可能）
　GAGSGVVIATVIVITAG（配列番号：１１０、カテプシンＬにより切断可能）
　APMAEGGG（配列番号：１１１、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　EAQGDKII（配列番号：１１２、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　LAFSDAGP（配列番号：１１３、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　YVADAPK（配列番号：１１４、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　RRRRR（配列番号：１１５、フーリンにより切断可能）
　RRRRRR（配列番号：１１６、フーリンにより切断可能）
　GQSSRHRRAL（配列番号：１１７、フーリンにより切断可能）
　SSRHRRALD（配列番号：１１８）
　RKSSIIIRMRDVVL（配列番号：１１９、プラスミノーゲン（Plasminogen）により切断可能）
　SSSFDKGKYKKGDDA（配列番号：１２０、Staphylokinaseにより切断可能）
　SSSFDKGKYKRGDDA（配列番号：１２１、Staphylokinaseにより切断可能）
　IEGR（配列番号：１２２、FactorIXaにより切断可能）
　IDGR（配列番号：１２３、FactorIXaにより切断可能）
　GGSIDGR（配列番号：１２４、FactorIXaにより切断可能）
　GPQGIAGQ（配列番号：１２５、Collagenaseにより切断可能）
　GPQGLLGA（配列番号：１２６、Collagenaseにより切断可能）
　GIAGQ（配列番号：１２７、Collagenaseにより切断可能）
　GPLGIAG（配列番号：１２８、Collagenaseにより切断可能）
　GPEGLRVG（配列番号：１２９、Collagenaseにより切断可能）
　YGAGLGVV（配列番号：１３０、Collagenaseにより切断可能）
　AGLGVVER（配列番号：１３１、Collagenaseにより切断可能）
　AGLGISST（配列番号：１３２、Collagenaseにより切断可能）
　EPQALAMS（配列番号：１３３、Collagenaseにより切断可能）
　QALAMSAI（配列番号：１３４、Collagenaseにより切断可能）
　AAYHLVSQ（配列番号：１３５、Collagenaseにより切断可能）
　MDAFLESS（配列番号：１３６、Collagenaseにより切断可能）
　ESLPVVAV（配列番号：１３７、Collagenaseにより切断可能）
　SAPAVESE（配列番号：１３８、Collagenaseにより切断可能）
　DVAQFVLT（配列番号：１３９、Collagenaseにより切断可能）
　VAQFVLTE（配列番号：１４０、Collagenaseにより切断可能）
　AQFVLTEG（配列番号：１４１、Collagenaseにより切断可能）
　PVQPIGPQ（配列番号：１４２、Collagenaseにより切断可能）
　LVPRGS（配列番号：１４３、Thrombinにより切断可能）
　TSTSGRSANPRG（配列番号：３４５）
　本発明の一実施態様において、プロテアーゼ切断配列のどちらか一端または両端に、可動リンカーを更に付加している。プロテアーゼ切断配列の一端の可動リンカーを第一可動リンカーと呼称することが出来、他端の可動リンカーを第二可動リンカーと呼称することが出来る。特定の実施形態では、プロテアーゼ切断配列と可動リンカーは以下の式のうちの一つを含む。
　　　（プロテアーゼ切断配列）
　　　（第一可動リンカー）-（プロテアーゼ切断配列）
　　　（プロテアーゼ切断配列）-（第二可動リンカー）
　　　（第一可動リンカー）-（プロテアーゼ切断配列）-（第二可動リンカー）
　本実施態様における可動リンカーはペプチドリンカーが好ましい。第一可動リンカーと第二可動リンカーは、それぞれ独立かつ任意的に存在し、少なくとも１つのフレキシブルアミノ酸（Ｇｌｙなど）を含む同一または異なる可動リンカーである。例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得られるほどの十分な数の残基（Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなど）が含まれる。
　プロテアーゼ切断配列の両端で使用するのに適した可動リンカーは通常、プロテアーゼ切断配列へのプロテアーゼのアクセスを向上し、プロテアーゼの切断効率を上昇させるものである。好適な可動リンカーは容易に選択可能であり、１アミノ酸（Ｇｌｙなど）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸あるいは、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸をはじめとして３アミノ酸から１２アミノ酸など、異なる長さのうちからの好適なものを選択できる。本発明のいくつかの実施態様においては、可動リンカーは１から７アミノ酸のペプチドリンカーである。
　可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ：配列番号：４５）ｎおよび（ＧＧＧＳ：配列番号：３６）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、従来技術において周知の他の可動リンカーが挙げられる。
　このうちグリシンおよびグリシン－セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
　グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
　Ser
　Gly・Ser（GS）
　Ser・Gly（SG）
　Gly・Gly・Ser（GGS）
　Gly・Ser・Gly（GSG）
　Ser・Gly・Gly（SGG）
　Gly・Ser・Ser（GSS）
　Ser・Ser・Gly（SSG）
　Ser・Gly・Ser（SGS）
　Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS、配列番号：３６）
　Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG、配列番号：３７）
　Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG、配列番号：３８）
　Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG、配列番号：３９）
　Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG、配列番号：４０）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：４１）
　Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG、配列番号：４２）
　Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG、配列番号：４３）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG、配列番号：４４）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS、配列番号：４５）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：４６）
　Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG、配列番号：４７）
　Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG、配列番号：４８）
　Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG、配列番号：４９）
　Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG、配列番号：５０）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS、配列番号：５１）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG、配列番号：５２）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS、配列番号：５３）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG、配列番号：５４）
　(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：４１）)n
　(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：４６）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLを含む。VHとVLを含むリガンド結合分子の例として、それだけに限定されないが、例えば、Fv、scFv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、完全抗体等が挙げられる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子はFc領域を含む。IgG抗体のFc領域を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのFc領域を用いることが可能である。例えば、配列番号：５５、５６、５７、５８で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体を用いることが可能である。また、本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体定常領域を含む。
　本発明のより具体的ないくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体である。リガンド結合分子として抗体を使用する場合、リガンドへの結合は可変領域により実現される。更に具体的ないくつかの実施態様において、リガンド結合分子はIgG抗体である。リガンド結合分子としてIgG抗体を使用する場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などを使用することが出来る。リガンド結合分子としてIgG抗体を使用する場合でも、リガンドへの結合は可変領域により実現され、IgG抗体の二つの可変領域の片方でも両方でも、リガンドへの結合を実現できる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子中の切断サイト／プロテアーゼ切断配列が切断されることで、リガンド結合分子中のリガンド結合活性を有するドメインが分断され、リガンドへの結合が減弱される。例えば、リガンド結合分子としてIgG抗体を使用する場合、抗体可変領域中に切断サイト／プロテアーゼ切断配列を設け、切断状態においては、完全なる抗体可変領域を形成できなくなり、リガンドへの結合が減弱される実施態様が挙げられる。
　本明細書における「会合」とは、例えば、２以上のポリペプチド領域が相互作用する状態を指すものと換言することができる。一般的に、対象となるポリペプチド領域の間に、疎水結合、水素結合、イオン結合等が作られ会合体が形成される。よく見る会合の一つの例として、天然型抗体を代表とする抗体においては、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）が両者間の非共有結合等によりペアリング構造を保持することが知られている。 
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子に含まれるVHとVLは会合する。また、抗体VHと抗体VLの会合は、例えば切断サイト／プロテアーゼ切断配列の切断により解消可能である。会合の解消とは、例えば、２以上のポリペプチド領域の相互作用状態の全部もしくは一部が解消されると換言することができる。VHとVLの会合の解消とは、VHとVLの相互作用が全部解消されても、VHとVLの相互作用の中の一部が解消されても良い。
　本発明のリガンド結合分子には、リガンド結合分子中の抗体VLもしくはその一部と抗体VHもしくはその一部との会合が、切断サイトが切断されることにより解消される、またはプロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消されるリガンド結合分子が包含される。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子が抗体VHと抗体VLを含み、リガンド結合分子の切断サイト／プロテアーゼ切断配列が切断されてない状態において、リガンド結合分子中の抗体VHと抗体VLは会合しており、切断サイト／プロテアーゼ切断配列の切断により、リガンド結合分子中の抗体VHと抗体VLの会合が解消される。リガンド結合分子中の切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、切断されることによってリガンド結合分子のリガンドへの結合を減弱できる限り、リガンド結合分子中のどの位置に配置されても良い。
　本発明の更なるいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体VHと抗体VLと抗体定常領域を含む。
　抗体のVHとVL、CHとCLは、Rothlisbergerら（J Mol Biol. 2005 Apr 8;347(4):773-89.）により述べられているようにドメイン間で多くのアミノ酸側鎖を介して相互作用していることが知られている。VH-CH1とVL-CLはFabドメインとして安定した構造を形成することが出来ることが知られているが、報告されている通りVHとVLの間のアミノ酸側鎖は一般的には10-5Mから10-8M範囲の解離定数で相互作用しており、VHドメインとVLドメインのみが存在する場合では会合状態を形成している割合は少ないと考えられる。
　本発明のいくつかの実施態様において、抗体VHと抗体VLを含むリガンド結合分子に切断サイト／プロテアーゼ切断配列が設けられ、切断前には、Fab構造において重鎖-軽鎖相互作用のすべてが二つのペプチド間で存在することに対し、切断サイト／プロテアーゼ切断配列を切断した際、VH（またはVHの一部）を含むペプチドとVL（またはVLの一部）を含むペプチドとの間の相互作用が減弱され、VHとVLの会合は解消されるリガンド結合分子が設計された。
　本発明の一実施態様においては、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体定常領域内に位置する。より具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体重鎖定常領域中の１４０番（EUナンバリング）アミノ酸より可変領域側、好ましくは、抗体重鎖定常領域中の１２２番（EUナンバリング）アミノ酸より可変領域側に位置する。いくつか具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体重鎖定常領域１１８番アミノ酸（EUナンバリング）から抗体重鎖定常領域１４０番アミノ酸（EUナンバリング）までの配列中の任意の位置に挿入される。別のより具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体軽鎖定常領域中の１３０番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１３０番）アミノ酸より可変領域側、好ましくは、抗体軽鎖定常領域中の１１３番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１３番）アミノ酸より可変領域側、抗体軽鎖定常領域中の１１２番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１２番）アミノ酸より可変領域側に位置する。いつくか具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体軽鎖定常領域１０８番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１０８番）から抗体軽鎖定常領域１３１番アミノ酸（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１３１番）までの配列中の任意の位置に挿入される
　本発明の一実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VH内または抗体VL内に位置する。より具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VHの7番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、好ましくは、抗体VHの40番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、より好ましくは、抗体VHの１０１番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側に、更に好ましくは、抗体VHの１０９番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側に、抗体VHの１１１番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側に位置する。より具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VLの7番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、好ましくは、抗体VLの３９番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、より好ましくは、抗体VLの96番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、更に好ましくは、抗体VLの１０４番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側、抗体VLの１０５番（Kabatナンバリング）アミノ酸より抗体定常領域側に位置する。
　いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VHまたは抗体VL中のループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置に挿入される。抗体VHまたは抗体VL中のループ構造とは、抗体VHまたは抗体VLの中で、α－へリックス、β－シード等の二次的構造を形成しない部分を言う。ループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置は、具体的に：抗体VH７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、抗体VL７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの範囲を指すことができる。
　いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体VH７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列中の任意位置に挿入される。
　いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、抗体VL７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列中の任意位置に挿入される。
　本発明の一実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VHと抗体定常領域の境界付近に位置する。抗体VHと抗体重鎖定常領域の境界付近とは、抗体VHの１０１番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１４０番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは抗体VHの１０９番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１２２番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことができ、または抗体VHの１１１番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１２２番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことが出来る。また、抗体VHと抗体軽鎖定常領域を連結している場合、抗体VHと抗体軽鎖定常領域の境界付近とは、抗体VHの１０１番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１３０番（EUナンバリング（Kabatナンバリング１３０番））のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは抗体VHの１０９番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１１３番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１３番）のアミノ酸の間を指すことができ、または抗体VHの１１１番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１１２番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１２番）のアミノ酸の間を指すことが出来る。
　一実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は抗体VLと抗体定常領域の境界付近に位置する。抗体VLと抗体軽鎖定常領域の境界付近とは、抗体VLの９６番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１３０番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１３０番）のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは抗体VLの１０４番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１１３番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１３番）のアミノ酸の間を指すことができ、または抗体VLの１０５番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体軽鎖定常領域１１２番（EUナンバリング）（Kabatナンバリング１１２番）のアミノ酸の間を指すことが出来る。抗体VLと抗体重鎖定常領域を連結している場合、抗体VLと抗体重鎖定常領域の境界付近とは、抗体VLの９６番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１４０番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことができ、好ましくは抗体VLの１０４番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１２２番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことができ、または抗体VLの１０５番（Kabatナンバリング）のアミノ酸から抗体重鎖定常領域１２２番（EUナンバリング）のアミノ酸の間を指すことが出来る。
　切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、リガンド分子中に複数設けられることが出来、例えば、抗体定常領域内、抗体VH内、抗体VL内、抗体VHと抗体定常領域の境界付近、抗体VLと抗体定常領域の境界付近から選ばれる複数個所に設けることが出来る。また、本発明に触れた当業者であれば、抗体VHと抗体VLを入れ替える等、抗体VHと抗体VLと抗体定常領域を含む分子の形を変更することは可能であり、当該分子形は本発明の範囲から逸脱しない。
　本明細書において、用語「リガンド」は生物活性を有する分子である。生物活性を有する分子は通常、細胞表面の受容体と相互作用し、それにより生物学的に刺激、阻害、または他の様式で変調することによって機能し、これらは通常は前記受容体を保有する細胞内のシグナル伝達経路に関与すると思われる。
　本明細書においてリガンドには、生体分子と相互作用することにより生物活性を発揮する所望の分子が包含される。例えばリガンドは、受容体に相互作用する分子を意味するだけでなく、当該分子に相互作用することにより生物活性を発揮する分子もリガンドであって、例えば当該分子に相互作用する受容体や、その結合断片などもリガンドに含まれる。例えば、受容体として知られるタンパク質のリガンド結合部位や、当該受容体が他の分子と相互作用する部位を含むタンパク質は、本発明においてリガンドに含まれる。具体的には、可溶性受容体、受容体の可溶性断片、膜貫通型受容体の細胞外ドメイン、およびそれらを含むポリペプチドなどは、本発明においてリガンドに含まれる。
　本発明のリガンドは通常、一つまたは複数の結合パートナーに結合することで、望ましい生物活性を発揮することが出来る。リガンドの結合パートナーは、細胞外、細胞内、または膜貫通タンパク質であることができる。一つの実施形態において、リガンドのその結合パートナーは、細胞外タンパク質、たとえば可溶性受容体である。別の実施形態において、リガンドの結合パートナーは、膜結合型受容体である。
　本発明のリガンドは、その結合パートナーに１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、または０．１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で特異的に結合することができる。
　生物活性を有する分子の例として、それだけに限定されないが、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、成長因子、アポトーシス誘導因子、PAMPｓ、DAMPｓ、核酸、またはそれらのフラグメントが挙げられる。詳細な実施形態においては、リガンドとして、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、TGF-βファミリー、マイオカイン、アディポカイン、または神経栄養因子が使用され得る。より詳細な実施形態においては、リガンドとして、CXCL10、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-g、MIG、I-TAC、RANTES、MIP-1a、またはMIP-1bが使用され得る。
　ケモカインは、７～１６ｋＤａの間の均質な血清タンパク質のファミリーであり、元来、白血球の遊走を誘導するその能力を特徴とした。ほとんどのケモカインは、４つの特徴的なシステイン（Ｃｙｓ）を有し、最初の２つのシステインによって示されるモチーフによって、ＣＸＣ、又はアルファ、ＣＣ又はベータ、Ｃ又はガンマ及びＣＸ３Ｃ又はデルタのケモカインクラスに分類されている。２つのジスルフィド結合は、第１と第３のシステインの間、及び第２と第４のシステインの間に形成される。一般に、ジスルフィド架橋は必要であると考えられ、Clark-Lewisと共同研究者らは、少なくともCXCL10についてはジスルフィド結合は、ケモカイン活性に決定的であることを報告した（Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. 269:16075-16081, 1994）。４つのシステインを有することに対する唯一の例外は、リンホタクチンであり、システイン残基を２つしか有さない。従って、リンホタクチンは、１つだけのジスルフィド結合によって機能的構造をなんとか保持する。
　さらに、ＣＸＣ又はアルファのサブファミリーは、第１のシステインに先行するＥＬＲモチーフ（Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ）の存在によって２つの群：ＥＬＲ-ＣＸＣケモカイン及び非ＥＬＲ-ＣＸＣケモカインに分類されている（たとえば、Clark-Lewis, 上記、 及びBelperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis（脈管形成におけるＣＸＣケモカイン）," J. Leukoc. Biol. 68:1-8, 2000を参照）。
　インターフェロン誘導性のタンパク質-１０（ＩＰ-１０又はＣＸＣＬ１０）は、インターフェロン-γ及びＴＮＦ-αによって誘導され、角化細胞、内皮細胞、線維芽細胞及び単球によって産生される。ＩＰ-１０は、組織炎症部位への活性化Ｔ細胞の動員において役割を担っていると考えられる（Dufour, et al., "IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking（ＩＦＮγが誘導可能なタンパク質-１０（ＩＰ-１０：ＣＸＣＬ１０）欠損マウスは、エフェクターＴ細胞の生成及び輸送におけるＩＰ-１０の役割を明らかにする）," J Immunol., 168:3195-204, 2002）。さらに、ＩＰ-１０は、過敏反応に役割を担っている可能性がある。また、炎症性脱髄神経障害の発生にも役割を担っている可能性がある（Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10（炎症性脱髄神経障害におけるケモカイン及びケモカイン受容体：ＩＰ-１０の中心的役割）," Brain 125:823-34, 2002）。
　研究によって、ＩＰ-１０は、移植に続く幹細胞の生着（Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72:408-11, 2000）、幹細胞の動員（Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10:229-36, 2001; Hattori et al., Blood 97:3354-59, 2001）及び抗腫瘍免疫の亢進（Nomura et al., Int. J. Cancer 91:597-606, 2001; Mach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12:571-75, 2000）に有用である可能性があることが示されている。たとえば、当業者に既知の報告の中で、ケモカインの生物活性が議論されている（Bruce, L. et al., "Radiolabeled Chemokine binding assays（放射性標識ケモカイン結合アッセイ）," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp129-134, Raphaele, B. et al. "Calcium Mobilization," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp143-148, Paul D. Ponath et al., "Transwell Chemotaxis," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp113-120 Humana Press. Totowa, New Jersey）。
　CXCL10の生物活性として、たとえば、CXCL10受容体（ＣＸＣＲ３）への結合、CXCL10誘導性カルシウム流、CXCL10誘導性細胞走化性、グリコサミノグリカンへのCXCL10の結合およびCXCL10オリゴマー化が挙げられる。
　CXCL10の生理活性を測定する方法として、CXCL10の細胞遊走活性を測定する方法、CXCR3安定発現細胞株を用いたReporter assay（PLoS One. 2010 Sep 13;5(9):e12700.参照）、GPCRシグナル伝達初期に誘導されるB-Arrestin recruitmentを利用したPathHunterTM β-Arrestin recruitment assay等が挙げられる。
　インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、ジスルフィド結合されている３０と４０ｋＤのグリコシル化ポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体のサイトカインである。サイトカインは、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞および角化細胞ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む抗原提示細胞によって合成され、そして分泌される。ＩＬ－１２は、種々の生物学的プロセスを媒介し、そしてＮＫ細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、Ｔ細胞刺激因子、細胞障害Ｔリンパ球成熟因子およびＥＢＶ－形質転換されたＢ細胞系因子として言及されてきた。
　インターロイキン１２は、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の細胞質膜に発現されたＩＬ－１２受容体に結合し、それによって生物学的プロセスを変える（例えば、開始、阻止する）ことができる。例えば、ＩＬ－１２受容体へのＩＬ－１２の結合は、前活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激し、細胞障害性のＴ細胞（ＣＴＬ）、ＮＫ細胞およびＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞の細胞溶解活性を増進し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるγインターフェロン（ＩＦＮγ）の生産を誘導し、そしてＩＦＮγおよびＩＬ－２を生産するＴｈ１細胞へのナイーブＴｈ０細胞(ｎａｉｖｅ  Ｔｈ０  ｃｅｌｌ)の分化を誘導する。特に、ＩＬ－１２は、細胞溶解細胞（例えばＮＫ、ＣＴＬ）の生成および細胞性免疫応答（例えば、Ｔｈ１細胞媒介の免疫応答）を設定するのに絶対に必要である。かくして、ＩＬ－１２は、予防免疫（例えば、感染症の根絶）と病理学的免疫応答（例えば、自己免疫）の両方の生成および調節において絶対的に重要である。
　IL12の生理活性を測定する方法として、IL12の細胞増殖活性の測定、STAT4 レポーターアッセイ、IL12による細胞活性化（細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生等）、IL12による細胞分化の促進等を測定する方法が挙げられる。
　タンパク質のＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １（ＰＤ－１）は、ＣＤ２８ファミリーレセプターの阻害メンバーであり、ＣＤ２８ファミリーには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現する（Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：３９１７７９－８２、Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。当該ファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体添加後のＴ細胞増殖上昇に及ぼす機能的影響により発見された（Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３－２６６、Ｈａｎｓｅｎら（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ １０：２４７－２６０）。ＰＤ－１は、アポトーシス細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ． １１：３８８７－９５）。当該ファミリーの他のメンバーであるＣＴＬＡ－４とＢＴＬＡは、それぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球とＴＨ１細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ－４は全て、対になっていないシステイン残基を有しており、それらはホモダイマー化を可能にする。対照的に、ＰＤ－１はモノマーとして存在すると考えられており、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な対になっていないシステインを有していない。
　ＰＤ－１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１は、膜近位免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位のチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＰＤ－１は、ＣＴＬＡ－４に構造的に類似しているが、Ｂ７－１およびＢ７－２結合に重要なＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号：537）を欠損している。ＰＤ－１に対する２個のリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２が同定されており、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を負に制御することが明らかとなっている（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４、Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８、Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は両者ともに、ＰＤ－１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ－１の一つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、様々なヒト癌に豊富に存在している（Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用の結果、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプター媒介性増殖の低下、および癌性細胞による免疫回避が起こる（Ｄｏｎｇら（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ． ８１：２８１－７、Ｂｌａｎｋら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５４：３０７－３１４、Ｋｏｎｉｓｈｉら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１の局所的相互作用を阻害することにより回復でき、ＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－２との相互作用が同様に阻害される時、その効果は付加的である（Ｉｗａｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１２２９３－７、Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７－６６）。
　ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現するＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ－１欠損動物は、自己免疫性心筋症および関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む様々な自己免疫性表現型を発症する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２）。さらに、ＰＤ－１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性ループスエリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎に重要な役割を果たすことがわかった（Ｓａｌａｍａら（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８、ＰｒｏｋｕｎｉａおよびＡｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３、Ｎｉｅｌｓｅｎら（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ－１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ媒介Ｃａ２＋の流れおよび下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を阻害する際に必須であることが明らかになった（Ｏｋａｚａｋｉら（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１）。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはサイトカインである。
　サイトカインは、免疫調節性および炎症性の過程に関与する分泌型細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーであり、これは神経システムのグリア細胞によっておよび免疫システムの多数の細胞によって分泌される。サイトカインは、タンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質に分類することができ、大きくて多様な調節因子ファミリーを包含する。サイトカインは細胞表面受容体に結合して細胞内シグナル伝達を誘発し、これによって酵素の活性調節、いくつかの遺伝子およびその転写因子の上方制御もしくは下方制御、またはフィードバック阻害等が起こりうる。
　いくつかの実施態様において、本発明のサイトカインは、インターロイキン(IL)およびインターフェロン(IFN)などの免疫調節因子を含む。適したサイトカインは以下のタイプの1つまたは複数由来のタンパク質を含むことができる：4つのα-ヘリックスバンドルファミリー(これはIL-2サブファミリー、IFNサブファミリーおよびIL-10サブファミリーを含む); IL-1ファミリー(これはIL-1およびIL-8を含む)、ならびにIL-17ファミリー。サイトカインは、細胞免疫反応を増強する1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TGF-βなど)、または抗体反応に有利に働く2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-10、IL-13など)に分類されるものを含むこともできる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはケモカインである。ケモカインは一般に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に動員させる化学誘引物質として作用する。これは、他の免疫系成分を治療部位に動員させる目的で、特定のケモカイン遺伝子を例えばサイトカイン遺伝子とともに発現させるためには有益と考えられる。このようなケモカインには、CXCL10、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-βが含まれる。当業者には、ある種のサイトカインも化学誘引作用を有することが知られていて、それらをケモカインという用語で分類しうることを認識していると考えられる。
　また、本発明のいくつかの実施態様において、リガンドとしてサイトカイン、ケモカイン等の改変体（例：Annu Rev Immunol. 2015;33:139-67.）やそれらを含む融合タンパク質（例：Stem Cells Transl Med. 2015 Jan; 4(1): 66-73.）を使用することができる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはCXCL10、PD1、IL12、IL6Rから選ばれる。前記CXCL10、PD1、IL12、IL6Rは、天然に存在するCXCL10、PD1、IL12、IL6Rと同じ配列を有していても良く、天然に存在するCXCL10、PD1、IL12、IL6Rと配列が異なるが対応する天然のリガンドを有する生理的活性を保持している改変体であってもよい。リガンドの改変体を取得するには、様々な目的で人為的にリガンド配列を加えてもよく、好ましくはプロテアーゼ切断を受けない（プロテアーゼ抵抗性の）改変を加えることでリガンドの改変体を取得する。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドは未切断のリガンド結合分子と結合することでその生物活性が阻害される。リガンドの生物活性が阻害される実施態様は限定されないが、その例として、例えば、未切断のリガンド結合分子とリガンドの結合は、リガンドとその結合パートナーの結合を実質的または有意的に妨害または競合する実施態様が挙げられる。リガンド結合分子としてリガンド中和活性を有する抗体またはその断片を使用する場合、リガンドと結合したリガンド結合分子がその中和活性を発揮することでリガンドの生物活性が阻害されることが可能である。
　本発明の一実施態様において、未切断のリガンド結合分子は、リガンドと結合することによりリガンドの生物活性を十分に中和できることが好ましい。即ち、未切断のリガンド結合分子と結合しているリガンドの生物活性が、未切断のリガンド結合分子と結合していないリガンドの生物活性より低いことが好ましい。これに限定されるものではないが、例えば未切断のリガンド結合分子と結合しているリガンドの生物活性が、未切断のリガンド結合分子と結合していないリガンドの生物活性に比較して、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であってよい。リガンドの生物活性を十分に中和することにより、リガンド結合分子を投与した場合、標的組織に到達前にリガンドが生物活性を発揮してしまうことを防ぐことが期待できる。
　また本発明の一実施態様において、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する結合活性は、リガンドに対する生体内の天然の結合パートナー（例えばリガンドに対する天然の受容体）のリガンドに対する結合活性よりも低いことが好ましい。これに限定されるものではないが、例えば切断されたリガンド結合分子とリガンドの結合活性は、生体内における天然の結合パートナーとリガンドの結合量（単位結合パートナーあたり）に比較して、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合量を示す。結合活性の指標は適宜所望の指標を用いてよいが、例えば解離定数（ＫＤ）を用いてよい。結合活性の評価指標として解離定数（KD）を用いる場合、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、生体内における天然の結合パートナーのリガンドに対する解離定数（KD）に比較して大きいことが、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する結合活性が生体内における天然の結合パートナーに比較して弱いことを示す。切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）は、生体内における天然の結合パートナーのリガンドに対する解離定数（KD）に比較して、例えば１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、特に好ましくは１００倍以上である。切断後のリガンド結合分子がリガンドに対して低い結合活性しか持たない、もしくはリガンドに対して結合活性をほぼ持たないことにより、リガンド結合分子が切断された後リガンドを遊離させることを保証し、また別のリガンド分子と再度結合してしまうことを防ぐことが期待できる。
　リガンド結合分子が切断された後、抑制されたリガンドの生物活性が回復することが望ましい。切断されたリガンド結合分子のリガンドへの結合が減弱されることで、リガンド結合分子のリガンド生物活性阻害機能も減弱されることが望ましい。当業者は、リガンドの生物活性を既知の方法、例えば、リガンドとその結合パートナーとの結合を検出する方法で確認することが出来る。
　本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子は、抗原抗体結合によりリガンドと複合体を形成する。より具体的な実施態様において、リガンド結合分子とリガンドとの複合体は、リガンド結合分子とリガンドの非共有結合、例えば抗原抗体結合により形成されている。
　本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子はリガンドと融合され、融合タンパク質を形成した上、当該融合タンパク質内のリガンド結合分子部分とリガンド部分が更に抗原抗体結合により相互作用している。リガンド結合分子とリガンドは、リンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合され得る。融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドはリンカーを介してまたは介さずに融合されている場合でも、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は依然として存在する。言い換えれば、リガンド結合分子がリガンドと融合されている実施態様においても、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は、リガンド結合分子とリガンドが融合されていない実施態様と類似する。リガンド結合分子が切断されることにより、その非共有結合が減弱する。すなわち、リガンド結合分子とリガンドとの結合は減弱することになる。
　本発明の好ましい一実施態様においては、リガンド結合分子とリガンドをリンカーを介して融合させる。リガンド結合分子とリガンドを融合させるとき用いられるリンカーとして、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本実施態様においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。例として、それだけに限定されないが、例えば、ペプチドリンカーの場合：
　Ser
　Gly・Ser（GS）
　Ser・Gly（SG）
　Gly・Gly・Ser（GGS）
　Gly・Ser・Gly（GSG）
　Ser・Gly・Gly（SGG）
　Gly・Ser・Ser（GSS）
　Ser・Ser・Gly（SSG）
　Ser・Gly・Ser（SGS）
　Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS、配列番号：３６）
　Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG、配列番号：３７）
　Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG、配列番号：３８）
　Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG、配列番号：３９）
　Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG、配列番号：４０）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：４１）
　Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG、配列番号：４２）
　Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG、配列番号：４３）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG、配列番号：４４）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS、配列番号：４５）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：４６）
　Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG、配列番号：４７）
　Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG、配列番号：４８）
　Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG、配列番号：４９）
　Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG、配列番号：５０）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS、配列番号：５１）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG、配列番号：５２）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS、配列番号：５３）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG、配列番号：５４）
　(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：４１）)n
　(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：４６）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
　合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
　また本発明は、本発明のリガンド結合分子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）、本発明のリガンド結合分子とリガンドと医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）、本発明のリガンド結合分子とリガンドが融合されている融合タンパク質と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）にも関する。
　本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、それだけに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの実施態様において、本発明のリガンド結合分子は、リガンドの生物活性を制御することができ、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤をいう。
　また、本発明において、「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。
　「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子とリガンドを治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。
　「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語は、「融合タンパク質を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造における融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するための融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子を含む組成物を個体に投与することが出来る。個体に投与されたリガンド結合分子は、個体内、例えば、血中、組織中等で、個体内に元々存在しているリガンドと結合し、リガンドと結合したまま更に生体内で運搬される。標的組織に運搬されたリガンド結合分子は、標的組織にて切断され、リガンドに対する結合が減弱し、標的組織にて結合しているリガンドをリリースすることが出来る。リリースされたリガンドは、標的組織にて生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子を含む組成物と、リガンドを含む組成物を別々にまたは同時に個体に投与することが出来る。また、リガンド結合分子とリガンドの両方を含む組成物を個体に投与するもできる。リガンド結合分子とリガンドの両方を含む組成物を個体に投与する場合、当該組成物中のリガンド結合分子とリガンドは複合体を形成していても良い。リガンド結合分子とリガンドの両方を個体に投与した場合、リガンド結合分子は、個体に投与されたリガンドと結合し、リガンドを結合したまま生体内で運搬される。標的組織に運搬されたリガンド結合分子は、標的組織にて切断され、リガンドに対する結合が減弱し、標的組織にて結合しているリガンドをリリースすることが出来る。リリースされたリガンドは、標的組織にて生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。個体に投与されたリガンド結合分子は、個体に投与されたリガンド以外に、個体内に元々存在するリガンドとも結合することも可能であり、個体内に元々存在するリガンドまたは個体に投与されたリガンドを結合したまま生体内で運搬することが出来る。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子とリガンドを融合した融合タンパク質を個体に投与することが出来る。当該いくつかの実施態様において、融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドはリンカーを介してまたは介さずに融合タンパク質を形成しているが、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は依然として存在する。リガンド結合分子とリガンドを融合した融合タンパク質を個体に投与した場合、融合タンパク質は生体内で運搬され、標的組織で融合タンパク質中のリガンド結合分子部分が切断されることにより、リガンド結合分子部分のリガンドに対する非共有結合が減弱され、リガンド及びリガンド結合分子の一部が融合タンパク質からリリースされる。リリースされたリガンド及びリガンド結合分子の一部は、標的組織にてリガンドの生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時の融合タンパク質中のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法を用いて製剤化され得る。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用され得る。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化され得る。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定される。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施にしたがって処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適切な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）が併用され得る。
　油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填される。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物が投与される。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。リガンド結合分子を含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量が設定され得るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
　本発明は、切断された状態でリガンドへの結合が減弱されるリガンド結合分子、または当該リガンド結合分子とリガンドを融合させた融合タンパク質を製造する方法にも関する。本発明の一実施態様において、リガンドに結合可能な分子中に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含むリガンド結合分子または融合タンパク質の製造方法が提供される。
　リガンドに結合可能な分子中にプロテアーゼ切断配列を導入する方法の例として、リガンドに結合可能なポリペプチドのアミノ酸配列中にプロテアーゼ切断配列を挿入する方法や、リガンドに結合可能なポリペプチドのアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列に置き換える方法等が挙げられる。
　リガンドに結合可能な分子を取得する方法の例として、リガンドに結合する能力を有するリガンド結合領域を取得する方法が挙げられる。リガンド結合領域は、例えば、公知の抗体の作製方法を用いた方法により得られる。
　該作製方法により得られた抗体は、そのままリガンド結合領域に用いてもよく、得られた抗体のうちFv領域のみを用いてもよく、該Fv領域が一本鎖（「sc」とも称する。）で抗原を認識し得る場合には、該一本鎖のみを用いてもよい。また、Fv領域を含むFab領域を用いてもよい。
　具体的な抗体の作製方法は当業者によく知られているが、例えばモノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）、組換え方法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、単一のB細胞クローンから単離してもよい (N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011))。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、例えばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、例えばOverlap Extension PCRが公知である。
　３つのCDRと４つのFRが連結された抗体可変領域をコードするDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許出願公開第２３９４００号明細書、国際公開第１９９６/００２５７６号参照）。
　必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。
　ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開第１９９３／０１２２２７号、国際公開第１９９２／００３９１８号、国際公開第１９９４／００２６０２号、国際公開第１９９４／０２５５８５号、国際公開第１９９６／０３４０９６号、国際公開第１９９６／０３３７３５号参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
　さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のFv領域が一本鎖抗体（「scFv」とも称する。）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のFv領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該Fv領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開第１９９２／００１０４７号、国際公開第１９９２／０２０７９１号、国際公開第１９９３／００６２１３号、国際公開第１９９３／０１１２３６号、国際公開第１９９３/０１９１７２号、国際公開第１９９５／００１４３８号、国際公開第１９９５/０１５３８８号参照）。
　リガンドに結合可能な分子にプロテアーゼ切断配列を導入した分子は、本発明のリガンド結合分子になる。リガンド結合分子に対して、任意的に、当該プロテアーゼ切断配列に対応するプロテアーゼの処理によりリガンド結合分子が切断されるかを確認することが出来る。例えば、リガンドに結合可能な分子にプロテアーゼ切断配列を導入した分子をプロテアーゼと接触させ、プロテアーゼ処理後産物の分子量をSDS-PAGE等の電気泳動法で確認することにより、プロテアーゼ切断配列が切断されたか否かを確認することができる。
　また、本発明は、切断された状態でリガンドへの結合が減弱されるリガンド結合分子をエンコードするポリヌクレオチド、または当該リガンド結合分子とリガンドを融合させた融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドにも関する。
　本発明におけるポリヌクレオチドは、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でリガンド結合分子を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
　上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。リガンド結合分子または融合タンパク質を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
　宿主細胞において発現したリガンド結合分子または融合タンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のリガンド結合分子または融合タンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルは目的のリガンド結合分子または融合タンパク質に対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
　上記製造方法におけるリガンド結合分子または融合タンパク質の回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にリガンド結合分子または融合タンパク質を回収する。
　組換え細胞培養物から本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質を回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
　本明細書に記載の１又は複数の実施態様を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当業者には当然に理解される。また、本明細書に記載の１又は複数の実施態様を任意に組み合わせたものを本発明から除外した発明も、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本明細書において意図され、記載された発明とみなされるべきものである。
　以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
実施例１　既報のイムノサイトカインおよびプロテアーゼ活性化サイトカインの課題
　癌組織に発現する抗原を標的としたイムノサイトカインは一般にターゲッティングさせるIgGやscFvの末端に目的のサイトカインを融合させることで作製されてきた（Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul;18(7):991-1000.、Curr Opin Immunol. 2016 Jun;40:96-102.）。IL2やIL12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが（非特許文献４、５、６）、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題がある。この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できない、ことが挙げられる。また、癌抗原に結合するイムノサイトカインは、腫瘍中で癌細胞に内在化されて消失してしまうため、場合によっては腫瘍局所にサイトカインを暴露することが困難となる。癌抗原に結合する抗体にIL2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある（非特許文献７）。
　イムノサイトカインの大きな課題である全身性の作用を低減させる方法として、サイトカインとサイトカインレセプターの間を癌で高発現するプロテアーゼによって切断されるリンカーで結合させた分子が報告されている。サイトカインはリンカーで結合されたサイトカインレセプターによって阻害されているが、リンカーがプロテアーゼによって切断されるとサイトカインレセプターが遊離し、サイトカインが活性体になる。例としてTNFalphaとTNFRをuPAで切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献８）、IL2とIL2RをMMP2で切断されるリンカーで結合させた分子（非特許文献９）などが報告されている。しかしながら、これらの分子はリンカーの切断前であってもサイトカインは生物活性を有しており、リンカーの切断によって活性が約10倍程度しか向上しない。
　この原因として、サイトカインとサイトカインレセプターの親和性が強くないため、プロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまうこと、あるいは、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプターはサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまうことの2点が挙げられる。
　IL2Rに代わり抗IL2 scFvをMMP-2で切断されるリンカーを介してIL2と結合させた分子（非特許文献９）が報告されている。このIL2と抗IL2 scFvとをプロテアーゼ切断リンカーを介して結合させた分子も、サイトカインとサイトカインレセプターを結合させた分子と同じように、リンカー切断時にIL2を遊離させることを考慮すれば、IL2親和性が強くない抗IL2 scFvを使用することは当然である。
　また、これらの報告されているプロテアーゼ活性化サイトカインは上述のIgG-IL2 fusionと異なりFc領域を有さないため半減期が短いと予想され、高い暴露を維持することが難しい。プロテアーゼ切断により活性化される前後のサイトカインの薬物動態に大きな差が無く（共に半減期が短い）、therapeutic windowを広げることが難しい。
実施例２　ケモカインの癌免疫療法への応用における課題
　ケモカイン（Nature Immunology 9, 949 - 952 (2008)）は、Gタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。受容体を発現する特定の白血球に作用し，その物質の濃度勾配の方向に白血球を遊走させる活性（走化性）を持つ（Nat Cell Biol. 2016 Jan;18(1):43-53.）。ケモカインは炎症部で大量に産生され，血管内から炎症組織内への白血球の遊走をもたらすことが知られている。
　ケモカインを制御することで、白血球の遊走をコントロールできることから、癌免疫療法に活用することが可能であると考えられる。固形癌の局所にT細胞や抗原提示細胞やM1マクロファージなどを遊走させることができれば、抗腫瘍効果を引き起こすことが可能であると考えられる。サイトカインは全身投与によっても作用を発揮することができるが、ケモカインは濃度勾配によって濃度の高い組織に細胞を遊走させるため、ケモカインを全身投与しても期待する効果は得られない。そのため、ケモカインの全身投与による癌免疫療法（ケモカイン療法）は現実的ではないと考えられる。
実施例３　プロテアーゼ切断配列を導入した標的組織特異的リガンドをリリースできるリガンド結合分子のコンセプト
　実施例１、２に示したように既報のサイトカイン・ケモカイン療法には以下の課題がある。
１．イムノサイトカインにおいては、抗体によりサイトカインを固形癌にターゲッティングしたとしても、サイトカインは全身で作用するため副作用が生じる、あるいは、副作用を回避するため低用量でしか投与できないため、腫瘍中に高い暴露をすることができない。
２．サイトカインレセプター（あるいは抗体）とサイトカインをプロテアーゼで切断出来るリンカーで繋ぐプロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、サイトカイン活性の中和が不十分でありプロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまう。
３．プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプター（あるいは抗体）がサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまう。
４．プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、不活性型サイトカインの半減期が短く、血中滞留時間が短いため、必要とする投与量が多い。
　この課題を解決するためには以下の条件を満たすことが重要であると考えた。
１．全身においては、サイトカインあるいはケモカインなどのリガンドがリガンド結合分子によって十分に阻害されている（生物活性が最小化されている）
２．プロテアーゼによる切断によりリガンドの生物活性が回復する（活性型リガンドとなる）
３．プロテアーゼによる切断によりリガンド結合分子がリガンド結合活性を失う
４．プロテアーゼによる切断を受ける前のリガンド結合分子に結合したリガンドと比較して、プロテアーゼによる切断を受けて活性型となったリガンドが短い半減期を有する
　上記条件を満たす医薬組成物として切断サイトが切断されることによってリガンドへの結合が減弱される分子を考案した。まず、リガンドに対する結合分子を取得し、次に結合分子中に切断サイトを挿入することでリガンド結合分子を作製することができる。
実施例４　プロテアーゼ切断配列を導入した抗リガンド抗体の例
　図１、２、３ではリガンドへ結合する分子として抗体を用いた分子の例を示している。これらの例では、まずリガンドに対する中和抗体を取得する。続いて、抗リガンド中和抗体の可変領域（VHあるいはVL）と定常領域（CH1あるいはCL）の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入する。当該抗リガンド抗体がプロテアーゼ切断配列挿入後においてもリガンド結合活性が保持されていることを確認する。リガンドが抗リガンド中和抗体に結合した状態で、プロテアーゼで切断することにより、リガンドが解離することを確認する。解離したリガンドが生物活性を発揮することを確認する。
　図１において、リガンドのC末端と抗リガンド抗体のVHのN末端がリンカーを介して結合されており、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入されている。抗リガンド抗体のリガンドに対する親和性が十分に強ければ、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド－抗リガンド抗体融合体を全身投与してもリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド－抗リガンド抗体融合体はFc領域を有するため長い半減期を有する。全身投与されたリガンド－抗リガンド抗体融合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによってVHとCH1の境界付近のプロテアーゼ切断配列が切断されると、リガンド－リンカー－抗リガンド抗体のVH分子が遊離する。VHあるいはVL単独ではリガンドに結合することができないため（リガンドへ結合するためにはVHとVL両方が必要）、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。また、このリリースされたリガンド－リンカー－抗リガンド抗体のVH分子は、Fc領域を有さず、分子量が小さいため、非常に短い半減期を有し、速やかに全身から消失するため、リガンドによる全身性の副作用を最小化することが可能である。
　図２においては、リガンドと抗リガンド抗体は図１のようにリンカーで結合されておらず、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入された抗リガンド抗体とリガンドが混合して投与される。抗リガンド抗体のリガンドに対する親和性が十分に強く、リガンド濃度に対して抗リガンド抗体が十分あれば、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド－抗リガンド抗体複合体を全身投与してもリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド－抗リガンド抗体複合体はFc領域を有するため長い半減期を有する。全身投与されたリガンド‐抗リガンド抗体複合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによってVHとCH1の境界付近のプロテアーゼ切断配列が切断されると、抗リガンド抗体のVH分子が遊離する。VHあるいはVL単独ではリガンドに結合することができないため（リガンドへ結合するためにはVHとVL両方が必要）、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。また、このリリースされたリガンド分子は、Fc領域を有さず、分子量が小さいため、非常に短い半減期を有し、速やかに全身から消失するため、リガンドによる全身性の副作用を最小化することが可能である。
　図３において、VHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入された抗リガンド抗体が全身投与される。投与された抗体は体内に元々存在するリガンドに結合し、以降は図２の上記記載と同様である。
　このようにVHとCH1の境界付近にプロテアーゼ切断配列が挿入された抗リガンド抗体を用いることで、リガンドをプロテアーゼが発現する組織で選択的にリリースし、その生物学的作用を発揮させることが可能となる。リガンドがサイトカインであれば、サイトカインをプロテアーゼが発現する組織で選択的に作用させることができる。リガンドがケモカインであれば、プロテアーゼが発現する組織でケモカインが高濃度で存在し、末梢血でケモカイン濃度が低くなるため、ケモカイン受容体を発現する細胞をプロテアーゼが発現する組織に遊走させることができる。
実施例５　CXCL10リリース抗体の作製と評価
５－１．抗CXCL10中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
　CXCL10はエフェクターT細胞に対する遊走作用を持つケモカインの一つである。ヒトCXCL10に対する中和抗体であるMabCXCL10（重鎖：EEIVH（配列番号：１）、軽鎖：EEIVL（配列番号：２））の発現ベクターを当業者公知の方法で調製し、FreeStyle 293(Life Technology)を用いて当業者公知の方法で発現、精製を行った。MabCXCL10に含まれるCDR配列は以下である：H-CDR1（NNGMH、配列番号：３８０）、H-CDR2（VIWFDGMNKFYVDSVKG、配列番号：３８１）、H-CDR3（EGDGSGIYYYYGMDV、配列番号：３８２）、L-CDR1（RASQSVSSSYLA、配列番号：３８３）、L-CDR2（GASSRAT、配列番号：３８４）、L-CDR3（QQYGSSPIFT、配列番号：３８５）。
　MabCXCL10とヒトCXCL10（ 266-IP-010/CF , R&D Systems ）の相互作用をBiacoreを用いて評価した。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare )にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 200mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で1.563 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、37℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図4に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス（結合量）が縦軸である。図4のセンサーグラムに示すように、MabCXCL10のヒトCXCL10に対する結合が確認された。
　MabCXCL10の重鎖あるいは軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入する検討を行った。癌特異的に発現しているウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ（ MT-SP1 ）で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A（配列番号：３）を重鎖または軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近の７か所に挿入した図5に示す重鎖および軽鎖を設計した。切断配列挿入に伴う糖鎖付加が起こらないような改変体も設計した。重鎖改変体であるEEIVHA（配列番号：４）、EEIVHB（配列番号：５）、EEIVHC（配列番号：６）、EEIVHD（配列番号：７）、EEIVHE（配列番号：８）、EEIVHF（配列番号：９）、EEIVHG（配列番号：１０）、EEIVHBG（配列番号：１１）、EEIVHCG（配列番号：１２）、EEIVHDG（配列番号：１３）、EEIVHEG（配列番号：１４）、および軽鎖改変体であるEEIVLA（配列番号：１５）、EEIVLB（配列番号：１６）、EEIVLC（配列番号：１７）、EEIVLD（配列番号：１８）、EEIVLE（配列番号：１９）、EEIVLF（配列番号：２０）、EEIVLG（配列番号：２１）、EEIVLEG（配列番号：２２）をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
　これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、あるいは、天然型重鎖と軽鎖改変体を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体：EEIVHA/EEIVL（重鎖配列番号：４、軽鎖配列番号：２）、EEIVHB/EEIVL（重鎖配列番号：５、軽鎖配列番号：２）、EEIVHC/EEIVL（重鎖配列番号：６、軽鎖配列番号：２）、EEIVHD/EEIVL（重鎖配列番号：７、軽鎖配列番号：２）、EEIVHE/EEIVL（重鎖配列番号：８、軽鎖配列番号：２）、EEIVHF/EEIVL（重鎖配列番号：９、軽鎖配列番号：２）、EEIVHG/EEIVL（重鎖配列番号：１０、軽鎖配列番号：２）、EEIVHBG/EEIVL（重鎖配列番号：１１、軽鎖配列番号：２）、EEIVHCG/EEIVL（重鎖配列番号：１２、軽鎖配列番号：２）、EEIVHDG/EEIVL（重鎖配列番号：１３、軽鎖配列番号：２）、EEIVHEG/EEIVL（重鎖配列番号：１４、軽鎖配列番号：２）、および、軽鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体：EEIVH/EEIVLA（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：１５）、EEIVH/EEIVLB（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：１６）、EEIVH/EEIVLC（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：１７）、EEIVH/EEIVLD（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：１８）、EEIVH/EEIVLE（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：１９）、EEIVH/EEIVLF（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：２０）、EEIVH/EEIVLG（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：２１）、EEIVH/EEIVLEG（重鎖配列番号：１、軽鎖配列番号：２２）を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
５－２．プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体の結合活性の評価
　５－１で調製した抗体とヒトCXCL10（266-IP-010/CF , R&D Systems）の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を図6に示す。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare )にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 150mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で3.125, 1.563, 0.781 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、25℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図6に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス（結合量）が縦軸である。図6のセンサーグラムに示すように、いずれの抗体もヒトCXCL10に結合した。すなわち、抗原への結合活性を失わせることなく抗体可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入することが出来た。
５－３．プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　５－１で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 20nM、抗体 60または100μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図7に示す。その結果、EEIVHA/EEIVL、EEIVHE/EEIVL、EEIVHF/EEIVL、EEIVHG/EEIVL、EEIVHEG/EEIVL、EEIVHBG/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。さらに、EEIVH/EEIVLEG、EEIVH/EEIVLF、EEIVH/EEIVLGは、プロテアーゼ処理によって25kDa以下にバンドが生じた。 したがって、EEIVHA/EEIVL、EEIVHE/EEIVL、EEIVHF/EEIVL、EEIVHG/EEIVL、EEIVHEG/EEIVL、EEIVHBG/EEIVL、EEIVH/EEIVLEG、EEIVH/EEIVLF、EEIVH/EEIVLGにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
５－４．プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体のプロテアーゼ切断配列近傍への可動リンカー配列の導入
　５－３でリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14（MT-SP1） 触媒ドメイン ( R&D Systems, 3946-SE-010 )による切断を受けなかったEEIVHC/EEIVLのプロテアーゼ切断配列の近傍に、グリシン-セリンポリマーからなるリンカーを含む配列を挿入する検討を行った。図8に示す5種類の重鎖を設計した。重鎖改変体であるEEIVHC002（配列番号：２３）、EEIVHC003（配列番号：２４）、EEIVHC004（配列番号：２５）、EEIVHC005（配列番号：２６）、EEIVHC006（配列番号：２７）をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
　これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、重鎖の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を挿入した以下のIgG1抗体：EEIVHC002/EEIVL（重鎖配列番号：２３、軽鎖配列番号：２）、EEIVHC003/EEIVL（重鎖配列番号：２４、軽鎖配列番号：２）、EEIVHC004/EEIVL（重鎖配列番号：２５、軽鎖配列番号：２）、EEIVHC005/EEIVL（重鎖配列番号：２６、軽鎖配列番号：２）、EEIVHC006/EEIVL（重鎖配列番号：２７、軽鎖配列番号：２）を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
５－５．プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗CXCL10中和抗体の結合活性の評価
　５－４で調製した抗体とヒトCXCL10（266-IP-010/CF , R&D Systems）の相互作用をBiacoreを用いて評価した結果を図９に示す。具体的には、CM3センサーチップ ( BR100536, GE Healthcare ) にR PROTEIN A (SURE) (28-4018-60, GE Healthcare ) をNHS・EDCを用いたアミンカップリング法によって固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, 300mM NaCl, pH 7.4 を用い、抗体をキャプチャーした状態で6.25, 3.125, 1.563, 0.781 nM のヒトCXCL10をアナライトとして流し、25℃における抗体の抗原に対する結合を評価した。ランニングバッファーのみをアナライトとしたブランクとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図9に示す。アナライトを流し始める時間を横軸の開始点としている。アナライトを流し始めた時間におけるレスポンスを0としたときの各時間におけるレスポンス（結合量）が縦軸である。図９のセンサーグラムに示すように、いずれの抗体もヒトCXCL10に結合した。すなわち、抗原への結合活性を失わせることなく抗体可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を挿入することが出来た。
５－６．プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗CXCL10中和抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　５－５で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトウロキナーゼ（ uPA ）（ R&D Systems, 1310-SE-010 ）、リコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、抗体 133μg/mL、PBS、37℃の条件下で2、20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図10に示す。その結果、EEIVHC002/EEIVL、EEIVHC003/EEIVL、EEIVHC004/EEIVL、EEIVHC005/EEIVL、EEIVHEC006/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。したがって、EEIVHC002/EEIVL、EEIVHC003/EEIVL、EEIVHC004/EEIVL、EEIVHC005/EEIVL、EEIVHEC006/EEIVLにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
　これらの結果から、EEIVHC/EEIVLのようにプロテアーゼ切断サイトのみを可変領域と定常領域の境界付近に導入した場合にはプロテアーゼによる切断を受けない抗体であっても、切断配列近傍に可動リンカー配列を導入することでプロテアーゼによる切断が可能な分子を作成できることが示された。したがって、プロテアーゼ切断配列と可動リンカーを任意に組み合わせることによっても、プロテアーゼによる切断を受ける抗体が作製可能であることが示された。
５－７．CXCL10－抗CXCL10中和抗体のプロテアーゼ切断によるリガンドの活性化
　次に、5-5で調製した抗体に結合したヒトCXCL10がプロテアーゼ処理によって遊離するかどうかをBiacoreを用いて評価した。具体的には、5-5で調製した抗体EEIVHC006a/EEIVL（重鎖配列番号：３３、軽鎖配列番号：２）を用いて、抗原あり／プロテアーゼありのアナライト、抗原なし／プロテアーゼありのアナライト、抗原あり／プロテアーゼなしのアナライトをそれぞれ用意した。抗原あり／プロテアーゼありのアナライトは、抗体とヒトCXCL10を結合させたのちに20nM のリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1）( R&D Systems, 3946-SE-010)で20時間処置したものを用いた。抗原なし／プロテアーゼありのアナライトは、抗体のみを20nM のリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1）( R&D Systems, 3946-SE-010)で20時間処置したものを用いた。抗原あり／プロテアーゼなしのアナライトは、抗体とヒトCXCL10を結合させたものを用いた。また、CXCL10の結合によるレスポンスであることを確認する系のコントロールとして、CXCL10を抗原のみのアナライトとして用意した。CM5センサーチップ ( BR100530, GE Healthcare ) に抗CXCL10抗体を当業者公知の方法で固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 を用い、抗原あり／プロテアーゼありのアナライト、抗原なし／プロテアーゼありのアナライト、抗原あり／プロテアーゼなしのアナライト、抗原のみアナライトの4種類をそれぞれ流し、25℃におけるセンサーチップ上の抗CXCL10抗体とヒトCXCL10の結合を評価した。
　また、プロテアーゼ切断配列を持っていない抗体MabCXCL10と同様のFab領域を持つMabCXCL10a（重鎖：EEIVHa（配列番号：６５）、軽鎖：EEIVL（配列番号：２））を用いて、抗体EEIVHC006a/EEIVLと同様に抗原あり／プロテアーゼありのアナライト、抗原なし／プロテアーゼありのアナライト、抗原あり／プロテアーゼなしのアナライトを用意した。同様に、CM5センサーチップ ( BR100530, GE Healthcare ) に抗CXCL10抗体を当業者公知の方法で固相化し、ランニングバッファーとして20mM ACES, 0.05% Tween20, pH 7.4 を用い、抗原あり／プロテアーゼありのアナライト、抗原なし／プロテアーゼありのアナライト、抗原あり／プロテアーゼなしのアナライト、抗原のみアナライト（CXCL10）の4種類をそれぞれ流し、25℃におけるセンサーチップ上の抗CXCL10抗体とヒトCXCL10の結合を評価した。
　抗CXCL10抗体を固相化していないフローセルとの差をとった継時的な結合量を表すセンサーグラムを図11に示す。アナライトを流し始める時間を縦軸の開始点としている。縦軸はアナライトを流し始めたときのレスポンスを100とした際の各時間のレスポンスを表す。その結果、図11(A)に示すように切断配列が挿入されていないMabCXCL10aをプロテアーゼ処理してもCXCL10は遊離されないが、図11(B)に示すようにEEIVHC006a/EEIVLをプロテアーゼ処理することでCXCL10が遊離されることが確認された。
５－８． 抗体可変領域と定常領域の境界付近のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列と可動リンカーの配列の一部に置換した抗CXCL10中和抗体の作製とプロテアーゼによる切断の評価
　MabCXCL10の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列と可動リンカーの配列の一部で置換する検討を行った。癌特異的に発現しているウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ（ MT-SP1 ）で切断されることが報告されている配列であるペプチド配列A（配列番号：３）を重鎖の一部のアミノ酸に置換した図12に示す重鎖を設計した。重鎖改変体であるEESVHA009（配列番号：５９）、EESVHA012（配列番号：６０）をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
　これらの重鎖改変体と天然型軽鎖を組み合わせて、以下のIgG1抗体：EESVHA009/EEIVL（重鎖配列番号：５９、軽鎖配列番号：２）、EESVHA012/EEIVL（重鎖配列番号：６０、軽鎖配列番号：２）を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
　EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLがプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトウロキナーゼ（ uPA ）（ R&D Systems, 1310-SE-010 ）、リコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ12.5nM、抗体 100μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図13に示す。その結果、EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLは、プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた。したがって、EESVHA009/EEIVL、EESVHA012/EEIVLにおいて、抗体がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
実施例６　プロテアーゼ切断によって抗原結合能を失わせるための切断配列挿入許容部位に関する考察
　ヒトIgG1抗体の重鎖216番アスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した抗体の作成及びインビトロでの機能評価に関する報告がなされている（国際公開WO2004/021861A2）。実験データは未記載であるが、この抗体と抗原を混合した後に対応するプロテアーゼが含まれる培地を処置すると、抗原抗体複合体から抗原が遊離されると主張している。
　当該報告でプロテアーゼ切断配列を挿入したと主張されたヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸は、Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリング、EUナンバリング、OUナンバリングのいずれかのナンバリングシステムにおいてもアスパラギン酸ではない。一方で異なる文献を参照すると、ヒトIgG1抗体の重鎖216番アミノ酸は重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合が形成されるシステインの直後のアスパラギン酸であると考えられる（Nature 344, 667 - 670 (12 April 1990), Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 4th edition）。この216番のアスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した場合、プロテアーゼによる切断を受けた抗体からはパパインによって抗体のヒンジ領域が切断を受けた場合と同様のFab領域が形成されると考えられる。パパインによる抗体のヒンジ領域の切断によって抗原結合能が失われることは考えにくいと一般的に認識されているため、この216番のアスパラギン酸の直前にプロテアーゼ切断配列を挿入した抗体を対応するプロテアーゼで切断しても、抗原結合能が失われることはないと考えられる。
　仮にKabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリングにおけるヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸（Kabatナンバリング）の直前にプロテアーゼ切断配列が挿入された場合も検討してみる。この部位は重鎖と軽鎖の間にジスルフィド結合が形成される220番目のシステイン（Kabatナンバリング）よりも数アミノ酸N末端側に存在する。そのため、この部位で起こるプロテアーゼによる重鎖の切断がもたらす影響は、重鎖と軽鎖の間に形成されるジスルフィド結合が失われた際にもたらされる影響と同様であると想定される。過去の文献より、重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合を形成できないFab領域であっても抗原結合が失われることは考えにくい（MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):204-18.）。そのため、Kabat, E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th editionに記載されているKabatナンバリングにおけるヒトIgG1抗体の重鎖216番目のアミノ酸（Kabatナンバリング）の直前にプロテアーゼ切断配列が挿入された場合であっても、プロテアーゼ切断によって抗原結合能が失われることはないと考えられる。
実施例7　プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体/CXCL10複合体のプロテアーゼ切断に伴う遊走活性評価
　実施例5で作製されたプロテアーゼ切断配列を導入したCXCL10中和抗体とCXCL10が形成する複合体がプロテアーゼ切断によってCXCL10を遊離させ、CXCL10が細胞遊走活性を発揮するかを評価した。
　CXCL10の細胞遊走活性は、マウスCXCR3（mCXCR3）を発現するBa/F3トランスフェクタント細胞を作製し(以下BaF3/mCXCR3)、この細胞とHTS TranswellTM-96 Permeable Support with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane (Cat. 3387、Corning) を用いて評価された。アナライトとして、CXCL10＋プロテアーゼ、EEIVHC006a/EEIVL＋CXCL10、EEIVHC006a/EEIVL＋CXCL10＋プロテアーゼ、EEIVHC006a/EEIVL＋プロテアーゼ、MabCXCL10＋CXCL10＋プロテアーゼの5種類を準備した。プロテオセーブSS 1.5mLマイクロチューブ（Cat. MS-4265M、住友ベークライト）中で終濃度10 μg/mLの抗体（MabCXCL10かEEIVHC006a/EEIVL）、終濃度100 ng/mL のhCXCL10 (Cat. 300-12、Peprotech)、もしくは抗体とhCXCL10両方を入れ、30分間常温で放置し、プロテアーゼありのアナライトについては前記反応後にmouse MT-SP1 (mMT-SP1 、Cat. 4735-SE-010、R&D Systems)を終濃度12.5 nMになるように、更に加えた。
　各アナライト235 μLをLower chamberに移し、Upper chamberにBaF3/mCXCR3細胞を2.0×105 cells/wellとなるように75 μL/wellで播き、6時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。6時間の反応後、Lower chamber中の溶液100 μLをフルオレッセンスルミネッセンス96ウェルプレート（Cat. 3912、Corning）に移し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay溶液（Cat. G7571、Promega）を100 μL加えた。室温で10分反応させた後、SpectraMax M3 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で発光値を測定し、Lower chamberへの細胞の遊走度を評価した。その結果を図14に示す。
　CXCL10＋プロテアーゼのアナライトと比較して、EEIVHC006a/EEIVL＋CXCL10のアナライトを添加した場合では発光強度が減少した。発光強度は遊走した細胞の量を反映することから、EEIVHC006a/EEIVLはCXCL10と複合体を形成し、CXCL10の作用を中和していることが分かった。一方で、EEIVHC006a/EEIVL＋CXCL10＋プロテアーゼのアナライトを添加した場合、EEIVHC006a/EEIVL＋CXCL10のアナライトを添加した場合と比較して発光強度が回復し、CXCL10＋プロテアーゼのアナライト添加の場合と同様に細胞を遊走させることが示された。切断配列を有していないMabCXCL10抗体を用いたMabCXCL10＋CXCL10＋プロテアーゼのアナライト添加の場合、発光強度の回復は見られなかった。この結果から、EEIVHC006a/EEIVLはプロテアーゼによる抗体切断に伴い、CXCL10の中和能が低下することが示された。
実施例8　プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質のプロテアーゼ切断に伴う遊走活性評価
8-1 抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質の作製及びプロテアーゼ切断評価
　ヒトCXCL10に対する中和抗体であるMabCXCL10_G7（重鎖：G7H-G1T4（配列番号：３６８）、軽鎖：G7L-LT0（配列番号：３６９））の軽鎖を用いて、当該軽鎖のN末端にグリシン-セリンポリマーからなるリンカー配列を介して、プロテアーゼに耐性になるように変異させたヒトCXCL10変異体hCXCL10R75A (配列番号：３７０)を連結させて、リガンド融合軽鎖hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0(配列番号：３７１）を設計した。リガンド融合軽鎖とMabCXCL10_G7重鎖のG7H-G1T4を組み合わせて、融合タンパク質：G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0（重鎖配列番号：３６８、リガンド融合軽鎖配列番号：３７１）を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。MabCXCL10_G7のCDR配列は下記通り：H-CDR1（SFSIT、配列番号：３７４）、H-CDR2（EITPMFGIANYAQKFQG、配列番号：３７５）、H-CDR3（DGRFDVSDLLTDKPKVTINYNGMDV、配列番号：３７６）、L-CDR1（SGSSSNIGSNTVN、配列番号：３７７）、L-CDR2（NNDQRPS、配列番号：３７８）、L-CDR3（ASWDDSLNGRV、配列番号：３７９）。
　この融合タンパク質がプロテアーゼにより切断されるかを検証した。プロテアーゼとしてヒトに由来するウロキナーゼ（human uPA, huPA）（R&D Systems, 1310-SE-010）を用いた。プロテアーゼによる融合タンパク質の切断は還元SDS-PAGEによって評価した。融合タンパク質0.1 mg/mlに対し30 nM huPAを37℃で1時間反応させた後、還元SDS-PAGEによって融合タンパク質の切断を評価した。その結果、G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0はプロテアーゼ処理により切断されなかった (図15)。
8-2 抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質のプロテアーゼ切断に伴う遊走活性評価
　プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体とCXCL10が融合された抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質がプロテアーゼ切断によってCXCL10を遊離させ、細胞遊走を引き起こすかを評価した。
　融合タンパク質から遊離したhCXCL10R75Aの活性比較対象として、hCXCL10R75Aのみの活性を表すhCXCL10R75A-His (配列番号：３７３)を以下の方法で作製・精製した。プロテアーゼに耐性になるように変異させたヒトCXCL10変異体hCXCL10R75A（配列番号：３７０）のC末端にヒスチジンタグを付加し、ヒスチジンタグ付加ヒトCXCL10変異体 hCXCL10R75A-His (配列番号：３７３)を作製した。hCXCL10R75A-His（配列番号：３７３)を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、ニッケルセファロースを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
　細胞遊走活性は、マウスCXCR3（mCXCR3）を発現するBa/F3トランスフェクタント細胞を作製し(以下BaF3/mCXCR3)、この細胞とHTS TranswellTM-96 Permeable Support with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane (Cat. 3387、Corning) を用いて評価された。
　uPA(+)のアナライトとして、2.0mL 96ウェルディープウェルプレート（Cat. P-DW-20-C-S、Axygen）中でhCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、プロテアーゼ切断配列を有さない融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 μg/mLに対してリコンビナントhuPA (Cat. 1310-SE、R&D systems)を終濃度30 nMになるように加えて準備した。G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 μg/mLは0.15 μg/mL相当量のhCXCL10R75Aを含む。uPA(-)のアナライトは、hCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、プロテアーゼ切断配列を有さない融合タンパク質G7H-G1T4/ hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0 1.5 μg/mLを使用した。
　分析対象となる各溶液それぞれ235 μLをLower chamberに移し、Upper chamberにBaF3/mCXCR3細胞を2.0×105 cells/wellとなるように75 μL/wellで播き、6時間反応させた。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われた。6時間の反応後、Lower chamber中の溶液100 μLをOptiPlate-96（Cat. 6005299、PerkinElmer）に移し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay溶液（Cat. G7571、Promega）を100 μL加えた。室温で10分反応させた後、SpectraMax M3 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で発光値を測定し、Lower chamberへの細胞の遊走度を評価した。その結果を図16に示す。CXCL10R75A-Hisを添加した場合と比較して、切断配列を有していないG7H-G1T4/hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0ではプロテアーゼ処理を行った場合でも発光強度の回復がみられなかった。
8-3 プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質の構築とプロテアーゼ切断に伴う遊走活性評価
　8-1で構築されたリガンド融合軽鎖hCXCL10R75A.G4SGGGG.G7L-LT0(配列番号：３７１）の可変領域と定常領域の境界付近にプロテアーゼ切断配列を含むようにアミノ酸配列を設計する。プロテアーゼ切断配列を導入したリガンド融合軽鎖とMabCXCL10_G7重鎖のG7H-G1T4を組み合わせて、融合タンパク質を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行う。
　これらの融合タンパク質がプロテアーゼにより切断されるかを検証する。プロテアーゼとしてヒトに由来するウロキナーゼ（human uPA, huPA）（R&D Systems, 1310-SE-010）を用いる。プロテアーゼによる融合タンパク質の切断は還元SDS-PAGEによって評価する。融合タンパク質0.1 mg/mlに対し30 nM huPAを37℃で1時間反応させた後、還元SDS-PAGEによって融合タンパク質の切断を評価する。
　プロテアーゼ切断配列を導入した抗CXCL10中和抗体とCXCL10が融合された抗CXCL10中和抗体-CXCL10融合タンパク質がプロテアーゼ切断によってCXCL10を遊離させ、細胞遊走を引き起こすかを評価する。細胞遊走活性は、マウスCXCR3（mCXCR3）を発現するBa/F3トランスフェクタント細胞を作製し(以下BaF3/mCXCR3)、この細胞とHTS TranswellTM-96 Permeable Support with 5.0μm Pore Polycarbonate Membrane (Cat. 3387、Corning) を用いて評価される。
　uPA(+)のアナライトとして、2.0mL 96ウェルディープウェルプレート（Cat. P-DW-20-C-S、Axygen）中で8-2で調製されたhCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、あるいはプロテアーゼ切断配列を導入した融合タンパク質1.5 μg/mLに対してリコンビナントhuPA (Cat. 1310-SE、R&D systems)を終濃度30 nMになるように加えて準備する。プロテアーゼ切断配列を有する融合タンパク質 1.5 μg/mLは0.15 μg/mL相当量のhCXCL10R75Aを含む。uPA(-)のアナライトは、hCXCL10R75A-His 0.15 μg/mL、またはプロテアーゼ切断配列を有する融合タンパク質1.5 μg/mLを使用する。
　分析対象となる各溶液それぞれ235 μLをLower chamberに移し、Upper chamberにBaF3/mCXCR3細胞を2.0×105 cells/wellとなるように75 μL/wellで播き、6時間反応させる。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下で行われる。6時間の反応後、Lower chamber中の溶液100 μLをOptiPlate-96（Cat. 6005299、PerkinElmer）に移し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay溶液（Cat. G7571、Promega）を100 μL加える。室温で10分反応させた後、SpectraMax M3 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で発光値を測定し、Lower chamberへの細胞の遊走度を評価する。発光強度で遊走活性の評価が可能である。
実施例9　プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体の作製とプロテアーゼ切断に伴うIL-12活性化の評価
9-1. プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体の作製
　IL-12は免疫活性化作用を持つサイトカインの一つである。IL-12は免疫細胞を活性化させることで抗腫瘍効果を発揮するが、同時に全身の暴露によって重篤な副作用を引き起こすことも報告されている(Nat Immunol. 2012 Jul 19;13(8):722-8.)。
　ヒトIL-12に対する中和抗体であるUstekinumabと同じ可変領域を有する抗IL12抗体の重鎖 (UstkH-G1T4, 重鎖配列番号：１４４)の可変領域と定常領域の境界付近に、ウロキナーゼ（uPA）およびマトリプターゼ（MT-SP1）で切断されることが報告されているペプチド配列A（配列番号：３）及びグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含む配列を挿入し、Ustekinumabの重鎖の改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1（配列番号：１４６）を設計し、Ustekinumabの軽鎖 (UstkL-kT0、配列番号：１４５)と組み合わせて、Ustekinumabの改変体であるUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0（重鎖配列番号：１４６、軽鎖配列番号：１４５）をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。このUstekinumabの改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0を当業者公知の方法でFreeStyle 293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。本実施例中の抗IL12抗体及びその改変体に含まれるCDR配列は下記通りである：H-CDR1（TYWLG、配列番号：３８６）、H-CDR2（IMSPVDSDIRYSPSFQG、配列番号：３８７）、H-CDR3（RRPGQGYFDF、配列番号：３８８）、L-CDR1（RASQGISSWLA、配列番号：３８９）、L-CDR2（AASSLQS、配列番号：３９０）、L-CDR3（QQYNIYPYT、配列番号：３９１）。
9-2. プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体のプロテアーゼ切断
　前記9-1で調製された抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてヒトに由来するリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（human MT-SP1, hMT-SP1） (R&D Systems, 3946-SE-010)、マウスに由来するリコンビナントマウスマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（mouse MT-SP1, mMT-SP1） (R&D Systems, 4735-SE-010)、および、ヒトに由来するウロキナーゼ（human uPA, huPA）（R&D Systems, 1310-SE-010）を用いた。プロテアーゼ処理は、Ustekinumab（UstkH-G1T4/ UstkL-kT0）、またはUstekinumabの改変体UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0に対してhMT-SP1、mMT-SP1、あるいは、huPAを最終濃度10.1, 16.9, 9.17 μMとなるようにそれぞれ加え、37℃で一晩反応させることで行った。
9-3. 切断されたプロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体の切断の確認とIL-12活性化の評価
　プロテアーゼによる抗体の切断は還元SDS-PAGEによって評価した。その結果、UstkH-G1T4/ UstkL-kT0は各プロテアーゼによる切断を受けなかったのに対して、プロテアーゼ切断配列及び可動リンカーを挿入したUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0は各プロテアーゼ処理によって25kDa から 50kDaの間に新たなバンドが生じた (図17)。したがって、プロテアーゼ切断配列と可動リンカー配列を導入した抗IL-12中和抗体（UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0）がプロテアーゼによって切断されることが確認された。
　つぎに、プロテアーゼにより抗体が切断されたとき、IL-12が抗体との複合体から遊離して生理活性を発揮するかについて評価した。IL-12の生理活性をNK92ヒト細胞株のIFN-γ（インターフェロンガンマ、IFN-gとも記載する）産生に基づき評価した。96ウェル細胞培養プレートにNK92細胞を1×105 cells/wellで播種した。10 ng/mLのIL-12とプロテアーゼ処理を行った抗体（UstkH-G1T4/ UstkL-kT0またはUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0、それぞれ20、4、0.8、0.16、0.032、0.0054、0.0013 μg/mLの各濃度）を添加し、48時間後のIFN-γ産生量をELISAで測定した。抗体のIL12活性に対する影響を評価するために、抗体を添加せずに、プロテアーゼ処理済みのIL12のみを添加した実験（No Ab）も行われた。図18はインターフェロンガンマの濃度を測定した結果である。各種プロテアーゼで処理したUstkH-G1T4/ UstkL-kT0（プロテアーゼ切断配列を持たない）はIL-12によるインターフェロンガンマの産生を抑制し（中和という）、抗体が0.8μg/mLの場合にIL-12を入れなかった場合（No IL-12）と同程度になった。一方で、各種プロテアーゼで処理したUstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0（プロテアーゼ切断配列を含む）はいずれの抗体濃度においても、プロテアーゼ切断配列を持たないUstkH-G1T4/ UstkL-kT0を添加した場合に比べてインターフェロンガンマが産生されていた。この結果から、UstkH-G1T4CYTM1inP1/UstkL-kT0はプロテアーゼによる切断に伴いIL-12に対する中和能が減弱されることで、IL-12を細胞に作用させることが確認された。
実施例10　抗ヒトCXCL10中和抗体にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の評価
10-1．抗ヒトCXCL10中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
　CXCL10を中和する抗体であるMabCXCL10（重鎖：EEIVH（配列番号：１）、軽鎖：EEIVL（配列番号：２））とMabCXCL10_G7（重鎖：G7H-G1T4（配列番号：３６８）、軽鎖：G7L-LT0（配列番号：３６９））の発現ベクターを当業者公知の方法で調製し、FreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いて当業者公知の方法で発現、精製を行った。
　MabCXCL10あるいはMabCXCL10_G7の重鎖の可変領域と定常領域の境界付近に、配列番号：３４５で示す切断配列をそれぞれ挿入し、MabCXCL10改変重鎖EldHA0003-G1T4（配列番号：３５６）とMabCXCL10_G7改変重鎖G7H.12aa-G1T4（配列番号：３６７）を作製した。
　上記二種類の改変重鎖と軽鎖を組み合わせて、MabCXCL10改変体EldHA0003（重鎖配列番号：３５６、軽鎖配列番号：２）及びMabCXCL10_G7改変体G7H.12aa（重鎖配列番号：３６７、軽鎖配列番号：３６９）を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
10－2．プロテアーゼ切断配列を重鎖領域に導入した抗ヒトCXCL10中和抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　10-1で調製した抗体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ human MT-SP1, hMT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図19A、19Bに示す。MabCXCL10改変体EldHA0003とMabCXCL10_G7改変体G7H.12aaのいずれも、hMT-SP1処理によって37kDa付近に新たなバンドが生じた。即ち、配列番号：３４５で示すプロテアーゼ切断配列はhMT-SP1によって切断されることが確認された。また、類似の方法で、配列番号：３４５で示すプロテアーゼ切断配列はhuman uPA, mouse uPAにも切断されることが確認された。
実施例11　多様なプロテアーゼの切断配列が導入されたポリペプチドの作製と評価
11-1　多様なプロテアーゼの認識配列が導入されたポリペプチドの作製
　ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：147）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：148））の発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。MRAのCDR配列は以下である：H-CDR1（SDHAWS、配列番号：398）、H-CDR2（YISYSGITTYNPSLKS、配列番号：399）、H-CDR3（SLARTTAMDY、配列番号：400）、L-CDR1（RASQDISSYLN、配列番号：401）、L-CDR2（YTSRLHS、配列番号：402）、L-CDR3（QQGNTLPYT、配列番号：403）。
　MMP-2、MMP-7、MMP-9で切断されることが知られているペプチド配列およびそれらの配列の近傍にグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を表4に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの挿入配列をMRA抗体の重鎖可変領域と定常領域の境界付近に挿入した改変重鎖MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4（配列番号：153）、MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4（配列番号：154）、MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4（配列番号：155）、MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4（配列番号：156）、MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4 (配列番号：157)、 MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4 (配列番号：158)、MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 (重鎖配列番号：159)を設計し、これらの改変重鎖をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
　これらの改変重鎖とMRA軽鎖を組み合わせて、表5に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
11－２．多様なプロテアーゼの認識配列が導入されたポリペプチドのプロテアーゼによる切断の評価
　11－１で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2（ R&D Systems, 902-MP-010 ）、リコンビナントヒトMMP-7（ R&D Systems, 907-MP-010 ）、リコンビナントヒトMMP-9（ R&D Systems, 911-MP-010 ）を用いた。なお、プロテアーゼは1 mM p-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 ) と混ぜ、37℃でそれぞれ1、24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、抗体50μg/mL、assay buffer(MMP Activity Assay Kit(Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer）で実施した。))または 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図20A、20B、図21に示す。MRA改変体抗体は、それぞれ表5に示すプロテアーゼと反応させている。MMP-2ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4/MRAL-k0,MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4/MRAL-k0, MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-7ではMEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-9ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4/MRAL-k0の切断が観察された。
実施例12　重鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の評価
12-1　重鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の作製
　ウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ（ MT-SP1 ）で切断されることが報告されているペプチド配列B（配列番号：160）をMRA重鎖可変領域（MRAH、配列番号：161）内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表6で示すMRA重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA重鎖定常領域（G1T4、配列番号：162）と連結させMRA重鎖改変体の作製し、対応する遺伝子コードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、ペプチド配列B（配列番号：160）をMRA重鎖定常領域（G1T4、配列番号：162）内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表7に示すMRA重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA重鎖可変領域（MRAH、配列番号：161）と連結させMRA重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。作製されたMRA重鎖可変領域の改変体およびMRA重鎖定常領域の改変体におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も表6、7に示す。表6における挿入箇所とは、抗体重鎖可変領域中の記載ポジション（Kabatナンバリング）の定常領域側隣を指し、表7における挿入箇所とは、抗体重鎖定常領域中の記載ポジション（EUナンバリング）の可変領域側隣を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　上記で作製したMRA重鎖改変体とMRA軽鎖を組み合わせて、表8に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　12－2．プロテアーゼ切断配列を抗体重鎖に導入した抗ヒトIL6R中和抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　12-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ human MT-SP1, hMT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図22A、22B、22C、22D、22E、22F、22G、22H、22I、図23A、23B、23Cに示す。プロテアーゼ処理後のMRA改変体は、重鎖が切断され、プロテアーゼ処理を受けていないMRA改変体の重鎖（図中のMT-SP1(-) laneの50kDa付近に出現するバンド）と比べて、より分子量の小さい位置に重鎖バンドが出現している。この結果から、12-1で調製したMRA改変体は、hMT-SP1によって切断されることが確認された。
実施例13　軽鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の評価
13-1　軽鎖の多様な位置にプロテアーゼ切断配列を導入した抗体の作製
　ウロキナーゼ ( uPA ) およびマトリプターゼ（ MT-SP1 ）で切断されることが報告されているペプチド配列B（配列番号：160）をMRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：230）内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表9で示すMRA軽鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖定常領域（k0、配列番号：231）と連結させMRA軽鎖改変体の作製し、対応する遺伝子コードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、ペプチド配列B（配列番号：160）をMRA軽鎖定常領域（k0、配列番号：231）内の異なる位置にそれぞれ挿入し、表10に示すMRA軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：230）と連結させMRA軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。作製されたMRA軽鎖可変領域の改変体およびMRA軽鎖定常領域の改変体におけるプロテアーゼ切断配列挿入位置も表9、10に示す。表9における挿入箇所とは、抗体軽鎖可変領域中の記載アミノ酸（Kabatナンバリング）の定常領域側隣を指し、表10における挿入箇所とは、抗体軽鎖定常領域中の記載アミノ酸（EUナンバリング）の可変領域側隣を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　上記で作製したMRA軽鎖改変体とMRA重鎖を組み合わせて、表11に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　13-2．プロテアーゼ切断配列を抗体軽鎖可変領域に導入した抗ヒトIL6R中和抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　13-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトマトリプターゼ/ST14 触媒ドメイン（ MT-SP1 ） ( R&D Systems, 3946-SE-010 ) を用い、プロテアーゼ 10nM、抗体 50μg/mL、PBS、37℃の条件下で20時間反応させたのちに、還元SDS-PAGEに供した。結果は図24A、24B、24C、24D、24E、図25A、25Bに示す。プロテアーゼ処理後切断されたMRA改変体は、プロテアーゼ処理を受けていないMRA改変体の軽鎖（図中MT-SP1(-)laneの25kDa付近に出願するバンド）と比べて、より分子量の小さい位置に軽鎖バンドが出現している。
実施例14　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD1中和抗体の作製およびヒトPD1に対する結合評価
14-1．抗ヒトPD1中和抗体へのプロテアーゼ切断配列の導入
　ヒトPD1に対する中和抗体5C4H-G1T4/5C4L-KT0（重鎖5C4H-G1T4、配列番号：297；重鎖可変領域5C4H、配列番号：300；重鎖定常領域G1T4、配列番号：301；軽鎖5C4L-KT0、配列番号：298；軽鎖可変領域5C4L、配列番号：302；軽鎖定常領域KT0、配列番号：303; H-CDR1（NSGMH、配列番号：392）、H-CDR2（VIWYDGSKRYYADSVKG、配列番号：393）、H-CDR3（NDDY、配列番号：394）、L-CDR1（RASQSVSSYLA、配列番号：395）、L-CDR2（DASNRAT、配列番号：396）、L-CDR3（QQSSNWPRT、配列番号：397））の重鎖または軽鎖にプロテアーゼ切断配列を挿入し、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体を作製した
　まず、癌特異的に発現しているマトリプターゼ（MT-SP1）で切断されることが報告されているペプチド配列（配列番号：299）を前述抗体の重鎖5C4H-G1T4または軽鎖5C4L-KT0に挿入し、表12に示す重鎖改変体と表13に示す軽鎖改変体を作製し、当業者公知の方法で発現させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表12の重鎖改変体と軽鎖5C4L-KT0、または表13の軽鎖改変体と重鎖5C4H-G1T4を組み合わせて、プロテアーゼ切断配列が導入されたIgG1抗体（表14）を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。なおプロテアーゼ切断配列を含まない対照抗体として5C4H-G1T4/5C4L-KT0（重鎖配列番号：297、軽鎖配列番号：298）を発現および精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
14-2．プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD1中和抗体のヒトPD1に対する結合評価
　14-2-1　プロテアーゼ処理
　プロテアーゼ処理抗体は14-1で調製された抗体（終濃度0.111mg/mL）にPBSで1.8μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を10μL加えた。プロテアーゼ未処理抗体は14-1で調製された抗体（終濃度0.111mg/mL）にPBSのみを10μL加えた。反応時のサンプル体積は90μLであり、プロテアーゼの終濃度は0.2μg/mLであった。各サンプルを37℃で12時間保温した。
　14-2-2　ビオチン化抗ヒトPD1中和抗体の調製
　5C4H-G1T4/5C4L-KT0と同じ可変領域の配列を有しているビオチン化抗ヒトPD1中和抗体を調製した。具体的には、重鎖可変領域5C4H（配列番号：300）に抗体の重鎖定常領域とビオチン（AviTag配列、配列番号：316）を付加した5C4VH-G1dGSBAP（配列番号：317）をコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。構築された発現ベクターと軽鎖5C4L-KT0B（配列番号：298）を発現するベクターを293フェクチン（Invitrogen）を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入した。このときEBNA1（配列番号：318）を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ（BirA、配列番号：319）を発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗ヒトPD1中和抗体（5C4-bio）を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法で5C4-bioを精製した。
　14-2-3　プロテアーゼ処理前後の各抗体のヒトPD1に対する結合評価
　14-2-1で調製されたプロテアーゼ処理抗体／プロテアーゼ未処理抗体80μLに、終濃度0.67μMとなるようにヒトPD1を添加し、30分間室温で結合させ、結合評価用サンプルを調製した。抗体と結合しなかったPD1の量を評価することで、抗体のプロテアーゼ処理／未処理時のPD1に対する結合を評価した。
　具体的に、抗体と結合しなかったPD1の量を、実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。
　結合評価用サンプル、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー（ForteBio, 18-0009）をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後結合評価用サンプルが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図26に示す。図26に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体の場合、プロテアーゼ未処理抗体を含む結合評価用サンプルに比べて、プロテアーゼ処理抗体を含む結合評価用サンプルで測定するときの5C4-bioに結合するヒトPD1の量が多かった。即ち、プテアーゼ切断配列が導入された各抗体は、プロテアーゼ処理によってPD1に対する結合活性が減弱し、PD1が遊離し、5C4-bioに結合した。
　14-2-4　抗体のプロテアーゼ切断確認（SDS-PAGE）
　14-2-3で用いられた抗体がプロテアーゼ処理で切断されているかSDS-PAGEで確認した。14-2-3で調製されたプロテアーゼ切断抗体／プロテアーゼ未処理抗体のうち、10μLを3.3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃5分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図27に示す。図27に示すように、プロテアーゼ切断配列を導入した各抗体はプロテアーゼ処理で切断された。
　14-2-5　プロテアーゼ処理前後の抗体のPD1結合評価
　プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体のプロテアーゼ処理前後のPD1に対する結合活性を別の方法でも測定した。
　14-2-1で調製したプロテアーゼ処理抗体またはプロテアーゼ未処理抗体10μLをPBS 70μLと混合し、PD1結合測定サンプルとした。サンプルのPD1結合評価はバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。14-2-1で調製したプロテアーゼ処理抗体／プロテアーゼ未処理抗体とヒトPD1 (250nM) をそれぞれTilted bottom (TW384) Microplates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。Protein Gセンサー（ForteBio, 18-0022）をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間抗体をProtein Gセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後ヒトPD1が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図28に示す。図28に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体を使用する場合、プロテアーゼ未処理抗体に比べて、プロテアーゼ処理抗体のヒトPD1結合量が減少した。
14-3．プロテアーゼ切断配列を導入した抗ヒトPD1中和抗体とリガンド(ヒトPD1)の複合体における、プロテアーゼによるリガンドリリース評価
　14-3-1　リガンド存在下のプロテアーゼ処理
　14-1で調製された抗体（終濃度0.100mg/mL）にPBSで6.67μMに調製したヒトPD1を10μL添加し、抗体-PD1複合体液を調製した。プロテアーゼ処理サンプルは、抗体-PD1複合体液にPBSで5.28μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を10μL加え、プロテアーゼ非処理サンプルはPBSのみを10μL加えた。反応時のプロテアーゼの終濃度は0.528μg/mLであった。各サンプルを37℃で12時間保温した。
　14-3-2　プロテアーゼ処理後のPD1リリースの評価
　抗体と複合体を形成していないPD1の量を実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。
　14-3-1で調製された各サンプル、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー（ForteBio, 18-0009）をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、プロテアーゼ処理サンプルまたはプロテアーゼ未処理サンプルが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図29に示す。図29に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各抗体の場合、プロテアーゼ未処理サンプルに比べ、プロテアーゼ処理サンプルの方では5C4-bioに結合するヒトPD1の量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により各抗体のPD1に対する結合活性が減弱し、抗体-PD1複合体からPD1が遊離し、リリースされた。
実施例15　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD1中和抗体とヒトPD1の融合タンパク質（抗PD1中和抗体‐PD1融合タンパク質）の作製及び評価
15-1．抗ヒトPD1中和抗体とヒトPD1の融合タンパク質の作製
　実施例14-1で作製された抗体の重鎖または重鎖改変体のN末端に、グリシン-セリンポリマー（配列番号：321）からなる可動リンカーを介してヒトPD1配列（配列番号：320）を接続し、PD1融合重鎖を作製した（表15）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　また、実施例14-1で作製された抗体の軽鎖または軽鎖改変体のN末端に、グリシン-セリンポリマー（配列番号：321）からなる可動リンカーを介してヒトPD1配列（配列番号：320）を接続し、PD1融合軽鎖を作製した（表16）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表15のPD1融合重鎖と軽鎖5C4L-KT0、または表16のPD1融合軽鎖と重鎖5C4H-G1T4を組み合わせた以下の抗PD1中和抗体-PD1融合タンパク質：
hPD15C4HA12aa-G1T4/5C4L-KT0（PD1融合重鎖配列番号：323、軽鎖配列番号：298）
hPD15C4HE12aa-G1T4E/5C4L-KT0（PD1融合重鎖配列番号：324、軽鎖配列番号：298）
5C4H-G1T4/hPD15C4LH12aa-KT0（重鎖配列番号：297、軽鎖配列番号：325）
5C4H-G1T4/hPD15C4LI12aa-KT0（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：326）
5C4H-G1T4/hPD15C4LC12aa-KT0（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：327）
5C4H-G1T4/hPD15C4LD12aa-KT0（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：328）
5C4H-G1T4/hPD15C4LE12aa-KT0E（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：329）
5C4H-G1T4/hPD15C4LB12aa-KT0B（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：330）
5C4H-G1T4/hPD15C4LF12aa-KT0F（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：331）
5C4H-G1T4/hPD15C4LG12aa-KT0G（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：332）
5C4H-G1T4/hPD15C4LJ12aa-KT0J（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：333）
5C4H-G1T4/hPD15C4LK12aa-KT0K（重鎖配列番号：297、PD1融合軽鎖配列番号：334）
を当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。なおプロテアーゼ切断配列を含まない対照抗体として5C4H-G1T4/5C4L-KT0（重鎖配列番号：297、軽鎖配列番号：298））を同様に発現および精製した。
15-2．抗PD1中和抗体‐PD1融合タンパク質のプロテアーゼによる切断評価
　15-2-1　プロテアーゼ処理
　プロテアーゼ処理融合タンパク質は15-1で調製された融合タンパク質30μgにPBSで16.7μg/mLに調製したRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systems 3946-SE-010) を4.9μL加えた。プロテアーゼ未処理融合タンパク質は15-1で調製された融合タンパク質30μgにPBSのみを4.9μL加えた。プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質を37℃で12時間保温した。
　15-2-2　プロテアーゼ処理によるPD1の遊離評価
　プロテアーゼ処理によるPD1遊離を実施例14-2-2で調製したビオチン化抗ヒトPD1中和抗体 (5C4-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。
　15-2-1で調製したプロテアーゼ処理融合タンパク質、プロテアーゼ未処理融合タンパク質、5C4-bio、PBSをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー（ForteBio, 18-0009）をPBSを用いて水和し、30℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間5C4-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施しその後プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図30に示す。図30に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された抗体を含む抗体-PD1融合タンパク質の場合、プロテアーゼ未処理サンプルに比べて、プロテアーゼ処理サンプルの方では5C4-bioに結合するヒトPD1の量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により融合タンパク質中の抗体のPD1に対する結合活性が減弱し、PD1が融合タンパク質から遊離した。
　15-2-3　抗PD1中和抗体-PD1融合タンパク質の切断の確認（SDS-PAGE）
　15-2-1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質がプロテアーゼ処理で切断されているかSDS-PAGEで確認した。15-2-1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質のうち、10μLを3.3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃5分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel(4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain(novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図31に示す。図31に示すように、プロテアーゼ切断配列を導入した抗体を含む融合タンパク質はプロテアーゼ処理で切断された。
　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
　本発明のリガンド結合分子は、リガンドを結合したまま生体内で運搬され、疾患組織において切断されてリガンドへの結合が弱まり、リガンドを疾患組織特異的にリリースできるので、疾患組織を特異的にリガンドに暴露することができる。また、当該リガンド結合分子は運搬時にリガンドの生物活性を抑制していることから、リガンドが全身的に作用してしまう恐れが減少し、疾患の治療に極めて有用である。

Claims (15)

  1. 　リガンドに結合可能な分子であって、当該分子は切断サイトを少なくとも一つ有するポリペプチドであり、且つ当該分子が少なくとも一つの切断サイトで切断された状態でリガンドとの結合が減弱される、リガンド結合分子。
  2. 　前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、請求項１に記載のリガンド結合分子。
  3. 　前記プロテアーゼは、標的組織特異的プロテアーゼである、請求項２に記載のリガンド結合分子。
  4. 　前記リガンド結合分子は抗体VHと、抗体VLと、抗体定常領域を含む、請求項１から請求項３のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  5. 　前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列は、前記抗体定常領域と前記抗体VHの境界付近、または／および前記抗体定常領域と前記抗体VLとの境界付近に位置する、請求項４に記載のリガンド結合分子。
  6. 　前記リガンド結合分子中の前記抗体VLと前記抗体VHは会合しており、当該会合は前記切断サイトが切断されることにより解消される、または前記プロテアーゼ切断配列がプロテアーゼで切断されることにより解消される、請求項４もしくは請求項５に記載のリガンド結合分子。
  7. 　前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記リガンド結合分子は前記リガンドとの結合で前記リガンドの生物活性を阻害する、請求項１から請求項６のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  8. 　前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、請求項１から請求項７のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  9. 　前記リガンド結合分子はIgG抗体である、請求項１から請求項８のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  10. 　前記リガンドと結合している、請求項１から請求項９のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  11. 　前記リガンドと融合されている、請求項１から請求項９のいずれかに記載のリガンド結合分子。
  12. 　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
  13. 　請求項１から請求項１０いずれかに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
  14. 　請求項１から請求項９のいずれかに記載のリガンド結合分子とリガンドが融合されている融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  15. 　請求項１から請求項１１のいずれかに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019230868A1 (ja) * 2018-05-30 2019-12-05 中外製薬株式会社 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
WO2020065096A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Pierre Fabre Medicament New immunocytokines for the treatment of cancer
WO2020116498A1 (ja) * 2018-12-04 2020-06-11 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３リガンド
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
EP3719035A4 (en) * 2017-11-28 2021-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE WITH ANTIGEN-BINDING AREA AND CARRYING SECTION
EP3719036A4 (en) * 2017-11-28 2021-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha LIGANDBINDING MOLECULE WITH ADJUSTABLE LIGANDBINDING ACTIVITY
JP2021523741A (ja) * 2018-05-14 2021-09-09 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法
US11168139B2 (en) 2016-11-28 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
JP2021530243A (ja) * 2018-07-25 2021-11-11 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドAskGene Pharma, Inc. 新規ｉｌ−２１プロドラッグおよびそれを使用する方法
CN114127277A (zh) * 2019-06-05 2022-03-01 中外制药株式会社 蛋白酶底物和包含蛋白酶切割序列的多肽
US20230069996A1 (en) * 2020-01-20 2023-03-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding fusion proteins
WO2023120643A1 (ja) 2021-12-23 2023-06-29 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３発現細胞遊走活性が増強したｃｘｃｒ３リガンド。
US12060654B2 (en) 2016-11-28 2024-08-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
US12077577B2 (en) 2018-05-30 2024-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety
EP4373862A4 (en) * 2021-07-19 2025-12-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd TARGET-SPECIFIC CYTOKINE ADMINISTRATION MEDIATRED BY A PROTEASE USING A FUSION POLYPEPTIDE

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210081372A (ko) * 2018-10-22 2021-07-01 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 절단 가능한 cxcr3의 활성제 및 이의 사용 방법
CA3141626A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 AskGene Pharma, Inc. Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof
US20220281934A1 (en) * 2019-08-29 2022-09-08 Antagonis Biotherapeutics Gmbh T-cell mobilizing cxcl10 mutant with increased glycosaminoglycan binding affinity
CA3165927A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 AskGene Pharma, Inc. Novel masked cytokines and methods of use thereof
EP3889183A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-06 Pierre Fabre Medicament A protein complex comprising an immunocytokine
CN120112547A (zh) 2022-11-16 2025-06-06 瑞泽恩制药公司 包含膜结合il-12和蛋白酶可裂解接头的嵌合蛋白

Citations (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995001937A1 (fr) 1993-07-09 1995-01-19 Association Gradient Procede de traitement de residus de combustion et installation de mise en ×uvre dudit procede
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996002576A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
WO2002032925A2 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2003000883A1 (fr) 2001-06-22 2003-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibiteurs de proliferation cellulaire renfermant un anticorps anti-glypicane 3
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
WO2004022754A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MRL/lprマウスを用いた抗体の作製
WO2004021861A2 (en) 2002-09-03 2004-03-18 Vit Lauermann Targeted release
WO2004044011A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
WO2006006693A1 (ja) 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
WO2008016854A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 The Uab Research Foundation Methods and compositions related to soluble monoclonal variable lymphocyte receptors of defined antigen specificity
WO2009025846A2 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2010081173A2 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
WO2013128194A1 (en) 2012-02-28 2013-09-06 The University Of Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
JP2013538204A (ja) * 2010-08-24 2013-10-10 ロシュ グリクアート アーゲー 活性化可能な二重特異性抗体
WO2015048329A2 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2015116933A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
WO2016046778A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Amgen Inc Protease-activatable bispecific proteins
WO2016118629A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof
US20160311903A1 (en) 2015-03-13 2016-10-27 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179285A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179335A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179257A2 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003234775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Dnavec Research Inc. Vector with modified protease-dependent tropism
JP2005168328A (ja) 2003-12-08 2005-06-30 Hokkaido Univ シグナル伝達活性を有する細胞質蛋白質の活性制御方法
PL1691837T3 (pl) 2003-12-10 2012-11-30 Squibb & Sons Llc IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie
JP5629423B2 (ja) 2004-04-12 2014-11-19 カタリスト バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 野生型及び変異型ｍｔ−ｓｐ１による、ｖｅｇｆ及びｖｅｇｆ受容体の切断
MY157915A (en) 2004-12-21 2016-08-15 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses.
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
AU2006284651C1 (en) 2005-08-31 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
JP2009519011A (ja) 2005-12-01 2009-05-14 ドマンティス リミテッド インターロイキン１受容体１型に結合する非競合ドメイン抗体フォーマット
EA200801166A1 (ru) 2005-12-01 2008-12-30 Домантис Лимитед Форматы конкурентного доменного антитела, которые связываются с рецептором интерлейкина 1 первого типа
TWI417301B (zh) 2006-02-21 2013-12-01 Wyeth Corp 對抗人類介白素-２２（ｉｌ-２２）之抗體及其用途
SG175602A1 (en) 2006-07-05 2011-11-28 Catalyst Biosciences Inc Protease screening methods and proteases identified thereby
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
CA2678626A1 (en) 2007-02-28 2008-09-04 Novimmune S.A. Anti-ip-10 antibodies and methods of use thereof
CA2688433A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
EP2158221B1 (en) 2007-06-21 2018-08-29 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
CA2696263C (en) 2007-08-15 2017-06-13 Bing Liu Monospecific and multispecific antibodies and method of use
AU2016213702C1 (en) 2007-08-22 2018-11-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
NZ595461A (en) 2009-04-10 2013-01-25 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
JP2011026294A (ja) 2009-06-26 2011-02-10 Canon Inc 化合物
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
EP2553101A4 (en) 2010-04-02 2013-09-04 Univ Rochester PROTEASE-ACTIVATED CYTOKINES
US9193791B2 (en) 2010-08-03 2015-11-24 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects
WO2012028697A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Eth Zürich, Institute Of Molecular Biology And Biophysics Affinity purification system based on donor strand complementation
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
US9975962B2 (en) 2012-03-30 2018-05-22 Bayer Healthcare Llc Thrombin/plasmin-regulated antibodies that bind TFPI
MX357540B (es) 2012-04-06 2018-07-13 Omeros Corp Composiciones y metodos para inhibir masp-1 y/o masp-2 y/o masp-3 para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxistica nocturna.
EP2852617B1 (en) 2012-05-22 2018-12-12 Life Technologies AS Recombinant antibody compositions and methods of use thereof
EP2863948B1 (en) 2012-06-22 2018-10-24 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
WO2014125955A1 (ja) 2013-02-15 2014-08-21 国立大学法人京都工芸繊維大学 抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用
WO2015066279A2 (en) 2013-10-30 2015-05-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
WO2015089283A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies that bind activatable antibodies and methods of use thereof
WO2015117930A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
GB201413357D0 (en) 2014-07-28 2014-09-10 Philogen Spa Antibodies for treatment and diagnosis
MX2017006016A (es) 2014-11-11 2017-06-19 Amunix Operating Inc Composiciones conjugadas de xten direccionadas y metodos para producir las mismas.
EP3296395B2 (en) 2015-05-13 2024-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multiple antigen binding molecular fusion, pharmaceutical composition, method for identifying linear epitope, and method for preparing multiple antigen binding molecular fusion
WO2017025698A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Queen Mary University Of London Bispecific, cleavable antibodies
WO2017162587A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
MY200695A (en) 2016-11-03 2024-01-11 Bristol Myers Squibb Co Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
JP7626577B2 (ja) 2016-11-28 2025-02-07 中外製薬株式会社 リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
BR112019008727A2 (pt) 2016-11-28 2019-07-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha domínio de ligação ao antígeno, e polipeptídeo incluindo seção de transporte
RU2754058C2 (ru) 2016-12-13 2021-08-26 Астеллас Фарма Инк. Антитело к cd73 человека
JP7249961B2 (ja) 2017-06-02 2023-03-31 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３およびアグリカンに結合するポリペプチド
NZ759601A (en) 2017-06-02 2023-06-30 Merck Patent Gmbh Aggrecan binding immunoglobulins
JP2020530280A (ja) 2017-07-03 2020-10-22 トルク セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫刺激性融合分子およびその使用
US20190038935A1 (en) 2017-08-07 2019-02-07 Timofey Ignatyev Exercise game and apparatus employing color-changing base locations
CN107602706B (zh) 2017-10-16 2020-12-04 湖北大学 一种切割效率增强的hrv 3c蛋白酶底物突变体及其应用
JP7482630B2 (ja) 2017-11-28 2024-05-14 中外製薬株式会社 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
TWI880235B (zh) 2017-11-28 2025-04-11 日商中外製藥股份有限公司 可調整配體結合活性的配體結合分子
KR102020131B1 (ko) 2017-12-29 2019-09-09 박성원 광경화성 조성물 및 이를 이용하여 제조된 성형품
EP3762406A2 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Askgene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
US20210253672A1 (en) 2018-05-30 2021-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule containing single domain antibody
JP7428661B2 (ja) 2018-05-30 2024-02-06 中外製薬株式会社 Ｉｌ－１ｒ１結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
JP7414736B2 (ja) 2018-05-30 2024-01-16 中外製薬株式会社 アグリカン結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
US20210355219A1 (en) 2018-09-21 2021-11-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Conditionally activated target-binding molecules
US20220002370A1 (en) 2018-09-27 2022-01-06 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
AU2019355971B2 (en) 2018-10-03 2025-05-08 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CN114127277A (zh) 2019-06-05 2022-03-01 中外制药株式会社 蛋白酶底物和包含蛋白酶切割序列的多肽
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
BR112022001320A2 (pt) 2019-07-25 2022-04-12 Univ Chicago Composições e métodos compreendendo agentes terapêuticos ativados por protease
EP4093875A4 (en) 2020-01-20 2024-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding fusion proteins
CN117957258A (zh) 2021-07-19 2024-04-30 中外制药株式会社 利用融合多肽的蛋白酶介导的靶向特异性细胞因子递送

Patent Citations (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995001937A1 (fr) 1993-07-09 1995-01-19 Association Gradient Procede de traitement de residus de combustion et installation de mise en ×uvre dudit procede
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996002576A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
WO2002032925A2 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
WO2003000883A1 (fr) 2001-06-22 2003-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibiteurs de proliferation cellulaire renfermant un anticorps anti-glypicane 3
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
WO2004021861A2 (en) 2002-09-03 2004-03-18 Vit Lauermann Targeted release
WO2004022754A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MRL/lprマウスを用いた抗体の作製
WO2004044011A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
WO2006006693A1 (ja) 2004-07-09 2006-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体
WO2008016854A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 The Uab Research Foundation Methods and compositions related to soluble monoclonal variable lymphocyte receptors of defined antigen specificity
WO2009025846A2 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2010081173A2 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
JP2013538204A (ja) * 2010-08-24 2013-10-10 ロシュ グリクアート アーゲー 活性化可能な二重特異性抗体
WO2013128194A1 (en) 2012-02-28 2013-09-06 The University Of Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
WO2015048329A2 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2015116933A2 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
WO2016046778A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Amgen Inc Protease-activatable bispecific proteins
WO2016118629A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof
US20160289324A1 (en) 2015-01-20 2016-10-06 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
US20160311903A1 (en) 2015-03-13 2016-10-27 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179285A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179335A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-itga3 antibodies, activatable anti-itga3 antibodies, and methods of use thereof
WO2016179257A2 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, and methods of use thereof

Non-Patent Citations (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
"GenBank", Database accession no. AB009864
ANAL. BIOCHEM., vol. 162, no. 1, 1987, pages 156 - 159
ANNU REV IMMUNOL, vol. 33, 2015, pages 139 - 67
ASANO,RYUTARO, KUMAGAI, IZUMI: "Functionalization of Bispecific Therapeutic Antibodies based on Protein Engineering", YAKUGAKU ZASSHI, vol. 135, no. 7, 1 July 2015 (2015-07-01), pages 851 - 856, XP055600128, DOI: 10.1248/yakushi.15-00007-2 *
BEILSTEIN J NANOTECHNOL, vol. 7, 2016, pages 364 - 373
BELPERIO ET AL.: "CXC Chemokines in Angiogenesis", J. LEUKOC. BIOL., vol. 68, 1 December 1999 (1999-12-01)
BENNETT ET AL., J IMMUNOL, vol. 170, 2003, pages 711 - 8
BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 426, 2010, pages 219 - 228
BIOCHEMISTRY, vol. 18, no. 24, 1979, pages 5294 - 5299
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1824, no. 1, January 2012 (2012-01-01), pages 133 - 45
BLANK ET AL., CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 54, 2005, pages 307 - 314
BROWN ET AL., J. IMMUNOL., vol. 170, 2003, pages 1257 - 66
BRUCE, L. ET AL.: "Radiolabeled Chemokine binding assays", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 138, 2000, pages 129 - 134
C. EUR. J. IMMUNOL., vol. 6, no. 7, 1976, pages 511 - 519
CARTER ET AL., EUR J IMMUNOL, vol. 32, 2002, pages 634 - 43
CELL, vol. 8, no. 3, 1976, pages 405 - 415
CHOTHIALESK, J. MOL. BIOL., vol. 196, 1987, pages 901 - 917
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
CURR OPIN IMMUNOL, vol. 40, June 2016 (2016-06-01), pages 96 - 102
CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 81, 1978, pages 1 - 7
DIS MODEL MECH, vol. 7, no. 2, February 2014 (2014-02-01), pages 193 - 203
DONG ET AL., J. MOL. MED., vol. 81, 2003, pages 281 - 7
DONG ET AL., NAT. MED., vol. 8, 2002, pages 787 - 9
DUFOUR ET AL.: "IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking", J IMMUNOL., vol. 168, 2002, pages 3195 - 204
EXPERT OPIN INVESTIG DRUGS, vol. 18, no. 7, July 2009 (2009-07-01), pages 991 - 1000
FREEMAN ET AL., J EXP MED, vol. 192, 2000, pages 1027 - 34
GAZITT, Y., J. HEMATOTHER STEM CELL RES, vol. 10, 2001, pages 229 - 36
GERSPACH J, NÉMETH J, MÜNKEL S, WAJANT H, PFIZENMAIER K.: ""Target-selective activation of a IFN prodrug by Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA) mediated Proteolytic processing at the cell surface"", CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER. , vol. 55, no. 12, December 2006 (2006-12-01), pages 1590 - 1600, XP019422516, DOI: 10.1007/s00262-006-0162-6 *
GERSPACH JLNEMETH JMUNKEL SWAJANT HPFIZENMAIER K: "Target-selective activation of a TNF prodrug by urokinase-type plasminogen activator (uPA) mediated proteolytic processing at the cell surface", CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER, vol. 55, no. 12, December 2006 (2006-12-01), pages 1590 - 600, XP019422516, DOI: doi:10.1007/s00262-006-0162-6
GLADKOV ORAMLAU RSERWATOWSKI PMILANOWSKI JTOMECZKO JKOMAMITSKY PBKRAMER DKRZAKOWSKI MJ: "Cyclophosphamide and tucotuzumab (huKS-IL2) following first-line chemotherapy in responding patients with extensive-disease small-cell lung cancer", ANTICANCER DRUGS, vol. 26, no. 10, November 2015 (2015-11-01), pages 1061 - 8
HANSEN ET AL., IMMUNOGENICS, vol. 10, 1980, pages 247 - 260
HATTORI ET AL., BLOOD, vol. 97, 2001, pages 3354 - 59
HUTLOFF ET AL., NATURE, vol. 397, 1999, pages 263 - 266
ISHIDA ET AL., EMBO J, vol. 11, 1992, pages 3887 - 95
IWAI ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 12293 - 7
J INFLAMM (LOND, vol. 7, 2010, pages 45
J. EXP. MED., vol. 148, no. 1, 1978, pages 313 - 323
J. IMMUNOL. METHODS, vol. 35, no. 1-2, 1980, pages 1 - 21
J. IMMUNOL., vol. 123, no. 4, 1979, pages 1548 - 1550
JANICE M REICHERTCLARK J ROSENSWEIGLAURA B FADENMATTHEW C DEWITZ: "Monoclonal antibody successes in the clinic", NAT. BIOTECHNOL., vol. 23, 2005, pages 1073 - 1078, XP002555770, DOI: doi:10.1038/nbt0905-1073
JOHN PUSKAS ET AL.: "Development of an attenuated interleukin-2 fusion protein that can be activated by tumour-expressed proteases", IMMUNOLOGY, vol. 133, no. 2, 23 March 2011 (2011-03-23), pages 206 - 220, XP055073392, DOI: 10.1111/j.1365-2567.2011.03428.x *
KIESEIER ET AL.: "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10", BRAIN, vol. 125, 2002, pages 823 - 34
KINDT ET AL.: "Kuby Immunology", 2007, W.H. FREEMAN AND CO., pages: 91
KOHLERMILSTEIN ET AL., METHODS ENZYMOL, vol. 73, 1981, pages 3 - 46
KOHLERMILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
KONISHI ET AL., CLIN. CANCER RES., vol. 10, 2004, pages 5094 - 100
LATCHMAN ET AL., NAT IMMUNOL, vol. 2, 2001, pages 261 - 8
MABS, vol. 6, no. 1, January 2014 (2014-01-01), pages 204 - 18
MACCALLUM ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 262, 1996, pages 732 - 745
MACHDRANOFF, CURR. OPIN. IMMUNOL., vol. 12, 2000, pages 571 - 75
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
METHODS ENZYMOL., vol. 323, 2000, pages 325 - 40
MOL CELL BIOL, vol. 8, 1988, pages 466 - 472
MULLBERG ET AL., J. IMMUNOL., vol. 152, no. 10, 1994, pages 4958 - 4968
N. BIOTECHNOL., vol. 28, no. 5, 2011, pages 253 - 457
NAGASAWA, T., INT. J. HEMATOL., vol. 72, 2000, pages 408 - 11
NAT CELL BIOL, vol. 18, no. 1, January 2016 (2016-01-01), pages 43 - 53
NAT IMMUNOL, vol. 13, no. 8, 19 July 2012 (2012-07-19), pages 722 - 8
NAT REV CANCER, vol. 3, no. 7, July 2003 (2003-07-01), pages 489 - 501
NAT REV DRUG DISCOV, vol. 13, no. 12, December 2014 (2014-12-01), pages 904 - 27
NAT REV DRUG DISCOV, vol. 9, no. 9, September 2010 (2010-09-01), pages 690 - 701
NAT REV IMMUNOL, vol. 6, no. 7, July 2006 (2006-07-01), pages 541 - 50
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 19, 2001, pages 661 - 667
NATURE IMMUNOLOGY, vol. 9, 2008, pages 949 - 952
NATURE, vol. 276, no. 5685, 1978, pages 269 - 270
NATURE, vol. 277, no. 5692, 1979, pages 131 - 133
NATURE, vol. 344, 12 April 1990 (1990-04-12), pages 667 - 670
NIELSEN ET AL., LUPUS, vol. 13, 2004, pages 510
NISHIMURA ET AL., IMMUNITY, vol. 11, 1999, pages 141 - 51
NISHIMURA ET AL., SCIENCE, vol. 291, 2001, pages 319 - 22
NOMURA ET AL., INT. J. CANCER, vol. 91, 2001, pages 597 - 606
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 9.47-9.58, no. 8, 1989, pages 2919 - 2932
OKAZAKI ET AL., CURR. OPIN. IMMUNOL., vol. 14, 2002, pages 391779 - 82
OKAZAKI ET AL., PNAS, vol. 98, 2001, pages 13866 - 71
PAOLONI MMAZCKO CSELTING KLANA SBARBER LPHILLIPS JSKORUPSKI KVAIL DWILSON HBILLER B: "Defining the Pharmacodynamic Profile and Therapeutic Index of NHS-IL12 Immunocytokine in Dogs with Malignant Melanoma", PLOS ONE, vol. 10, no. 6, 19 June 2015 (2015-06-19), pages e0129954
PAPADIA F, BASSO VPATUZZO RMAURICHI ADI FLORIO AZARDI LVENTURA EGONZALEZ-IGLESIAS RLOVATO VGIOVANNONI LTASCIOTTI A: "Isolated limb perfusion with the tumor-targeting human monoclonal antibody-cytokine fusion protein L19-TNF plus melphalan and mild hyperthermia in patients with locally advanced extremity melanoma", J SURG ONCOL, vol. 107, no. 2, February 2013 (2013-02-01), pages 173 - 9, XP055413902, DOI: doi:10.1002/jso.23168
PAUL D. PONATH ET AL.: "Methods in Molecular Biology", vol. 138, 2000, HUMANA PRESS, article "Transwell Chemotaxis", pages: 113 - 120
PAVLOU AKBELSEY MJ.: "The therapeutic antibodies market", EUR. J. PHARM. BIOPHARM., vol. 59, no. 3, 2005, pages 389 - 396, XP025317626, DOI: doi:10.1016/j.ejpb.2004.11.007
PLOS ONE, vol. 5, no. 9, 13 September 2010 (2010-09-13), pages el2700
PNAS, vol. 110, no. 1, 2 January 2013 (2013-01-02), pages 93 - 98
PNAS, vol. 97, 2000, pages 7754 - 7759
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 103, no. 11, 2006, pages 4005 - 4010
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, no. 23, 1988, pages 8998 - 9002
PROKUNIAALARCON-RIQUELME, HUM MOL GENET, vol. 13, 2004, pages R143
PROTEIN ENGINEERING, vol. 9, no. 3, 1996, pages 299 - 305
PUSKAS JLSKROMBOLAS DSEDLACEK ALORD ESULLIVAN MFRELINGER J: "Development of an attenuated interleukin-2 fusion protein that can be activated by tumour-expressed proteases", IMMUNOLOGY, vol. 133, no. 2, June 2011 (2011-06-01), pages 206 - 20, XP055073392, DOI: doi:10.1111/j.1365-2567.2011.03428.x
RAPHAELE, B ET AL.: "Calcium Mobilization", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 138, 2000, pages 143 - 148
RESPIR RES, vol. 17, 4 March 2016 (2016-03-04), pages 23
ROTHLISBERGER ET AL., J MOL BIOL., vol. 347, no. 4, 8 April 2005 (2005-04-08), pages 773 - 89
SALAMA ET AL., J EXP MED, vol. 198, 2003, pages 71 - 78
STEM CELLS TRANSL MED, vol. 4, no. 1, January 2015 (2015-01-01), pages 66 - 73
TZENG AKWAN BHOPEL CFNAVARATNA TWITTRUP KD: "Antigen specificity can be irrelevant to immunocytokine efficacy and biodistribution", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 112, no. 11, 17 March 2015 (2015-03-17), pages 3320 - 5, XP002779698
VANDAMME ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 192, no. 3, 1990, pages 767 - 775
WEINER LMSURANARWANG S.: "Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy", NAT. REV. IMMUNOL., vol. 10, no. 5, 2010, pages 317 - 327, XP055217481, DOI: doi:10.1038/nri2744

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12060654B2 (en) 2016-11-28 2024-08-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand binding activity
US11932697B2 (en) 2016-11-28 2024-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
US11168139B2 (en) 2016-11-28 2021-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding domain, and polypeptide including conveying section
US12030955B2 (en) 2017-11-28 2024-07-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
EP3719035A4 (en) * 2017-11-28 2021-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE WITH ANTIGEN-BINDING AREA AND CARRYING SECTION
EP3719036A4 (en) * 2017-11-28 2021-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha LIGANDBINDING MOLECULE WITH ADJUSTABLE LIGANDBINDING ACTIVITY
US12195528B2 (en) 2017-11-28 2025-01-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule having adjustable ligand-binding activity
JP2021523741A (ja) * 2018-05-14 2021-09-09 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法
JP7497340B2 (ja) 2018-05-14 2024-06-10 ウェアウルフ セラピューティクス， インコーポレイテッド 活性化可能なインターロイキン１２ポリペプチド及びその使用方法
US12077577B2 (en) 2018-05-30 2024-09-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide comprising aggrecan binding domain and carrying moiety
WO2019230868A1 (ja) * 2018-05-30 2019-12-05 中外製薬株式会社 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
EP3816182A4 (en) * 2018-05-30 2022-07-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha LIGAND BINDING MOLECULE WITH SINGLE DOMAIN ANTIBODY
JP2021530243A (ja) * 2018-07-25 2021-11-11 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッドAskGene Pharma, Inc. 新規ｉｌ−２１プロドラッグおよびそれを使用する方法
CN113164558A (zh) * 2018-09-28 2021-07-23 皮埃尔法布雷医药公司 用于治疗癌症的新型免疫细胞因子
JP2022502443A (ja) * 2018-09-28 2022-01-11 ピエール、ファーブル、メディカマン 癌の処置のための新規な免疫サイトカイン
WO2020065096A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Pierre Fabre Medicament New immunocytokines for the treatment of cancer
JP7438975B2 (ja) 2018-12-04 2024-02-27 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３リガンド
JPWO2020116498A1 (ja) * 2018-12-04 2021-10-14 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３リガンド
WO2020116498A1 (ja) * 2018-12-04 2020-06-11 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３リガンド
EP3981428A4 (en) * 2019-06-05 2023-07-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protease substrate, and polypeptide including protease cleavage sequence
CN114127277A (zh) * 2019-06-05 2022-03-01 中外制药株式会社 蛋白酶底物和包含蛋白酶切割序列的多肽
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
JP2023510994A (ja) * 2020-01-20 2023-03-16 中外製薬株式会社 リガンド結合融合タンパク質
US20230069996A1 (en) * 2020-01-20 2023-03-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding fusion proteins
EP4373862A4 (en) * 2021-07-19 2025-12-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd TARGET-SPECIFIC CYTOKINE ADMINISTRATION MEDIATRED BY A PROTEASE USING A FUSION POLYPEPTIDE
WO2023120643A1 (ja) 2021-12-23 2023-06-29 中外製薬株式会社 Ｃｘｃｒ３発現細胞遊走活性が増強したｃｘｃｒ３リガンド。

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