WO2018070652A1 - 당화혈색소 정량분석용 키트 - Google Patents

당화혈색소 정량분석용 키트 Download PDF

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WO2018070652A1
WO2018070652A1 PCT/KR2017/008700 KR2017008700W WO2018070652A1 WO 2018070652 A1 WO2018070652 A1 WO 2018070652A1 KR 2017008700 W KR2017008700 W KR 2017008700W WO 2018070652 A1 WO2018070652 A1 WO 2018070652A1
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solution
kit
glycated hemoglobin
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신동헌
김지훈
조주영
박갑수
김형은
조현규
이석원
남학현
차근식
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주식회사 아이센스
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology

Definitions

  • the present invention relates to a kit for glycated hemoglobin quantitative analysis.
  • the cartridge type POCT has high user convenience when measuring the biological sample supply unit, the reaction reagent, and the detection site in one cartridge. .
  • HbA1c refers to hemoglobin combined with glucose
  • the measurement of glycated hemoglobin contained in the blood can measure the average blood glucose level of the patient for 3 to 4 months regardless of the presence of the meal and the physical condition of the patient.
  • it can be used as an index for evaluating the efficiency of the blood sugar management method that patients are performing, which has attracted attention recently.
  • glycated hemoglobin levels of 6.5% or higher should be measured by the National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP).
  • WHO World Health Organization
  • glycated hemoglobin measurement has been used only for the monitoring of diabetic patients, but the glycated hemoglobin measurement can be used for diagnosing diabetes based on strict quality assurance and standardized methods.
  • KR 10-2012-0013841 discloses a hemolytic reagent composition capable of performing quantitative analysis of glycated hemoglobin using an enzyme method.
  • fructosyl peptide oxidase (FPOX) in the enzyme assay reagent is known to have a poor thermal stability and significantly lower its activity over time at room temperature.
  • the inventors of the present invention while trying to ensure the long-term stability of the enzyme reagents used in the enzyme measurement method for measuring glycated hemoglobin and to improve the durability and accuracy of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit including the same, according to the present invention
  • the glycated hemoglobin quantitative analysis kit is excellent in the long-term stability of the enzyme reagents to confirm that the disadvantages of the reagents used in the conventional enzyme measurement method can be overcome the storage, accuracy, portability, ease of use, etc. and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a glycosylated hemoglobin quantitative kit comprising a sample with improved long-term stability.
  • the present invention comprises a first composition comprising a saccharide and a nitrite compound
  • a second composition comprising at least one selected from the group consisting of sugars, amino acids, sugar alcohols and polyamines, and proteases and oxidants;
  • a third composition comprising at least one selected from the group consisting of saccharides and organic polymers, and FAOD (Fructosyl amino acid oxidase);
  • kit for glycated hemoglobin quantitative analysis comprising a; 4 composition comprising a saccharide and a coloring reagent.
  • Glycated hemoglobin quantitative analysis kit has excellent long-term stability of the enzyme reagent has the effect that can easily overcome the disadvantages of the reagents used in conventional enzyme measurement, storage, accuracy, portability, ease of use, etc. .
  • Figure 1 shows the specific structure of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention as an example.
  • Figure 2 shows a specific front perspective view of the glycosylated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention as an example.
  • Figure 3 is a front perspective view showing the reaction cartridge as an example of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention.
  • Figure 4 is an image showing the reaction solution storage chamber provided in the kit for quantified glycated hemoglobin according to the present invention.
  • FIG. 5 is an image showing an insertable sample cartridge of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention.
  • the insert sample cartridge 100 is inserted into the reaction cartridge 200 and the reaction solution storage chamber 301 is moved toward the cover tape rupture portion 202 at the same time Accordingly, the reaction liquid is an image indicating that the reaction liquid flows out of the reaction liquid storage chamber 301 and moves to the mixing unit 204.
  • Figure 7 is a graph showing the results of evaluating the thermal stability over time of FPOX (fructosyl peptide oxidase (fructosyl peptide oxidase) reagent).
  • FIG. 8 is a graph showing the results of evaluating thermal stability over time after adding trehalose, mannitol, or dextran to a mixture of FPOX and peroxidase (POD) reagents to be.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of evaluating thermal stability over time after adding various kinds of stabilizers to the FPOX and POD reagent mixture.
  • the unit of the number located at the top of FIG. 9 is minute (min); Tre is Trehalose, PEG is Polyethylene glycol, PVP is Polyvinylpyrrolidone, PVA is Polyvinyl Alcohol, PAA is Polyacryl acid, PAS means paraaminosalicylic acid and Man means mannitol.
  • 10 is a graph showing the results of evaluating thermal stability over time after adding a buffer having various types and various pH values to FPOX at 40 °C.
  • the numerical value on the right means each pH value.
  • 11 is a graph showing the results of evaluating thermal stability over time after adding a buffer having various types and various pH values to FPOX at 50 °C.
  • the numerical value on the right means each pH value.
  • the numerical value on the right means each pH value.
  • FIG. 12 is a graph showing evaluation results of thermal stability of FPOX observed when trehalose is added to FPOX at various concentrations.
  • FIG. 13 is a graph showing evaluation results of thermal stability of FPOX observed when FPOX is treated with trehalose alone or when trehalose is mixed with other types of stabilizers.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of evaluation of thermal stability over time after adding trehalose and a buffer to FPOX.
  • 15 is a graph showing the results of measuring the turbidity of the solution when FPOX was treated with trehalose alone or additionally mixed with Neo Protein Saver, known as a protein stabilizer.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of comparing and evaluating the thermal stability of the reagent composition when FPOX was treated with trehalose alone and additionally with Neo Protein Saver.
  • 17 is a graph showing the results of evaluating the thermal stability of the reagent composition of FPOX, Trehalose, Neo Protein Savor (NPS), and buffer (100 mM phosphate buffer, pH 6.5).
  • FIG. 18 is a graph showing the results of evaluating the thermal stability of pronase over time when various kinds of small molecule stabilizers are treated with pronase.
  • 19 is a graph showing the results of evaluating the thermal stability of pronase over time when treated with various kinds of polymer stabilizer to pronase.
  • 20 is a graph showing the results of evaluating the stability of pronase over time when prohalase was treated with trehalose and various kinds of polymers as stabilizers.
  • FIG. 21 is a graph showing the results of evaluating thermal stability over time when various kinds of stabilizers are treated with neutral protease.
  • NP means neutral protease (Neutral protease, Tre is trehalose, SP is spermine, Arg is arginine).
  • FIG. 22 is a graph showing the background observed when various kinds of stabilizers are treated with neutral protease.
  • FIG. 24 is a graph showing changes in performance observed after DA-67 was treated with various kinds of stabilizers.
  • 25 is a graph showing the results of evaluating stability by refrigeration of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention.
  • 26 is a graph showing the results of evaluating the stability of the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention at room temperature.
  • the present invention comprises a first composition comprising a saccharide and a nitrite compound
  • a second composition comprising at least one selected from the group consisting of sugars, amino acids, sugar alcohols and polyamines, and proteases and oxidants;
  • a third composition comprising at least one selected from the group consisting of saccharides and organic polymers, and FAOD (Fructosyl amino acid oxidase);
  • kit for glycated hemoglobin quantitative analysis comprising a; 4 composition comprising a saccharide and a coloring reagent.
  • the second composition is a second composition comprising at least one selected from the group consisting of sugars, amino acids, sugar alcohols and polyamines and proteolytic enzymes;
  • a second composition comprising at least one member selected from the group consisting of sugars, amino acids, sugar alcohols and polyamines, and an oxidizing agent.
  • a combination of two selected from the respective compositions may be mixed with each other, and the combination of the two may be a combination of the second composition and the third composition.
  • the sugar may be at least one selected from the group consisting of monosaccharides, disaccharides and polysaccharides, more specifically, the monosaccharides are fructose, galactose, glucose, or mannose;
  • the disaccharide is sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose, or cellobiose;
  • the polysaccharide is Dextran, Diethylamino ethyl-Dextran, Dextrin, Cellulose or Beta-Glucans.
  • the amino acid is Arginine (Arginine), Sarcosine (Sarcosine), Alanine (Alanine), Cysteine (Cysteine), Aspartic acid (Aspartic acid), Glutamic acid (Glutamic acid), Phenylalanine, Glycine, Histidine (Histidine), Isoleucine, Lysine, Leucine, Methionine, Asparagine, Pyrrolysine, Proline, Glutamine, Serine ) And one or more selected from the group consisting of threonine can be used.
  • the sugar alcohol may be used at least one selected from the group consisting of mannitol, xylitol, Xylitol, sorbbitol, maltitol and erythritol.
  • polyamine 1 is selected from the group consisting of spermine, putrescine, spermidine, cadaverine, agmatine and ornithine. More than one species can be used.
  • the organic polymer may be polydiene, polyalkene, polyacrylic acid, polyacrylate, polyacrylamide, polymethacrylic acid, polymethacrylate, polymethacrylamide, polyvinyl ether, Polyvinyl thioether, polyvinyl alcohol, polyvinyl ketone, polyvinyl halide, polyvinyl nitrile, polyvinyl ester, polystyrene, polyphenylene, polyoxide, polycarbonate, polyester, Polyanhydrides, polyurethanes, polysulfonates, nitroso-polymers, polysiloxanes, polysulfides, polythioesters, polysulfones, polysulfonamides, polyamides, polyimines, polyureas , Polyaniline, polythiophene, polypyrrole, polyheterocyclic, polyether, polyphosphate and polysilsesquioxane Homopolymers and derivatives thereof and copolymers or derivative
  • the nitrite compound may be used one or more selected from the group consisting of sodium nitrite, potassium nitrite, magnesium nitrite and calcium nitrite.
  • the nitrite compound is preferably added at a concentration of 1-500 mM. If the nitrite compound is less than 1 mM, there is a problem in that hemoglobin protein structure is not sufficiently flexibly modified. If the nitrite compound is more than 500 mM, scattering occurs when the total hemoglobin concentration is measured.
  • protease is Pronase, Protease A, Protease N, Dispase, Neutral protease, Glu-C, Papain At least one selected from the group consisting of trypsin and pepsin can be used.
  • the protease is preferably added at 500-1000 U / mL. If the proteolytic enzyme is less than 500 U / mL, there is a problem that the sensitivity of the overall reaction is reduced, and if the proteolytic enzyme is more than 1000 U / mL, the enzymes used together are also decomposed together to degrade the reactivity.
  • the oxidizing agent may be used without limitation as long as it oxidizes hydrogen peroxide generated by FAOD, for example POD (Peroxidase) can be used.
  • the oxidizing agent is preferably added at 5-900 U / mL. If the oxidizing agent is less than 5 U / mL, there is a problem that the sensitivity of the overall reaction is lowered, and if the oxidizing agent exceeds 900 U / mL, the color of the enzyme itself is similar to the color of the hemoglobin to determine the glycated hemoglobin concentration There is a problem that interferes with it.
  • the FAOD (Fructosyl amino acid oxidase) is preferably FPOX (fructosyl peptide oxidase).
  • the FAOD is preferably added 1.0 U / mL to 300 U / mL. If the FAOD is less than 1.0 U / mL, there is a problem in that the sensitivity of the entire reaction is reduced. If the FAOD is more than 300 U / mL, there is a problem in that it is not economical because excessive FAOD is used more than necessary.
  • the color reagent was N- (carboxymethyl amino carbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine (DA-64; Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 10- (carboxymethyl amino carbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt (DA-67: Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 10- (N-methylcarbamoyl) -3,7-bis (dimethylamino) -1H- Phenothiazine (MCDP: product of Dojindo Laboratories), N, N, N ', N', N '', N ''-hexa-3-sulfopropyl-4,4 ', 4' '-triaminotriphenyl At least one selected from the group consisting of methane (TPM-PS: product of Dojindo Laboratories) and ortho phenylenediamine (OPD) may be used.
  • the coloring reagent is preferably added at a concentration of 5-100 mg / dL. If the coloring reagent is less than 5 mg / dL, there is a problem that it is not sufficient to induce color development. If the coloring reagent is more than 100 mg / dL, a spontaneous color change occurs, causing errors in spectroscopic measurements. there is a problem.
  • the coloring reagent is an unstable substance that is spontaneously discolored by the outside and temperature when used alone, so care must be taken in using it.
  • the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention may include a plurality of reagent fixing parts, wherein the first composition, the second composition, the third composition, and the fourth composition are each independently fixed to the plurality of reagent fixing parts. It is desirable to have.
  • the first composition, the second composition, the third composition and the fourth composition are preferably fixed to the reagent holding part in a dry state.
  • the glycated hemoglobin quantitative kit according to the present invention may be, for example, a cartridge having the following structure:
  • the cartridge for glycated hemoglobin quantitative analysis comprising an insertable sample cartridge for supplying a sample, and a reaction cartridge that can accommodate the inserted sample cartridge,
  • the reaction cartridge is
  • the cover including a cover tape attached to the opening to store a reaction solution capable of reacting with the sample therein and preventing leakage of the stored reaction solution;
  • a reaction liquid storage chamber having a tape-attached opening facing toward the reaction cartridge;
  • a cover tape rupture unit provided to face the cover tape of the reaction liquid storage chamber and spaced apart from the cover tape;
  • a mixing part for accommodating the reaction liquid flowing out as the cover tape is removed, and mixing the reaction liquid with the biological sample flowing out by contacting the sample inlet of the insertable sample cartridge to form a mixed liquid;
  • a reagent fixing part for fixing a sample to react with the mixed solution of the mixing part
  • a measuring unit optically measuring the result of the reaction
  • the insertable sample cartridge is
  • a capillary type sample injector having a sample inlet for collecting and storing a liquid biological sample and supplying the stored biological sample to the reaction cartridge;
  • the reaction cartridge may comprise a plurality of reagent fixtures;
  • the spilled reaction solution and the biological sample mixture may be moved to the measurement unit or the sample introduction unit along the flow path by gravity and centrifugal force caused by rotation of the entire cartridge;
  • the reaction cartridge may further include a waste solution processing unit for processing a mixed solution of a biological sample, a reaction solution and a chemical sample after measurement;
  • the reaction cartridge may further include an air outlet for smooth movement and collection of the waste liquid.
  • the enzyme method for quantitative analysis of glycated hemoglobin according to the present invention mainly consists of four chemical reactions.
  • the first reaction is a hemolytic reaction of a blood sample, which uses a reaction solution to destroy red blood cells in the blood to release hemoglobin.
  • the reaction solution used for the purpose of the hemolysis reaction may be prepared by various methods such as pH control, the use of a surfactant.
  • surfactants usable include, for example, 3- (dimethyl (3-tetradecaneamidopropyl) ammonio) propane-1-sulfonate; 4- (dimethyl (3-tetradecaneamidopropyl) ammonio) butane-1-sulfonate; Zwitterionic surfactants, such as 3- (dimethyl (tetradecyl) ammonio) propane-1-sulfonate, can be used.
  • the second reaction is the cleavage of glycated hemoglobin molecules using proteolytic enzymes, including protease A, protease N, dispase, pronase, Various enzymes such as Neutral protease, Glu-C, Papain, Trypsin, Pepsin and the like can be used.
  • proteolytic enzymes including protease A, protease N, dispase, pronase, Various enzymes such as Neutral protease, Glu-C, Papain, Trypsin, Pepsin and the like can be used.
  • the glycosylated hemoglobin from which red blood cells are hemolyzed can be selectively cleaved from sugar-Val-His- of the N-terminal ⁇ -chain of glycated hemoglobin to obtain monomolecular fructosyl amino acids.
  • the third reaction is the oxidation of glycated peptide or glycated amino acid molecules, which are produced by cleavage by proteolytic enzymes, using an oxidase called FPOX (Fructosyl peptide oxidase) to produce hydrogen peroxide.
  • FPOX Frazier oxidase oxidase
  • the fourth reaction is a color reaction.
  • the hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) generated through the third reaction is oxidized using hydrogen peroxide oxidase (POD, Peroxidase), and the coloring reagent and substrate due to the electrons released by the oxidation (substrate) is a chemical reaction that is reduced and discolored.
  • POD hydrogen peroxide oxidase
  • the glycated hemoglobin concentration in the blood sample may be quantified by comparing the amount of total hemoglobin measured through discoloration with the amount of total hemoglobin immediately after hemolysis from red blood cells prior to proteolytic enzyme treatment.
  • the amount of glycated hemoglobin relative to the total hemoglobin amount can be calculated and expressed as a percentage.
  • the total hemoglobin amount can be measured using a spectroscopic device such as UV / vis.
  • the four reactions are performed in a biochemical assay cartridge according to the present invention, and quantitative analysis of glycated hemoglobin through the cartridge structure shown in FIGS. 2 to 6. This will be described in detail with an example.
  • the kit for quantifying glycated hemoglobin according to the present invention is not limited thereto.
  • the insertable sample cartridge 100 In order to perform the analysis, blood is collected and stored in the sample inlet 101 of the insertable sample cartridge 100. Thereafter, the insertable sample cartridge 100 was inserted into the receiving portion 201 of the reaction cartridge 200, and the reaction solution storage chamber 301 opened the chamber moving frame 203 by the protrusion 102 of the insertable sample cartridge. As the cover tape 302 attached to the reaction liquid storage chamber is in contact with the cover tape rupture unit 202, the reaction liquid in the storage chamber is discharged and moved to the mixing unit 204. The spilled reaction solution comes into contact with the sample inlet 101 of the sample cartridge 100 and is mixed with the blood sample. Accordingly, the hemolysis reaction of the blood sample and the reaction solution proceeds. After the hemolysis reaction is performed, the reagent fixed by the blood sample is dissolved in the first sample fixing part in which one of the proteolytic enzyme, FPOX, and POD is fixed, thereby inducing an enzymatic reaction. .
  • the hemolysis reaction is performed in the mixing unit 204, and the reaction solution in which the enzyme reaction is completed by the first sample fixing unit is moved to the measuring unit 207 through the flow path 206 in the reaction cartridge due to the rotation and gravity of the cartridge. Done.
  • the reaction solution transferred to the measuring unit 207 measures the concentration of hemoglobin hemoglobin hemoglobin using the absorbance at 535 nm through a UV-Vis spectrometer.
  • the reaction solution of which the measurement of total hemoglobin is completed is moved to the second sample holder through the rotation of the cartridge.
  • the second sample fixing part is fixed with a reagent and a coloring reagent mixed with two other enzymes except for the enzyme immobilized on the first sample holding part, and the two enzyme reagents and the coloring reagent face each other (face to face) ) Structure.
  • the reaction solution moved to the second sample fixing part proceeds with both the enzyme reaction and the color reaction, and the reaction solution with the completion of the enzyme reaction and the color reaction is moved back to the measurement unit 207 through the rotation of the cartridge. Subsequently, the concentration of glycated hemoglobin, which is colored by the color reaction, is measured by using an absorbance at around 660 nm through a UV-Vis spectrometer.
  • the waste liquid having been analyzed is moved to the waste liquid treatment unit 208 by rotating the cartridge, and the waste liquid is absorbed and collected through the absorbent material in the waste liquid treatment unit 208.
  • glycated hemoglobin represents the ratio of glycated hemoglobin to the concentration of total hemoglobin.
  • the measurer when analyzing glycated hemoglobin using the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention, by moving the reaction solution through the rotation of the cartridge, it is possible to measure the absolute concentrations of total hemoglobin and glycated hemoglobin as well as performing the enzymatic reaction. It can be done in one cartridge.
  • the insertable sample cartridge 100 is inserted into the reaction cartridge 200, and at the same time, the reaction solution (hemolytic reagent in the case of glycated hemoglobin analysis) can be leaked to the mixing part in the reaction cartridge. Intervention can be minimized, and problems such as delayed analysis time and reduced accuracy of analysis can be prevented.
  • the reaction liquid storage chamber 301 is provided inside the reaction cartridge 200, the reaction liquid may be prevented from flowing out before the sample cartridge 100 is inserted.
  • glycosylated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention has been described with reference to specific embodiments, various modifications are possible, and those skilled in the art can make various modifications without departing from the claims of the present invention. It is understood that examples and modifications may be made.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 1.6 mg / ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.POD solution 50U POD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 1.6 mg / ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.DA-67 solution 4.8 mg / dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • the activity decreased rapidly with 120 hours, and the activity was completely lost after 500 hours. Similar changes were observed with 50 mM mannitol but remained slightly active after 500 hours (about 10%). On the other hand, for samples containing 100 mM trehalose or 1 wt% dextran, the activity was maintained at almost 95% or more until 200 hours elapsed, but then began to decrease, and then decreased to 75% after 500 hours.
  • trehalose and dextran significantly improved the thermal stability of the mixture of FPOX and POD. Since POD is generally known to have excellent thermal stability, trehalose and dextran can significantly improve the thermal stability of FPOX.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 1.6 mg / ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.DA-67 solution 4.8 mg / dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • 40U / mL FPOX was treated with 10 mM MES-NaOH buffer at pH 5.5, 10 mM MES-NaOH buffer at pH 6.0, 100 mM phosphate buffer (manufactured by TOYOBO) at pH 6.5 or 100 mM phosphate buffer at pH 7.0. 5 ⁇ l each was dispensed into each well of a separate 96 well plate, dried in a 50 ° C. oven for 2 hours and individually packaged. Individually packaged samples were stored at 40 ° C. and 50 ° C. for a long time. Thermal stability at 40 ° C or 50 ° C was evaluated by HbA1c measurement.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 1.6 mg / ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.POD solution 50U PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • FPOX + POD with the following composition (40U / ml FPOX, 400U / ml POD, 100 mM PB pH6.5, 1.5 mg / ml 3- (N, N-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate, + 0, 100, 200, 300, 400 , 500 mM trehalose) was dispensed 5 ⁇ l each and dried in a 50 ° C. oven for 2 hours. It was then stored in an oven at 50 ° C, and the change in residual activity over time was investigated.
  • composition 40U / ml FPOX, 400U / ml POD, 100 mM PB pH6.5, 1.5 mg / ml 3- (N, N-Dimethylmyristylammonio) propanesulfonate, + 0, 100, 200, 300, 400 , 500 mM trehalose
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 1.6 mg / ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.DA-67 solution 4.8 mg / dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 4000 U / ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.POD solution 50 U / mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • the treatment with trehalose alone showed a significant effect of improving the thermal stability of FPOX compared with the treatment with trehalose with other stabilizers.
  • the composition maintained about 95-100% of the initial activity in all compositions except 1% dextran and 5% PAA.
  • the activity of FPOX can be maintained at 50 degrees for one month or more depending on the ratio of FPOX, buffer conditions, and the like.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 4000 U / ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.POD solution 50 U / mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • FPOX treated with phosphate buffer (pH 6.5) and trehalose was maintained at 50 ° C. for at least about 70 days.
  • Slope represents activity, and in the case of Inter (Y intercept), the background absorbance (absorbance value in the case of no sample) of the measurement system itself.
  • Neo Protein Saver (NPS, TOYOBO), the active ingredient of amino acids and peptides, is commercially available as a protein stabilizer, 10 mL of a reagent mixture of 200 U / mL FPOX dissolved in 100 mM PB (pH6.5) and 500 mM trehalose. A turbidity at 330 nm was measured using a UV-Vis spectrometer to evaluate the solubility of each 10 mL solution of the composition mixed to 17 mg / mL. Every hour was measured until immediately after the solution was prepared for 3 hours, and when the OD value of the composition containing only 500 mM trehalose was calculated as 100%, the proportion of the composition containing NPS was calculated.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease solution 4000 U / ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , pH6.0
  • 3.POD solution 50 U / mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl 2 , 0.5 mM NaNO 2 , 1.25 mg / ml ASB-14, pH6.0
  • the FPOX mixture comprising trehalose and NPS was shown to maintain similar thermal stability as treated with trehalose for 14 days.
  • NPS NPS to the FPOX mixture solution containing trehalose ensures thermal stability and improves the uniformity of the solution.
  • the uniformity of the solution is then believed to contribute to the overall quality in the process of preparing the solution in cartridge form.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • Protease and POD solution 40000 U / ml Neutral Protease (from TOYOBO), 800 U / mL PD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, 100 mM Trehalose, pH6.0
  • Oxidation solution 300 mM NaNO 2 , 0.005wt% D10, pH8.0
  • compositions containing FPOX, trehalose, NPS, and buffers have been shown to maintain stability for at least about 63 days at a temperature of 50 degrees even when dispensed / dried onto cartridges.
  • the stabilizer was 100 mM or Thermal stability was assessed by further addition at a concentration of 1 wt%.
  • the stabilizers used in this experiment were largely divided into small molecule stabilizers and polymer stabilizers.
  • small molecule stabilizers trehalose, trimethylamine N-oxide (TMA-NO, Trimethylamine N-oxide), and spermine (SP, Spermine) were used.
  • TMA-NO trimethylamine N-oxide
  • SP Spermine
  • Spermidine SPD, Spermidine
  • arginine Arg, arginine
  • sarcosine Src, Sarcosine
  • Betaine mannitol
  • Dextran, PEG, PVP Dextrin for the polymer stabilizer Used.
  • trehalose was shown to maintain its stability for about 300 hours, and arginine, sarcosine, and mannitol. ), Spermine and the like also appeared to produce a stabilizing effect of more than 80%.
  • dextran was found to maintain its stability for about 300 hours, and dextrin was maintained at about 75% for PEG. , PVP has not been shown to induce thermal stabilization of pronase.
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • 3.POD solution 50U POD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl 2 , 2 mM NaNO 2 , 0.75 mg / ml ASB-14
  • composition of the other reagents used is as follows.
  • 3.POD solution 50U POD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl 2 , 2 mM NaNO 2 , 0.75 mg / ml ASB-14
  • the composition including NaNO 2 , D10, trehalose, and MES buffer prepared above maintained the initial value even after maintaining at 50 ° C. for 400 hours or more. This shows that NaNO 2 can be separated and dried.
  • the physical shape of the spot is different depending on the presence of trehalose, there was no difference in manufacturing process and performance.
  • DA-67 is a Formazan-based (synthesized from methylene blue structure) dye, which is a colorimetric reagent mainly used for the measurement of H 2 O 2 concentration with OD (peroxidase, peroxidase), produced and sold by WAKO. have.
  • DA-67 has a large absorbance change and has good color development ability.However, due to the low stability of the material itself, when it is exposed to light, it is rapidly decomposed, resulting in a colorless change from colorless to blue, which is difficult to handle. In order to efficiently use DA-67, screening of stabilizers was performed to minimize self-decomposition due to light exposure.
  • PAAS Poly (acrylic acid sodium salt)
  • PAA Poly (acrylic acid)
  • trehalose were inhibited from increasing Y inter.
  • PAAS and PAA PAA
  • DA-67 signal itself was inhibited.
  • Stability was confirmed through long-term measurements using the glycated hemoglobin quantitative kit stored in the refrigerator (2 ⁇ 8 °C) and constant temperature and humidity room (20 ⁇ 25 °C) of the refrigerator. Validation is described in EP25-A Evaluation of Stability of in Vitro Diagnostic Reagents; The procedure was conducted in accordance with the Approved Guideline and the KFDA's Criteria for Stability of Medical Devices.
  • the measurement procedure and method are as follows.
  • the glycated hemoglobin quantitative kit according to the present invention showed a stability of more than two years when refrigerated;
  • the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention showed a stability of 1 year or more when stored at room temperature.
  • the glycated hemoglobin quantitative analysis kit according to the present invention is excellent in the long-term stability of the enzyme reagents, the improved storage, accuracy, portability, ease of use, etc. disadvantages of the reagents used in conventional enzyme measurement, glycated hemoglobin It can be usefully used as a quantitative analysis kit.

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Abstract

본 발명은 당화혈색소 정량분석용 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 효소 시약의 장기안정성이 우수하여 종래의 효소 측정법에 사용되는 시약이 갖는 단점인 보관성, 정확성, 휴대성, 사용편의성 등이 용이하게 극복 가능한 효과가 있다.

Description

당화혈색소 정량분석용 키트
본 발명은 당화혈색소 정량분석용 키트에 관한 것이다.
현재 의료 진단 분야에 있어 혈액, 혈청, 소변, 세포액 등의 생체시료에 포함된 특정시료를 검출 또는 정량하기 위해서, 효소 분석(enzyme assay), 면역분석(immunoassay), 화학 비색 분석(chemical colorimetric assay), 전기화학적 분석(electrochemical assay), 형광 표지(fluorescence labeling) 및 측정, 화학발광 표지(chemiluminescent labeling) 및 측정 등의 다양한 분석 기술이 사용되고 있다. 이들 분석 기술은 대형병원의 임상시험센터 등에서 사용되는 자동분석장치와 같은 대형장비, 혹은 테스트 스트립(test strip), 카트리지(cartridge) 등의 플랫폼을 이용한 현장현시검사(Point-of-care testing, POCT) 장치에 응용되어 사용되고 있다.
대형의 장비를 사용하는 경우, 대량의 시료를 처리 가능하다는 점 및 측정값의 신뢰도가 높다는 장점이 있는 반면, 기계장치의 특성상 구조가 복잡하고 대형으로 이루어져 특정 검사실에서만 사용되기 때문에 사용 장소가 제한되는 단점이 있다. 또한, 생체시료의 전처리 과정이 필요한 경우가 많고, 여러 종류의 시약과 센서를 각각 주기적으로 교체하며 사용하여야 하므로, 유지관리 측면에서 번거로움이 많다.
한편, POCT의 경우, 대형장비에 비해 측정값의 신뢰도는 낮지만, 측정 장소의 제한을 받지 않고, 신속한 측정이 가능하다는 점에서 의료 진단 분야에서 넓게 사용되고 있다. 특히, 카트리지형 POCT는 여러 종류의 시약과 센서를 각각 구비 및 설치해야 하는 대형장비와는 달리, 생체시료 공급부와 반응시약, 그리고 검출 부위를 하나의 카트리지에 구성하였기 때문에, 측정 시 사용자 편의성이 높다. 또한, 측정 후 생체시료 노출에 의한 오염 위험성이 낮으므로 안정성 면에서도 이점이 있다.
한편, 당뇨병 진단에 있어 혈당 측정과 함께, 당화혈색소에 대한 현장검사의 필요성이 높아지고 있다. 당화혈색소(HbA1c)란 포도당과 결합한 혈색소를 이르는 말로, 혈액에 포함되는 당화혈색소의 측정은 식사 유무 및 환자의 신체상태에 구애받지 않고 환자의 3 내지 4달 동안의 평균 혈당 수치를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 환자가 실시하고 있는 혈당 관리 방법의 효율성을 평가할 수 있는 지표로 사용할 수 있어, 최근 주목받고 있다.
2010년 미국당뇨협회(American Diabetes Association)는 당화혈색소 수치가 6.5% 이상을 당뇨병 진단기준으로 제시하였고, NGSP(National Glycohemoglobin Standardization Program)에 인증된 검사로 측정되어야 한다고 명시하였다. 또한 2011년 국제보건기구(World Health Organization; WHO)는 지금까지 당화혈색소 측정은 단순히 당뇨병 환자의 모니터링에만 사용되어 왔으나, 엄밀한 품질보증 및 표준화된 방법에 근거하여 당화혈색소 측정을 당뇨진단에 사용 가능하다고 발표하였다. 실제로 지금까지 혈액에 포함된 당화혈색소를 측정하기 위한 카트리지형 현장현시검사 장치가 다수 보고 및 출시된 바 있다. 일례로, KR 10-2012-0013841에서는 효소법을 이용하여 당화혈색소 정량분석을 수행할 수 있는 용혈시약 조성물에 대하여 개시하고 있다.
다만, 기존에 시판되고 있는 당화혈색소 측정을 위한 효소 측정법 시약들은 모두 용액으로 제조되어 판매되고 사용되고 있고, 장기 안정성, 보관성, 정확성, 휴대성, 사용편의성 등에 한계점을 지니고 있다. 일례로, 상기 효소 측정법 시약 중 FPOX(fructosyl peptide oxidase)는 열 안정성이 좋지 못하여 실온에서 시간이 경과함에 따라 그 활성이 현저히 떨어지는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 당화혈색소를 측정하는 방법 중에서 효소 측정법에 사용되는 효소 시약들의 장기안정성을 확보하고 이를 포함하는 당화혈색소 정량분석용 키트의 내구성과 정확성을 향상시키기 위하여 노력하던 중, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 효소 시약의 장기안정성이 우수하여 종래의 효소 측정법에 사용되는 시약이 갖는 단점인 보관성, 정확성, 휴대성, 사용편의성 등이 극복 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 장기 안정성이 향상된 시료를 포함하는 당화혈색소 정량분석용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 당류 및 아질산 화합물을 포함하는 제1조성물;
당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, 단백질분해효소 및 산화제를 포함하는 제2조성물;
당류 및 유기 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, FAOD(Fructosyl amino acid oxidase)를 포함하는 제3조성물; 및
당류 및 발색시약을 포함하는 제4조성물;을 포함하는 당화혈색소 정량분석용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 효소 시약의 장기안정성이 우수하여 종래의 효소 측정법에 사용되는 시약이 갖는 단점인 보관성, 정확성, 휴대성, 사용편의성 등이 용이하게 극복 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트의 구체적인 구조를 일례로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트의 구체적인 정면투시도를 일례로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트 중, 반응 카트리지를 일례로 나타낸 정면투시도이다.
도 4는 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트 내부에 구비되는 반응액 저장 챔버를 나타내는 이미지이다.
도 5는 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트 중, 삽입형 시료 카트리지를 나타내는 이미지이다.
도 6은 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트에 있어서, 삽입형 시료 카트리지(100)가 반응 카트리지(200)로 삽입됨과 동시에 반응액 저장 챔버(301)가 커버테이프 파열부(202)를 향해 이동하며, 이에 따라 반응액이 반응액 저장 챔버(301)로부터 유출되어 혼합부(204)로 이동하는 것을 나타내는 이미지이다.
도 7은 FPOX(fructosyl peptide oxidase, 프럭토실 펩타이드 옥시다아제) 시약의 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
여기서 Slope은 활성을 나타낸다.
도 8은 FPOX 및 POD(peroxidase, 퍼옥시다아제) 시약 혼합물에 트레할로오스(Trehalose), 만니톨(Mannitol) 또는 덱스트란(Dextran)을 첨가한 후 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 FPOX 및 POD 시약 혼합물에 다양한 종류의 안정제를 첨가한 후 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
여기서, 도 9의 상단에 위치한 숫자의 단위는 분(min)이고; Tre는 트레할로오스(Trehalose), PEG는 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol), PVP는 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone), PVA는 폴리비닐 알코올(Polyvinyl Alcohol), PAA는 폴리아크릴산(polyacryl acid), PAS는 파라아미노살리실산(paraaminosalicylic acid), Man은 만니톨(Mannitol)을 의미한다.
도 10은 40℃에서 FPOX에 다양한 종류와 다양한 pH 값을 갖는 버퍼를 첨가한 후 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 여기서, 오른쪽의 수치는 각 pH 값을 의미한다.
도 11은 50℃에서 FPOX에 다양한 종류와 다양한 pH 값을 갖는 버퍼를 첨가한 후 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 여기서, 오른쪽의 수치는 각 pH 값을 의미한다. 여기서, 오른쪽의 수치는 각 pH 값을 의미한다.
도 12는 FPOX에 트레할로오스를 다양한 농도별로 첨가할 경우 관찰되는 FPOX의 열 안정성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 FPOX에 트레할로오스를 단독으로 처리하거나, 트레할로오스를 다른 종류의 안정제들과 함께 혼합하여 처리할 경우 관찰되는 FPOX의 열 안정성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 FPOX에 트레할로오스와 버퍼를 첨가한 후 시간 경과에 따른 열 안정성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
여기서 Slope은 활성을 나타내며, Inter(Y Intercept)는 측정시스템 자체의 Background 흡광도(샘플이 없는 경우의 흡광도 값)이다.
도 15는 FPOX에 트레할로스를 단독으로 처리하거나, 추가적으로 단백질 안정제로 알려진 Neo Protein Saver를 혼합한 경우, 용액의 탁도(turbidity)를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 FPOX에 트레할로스를 단독으로 처리한 경우와 추가적으로 Neo Protein Saver를 혼합한 경우, 시약 조성물이 갖는 열 안정성을 비교 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 FPOX, 트레할로오스(Trehalose), NPS(Neo Protein Savor), 버퍼(100mM 인산 완충액, pH 6.5) 조성의 시약 조성물이 갖는 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 프로나아제(pronase)에 다양한 종류의 소분자 안정제를 처리하였을 경우 시간 경과에 따른 프로나아제의 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 프로나아제에 다양한 종류의 고분자 안정제를 처리하였을 경우 시간 경과에 따른 프로나아제의 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 프로나아제에 트레할로오스와 다양한 종류의 고분자를 안정제로서 처리하였을 경우 시간 경과에 따른 프로나아제의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 중성 단백질 가수분해효소(Neutral protease)에 다양한 종류의 안정제를 처리한 경우 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다. 여기서, NP는 중성 단백질 가수분해효소(Neutral protease, Tre는 트레할로오스, SP는 스페르민(Spermine), Arg는 아르기닌(Arginine)을 의미한다.
도 22는 중성 단백질 가수분해효소(Neutral protease)에 다양한 종류의 안정제를 처리한 경우 관찰되는 백그라운드를 나타내는 그래프이다.
도 23은 NaNO2에 MES 버퍼, D10 및 트레할로오스를 처리한 경우 시간 경과에 따른 성능을 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 24는 DA-67에 다양한 종류의 안정제를 처리한 후 관찰되는 성능의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 25는 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트를 냉장 보관하여 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트를 실온 보관하여 안정성을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 당류 및 아질산 화합물을 포함하는 제1조성물;
당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, 단백질분해효소 및 산화제를 포함하는 제2조성물;
당류 및 유기 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, FAOD(Fructosyl amino acid oxidase)를 포함하는 제3조성물; 및
당류 및 발색시약을 포함하는 제4조성물;을 포함하는 당화혈색소 정량분석용 키트를 제공한다.
여기서, 상기 제2조성물은 당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상 및 단백질 분해효소를 포함하는 제 2의1 조성물; 및
당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상 및 산화제를 포함하는 제2의2 조성물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 발명에 있어서 상기 각 조성물로부터 선택되는 2의 조합이 서로 혼합될 수 있고, 상기 2의 조합은 제2조성물 및 제3조성물의 조합일 수 있다.
여기서, 상기 당류는 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 상기 단당류는 과당(Fructose), 갈락토스(Galactose), 글루코스(Glucose) 또는 만노스(Mannose)이고;
상기 이당류는 수크로스(Sucrose), 락토스(Lactose), 말토스(maltose), 트레할로스(Trehalose), 투라노스(Turanose) 또는 셀로비오스(Cellobiose)이고; 및
상기 다당류는 덱스트란(Dextran), 디에틸아미노에틸-덱스트란(Diethylamino ethyl-Dextran), 덱스트린(Dextrin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 베타-글루칸(β-Glucans)이다.
또한, 상기 아미노산은 아르기닌(Arginine), 사르코신(Sarcosine), 알라닌(Alanine), 시스테인(Cysteine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 페닐알라닌(Phenylalanine), 글라이신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 아이소류신(Isoleucine), 라이신(Lysine), 류신(Leucine), 메티오닌(Methionine), 아스파라긴(Asparagine), 피롤라이신(Pyrrolysine), 프롤린(Proline), 글루타민(Glutamine), 세린(Serine) 및 트레오닌(Threonine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
나아가, 상기 당알코올은 만니톨(Mannitol), 크실리톨(Xylitol), 솔비톨(solbitol), 말티톨(maltitol) 및 에리스리톨(Erythritol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
또한, 상기 폴리아민은 스페르민(Spermine), 푸트레신(putrescine), 스페르미딘(spermidine), 카다베린(cadaverine), 아그마틴(Agmatine) 및 오르니틴(Ornithine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
나아가, 상기 유기 고분자는 폴리디엔계, 폴리알켄계, 폴리아크릴산계, 폴리아크릴레이트계, 폴리아크릴아마이드계, 폴리메타크릴산계, 폴리메타크릴레이트계, 폴리메타크릴아마이드계, 폴리비닐 에테르계, 폴리비닐 티오에테르계, 폴리비닐 알콜계, 폴리비닐 케톤계, 폴리비닐 할라이드계, 폴리비닐 니트릴계, 폴리비닐 에스터계, 폴리스티렌계, 폴리페닐렌계, 폴리옥사이드계, 폴리카보네이트계, 폴리에스터계, 폴리무수물계, 폴리우레탄계, 폴리설포네이트계, 니트로소-고분자, 폴리실록세인계, 폴리설파이드계, 폴리티오에스터계, 폴리설폰계, 폴리설폰아미드계, 폴리아미드계, 폴리이민계, 폴리우레아계, 폴리아닐린계, 폴리티오펜계, 폴리피롤계, 폴리헤테로싸이틀릭계, 폴리에테르계, 폴리포스페이트계 및 폴리실세스퀴옥산계와 같은 단일고분자(homopolymer) 및 이들의 유도체 및 이들의 공중합체 또는 그의 유도체를 사용할 수 있다.
또한, 상기 아질산 화합물은 소듐 나이트라이트, 포타슘 나이트라이트, 마그네슘 나이트라이트 및 칼슘 나이트라이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
이때, 상기 아질산 화합물은 1-500 mM의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 아질산 화합물이 1 mM 미만일 경우에는 혈색소의 단백질 구조를 충분히 유연하게 변형시키지 못하는 문제가 있고, 500 mM을 초과할 경우에는 총 혈색소 농도 측정시 산란이 발생하는 문제가 있다.
나아가, 상기 단백질분해효소는 프로나아제(Pronase), 프로테아제 A(Protease A), 프로테아제 N(Protease N), 디스파아제(Dispase), 뉴트럴 프로테아제(Neutral protease), Glu-C, 파파인(Papain), 트립신(Trypsin) 및 펩신(Pepsin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
이때, 상기 단백질분해효소는 500-1000 U/mL로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 단백질분해효소가 500 U/mL 미만일 경우에는 전체 반응의 감도가 작아지는 문제가 있고, 1000 U/mL를 초과할 경우에는 함께 사용되는 효소도 함께 분해되어 반응성이 저하하는 문제가 있다.
또한, 상기 산화제는 FAOD에 의해 생성되는 과산화수소를 산화하는 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 일례로 POD(Peroxidase)를 사용할 수 있다.
이때, 상기 산화제는 5-900 U/mL로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 산화제가 5 U/mL 미만일 경우에는 전체 반응의 감도가 저하하는 문제가 있고, 900 U/mL를 초과할 경우에는 효소 자체가 가지고 있는 색상이 혈색소의 색상과 유사하여 당화혈색소 농도 측정에 방해 요인이 되는 문제가 있다.
나아가, 상기 FAOD(Fructosyl amino acid oxidase)는 FPOX(fructosyl peptide oxidase)인 것이 바람직하다.
이때, 상기 FAOD는 1.0 U/mL 내지 300 U/mL 첨가하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 FAOD가 1.0 U/mL 미만일 경우에는 전체 반응의 감도가 작아지는 문제가 있고, 300 U/mL 초과일 경우에는 필요 이상으로 과다한 FAOD가 사용되어 경제적이지 못한 문제가 있다.
또한, 발색시약은 N-(카복시메틸 아미노 카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민(DA-64; Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 10-(카복시메틸 아미노 카보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 소듐 염(DA-67: Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 10-(N-메틸카바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-1H-페노티아진(MCDP: product of Dojindo Laboratories), N,N,N',N',N'',N''-헥사-3-설포프로필-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 (TPM-PS: product of Dojindo Laboratories) 및 오르토 페닐렌디아민(OPD, ortho phenylenediamine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.
이때, 상기 발색시약은 5-100 mg/dL 농도로 첨가하는 것이 바람직하다. 만약, 상기 발색시약이 5 mg/dL 미만일 경우에는 발색을 유도하기에 충분하지 못한 문제가 있고, 상기 발색시약이 100 mg/dL 초과일 경우에는 자발적 색변화가 일어나 분광학적 측정에 오차를 유발하는 문제가 있다. 상기 발색시약은 단독으로 사용시 외부 및 온도에 의해 자발적으로 변색되는 불안정한 물질이므로 사용에 주의가 요구된다.
본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 복수개의 시약 고정부를 포함할 수 있으며, 상기 제1조성물, 제2조성물, 제3조성물 및 제4조성물이 각각 독립적으로 복수개의 시약 고정부에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 제1조성물, 제2조성물, 제3조성물 및 제4조성물은 건조 상태로 시약 고정부에 고정되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 일례로 아래와 같은 구조를 갖는 카트리지일 수 있다:
시료 공급을 위한 삽입형 시료 카트리지, 및 상기 삽입형 시료 카트리지를 수용할 수 있는 반응 카트리지를 포함하는 당화혈색소 정량분석용 카트리지에 있어서,
상기 반응 카트리지는
상기 삽입형 시료 카트리지가 삽입되어 수용되는 수용부;
상기 수용부 내에 구비되고 일단부에 개구부를 포함하되, 시료와 반응할 수 있는 반응액을 내부에 저장하고, 저장된 반응액의 유출을 방지하기 위해 상기 개구부에 부착되는 커버테이프를 포함하며, 상기 커버테이프가 부착된 개구부가 반응 카트리지 내부를 향하도록 구비되는 반응액 저장 챔버;
상기 반응액 저장 챔버의 커버테이프와 마주보도록 구비되되, 상기 커버테이프와 이격되어 구비되는 커버테이프 파열부;
상기 반응액 저장 챔버를 고정하되, 반응액 저장 챔버가 커버테이프 파열부를 향해 이동할 수 있는 이동로를 포함하는 챔버 이동틀;
상기 커버테이프가 제거됨에 따라 유출된 반응액을 수용하면서, 상기 반응액이 삽입형 시료 카트리지의 시료 주입구에 접촉함으로써 유출되는 생체시료와 혼합되어 혼합액이 형성되는 혼합부;
상기 혼합부의 혼합액과 반응할 수 있도록 시료가 고정되는 시약 고정부;
상기 반응의 결과를 광학적으로 측정하는 측정부; 및
상기 혼합부, 시약 고정부 및 측정부를 연결시키는 유로;를 포함하고,
상기 삽입형 시료 카트리지는
액상의 생체시료를 채취하고 저장하며, 저장되어 있는 생체시료를 반응 카트리지로 공급할 수 있는 시료 주입구가 구비된 모세관 형태의 시료 주입부; 및
삽입형 시료 카트리지가 반응 카트리지의 수용부로 삽입될 때, 상기 반응 카트리지의 반응액 저장 챔버와 접촉하여 반응액 저장 챔버를 커버테이프 파열부로 이동시키는 돌출부;를 포함하는 당화혈색소 정량분석용 카트리지.
여기서, 상기 삽입형 시료 카트리지가 반응 카트리지로 삽입됨과 동시에 반응액 저장 챔버가 커버테이프 파열부를 향해 이동하여 커버테이프가 파열될 수 있고; 상기 반응 카트리지는 복수개의 시약 고정부를 포함할 수 있으며; 상기 유출된 반응액과 생체시료 혼합액은 카트리지 전체의 회전으로 야기되는 중력 및 원심력에 의해 유로를 따라 측정부 또는 시료 도입부로 이동될 수 있고; 상기 반응 카트리지는 측정 후 생체시료, 반응액 및 화학시료의 혼합액을 처리하기 위한 폐액 처리부를 더 포함할 수 있고; 상기 반응 카트리지는 폐액의 원활한 이동 및 수거를 위한 공기배출구를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 당화혈색소를 정량분석하기 위한 효소법은 주로 4가지 화학반응으로 구성된다.
첫 번째 반응은 혈액시료의 용혈 반응으로, 반응액을 이용하여 혈액의 적혈구를 파괴해 혈색소를 유리시키는 반응을 말한다. 이때, 용혈반응을 목적으로 사용되는 반응액은 pH 조절 및, 계면활성제 사용 등과 같은 다양한 방법으로 제작될 수 있다. 상기 사용 가능한 계면활성제는 일례로 3-(디메틸(3-테트라데칸아미도프로필)암모니오)프로판-1-설포네이트; 4-(디메틸(3-테트라데칸아미도프로필)암모니오)부탄-1-설포네이트; 3-(디메틸(테트라데실)암모니오)프로판-1-설포네이트 등의 양쪽이온성 계면활성제를 사용할 수 있다.
두 번째 반응은 단백질 분해효소(Proteolytic enzyme)를 이용해 당화혈색소 분자를 절단시키는 반응으로, 프로테아제 A(Protease A), 프로테아제 N(Protease N), 디스파아제(Dispase), 프로나아제(Pronase), 뉴트럴 프로테아제(Neutral protease), Glu-C, 파파인(Papain), 트립신(Trypsin), 펩신(Pepsin) 등과 같은 다양한 효소를 사용할 수 있다. 일례로, 적혈구가 용혈되어 나온 당화혈색소를 단백질분해효소가 당화혈색소의 N-말단 β-체인의 당-Val-His- 만을 선택적으로 절단하여 단분자성의 프럭토실 아미노산을 얻을 수 있다.
세 번째 반응은 단백질 분해효소에 의해 절단되어 생성된 당화 펩티드(glycated peptide) 또는 당화 아미노산(glycated amino acid) 분자를 FPOX(Fructosyl peptide oxidase)라는 산화 효소를 이용해 산화시키는 반응으로, 이를 통해 과산화수소를 생성시킬 수 있다.
네 번째 반응은 발색 반응으로, 상기 세 번째 반응을 통해 생성된 과산화수소(H2O2)를 과산화수소 산화효소(POD, Peroxidase)를 이용해 산화시키고, 상기 산화에 의해 방출되는 전자로 인하여 발색시약 및 기질(substrate)이 환원되어 변색되는 화학반응을 의미한다.
상기 변색을 통해 측정한 총 혈색소의 양과, 단백질 분해효소를 처리하기 이전인 적혈구로부터 용혈된 직후의 총 혈색소의 양을 상대적으로 비교하여 혈액시료 중에서 당화혈색소 농도를 정량할 수 있다.
구체적으로, 상기 총 혈색소 양에 대한 당화혈색소의 양을 백분율로 계산하여 나타낼 수 있다. 또한, 상기 총 혈색소 양 측정은 UV/vis 등과 같은 분광학적 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
효소법(enzymatic method)을 통해 당화혈색소를 정량분석하기 위해서는 일례로 상기 네가지 반응이 본 발명에 따른 생화학 분석 카트리지 내에서 수행되며, 도 2 내지 도 6에 도시된 카트리지 구조를 통해 당화혈색소를 정량분석하는 것을 예로 들어 상세히 설명한다. 단, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트가 이에 제한되는 것은 아니다.
분석을 수행하기 위해, 삽입형 시료 카트리지(100)의 시료 주입부(101)로 혈액을 채취하여 저장한다. 이후, 상기 삽입형 시료 카트리지(100)를 반응 카트리지(200)의 수용부(201)에 삽입하였고, 삽입형 시료 카트리지의 돌출부(102)에 의해 반응액 저장 챔버(301)가 챔버 이동틀(203)을 통해 이동하였으며, 반응액 저장 챔버에 부착된 커버테이프(302)가 커버테이프 파열부(202)와 접촉함에 따라 저장 챔버 내의 반응액이 유출되어 혼합부(204)로 이동하였다. 유출된 반응액은 시료 카트리지(100)의 시료 주입구(101)와 접촉하여 혈액시료와 혼합되며, 이에 따라 혈액시료와 반응액의 용혈반응이 진행된다. 상기 용혈반응이 수행된 후, 단백질분해 효소, FPOX 및 POD 중 1종의 시약이 고정된 제1시료 고정부에서는 혈액 시료에 의해 고정된 시약이 용해되며, 이를 통해 효소반응을 유도할 수 있게 된다.
상기 혼합부(204)에서 용혈반응이 수행되고, 제1시료 고정부에 의한 효소반응이 완료된 반응액은 카트리지의 회전 및 중력으로 인하여 반응 카트리지 내에 유로(206)를 통해 측정부(207)로 이동하게 된다. 측정부(207)로 이동된 반응액은 UV-Vis 분광 측정기를 통해 535nm에서 나타나는 흡광도를 이용, 용혈된 총 혈색소(total hemoglobin)의 농도를 측정하게 된다.
총 혈색소의 측정이 완료된 반응액은 카트리지의 회전을 통해 제2 시료 고정부로 이동된다. 상기 제2 시료 고정부는 제1 시료 고정부에 고정된 효소를 제외한 나머지 효소 두 가지를 혼합한 시약 및 발색시약이 고정되며, 상기 두 가지 효소 시약 및 발색시약은 서로 마주보는 대면형(face to face) 구조로 구성하였다.
제2 시료 고정부로 이동된 반응액은 효소 반응 및 발색 반응이 모두 진행되며, 효소 반응 및 발색 반응이 완료된 반응액은 카트리지의 회전을 통해 다시 측정부(207)로 이동된다. 이후, UV-Vis 분광 측정기를 통하여, 660nm 부근에서 나타나는 흡광도를 이용, 발색반응에 의해 발색된 당화혈색소(glycated hemoglobin)의 농도를 측정하게 된다.
분석이 완료된 폐액은 카트리지의 회전에 의해 폐액처리부(208)로 이동시키며, 폐액 처리부(208) 내의 흡수 원료를 통해 폐액을 흡수하여 수거한다.
상기한 바와 같이, 당화혈색소의 정량분석을 위해서는 두 번의 분광 측정이 수행되어야 하며, 이는 당화혈색소가 총 혈색소의 농도에 대한 당화 된 혈색소의 비율을 나타내는 것이기 때문이다. 즉, 측정자가 혈액샘플을 전처리하는 과정, 표지물질을 부착하는 과정 등 많은 단계로 이루어지는 분석과정을 수행하여야 하는 번거로움이있다. 그러나, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트를 이용하여 당화혈색소를 분석하는 경우, 카트리지의 회전을 통한 반응액을 이동시킴으로써, 효소반응의 수행뿐만 아니라 총 혈색소 및 당화 혈색소의 절대 농도를 측정을 하나의 카트리지 내에서 수행할 수 있다. 특히, 삽입형 시료 카트리지(100)가 반응 카트리지(200)로 삽입됨과 동시에 자동적으로 반응액(당화혈색소 분석 시에는 용혈시약)을 반응 카트리지 내의 혼합부로 유출시킬 수 있어 분석을 수행하는 자가 분석과정에 직접적인 개입하는 것이 최소화되며, 분석시간이 지체되거나, 분석의 정확도가 저하되는 문제를 방지할 수 있다. 또한, 반응액 저장 챔버(301)가 반응 카트리지(200) 내부에 구비됨에 따라 시료 카트리지(100)가 삽입되기 전, 반응액이 외부로 유출되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.
이상에서 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트를 구체예를 들어 설명하였으나 다양한 형태로 변형이 가능하며, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위를 벗어남이 없이 다양한 변형예 및 수정예를 실시할 수 있을 것으로 이해된다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
< 실험예 1> FPOX 시약의 시간 경과에 따른 열 안정성 평가
1. 실험방법
FPOX 시약의 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가하기 위하여 실온(15-20℃), 40℃ 또는 50℃에서 위치시켜 발생하는 변화를 측정하였다.
50 mM MES (pH5.5)에 용해한 40U/mL FPOX를 (반응 최종농도가 1 U/ml) 5 μl씩 분리형 96 well plate의 각 well에 디스펜싱하여 50℃ 오븐에서 2시간 건조하고 개별 포장하였다. 개별 포장한 시료를 실온(15~20°C), 40℃, 50℃에서 장기간 보관하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 1.6 mg/ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. POD 용액: 50U POD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease, POD 용액 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
시간 경과에 따른 잔존활성을 조사한 결과, 실온에서 보관하면, 312시간 이후에도 초기 활성의 95%이상을 유지하였다. 40°C의 경우, 312시간 이후 초기 활성의 65%까지 감소하였다. 50°C의 경우, 312시간 경과 후, 완전히 활성을 상실하였다.
위 결과로부터, FPOX만 단독으로 분주/건조한 시료의 경우, 도7에 나타난 바와 같이 가해지는 온도에 비례하여 시간경과에 따른 활성감소가 큰 것으로 나타났으며, 이로부터 FPOX 시약을 건조하여 사용할 시 열 안정성을 향상시키기 위한 방안이 필요함을 인지하였다.
<실험예 2> 안정제 종류에 따른 FPOX 시약의 열 안정성 평가 1
1. 실험방법
50 mM MES (pH5.5)에 용해한 FPOX 40 U/mL와 POD 400 U/mL를 혼합한 시약 혼합물 10 μL를 분주한 것과, 상기 혼합물에 본 발명에서 단백질 안정제로서 역할을 수행하는 100 mM 트레할로오스(Trehalose), 50 mM 만니톨(Mannitol) 또는 1wt% 덱스트란(Dextran)을 각각 처리하여 50°C에서 안정성을 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 1.6 mg/ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 800 μL을 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
효소 단독 시약 혼합물의 경우 120시간 경과에 따라 급속하게 활성이 감소하여, 500시간 이후 활성이 완전히 상실되었다. 50 mM 만니톨을 포함한 경우에도 이와 유사한 변화를 보이나 500시간 이후에도 약간 활성이 남아있다(약10%). 한편 100 mM 트레할로오스 또는 1wt% 덱스트란을 포함한 시료의 경우, 200시간 경과된 시점까지 거의 95%이상 활성을 유지하나, 이후 감소하기 시작하여, 500시간 이후에는 75%까지 감소하였다.
즉, 도8에 나타난 바와 같이 트레할로오스와 덱스트란의 경우 FPOX 및 POD 혼합물의 열 안정성을 현저히 향상 시키는 것으로 나타났다. POD의 경우 시약 자체의 열 안정성이 우수한 것으로 통상적으로 알려져 있으므로, 본 실험 결과로부터 트레할로오스와 덱스트란이 FPOX의 열 안정성을 현저히 향상 시킬 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 3> 안정제 종류에 따른 FPOX 시약의 열 안정성 평가 2
1. 실험방법
FPOX 40 U/mL 및 POD(400U/mL)가 혼합된 조성물 5μL를 분주한 것과, 이에 500 mM 트레할로오스(Trehalose), 500 mM 만니톨(Mannitol), 5 wt% 덱스트란(Dextran), 5 wt% 다이에틸아미노에틸 셀룰로스-덱스트란(Diethylaminoethyl cellulose-Dextran, DEAE-dextran), 5 wt% 폴리에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol, PEG), 5 wt% 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP), 5 wt% 폴리비닐 알코올(Polyvinyl Alcohol, PVA), 5 wt% 폴리아크릴산(polyacryl acid, PAA), 5 wt% 파라아미노살리실산(paraaminosalicylic acid, PAS) 또는 5 wt% CD(Dextrin from Corn)를 각각 첨가한 시약을 50℃에서 120분 건조한 후 포장하여 50℃에서 보관하고, 이후 시간의 경과에 따른 열 안정성을 HbA1c측정을 통해 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 1.6 mg/ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 800 μL을 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
시간 경과 후의 잔존활성을 검토한 결과, 안정제를 포함하지 않은 FPOX + POD 단독 조성물이 144시간 경과 후 활성이 거의 없어진 것과 달리, 고농도의 트레할로오스, 덱스트란, DEAE-덱스트란, 폴리아크릴산(PAA)를 포함한 시료에서는 90%이상의 활성을 유지하여 이들 물질이 안정성 유지에 기여하는 것으로 나타났다. 폴리비닐 알코올(PVP), 덱스트린(CD), 만니톨 등도 안정화 효과는 있으나 트레할로오스, 덱스트란, DEAE-덱스트란, 폴리아크릴산(PAA)에 비해서 효과가 떨어지는 것을 알 수 있었다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 파라아마노살리실산(PAS)은 효과가 없었다. 위 결과를 바탕으로 안정화 효과가 높은 트레할로오스 와 고분자인 덱스트란, DEAE-덱스트란, 폴리아크릴산(PAA)를 혼합하여, 더 높은 효과를 나타내는 조합을 검토할 필요가 있었다.
<실험예 4> 버퍼 종류에 따른 FPOX 시약의 열 안정성 평가
1. 실험방법
40U/mL FPOX에 pH 5.5인 10 mM MES-NaOH 버퍼, pH 6.0인 10 mM MES-NaOH 버퍼, pH 6.5인 100 mM 인산 완충액(제조사: TOYOBO) 또는 pH 7.0인 100 mM 인산 완충액을 처리한 후, 5 μl씩 분리형 96 well plate의 각 well에 디스펜싱하여 50°C 오븐에서 2시간 건조하고 개별 포장하였다. 개별 포장한 시료를 40°C, 50°C에서 장기간 보관하였다. 40°C 또는 50°C의 온도조건에서 열 안정성을 HbA1c 측정을 통해 평가 하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 1.6 mg/ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. POD 용액: 50U PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이,
다양한 종류 및 pH의 버퍼 중에서, pH6.5인 인산 완충액을 사용할 경우 FPOX 자체의 열 안정성이 기타 조성과 비교하여 현저히 향상되는 것으로 나타났다. 이들 결과로부터 트레할로오스와 같은 안정제 첨가에 의한 효과뿐만 아니라 버퍼 조성을 변화하여 추가적인 안정성의 향상을 기대할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 5> 트레할로오스 처리농도에 따른 FPOX 열 안정성 평가
1. 실험방법
FPOX + POD를 다음과 같은 조성(40U/ml FPOX, 400U/ml POD, 100mM PB pH6.5, 1.5 mg/ml 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate, + 0, 100, 200, 300, 400, 500 mM 트레할로오스)으로 제조하여 5 μl씩 디스펜싱 하고 50°C 오븐에서 2시간 건조하였다. 그 후 50°C 오븐에서 보관하며, 시간 경과에 따른 잔존 활성의 변화를 조사하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 1.6 mg/ml Pronase (from Roche) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 800 μL을 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도12에 나타난 바와 같이, 트레할로오스의 경우 농도 의존적으로 FPOX의 열 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다.
트레할로오스가 포함되지 않은 시료와 100~200mM 트레할로오스를 포함한 시료의 경우, 활성이 급격히 감소하기 시작하여 360시간 이상 경과하면 거의 100% 활성이 없어졌다. 한편 300~500mM 트레할로오스를 포함한 조성물에서는 이보다 열 스트레스에 안정적이었지만, 200시간 이후 활성이 급격히 감소하였다. 500mM 트레할로오스를 포함한 조성물은 장기간 동안 열에 상당히 안정한 퍼포먼스를 보여왔던 지금까지의 결과를 고려하면, 본 실험에서 건조 후 재 용해 시 용해속도를 높이기 위해 첨가한 계면활성제 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate의 영향 혹은 인산 버퍼와 계면활성제, FPOX의 조합에 문제가 있을 가능성이 있었다.
<실험예 6> 안정제 혼합처리에 따른 FPOX 열 안정성 평가
1. 실험방법
FPOX 40U/mL 5μL에 트레할로오스를 500 mM의 농도로 단독으로 처리하거나, 500 mM 농도의 트레할로오스와 함께 덱스트란(Dextran), DEAD 또는 PAA를 1 또는 5 wt% 함께 병용 처리한 후, 이를 pH 6.5인 100 mM의 인산 완충액에 용해시키고, 80℃에서 10분 동안 건조한 후 포장하여 50℃하며 시간 경과에 따른 열 안정성을 HbA1c측정을 통해 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 4000 U/ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. POD 용액: 50 U/mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도 13에 나타난 바와 같이, 트레할로오스를 단독으로 처리할 경우가, 다른 종류의 안정제와 함께 트레할로오스를 처리할 경우에 비해 FPOX의 열 안정성을 향상시키는 효과가 현저한 것으로 나타났다.
80도에서 10분 건조한 조건에서는 1% 덱스트란과 5% PAA를 제외한 모든 조성물에서 초기 활성의 약 95~100%를 유지하였다. 단, 500mM 트레할로오스만을 사용하여도 FPOX와 비율, 버퍼 조건 등에 따라, FPOX의 활성을 50도에서 한달 이상 유지시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 7> 트레할로오스 및 버퍼 처리에 따른 FPOX 열 안정성 평가
1. 실험방법
100 mM 인산 완충액(pH 6.5)의 버퍼에서 500 mM 농도의 트레할로오스를 포함한 FPOX를 분주하고, 80℃에서 10분 동안 건조한 후 이를 포장하고, 50℃에서 보관하며 시간 경과에 따른 열 안정성을 HbA1c측정을 통해 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 4000 U/ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. POD 용액: 50 U/mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도 14에 나타난 바와 같이, 인산 완충액(pH 6.5)과 트레할로오스를 처리한 FPOX의 경우 50℃에서 약 70일 이상 안정성을 유지하는 것으로 나타났다.
이는 일반적인 효소 안정성 가속테스트의 환산 방식(50도에서 1일을 상온에서의 12.9일로 계산)을 적용할 시 930일(2.5년)에 해당한다.
도 14에서 Slope은 활성을 나타내며, Inter (Y intercept)의 경우 측정시스템 자제의 background 흡광도(샘플이 없는 경우의 흡광도 값) 이다.
<실험예 8> NPS(Neo Protein Savor) 첨가에 따른 FPOX 균일성 평가
100 mM PB (pH6.5)에 용해한 FPOX 200 U/mL에 500 mM 트레할로오스를 혼합한 시약 혼합물 10mL와 추가적으로 단백질 안정제로 시판되고 있는 주성분이 아미노산 및 펩타이드인 Neo Protein Saver (NPS, TOYOBO) 17 mg/mL가 되도록 혼합한 조성물 10 mL 용액, 각각의 용해도를 평가하기 위해 UV-Vis 분광분석기를 이용하여 330nm에서의 탁도(turbidity)를 측정했다. 용액 제조 직후로부터 3시간 경과할 때까지 매 시간 측정하여 500 mM 트레할로오스만을 포함하는 조성물의 OD값을 100%로 계산했을 경우, NPS를 포함하는 조성물의 비율을 산출했다.
도15에 나타난 바와 같이 FPOX에 NPS를 17 mg/mL만큼 포함시킨 용액(실험군)과 포함시키지 않은 용액(대조군)을 비교한 결과, 실험군은 대조군에 비해 탁도가 낮고 (약 20%) 투명한 것으로 관찰되었다. 이는 육안으로도 구별 가능할 정도이며, 이로부터 NPS가 FPOX의 용해도에 영향을 준 것임을 알 수 있었다.
이들 결과를 바탕으로 100 mM PB (pH6.5)에 용해한 FPOX 40 U/mL에 500 mM 트레할로오스를 혼합한 시약 조성물과 추가적으로 17 mg/mL NPS를 혼합한 조성물을 각각 5 μL씩 분주하여 80도에서 10분동안 건조한 후 이를 포장하고, 50°C에서 보관하여 0, 6, 14일 이후의 열 안정성을 HbA1c 측정을 통해 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 용액: 4000 U/ml Neutral Protease (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, pH6.0
3. POD 용액: 50 U/mL PD (from TOYOBO) 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 0.5 mM NaNO2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14, pH6.0
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. Protease 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 용혈용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 FPOX + POD시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. Protease용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
8. 시험군과 대조군에서 각각 산출된 Slope의 비율을 계산한다.
2. 실험결과
도16에 나타난 바와 같이 트레할로오스 및 NPS를 포함하는 FPOX 혼합물의 경우, 14일 동안 FPOX를 트레할로오스로 처리한 경우와 유사한 열 안정성을 유지하는 것으로 나타났다. 결과적으로 트레할로오스를 포함하는 FPOX 혼합물 용액에 NPS를 추가함으로써 열 안정성을 확보하는 동시에 용액의 균일성을 향상 시킬 수 있음을 알 수 있었다. 용액의 균일성은 이후 해당 용액을 카트리지 형태로 제조하는 과정에서 전체적인 품질에 기여할 것으로 생각된다.
< 실험예 9> FPOX , 트레할로오스 , NPS 및 버퍼를 포함하는 조성물의 시간 경과에 따란 열 안정성 평가
1. 실험방법
180 U/mL FPOX, 500mM 농도의 트레할로오스, 17.5mg/mL의 NPS 및 pH6.5 인산 완충액 100mM을 포함하는 조성물을 준비한 후, 시약 카트리지(도1)의 FPOX 위치에 5 μL분주하여 80도에서 10분 동안 건조하고 포장하여 50도에서 보관하여 시간 경과에 따른 열 안정성을 HbA1c 측정을 통해 평가하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 1.25 mg/ml ASB-14
2. 프로테아제 및 POD 용액: 40000 U/ml Neutral Protease (from TOYOBO), 800 U/mL PD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, 100 mM Trehalose, pH6.0
3. 산화용액: 300 mM NaNO2, 0.005wt% D10, pH8.0
4. DA-67 용액: 40 mg/dl DA, DW
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. 50도에서 일정기간 경과한 FPOX가 분주된 카트리지를 회수하여, 기타 용액을 분주하고 조립/융착하여 시약 카트리지를 제작한다.
2. A1Care Analyzer의 측정창의 “RUN” 버튼을 클릭해 측정을 시작한다.
3. 측정할 Control sample을 샘플컬렉터의 모세관에 주입한 후 샘플컬렉터를 카트리지에 장착하고 A1Care Analyzer의 도어를 열고 제조된 카트리지를 장착한다.
4. 장비 내부에서 샘플컬렉터를 끝까지 삽입하여 카트리지 내부에 장착된 용액셀을 파쇄시켜 용혈용액과 샘플컬렉터의 샘플을 혼합시킨다.
5. A1Care Analyzer의 도어를 닫고 반응을 시작한다.
6. 약 4분 뒤에 측정이 완료된 후 HbA1c% 값을 확인한다.
2. 실험결과
도17에서 나타난 바와 같이, FPOX, 트레할로오스, NPS 및 버퍼를 포함하는 조성물의 경우, 카트리지 상에분주/건조하여 제조하여도 50도의 온도에서 약 63일 이상 안정성을 유지하는 것으로 나타났다.
<실험예 10> 안정제 종류에 따른 프로나아제(Pronase) 안정성 평가
1. 실험방법
0.1 mg/ml 프로나아제(Pronase), 100 mM 농도의 MES-NaOH 버퍼, 10 mM 농도의 CaCl2 및 0.5 mM 농도의 NaNO2(pH 6.0)를 포함하는 조성물을 준비한 후, 안정제를 100 mM 또는 1wt% 농도로 추가로 첨가하여 열 안정성을 평가하였다.
여기서, 본 실험에서 사용한 안정제는 크게 소분자 안정제와 고분자 안정제로 구분하였으며, 소분자 안정제의 경우 트레할로오스, 트리메틸아민 N-옥사이드(TMA-NO,Trimethylamine N-oxide), 스페르민(SP,Spermine) 스페르미딘(SPD,Spermidine), 아르기닌(Arg,arginine), 사르코신(Src,Sarcosine) 베타인(Betaine), 만니톨(Mannitol)을 사용하였고, 고분자 안정제의 경우 Dextran, PEG, PVP, Dextrin을 사용하였다.
2. 실험결과
소분자 안정제를 처리한 경우인 도 18을 살펴보면, 프로나아제에 대하여 트레할로오스는 약 300시간까지 그 안정성을 유지시키게 하는 것으로 나타났고, 아르기닌(Arginine), 사르코신(Sarcosine), 만니톨(Mannitol), 스페르민(Spermine) 등도 80% 이상의 안정화 효과를 발생시키는 것으로 나타났다.
고분자 안정제를 처리한 경우인 도 19를 살펴보면, 프로나아제에 대하여 덱스트란은 약 300시간까지 그 안정성을 유지시키게 하는 것으로 나타났고, 덱스트린은 75% 정도까지 활성을 유지하는 것으로 나타났으나, PEG, PVP는 프로나아제의 열 안정화를 유도하지 못하는 것으로 나타났다.
<실험예 11> 안정제 혼합 처리에 따른 프로나아제(Pronase) 안정성 평가
1. 실험방법
프로테아제 시약의 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가하기 위하여 50°C에서 위치시켜 발생하는 변화를 측정하였다. 100 mM MES (pH6.0)에 용해한 0.1 mg/mL Pronase에 1M 트레할로오스와 1M 혹은 10% 고분자 화합물을 혼합한 조성물을 제조하여 5 μl씩 분리형 96 well plate의 각 well에 디스펜싱하여 50°C 오븐에서 2시간 건조하고 개별 포장하였다. 개별 포장한 시료를 50°C에서 장기간 보관하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
2. FPOX 용액: 5 U/ml FPOX (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
3. POD 용액: 50U POD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.75 mg/ml ASB-14
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. FPOX 및 POD 용액 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 FPOX용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 프로테아제 시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. 용혈용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도 20에 나타난 바와 같이, 트레할로오스를 다른 종류의 화합물(Dextran, PEG, Man, Src)과 혼합하여 사용한다 하더라도 동반상승효과(synergy)는 발생하지 않으며, 트레할로오스를 단독으로 사용할 경우와 안정성에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 다만, 트레할로오스를 다른 종류의 고분자와 혼합할 경우 용액의 점성을 높일 수 있어, 분주 및 건조에 유리할 것으로 판단되었다.
< 실험예 12> 안정제 종류에 따른 중성 단백질 가수분해효소(Neutral protease)의 열 안정성 평가
1. 실험방법
프로테아제 시약의 시간 경과에 따른 열 안정성을 평가하기 위하여 50°C에서 위치시켜 발생하는 변화를 측정하였다. 100 mM MES (pH6.0)에 용해한 0.2 mg/mL Neutral Protease (TOYOBO)에 100mM 혹은 1% 고분자 화합물을 혼합한 조성물을 제조하여 5 μl씩 분리형 96 well plate의 각 well에 디스펜싱하여 50°C 오븐에서 2시간 건조하고 개별 포장하였다. 개별 포장한 시료를 50°C에서 장기간 보관하였다.
사용한 기타 시약의 조성은 다음과 같다.
1. 용혈용액: 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
2. FPOX 용액: 5 U/ml FPOX (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
3. POD 용액: 50U POD (from TOYOBO), 100 mM MES-NaOH, pH6.0, 10 mM CaCl2, 2 mM NaNO2, 0.75 mg/ml ASB-14
4. DA-67 용액: 4.8 mg/dl DA 100 mM MES-NaOH pH6.0, 10 mM CaCl2, 0.75 mg/ml ASB-14
5. 측정샘플: Lyphochek Diabetes Linearity Controls Level 1 & 4 (from Bio-Rad)
활성측정은 다음과 같이 진행하였다.
1. FPOX 및 POD 용액 및 용혈용액을 40도 항온수조에서 30분 이상 인큐베이션 한다. DA-67용액은 빛에 노출되지 않도록 주의한다.
2. 튜브에서 395 μL의 용혈용액과 측정샘플 (Level #1 혹은 #4) 5 μL를 혼합한다.
3. 2번 튜브에 FPOX용액 및 POD 용액을 400 μL씩 추가하여 충분히 혼합한다.
4. 측정하고자 하는 프로테아제 시약이 분주/건조되어 있는 well에 2번 튜브 용액 120 μL를 넣고 37°C 에서 1분간 인큐베이션 한다.
5. 용혈용액과 DA-67용액을 튜브에 100 μL씩 넣어 1:1로 혼합한다.
6. 5번 튜브의 용액 80 μL를 4번 well에 추가하고 37°C 에서 1, 2, 3분 경과 후의 663nm 및 750nm의 흡광도를 측정한다.
7. 2분 경과 후의 흡광도로 663-750nm를 계산하고 이를 Y축으로, 측정샘플의 HbA1c%농도로부터 HbA1c의 이론적인 몰 농도(μM)를 계산하여 이를 X축으로 하여 직선식을 작성하고, Slope 및 Y inter. 를 산출한다.
2. 실험결과
도21에 나타난 바와 같이, Neutral protease의 경우 기본적으로 열에 대해 Pronase보다 안정성이 높아, 효소 단독과 트레할로오스, Mannitol, Dextran을 포함한 조성물 사이에 차이가 없다. 도리어 Arginine이나 Spermine을 포함한 조성물을 활성이 크게 저하되었다.
도22에 나타난 바와 같이 효소 단독으로 사용할 경우 시간경과에 따라 Y inter. 의 값이 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 이에 비해 트레할로오스, Arginine, Spermine 등을 혼합한 경우, 백그라운드의 상승은 보이지 않았다. 이들 결과로부터 활성 및 백그라운드 값 모두 안정적으로 유지되고 있는 트레할로오스를 포함하는 조성물이 Neutral protease의 안정제로 적합한 것으로 생각된다.
< 실험예 13> 안정제 처리에 따른 NaNO2 열 안정성 평가
1. 실험방법
NaNO2의 경우 다른 효소시약과 혼합이 불가능하므로, 별도로 조성물을 제조하여 분주하여야 한다. 조성을 평가하기 위해, 단순히 MES 버퍼에 200 mM 농도의 NaNO2가 되도록 녹여 건조하였으나, 건조 과정 중에 스팟이 퍼지지 않고 "구" 모양으로 건조되어, 카트리지 조립 및 융착 공정에서 모두 깨져나가므로 사용이 어려웠다. 이에 계면활성제(detergent)인 D10(3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate) 및 트레할로오스를 물리적인 점성을 주기 위해 혼합하여 성능을 평가하였다.
2. 실험결과
도 23에 나타난 바와 같이, 50℃에서 400시간 이상 유지하여도 상기 준비한 NaNO2, D10, 트레할로오스 및 MES 버퍼를 포함하는 조성물은 초기값을 유지하는 것으로 나타났다. 이로부터, NaNO2를 분리하여 건조하는 것이 가능함을 알 수 있었다. 또한, 트레할로오스의 유무에 따라 스팟의 물리적인 모양은 다르지만, 제조공정 및 성능에는 차이가 없는 것으로 나타났다.
<실험예 14> 안정제 처리에 따른 발색시약의 열 안정성 평가
1. 실험방법
DA-67이란 Formazan 계열의 (메틸린블루의 구조로부터 합성) 염료로OD(peroxidase, 퍼옥시다아제)와 함께 사용하여 H2O2의 농도 측정에 주로 사용되는 발색시약이며, WAKO에서 생산 및 판매하고 있다. DA-67은 큰 흡광도 변화가 있어 발색력이 좋아 많이 사용되는 반면, 물질 자체의 안정성이 낮아 빛에 노출되면 급격히 분해가 일어나 무색으로부터 푸른색으로의 비색 변화가 발생하여 취급하기 어려운 단점이 있다. 이에, DA-67을 효율적으로 사용하기 위하여 빛 노출에 따른 자가 분해를 최소화할 수 있는 안정제의 스크리닝을 수행하였다.
2. 실험결과
도 24에 나타난 바와 같이, PAAS(Poly(acrylic acid sodium salt)), PAA(Poly(acrylic acid)), 트레할로오스는 DA-67 단독군과 비교하여 Y inter.의 증가가 억제되는 것으로 나타났다. 단, PAAS 및 PAA의 경우 DA-67 시그널 자체가 억제되는 효과를 동반하였다.
< 실험예 15> 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트의 보관성 평가
1. 실험방법
냉장고의 냉장실(2~8℃) 및 항온항습실(20~25℃)에 보관된 당화혈색소 정량분석용 키트를 사용한 장기간에 따른 측정을 통해 안정성을 확인하였다. 검증은 EP25-A Evaluation of Stability of in Vitro Diagnostic Reagents; Approved Guideline 및 식약처의 [의료기기의 안정성 기준]의 기준에 따라 진행하였다.
기준은 측정 순서 및 방법은 다음과 같다.
1. 임의의 기간이 경과한 후, 냉장고의 냉장실(2~8℃) 및 항온항습실(20~25℃)에 보관된 카트리지를 10개씩 꺼내 실온(20~25°C) 조건에서 10~20분간 보관한 후 사용한다.
2. A1Care analyzer의 전원 켜 측정을 준비한다.
3. 측정 10~20분전에 냉동 보관 중인 측정샘플(Low & High)을 꺼내 실온 조건에서 교반한다.
4. Low Control sample을 샘플컬렉터에 점적하고 카트리지 본체에 장착한다.
5. A1Care analyzer의 문을 열고 카트리지를 삽입한 뒤, 샘플컬렉터를 누르고 분석기의 문을 닫는다.
6. 측정이 완료되면 터치스크린에 HbA1c, % 값이 산출되며, 그 값을 기록한다.
7. High Control sample 샘플도 동일하게 진행한다.
8. 4~7 과정을 반복한다. (각 샘플 당 5회 반복 측정)
초기 측정 값 (HbA1c,%)를 기준으로 ±5% 이내 의 범위에서 값이 유지 될 경우, 그 기간 동안 카트리지의 성능이 안정적으로 유지되는 것으로 판단하고, ±5% 를 초과하는 값이 연속으로 3회 이상 반복될 경우, 안정성이 유지되지 못한 것으로 판단한다.
2. 실험결과
도 25에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 냉장 보관시 2년 이상의 안정성을 나타냈고;
도 26에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 실온 보관시 1년 이상의 안정성을 나타냈다.
[부호의 설명]
100 : 삽입형 시료 카트리지
101 : 시료 주입부
102 : 돌출부
103 : 시료 카트리지 손잡이
104 : 고정쇠
200 : 반응 카트리지
201 : 수용부
202 : 커버테이프 파열부
203 : 챔버 이동틀
204 : 혼합부
205 : 시약 고정부
206 : 유로
207 : 측정부
208 : 폐액처리부
209 : 공기배출구
210 : 반응 카트리지 손잡이
211 : 고정홈
301 : 반응액 저장 챔버
302 : 커버테이프
본 발명에 따른 당화혈색소 정량분석용 키트는 효소 시약의 장기안정성이 우수하여 종래의 효소 측정법에 사용되는 시약이 갖는 단점인 보관성, 정확성, 휴대성, 사용편의성 등이 용이하게 개선된, 당화혈색소 정량분석용 키트로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (18)

  1. 당류 및 아질산 화합물을 포함하는 제1조성물;
    당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, 단백질분해효소 및 산화제를 포함하는 제2조성물;
    당류 및 유기 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상과, FAOD(Fructosyl amino acid oxidase)를 포함하는 제3조성물; 및
    당류 및 발색시약을 포함하는 제4조성물;을 포함하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2조성물은 당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상 및 단백질 분해효소를 포함하는 제 2의1 조성물; 및
    당류, 아미노산, 당알코올 및 폴리아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종이상 및 산화제를 포함하는 제2의2 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량 분석용 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 당류는 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단당류는 과당(Fructose), 갈락토스(Galactose), 글루코스(Glucose) 또는 만노스(Mannose)이고;
    상기 이당류는 수크로스(Sucrose), 락토스(Lactose), 말토스(maltose), 트레할로스(Trehalose), 투라노스(Turanose) 또는 셀로비오스(Cellobiose)이고; 및
    상기 다당류는 덱스트란(Dextran), 디에틸아미노에틸-덱스트란(Diethylamino ethyl-Dextran), 덱스트린(Dextrin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 베타-글루칸(β-Glucans)인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산은 아르기닌(Arginine), 사르코신(Sarcosine), 알라닌(Alanine), 시스테인(Cysteine), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 페닐알라닌(Phenylalanine), 글라이신(Glycine), 히스티딘(Histidine), 아이소류신(Isoleucine), 라이신(Lysine), 류신(Leucine), 메티오닌(Methionine), 아스파라긴(Asparagine), 피롤라이신(Pyrrolysine), 프롤린(Proline), 글루타민(Glutamine), 세린(Serine) 및 트레오닌(Threonine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 당알코올은 만니톨(Mannitol), 크실리톨(Xylitol), 솔비톨(solbitol), 말티톨(maltitol) 및 에리스리톨(Erythritol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폴리아민은 스페르민(Spermine), 푸트레신(putrescine), 스페르미딘(spermidine), 카다베린(cadaverine), 아그마틴(Agmatine) 및 오르니틴(Ornithine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유기 고분자는 폴리디엔계, 폴리알켄계, 폴리아크릴산계, 폴리아크릴레이트계, 폴리아크릴아마이드계, 폴리메타크릴산계, 폴리메타크릴레이트계, 폴리메타크릴아마이드계, 폴리비닐 에테르계, 폴리비닐 티오에테르계, 폴리비닐 알콜계, 폴리비닐 케톤계, 폴리비닐 할라이드계, 폴리비닐 니트릴계, 폴리비닐 에스터계, 폴리스티렌계, 폴리페닐렌계, 폴리옥사이드계, 폴리카보네이트계, 폴리에스터계, 폴리무수물계, 폴리우레탄계, 폴리설포네이트계, 니트로소-고분자, 폴리실록세인계, 폴리설파이드계, 폴리티오에스터계, 폴리설폰계, 폴리설폰아미드계, 폴리아미드계, 폴리이민계, 폴리우레아계, 폴리아닐린계, 폴리티오펜계, 폴리피롤계, 폴리헤테로싸이틀릭계, 폴리에테르계, 폴리포스페이트계 및 폴리실세스퀴옥산계와 같은 단일고분자(homopolymer) 및 이들의 유도체 및 이들의 공중합체 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 아질산 화합물은 소듐 나이트라이트, 포타슘 나이트라이트, 마그네슘 나이트라이트 및 칼슘 나이트라이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 단백질분해효소는 프로나아제(Pronase), 프로테아제 A(Protease A), 프로테아제 N(Protease N), 디스파아제(Dispase), 뉴트럴 프로테아제(Neutral protease), Glu-C, 파파인(Papain), 트립신(Trypsin) 및 펩신(Pepsin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 산화제는 POD(Peroxidase)인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 FAOD(Fructosyl amino acid oxidase)는 FPOX(fructosyl peptide oxidase)인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 발색시약은 N-(카복시메틸 아미노 카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 10-(카복시메틸 아미노 카보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 소듐 염, 10-(N-메틸카바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-1H-페노티아진, N,N,N',N',N'',N''-헥사-3-설포프로필-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 및 오르토 페닐렌디아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 당화혈색소 정량분석용 키트는 복수개의 시약 고정부를 포함하는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1조성물, 제2조성물, 제3조성물 및 제4조성물은 각각 독립적으로 복수개의 시약 고정부에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 각 조성물로부터 선택되는 2의 조합이 서로 혼합되는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 2의 조합은 제2조성물 및 제3조성물의 조합인 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 제1조성물, 제2조성물, 제3조성물 및 제4조성물은 건조 상태로 시약 고정부에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 당화혈색소 정량분석용 키트.
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