人源白细胞介素 6 的 siRNA 、重组表达 CAR-T 载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域,具体涉及一种人源白细胞介素 6 ( IL-6 )的 siRNA
、重组表达 CAR-T 载体(尤其是一种 通过敲减 IL-6 的用于缓解 CRS 的 CAR-T 转基因载体 )及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。 1950 年代, Burnet 和 Thomas
提出了'免疫监视'理论,认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除,为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础 [Burnet
FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967;1: 1171-4]
。随后,各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。
2013 年一种更先进的肿瘤免疫疗法 --- CAR-T 疗法成功用于临床,并表现了前所未有的临床疗效。
CAR-T ,全称是 Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy ,嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法。
CAR-T 疗法在临床上最领先的有诺华的 CLT019 ,采用 CLT019 治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者,六个月的肿瘤无进展生存率达到 67%
,其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作,共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者 36 例,其中完全 24
例,缓解比例达到 66.6% 。这是抗癌研究的颠覆性突破。 CAR-T 细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一,并被《 Science 》杂志评为 2013
年度十大科技突破之首。
CAR-T
疗法虽然效果显著,但是在治疗过程中会出现一类特殊的临床综合症,临床常表现为发热,低血压,寒颤,以及出现与血清中一系列细胞因子水平显着升高有关的神经系统症状,被称为细胞因子释放综合症
(Cytokine Release Syndrome , CRS) 。其发生机制是由于抗原与 T 细胞受体结合后,激活了 T 细胞, T
细胞被激活后释放了包括 IL-6 在内的一系列细胞因子,造成了一种系统性的炎症反应, IL-6 信号通路如图 1
所示。如果治疗不及时,很可能引起肺水肿而导致患者死亡。
目前临床上可通过静脉注射抗组胺类药物 ( 如扑尔敏 ) 或皮质类固醇 ( 如氢化可的松 )
来抑制炎症反应,但是相应的, CAR-T 细胞对肿瘤的杀伤作用也被抑制,使得这类患者,有较高的复发率,影响 CAR-T 治疗的疗效。
还有一个比较可行的方案是使用商品化的托珠单抗 ( 雅美罗® ) 来控制 CRS
的发生程度。托珠单抗是一种人源化的 IL-6 受体单克隆抗体 (Tocilizumab ),托珠单抗与 IL-6 受体发生特异性结合,阻断 IL-6
信号转导,从而减少急性时相反应物、降低铁调素产物、减少 B 细胞活化、减少骨吸收和软骨转化,以及抑制 T 淋巴细胞向 Th17
细胞的分化,从而有效控制炎症反应。但是托珠单抗也有一些很明显的缺点,首先是费用很高。一支 10kg 体重剂量的托珠单抗价格约为 2000 元 RMB
,成年患者一般一次要用 5 支,普通家庭难以承受。其次是使用托珠单抗后,由于封闭了 IL-6 受体,导致患者后期很容易遭受感染。
自从 20 世纪 90 年代以来,研究人员发现双链 RNA( ' dsRNA ' )
可以用来抑制蛋白表达。这种沉默基因的能力在治疗人类疾病方面具有具有广泛的潜力,和许多研究人员和商业实体目前投入相当大的资源在发展中基于这种技术的治疗方法。
从机制的角度来看,当 dsRNA 进入植物和无脊椎动物细胞后,被 III 型核酸内切酶 Dicer
分解成 siRNA 。【 Sharp, RNA interference-2001, Genes Dev.2001, 15:485 】。 III 型核糖核酸酶
Dicer ,将 dsRNA 分解成带有 2 碱基凸出 3' 粘性末端的 19-23bp 的 siRNA 。【 Bernstein, Caudy,
Hammond, & Hannon, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step
of RNA interference, Nature 2001, 409:363 】。 siRNA 与 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC)
整合,复合体中一个或多个解旋酶解开双链 siRNA ,使互补反义链引导靶点识别。【 Nykanen, Haley, & Zamore, ATP
requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference
pathway, Cell 2001, 107:309 】。在结合相应的目标 mRNA 后, RISC 复合物中的一个或多个核酸内切酶切割目标 mRNA 引起
mRNA 沉默。【 Elbashir , Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, RNA interference is
mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev 2001, 15:188 】。
这种干扰效应可以持续很久,而且在细胞分裂后仍然有效。并且,RNAi具有非常好的序列特异性【Kisielow, M. et al. (2002)
Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small
interfering RNA, J. of Biochemistry 363:
1-5】。因此,RNAi系统可以特异性敲减一种类型的转录本,而不影响序列相近的其它mRNA。这些特性使siRNA系统在抑制基因表达、基因功能研究和药物靶点验证方面表现出潜力和价值。此外,siRNA系统可以用来治疗相关疾病,包括
(1) 基因过表达或错误表达引起的疾病; (2) 基因突变引起的疾病。
技术问题
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种人源白细胞介素 6 的 siRNA
、重组表达载体及其构建方法和应用。
技术解决方案
本发明的目的通过以下技术方案来实现:
本发明的第一目的在于提供一种人源白细胞介素 6 的 siRNA ,所述 siRNA 选自下述中的
a-h 中的任一对:
a. SEQ ID NO.43 和 SEQ ID NO.44 所示的核苷酸序列;
b. SEQ ID NO.45 和 SEQ ID NO.46 所示的核苷酸序列;
c. SEQ ID NO.47 和 SEQ ID NO.48 所示的核苷酸序列;
d. SEQ ID NO.49 和 SEQ ID NO.50 所示的核苷酸序列;
e. SEQ ID NO.51 和 SEQ ID NO.52 所示的核苷酸序列;
f. SEQ ID NO.53 和 SEQ ID NO.54 所示的核苷酸序列;
g. SEQ ID NO.55 和 SEQ ID NO.56 所示的核苷酸序列;
h. SEQ ID NO.57 和 SEQ ID NO.58 所示的核苷酸序列。
进一步的,优选 b. SEQ ID NO.45 和 SEQ ID NO.46
所示的核苷酸序列。
本发明的第二目的在于提供上述 siRNA 在制备 治疗缓解细胞因子释放综合症药物中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种包含上述 siRNA 的重组表达载体。
进一步的,所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒;优选的,包含上述 siRNA 的慢病毒表达载体。
进一步的,所述的慢病毒表达载体包括:用于质粒复制的原核复制子 pUC Ori 序列,如 SEQ
ID NO.2 所示;用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因 AmpR 序列,如 SEQ ID NO.1 所示;用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子
SV40 Ori 序列,如 SEQ ID NO.3 所示;用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件;用于真核细胞表达绿色荧光的 ZsGreen1 绿色荧光蛋白,如
SEQ ID NO.11 所示;用于共同转录表达蛋白质的 IRES 核糖体结合序列,如 SEQ ID NO.12 所示;用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人
EF1 α 启动子,如 SEQ ID NO.14 所示;用于组成集识别、传递、启动于一体的二代 CAR 或三代 CAR 的抗 CD19
嵌合抗原受体的编码基因,如 SEQ ID NO.52 或 SEQ ID NO.53 所示;用于增强转基因的表达效率的 eWPRE
增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件,如 SEQ ID NO.13 所示; 用于胞内转录 siRNA 的 人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 ,如
SEQ ID NO.14 所示。
进一步的,所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括:如 SEQ ID NO.5 所示的慢病毒
5 terminal LTR 、如 SEQ ID NO.6 所示的慢病毒 3 terminal Self-Inactivating LTR 、如 SEQ ID
NO.7 所示的 Gag 顺式元件、如 SEQ ID NO.8 所示的 RRE 顺式元件、如 SEQ ID NO.9 所示的 env 顺式元件、如 SEQ
ID NO.10 所示的 cPPT 顺式元件。
进一步的,所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括:如 SEQ ID NO.5 所示的慢病毒
5 terminal LTR 、如 SEQ ID NO.6 所示的慢病毒 3 terminal Self-Inactivating LTR 、如 SEQ ID
NO.7 所示的 Gag 顺式元件、如 SEQ ID NO.8 所示的 RRE 顺式元件、如 SEQ ID NO.9 所示的 env 顺式元件、如 SEQ
ID NO.10 所示的 cPPT 顺式元件所述慢病毒包装顺式元件,以及如 SEQ ID NO.4 所示的 RSV 启动子。
进一步的,所述 eWPRE 增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有 6 个核苷酸的增强突变,具体为:
g.396G>A 、 g.397C>T 、 g.398T>C 、 g.399G>A 、 g.400A>T 、
g.411A>T 。
进一步的,所述抗 CD19 嵌合抗原受体(二代 CAR ),包括依次串联的如 SEQ ID
NO.16 所示的 CD8 leader 嵌合受体信号肽、如 SEQ ID NO.17 所示的 CD19 单链抗体轻链 VL 、如 SEQ ID NO.18
所示的 Optimal Linker C 、如 SEQ ID NO.19 所示的 CD19 单链抗体重链 VH 、如 SEQ ID NO.20 所示的 CD8
Hinge 嵌合受体铰链、如 SEQ ID NO.21 所示的 CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区、如 SEQ ID NO.22 所示的
CD137 嵌合受体共刺激因子,以及如 SEQ ID NO.23 所示的 TCR 嵌合受体 T 细胞激活域。
进一步的,所述抗 CD19 嵌合抗原受体(三代 CAR ),包括依次串联的如 SEQ ID
NO.16 所示的 CD8 leader 嵌合受体信号肽、、如 SEQ ID NO.17 所示的 CD19 单链抗体轻链 VL 、如 SEQ ID NO.18
所示的 Optimal Linker C 、如 SEQ ID NO.19 所示的 CD19 单链抗体重链 VH 、如 SEQ ID NO.20 所示的 CD8
Hinge 嵌合受体铰链、如 SEQ ID NO.21 所示的 CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区、如 SEQ ID NO.24 所示的
CD28 嵌合受体共刺激因子、如 SEQ ID NO.22 所示的 CD137 嵌合受体共刺激因子以及如 SEQ ID NO.23 所示的 TCR 嵌合受体
T 细胞激活域。
本发明的第四目的在于提供一种包含上述 siRNA
的慢病毒表达载体的构建方法,包括以下步骤:
( 1 )将含氨苄青霉素抗性基因 AmpR 序列(如 SEQ ID NO.1 所示)、原核复制子
pUC Ori 序列(如 SEQ ID NO.2 所示)、病毒复制子 SV40 Ori 序列(如 SEQ ID NO.3
所示)、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、 ZsGreen1 绿色荧光蛋白(如 SEQ ID NO.11 所示)、 IRES 核糖体结合序列(如 SEQ
ID NO.12 所示)、 eWPRE 增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如 SEQ ID NO.13 所示)、 人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6
(如 SEQ ID NO.14 所示) 存储于慢病毒骨架质粒( pLenti-3G silencer )上;
( 2 )将人 EF1 α 启动子(如 SEQ ID NO.15
所示)、用于组成集识别、传递、启动于一体的二代 CAR 或三代 CAR 的抗 CD19 嵌合抗原受体组合成二代 CAR 或三代 CAR
设计方案,经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中,得到二代 CAR 或三代 CAR 设计的重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer ;
( 3 )将上述 siRNA 以及如 SEQ ID NO.41 和 SEQ ID NO.42
所示的 negative control 序列,分别克隆至步骤( 2 )所得的重组慢病毒质粒中,得到 IL-6 敲减重组慢病毒质粒(
pCAR19-1762~pCAR19-1769 和 negative control 的 pCAR19-1761 );
( 4 )将步骤( 3 )得到的重组慢病毒质粒( pCAR19-1761~pCAR19-1769
)分别与慢病毒包装质粒 pPac-GP 、 pPac-R 以及膜蛋白质粒 pEnv-G 共同转染 HEK293T/17 细胞,在 HEK293T/17
细胞中进行基因转录表达后,包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中,收集包含的重组慢病毒载体的上清液;
( 5
)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的离子交换方式进行纯化,分别得到重组慢病毒载体。
进一步的,步骤( 1 )中,所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括:如 SEQ ID
NO.5 所示的慢病毒 5 terminal LTR 、如 SEQ ID NO.6 所示的慢病毒 3 terminal Self-Inactivating
LTR 、如 SEQ ID NO.7 所示的 Gag 顺式元件、如 SEQ ID NO.8 所示的 RRE 顺式元件、如 SEQ ID NO.9 所示的
env 顺式元件、如 SEQ ID NO.10 所示的 cPPT 顺式元件;所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括:如 SEQ ID NO.5
所示的慢病毒 5 terminal LTR 、如 SEQ ID NO.6 所示的慢病毒 3 terminal Self-Inactivating LTR 、如
SEQ ID NO.7 所示的 Gag 顺式元件、如 SEQ ID NO.8 所示的 RRE 顺式元件、如 SEQ ID NO.9 所示的 env
顺式元件、如 SEQ ID NO.10 所示的 cPPT 顺式元件所述慢病毒包装顺式元件,以及如 SEQ ID NO.4 所示的 RSV 启动子。
进一步的,步骤( 2 )中,所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二代 CAR 的抗 CD19
嵌合抗原受体,包括依次串联的如 SEQ ID NO.16 所示的 CD8 leader 嵌合受体信号肽、如 SEQ ID NO.17 所示的 CD19
单链抗体轻链 VL 、如 SEQ ID NO.18 所示的 Optimal Linker C 、如 SEQ ID NO.19 所示的 CD19 单链抗体重链
VH 、如 SEQ ID NO.20 所示的 CD8 Hinge 嵌合受体铰链、如 SEQ ID NO.21 所示的 CD8 Transmembrane
嵌合受体跨膜区、如 SEQ ID NO.22 所示的 CD137 嵌合受体共刺激因子,以及如 SEQ ID NO.23 所示的 TCR 嵌合受体 T
细胞激活域;所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三代 CAR 的抗 CD19 嵌合抗原受体,包括依次串联的如 SEQ ID NO.16 所示的 CD8
leader 嵌合受体信号肽、、如 SEQ ID NO.17 所示的 CD19 单链抗体轻链 VL 、如 SEQ ID NO.18 所示的 Optimal
Linker C 、如 SEQ ID NO.19 所示的 CD19 单链抗体重链 VH 、如 SEQ ID NO.20 所示的 CD8 Hinge
嵌合受体铰链、如 SEQ ID NO.21 所示的 CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区、如 SEQ ID NO.24 所示的 CD28
嵌合受体共刺激因子、如 SEQ ID NO.22 所示的 CD137 嵌合受体共刺激因子以及如 SEQ ID NO.23 所示的 TCR 嵌合受体 T
细胞激活域。
进一步的,步骤( 1 )中,所述 eWPRE 增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有 6
个核苷酸的增强突变,具体为: g.396G>A 、 g.397C>T 、 g.398T>C 、 g.399G>A 、
g.400A>T 、 g.411A>T 。
进一步的,步骤( 2 )中,由人 EF1 α 启动子启动整个 CAR 基因表达; CD8
leader 嵌合受体信号肽位于 CAR 编码序列的 N 端,用于引导 CAR 蛋白定位于细胞膜; CD19 单链抗体轻链 VL 、 Optimal
Linker C 、 CD19 单链抗体重链 VH 组合成 scfv 区域,用于识别 CD19 抗原; CD8 Hinge 嵌合受体铰链用于将 scfv
锚定于细胞膜外侧; CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上; CD137 嵌合受体共刺激因子用于刺激 T
细胞增殖和细胞因子分泌; TCR 嵌合受体 T 细胞激活域用于激活下游信号通路的表达;当 scfv 区域与 CD20
抗原结合时,信号通过嵌合受体传递至细胞内,从而产生包括 T
细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞的一系列生物学效应。
进一步的,步骤( 4 )中,所述慢病毒载体有带荧光标签 zsGreen1 的版本和不带荧光标签
zsGreen1 版本,带荧光标签的版本用于体外实验,不带荧光标签的版本用于临床实验。
进一步的,步骤( 4 )中,所述抽滤步骤控制上清体积在 200ml~2000ml ,真空度控制在
-0.5MPA~-0.9MPA ,防止由于堵孔带来的载体损失;所述吸附步骤控制溶液的 PH 值在 6~8 ,防止 PH
的变化导致载体失活;所述洗脱步骤控制洗脱液的离子强度在 0.5M~1.0M ,防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。
本发明的第五目的在于提供包含上述 siRNA 的重组表达载体在制备 CAR-T 治疗过程中由
IL6 释放引起的炎症细胞因子 综合症药物中的应用。
本发明的第六目的在于提供一种 CART 细胞,所述的 CAR-T 细胞是由上述 siRNA 修饰的
T 淋巴细胞。
本发明的再一目的在于提供上述 CAR-T 细胞在制备 B
淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤治疗药物中的应用。
本发明是将人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 、人 EF1 α启动子、 CD8
leader 嵌合受体信号肽、 CD19 单链抗体轻链 VL 、 Optimal Linker C 、 CD19 单链抗体重链 VH 、 CD8 Hinge
嵌合受体铰链、 CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区、 CD137 嵌合受体共刺激因子、 TCR 嵌合受体 T
细胞激活域构建进入重组慢病毒载体,由人 EF1 α启动子启动整个 CAR 基因表达。 CAR 蛋白定位于细胞膜表面,识别 CD19 抗原,刺激 T
细胞增殖和细胞因子分泌,激活下游信号通路的表达。当 scfv 区域与 CD19 抗原结合时,信号通过嵌合受体传递至细胞内,从而产生 T
细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系列生物学效应。由人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 启动 siRNA
的表达,通过 RISC complex 的作用,降解 IL-6 mRNA ,抑制 IL-6 的合成与分泌,达到抑制 CRS 的效果。
本发明所采用的表达载体包括原核复制子( pUC ori )用于质粒复制;原核筛选标记( AmpR
)用于目的菌株大量扩增;病毒复制子( SV40 Ori )用于增强真核细胞内的复制;慢病毒包装顺式元件( RSV 、 5 terminal LTR 、 3
terminal Self-Inactivating LTR 、 Gag 、 RRE 、 env 、 cPPT )用于慢病毒包装;人 RNA 聚合酶 III
启动子( hU6 )用于胞内转录 siRNA ;真核荧光标签蛋白( ZsGreen1 )用于真核细胞表达绿色荧光;共表达元件( IRES
)用于共同转录表达蛋白质;真核启动子( EF1 α)用于嵌合抗原受体基因的真核转录;嵌合抗原受体( CD8 leader 、 CD19 VL 、
Optimal Linker C ( SEQ ID NO.19 )、 CD19 VH 、 CD8 Hinge 、 CD8 Transmembrane 、
CD137 、 TCR )用于组成集识别、传递、启动于一体的二代和三代 CAR ;转录后调控元件( eWPRE )用于增强转基因的表达效率。
本发明涉及含肽的医药配置品,具体涉及:
一、人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 、含氨苄青霉素抗性基因 AmpR 序列、原核复制子
pUC Ori 序列 , 、病毒复制子 SV40 Ori 序列、 RSV 启动子、人 EF1 α启动子、慢病毒 5 terminal LTR 、慢病毒 3
terminal Self-Inactivating LTR 、 Gag 顺式元件、 RRE 顺式元件、 env 顺式元件、 cPPT 顺式元件、 IRES
核糖体结合序列、 ZsGreen1 绿色荧光蛋白、 WPRE
土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件的重组慢病毒载体骨架,这种重组慢病毒载体骨架可以搭载不同的治疗性基因并广泛的用于过继性细胞治疗领域,搭载不同的 siRNA
并广泛的用于基因过表达、错误表达和基因突变引起的疾病。
二、重组慢病毒载体骨架、 IL6-siRNA 、 CD8 leader 嵌合受体信号肽、 CD19
单链抗体轻链 VL 、单链抗体铰链 LinkerA 、单链抗体铰链 Linker B 、单链抗体铰链 Linker C 、 CD19 单链抗体重链 VH 、
CD8 Hinge 嵌合受体铰链、 CD8 Transmembrane 嵌合受体跨膜区、 CD28 嵌合受体共刺激因子、 CD137 嵌合受体共刺激因子、
TCR 嵌合受体 T 细胞激活域构建形成重组慢病毒载体,该方法得到的重组慢病毒载体可以实现在人 T 淋巴细胞上表达 CD19 嵌合抗原受体,引导并激活 T
淋巴细胞对 CD19 阳性细胞的杀伤作用,在临床上用于治疗 B 淋巴细胞白血病、 B 淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在人 T 淋巴细胞内表达白介素 -6(IL-6)
的 siRNA ,有效降低白介素 -6 的表达水平,临床上可用于缓解细胞因子释放综合症 (Cytokine Release Syndrome , CRS)
。
有益效果
本发明设计的 siRNA 序列含有 21 个 bp 的核苷酸,采用
N2[CG]N8[AU]N8[AU]N2 的寡核苷酸排列模式,互补序列之间采用 stem-loop 的发卡结构,通过 siRNA pattern 、 GC
percentage 、 T or A or G in a row 、 consecutiver GC 、 3'end nt pattern 、
thermodynamic value 、 siRNA target 、 identity 、 alignment 等条件的筛选,大大提高 siRNA
设计的干扰成功率。
本发明所采用的人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 转录 siRNA ,抑制 IL-6
表达的系统,在 T 细胞杀伤实验中,经过 QPCR 检测,能有效抑制 mRNA 的转录水平,经过 CBA 检测,能有效减少细胞培养上清中的 IL-6
表达水平,将来可以在体内抑制 IL-6 表达水平,减轻 CRS 的症状。
本发明采用慢病毒载体方式递送 siRNA( 如图 2 所示 ) 。首先,节约了成本,避免
siRNA 体外合成的昂贵费用。其次,避免了 siRNA 的在体递送效率低的问题。第三,使用人 RNA 聚合酶 III 启动子 hU6 表达 siRNA
,能够有效利用细胞内的 RNA 转录体系,大量表达出相应的 siRNA ,经过一系列的酶促作用,达到良好的基因沉默效果。
本发明所采用的载体骨架为第三代慢病毒载体(如图 3A 所示), 3' SIN LTR 去除了
U3 区域,消除了慢病毒载体自我复制的可能性,大大提高了安全性;增加了 cPPT 和 WPRE 元件,提高了转导效率和转基因的表达效率;采用 RSV
启动子保证了慢病毒载体包装时核心 RNA 的持续高效转录;采用人自身的 EF1 α启动子,使 CAR 基因能够在人体内长时间持续表达。
本发明所采用的siRNA敲减方案,同样可以应用于第三代CAR设计方案。第三代CAR设计与第二代设计相比,增加了CD28嵌合受体共刺激因子(SEQ ID
NO.24)。
本发明所采用的慢病毒载体柱纯化系统(如图 8
所示),系本公司开发出的慢病毒规模化生产工艺。常用的超速离心法或者高速离心法,是利用离心沉降原理分离慢病毒颗粒,不可避免的会残留很多沉降系数相近的杂质,对后续实验带来不利影响。并且,装管过程复杂、操作繁琐、多次转换容器带来更多的污染机会。而本发明的慢病毒载体柱纯化工艺为半自动化操作,全部过程在百级实验区域完成,避免人工操作的繁琐和污染几率,所回收的慢病毒载体在内毒素、支原体等指标上完全达到临床标准。后续可跟进开发全自动纯化仪。
本发明所采用 CAR
设计方案也可以应用于第二代慢病毒载体结构上。第二代和第三代慢病毒载体在结构上的区别(如图 3B 所示),主要是第三代慢病毒载体把第二代载体 5'LTR 的
U3 区域替换为 RSV 启动子,这样就消除了 U3 转录时对 Tat 蛋白的依赖,既可以在慢病毒的结构基因里去除 Tat
序列,也提高了慢病毒基因组转录水平和转录持续性。第二代和第三代慢病毒载体主要是基因组转录方式的区别,因此本发明所采用 CAR
设计方案可以应用于这两代慢病毒载体。
本发明的第三代慢病毒骨架质粒,采用 enhancedWPRE 元件,与宾州大学 Carl H.
June 等人( Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen
receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011;365:725
-33.)所采用的 WPRE 元件相比,有 6 个核苷酸的增强突变( g.396G>A 、 g.397C>T 、 g.398T>C 、
g.399G>A 、 g.400A>T 、 g.411A>T ),能够增强初级转录产物的多聚腺苷化,增加细胞内 mRNA
的含量,增强转基因的表达效率。
本发明的 Lentival 包装系统是无辅助病毒的四质粒包装系统,通过四种质粒共同转染至
HEK293T/17
细胞中,产生重组慢病毒载体。重组后的慢病毒载体是复制缺陷型载体,能将外源片段整合入宿主基因,一次性使用,无法复制和增殖,安全性有很大提高。
本发明采用的慢病毒载体有带荧光标签 zsGreen1 的版本和不带荧光标签 zsGreen1
版本,带荧光标签的版本用于体外实验,不带荧光标签的版本用于临床实验。
本发明采用的 scfv 段的 Linker 设计,能够显著提高细胞因子的分泌、 CAR-T
细胞的体外杀伤作用以及临床治疗效果。
可见,本发明所述的重组慢病毒载体在给急性 B 淋巴细胞白血病 (ALL) 的 CAR-T
治疗提供可靠转基因保障的同时,可以极大的降低发生 CRS 的风险,减轻患者的痛苦。
本发明所述的IL-6敲减siRNA表达框及其siRNA表达产物,不仅可以应用于CAR19-T治疗急性B淋巴细胞白血病(ALL)中用于消除或减轻CRS的症状,还可应用于缓解CAR-T治疗诸如B淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤等等所有类型肿瘤时引起的CRS症状,甚至还可以应用于缓解其他类型的治疗引起的CRS
。
附图说明
图 1 是本发明所述的 IL-6 信号通路示意图 ;
图 2 是本发明 所述的慢病毒递送 siRNA 方式示意图 ;
图 3 是 本发明所述的慢病毒载体结构示意图; 其中 , 图 3 ( A
)是本发明采用的第三代慢病毒载体结 构示意图,图 3 ( B )是第二代和第三代慢病毒载体结构比较;
图 4 是本发明所述的重组慢病毒载体的构建流程图;其中,( A )图是慢病毒骨架质粒
pLenti-3G silencer 的结构示意图;( B )图是 pCAR19-silencer 质粒的结构示意图;( C )图是
pCAR19-1761~pCAR19-1769 质粒的示意图;( D )图是慢病毒包装质粒 pPac-GP 的结构示意图;( E )图是慢病毒包装质粒
pPac-R 的结构示意图;( F )图是膜蛋白 pEnv-G 的结构示意图;
图 5 是慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer
的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图;其中,图 5A 是慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer 的酶切预测示意图,其中, lane1 是 1kb
DNA ladder Marker :条带从上到下依次为: 10kb 、 8kb 、 6kb 、 5 kb 、 4kb 、 3.5kb 、 3kb 、
2.5kb 、 2kb 、 1.5kb 、 1kb 、 750bp 、 500bp 、 250bp ; lane2 是 pLenti-3G silencer
的 Cla I+BamH I 酶切预测:条带从上到下依次为: 7381bp , 23bp ;图 5B 是慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer
的酶切琼脂糖凝胶电泳图,其中, lane1 是 pLenti-3G silencer 的 Cla I+BamH I 酶切电泳结果; lane2 是 1kb
DNA ladder Marker 的电泳结果;
图 6 是重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer 的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图;其中,图
6A 是重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer 的酶切预测示意图,其中, lane1 是 1kb DNA ladder Marker
:条带从上到下依次为: 10kb 、 8kb 、 6kb 、 5 kb 、 4kb 、 3.5kb 、 3kb 、 2.5kb 、 2kb 、 1.5kb 、
1kb 、 750bp 、 500bp 、 250bp ; lane2 是 pCAR19-silencer 的 Kpn I 酶切预测:条带从上到下依次为:
8335bp 、 1708bp ;图 6B 是重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer 的酶切琼脂糖凝胶电泳图,其中, lane1 是 1kb DNA
ladder Marker 的电泳结果; lane2 是 pCAR19-silencer 的 Kpn I 酶切电泳结果;
图 7 是 IL-6 敲减重组慢病毒质粒 pCAR19-1761~pCAR19-1769
的测序比对结果;其中, A 是 pCAR19-1761 的测序比对结果; B 是 pCAR19-1762 的测序比对结果; C 是 pCAR19-1763
的测序比对结果; D 是 pCAR19-1764 的测序比对结果; E 是 pCAR19-1765 的测序比对结果; F 是 pCAR19-1766
的测序比对结果; G 是 pCAR19-1767 的测序比对结果; H 是 pCAR19-1768 的测序比对结果; I 是 pCAR19-1769
的测序比对结果;
图 8 是离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体的流程图;
图 9 是重组慢病毒载体的滴度检测结果;
图 10 是重组慢病毒载体的不同纯化方式的支原体检测结果, lane1 为 DL2000
marker ,从上到下条带条带从上到下依次为: 2kb 、 1kb 、 750 bp 、 500 bp 、 250 bp 、 100bp ; lane2
为阳性对照; lane3 为阴性对照; lane4 为 PBS ; lane5 为水; lane6 为 lvCAR19-1761 ; lane7 为
lvCAR19-1762 ; lane8 为 lvCAR19-1763 ; lane9 为 lvCAR19-1764 ; lane10 为
lvCAR19-1765 ; lane11 为 lvCAR19-1766 ; lane12 为 lvCAR19-1767 ; lane13 为
lvCAR19-1768 ; lane14 为 lvCAR19-1769 ;
图 11 为 mRNA 相对表达量的柱状图;
图 12 为 CAR 蛋白表达量的 WB 检测图;其中,图 12A , lane1 为 PBMC
空细胞, lane2 为对照病毒 MOCK , lane3 为 lvCAR19-1761 , lane4 为 lvCAR19-1762 , lane5 为
lvCAR19-1763 , lane6 为 lvCAR19-1764 , lane7 为 lvCAR19-1765 , lane8 为
lvCAR19-1766 , lane9 为 lvCAR19-1767 , lane10 为 lvCAR19-1768 , lane11 为
lvCAR19-1769 ;图 12B ,是 beta-actin 内参条带;
图 13 为 IL-6 敲减重组慢病毒 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769
与靶细胞孵育后, 4h 和 24h 上清中 CBA 的检测结果;图 13A 是 4h 的 CBA 检测结果;图 13B 是 24h 的 CBA
检测结果;
图 14 为不同效应细胞分别与靶细胞共培养条件下, 4h 和 24h 上清中 IL-6
含量的变化情况;
图 15 为不同效应细胞分别与靶细胞共培养条件下, 24h mRNA 转录水平的变化情况;
图 16 为不同效应细胞分别与靶细胞以 10:1 的比例共培养条件下, 24h
后检测对靶细胞的杀伤情况, E 为效应细胞, T 为靶细胞。
本发明的实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 构建重组慢病毒载体
一、材料
1 、慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer ,慢病毒包装质粒 pPac-GP 、
pPac-R 以及膜蛋白质粒 pEnv-G , HEK293T/17 细胞、同源重组酶、 Oligo Annealing Buffer
由世翱(上海)生物医药科技有限公司提供;
2 、引物:根据引物设计原则设计扩增DNA 片段和靶位点所需的引物,具体为:
EF1 α -F :
5'-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3' (SEQ ID NO.25)
EF1 α -R : 5'-TCACGACACCTGAAATGGAAGA-3' (SEQ ID
NO.26)
CD8 leader-F :
5'-ggtgtcgtgaggatccgccaccatggccttaccagtgaccgc-3' (SEQ ID NO.27)
CD8 leader-R :
5'-GTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTG-3'(SEQ ID NO.28)
VL-F :
5'-cacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatc-3'(SEQ ID NO.29)
VL-R : 5'-TGTGATCTCCAGCTTGGTCC-3'(SEQ ID
NO.30)
OLC-VH-F:5'-caagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtca
-3'(SEQ ID NO.31)
VH-R : 5'-TGAGGAGACGGTGACTGAGGT-3'(SEQ ID
NO.32)
CD8 Hinge-F :
5'-AGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCC-3'(SEQ ID NO.33)
CD8 Hinge-R : 5'-GTAGATATCACAGGCGAAGTCCA-3'(SEQ ID
NO.34)
CD8 Transmembrane-F :
5'-cgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggc-3'(SEQ ID NO.35)
CD8Transmembrane-R:5'-TCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG- 3'(SEQ ID
NO.36)
CD137-F : 5'-aaacggggcagaaagaaactc-3'(SEQ ID
NO.37)
CD137-R:5'-TGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'(SEQ ID NO. 38)
TCR-F : 5'-agagtgaagttcagcaggagcg-3'(SEQ ID
NO.39)
TCR-R :
5'-GGAGAGGGGCGTCGACTTAGCGAGGGGGCAGGGC-3'(SEQ ID NO.40)
siRNA1761-F(negative
control):5'-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3'(SEQ ID
NO.41)
siRNA1761-R(negative
control):5'-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA-3'(SEQ ID
NO.42)
siRNA1762-F:5'-CCGGGTGAAGCTGAGTTAATTTATGCTCGAGTAAATTAACTCAGCTTCACATTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.43)
siRNA1762-R:5'-AATTCAAAAAAATGTGAAGCTGAGTTAATTTACTCGAGCATAAATTAACTCAGCTTCAC-3'(SEQ
ID NO.44)
siRNA1763-F:5'-CCGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTCGAGAACAACATAAGTTCTGTGCCCTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.45)
siRNA1763-R:5'-AATTCAAAAAAGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCGAGAGAACAACATAAGTTCTGTGC-3'(SEQ
ID NO.46)
siRNA1764-F:5'-CCGGCTCAGATTGTTGTTGTTAATGCTCGAGTTAACAACAACAATCTGAGGTTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.47)
siRNA1764-R:5'-AATTCAAAAAAACCTCAGATTGTTGTTGTTAACTCGAGCATTAACAACAACAATCTGAG-3'(SEQ
ID NO.48)
siRNA1765-F:5'-CCGGGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCCTCGAGAGGAACTCCTTAAAGCTGCGCTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.49)
siRNA1765-R:5'-AATTCAAAAAAGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTCTCGAGGCAGGAACTCCTTAAAGCTGC-3'(SEQ
ID NO.50)
siRNA1766-F:5'-CCGGGTGTAGGCTTACCTCAAATAACTCGAGATTTGAGGTAAGCCTACACTTTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.51)
siRNA1766-R:5'-AATTCAAAAAAAAGTGTAGGCTTACCTCAAATCTCGAGTTATTTGAGGTAAGCCTACAC-3'(SEQ
ID NO.52)
siRNA1767-F:5'-CCGGCTCAAATAAATGGCTAACTTACTCGAGAGTTAGCCATTTATTTGAGGTTTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.53)
siRNA1767-R:5'-AATTCAAAAAAACCTCAAATAAATGGCTAACTCTCGAGTAAGTTAGCCATTTATTTGAG-3'(SEQ
ID NO.54)
siRNA1768-F:5'-CCGGGATGCTTCCAATCTGGATTCACTCGAGAATCCAGATTGGAAGCATCCATTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.55)
siRNA1768-R:5'-AATTCAAAAAATGGATGCTTCCAATCTGGATTCTCGAGTGAATCCAGATTGGAAGCATC-3'(SEQ
ID NO.56)
siRNA1769-F:5'-CCGGCTTCCAATCTGGATTCAATGACTCGAGATTGAATCCAGATTGGAAGCATTTTTTG-3'(SEQ
ID NO.57)
siRNA1769-R:5'-AATTCAAAAAATGCTTCCAATCTGGATTCAATCTCGAGTCATTGAATCCAGATTGGAAG-3'(SEQ
ID NO.58)
WPRE-QPCR-F:5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(SEQ ID
NO.59)
WPRE-QPCR-R:5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(SEQ ID
NO.60)
Actin-QPCR-F:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'(SEQ ID
NO.61)
Actin-QPCR-R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'(SEQ ID
NO.62)
CAR-QPCR-F:5'-GACTTGTGGGGTCCTTCTCCT-3'(SEQ ID
NO.63)
CAR-QPCR-R:5'-GCAGCTACAGCCATCTTCCTC-3'(SEQ ID
NO.64)
IL6-QPCR-F:5'-GGATTCAATGAGGAGACTT-3'(SEQ ID
NO.65)
IL6-QPCR-R:5'-ATCTGTTCTGGAGGTACT-3'(SEQ ID
NO.66)
3 、 SEQ ID NO.15~SEQ ID NO.66 所示的 DNA
序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成,并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存;
4 、工具酶 BspE I 、 EcoR I 、 BamH I 、 Kpn I 、 Cla I 、
T4 DNA 连接酶均购自 NEB 公司;
5 、高保真酶 PrimeSTAR 、 RN 购自 Takara 公司;
6 、 0.22μm-0.8μm PES 滤器购自 millipore 公司;
7 、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自 MN 公司;
8 、感受态细胞 TOP10 购自 tiangen 公司;
9 、 NaCl 、 KCl 、
Na2HPO4.12H2O 、 KH2PO4 、
Trypsin 、 EDTA 、 CaCl2 、 NaOH 、 PEG6000 均购自上海生工;
10 、 Opti-MEM 、 FBS 、 DMEM 、 1640 、 Pen-Srep 、
Hepes 、购自 invitrogen 公司;
11 、 Biotinylated protein L 购自 GeneScript 公司;
12、辣根过氧化物酶标记的二抗、 DAB 工作液均购自北京中杉金桥;
13 、 ECL+plusTM Western blotting system 购自
Amersham 公司;
14 、 DNeasy 试剂盒购自上海捷瑞公司;
15 、 淋巴细胞分离液购自深圳达科为公司;
16 、 phycoerythrin(PE) -conjugated streptavidin 、
CBA kit 购自 BD Bioscience 公司;
17 、 S A-HRP 购自上海翊圣公司;
18 、 支原体检测试剂盒、内毒素检测试剂盒、 CD19+K562
细胞购自世翱(上海)公司;
19 、 LDH 检测试剂盒购自 promega 公司;
二、重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 的构建方法。
参见图 4 ,本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下:
1 、将人 EF1 α启动子、 CD8 leader 嵌合受体信号肽、 CD19 单链抗体轻链
VL 、 Optimal Linker C 、 CD19 单链抗体重链 VH 、 CD8 Hinge 嵌合受体铰链、 CD8 Transmembrane
嵌合受体跨膜区、 CD137 嵌合受体共刺激因子、 TCR 嵌合受体 T 细胞激活域片段克隆至慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer
,得到重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer ,再将 siRNA 片段分别连接到 pCAR19-silencer 中,得到 IL-6
敲减重组慢病毒质粒 pCAR19-1761~pCAR19-1769 。
( 1 )将慢病毒骨架质粒 pLenti-3G silencer 使用 Cla I 和 BamH
I 限制性内切酶进行双酶切,产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 7381bp 的片段 V1 (图 5 所示),并割胶回收置于 Eppendorf
管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
1 、溶胶 |
按 200 μl NTI/100 mg gel 比例加入溶胶液, 50 ℃水浴放置5-10分钟。 |
2 、结合 DNA |
11000g 离心 30 秒,弃去滤液。 |
3 、洗膜 |
加入 700μl NT3 , 11000g 离心 30 秒,弃去滤液。 |
4 、洗膜 |
重复第三步一次 |
5 、晾干 |
11000g 离心 1 分钟,换新的收集管,室温放置 1 分钟。 |
6 、洗脱 DNA |
加入 15-30 μl NE ,室温放置 1 分钟, 11000g 离心 1 分钟,收集滤液。 |
表 1 琼脂糖凝胶回收步骤
( 2 )用引物 EF1 α -F 和 EF1 α -R 以合成的 SEQ ID NO.15
为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98℃ 3min ,( 98℃ 10sec , 55℃ 15sec , 72℃ 2min )
*35cycle , 72℃ 10min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 1208bp 的片段 a ,并割胶回收置于 Eppendorf
管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
试剂 |
体积( μl ) |
H2O |
32.5 |
5×Buffer ( with Mg2+ ) |
10 |
dNTP (各 2.5mM ) |
4 |
Primer1 (+)( 10μM ) |
1 |
Primer2 (-)( 10μM ) |
1 |
Template |
1 |
PrimeSTAR |
0.5 |
表 2 50 μl PCR 反应体系
( 3 )用引物 CD8 leader-F 和 CD8 leader-R 以合成的 SEQ ID
NO.16 为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98℃ 3min ,( 98℃ 10sec , 55℃ 15sec , 72℃ 30sec
) *35cycle , 72℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 101bp 的片段 b ,并割胶回收置于 Eppendorf
管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 4 )用引物 VL-F 和 VL-R 以合成的 SEQ ID NO.17 为模板,使用表 2
中的体系, PCR 循环条件为: 98℃ 3min ,( 98℃ 10sec , 55℃ 15sec , 72℃ 30sec ) *35cycle , 72℃
5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 336bp 的片段 c ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用 MN
公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 5 )用引物 OLC-VH-F 和 VH-R 以合成的 SEQ ID NO.19
为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 55 ℃ 15sec , 72 ℃ 30sec )
*35cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 421bp 的片段 d ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用
MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 6 )用引物 CD8 Hinge-F 和 CD8 Hinge-R 以合成的 SEQ ID
NO.20 为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 55 ℃ 15sec , 72 ℃
30sec ) *35cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 147bp 的片段 e ,并割胶回收置于
Eppendorf 管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 7 )用引物 CD8 Transmembrane-F 和 CD8
Transmembrane-R 以合成的 SEQ ID NO.21 为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃
10sec , 55 ℃ 15sec , 72 ℃ 30sec ) *35cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认
100bp 的片段 f ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1
),并测定产物的纯度和浓度;
( 8 )用引物 CD137-F 和 CD137-R 以合成的 SEQ ID NO.22
为模板,使用表 2 中的体系, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 55 ℃ 15sec , 72 ℃ 30sec )
*35cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 142bp 的片段 g ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用
MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 9 )用引物 TCR-F 和 TCR-R 以合成的 SEQ ID NO.23 为模板,使用表
2 中的体系, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 55 ℃ 15sec , 72 ℃ 30sec ) *35cycle
, 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 355bp 的片段 h ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用 MN
公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 10 )将 DNA 片段 b 、 c 、 d 各 1μl 作为模板,使用表 3
中的体系,除引物外加入 Eppendorf 管内, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 60 ℃ 10sec , 72
℃ 30sec ) *6cycle ,加入引物 CD8 leader-F/VH-R, ( 98 ℃ 10sec , 60 ℃ 10sec , 72 ℃
40sec ) *24cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 814bp 的片段 i ,并割胶回收置于
Eppendorf 管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1),并测定产物的纯度和浓度;
试剂 |
体积( μl ) |
H2O |
33.5-1* 模板数 |
5×Buffer ( with Mg2+ ) |
10 |
dNTP (各 2.5mM ) |
4 |
Primer1 (+)( 10μM ) |
1 |
Primer2 (-)( 10μM ) |
1 |
Template |
1* 模板数 |
PrimeSTAR |
0.5 |
表 3 50 μl 重叠 PCR 反应体系
( 11 )将 DNA 片段 e 、 f 、 g 、 h 各 1μl 作为模板,使用表 3
中的体系,除引物外加入 Eppendorf 管内, PCR 循环条件为: 98 ℃ 3min ,( 98 ℃ 10sec , 60 ℃ 10sec , 72
℃ 30sec ) *6cycle ,加入引物 CD8 Hinge-F/TCR-R, ( 98 ℃ 10sec , 60 ℃ 10sec , 72 ℃
30sec ) *24cycle , 72 ℃ 5min 。产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 704bp 的片段 j ,并割胶回收置于
Eppendorf 管内,用 MN 公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 12 )将 DNA 片段 V1 、 a 、 i 、 j 以 5μl 总体积且摩尔比
1:1:1:1 的比例加入 Eppendorf 管内,加入同源重组酶反应液 15μl ,混匀后在 42℃ 孵育 30 分钟,转移至冰上放置 2-3
分钟,将反应液加入 50μl TOP10 中,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置 30 分钟,将管放到预加温到 42 ℃的恒温水浴锅中热激 90
秒,快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却 2-3 分钟,每管加 900 µl LB 培养液,然后将管转移到 37 ℃摇床上,温育 1 小时使细菌复苏,取
100μl 的转化菌液涂布于 Amp LB 琼脂平板上,倒置平皿,于恒温培养箱中 37 ℃培养, 16 小时。
挑取克隆进行菌落 PCR 鉴定,鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer
,对正确的克隆进行酶切鉴定(见图 6 );
( 13 )将重组慢病毒质粒 pCAR19-silencer 使用 BspE I 和 EcoR I
限制性内切酶进行双酶切,产物经过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳,确认 10029bp 的片段 V2 ,并割胶回收置于 Eppendorf 管内,用 MN
公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表 1 ),并测定产物的纯度和浓度;
( 14 )将合成好的 siRNA1761-F/R~siRNA1769-F/R 分别用 oligo
annealing buffer 溶解成 20μM ,对应的 F 和 R 各取 30μl 混合。然后将 siRNA1761-F&R~
siRNA1769-F&R 混合物在水浴锅中 95 ℃ 加热 5 分钟,然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温,形成双链寡核苷酸片段。取 1μl
用于的连接反应(见表 4 ), 4℃ 连接 16h ,转移至冰上放置 2-3 分钟,将反应液加入 50μl TOP10 中,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置
30 分钟,将管放到预加温到 42 ℃的恒温水浴锅中热激 90 秒,快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却 2-3 分钟,每管加 900 µl LB
培养液,然后将管转移到 37 ℃摇床上,温育 1 小时使细菌复苏,取 100μl 的转化菌液涂布于 Amp LB 琼脂平板上,倒置平皿,于恒温培养箱中 37
℃培养, 16 小时。
挑取克隆进行菌落 PCR 鉴定,鉴定正确的克隆即为 IL-6 敲减重组慢病毒质粒
pCAR19-1761~pCAR19-1769 ,对正确的克隆进行测序鉴定(见图 7 )。
试剂 |
体积( μl ) |
H2O |
13 |
V2 |
3 |
10 × T4 DNA ligase Buffer |
2 |
T4 DNA ligase |
1 |
退火的双链寡核苷酸 |
1 |
表 4 20 μl 连接反应体系
2 、重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 的包装。
( 1 )完全培养基:取出预热好的新鲜培养基,加入 10%FBS +5ml Pen-Srep
,上下颠倒混匀即可;
( 2 ) 1XPBS 溶液:称量 NaCl 8g , KCl 0.2 ,
Na2HPO4.12H2O 3.58g , KH2PO4
0.24g置于 1000ml 烧杯中,加入 900ml Milli-Q grade 超纯水溶解,溶解完成后,使用 1000ml 量筒定容至 1000ml ,
121 ℃高温湿热灭菌 20min ;
( 3 ) 0.25%Trypsin 溶液 : 称量 Trypsin 2.5g , EDTA
0.19729g 置于 1000ml 烧杯中,加入 900ml 1XPBS 溶解,溶解完成后,使用 1000ml 量筒定容至 1000ml , 0.22 μ
M 过滤除菌,长期使用可保存至 -20 ℃冰箱;
( 4 ) 0.5M CaCl2 溶液:称量 36.75g CaCl2 用
400ml Milli-Q grade 超纯水溶解;用 Milli-Q grade 超纯水将总体积定容至 500ml ,混匀; 0.22μm
过滤除菌,分装保存到 50ml 离心管中,每管 45ml 左右, 4 ℃保存。
( 5 ) 2XHBS 溶液:称量 4.09g NaCl , 0.269g
Na2HPO4 , 5.96g Hepes ,用 400ml Milli-Q grade 超纯水溶解;校准 pH 仪后,用 2M
NaOH 溶液将 HBS 溶液的 pH 调到 7.05 。调整每瓶 HBS 的 PH 消耗 2M NaOH 为 3ml 左右;
( 6 )从液氮罐中取出冻存的 HEK293T/17 细胞,迅速转移到 37 ℃ 水浴中,
1~2min 后转移到超净台中,无菌操作将冻存管中的液体全部转移至 10cm2 培养皿中,补足含 10%FBS 的 DMEM 至
8mL/10cm2 dish , 24h 后显微镜观察细胞,细胞汇合的程度大于 80% 进行传代;
( 7 )选择细胞状态良好、无污染的 HEK293T/17 细胞,每 2-6
个培养皿为一组,将细胞胰酶消化后,用电动移液器吸取 4-12ml 完全培养基,向每个消化后的培养皿中加 2ml ,避免培养皿变干;使用 1ml
移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液,转移到培养基瓶中;
( 8 )将上述 2-6
个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中,并用培养基再冲洗一便培养皿;
( 9 )盖紧培养基瓶盖,上下颠倒 10 次左右充分混匀细胞悬液,将细胞传到 8-24 个
10cm2 培养皿中,每皿的细胞密度应当约 4 × 106 个 /10ml
完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大,则需要对细胞进行计数,然后按照 4× 106 个 / 皿的量接种;
( 10 )每 6
个培养皿整理为一摞,注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右,前后晃动数次,使细胞充分铺开,然后放入 5% CO2
培养箱。剩余细胞做同样处理;
( 11 )检查所传代细胞,细胞汇合度应当为 70-80%
,轮廓饱满,贴壁良好,在细胞培养皿中均匀分布;
( 12 )为细胞换液,将培养基替换为新鲜完全培养基 , 每皿 9ml ,并将培养箱的
CO2 浓度设定值提高到 8% ;
( 13 )按照 N+0.5 配 DNA/CaCl2 溶液。每皿
HEK293T/17 细胞转染质粒量按照下列比例使用:重组慢病毒质粒 (20μg), pPac-GP (15μg) , pPac-R (10μg),
pEnv-G (7.5μg) 。取一个新的 5ml 离心管,加入 0.5M CaCl2 : 0.25ml ,重组慢病毒质粒 20μg : pPac-GP
15μg : pPac-R 10μg : pEnv-G 7.5μg ,补充超纯水至 0.5ml 盖上盖子,充分混匀;
( 14 )另取一支 5ml 离心管,加入 0.5ml DNA/CaCl2
溶液。打开涡旋振荡器,一只手拿住 5ml 离心管的上端,使管底接触振荡头,使液体在管壁上散开流动,另一只手拿一把 1mL 移液枪,吸取 0.5mL 2×HBS
溶液,缓慢滴加进入离心管,控制流速,以半分钟滴完为宜。 2×HBS 加入后,继续振荡 5 秒钟,停止振荡,可直接加入需要转染的细胞中;
( 15 )取一皿细胞,将离心管中的 1mL
钙转液滴加进去,尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中;
( 16 )钙转液加入后,在皿盖上做好标记,将培养皿放还到另一个 5%
CO2 培养箱中。确保培养皿水平放置,每摞培养皿不要超过 6 个。在 5% CO2 培养箱中放置 (6-8 h)
;
( 17 )将第一个培养箱的 CO2 浓度设定值调回到 5% ;
( 18 ) 24 小时后,检查细胞状态。细胞汇合度应当为 80-85%
左右,状态良好。将培养基吸走,更换 10ml 新鲜的 DMEM 完全培养基;
( 19 ) 48 小时后,观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过 95%
细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起,并向培养皿中继续添加 10mL 新鲜培养基;
( 20 ) 72
小时后,再次将同一个病毒上清液收集到一起,两次收集的病毒可以放在一起,丢弃培养皿;此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体
lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 。
实施例 2 重组慢病毒载体的浓缩及检测
一、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体 ( 如图 8 所示 ) ;
( 1 )将收集的上清液使用 Thermo 真空泵,经 0.22μm-0.8μm 的 PES
滤器抽滤,除去杂质;
( 2 )按 1:1~1:10 的比例往上清中加入 1.5M NaCl 250 mM
Tris-HCl (pH 6-8);
( 3 )将 2 个离子交换柱串联放置,用 4ml 1M NaOH 、 4ml 1M NaCl 、
5ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl ( pH 6-8 )溶液依次过柱;
(4)将步骤 2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样;
( 5 )全部上清液过柱后,使用 10ml 0.15M NaCl 25 mM Tris-HCl (
pH 6-8 )溶液清洗一遍;
( 6 )根据上样量使用 1-5ml 1.5M NaCl 25 mM Tris-HCl ( pH
6-8 )进行洗脱,收集洗脱液;
( 7 )将洗脱液分成 25 到 50μl 一管,冻存到 -80℃ 冰箱,进行长期保存;
二、滴度测定;
( 1 )取 24 孔板接种 293T 细胞。每孔细胞为 5×104
个,所加培养基体积为 500ul, 不同种类的细胞生长速度有所差异,进行病毒感染时的细胞融合率为 40%-60% ;
( 2 )准备 3 个无菌 EP 管,在每个管中加入 90ul 的新鲜完全培养基(高糖
DMEM+10%FBS )接种细胞 24 小时后,取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定感染时细胞的实际数目,记为 N ;
( 3 )取待测定的病毒原液 10ul 加入到第一个管中,轻轻混匀后,取 10ul
加入到第二个管中,然后依次操作直到最后一管;在每管中加入 410ul 完全培养基(高糖 DMEM+10%FBS ) , 终体积为 500ul ;
( 4 )感染开始后 20 小时,除去培养上清,更换为 500μl 完全培养基(高糖
DMEM+10%FBS ), 5%CO2 继续培养 48 小时;
( 5 ) 72 小时后,观察荧光表达情况,正常情况下,荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少 ,
并拍照;
( 6 )用 0.2ml 0.25% 胰酶 -EDTA 溶液消化细胞,在 37℃ 放置 1
分钟。用培养基吹洗整个细胞面,离心收集细胞。按照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA 。每个样品管中加入 200μl 洗脱液洗下 DNA
并定量;
( 7 )准备目的 DNA 检测 qPCRmix 总管 Ⅰ ( QPCR 引物序列为 SEQ ID
NO.59 --- SEQ ID NO.60 ):
2× TaqMan Master Mix |
25 μl × n |
Forward primer (100 pmol ml-1) |
0.1μl × n |
Reverse primer (100 pmol ml-1) |
0.1μl × n |
Probe (100 pmol ml-1) |
0.1μl × n |
H2O |
19.7μl × n |
n = number of reactions. 例如:总反应数为 40 ,将 1ml 2×
TaqMan Universal PCR Master Mix , 4μl forward primer , 4μl reverse primer , 4μl
probe 和 788μl H2O 混和。震荡后放在冰上;
( 8 )准备内参 DNA 检测 qPCRmix 管 Ⅱ ( QPCR 引物序列为 SEQ ID
NO.61--- SEQ ID NO.62 ):
2× TaqMan Master Mix |
25 μl × n |
10×RNaseP primer/probe mix |
2.5 μl × n |
H2O |
17.5μl × n |
n = number of reactions. 例如:总反应数为 40 ,将 1ml 2×
TaqMan Universal PCR Master Mix , 100μl 10×RNaseP primer/probe mix 和 700μl
H2O 混和。震荡后放在冰上;
( 9 )在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立。从总管 Ⅰ 中各取 45μl
加入到 A-D 各行的孔中,从总管 Ⅱ 中各取 45μl 加入到 E-G 各行的孔中。
( 10 )分别取 5μl 质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A-D 行中,每个样品重复
1 次。另留 1 个孔加入 5μl 的水做为无模板对照(no-template control)。
(11)分别取 5μl 基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中,每个样品重复
1 次。另留 1 个孔加入 5μl 的水做为无模板对照(no-template control)。
( 12 )所使用定量 PCR 仪为 ABI PRISM 7500 定量系统。循环条件设定为:
50℃ 2 分钟, 95℃ 10 分钟,然后是 95℃ 15 秒, 60℃ 1 分钟的 40 个循环。
数据分析:测得的 DNA
样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定,得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度( integration units per ml , IU ml-1
)的计算公式如下:
IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V
其中: |
C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数 |
|
N = 感染时细胞的数目(约为 1×105 ) |
|
D = 病毒载体的稀释倍数 |
|
V = 加入的稀释病毒的体积数 |
( 13 )重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 的滴度结果(如图
9 所示);
三、内毒素测定;
( 1 )、内毒素工作标准品为 15EU/ 支;
( 2 )、鲎试剂灵敏度λ= 0.25EU/ml, 0.5ml/ 管
( 3 )、内毒素标准品稀释:取内毒素标准品一支,分别用 BET 水按比例稀释成 4 λ和 2
λ的溶解,封口膜封口,震荡溶解 15min ;稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀 30s ;
( 4 )、加样:取鲎试剂若干支,每支加入 BET 水 0.5ml
溶解,分装至若干支无内毒素试管中,每管 0.1ml 。其中 2 支为阴性对照管,加入 BET 水 0.1ml ;
2 支为阳性对照管,加入 2λ 浓度的内毒素工作标准品溶液 0.1ml ;
2 支为样品阳性对照管,加入 0.1ml 含 2λ 内毒素标准品的样品溶液(稀释 20
倍的待测样品 1ml + 4λ 的内毒素标准品溶液 1ml=2ml 含 2λ 内毒素标准品的稀释 40 倍样品)。
样品管中加入 0.1ml 样品,稀释比例见表 5 , 37 ± 1 ℃水浴(或培养箱)保温 60
± 1min ;
稀释倍数 |
原液 |
5 |
10 |
20 |
40 |
80 |
160 |
对应 EU/ml |
0.25 |
1.25 |
2.5 |
5 |
10 |
20 |
40 |
表 5 内毒素稀释比例及对应内毒素含量
( 5 )、重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769
的内毒素检测结果(如表 6 所示),内毒素含量在 0~2.5 EU/ml 之间,符合要求;
稀释倍数
|
原液
|
5
|
10
|
20
|
40
|
80
|
160
|
对应 EU/ml
|
0.25
|
1.25
|
2.5
|
5
|
10
|
20
|
40
|
lvCAR19-1761
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1762
|
( + )
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1763
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1764
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1765
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1766
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1767
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1768
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
lvCAR19-1769
|
( + )
|
( + )
|
( + )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
( - )
|
表 6 内毒素检测结果
四、支原体测定及比较;
( 1 )在实验前三日,细胞样品用无抗生素培养基进行培养;
( 2 )收集 1ml 细胞悬浮液(细胞数大于 1*105 ),置于
1.5ml 离心管中;
( 3 ) 13000 × g 离心 1min ,收集沉淀,弃去培养基;
( 4 )加入 500ul PBS 用枪头吹吸或涡旋振荡,重悬沉淀。 13000 × g 离心
5min ;
( 5 )步骤 4 重复一次;
( 6 )加入 50μl Cell Lysis Buffer ,用枪头吹吸,充分混匀后 , 在
55 ℃水浴中孵育 20min ;
( 7 )将样品置于 95 ℃中加热 5min ;
( 8 ) 13000 × g 离心 5min 后,取 5μl 上清作为模板, 25μlPCR
反应体系为: ddH20 6.5μl 、 Myco Mix 1μl 、 2x Taq Plus Mix Master (Dye Plus) 12.5μl
、模板 5μl ; PCR 循环条件为: 95 ℃ 30sec ,( 95 ℃ 30sec , 56 ℃ 30sec , 72 ℃ 30sec )
*30cycle , 72 ℃ 5min 。
( 9 )支原体检测结果显示(如图 10 和表 7 所示),重组慢病毒载体
lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 均不含支原体。
PCR 模版
|
PCR 产物
|
判定说明
|
阳性对照
|
有280bp和150bp条带
|
阳性成立
|
无或者只有一条带
|
阳性不成立
|
|
阴性对照
|
150bp 条带
|
阴性成立
|
无或有两条带以上
|
阴性不成立
|
|
样品
|
有280和150条带
|
支原体污染
|
只有280条带
|
支原体严重污染
|
|
只有150bp
|
无支原体污染
|
|
无条带
|
细胞量过少或PCR反应被抑制
|
|
表 7 支原体检测结果
实施例 3 重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769
的功能检测。
一、 CAR 基因的细胞水平表达检测:
( 1 )重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 和对照病毒 MOCK
感染 PBMC 细胞后,收集细胞采用 RT-PCR 进行 CAR mRNA 转录水平的检测,验证 CAR 基因的表达,如果 CAR mRNA
转录水平增高,则说明 CAR 基因的转录水平表达成功;
( 2 )重组慢病毒载体 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 和对照病毒 MOCK
感染 PBMC 细胞后,收集细胞采用 western blot 进行 CAR 蛋白表达水平的检测,验证 CAR 基因的表达,如果 CAR
蛋白表达水平增高,则说明 CAR 基因的翻译水平表达成功;
( 3 )分别将 MOI=15 的 lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 和对照病毒
MOCK 感染细胞, 48h 后提取 6 孔板中细胞的总 RNA 和总蛋白分别进行荧光定量 PCR 实验和免疫印迹实验。具体步骤:包被 6
孔板的四个孔,每个孔加入相应的 PBS 和 RN , 4 ℃ 过夜。 12 小时后按 MOI=15 包被病毒, 37 ℃ 培养箱放置 5h ;取出的 6
孔板,弃掉病毒上清,用 PBS 洗两遍,按 1*106/ 孔,包被 PBMC (用淋巴细胞分离液从人血中分离),加入 500ul
培养基(含 10% 血清、 20U/ml IL-2 、 Polybrene 8ug/ml )。静置 20min , 1000g 20 ℃离心 30min ,
37 ℃ 培养 48h 。
( 4 ) Trizol 法提取 6 孔板中 PBMC 细胞的总 RNA ,逆转录扩增 cDNA,
用 QPCR 引物(序列为 SEQ ID NO.63---SEQ ID NO.64 )进行荧光定量 PCR 实验,反应体系见表 8 ,以内参 Actin
为对照组,验证其 mRNA 的转录情况。
试剂 |
体积( μl ) |
SYBR premix ex taq: |
10 μl |
ROX Reverse Dye(50x) |
0.4μl |
上游引物( 2.5μM ): |
0.5μl |
下游引物( 2.5μM ): |
0.5μl |
cDNA |
1.0μl |
ddH2O |
7.6μl |
表 8 20μl qPCR 反应体系
( 5 )蛋白 免疫印迹 ( Western Blot) 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将从 PBMC
中提取的总蛋白质按相对分子质量分离。采用湿转( 4 ℃ , 400 mA , 120min ),将蛋白转移到 PVDF 膜上。用封闭液(含 5% 脱脂牛奶的
TBST 溶液)室温封闭 PVDF 膜 1h ,封闭液 1:1000 稀释 Biotinylated protein L ,然后 与封闭好的 PVDF
膜室温孵育 4 ℃ 过夜。 TBST 洗膜 3 次,每次 10min 。封闭液 1:500 稀 释相应的 SA-HRP ,室温 下孵育 PVDF 膜 2h ,
TBST 洗膜 3 次,每次 10min 。采用 Amersham 公司 ECL+plusTM Western blotting system
试剂盒进行显色。 X 光显影获得显示条带的胶片。
( 6 ) RT-QPCR 检测显示,重组慢病毒载体感染 PBMC 后的 CAR
基因的转录水平比对照病毒 MOCK 和空细胞有明显升高(如图 11 和表 9 所示),说明 CAR 基因的转录水平表达成功。
Sample name
|
Actin(CT)
|
CAR(CT)
|
- ΔCt
|
-ΔΔCt |
2-ΔΔCt |
lv CAR19-1761
|
19.51814
|
29.58243
|
-10.0643
|
5.91976
|
60.53753
|
lv CAR19-1762
|
19.15714
|
29.11395
|
-9.9568
|
6.02725
|
65.22033
|
lv CAR19-1763
|
19.20232
|
29.19465
|
-9.99233
|
5.99172
|
63.6338
|
lv CAR19-1764
|
19.26301
|
29.27989
|
-10.0169
|
5.96717
|
62.55993
|
lv CAR19-1765
|
19.29964
|
29.35456
|
-10.0549
|
5.92914
|
60.93236
|
lv CAR19-1766
|
19.3805
|
29.55666
|
-10.1762
|
5.8079
|
56.02099
|
lv CAR19-1767
|
19.52714
|
29.39926
|
-9.87212
|
6.11194
|
69.16335
|
lv CAR19-1768
|
19.75407
|
29.71702
|
-9.96295
|
6.02111
|
64.94329
|
lv CAR19-1769
|
19.48712
|
29.36486
|
-9.87774
|
6.10631
|
68.89426
|
MOCK
|
19.31164
|
35.11353
|
-15.8019
|
0.18217
|
1.134585
|
Blank
|
19.94915
|
35.93321
|
-15.9841
|
0
|
1
|
表 9
( 7 )蛋白 免疫印迹 (Western Blot) 的结果表明,重组慢病毒载体感染 PBMC
后 CAR 蛋白的表达水平比对照病毒 MOCK 和空细胞有明显升高(如图 12 所示),说明 CAR 基因的翻译水平表达成功。
二、 IL-6 敲减效果评估( mRNA 转录水平和上清中 IL-6 的表达水平)。
( 1 )分别培养 CD19+K562 细胞和 PBMC 细胞;
( 2 )实验开始前 4 天, MOI=15 的
lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 的病毒感染 PBMC 细胞,培养 72-96h 后可安排开始实验;
( 3 )收集靶细胞( CD19+K562
)4x105cells和效应细胞(lvCAR19-1761-PBMC~lvCAR19-1769-PBMC 细胞)
2.8x106cells , 800g , 6min 离心,弃上清;
( 4 )用 1ml 1xPBS 溶液分别重悬靶细胞和效应细胞, 800g , 6min
离心,弃上清;
( 5 )重复步骤 4 一次;
( 6 )用 700ul 培养基( 1640 培养基 +10% FBS )重悬效应细胞,用 2ml
培养基( 1640 培养基 +10% FBS )重悬靶细胞;
( 7 )设置效靶比为 10:1 的实验孔,并设置对照组;
( 8 ) 250xg , 5min 平板离心;
( 9 ) 37 ℃ 5%CO2 培养箱中共培养 4 小时,收集 100ul
共培养上清,做 CBA 检测 IL-6 含量;
( 10 )继续 37 ℃ 5%CO2 培养箱中共培养至 24 小时,
1000xg , 2min 平板离心,收集 100ul 共培养上清做 CBA 检测 IL-6 含量,收集细胞检测 IL-6 mRNA 转录水平;
( 11 ) CBA 检测 IL-6 含量的步骤为, IL-6
标准品管、样品管、阴性对照管中各加入 50ul IL-6 捕获微球悬液,加样前混匀微球;各管分别加入 50ul PE 信号抗体; IL-6 标准品管加入
IL-6 标准品稀释液;样品管、阴性对照管中分别加入稀释后样品和阴性对照液;室温避光孵育 3h ;各管加入 1ml 洗液, 200 xg 离心 5min
;弃上清;各管加入 300ul 洗液,重新悬浮微球;使用 Attune® NxT 流式细胞仪分析样本,当日上机,上机前充分混匀 3-5s ;
( 12 ) Trizol 法提取上述混合细胞的总 RNA ,逆转录扩增 cDNA, 用 QPCR
引物(序列为 SEQ ID NO.65---SEQ ID NO.66 )进行荧光定量 PCR 实验,反应体系见表 6 ,以内参 Actin 为对照组,验证其
mRNA 的转录情况。
( 13 ) 4h 和 24h 的 CBA 检测结果(如图 13 所示), IL-6
敲减重组慢病毒载体感染 PBMC 并与靶细胞孵育后, IL-6 基因的上清含量比对照病毒 lvCAR19-1761 和空细胞有明显降低(如图 14
所示),说明 IL-6 基因的表达水平明显降低。
( 14 ) RT-QPCR 检测结果显示, IL-6 敲减重组慢病毒载体感染 PBMC
并与靶细胞孵育后, IL-6 基因的 mRNA 比对照病毒 lvCAR19-1761 和空细胞有明显降低(如图 15 所示),说明 IL-6
基因的转录水平明显降低。
三、细胞杀伤实验效果评估。
( 1 )分别培养 CD19+K562 细胞和 PBMC 细胞;
( 2 )实验开始前 4 天, MOI=15 的
lvCAR19-1761~lvCAR19-1769 的病毒感染 PBMC 细胞,培养 72-96h 后可安排开始实验;
( 3 )收集靶细胞( CD19+K562 ) 4x105cells
和效应细胞( CART 细胞) 2.8x106cells , 800g , 6min 离心,弃上清;
( 4 )用 1ml 1xPBS 溶液分别重悬靶细胞和效应细胞, 800g , 6min
离心,弃上清;
( 5 )重复步骤 3 一次;
( 6 )用 700ul 培养基( 1640 培养基 +10% FBS )重悬效应细胞,用 2ml
培养基( 1640 培养基 +10% FBS )重悬靶细胞;
( 7 )设置效靶比为 1:1 、 5:1 、 10:1 的实验孔,并设置对照组,每组 3
个复孔;
( 8 ) 250xg , 5min 平板离心;
( 9 ) 37 ℃ 5%CO2 培养箱中培养 4 小时;
( 10 ) 250xg , 5min 平板离心;
( 11 )取每个孔的 50ul 上清到新 96 孔板中,并且每孔加入 50ul
底物溶液(避光操作);
( 12 )避光孵育 25 分钟;
( 13 )每孔加入 50ul 终止液;
( 14 )酶标仪检测 490nm 吸光度;
( 15 )将 3
个复孔取平均值;将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值;将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。
( 16 )将步骤 15
中获得的经过校正的值带入下面公式,计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。结果如图 16 所示,, IL-6 敲减重组慢病毒载体转导的 PBMC 细胞在
10:1 效靶比条件下杀伤效率明显高于 PBMC 空细胞,低于对照病毒 lvCAR19-1761 转导的 PBMC 细胞;其中
lvCAR19-1763-PBMC 杀伤效率略低于对照病毒 lvCAR19-1761-PBMC ,但是 IL-6 的表达水平下降超过 70%
,将来可以在杀伤肿瘤细胞的同时,释放较少的 IL-6 ,有效缓解 CRS 。
杀伤效率 = (实验孔 − 效应细胞孔 − 靶细胞孔) / (靶细胞最大孔 −
靶细胞孔) X100%
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
工业实用性
本发明所述的 IL-6 敲减 siRNA 表达框及其 siRNA 表达产物,不仅可以应用于
CAR19-T 治疗急性 B 淋巴细胞白血病 (ALL) 中用于消除或减轻 CRS 的症状,还可应用于缓解 CAR-T 治疗诸如 B
淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤等等所有类型肿瘤时引起的 CRS 症状,甚至还可以应用于缓解其他类型的治疗引起的 CRS 。
序列表自由内容
序列表
<110> 上海优卡迪生物医药科技有限公司
<120>
人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
<130> HJPCT16-1218
<160> 66
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt
ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg
ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga
tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc
tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac
actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg
gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca
acttacttct gacaacgatc 420
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg
gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg
acgagcgtga caccacgatg 540
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg
gcgaactact tactctagct 600
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag
ttgcaggacc acttctgcgc 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg
gagccggtga gcgtgggtct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct
cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac
agatcgctga gataggtgcc 840
tcactgatta agcattggta a 861
<210> 2
<211> 674
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt
ttctgcgcgt aatctgctgc 60
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt
tgccggatca agagctacca 120
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga
taccaaatac tgtccttcta 180
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag
caccgcctac atacctcgct 240
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata
agtcgtgtct taccgggttg 300
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg
gctgaacggg gggttcgtgc 360
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga
gatacctaca gcgtgagcta 420
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca
ggtatccggt aagcggcagg 480
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa
acgcctggta tctttatagt 540
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt
tgtgatgctc gtcagggggg 600
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac
ggttcctggc cttttgctgg 660
ccttttgctc acat 674
<210> 3
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc
cccatggctg actaattttt 60
tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc
tattccagaa gtagtgagga 120
ggcttttttg gaggcctaga cttttgc 147
<210> 4
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta
acgatgagtt agcaacatgc 60
cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg
gaagtaaggt ggtacgatcg 120
tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt
ggacgaacca ctgaattgcc 180
gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac
aataaacg 228
<210> 5
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc
tggctaacta gggaacccac 60
tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt
agtgtgtgcc cgtctgttgt 120
gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc
agtgtggaaa atctctagca 180
<210> 6
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgctagagat tttccacact gactaaaagg gtctgaggga
tctctagtta ccagagtcac 60
acaacagacg ggcacacact acttgaagca ctcaaggcaa
gctttattga ggcttaagca 120
gtgggttccc tagttagcca gagagctccc aggctcagat
ctggtctaac cagagagacc 180
cagtacaagc aaaaagcaga tcttattttc gttgggagtg
aattagccct tcca 234
<210> 7
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag
atcgcgatgg gaaaaaattc 60
ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca
tatagtatgg gcaagcaggg 120
agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac
atcagaaggc tgtagacaaa 180
tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga
agaacttaga tcattatata 240
atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga
gataaaagac accaaggaag 300
ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac
caccgcacag caa 353
<210> 8
<211> 233
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc
actatgggcg cagcctcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata
gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc
acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag
gatcaacagc tcc 233
<210> 9
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac
tgctgtgcct tggaatgcta 60
gttggagtaa taaatctctg gaacagattg gaatcacacg
acctggatgg agtgggacag 120
agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt
gaagaatcgc aaaaccagca 180
agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg
gcaagtttgt ggaattggtt 240
taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata
atgatagtag gaggcttggt 300
aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat
agagttaggc agggatattc 360
accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga
cccgacaggc ccgaaggaat 420
agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt
cgattagtga acggatctcg 480
acggttaac 489
<210> 10
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg
gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt
acaaaaattc aaaatttta 119
<210> 11
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca
tgaagtaccg catggagggc 60
tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca
tcggctaccc cttcaagggc 120
aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct
tgcccttcgc cgaggacatc 180
ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg
agtaccccca ggacatcgtc 240
gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg
accgctcctt cctgttcgag 300
gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga
gcgtggagga gaactgcatg 360
taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg
acggccccgt gatgaagaag 420
atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc
ccgtgcccaa gcagggcatc 480
ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg
gtggccgctt gcgctgccag 540
ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga
tgcccgactg gcacttcatc 600
cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga
accagaagtg gcacctgacc 660
gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctga 696
<210> 12
<211> 575
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag
ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc
ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg
tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc
tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc
cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa
ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct
cacctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg
atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt
ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataat 575
<210> 13
<211> 592
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg
gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt
atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc
tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt
ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga
ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct
gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat
cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct
gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc
tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg
cctccccgcc tg 592
<210> 14
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccccttcacc gagggcctat ttcccatgat tccttcatat
ttgcatatac gatacaaggc 60
tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca
aagatattag tacaaaatac 120
gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt
ttaaaattat gttttaaaat 180
ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat
ttcttggctt tatatatctt 240
gtggaaagga cgaaac 256
<210> 15
<211> 1178
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac
agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg
cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg
agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc
cagaacacag gtaagtgccg 240
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg
cccttgcgtg ccttgaatta 300
cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct
tcgggttgga agtgggtggg 360
agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg
tgcttgagtt gaggcctggc 420
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct
tcgcgcctgt ctcgctgctt 480
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc
tgcgacgctt tttttctggc 540
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg
tatttcggtt tttggggccg 600
cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc
ggcgaggcgg ggcctgcgag 660
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg
ccggcctgct ctggtgcctg 720
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag
gctggcccgg tcggcaccag 780
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc
agggagctca aaatggagga 840
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca
aaggaaaagg gcctttccgt 900
cctcagccgt cgcttcatgt gactccactg agtaccgggc
gccgtccagg cacctcgatt 960
agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg
ggaggggttt tatgcgatgg 1020
agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc
agcttggcac ttgatgtaat 1080
tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt
cattctcaag cctcagacag 1140
tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga
1178
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct
tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 17
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct
ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa
attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat
tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca
ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc
ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac a 321
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct
45
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc
cctcacagag cctgtccgtc 60
acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg
taagctggat tcgccagcct 120
ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta
gtgaaaccac atactataat 180
tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact
ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact
actgtgccaa acattattac 300
tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa
cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 20
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca
ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg
cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta c 141
<210> 21
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc
tgtcactggt tatcaccctt 60
tactgc 66
<210> 22
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工系列
<400> 22
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac
catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag
aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 23
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca
agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg
ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc
ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga
ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca
gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 24
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga
acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac
gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
attcaaaatt ttatcgatgc tccggtgccc gtcagt 36
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcacgacacc tgaaatggaa ga 22
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggtgtcgtga ggatccgcca ccatggcctt accagtgacc gc
42
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gtgtcatctg gatgtccggc ctggcggcgt g 31
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cacgccgcca ggccggacat ccagatgaca cagactacat c
41
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tgtgatctcc agcttggtcc 20
<210> 31
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
caagctggag atcacaggtg gcggtggctc gggcggtggt
gggtcgggtg gcggcggatc 60
tgaggtgaaa ctgcaggagt ca 82
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tgaggagacg gtgactgagg t 21
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agtcaccgtc tcctcaacca cgacgccagc gcc 33
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtagatatca caggcgaagt cca 23
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggc 33
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tctttctgcc ccgtttgcag taaagggtga taaccagtg 39
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
aaacggggca gaaagaaact c 21
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
tgctgaactt cactctcagt tcacatcctc cttcttcttc
40
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
agagtgaagt tcagcaggag cg 22
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggagaggggc gtcgacttag cgagggggca gggc 34
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ccggttctcc gaacgtgtca cgtctcgaga cgtgacacgt
tcggagaatt tttg 54
<210> 42
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtc tcgagacgtg
acacgttcgg agaa 54
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ccgggtgaag ctgagttaat ttatgctcga gtaaattaac
tcagcttcac atttttttg 59
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
aattcaaaaa aatgtgaagc tgagttaatt tactcgagca
taaattaact cagcttcac 59
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ccgggcacag aacttatgtt gttctctcga gaacaacata
agttctgtgc ccttttttg 59
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aattcaaaaa agggcacaga acttatgttg ttctcgagag
aacaacataa gttctgtgc 59
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ccggctcaga ttgttgttgt taatgctcga gttaacaaca
acaatctgag gtttttttg 59
<210> 48
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aattcaaaaa aacctcagat tgttgttgtt aactcgagca
ttaacaacaa caatctgag 59
<210> 49
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ccgggcagct ttaaggagtt cctgcctcga gaggaactcc
ttaaagctgc gcttttttg 59
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
aattcaaaaa agcgcagctt taaggagttc ctctcgaggc
aggaactcct taaagctgc 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ccgggtgtag gcttacctca aataactcga gatttgaggt
aagcctacac ttttttttg 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
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aattcaaaaa aaagtgtagg cttacctcaa atctcgagtt
atttgaggta agcctacac 59
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ccggctcaaa taaatggcta acttactcga gagttagcca
tttatttgag gtttttttg 59
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<212> DNA
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aattcaaaaa aacctcaaat aaatggctaa ctctcgagta
agttagccat ttatttgag 59
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<212> DNA
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ccgggatgct tccaatctgg attcactcga gaatccagat
tggaagcatc cattttttg 59
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aattcaaaaa atggatgctt ccaatctgga ttctcgagtg
aatccagatt ggaagcatc 59
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ccggcttcca atctggattc aatgactcga gattgaatcc
agattggaag cattttttg 59
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attgaatcca gattggaag 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
atctgttctg gaggtact 18