WO2018052041A1 - 抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンｇ抗体 - Google Patents

抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンｇ抗体 Download PDF

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WO2018052041A1
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antibody
human igg
core fucosylated
core
human immunoglobulin
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PCT/JP2017/033126
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谷口　直之
建国 顧
小野　達也
真史 椎田
賢太郎 真木
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国立研究開発法人理化学研究所
協和メデックス株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-core fucosylated human immunoglobulin G antibody or an antibody fragment thereof, a hybridoma producing an anti-core fucosylated human immunoglobulin G monoclonal antibody, a method for producing an anti-core fucosylated human immunoglobulin G antibody, a core fucosylated human immunoglobulin G
  • the present invention relates to a measuring method, a core fucosylated human immunoglobulin G measuring reagent, a core fucosylated human immunoglobulin G purification method, and an insoluble carrier on which an anti-core fucosylated human immunoglobulin G antibody or the antibody fragment is immobilized.
  • Human immunoglobulin G (hereinafter referred to as IgG) is a glycoprotein that is secreted into the blood by mature B cells in the acquired immune mechanism.
  • Human IgG is a tetramer composed of two light chains (L chains) and two heavy chains (H chains), and there are four types of subclasses (IgG1, 2, 3, 4).
  • Asparagine (N) at the heavy chain 297 position contained in the Fc region also referred to as constant region
  • C H 2 domain and C H 3 domain the C-terminal domains of two heavy chains
  • N-linked sugar chain A sugar chain bound to the 297th asparagine (N) in the heavy chain contained in the Fc region of IgG is referred to as an N-linked sugar chain.
  • the N-linked sugar chain of the human IgG Fc region has a pentasaccharide structure consisting of two N-acetylglucosamines and three mannoses, to which N-acetylglucosamine, galactose, sialic acid, and fucose are added. It is a complex type biantennary sugar chain, and shows structural diversity depending on the presence / absence, number of additions, and position of addition of each monosaccharide (see Non-Patent Document 1).
  • the structure of the N-linked sugar chain present in the Fc region has an important influence on the function of IgG.
  • the N-linked sugar chain of the human IgG Fc region has an ⁇ 1-6 bond between the 6th position of N-acetylglucosamine (reducing terminal GlcNAc) directly bound to the 297th asparagine and the 1st position of fucose.
  • this fucose is called core fucose.
  • Fc ⁇ receptor III also known as CD16
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • Non-core fucosylated human IgG This phenomenon is used in the development of antibody drugs having ADCC activity as a medicinal mechanism, and various production methods for human IgG having no core fucose (hereinafter referred to as non-core fucosylated human IgG) have been reported. .
  • non-core fucosylated human IgG a method of using, as antibody-producing cells, cells in which all genes encoding ⁇ 1-6 fucosyltransferase (hereinafter referred to as Fut8), which is an enzyme involved in the addition of core fucose, are disrupted (see Non-Patent Document 5).
  • a method of disrupting a messenger RNA encoding Fut8 with a small interfering RNA (siRNA) (see Non-Patent Document 6), culturing antibody-producing cells in the presence of an inhibitor of a sugar chain-modifying enzyme ( ⁇ -mannosidase I), and as a result
  • ⁇ -mannosidase I a sugar chain-modifying enzyme
  • a method for obtaining non-core fucosylated human IgG see Non-Patent Document 7
  • an enzyme that promotes the addition of bisecting N-acetylglucosamine ⁇ 1-4N-acetylglucosaminyltransferase
  • a method for obtaining non-core fucosylated human IgG (non-specific References 8), and the like.
  • NAIT neonatal alloimmune thrombocytopenia
  • HDN hemolytic disease of the newborn
  • IgG core fucose that recognizes alloantigens is specifically and significantly reduced, and the degree of this core fucose reduction is the severity of the disease state. And is reported to be useful as an index for predicting the onset and severity of each disease (see Non-Patent Documents 11 and 12).
  • core fucosylated human IgG is measured by a method using a mass spectrometer or high performance liquid chromatography (HPLC) (see Patent Documents 1 and 2), or by using a lectin having affinity for core fucose. This is performed by the method used (see Patent Documents 3 and 4).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the specificity of lectin to core fucose is low, high-sensitivity measurement and efficient purification of core fucosylated human IgG are difficult.
  • An object of the present invention is to bind to a human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in an Fc region, but bind to a human IgG containing an N-linked sugar chain to which no core fucose is bound in an Fc region. It is not intended to provide an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment thereof.
  • the object of the present invention is to provide a hybridoma producing an anti-core fucosylated human IgG monoclonal antibody, a method for producing an anti-core fucosylated human IgG antibody, a method for measuring core fucosylated human IgG, a core fucosylated human IgG measurement reagent, a core fucosylated human IgG It is an object of the present invention to provide a purification method and an insoluble carrier on which an anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized.
  • the present inventors have bound N-linked sugar chains to which core fucose is bound to human IgG containing Fc region, but are not bound to core fucose.
  • the present invention was completed by successfully obtaining an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment that does not bind to human IgG containing a chain in the Fc region. That is, the present invention relates to the following [1] to [30].
  • N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing Fc region, and an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound is not bound to human IgG containing Fc region.
  • the antibody or antibody fragment thereof according to [1], wherein the N-linked sugar chain to which core fucose is bonded is an N-linked sugar chain in which fucose is ⁇ 1-6 bonded to a reducing terminal GlcNAc.
  • the antibody according to [1] or [2], wherein the N-linked sugar chain to which core fucose is bound is an N-linked sugar chain containing a sugar chain represented by the following general formula (I): The antibody fragment.
  • Human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region binds to at least one antigen selected from the group consisting of autoantigens, alloantigens, virus-derived antigens, and bacteria-derived antigens.
  • the antibody or the antibody fragment thereof according to [5] which is produced by a hybridoma deposited under accession number NITE BP-02342.
  • a method for producing an anti-core fucosylated human IgG antibody comprising the following steps.
  • a step of immunizing a non-human animal using human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region or an Fc region fragment thereof as an immunogen (2) A step of fusing the antibody-producing cells obtained from the non-human animal immunized in step (1) with myeloma cells to obtain a hybridoma; (3) culturing the hybridoma obtained in step (2); (4) From the culture obtained in step (3), an N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing Fc region, and an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound is bound to Fc.
  • step (4) The hybridoma selected in step (4) is cultured, and from the culture, N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing Fc region, and core fucose is not bound to N
  • step (4) The production method according to [9], wherein the non-human animal is a non-human animal deficient in a gene encoding ⁇ 1-6 fucosyltransferase.
  • N-linked sugar chain to which core fucose is bonded is an N-linked sugar chain in which fucose is ⁇ 1-6 bonded to a reducing end GlcNAc.
  • the N-linked sugar chain to which core fucose is bound is an N-linked sugar chain containing a sugar chain represented by the following general formula (I): Manufacturing method.
  • a method for measuring core fucosylated human IgG in a sample comprising using the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6].
  • the measurement method according to [13] comprising the following steps. (1) A sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6], and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment and the core fucosylated human IgG are reacted.
  • step (1) The immune complex produced in step (1) is reacted with an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, so that anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment, core fucosylated Generating an immune complex of an antibody that binds to human IgG and human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region; (3) A step of measuring the immune complex generated in step (2). [15] The measuring method according to [13], comprising the following steps.
  • a sample is reacted with an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region and a core fucosylated human IgG Generating an immune complex; (2) reacting the immune complex produced in the step (1) with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6], thereby producing an N-linked sugar chain Generating an antibody that binds to human IgG contained in the Fc region, a core fucosylated human IgG, and an anti-core fucosylated human IgG antibody or an immune complex of the antibody fragment; (3) A step of measuring the immune complex generated in step (2).
  • the measurement method according to [13], comprising the following steps.
  • the sample is a labeled competitive substance in which a label is bound to a core fucosylated human IgG competitor, and the anti-core fucosylated human according to any one of [1] to [6] immobilized on an insoluble carrier Reaction with an IgG antibody or the antibody fragment, and on the insoluble carrier, an anti-core fucosylated human IgG antibody or an immune complex of the antibody fragment and a labeled competitor, and an anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment Generating an immune complex with core fucosylated human IgG;
  • the measurement method according to [13], comprising the following steps. (1) A sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6] and a core fucosylated human IgG competitor immobilized on an insoluble carrier. Generating an immune complex between the competitor and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment on the insoluble carrier; (2) A step of measuring the immune complex formed on the insoluble carrier in step (1). [18] The measurement method according to [13], comprising the following steps.
  • a sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6], and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment and the core fucosylated human IgG are reacted.
  • the immune complex produced in step (1) is reacted with an antigen to which core fucosylated human IgG reacts to immunize anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment, core fucosylated human IgG, and antigen. Forming a complex; (3) A step of measuring the immune complex generated in step (2).
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts is at least one antigen selected from the group consisting of autoantigen, alloantigen, virus-derived antigen, and bacteria-derived antigen, [18] or [19] Measuring method.
  • a reagent for measuring a core fucosylated human IgG in a sample comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6].
  • the measurement reagent according to [21] further comprising an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • a label in which a label is bound to an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6] immobilized on an insoluble carrier, and a core fucosylated human IgG competitor A reagent for measuring a core fucosylated human IgG in a sample, characterized in that the reagent comprises a glycation competitor.
  • a core fucosylated human IgG competitor immobilized on an insoluble carrier, and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6] A reagent for measuring core fucosylated human IgG in a sample.
  • a method for purifying core fucosylated human IgG in a sample comprising using the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6].
  • the purification method according to [27] comprising the following steps.
  • a sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof according to any one of [1] to [6] to thereby react with the core fucosylated human IgG and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • N-linked sugar chains to which core fucose is bound are bound to human IgG containing Fc region, but N-linked sugar chains to which core fucose is not bound are bound to human IgG containing Fc region;
  • An anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment thereof is provided.
  • a hybridoma that produces an anti-core fucosylated human IgG monoclonal antibody, a method for producing an anti-core fucosylated human IgG antibody, a method for measuring core fucosylated human IgG, a core fucosylated human IgG measurement reagent, a method for purifying core fucosylated human IgG, and an anti An insoluble carrier on which the core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized is provided.
  • FIG. 1 schematically shows the structure of human IgG.
  • the structure of a vector for expressing a human IgG4Fc region-FLAG fusion protein (hereinafter referred to as hIgG4Fc-FLAG) in cultured mammalian cells is shown.
  • 2 shows SDS-polyacrylamide gel electrophoresis images of hIgG4Fc-FLAG in reduced and non-reduced states. The reactivity of each lectin and anti-FLAG antibody to hIgG4Fc-FLAG evaluated by antigen solid phase ELISA is shown.
  • CHO cell-derived indicates CHO cell-derived hIgG4Fc-FLAG
  • “Fut8KO CHO cell-derived” indicates Fut8KO CHO cell-derived hIgG4Fc-FLAG.
  • stock evaluated by the antigen solid-phase ELISA is shown.
  • “+” indicates core fucosylated hIgG4Fc-FLAG
  • “ ⁇ ” indicates non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG.
  • the reactivity of the monoclonal antibody secreted by the obtained hybridoma strain and evaluated by Biacore to hIgG4Fc-FLAG is shown.
  • the solid line shows the reactivity to core fucosylated hIgG4Fc-FLAG
  • the broken line shows the reactivity to non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG.
  • the “reaction between anti-human IgG antibody and hIgG4Fc-FLAG” in the lower right is the core fucosylated hIgG4Fc-FLAG and non-core fucosylated hIgG4Fc ⁇ of the anti-human IgG antibody immobilized on the sensor chip evaluated by Biacore.
  • the “reactivity between anti-human IgG antibody and each subclass human IgG” in the lower right shows the reactivity of the anti-human IgG antibody immobilized on the sensor chip to human IgG of each subclass, evaluated by Biacore.
  • Periodic acid-treated human IgG of each subclass of LCA lectin and anti-human IgG antibody evaluated by antigen solid phase ELISA (indicated as “+” in the figure), and humans of each subclass not treated with periodate
  • the reactivity with IgG is shown.
  • the three figures at the bottom show the reactivity of the anti-human IgG antibody immobilized on the sensor chip to human IgG of each subclass, as evaluated by Biacore.
  • 2 shows an MS spectrum of an N-linked sugar chain derived from human IgG purified with a column containing an insoluble carrier on which an anti-core fucosylated human IgG antibody is immobilized.
  • the spectrum of the MS spectrum of the N-linked sugar chain derived from human IgG before purification on a column containing an insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody column is immobilized is shown.
  • the standard curve of a core fucosylated human IgG measurement system is shown.
  • Anti-core fucosylated human IgG antibody The anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention binds to a human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region, and is not bound to core fucose. It is an antibody that does not bind to human IgG containing a conjugated sugar chain in the Fc region.
  • the core fucose in the present invention is N-acetylglucosamine directly bound to the asparagine among N-linked sugar chains bound to the 297th asparagine (N) of the two Fc regions of human IgG, that is, reduced This refers to fucose that is ⁇ 1--6 linked to the 6-position carbon of the terminal N-acetylglucosamine.
  • the sugar chain refers to a compound in which various monosaccharides are linked by glycosidic bonds.
  • monosaccharides include glucose, galactose, mannose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, fucose, xylose, sialic acid and the like.
  • a glycosidic bond refers to a bond between a monosaccharide hemiacetal and a hydroxyl group of another monosaccharide, such as a bond between two N-acetylglucosamines, a bond between two mannoses, mannose and N -A bond between acetylglucosamine, a bond between N-acetylglucosamine and fucose, and the like.
  • these binding modes include ⁇ 1-3 bond, ⁇ 1-6 bond, ⁇ 1-4 bond, and the like. Specific examples include a ⁇ 1-4 bond between two N-acetylglucosamines.
  • N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the present invention examples include N-linked sugar chains represented by the structures of formulas (I) to (VII) shown below.
  • the N-linked sugar chain to which core fucose is not bound in the present invention is an N-linked sugar chain in which a sugar chain is bound to the 297th asparagine (N) of the two Fc regions of human IgG, and directly to the asparagine.
  • N-acetylglucosamine bound that is, a sugar chain in which fucose is not bound to the reducing terminal N-acetylglucosamine, for example, N represented by the structures of formulas (VIII) to (XIV) shown below Examples include linked sugar chains.
  • the core fucosylated human IgG in the present invention is a human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region, and examples thereof include human IgG shown in FIG.
  • the antigen that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region is bound to an antigen that binds to human IgG that has an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region. If it is, there will be no restriction
  • self-antigens include intracellular nuclear antigens, alloantigens include major histocompatibility complex antigens (MHC antigens), and virus-derived antigens include hepatitis B virus HBs antigen, hepatitis C virus Core antigens and the like can be mentioned, and examples of bacteria-derived antigens include O antigen of the outer membrane of Gram-negative bacteria, pertussis toxin of Bordetella pertussis, and the like.
  • MHC antigens major histocompatibility complex antigens
  • virus-derived antigens include hepatitis B virus HBs antigen, hepatitis C virus Core antigens and the like can be mentioned, and examples of bacteria-derived antigens include O antigen of the outer membrane of Gram-negative bacteria, pertussis toxin of Bordetella pertussis, and the like.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferred.
  • the monoclonal antibody include a monoclonal antibody produced by a hybridoma, a recombinant monoclonal antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene, and the like.
  • the monoclonal antibody produced by the hybridoma include a monoclonal antibody produced by the hybridoma deposited under the accession number NITE BP-02342.
  • the hybridoma of the present invention is not particularly limited as long as it is a hybridoma that produces the anti-core fucosylated human IgG monoclonal antibody of the present invention, and examples thereof include a hybridoma deposited under accession number NITE BP-02342.
  • the hybridoma of the present invention can be produced by a known method, for example, a method described in "Monoclonal antibody” (Yodosha, 1996).
  • Examples of the fragment of the anti-core fucosylated human IgG antibody in the present invention include, for example, Fab obtained by papain treatment of the antibody, F (ab ′) 2 obtained by pepsin treatment of the antibody, and pepsin treatment of the antibody— Fab ′ obtained by the reduction treatment, a single chain antibody in which the variable region of the antibody light chain ( VL region) and the variable region of the antibody heavy chain (V H region) are artificially linked as one polypeptide ( scFv), a variable region (V HH region) fragment of an antibody heavy chain of a single-chain antibody that does not have an antibody light chain possessed by camelids and the like.
  • the method for producing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a method capable of producing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention, and examples thereof include a production method including the following steps.
  • [i] a step of immunizing a non-human animal using human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in an Fc region or an Fc region fragment thereof as an immunogen; [ii] a step of fusing antibody-producing cells obtained from the non-human animal immunized in step [i] with myeloma cells to obtain a hybridoma; [iii] culturing the hybridoma obtained in step [ii]; [iv] From the culture obtained in step [iii], an N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing the Fc region, and an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound is bound to Fc.
  • step [iv] The hybridoma selected in step [iv] is cultured, and N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing Fc region, and core fucose is not bound to N.
  • Step [i] is a step of immunizing a non-human animal using human IgG or an Fc region fragment thereof containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region as an immunogen.
  • the immunization method include a method of administering an antigen together with an appropriate adjuvant to the prepared immunogen, for example, subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in a non-human animal.
  • the immunogen is not particularly limited as long as it is an immunogen capable of producing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention in a non-human animal, and examples thereof include core fucosylated human IgG or core fucosylated human IgG Fc region fragment.
  • core fucosylated human IgG or a core fucosylated human IgG Fc region fragment bound with a carrier protein such as KLH (Keyhole-limpet-hemocyanin) or albumin may be used.
  • a carrier protein such as KLH (Keyhole-limpet-hemocyanin) or albumin
  • albumin include bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin.
  • the non-human animal is not particularly limited as long as it is a non-human animal that can produce the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention in vivo, and examples thereof include mouse, rat, hamster, rabbit, camel, alpaca and the like.
  • a Fut8 knockout mouse lacking a gene encoding ⁇ 1-6 fucosyltransferase (hereinafter referred to as Fut8), which is expected to generate an antibody against an epitope including core fucose (hereinafter referred to as Fut8KO mouse).
  • Fut8KO mouse a Fut8 knockout mouse lacking a gene encoding ⁇ 1-6 fucosyltransferase
  • Fut8KO mouse which is expected to generate an antibody against an epitope including core fucose
  • the adjuvant is not particularly limited as long as it is an adjuvant capable of producing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention in a non-human animal, and examples thereof include Freund's Complete Adjuvant (FCA), Freund's Incomplete Adjuvant (FIA), Ribi adjuvant and the like. Can be mentioned.
  • the immunogen preparation method is not particularly limited as long as it can prepare the anti-core fucosylated human IgG antibody or Fc region fragment thereof of the present invention.
  • a) core fucosylated human IgG or Fc thereof shown below (B) a method for preparing a core fucosylated human IgG from a human blood sample or the like, (c) a core fucosylated by treating the core fucosylated human IgG purified from a human blood sample or the like with a protease. Examples thereof include a method of obtaining an Fc region fragment of human IgG, and (d) a method of artificially synthesizing a core fucosylated human IgG or its Fc region fragment in a test tube.
  • a method for genetically engineering core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof Core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof is, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • a recombinant vector an expression vector into which cDNA encoding human IgG or an Fc region fragment thereof is inserted
  • the recombinant vector is introduced into a host cell. It can be produced by preparing a transformant and expressing the human IgG or an Fc region fragment thereof in the transformant. Specifically, the following steps (a-1) to (a-3) can be performed.
  • Recombinant vector for expressing human IgG or Fc region fragment thereof is cDNA encoding human IgG or Fc region fragment thereof The fragment can be prepared by inserting it downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • CDNA encoding human IgG or an Fc region fragment thereof can be obtained by the following method.
  • Total RNA is prepared from leukocytes isolated from human peripheral blood, mRNA is extracted from the total RNA, and then cDNA is synthesized from the mRNA.
  • cDNA is synthesized from the mRNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • primers designed to amplify cDNA encoding human IgG or its Fc region fragment primers designed to amplify cDNA encoding human IgG or its Fc region fragment, and cDNA encoding human IgG or its Fc region fragment is amplified.
  • the subclass of human IgG encoded by the cDNA fragment or Fc region fragment thereof may be any of IgG1 to IgG4.
  • RNA Preparation of mRNA from total RNA is performed by oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], or Oligo-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit ( It can be carried out using a kit such as Takara Bio. Alternatively, mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience).
  • kit such as Takara Bio.
  • mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience).
  • Synthesis of cDNA from mRNA can be performed using a kit such as PrimeScript (registered trademark) II 1st strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a transformant producing human IgG or its Fc region fragment is introduced by introducing the recombinant vector prepared in (a-1) into a host cell suitable for the expression vector.
  • the method for introducing the recombinant vector into the host cell is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the host cell. For example, electroporation [Cytotechnology, vol.3, p.133 (1990)] , Calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, p. 7413 (1987)] and the like.
  • Host cells for obtaining core fucosylated human IgG or its Fc region fragment include animal cells, yeast, insect cells, etc. that can express human IgG encoded by the introduced expression vector or its Fc region fragment, to which core fucose binds. Any N-linked sugar chain can be used as long as it has an ability to add.
  • the host cell also includes a host cell that has acquired the ability to add an N-linked sugar chain to which core fucose is bound by genetic modification.
  • Examples of animal cells include Namalwa cells, COS cells that are monkey cells, CHO cells that are Chinese hamster cells, and HBT5637 cells (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299).
  • Examples of the yeast include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwaniomyces, and the like. Specifically, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Swanniomyces alluvius and the like can be mentioned.
  • insect cells examples include Sf9 cells, Sf21 cells [Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WHFreeman and Company, New York (1992)] and Triplu cells, which are ovary cells of Spodopterafrugipeda. And High 5 (manufactured by Invitrogen).
  • an expression vector one that can autonomously replicate in a host cell to be used or can be integrated into a chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where cDNA encoding a human IgG or an Fc region fragment thereof can be transcribed. Used.
  • the expression vector in the case of using animal cells as a host is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing human IgG or an Fc region fragment thereof.
  • pcDNAI, pcDM8 commercially available from Funakoshi
  • pAGE107 3-22979 Cytotechnology, vol.3, p.133 (1990)
  • pAS3-3 Japanese Patent Laid-Open No.
  • the expression vector in the case of using yeast as a host is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing human IgG or its Fc region fragment, and examples thereof include YEP13 (ATCC37115), YCp50 (ATCC37419) and the like.
  • the expression vector when using insect cells as a host is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing human IgG or an Fc region fragment thereof, and examples thereof include pVL1392 and pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen).
  • the promoter in the expression vector for animal cells is not particularly limited as long as it can function in animal cells.
  • the promoter of cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene the initial of SV40 Examples include promoters, retrovirus promoters, metallothionein promoters, heat shock promoters, SR ⁇ promoters, Moloney murine leukemia virus promoters and enhancers.
  • an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • the promoter in the expression vector for yeast is not particularly limited as long as it can function in yeast.
  • a glycolytic gene promoter such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter
  • Examples include ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ 1 promoter and CUP 1 promoter.
  • the promoter in the expression vector for insect cells is not particularly limited as long as it can function in insect cells, and examples thereof include polyhedrin promoter and p10 promoter.
  • (A-3) Method for producing core fucosylated human IgG or its Fc region fragment from the transformant The transformant obtained in (a-2) is cultured in a medium, and the core fucosylated human IgG or its Fc is cultured in the culture. By producing a region fragment and collecting it from the culture, a core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof can be produced.
  • the culture is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and the presence of 5% CO 2 .
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host for example, RPMI 1640 medium [The Journal of Medicine, Medical American Association, vol. 199, p. 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, vol.122, p.501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, vol.8, p.396 (1959)], 199 medium [Proc.Soc.Exp.Biol.Med., vol.73, p .1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal calf serum (FCS) or the like to these media can be used.
  • the medium for culturing the transformant obtained using yeast as a host include YPD medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using insect cells as a host include Grace insect medium.
  • Methods for producing core fucosylated human IgG or its Fc region fragment using a transformant include a method for producing it in a host cell, a method for secreting it outside the host cell, and a method for producing it on the host cell membrane. By changing the host cell to be used, an appropriate method can be selected.
  • a method for producing it in a host cell includes, for example, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., Vol. 264, p. [Proc.Natl.Acad.Sci. USA, vol.86, p.8227 (1989); Genes Develop., Vol.4, p.1288 (1990)], etc.
  • the method of Paulson et al. J. Biol. Chem., Vol. 264, p.17619 (1989)]
  • the method of Rowe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
  • Examples of methods for secretion outside the host cell include, for example, JP-A-5-336963, International Publication No. Examples include the method described in 1994/23021.
  • the core fucosylated human IgG produced from the host cell or the Fc region fragment thereof can be prepared, for example, as follows.
  • the core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a manton Cells are disrupted with a Gaurin homogenizer, dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), and a positive using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Japan)
  • Electrophoresis methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Using these methods alone or in combination to obtain a refined product Kill.
  • the core fucosylated human IgG or its Fc region fragment When the core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cells are similarly collected, disrupted, and centrifuged to obtain a core fucosylated human IgG or its fragment as a precipitate fraction. Insoluble Fc region fragments are recovered. The recovered infusate of core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is returned to a normal three-dimensional structure, and then the core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is obtained by the same preparation method as described above. Can do.
  • a method for preparing core fucosylated human IgG from a human blood sample etc. for example, from serum obtained by centrifuging blood collected from a human
  • Examples thereof include a method for preparing core fucosylated human IgG using the usual protein isolation and purification method described in (a-3) above.
  • (C) A method for obtaining an Fc region fragment of a core fucosylated human IgG prepared by treating a core fucosylated human IgG prepared from a human blood sample or the like with a protease treatment.
  • a method for obtaining the Fc region fragment of human IgG for example, the core fucosylated human IgG prepared by the method described in (b) above is cleaved into a variable region and an Fc region with a protease, and then the above-mentioned (a-3) And a method for preparing the Fc region fragment using the usual protein isolation and purification method described in 1. above.
  • proteases include pepsin and papain.
  • the time for protease treatment of core fucosylated human IgG is not particularly limited as long as the Fc region fragment of core fucosylated human IgG can be obtained, and is usually 1 to 48 hours, and preferably 2 to 24 hours.
  • the temperature at which the core fucosylated human IgG is treated with the protease is not particularly limited as long as the Fc region fragment of the core fucosylated human IgG can be obtained, and is usually 0 to 50 ° C., preferably 5 to 45 ° C., 20 ⁇ 40 ° C. is particularly preferred.
  • Step [ii] is a step of producing a hybridoma by fusing the antibody-producing cells obtained from the non-human animal immunized in step [i] with myeloma cells.
  • the antibody-producing cell is not particularly limited as long as it is an antibody-producing cell capable of producing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention.
  • the antibody-producing cell is derived from the spleen, lymph node, or peripheral blood of a non-human animal immunized with an immunogen. Examples thereof include B cells obtained.
  • the myeloma cell is not particularly limited as long as it can produce the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention.
  • the cell fusion method is not particularly limited as long as it is a method capable of fusing antibody-producing cells and myeloma cells, and examples thereof include a method using polyethylene glycol (PEG) and an electric pulse method.
  • PEG polyethylene glycol
  • Step [iii] is a step of culturing the hybridoma prepared in step [ii].
  • a selective medium 10% (v / v) BM-condimed H1, 2% (v / V) GIT medium containing HAT supplement (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] and culturing in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • step [iv] N-linked sugar chains to which core fucose is bound are bound to human IgG containing Fc region, and N-linked sugar chains to which core fucose is not bound are bound to human IgG containing Fc region.
  • step [iv] only the hybridoma producing the anti-core fucosylated human IgG antibody is selected. Examples of the method of selecting only the hybridoma include the following methods.
  • the culture supernatant obtained by the hybridoma culture method described in Step [iii] is dispensed into each well of a microtiter plate on which solid or non-core fucosylated human IgG is immobilized, and reacted at 25 ° C. After washing each well with a washing solution [PBS buffer containing 0.05% (v / v) Tween 20], an anti-IgG antibody labeled with an enzyme or the like is dispensed and reacted.
  • immune complex A comprising core fucosylated human IgG, anti-core fucosylated human IgG antibody in the culture supernatant, and labeled anti-IgG antibody, or , A well formed by immune complex B consisting of non-core fucosylated human IgG, anti-non-core fucosylated human IgG antibody in the culture supernatant, and labeled anti-IgG antibody, and monoclonals contained in the culture supernatant It can be determined whether the antibody binds to core fucosylated human IgG or non-core fucosylated human IgG.
  • an N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to human IgG containing Fc region, and an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound is bound to human IgG containing Fc region. Only hybridomas producing core fucosylated human IgG antibodies can be selected.
  • the core fucosylated human IgG used for the selection of the hybridoma is a human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region.
  • the methods (a) to (d) in the aforementioned step (i) Etc. can be manufactured.
  • the non-core fucosylated human IgG used for selection of the hybridoma is a human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound in the Fc region.
  • (e) non-core fucosylated human IgG shown below is genetically engineered It can be produced by a method such as IgG production method (f) chemical synthesis method or the like.
  • Non-core fucosylated human IgG is prepared according to, for example, the method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). After preparing a recombinant vector for expressing non-core fucosylated human IgG or its Fc region fragment, a transformant in which the recombinant vector is introduced into a host cell is prepared, and non-core fucosylated human is introduced into the transformant. It can be produced by expressing IgG or an Fc region fragment thereof. Specifically, the following steps (e-1) to (e-3) can be performed.
  • Non-core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is produced by introducing the recombinant vector obtained in (e-1) into a host cell suitable for the expression vector.
  • a transformant can be obtained.
  • the method for introducing the recombinant vector into the host cell is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing the recombinant vector into the host cell, and examples thereof include the method described in the above (a-2).
  • the host cell is not particularly limited as long as it is a host cell capable of producing non-core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof.
  • the activity of an enzyme that binds core fucose to an N-linked sugar chain is reduced or eliminated.
  • Examples include animal cells and prokaryotic cells having no ability to add sugar chains.
  • Examples of the enzyme that binds core fucose to an N-linked sugar chain include Fut8.
  • Animal cells that have decreased or lacked the activity of an enzyme that binds core fucose to an N-linked sugar chain are not particularly limited as long as they are animal cells that have reduced or lacked the activity of an enzyme that binds core fucose to an N-linked sugar chain. Examples include Namalwa cells with reduced or deficient Fut8 activity, COS cells with reduced or deficient Fut8 activity, CHO cells with reduced or deficient Fut8 activity, HBT5637 cells with reduced or deficient Fut8 activity, and the like. .
  • prokaryotes having prokaryotic cells having no glycosylation ability include microorganisms belonging to the genus Escherichia and the like, and microorganisms belonging to the genus Escherichia and the like include, for example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1.
  • the expression vector can be autonomously replicated in the host cell to be used or can be integrated into a chromosome, and an appropriate promoter can be transcribed into a cDNA encoding human IgG or an Fc region fragment thereof. Can be used.
  • the expression vector in the case of using animal cells as a host is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing human IgG or an Fc region fragment thereof.
  • the expression vector described in (a-2) above is Can be mentioned.
  • the promoter in the expression vector when animal cells are used as a host is not particularly limited as long as it can function in animal cells, and examples thereof include the promoter described in (a-2) above. .
  • bases can be substituted so as to be optimal codons for expression in the host, Thereby, the production rate of the target human IgG or its Fc region fragment can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for gene expression in the recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • an expression vector when a prokaryotic cell having no ability to add a sugar chain is used as a host cell, an expression vector which can autonomously replicate in a prokaryote and contains a promoter and a ribosome binding sequence can be used.
  • the ribosome binding sequence include Shine-Dalgarno sequence.
  • the expression vector may further contain a gene that controls the promoter.
  • the expression vector in the case of using prokaryotic cells having no glycosylation ability as host cells is not particularly limited as long as it is an expression vector capable of expressing human IgG or an Fc region fragment thereof.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 any Roche
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Qiagen
  • pKYP10 Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600
  • PKYP200 Japanese Biological Chemistry, vol.
  • coli IGHA2 (FERM BP-400), JP-A-60-221091 ], PGKA2 [prepared from E. coli IGKA2 (FERM BP-6798), Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-221091], pTerm2 (US Pat. No. 4,686,191, US Pat. No. 4,939,094, US Pat. No. 5,160,735) ), PSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J.
  • the promoter in the expression vector when a prokaryotic cell having no glycosylation ability is used as a host cell is not particularly limited as long as it can function in the host cell to be used.
  • trp promoter Ptrp
  • Examples include promoters derived from Escherichia coli, phages, and the like, such as lac promoter, PL promoter, PR promoter, and T7 promoter.
  • artificially modified promoters such as a tandem promoter, tac promoter, lac T7 promoter, let I promoter, etc. in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Recombinant vector in which prokaryotic cells without glycosylation ability are used as host cells with the ribosome binding sequence Shine-Dalgarno sequence and the start codon adjusted to an appropriate distance (eg, 6-18 bases) Is preferably used.
  • bases can be substituted so as to be optimal codons for expression in the host.
  • the production rate of core fucosylated human IgG or Fc region fragment thereof can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for gene expression in the recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • (E-3) Method for producing non-core fucosylated human IgG or Fc region fragment thereof from the transformant
  • the transformant obtained in (e-2) is cultured in a medium, and the non-core fucosylated human IgG or Non-core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof can be produced by producing the Fc region fragment and collecting it from the culture.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host include the medium described in (a-3) above.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using a prokaryotic organism having no ability to add a sugar chain as a host include LB medium and the like.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • the prokaryote transformed with a recombinant vector using the lac promoter the prokaryote transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like with the recombinant vector using the trp promoter is used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • gene expression methods include secretory production, fusion protein expression, etc. according to methods described in Molecular Cloning, A Laboratory or Manual, Second Edition, Cold Harbor Laboratory Press (1989) be able to.
  • Non-core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof can be produced by a method of producing it in a host cell, a method of secreting it outside the host cell, or a method of producing it on the host cell membrane. By changing, an appropriate method can be selected.
  • non-core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof in a host cell for example, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., Vol. 264, p. 17619 (1989)], Roh et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 8227 (1989); Genes Development, vol. 4, p. 1288 (1990)], etc.
  • Examples of the method of production above include the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., Vol. 264, p. 17619 (1989)], the method of Roh et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
  • Examples of a method for producing non-core fucosylated human IgG or an Fc region fragment thereof using the transformant include the following methods.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer solution, an ultrasonic crusher, a French press, A cell-free extract is obtained by disrupting the cells with a Manton Gaurin homogenizer, dynomill or the like.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), and a positive using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by GE Healthcare Japan) Electrophoresis methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing Can be used alone or in combination to obtain a refined product. .
  • a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi
  • non-core fucosylated human IgG or its Fc region fragment When non-core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cells are similarly collected and then disrupted and centrifuged to give a non-core fucosylated human IgG as a precipitate fraction. Alternatively, the insoluble form of the Fc region fragment is recovered. The recovered insoluble form of non-core fucosylated human IgG or Fc region fragment thereof is solubilized with a protein denaturant.
  • the non-core fucosylated human IgG or its Fc region fragment is returned to a normal three-dimensional structure, and then the non-core fucosylated human IgG or its Fc region is isolated and purified in the same manner as described above. A purified sample of the fragment can be obtained.
  • (F) Chemical synthesis method of non-core fucosylated human IgG As a chemical synthesis method of non-core fucosylated human IgG, for example, a solid-phase peptide synthesis method using asparagine bound with an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound. [J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, vol. 3, p. 549 (1998)] etc., and human IgG bound to an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound or a peptide in its Fc region Examples include a method of linking a fragment and a peptide fragment of human IgG of the other part or its Fc region using a native chemical ligation method [Science, vol. 226, p. 5186 (1994)].
  • Step [v] is a step of collecting the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention.
  • the hybridoma selected by the method of the above-mentioned step [iv] is cultured by the method of the step [iii], and it binds to the antibody from the obtained culture supernatant. And a method of collecting the antibody using a molecule to be used.
  • the molecule that binds to the antibody in step [v] is not particularly limited as long as it is a molecule that can bind to the anti-core fucosylated human IgG antibody, and examples thereof include protein A, protein G, and an antibody that binds to the Fc region of human IgG. Can be mentioned.
  • the method for measuring core fucosylated human IgG of the present invention is a method for measuring core fucosylated human IgG using the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention. Specific embodiments of the measurement method of the present invention are shown below.
  • ⁇ Measurement method 1 A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) reacting a sample with the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof to produce an immune complex 1 of the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment and the core fucosylated human IgG; (2) An anti-core fucosylated human IgG antibody or an antibody fragment thereof, core fucosyl, by reacting the immune complex 1 produced in step (1) with an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • an immune complex 2 of an antibody that binds to human IgG and human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region (3) a step of measuring the immune complex 2 produced in step (2); (4) The above steps (1) to (3) are performed using a known concentration of core fucosylated human IgG instead of the sample, and a calibration curve representing the relationship between the core fucosylated human IgG concentration and the measured value of immune complex 2 is obtained. Creating process; (5) A step of determining the core fucosylated human IgG concentration in the sample from the calibration curve prepared in step (4) and the measured value of immune complex 2 measured in step (3).
  • Step (1) and step (2) may be performed sequentially or simultaneously.
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2). Further, a cleaning step may be inserted between step (2) and step (3).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may or may not be immobilized on an insoluble carrier, but is preferably immobilized.
  • An antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region may or may not be labeled with a labeling substance, but is preferably labeled.
  • the labeling substance of immune complex 2 may be measured in step (3).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment When the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized on an insoluble carrier, the anti-core fucosylated human IgG antibody or the insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized is produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment bound with one of a set of affinity substances (A) and an insoluble carrier bound with the other set of affinity substances (a) Is reacted in an antigen-antibody reaction reaction solution to produce an insoluble carrier in which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized in the antigen-antibody reaction reaction solution.
  • Aa affinity substances
  • combinations of Aa include the following combinations.
  • Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin; • Fc region of an anti-core fucosylated human IgG antibody-an antibody that binds to the Fc region.
  • ⁇ Measurement method 2 (sandwich method 2) A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) A sample is reacted with an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region and a core fucosylated human IgG Generating immune complex 3; (2) The immune complex 3 produced in step (1) is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment to bind to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • Step (1) and step (2) may be performed sequentially or simultaneously.
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2). Further, a cleaning step may be inserted between step (2) and step (3).
  • the antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region may or may not be immobilized on an insoluble carrier, but it must be immobilized. Is preferred.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may or may not be labeled with a labeling substance, but is preferably labeled. When a labeled anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is used, the labeling substance of the immune complex 4 may be measured in the step (3).
  • an insoluble carrier on which an antibody that binds to human IgG that contains an N-linked sugar chain in the Fc region is immobilized May be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • an antibody that binds to one of a pair of affinity substances (B) and binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region An antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is obtained by reacting an insoluble carrier to which the other (b) of the pair of affinity substances is bound in an antigen-antibody reaction solution.
  • An immobilized insoluble carrier can be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • Examples of the combination of BB include the following combinations. Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc .; Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin; Fc region of an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region—An antibody that binds to an Fc region of an antibody that binds to human IgG that contains an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • ⁇ Measurement method 3 (competitive method 1) A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) reacting a sample with a labeled competitor substance in which a label substance is bound to a competitor substance of core fucosylated human IgG, and the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention immobilized on an insoluble carrier or the antibody fragment thereof An anti-core fucosylated human IgG antibody or an antibody fragment thereof and a labeled competitor immune complex 5 and an anti-core fucosylated human IgG antibody or an antibody fragment thereof and a core fucosylated human IgG immune complex 6 on an insoluble carrier.
  • Producing (2) a step of measuring the labeling substance in the immunocomplex 5 of the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment and the labeled competitor produced on the insoluble carrier in the step (1); (3) Perform steps (1) to (2) using a known concentration of core fucosylated human IgG instead of the sample, and create a calibration curve representing the relationship between the core fucosylated human IgG concentration and the measured value of the labeling substance. Process; (4) A step of determining the core fucosylated human IgG concentration in the sample from the calibration curve prepared in the step (3) and the measured value of the labeling substance measured in the step (2).
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2).
  • step (1) after reacting the sample with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment immobilized on an insoluble carrier, the labeled competitor may be added to the reaction solution of the reaction. Good.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction. In this case, one of the pair of affinity substances (C) is bound.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment thereof is reacted with an insoluble carrier bound with the other (c) of a pair of affinity substances in the reaction solution of the antigen-antibody reaction, thereby anti-core fucosylated human IgG.
  • An insoluble carrier on which the antibody or the antibody fragment is immobilized can be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction. Examples of the combination of Cc include the following combinations.
  • Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin; • Fc region of anti-core fucosylated human IgG antibody-an antibody that binds to the Fc region of anti-core fucosylated human IgG antibody.
  • ⁇ Measurement method 4 (competitive method 2) A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) The sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof and a core fucosylated human IgG competitor immobilized on an insoluble carrier, and the competitor is immobilized on the insoluble carrier.
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may be labeled with a labeling substance.
  • the labeling substance of the immune complex 7 may be measured in the step (2).
  • step (1) the sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment, and then the core fucosylated human IgG competitor immobilized on the insoluble carrier is added to the reaction solution. It may be added.
  • the insoluble carrier on which the core fucosylated human IgG competitor is immobilized may be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction. In this case, the core fucosyl to which one of the pair of affinity substances (D) is bound.
  • the core fucosylated human IgG competitor is immobilized by reacting the immobilized human IgG competitor with the insoluble carrier to which the other pair of affinity substances (d) is bound in the antigen-antibody reaction solution.
  • the insoluble carrier thus produced can be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • Examples of the combination of Dd include the following combinations. Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin.
  • Measurement method 5 (Measurement method 1 of antigen-specific core fucosylated human IgG) A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) reacting a sample with an antigen to which core fucosylated human IgG reacts to produce an antigen and core fucosylated human IgG immune complex 8 in the sample; (2) The immune complex 8 produced in step (1) is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention to produce an antigen, core fucosylated human IgG, and anti-core fucosylated human IgG antibody.
  • Step (1) and step (2) may be performed sequentially or simultaneously.
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2). Further, a cleaning step may be inserted between step (2) and step (3).
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts may or may not be immobilized on an insoluble carrier, but is preferably immobilized.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may or may not be labeled with a labeling substance, but is preferably labeled.
  • the labeling substance of the immune complex 9 may be measured in the step (3).
  • the insoluble carrier on which the antigen that reacts with core fucosylated human IgG is immobilized may be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • the antigen reacting with the core fucosylated human IgG bound with one of the pair of affinity substances (E) and the insoluble carrier bound with the other pair of affinity substances (e) By reacting in the solution, an insoluble carrier on which the antigen to which core fucosylated human IgG reacts is immobilized can be produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • the combination of EE include the following combinations. Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin.
  • Measurement method 6 (Measurement method 2 of antigen-specific core fucosylated human IgG) A method for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the following steps. (1) The sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof to produce an immune complex 10 of the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment and the core fucosylated human IgG in the sample.
  • Step (1) and step (2) may be performed sequentially or simultaneously.
  • a cleaning step may be inserted between step (1) and step (2). Further, a cleaning step may be inserted between step (2) and step (3).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may or may not be immobilized on an insoluble carrier, but is preferably immobilized.
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts may be labeled with a labeling substance or not labeled, but is preferably labeled. When a labeled antigen that reacts with core fucosylated human IgG is used, the labeling substance of immune complex 11 may be measured in step (3).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment When the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized on an insoluble carrier, the anti-core fucosylated human IgG antibody or the insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized is produced in the reaction solution of the antigen-antibody reaction.
  • an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment bound with one of a pair of affinity substances (F) and an insoluble carrier bound with the other of the pair of affinity substances (f) Is reacted in an antigen-antibody reaction reaction solution to produce an insoluble carrier in which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized in the antigen-antibody reaction reaction solution.
  • the combination of Ff include the following combinations.
  • Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin; • Fc region of an anti-core fucosylated human IgG antibody-an antibody that binds to the Fc region.
  • the sample in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the present invention.
  • whole blood blood
  • blood cells serum, plasma, spinal fluid, urine, seminal plasma, amniotic fluid , Saliva, tissue, cultured cells, and serum and plasma are preferred.
  • the human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is not particularly limited as long as it is a human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • a human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region For example, an N-linked sugar to which core fucose is bound.
  • Human IgG containing a chain in the Fc region and human IgG containing an N-linked sugar chain not bound to core fucose in the Fc region are included.
  • the antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to any part of human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region an antibody that binds to human IgG that contains an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound in the Fc region
  • anti-human Examples include IgG antibodies and anti-N-linked sugar chain antibodies.
  • any competitor can be used as long as it enables the measurement method according to the competition method 1 or 2 of the present invention.
  • a substance having the same structure as that of the epitope recognized by the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention is preferable.
  • the binding strength to the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention is high.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody preferably has the same binding strength as human IgG containing an N-linked sugar chain to which the core fucose is bound in the Fc region.
  • human IgG itself containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region is exemplified.
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts is not particularly limited as long as it can bind to human IgG containing an N-linked sugar chain to which core fucose is bound in the Fc region, and examples thereof include the aforementioned antigens. It is done.
  • the measurement method of the present invention can be applied to both dry chemistry and reaction in solution.
  • the antigen-antibody reaction that is, the reaction temperature in steps (1) and (2) in measurement methods 1, 2, 5, and 6 and in step (1) in measurement methods 3 and 4 is
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the present invention, and is usually 0 to 50 ° C., preferably 4 to 40 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited as long as it allows the measurement method of the present invention, and is usually 1 minute to 72 hours, preferably 5 minutes to 20 hours.
  • the washing solution used in the washing step is not particularly limited as long as it is a washing solution that can remove the antigen-antibody reaction in the present invention.
  • phosphate buffered saline [containing 0.15 mol / L sodium chloride] 10 mmol / L phosphate buffer, pH 7.2 (hereinafter referred to as PBS)]
  • PBS containing a surfactant an aqueous medium described later, and the like.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as Tween20.
  • the insoluble carrier in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is an insoluble carrier that enables the measurement method of the present invention.
  • Preferred materials for the insoluble carrier include polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, polyethylene terephthalate, and other polymer materials, Examples thereof include glass, ceramics, magnetic particles and metals.
  • Preferable shapes of the insoluble carrier include tubes, beads, plates, fine particles such as latex, sticks, and the like, and a 96-well / sheet polystyrene microtiter plate is preferable.
  • Binding of the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof to an insoluble carrier, binding of an antibody binding to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region and an insoluble carrier, core fucosylated human IgG reacts
  • Examples of the binding between the antigen and the insoluble carrier and the binding between the core fucosylated human IgG competitor and the insoluble carrier include physical adsorption and chemical binding. Examples of physical adsorption include electrostatic bonding, hydrogen bonding, and hydrophobic bonding. Examples of chemical bonds include covalent bonds and coordinate bonds.
  • Anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, an antigen to which core fucosylated human IgG reacts, or a core fucosylated human IgG competitor may be used to immobilize directly on the insoluble carrier or indirectly on the insoluble carrier.
  • Anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, an antigen that reacts with core fucosylated human IgG, or a core fucosylated human IgG competitor
  • Examples of the method of directly immobilizing on an insoluble carrier include reaction of the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, and core fucosylated human IgG.
  • a core fucosylated human IgG competitor solution is added to the wells of a polystyrene microtiter plate, which is an insoluble carrier, and incubated at 4-30 ° C. for 1 hour to 1 day.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and the N-linked sugar chain are contained in the Fc region.
  • Antibodies that bind to human IgG, antigen core fucosylation human IgG is reacted, or a method or the like be immobilized by the competitor of core fucosylation human IgG is physically adsorbed to the wells.
  • Anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, an antigen that reacts with core fucosylated human IgG, or a core fucosylated human IgG competitor As an indirect immobilization method on an insoluble carrier, for example, the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody via specific binding of biotin and avidin (eg, avidin, streptavidin, neutravidin, etc.) Examples thereof include a method of immobilizing a fragment, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, an antigen that reacts with core fucosylated human IgG, or a competitive substance of core fucosylated human IgG on an insoluble carrier.
  • biotin and avidin eg, avidin, streptavidin, neutravidin, etc.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, an antigen that reacts with core fucosylated human IgG, or a competition of core fucosylated human IgG may be immobilized on an insoluble carrier by a covalent bond via a linker.
  • linker examples include a functional group on the surface of an insoluble carrier, the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, and core fucosylated human IgG.
  • the linker There is no particular limitation as long as it is a molecule capable of covalently binding both a reactive antigen or a functional group of a core fucosylated human IgG competitor.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, N bond A first reactive group capable of reacting with an antibody that binds to human IgG having a type sugar chain in the Fc region, an antigen that reacts with core fucosylated human IgG, or a functional group possessed by a competitor of core fucosylated human IgG , A molecule having a second reactive group simultaneously capable of reacting with a functional group on the surface of the insoluble carrier, the first reactive group and the second reactive group It is preferred reactive groups are different groups.
  • the functional group and the functional group retained on the surface of the insoluble carrier include carboxyl group, amino group, glycidyl group, sulfhydryl group, hydroxyl group, amide group, imino group, N-hydroxysuccinimide group (NHS group), maleimide Groups and the like.
  • Examples of the reactive group in the linker include allyl azide, carbodiimide, hydrazide, aldehyde, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, pentafluorophenyl (PFP) ester, psoralen, pyridyl disulfide, Examples include groups such as vinyl sulfone.
  • each immune complex (immune complex 2; immune complex 4; immune complex 9; immune complex) produced in step (2) in each measurement method
  • the method for measuring 11) is not particularly limited as long as it can measure each immune complex generated in step (2) in each measurement method.
  • a method using a crystal resonator, a method using an electrode examples thereof include a method for measuring aggregation.
  • the antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region in step (2) of measurement method 1 binds to human IgG that contains an N-linked sugar chain labeled with a labeling substance in the Fc region.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention in the step (2) of the measuring method 2 and the measuring method 5 is an anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody labeled with a labeling substance.
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts in step (2) of measurement method 6 is an antigen to which core fucosylated human IgG labeled with a labeling substance reacts
  • step (3) As a method for measuring the immune complex generated in step (2) in each measurement method, the labeling substance in each immune complex generated in step (2) in each measurement method is measured. That way, and the like.
  • the method for measuring immune complex 5 generated in step (1) is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring immune complex 5 generated in step (1). Examples thereof include a method using a crystal resonator, a method using an electrode, a method for measuring aggregation, and a method for measuring a labeling substance.
  • the method for measuring immune complex 7 generated in step (1) is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring immune complex 7 generated in step (1). Examples thereof include a method using a crystal resonator, a method using an electrode, and a method for measuring agglomeration. Further, when the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention in the step (1) is an anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment labeled with a labeling substance, the step in the step (2) Examples of the method of measuring the immune complex 7 generated in (1) include a method of measuring a labeling substance in the immune complex generated in step (1).
  • labeling substances include enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioisotopes, biotin, digoxigenin, polypeptides containing tag sequences, metal colloid particles, colored latex particles, and the like.
  • the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, galactosidase, glucuronidase, luciferase and the like.
  • the fluorescent substance include FITC (fluorescein isothiocyanate), RITC (rhodamine B-isothiocyanate) and the like.
  • fluorescent substances for example, quantum dot [Science, vol.281, p.2016-2018 (1998)], phycobiliproteins such as phycoerythrin, GFP (Green fluorescent Protein), RFP (Red fluorescent Protein), YFP ( Examples of the fluorescent protein include yellow fluorescent protein and BFP (blue fluorescent protein).
  • the luminescent substance include acridinium and its derivatives, ruthenium complex compounds, and lophine. Further, as the ruthenium complex compound, those shown in Clin. Chem., Vol. 37 (9), p.1534-1539 (1991), which emit light electrochemically together with an electron donor are preferable.
  • the radioisotope include 3 H, 14 C, 35 S, 32 P, 125 I, 131 I, and the like.
  • polypeptide containing the tag sequence examples include FLAG peptide (FLAG tag, Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys), polyhistidine (His tag, His His His His His His His), myc epitope peptide (myc tag, Glu Gln Lys Leu). Ile Ser Glu Glu Asp Leu), hemagglutinin epitope peptide (HA tag, Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) and the like.
  • the labeling of each substance of the antigen to which core fucosylated human IgG reacts with a labeling substance is a reaction that causes a covalent bond between the functional group of each substance and the functional group of the labeling substance through or without a linker. Can be done by.
  • Examples of the functional group include a carboxyl group, amino group, glycidyl group, sulfhydryl group, hydroxyl group, amide group, imino group, hydroxysuccinyl ester group, maleimide group, and isothiocyanate group. It is possible to cause a condensation reaction between these functional groups.
  • Examples of the bonding method without using a linker include a method using a carbodiimide compound such as EDC. In this case, it is also possible to use an active ester such as NHS or a derivative thereof.
  • the condensation reaction between the isothiocyanate group and the amino group is preferable because it does not require other reagents and proceeds only by mixing under neutral to weakly alkaline conditions.
  • Examples of the linker include those having in the molecule both a functional group that reacts with the functional group of each substance and a functional group that reacts with the functional group of the labeling substance.
  • a molecule having a first functional group capable of reacting with a group and a second functional group capable of reacting with a functional group of a labeling substance in the same molecule is preferred, and among these, the first functional group and Molecules in which the second functional group is a different group are particularly preferred.
  • a functional group of a linker the above-mentioned functional group is mentioned, for example.
  • the labeling substance is a polypeptide such as an enzyme, avidin, a fluorescent protein, a phycobiliprotein, or a polypeptide containing a tag sequence
  • a known genetic recombination technique [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring According to Harbor Laboratory Press (2001)]
  • an expression vector containing a DNA encoding a fusion protein of a labeling substance and an antibody is prepared, and the expression vector is introduced into an appropriate host and cultured.
  • the DNA encoding the fusion protein can be obtained by cloning the DNA encoding the antibody and the labeling substance by PCR or the like and ligating each DNA by a ligase reaction.
  • the generation is performed in the step (2) of the measuring methods 1, 2, 5, and
  • the measurement of the amount of the labeled substance An appropriate method can be selected depending on the situation.
  • the labeling substance is a coloring substance, that is, a substance that absorbs light of a certain wavelength, a spectrophotometer, a multiwell plate reader, or the like can be used.
  • the labeling substance is a fluorescent substance, a fluorometer, a fluorescent multiwell plate reader, or the like can be used.
  • the labeling substance is a luminescent substance
  • a luminescence photometer When the labeling substance is a luminescent substance, a luminescence photometer, a luminescent multiwell plate reader, or the like can be used.
  • the labeling substance is a radioisotope
  • the amount of radioisotope can be measured with a scintillation counter, a ⁇ -well counter or the like for the radioactivity.
  • measuring the amount of the labeling substance means measuring the enzyme activity.
  • the enzyme activity that is, the amount of the labeling substance can be measured.
  • the enzyme is a peroxidase
  • the peroxidase activity can be measured by, for example, an absorbance method, a fluorescence method, a luminescence method, or the like.
  • the peroxidase is reacted with a combination of hydrogen peroxide and an oxidative coloring chromogen as a substrate thereof, and the absorbance of the reaction solution is measured by a spectrophotometer, a multiwell plate reader, etc.
  • the method etc. which measure by are mentioned.
  • the oxidative coloring chromogen include a leuco chromogen and an oxidative coupling coloring chromogen.
  • a leuco chromogen is a substance that is converted into a pigment alone in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7- Bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • DA-64 4,4′-bis (dimethylamino) )
  • Diphenylamine bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA), and the like.
  • the oxidative coupling chromogen is a substance that forms a dye by oxidative coupling of two compounds in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aniline (Trinder reagent), a combination of a coupler and a phenol.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • anilines include N- (3-sulfopropyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy -3-Sulfopropyl) -3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methylaniline (TOPS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methylaniline, N , N-di (3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -3-methoxyaniline (
  • the peroxidase is reacted with a combination of hydrogen peroxide and a fluorescent substance as a substrate thereof, and the intensity of fluorescence generated by a fluorometer or a fluorescent multiwell plate reader is measured.
  • the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • the peroxidase is reacted with a combination of hydrogen peroxide and a luminescent substance as a substrate, and the intensity of luminescence generated by a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader is measured.
  • the luminescent substance include luminol compounds and lucigenin compounds.
  • alkaline phosphatase activity can be measured by, for example, a luminescence method.
  • a luminescence method examples include a method in which alkaline phosphatase and its substrate are reacted and the luminescence intensity of the produced luminescence is measured with a luminescence intensity meter, a luminescence multiwell plate reader, or the like.
  • alkaline phosphatase substrates examples include 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3′-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt (AMPPD), 2-chloro- 5- ⁇ 4-methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.1 3,7 ] decan] -4-yl ⁇ phenyl phosphate disodium Salt (CDP-Star®), 3- ⁇ 4-methoxyspiro [1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.1 3,7 ] decane ] -4-yl ⁇ phenyl phosphate disodium salt (CSPD®), 9-[(phenyloxy) (phosphoryloxy) methylidene] -10-methylacridan dinat And 9-[(4-chlorophen
  • ⁇ -D-galactosidase activity can be measured by, for example, an absorbance method (colorimetric method), a luminescence method, or a fluorescence method.
  • an absorbance method colorimetric method
  • ⁇ -D-galactosidase and its substrate are reacted, and the absorbance of the reaction solution is measured using a spectrophotometer, a multiwell plate reader, etc.
  • the method etc. which measure by are mentioned.
  • the substrate of ⁇ -D-galactosidase include o-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside.
  • a method of measuring ⁇ -D-galactosidase activity by a luminescence method for example, a method of reacting ⁇ -D-galactosidase and its substrate and measuring the luminescence intensity of the reaction solution with a luminescence intensity meter, a luminescence multiwell plate reader, or the like Etc.
  • the substrate of ⁇ -D-galactosidase include galacton-plus (Galacton-Plus, manufactured by Applied Biosystems) or an analogous compound thereof.
  • a method of measuring ⁇ -D-galactosidase activity by a fluorescence method for example, a method of reacting ⁇ -D-galactosidase and its substrate and measuring the fluorescence of the reaction solution with a fluorometer, a fluorescent multiwell plate reader or the like Etc.
  • the substrate of ⁇ -D-galactosidase include 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside.
  • the luciferase activity can be measured by, for example, a luminescence method.
  • the method for measuring luciferase activity by the luminescence method include a method of reacting luciferase with its substrate and measuring the luminescence intensity of the reaction solution with a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader.
  • the luciferase substrate include luciferin and coelenterazine.
  • a substance (substance B) that specifically binds to substance A is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a radioisotope.
  • a labeled substance B labeled with an element, an enzyme, or the like, and an immune complex containing the substance A generated in the detection step are reacted to generate an immune complex containing the substance A and the labeled substance B;
  • Examples of the substance B include an antibody against the substance A, avidin (when the substance A is biotin), streptavidin (when the substance A is biotin), biotin (when the substance A is avidin, streptavidin), and the like. It is done.
  • the antibody against the substance A may be an antibody fragment, and examples of the antibody fragment include the aforementioned Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′ and the like.
  • antigen-antibody reaction that is, steps (1) and (2) of measurement methods 1, 2, 5 and 6, and step (1) of measurement methods 3 and 4 are carried out in an aqueous medium. It may be done.
  • the detection step may be performed in an aqueous medium.
  • the aqueous medium used in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it is an aqueous medium that enables the measurement method of the present invention, and examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer solution. Is preferred.
  • the buffer used for preparing the buffer solution is not particularly limited as long as it has a buffering capacity, but has a pH of 1 to 11, for example, lactic acid buffer, citrate buffer, acetate buffer, succinate buffer, phthalic acid Buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, diethanolamine buffer, lysine buffer, barbitur buffer, imidazole buffer, malate buffer, oxalate buffer, glycine buffer, borate buffer, Examples include carbonate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good buffer, and the like.
  • good buffer examples include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer, and tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris).
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • Bis-Tris bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
  • Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • Buffer N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) buffer, piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer, 2- [N- (2-acetamido) Amino] ethanesulfonic acid (ACES) buffer, 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) buffer, 2- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] ethanesulfonic acid (BES) buffer Agent, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer, 2- ⁇ N- [tris (hydroxy Til) methyl] amino ⁇ ethanesulfonic acid (TES) buffer, N- (2-hydroxyethyl) -N ′-(2-sulfoethyl) piperazine (HEPES) buffer, 3- [N, N-bis (2- Hydroxyethyl) amino] -2-hydroxypropanesulfonic acid (DIPS
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L, and 0.01 to 0.00. 1 mol / L is particularly preferable.
  • metal ions, salts, saccharides, preservatives, proteins, protein stabilizers and the like can coexist.
  • the metal ion include magnesium ion, manganese ion, zinc ion and the like.
  • the salts include sodium chloride and potassium chloride.
  • the saccharide include mannitol and sorbitol.
  • preservatives include sodium azide, antibiotics (streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.), Bioace, Procrine 300, Proxel GXL, and the like.
  • Examples of the protein include bovine serum albumin (BSA), fetal bovine serum (FBS), casein, block ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like.
  • Examples of the protein stabilizer include peroxidase stabilization buffer (Peroxidase Stabilizing Buffer, manufactured by DakoCytomation).
  • the reagent for measuring core fucosylated human IgG of the present invention is a reagent used in the method for measuring core fucosylated human IgG of the present invention, and the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof It is a reagent characterized by containing. Specific embodiments of the measurement reagent of the present invention are shown below.
  • Measurement reagent 1 A reagent for measuring core fucosylated human IgG in a sample, comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • a reagent for measuring core fucosylated human IgG in a sample comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment immobilized on an insoluble carrier.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in the reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody.
  • the anti-core fucosylated human IgG to which one of a pair of affinity substances (G) is bound instead of the anti-core fucosylated human IgG antibody or the insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized is used as the measurement reagent of the present invention.
  • An IgG antibody or an antibody fragment thereof and an insoluble carrier to which the other pair of affinity substances (g) is bound are included.
  • Examples of the combination of one affinity substance, that is, the combination of G and g include the following combinations. Biotin-avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.); Avidins (avidin, neutravidin, streptavidin, etc.)-biotin; • Fc region of an anti-core fucosylated human IgG antibody-an antibody that binds to the Fc region.
  • Measurement reagent 3 A reagent for measuring a core fucosylated human IgG in a sample, comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • Measurement reagent 4 A core fucosylated human IgG in a sample comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof immobilized on an insoluble carrier and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region. Measuring reagent.
  • the antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the measurement reagent of the present invention has an anti-core fucosylated human IgG to which one of a pair of affinity substances (A) is bound instead of an anti-core fucosylated human IgG antibody or an insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized.
  • An IgG antibody or the antibody fragment and an insoluble carrier to which the other (a) of the pair of affinity substances is bound are included.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of A and a, for example, the above-mentioned combination of A and a can be mentioned.
  • a core fucosylated human IgG in a sample comprising an antibody that binds to a human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, immobilized on an insoluble carrier, and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention Measuring reagent.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is preferably labeled with a labeling substance.
  • An insoluble carrier on which an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is immobilized is a reaction between the sample and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • one pair of affinity substances (B) is used instead of an insoluble carrier on which an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is immobilized.
  • a bound antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region and an insoluble carrier bound to the other (b) of the pair of affinity substances are included.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of B and b, for example, the above-mentioned combination of B and b can be mentioned.
  • a core fucosylation in a sample comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof immobilized on an insoluble carrier, and a labeled competitor bound to the competitor of core fucosylated human IgG.
  • Reagent for measuring human IgG The insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the anti-core fucosylated human IgG to which one of a pair of affinity substances (C) is bound in place of the anti-core fucosylated human IgG antibody or the insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized is used as the measurement reagent of the present invention.
  • An IgG antibody or an antibody fragment thereof and an insoluble carrier bound with the other (c) of a pair of affinity substances are included.
  • Examples of the combination of a pair of affinity substances, that is, the combination of C and c include, for example, the above-described combination of C and c.
  • a core fucosylated human IgG measurement reagent in a sample comprising a core fucosylated human IgG competitor immobilized on an insoluble carrier and the anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment of the present invention.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may be labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the core fucosylated human IgG competitor is immobilized may be produced in the reaction solution of the reaction between the core fucosylated human IgG competitor and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the measurement reagent of the present invention uses a core fucosylated human IgG competitor bound with one of a pair of affinity substances (D) instead of the insoluble carrier on which the core fucosylated human IgG competitor is immobilized. And an insoluble carrier to which the other member (d) of the pair of affinity substances is bound.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of D and d, for example, the above-mentioned combination of D and d can be mentioned.
  • Measurement reagent 8 A reagent for measuring a core fucosylated human IgG in a sample, comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof and an antigen to which the core fucosylated human IgG reacts.
  • a reagent for measuring core fucosylated human IgG in a sample comprising an antigen immobilized on an insoluble carrier and reacting with core fucosylated human IgG, and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the antigen that reacts with core fucosylated human IgG is immobilized may be produced in the reaction solution of the reaction between the sample and the antigen that reacts with core fucosylated human IgG.
  • the measurement reagent of the present invention contains core fucosylated human IgG to which one of a pair of affinity substances (E) is bound instead of an insoluble carrier on which an antigen to which core fucosylated human IgG reacts is immobilized. It includes an antigen to react and an insoluble carrier to which the other (e) of the set of affinity substances is bound.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of E and e, for example, the above-mentioned combination of E and e can be mentioned.
  • a reagent for measuring a core fucosylated human IgG in a sample comprising the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof immobilized on an insoluble carrier and an antigen to which the core fucosylated human IgG reacts.
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the measurement reagent of the present invention has an anti-core fucosylated human IgG to which one of a pair of affinity substances (F) is bound instead of an anti-core fucosylated human IgG antibody or an insoluble carrier on which the antibody fragment is immobilized.
  • An IgG antibody or an antibody fragment thereof and an insoluble carrier to which the other (f) of a pair of affinity substances is bound are included.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of F and f, for example, the above-mentioned combination of F and f can be mentioned.
  • the measurement reagent of the present invention can take the form of a kit from the viewpoint of storage, transportation, distribution and the like.
  • the kit form include a two-reagent kit, a three-reagent kit, and the like. Specific embodiments of the measurement kit of the present invention are shown below.
  • Measurement kit 1 A kit comprising a first reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment of the present invention and a second reagent containing an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • a kit comprising a reagent.
  • the antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the measurement kit of the present invention includes an anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment to which one of a pair of affinity substances (A) is bound, and the other pair of affinity substances (a).
  • the bound insoluble carrier is preferably contained in different reagents, and for example, the embodiment of the measurement kit 3 can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of A and a, for example, the above-mentioned combination of A and a can be mentioned.
  • a kit comprising: a second reagent contained; and a third reagent containing an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of A and a, for example, the above-mentioned combination of A and a can be mentioned.
  • Measurement kit 4 A first reagent containing an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, immobilized on an insoluble carrier, and a second reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • a kit comprising a reagent.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is preferably labeled with a labeling substance.
  • an insoluble carrier on which an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in an Fc region is immobilized is a reaction solution for the reaction between a sample and an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region May be generated in.
  • the measurement kit of the present invention includes an antibody that binds to a human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, to which one of the pair of affinity substances (B) is bound, and a pair of affinity substances. It is preferable that the other insoluble carrier to which the other (b) is bound is contained in a separate reagent.
  • the embodiment of the measurement kit 5 can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of B and b, for example, the above-mentioned combination of B and b can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of B and b, for example, the above-mentioned combination of B and b can be mentioned.
  • a second reagent comprising an anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or an antibody fragment thereof immobilized on an insoluble carrier, and a labeled competitive substance in which a labeling substance is bound to a competitive substance of core fucosylated human IgG.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the measurement kit of the present invention has an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment to which one of a pair of affinity substances (C) is bound, and the other pair of affinity substances (c).
  • the bound insoluble carrier is preferably contained in different reagents, and for example, the embodiment of the measurement kit 7 can be mentioned.
  • Examples of the combination of a pair of affinity substances, that is, the combination of C and c include, for example, the above-described combination of C and c.
  • a kit comprising: a second reagent contained; and a third reagent comprising a labeled competitor substance in which a label substance is bound to a competitor of core fucosylated human IgG.
  • Examples of the combination of a pair of affinity substances, that is, the combination of C and c include, for example, the above-described combination of C and c.
  • a kit comprising a first reagent containing a core fucosylated human IgG competitor immobilized on an insoluble carrier, and a second reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may be labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the core fucosylated human IgG competitor is immobilized may be produced in the reaction solution of the reaction between the core fucosylated human IgG competitor and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the carrier is contained in different reagents, for example, the embodiment of the measurement kit 9 can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of D and d, for example, the above-mentioned combination of D and d can be mentioned.
  • a first reagent containing a core fucosylated human IgG competitor bound to one of the pair of affinity substances (D) and an insoluble carrier bound to the other of the pair of affinity substances (d) A kit comprising a second reagent and a third reagent containing an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of D and d, for example, the above-mentioned combination of D and d can be mentioned.
  • a kit comprising a first reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment of the present invention and a second reagent containing an antigen to which core fucosylated human IgG reacts.
  • a kit comprising a first reagent containing an antigen that reacts with core fucosylated human IgG immobilized on an insoluble carrier, and a second reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the antigen that reacts with core fucosylated human IgG is immobilized may be produced in the reaction solution of the reaction between the sample and the antigen that reacts with core fucosylated human IgG.
  • the measurement kit of the present invention binds the antigen reacting with core fucosylated human IgG bound to one of the pair of affinity substances (E) and the other pair of affinity substances (e).
  • the insoluble carrier thus prepared is preferably contained in a separate reagent, and for example, the embodiment of the measurement kit 12 can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of E and e, for example, the above-mentioned combination of E and e can be mentioned.
  • Measurement kit 12 A first reagent containing an antigen that reacts with core fucosylated human IgG bound to one of a pair of affinity substances (E) and an insoluble carrier bound to the other of the pair of affinity substances (e) And a third reagent containing an anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment thereof.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of E and e, for example, the above-mentioned combination of E and e can be mentioned.
  • a kit comprising a first reagent containing the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention immobilized on an insoluble carrier, and a second reagent containing an antigen that reacts with the core fucosylated human IgG.
  • the antigen to which core fucosylated human IgG reacts is preferably labeled with a labeling substance.
  • the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized may be produced in a reaction solution of the reaction between the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment to which one pair of affinity substances (F) is bound, and the other pair of affinity substances (f) are included.
  • the bound insoluble carrier is contained in different reagents, for example, the embodiment of the measurement kit 14 can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of F and f, for example, the above-mentioned combination of F and f can be mentioned.
  • a combination of a pair of affinity substances that is, a combination of F and f, for example, the above-mentioned combination of F and f can be mentioned.
  • Anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment antibody binding to human IgG containing N-linked sugar chain in Fc region, core fucosylated human IgG competitor, labeling substance, core fucosylation in measurement reagent and measurement kit of the present invention
  • Antigens to which human IgG reacts and insoluble carriers include, for example, the aforementioned anti-core fucosylated human IgG antibody or antibody fragment, an antibody that binds to human IgG containing an N-linked sugar chain in the Fc region, and a core fucosylated human IgG competitor , A labeling substance, an antigen with which core fucosylated human IgG reacts, and an insoluble carrier.
  • the measurement reagent and measurement kit of the present invention can contain an aqueous medium, metal ions, salts, saccharides, preservatives, proteins, protein stabilizers, and the like, if necessary.
  • aqueous medium, metal ion, salt, saccharide, preservative, protein, and protein stabilizer include the aforementioned aqueous medium, metal ion, salt, saccharide, preservative, protein, protein stabilizer, and the like.
  • the form of the measurement reagent and measurement kit of the present invention is not particularly limited as long as it enables the measurement method of the present invention, and may take the form of, for example, a solution form or a lyophilized form.
  • the method for purifying core fucosylated human IgG of the present invention is a purification method using the anti-core fucosylated human IgG antibody of the present invention or the antibody fragment thereof.
  • the method for purifying core fucosylated human IgG of the present invention is not particularly limited as long as the core fucosylated human IgG in the sample can be purified using the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention, and includes, for example, the following steps: Examples include purification methods.
  • the sample is reacted with the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment of the present invention to generate an immunocomplex of the core fucosylated human IgG in the sample and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment.
  • Process (2) releasing core fucosylated human IgG from the immune complex produced in step (1); (3) A step of recovering the core fucosylated human IgG released in the step (2).
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment may or may not be immobilized on an insoluble carrier, but is preferably immobilized on an insoluble carrier. That is, the insoluble carrier on which the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized is preferably used for the purification of the core fucosylated human IgG in the sample.
  • the insoluble carrier include the aforementioned insoluble carrier.
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized on an insoluble carrier
  • the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment is immobilized between step (1) and step (2).
  • a step of washing away substances other than the core fucosylated human IgG in the sample bound to the insoluble carrier with a washing solution may be included.
  • the washing liquid the core fucosylated human IgG and the anti-core fucosylated human IgG antibody or the antibody fragment immunocomplex produced on the insoluble carrier are stably retained, and the sample is not released from the insoluble carrier. If it is a washing
  • an eluent is used to release the core fucosylated human IgG from the immune complex generated in step (1).
  • the eluent is not particularly limited as long as it is a solution that releases core fucosylated human IgG from the immune complex without releasing the immune complex generated in step (1), and examples thereof include a glycine-hydrochloric acid solution. It is done.
  • step (3) free core fucosylated human IgG can be recovered to obtain purified core fucosylated human IgG.
  • Tris (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), EDTA (manufactured by Dojin Chemical Laboratory), potassium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disodium hydrogen phosphate (Kanto Chemical) ), Sodium dihydrogen phosphate (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), potassium dihydrogen phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Coomassie Brilliant Blue (Nacalai Tesque, Inc.) Manufactured), BSA (manufactured by Proliant), Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate; manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), TMB-ONE (main component: 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine; Chem.
  • reaction solution containing 1 ng of plasmid pBShC ⁇ 4 as a template [10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 0.001% gelatin, 200 ⁇ M dNTPs, 0.5 ⁇ M Primer1, 0.5 ⁇ M Primer 2 and 2 units of TaKaRa Ex Taq DNA polymerase are prepared, and a cycle of 94 ° C. for 2 minutes, 55 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes using GeneAmp PCR system 9700 (manufactured by Perkin Elmer). 30 cycles were performed.
  • the reaction mixture was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached instruction manual, then treated with restriction enzyme EcoT14I (Takara Bio) and separated by 0.8% agarose gel electrophoresis. Thereafter, the amplified fragment was recovered using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual.
  • Reaction conditions were 98 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 30 seconds in 25 cycles.
  • a PCR product of about 700 bp was introduced into a pCR-Blunt vector using Zero Blunt PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached instruction manual.
  • This plasmid was designated as pCRIgG4FcNotIBamHI.
  • the 5 ′ and 3 ′ ends of the recovered DNA fragments were ligated using DNA Ligation Kit (Takara Bio Inc.), and Escherichia coli DH5 ⁇ strain (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with the obtained recombinant plasmid DNA.
  • Recombinant plasmid DNA was isolated from the obtained multiple ampicillin resistant colonies using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), and the restriction enzyme NotI (Takara Bio Inc.) was removed from the antibody light chain expression unit. Manufactured) and KpnI (Takara Bio) digestion.
  • the plasmid was named pKANTEX XhoI / SalI.
  • the pKANTEX hIgG4Fc-FLAG was introduced into E. coli D by a known method (Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition published by Cold Spring Harbor Press, 1989). Escherichia coli DH5 ⁇ that has acquired ampicillin resistance is seeded in 100 mL of LB medium (Becton Dickinson Bioscience), cultured at 37 ° C. for 12 hours, and then the cells are collected and Qiafilter Plasmid Midi Kit (Qiagen) ) was used to purify the plasmid DNA. 30 ⁇ g of the plasmid DNA was reacted for 12 hours at 37 ° C. using the restriction enzyme BspEI (New England Biolabs) to linearize it.
  • BspEI New England Biolabs
  • Fut8KO Fut8 knockout CHO cell
  • the antigen expression vector prepared in (1) by the electroporation method that is, the linearized plasmid DNA pKANTEX hIgG4Fc-FLAG was introduced into the established Fut8KO CHO cell and its parent CHO cell. Gene transfer by electroporation was performed according to the following procedure.
  • This cell suspension was mixed with 10 mL of a basic medium, seeded in a 75 cm 2 adherent cell flask (manufactured by Greiner), and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After culturing for 3 days, G418 (manufactured by Sigma-Aldrich) was added to a final concentration of 0.5 mg / mL, and further cultured for 10 days. Ten days later, the cells were passaged to a flask for 182 cm 2 adherent cells (manufactured by Greiner), and the culture was continued until confluent. When the cells became confluent, the medium was changed to a serum-free medium for CHO cells Hyclone CDM4CHO (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the culture supernatant was collected after 1 week of culture.
  • G418 manufactured by Sigma-Aldrich
  • rProtein A GraviTrap column (manufactured by GE Healthcare Japan) was equilibrated with PBS buffer [10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4) containing 150 mmol / L sodium chloride], and then filtered culture supernatant was passed through a column, washed with PBS buffer, and hIgG4Fc-FLAG bound to rProtein A was eluted with 0.1 mol / L glycine-HCl solution (pH 2.7).
  • the solvent of the eluate containing hIgG4Fc-FLAG was replaced with a PBS buffer with a PD-10 column (GE Healthcare Japan), the absorbance at 280 nm was measured, and the molar absorbance derived from the amino acid sequence of hIgG4Fc-FLAG.
  • the hIgG4Fc-FLAG concentration was calculated using the coefficient.
  • About 5 mg of hIgG4Fc-FLAG was obtained from about 300 mL of the culture supernatant of CHO cells and Fut8KO CHO cells.
  • FIG. 3 shows the result of 2.5 ⁇ g of purified hIgG4Fc-FLAG subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie brilliant blue.
  • hIgG4Fc-FLAG In any cell-derived hIgG4Fc-FLAG, a band was observed at a molecular weight of about 30 kDa under reducing conditions. In addition, under non-reducing conditions, a band was observed at a position showing a molecular weight approximately twice that of the band observed under reducing conditions, indicating that hIgG4Fc-FLAG exists as a dimer.
  • Each hIgG4Fc-FLAG is prepared to 5 ⁇ g / mL with PBS buffer, and 50 ⁇ L / well of the hIgG4Fc-FLAG is dispensed into a 96-well EIA plate (manufactured by Nunk) and left at 25 ° C. for 12 hours.
  • Wells in which hIgG4Fc-FLAG derived from CHO cells was immobilized or wells in which hIgG4Fc-FLAG derived from Fut8KO CHO cells were immobilized were prepared. At this time, a well in which only 50 ⁇ L of PBS buffer solution was dispensed was prepared and used as a blank well.
  • blocking solution [1% (w / v) BSA, 0.05% (v / v) Tween 20, 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4) containing 150 mmol / L sodium chloride] in each well] was dispensed at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to block the plate. Thereafter, the blocking solution was discarded, and the plate was washed 3 times with 350 ⁇ L of a wash solution [0.05 mmol (v / v) Tween 20, 10 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4) containing 150 mmol / L sodium chloride].
  • Peroxidase-labeled lens bean lectin (hereinafter referred to as LCA lectin, manufactured by J-Oil Mills) diluted 5,000 times with a sample diluent [a solution obtained by diluting a blocking solution 10 times with a washing solution], or 5,000 times Diluted biotin-labeled herochawantake lectin (hereinafter referred to as AAL lectin, manufactured by J-Oil Mills) or peroxidase-labeled concanavalin A lectin diluted 2,000 times (hereinafter referred to as ConA lectin, hereinafter referred to as J-oil mills).
  • LCA lectin Peroxidase-labeled lens bean lectin
  • AAL lectin manufactured by J-Oil Mills
  • ConA lectin peroxidase-labeled concanavalin A lectin diluted 2,000 times
  • Peroxidase label diluted by 1,000 times) FLAG antibody (Sigma Aldrich) dispensed at 50 [mu] L / well, and allowed to stand for 1 hour at 25 ° C.. Only the wells into which the biotin-labeled AAL lectin was dispensed were washed three times with 350 ⁇ L of the washing solution, and then peroxidase-labeled streptavidin (manufactured by Thermo Fisher Scientific) 50 ⁇ L / well diluted 10,000 times with the sample diluent. The aliquot was dispensed and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour.
  • the LCA lectin and AAL lectin used in this experiment have a property of binding to an N-linked sugar chain to which core fucose is bound, and ConA lectin has a property of binding to an N-linked sugar chain regardless of the presence or absence of core fucose.
  • ConA lectin reacted with any hIgG4Fc-FLAG
  • LCA lectin and AAL lectin reacted only with hIgG4Fc-FLAG derived from CHO cells. Therefore, N-linked sugar chains were present in any hIgG4Fc-FLAG.
  • hIgG4Fc-FLAG derived from CHO cells has an N-linked sugar chain to which core fucose is bound
  • hIgG4Fc-FLAG derived from Fut8KO CHO cells has an N-linked sugar chain to which core fucose is not bound. did.
  • hIgG4Fc-FLAG derived from CHO cells is referred to as core fucosylated hIgG4Fc-FLAG
  • hIgG4Fc-FLAG derived from Fut8KO CHO cells is referred to as non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG.
  • Example 1 Production of anti-core fucosylated human IgG antibody (1) Immunization to animals and preparation of antibody producing cells Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 102, p.15791 (2005) Thus, a Fut8KO mouse in which all the genes encoding Fut8 on the genome were disrupted was produced, and this Fut8KO mouse was used as an animal to be immunized. 50 ⁇ g of core fucosylated hIgG4Fc-FLAG prepared in Reference Example 1 was produced together with 2 mg of aluminum gel (Cosmo Bio) and pertussis vaccine (Chiba Serum Research Laboratories) 1 ⁇ 10 9 cells.
  • Aluminum gel Cosmo Bio
  • pertussis vaccine Chiba Serum Research Laboratories
  • hIgG4Fc-FLAG 50 ⁇ g of core fucosylated hIgG4Fc-FLAG was administered once (4 doses in total).
  • the spleen was removed 3 days after the final immunization from the mice after immunization.
  • the spleen is shredded in RPMI medium (Gibco), loosened with tweezers, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes at 25 ° C., the supernatant is discarded, and the erythrocyte lysis buffer (Sigma Aldrich) is used for 1-2. Red blood cells were removed by treatment for minutes, and spleen cells were obtained by washing 3 times with RPMI medium and used for cell fusion.
  • mice myeloma cells An 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line P3-U1 is prepared as mouse myeloma cells, and 2 ⁇ 10 7 or more cells are used using GIT medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Cultured until cells were obtained.
  • GIT medium manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the cell solution was centrifuged at 900 rpm for 5 minutes at 25 ° C., then the supernatant was discarded, and the cells were warmed to 37 ° C. [10% (v / v) BM-condimed H1 (Roche), 2 GIT medium (Wako Pure Chemical Industries) containing 100% (v / v) HAT supplement (50 ⁇ , manufactured by Gibco)] was gently suspended. This suspension was dispensed at 100 ⁇ L / well into a 96-well culture plate and cultured at 37 ° C. for 10-14 days in a 5% CO 2 incubator.
  • the core fucosylated hIgG4Fc-FLAG and non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG obtained in Reference Example 1 were each prepared to 5 ⁇ g / mL with the PBS buffer described in Reference Example 1 (3) and used for 96-well EIA The plate was dispensed at 50 ⁇ L / well. The plate was allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours to prepare wells in which the core fucosylated hIgG4Fc-FLAG was immobilized and wells in which the non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG was immobilized.
  • a well in which only 50 ⁇ L of PBS buffer solution was dispensed was prepared and used as a blank well.
  • the blocking solution described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to block the plate.
  • the hybridoma culture supernatant diluted 100-fold with the sample diluent described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour.
  • the diluted hybridoma culture supernatant was removed, washed 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution described in Reference Example 1 (4), and then peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Thermo Fisher Scientific) diluted 10,000 times with the sample diluent.
  • Thermo Fisher Scientific peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody
  • TMB-ONE was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes.
  • the absorbance of the reaction solution was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 650 nm using a plate reader.
  • Hybridoma strains that strongly developed color in wells coated with core fucosylated hIgG4Fc-FLAG and weak or did not develop color in wells coated with non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG were selected, and cloning was repeated twice by limiting dilution.
  • Hybridoma strain 18-3D11 was received on August 30, 2016 from the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganisms Deposit Center (2-5-8, Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) with the receipt number NITE AP- It was deposited as 02342 and was deposited as deposit number NITE BP-02342 as of August 4, 2017. FIG.
  • FIG. 5 shows the reactivity of each hybridoma strain culture supernatant to core fucosylated hIgG4Fc-FLAG and non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG immobilized on the plate.
  • the graph of “anti-FLAG antibody” shown in FIG. 5 is a graph showing the results of using peroxidase-labeled anti-FLAG antibody instead of hybridoma strain supernatant and peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody.
  • Core fucosylated hIgG4Fc -FLAG, non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG is shown to be immobilized on the same amount of plate.
  • Example 2 Reactivity analysis of anti-core fucosylated human IgG antibody (1) Analysis of reactivity to hIgG4Fc-FLAG by Biacore Generally, proteins are denatured by solid phase on a plate and have a special three-dimensional structure. Known to. Therefore, an antibody that reacts with the antigen solid-phased on the plate but does not react with the antigen in a non-solid-phase state (that is, the antigen present in the solution without being immobilized on the plate) is obtained. Often occurs.
  • the antibody produced by the hybridoma strain obtained in Example 1 also reacts with non-solid-phase core fucosylated hIgG4Fc-FLAG, or in addition, non-solid-phase core fucosylated hIgG4Fc-FLAG and non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG.
  • SPR method surface plasmon resonance
  • the Anti-human IgG (Fc) antibody enclosed in the Human Antibody Capture Kit (GE Healthcare Japan) is fixed to the CM5 sensor chip (GE Healthcare Japan) by the amine coupling method according to the attached protocol.
  • the core fucosylated hIgG4Fc-FLAG or non-core fucosylated hIgG4Fc-FLAG obtained in Reference Example 1 was captured by immobilized anti-human IgG (Fc) antibody, and then the culture supernatant of the hybridoma strain was allowed to flow on the sensor chip.
  • the reactivity against each hIgG4Fc-FLAG captured on the sensor chip was evaluated. The results are shown in FIG.
  • the natural core fucosylated antigen was prepared to 5 ⁇ g / mL with the PBS buffer described in Reference Example 1 (3), and a well in which each antigen was immobilized was prepared in the same manner as in Reference Example 1.
  • the culture supernatant of the hybridoma strain diluted 100-fold with the sample diluent described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour.
  • the diluted hybridoma culture supernatant was removed, washed 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution described in Reference Example 1 (4), and then peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 10,000 times with the sample dilution solution was added at 50 ⁇ L / well. It dispensed and left still at 25 degreeC for 1 hour. After removing the labeled antibody dilution and washing 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution, TMB-ONE was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes.
  • the reactivity to human antibody class (isotype) and rabbit IgG was evaluated by antigen solid phase ELISA.
  • the PBS buffer described in Reference Example 1 (3) is human IgG (manufactured by Alternative Research), human immunoglobulin A (manufactured by Lee Biosolutions), human immunoglobulin M (manufactured by Immunoregent), and rabbit IgG (manufactured by Dako).
  • the solution was adjusted to 5 ⁇ g / mL.
  • Each antigen solution was dispensed into a 96-well EIA plate at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours to immobilize the antigen on the plate.
  • the antigen solution was removed, and then the blocking solution described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to block the plate. After removing the blocking solution, 50 ⁇ L / well of the culture supernatant of hybridoma strains 18-2D3, 18-3D11, and 18-12F7 diluted 10-fold with the sample diluent described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 25 ° C. And left for 1 hour.
  • the diluted hybridoma culture supernatant was removed, washed 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution described in Reference Example 1 (4), and then peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 10,000-fold with the sample diluent was added at 50 ⁇ L / well. Poured and left at 25 ° C. for 1 hour. After removing the labeled antibody dilution and washing 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution, TMB-ONE was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes.
  • the culture supernatants of the hybridoma strains 18-2D3, 18-3D11, and 18-12F7 were run on the sensor chip, and the reactivity to each human IgG subclass was evaluated.
  • the results are shown in FIG.
  • Antibodies from any hybridoma strain were found to bind to all human IgG subclasses.
  • the graph of “Reaction between anti-human IgG antibody and each subclass human IgG” shown in FIG. 9 shows the amount of each human IgG subclass antigen captured by the antibody against the Fc region of human IgG immobilized on the sensor chip. Show.
  • Each subclass of human IgG treated with sodium periodate was diluted to 5 ⁇ g / mL with PBS buffer, dispensed into a 96-well EIA plate at 50 ⁇ L / well, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours to plate the antigen. To solid phase. The antigen solution was removed, and then the blocking solution described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to block the plate.
  • the diluted labeled lectin and the antibody solution were removed, and after washing 3 times with 350 ⁇ L of the washing solution described in Reference Example 1 (4), TMB-ONE was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes.
  • Human IgG1, human IgG3, and human IgG4 treated with or without sodium periodate were captured by a mouse anti-human IgG (Fc) monoclonal antibody immobilized on a sensor chip, and then hybridoma strain 18-2D3, The culture supernatants of 18-3D11 and 18-12F7 were flowed on the sensor chip, and the reactivity to each human IgG subclass antigen treated or not treated with sodium periodate was evaluated. The results are shown in FIG. In any hybridoma strain-derived antibody, the reactivity to human IgG modified with core fucose was almost lost or greatly attenuated. The graph of “reaction between anti-human IgG antibody and each subclass human IgG” shown at the bottom of FIG.
  • Example 11 shows the periodate captured by the antibody against the Fc region of human IgG immobilized on the sensor chip.
  • the amount of human IgG of each subclass that has been treated with sodium and the amount of human IgG of each subclass that has not been treated with sodium periodate is shown. This confirmed that the monoclonal antibody produced by the hybridoma strain obtained in Example 1 was an antibody that reacts with human IgG in a core fucose-dependent manner.
  • Example 3 Purification of core fucosylated human IgG (1) Purification of anti-core fucosylated human IgG antibody Among the hybridoma strains obtained in Example 1, 18-3D11 strain was 520 mL of serum-free medium for hybridoma Hyclone SFM4MAb-Utility ( The culture supernatant was recovered. After centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes at 25 ° C. and collecting the supernatant, the supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m pore size cellulose acetate membrane and sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was prepared to a final concentration of 3 mol / L.
  • the solvent of the eluate containing the 18-3D11 antibody was replaced with a PBS buffer solution, and then the 18-3D11 antibody solution replaced with the PBS buffer solution
  • the absorbance at 280 nm was measured with an absorptiometer (U-3000, manufactured by Hitachi, Ltd.), and the 18-3D11 antibody concentration was calculated as a molar extinction coefficient of 1.4 to obtain about 2.5 mg of 18-3D11 antibody. .
  • Example 4 Sugar chain structure analysis of core fucosylated human IgG (1) Separation of N-linked sugar chain from core fucosylated human IgG The solvent of core fucosylated human IgG purified in Example 3 was used using a PD-10 column. After replacing with the PBS buffer described in Reference Example 1 (3), the solution was concentrated by ultrafiltration to prepare a 2.1 mg / mL core fucosylated human IgG solution. To 50 ⁇ L of this core fucosylated human IgG sample, 5 ⁇ L of 1 mol / L aqueous ammonium bicarbonate solution and 5 ⁇ L of 120 mmol / L DTT aqueous solution were added and stirred well, and then incubated at 60 ° C.
  • N-glycosidase F that cleaves the reducing end of the N-linked sugar chain was added at 37 ° C., 12
  • the N-linked sugar chain was released from the peptide by reacting for a period of time.
  • MTT / DMSO solution [74.6 mg of MTT dissolved in 1 mL of DMSO] was added, and the tube was opened, incubated at 60 ° C. for 1 hour, and sialic acid present in the N-linked sugar chain. was protected by methyl esterification. After centrifuging for several seconds in a tabletop centrifuge to discharge the MTT / dimethylsulfoxide solution, the polymer beads were washed twice with 200 ⁇ L of methanol and twice with 200 ⁇ L of pure water.
  • the cleanup column attached to the kit is once with 200 ⁇ L of pure water and 200 ⁇ L of acetonitrile. After washing twice, a total amount of a sample obtained by adding 950 ⁇ L of acetonitrile to 50 ⁇ L of the collected labeled N-linked sugar chain solution was added and allowed to pass through a cleanup column by natural dropping for 10 minutes. After centrifuging for several seconds in a tabletop centrifuge to pass the remaining solution, the cleanup column was washed twice with 300 ⁇ L of acetonitrile.
  • Centrifugation was performed for several seconds using a tabletop centrifuge, and acetonitrile was completely removed from the cleanup column. Then, 50 ⁇ L of pure water was added, and the mixture was further centrifuged for several seconds to recover the labeled N-linked sugar chain solution.
  • MALDI-TOF MS analysis 300 mg of acetonitrile and 700 ⁇ L of pure water were added to 10 mg of MALDI matrix grade 2,5-dihydroxybenzoic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and dissolved to prepare a matrix solution. 1 ⁇ L of the labeled N-linked sugar chain solution recovered in (4) was mixed with 1 ⁇ L of this matrix solution. 1 ⁇ L of this mixed solution was spotted on a MALDI target plate, allowed to stand and dried, and then subjected to MALDI-TOF MS analysis using MALDI-TOF MS Autoflex III smartbeam (manufactured by Bruker Daltonics). The obtained MS spectrum is shown in FIG.
  • Table 2 shows the sugar chain structure estimated for each mass peak using the sugar chain structure estimation software GlycoMod Tool [Proteomics, vol.1, p.340 (2001)].
  • FIG. 13 shows an MS spectrum obtained from human IgG (manufactured by Alternative Research) before purification with the anti-core fucosylated IgG antibody (18-3D11) obtained in Example 1, which was analyzed in the same manner as a comparison target.
  • Table 3 shows the estimated N-linked sugar chain structure.
  • the mass-to-charge ratio (m / z) represents the actually measured ion mass for each peak
  • “dmass” represents the difference between the theoretical ion mass of the estimated N-linked sugar chain structure and the actually measured ion mass.
  • GlcNAc is N-acetylglucosamine
  • Man is mannose
  • NeuroAc is N-acetylneuraminic acid
  • Deoxyhexose is fucose
  • HexNAc is N-acetylglucosamine or N-acetylene.
  • Acetylgalactosamine refers to mannose or galactose.
  • human IgG obtained by purification using an anti-core fucosylated IgG antibody (18-3D11) is almost 100% core fucosylated human IgG, and is suitable as a standard substance for a core fucosylated human IgG measurement system. found.
  • Example 5 Construction of measurement system for core fucosylated human IgG (1) Preparation of anti-human IgG polyclonal antibody-immobilized plate 5 ⁇ g / mL in 96 well EIA plate with PBS buffer described in Reference Example 1 (3) An anti-human IgG polyclonal antibody (manufactured by Thermo Fisher Scientific) diluted 50 ⁇ L / well was dispensed and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours to immobilize the antibody on a plate. After removing the antibody solution, the blocking solution described in Reference Example 1 (4) was dispensed at 200 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to block the plate. After removing the blocking solution, it was used to measure core fucosylated human IgG.
  • Example 3 (2) Preparation of peroxidase-labeled anti-core fucosylated human IgG antibody 200 ⁇ g of 18-3D11 antibody purified in Example 3 (1) was used with Peroxidase Labeling Kit-NH 2 (manufactured by Dojindo Laboratories). Labeled with peroxidase according to the attached manual. The peroxidase-labeled 18-3D11 antibody was suspended in a storage buffer attached to the kit, and this was used as a peroxidase-labeled anti-core fucosylated human IgG antibody solution.
  • Example 3 (3) Preparation of standard substance
  • the core fucosylated human IgG purified in Example 3 (3) was diluted with the sample diluent described in Reference Example 1 (4) by 725.5 ng / mL, 362.8 ng / mL, 181.4 ng / It adjusted to each density
  • This 2-fold dilution series was used as a standard substance for obtaining a standard curve, and used for measurement of core fucosylated human IgG.
  • the anti-human IgG polyclonal antibody-immobilized plate prepared in (1) above was prepared using the standard substance prepared in (3) above or the sample diluent described in Reference Example 1 (4).
  • Human serum samples diluted to 100,000 times or 200,000 times were dispensed at 50 ⁇ L / well. After standing at 25 ° C. for 1 hour, the sample was removed, and the wells were washed 3 times with 350 ⁇ L of the cleaning solution described in Reference Example 1 (4).
  • the peroxidase-labeled anti-core fucosylated human IgG antibody solution prepared in (2) was diluted 10,000 times with a sample diluent, and this solution was dispensed at 50 ⁇ L / well.
  • the labeled antibody solution was removed, and the wells were washed 3 times with 350 ⁇ L of washing solution.
  • TMB-ONE was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 25 ° C. for 20 minutes.
  • As a stop solution 0.5 mol / L sulfuric acid was added at 50 ⁇ L / well, and the absorbance of each well was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 650 nm using a plate reader.
  • the obtained standard curve is shown in FIG.
  • the core fucosylated human IgG concentration in the human serum sample was calculated by converting the obtained absorbance with a standard curve and correcting the dilution rate with the sample diluent.
  • Example 6 Performance evaluation of core fucosylated human IgG measurement system (1) Dilution linearity test The dilution linearity test of the core fucosylated human IgG measurement system constructed in Example 5 was performed. Three types of healthy human serum samples (Samples I to III) (manufactured by Aries) were prepared, and each was diluted 100,000 times with the sample diluent described in Reference Example 1 (4).
  • the dilution ratio of the diluted specimen and the sample diluent is 10 volumes: 0 volumes (dilution ratio: 10/10), 9 volumes: 1 volume dilution ratio: 9/10), 8 volumes: 2 volumes dilution ratio: 8 / 10), 7 volumes: 3 volumes (dilution ratio: 7/10), 6 volumes: 4 volumes (dilution ratio: 6/10), 5 volumes: 5 volumes (dilution ratio: 5/10), 4 volumes: 6 volumes (Dilution ratio: 4/10), 3 volumes: 7 volumes (dilution ratio: 3/10), 2 volumes: 8 volumes (dilution ratio: 2/10), 1 volume: 9 volumes (dilution ratio: 1/10) Were mixed so that a 10-step dilution series was prepared.
  • samples I to III Three types of healthy human serum samples (Samples I to III) (Aries) were prepared, and each was diluted 200,000 times with the sample diluent described in Reference Example 1 (4).
  • a specimen sample (hereinafter referred to as A) was prepared by mixing 9 volumes of this 200,000-fold diluted specimen with 1 volume of the sample diluent.
  • a standard material sample (hereinafter referred to as B) was prepared by mixing 9 volumes of the sample diluent with 1 volume of the standard substance solution of the standard substance (a) or the standard substance (b).
  • B standard material sample
  • C an added specimen sample (hereinafter referred to as C) prepared by mixing 9 volumes of 200,000-fold diluted specimen with 1 volume of standard substance solution of standard substance (a) or standard substance (b) was prepared.
  • the results are shown in Table 5.
  • the addition recovery rate converged within the range of 90 to 110% for any sample and any standard substance addition amount, and this measurement system showed a good addition recovery rate.
  • the recovery rate of the addition is poor when the measurement system is affected by various components (matrix) contained in the specimen. Therefore, this measurement system is not affected by the specimen components, and the core fucosylated human IgG can be accurately obtained. It was found that it can be measured.
  • an N-linked sugar chain to which core fucose is bound is bound to a human immunoglobulin G containing an Fc region
  • an N-linked sugar chain to which no core fucose is bound is bound to a human immunoglobulin G containing an Fc region.
  • Anti-core fucosylated human immunoglobulin G antibody that does not bind hybridoma producing the antibody, method for producing the antibody, method for measuring core fucosylated human immunoglobulin G using the antibody, core fucosylated human immunoglobulin G containing the antibody
  • a measuring reagent, a method for purifying core fucosylated human immunoglobulin G using the antibody, and an insoluble carrier on which the antibody is immobilized are provided. These are useful in clinical diagnosis.

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Abstract

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧ（ヒトＩｇＧ）には結合しないことを特徴とする、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、該抗体又は該抗体断片を用いる、コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法、該抗体又は該抗体断片を用いる、測定方法、及び、該抗体又は該抗体断片を用いる、測定試薬を提供する。

Description

抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体
　本発明は、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体に関する。
本願は、２０１６年９月１４日に、日本に出願された特願２０１６－１７９９４４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒトの免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと記載する）は、獲得免疫機構において成熟したＢ細胞が血液中に分泌する糖蛋白質である。ヒトＩｇＧは２本の軽鎖（Ｌ鎖）と２本の重鎖（Ｈ鎖）からなる４量体で、４種類のサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、４）が存在する。２本の重鎖のＣ末端側ドメイン（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）が構成するＦｃ領域（定常領域とも呼ぶ）に含まれる重鎖２９７番目のアスパラギン（Ｎ）には、いずれのサブクラスにおいても翻訳後修飾として糖鎖が付加される（図１）。このＩｇＧのＦｃ領域に含まれる重鎖２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に結合した糖鎖をＮ結合型糖鎖という。ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域のＮ結合型糖鎖は、２個のＮ－アセチルグルコサミンと３個のマンノースからなる５糖構造を核とし、これにＮ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸、フコースが付加される複合型２分岐糖鎖であり、各単糖の付加の有無や付加数、付加される位置の違いによって構造的多様性を示す（非特許文献１参照）。
　Ｆｃ領域に存在するＮ結合型糖鎖の構造は、ＩｇＧの機能に重要な影響を与えることが知られている。例えば、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域のＮ結合型糖鎖には、２９７番目のアスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン（還元末端ＧｌｃＮＡｃ）の６位と、フコースの１位とがα１－６結合した糖鎖構造が存在する（このフコースをコアフコースと呼ぶ）。このコアフコースが失われると、細胞傷害性リンパ球の１種であるナチュラルキラー細胞が細胞表面に発現するＦｃγレセプターＩＩＩ（別名ＣＤ１６）と、ＩｇＧ　Ｆｃ領域との相互作用が強くなる（非特許文献２参照）。その結果、ヒトＩｇＧが結合した標的（がん細胞、ウイルス感染細胞など）に対して、このヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域に結合したナチュラルキラー細胞が発揮する抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下、ＡＤＣＣと記載する）活性が劇的に増強される（非特許文献３、４参照）。
　この現象はＡＤＣＣ活性を薬効機序とした抗体医薬の開発に利用されており、コアフコースを持たないヒトＩｇＧ（以下、非コアフコシル化ヒトＩｇＧと記載する。）の様々な生産方法が報告されている。例えば、コアフコースの付加に関与する酵素であるα１－６フコシルトランスフェラーゼ（以下、Ｆｕｔ８と記載する。）をコードするすべての遺伝子を破壊した細胞を抗体生産細胞として利用する方法（非特許文献５参照）、Ｆｕｔ８をコードするメッセンジャーＲＮＡをｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で破壊する方法（非特許文献６参照）、抗体産生細胞を糖鎖修飾酵素（αマンノシダーゼＩ）の阻害剤存在下で培養し、結果的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを得る方法（非特許文献７参照）、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンの付加を促進する酵素（β１－４Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）を抗体産生細胞に人工的に発現させ、非コアフコシル化ヒトＩｇＧを得る方法（非特許文献８参照）などが挙げられる。
　一方、コアフコシル化ヒトＩｇＧの量が、疾患の有無やその病態の度合いに伴い変動する事が知られている。例えばＫｒａｔｚらは、男性不妊を呈する膿精子症（ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｐｅｒｍｉａ）の患者において、精漿中に存在するコアフコシル化ヒトＩｇＧ量が減少していることを報告し、この変化が膿精子症の診断に有用である可能性を示唆している（非特許文献９参照）。またＫｏｄａｒらは、胃がん患者のがん進行度（がんステージ）に応じたコアフコシル化ヒトＩｇＧ量の変動を見出し、コアフコースを含むヒトＩｇＧの糖鎖構造の変化が、胃がんの悪性度や予後を予測する指標として有用である可能性を示唆している（非特許文献１０参照）。さらにＫａｐｕｒらは、妊娠中の母体由来の抗体が胎児に移行し、胎児が提示する同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）に反応することで発症する新生児同種免疫性血小板減少症（Ｎｅｏｎａｔａｌ　ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ、ＮＡＩＴ）、及び新生児溶血性疾患（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｗｂｏｒｎ、ＨＤＮ）において、同種抗原を認識する母体由来のＩｇＧのコアフコースが特異的かつ顕著に減少していること、またこのコアフコース減少の程度が病態の重篤度と相関することを見出し、各疾患の発症予測や重篤度を予測する指標として有用であることを報告している（非特許文献１１、１２参照）。
　現在、研究及び臨床の現場において、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定は、質量分析機や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法（特許文献１、２参照）、あるいはコアフコースに親和性を示すレクチンを用いた方法（特許文献３、４参照）によって行われている。しかしながら、前者では、高額な測定機を準備する必要があり、また、糖鎖分解酵素や蛋白質分解酵素による試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの分解等の試料の前処理が必要であり、かつ、操作が非常に煩雑であり、効率性に欠けるという問題があり、後者では、レクチンのコアフコースに対する特異性が低いため、コアフコシル化ヒトＩｇＧの高感度測定、及び、効率的精製は難しいという問題がある。
国際公開第２０１１／０２６６４０号 国際公開第２０１１／０３９１５０号 国際公開第２０１０／０１０６７４号 特開２００７－１６１６３３号公報
Journal of Immunological Methods, http://dx.doi.org/10.1016/j.jim. 2014.12.004 Proceedings of the National Academy of Sciences, vol.108, p.12669～12674 (2011) Journal of Biological Chemistry, vol.277, p.26733～26740 (2002) Journal of Biological Chemistry, vol.278, p.3466～3473 (2003) Biotechnology and Bioengineering, vol.87, p.614～622 (2004) Biotechnology and Bioengineering, vol.88, p.901～908 (2004) Biotechnology and Bioengineering, vol.99, p.652～665 (2008) Nature Biotechnology, vol.17, p.176～180 (1999) Glycoconjugate Journal, DOI 10.1007/s10719-013-9501-y (2013) Glycoconjugate Journal, DOI 10.1007/s10719-011-9364-z (2012) Blood, vol.123, p.471～480 (2014) British Journal of Haematology, vol.166, p.936～945 (2014)
　本発明の目的は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を提供することにある。また、本発明の目的は、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬、コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の取得に成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の［１］～［３０］に関する。
［１］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しないことを特徴とする、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片。
［２］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、［１］に記載の抗体又は該抗体断片。
［３］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、［１］又は［２］に記載の抗体又は該抗体断片。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［４］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原と結合するヒトＩｇＧである、［１］～［３］のいずれかに記載の抗体又は該抗体断片。
［５］　抗体が、モノクローナル抗体である、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又は該抗体断片。
［６］　受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより産生される、［５］に記載の抗体又は該抗体断片。
［７］　［５］に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［８］　受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマ。
［９］　以下の工程を含有することを特徴とする、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法。
（１）コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程；
（２）工程（１）で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
（３）工程（２）で得られるハイブリドーマを培養する工程；
（４）工程（３）で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
（５）工程（４）で選択されたハイブリドーマを培養し、該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程。
［１０］　非ヒト動物が、α１－６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物である、［９］に記載の製造方法。
［１１］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［１３］　［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
［１４］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１５］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１６］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料を、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と反応させ、該不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体における標識化競合物質を測定する工程。
［１７］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料を、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と反応させ、該不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した免疫複合体を測定する工程。
［１８］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗原とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１９］　以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗原の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［２０］　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、［１８］又は［１９］に記載の測定方法。
［２１］　［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２２］　さらに、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、［２１］に記載の測定試薬。
［２３］　不溶性担体上に固定化された［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２４］　不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、及び、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２５］　さらに、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、［２１］に記載の測定試薬。
［２６］　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、［２５］に記載の測定試薬。
［２７］　［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法。
［２８］　以下の工程を含む、［２７］に記載の精製方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、コアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる工程；
（３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収する工程。
［２９］　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が不溶性担体上に固定化されている、［２７］又は［２８］に記載の精製方法。
［３０］　［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体。
　本発明により、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が提供される。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬、コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体が提供される。
ヒトＩｇＧの構造を模式的に示す。 ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域－ＦＬＡＧ融合蛋白質（以下、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと記載する）を哺乳類培養細胞で発現させるためのベクターの構造を示す。 還元、非還元状態におけるｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。 抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、各レクチン及び抗ＦＬＡＧ抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図４において、「ＣＨＯ細胞由来」とはＣＨＯ細胞由来ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示し、「Ｆｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来」とはＦｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示している。 抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図５において、「＋」とは、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示し、「－」とは、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示している。 ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図６において、実線は、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示し、破線は、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示している。なお、右下の“抗ヒトＩｇＧ抗体とｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧとの反応”は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧおよび非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。 抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、天然コアフコシル化抗原に対する反応性を示す。 抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ヒトＩｇＧ、ヒト免疫グロブリンＡ、ヒト免疫グロブリンＭ、ウサギＩｇＧに対する反応性を示す。 ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を示す。なお、右下の“抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応”は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、各サブクラスのヒトＩｇＧに対する反応性を示す。 抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、ＬＣＡレクチン及び抗ヒトＩｇＧ抗体の、過ヨウ素酸処理した各サブクラスのヒトＩｇＧ（図において「＋」と表示）、及び、過ヨウ素酸処理していない各サブクラスのヒトＩｇＧ（図において「－」と表示）に対する反応性を示す。 ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、過ヨウ素酸処理した各サブクラスのヒトＩｇＧ（破線）、及び、過ヨウ素酸処理していない各サブクラスのヒトＩｇＧ（実線）に対する反応性を示す。なお、最下段の３つの図は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、各サブクラスのヒトＩｇＧに対する反応性を示す。 抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が固定化された不溶性担体を含有するカラムで精製した、ヒトＩｇＧ由来のＮ結合型糖鎖のＭＳスペクトルを示す。 抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体カラムが固定化された不溶性担体を含有するカラムで精製する前の、ヒトＩｇＧ由来のＮ結合型糖鎖のＭＳスペクトルのスペクトラムを示す。 コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準曲線を示す。
［１］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体とは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない抗体である。
　本発明におけるコアフコースとは、ヒトＩｇＧの２つのＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に結合しているＮ結合型糖鎖のうち該アスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン、すなわち、還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンの６位の炭素と、α１－６結合したフコースをいう。
　本発明における糖鎖とは、各種の単糖がグリコシド結合によって繋がった化合物をいう。単糖としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸等が挙げられる。グリコシド結合とは、単糖のヘミアセタールと他の単糖のヒドロキシル基との間の結合をいい、例えば、２つのＮ－アセチルグルコサミンの間の結合、２つのマンノースの間の結合、マンノースとＮ－アセチルグルコサミンとの間の結合、Ｎ－アセチルグルコサミンとフコースとの間の結合等が挙げられ、これらの結合様式としてα１－３結合、α１－６結合、β１－４結合等が挙げられる。具体的には、２つのＮ－アセチルグルコサミンの間のβ１－４結合等が挙げられる。
　本発明におけるコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖とは、例えば、下記に示される式(I)～(VII)の構造で表されるＮ結合型糖鎖等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明におけるコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖とは、ヒトＩｇＧの２つのＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に糖鎖が結合したＮ結合型糖鎖であって、アスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン、すなわち、還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であり、例えば、下記に示される式(VIII)～(XIV)の構造で表されるＮ結合型糖鎖等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　本発明におけるコアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば図１に示すヒトＩｇＧ等が挙げられる。
　本発明におけるコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合する抗原としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合する抗原であれば特に制限はなく、例えば、自己抗原、同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原等が挙げられる。自己抗原としては細胞核内抗原等が挙げられ、同種抗原としては主要組織適合遺伝子複合体抗原（ＭＨＣ抗原）等が挙げられ、ウイルス由来抗原としてはＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのコア抗原等が挙げられ、細菌由来抗原としてはグラム陰性菌外膜のＯ抗原、百日咳菌の百日咳毒素等が挙げられる。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換えモノクローナル抗体等が挙げられる。ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体としては、例えば、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体等が挙げられる。
　本発明のハイブリドーマとしては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマであれば特に制限はなく、例えば、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマが挙げられる。
　本発明のハイブリドーマは、公知の方法、例えば、「モノクローナル抗体」（羊土社、１９９６年）等に記載されている方法等で製造することができる。
　また、本発明における抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の断片としては、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるＦａｂ、抗体をペプシン処理することにより得られるＦ（ａｂ’）２、抗体をペプシン処理－還元処理することにより得られるＦａｂ’、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ領域）と抗体重鎖の可変領域（ＶＨ領域）を人工的に１本のポリペプチドとして繋いだ１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ科動物等が保有する抗体軽鎖を持たない１本鎖抗体の抗体重鎖の可変領域（ＶＨＨ領域）断片等が挙げられる。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を製造し得る方法であれば特に制限はなく、例えば以下の工程を含む製造方法等が挙げられる。
[i]　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程；
[ii]　工程[i]で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
[iii]　工程[ii]で得られるハイブリドーマを培養する工程；
[iv]　工程[iii]で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
[v]　工程[iv]で選択されたハイブリドーマを培養し、該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程。
（工程[i]）
　工程[i]は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程であり、非ヒト動物に免疫する方法としては、調製した免疫原を、例えば、非ヒト動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を投与する方法等が挙げられる。
　免疫原としては、非ヒト動物に本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得る免疫原であれば特に制限はなく、例えばコアフコシル化ヒトＩｇＧ、又はコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片等が挙げられ、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、又はコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片にＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）やアルブミン等のキャリア蛋白質を結合させたものを用いていてもよい。アルブミンとしては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン等が挙げられる。
　非ヒト動物としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生体内に生成し得るヒト以外の動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、アルパカ等が挙がられ、特に、コアフコースを含むエピトープに対する抗体が生じ易いことが期待される、α１－６フコシルトランスフェラーゼ（以下、Ｆｕｔ８と記載する）をコードする遺伝子が欠損したＦｕｔ８ノックアウトマウス（以下、Ｆｕｔ８ＫＯマウスと記載する）［Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.102，p.15791 (2005)］が好的に用いられる。
　アジュバントとしては、非ヒト動物に本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得るアジュバントであれば特に制限はなく、例えば、Freund’s Complete Adjuvant（ＦＣＡ）、Freund’s Incomplete Adjuvant（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント等が挙げられる。
　免疫原の調製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又はそのＦｃ領域断片を調製し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、下記に示す、（a）コアフコシル化ヒトＩｇＧ若しくはそのＦｃ領域断片を遺伝子工学的に製造する方法、（b）ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法、（c）ヒト血液試料等から精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することでコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法、（d）試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法等が挙げられる。
（a）コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を遺伝子工学的に製造する方法
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片は、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法等に従い、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを挿入した発現ベクター（以下、組換えベクターという）を作製した後、該組換えベクターを宿主細胞に導入することで形質転換体を作製し、該形質転換体にヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させることにより、製造することができる。具体的には以下の（a‐1）～（a‐3）の手順で行うことができる。
（a‐1）ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターの作製
　ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターは、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡ断片を、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。
　ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡは、以下の方法により取得することができる。
　ヒト末梢血から単離した白血球から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出した後、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを増幅するように設計したプライマーを用いてpolymerase chain reaction（ＰＣＲ）を行い、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを増幅する。ｃＤＮＡ断片がコードするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片のサブクラスは、ＩｇＧ１～４のいずれでもよい。また該ｃＤＮＡ断片に必要に応じてＨｉｓ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ等のエピトープタグをコードする配列を付加してもよい。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、又はOligo-dT30<Super> mRNA Purification Kit（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。また、Fast Track mRNA Isolation Kit（インビトロジェン社製）、又はQuickPrep mRNA Purification Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等のキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、PrimeScript（登録商標） II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。
（a‐2）形質転換体の作製
　（a‐1）で作製した組換えベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する形質転換体を得ることができる。
　組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology，vol.3，p.133(1990)]、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５号公報）、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.84，p.7413 (1987)]などが挙げられる。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を得るための宿主細胞としては、導入した発現ベクターがコードするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現できる動物細胞、酵母、昆虫細胞等であって、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を付加する能力を有するものであればいずれをも用いることができる。なお、該宿主細胞には、遺伝子改変によりコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を付加する能力を獲得した宿主細胞も含まれる。
　動物細胞としては、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７細胞（特開昭６３－２９９号公報）等が挙げられる。酵母としては、例えばサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物等が挙げられる。具体的には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ等がそれぞれ挙げられる。昆虫細胞としては、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞［Current Protocols in Molecular Biology，Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)］及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ　５（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology，vol.3，p.133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature，vol.329，p.840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J.Biochemistry，vol.101，p.1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［国際公開第１９９７／１０３５４号］等が挙げられる。
　酵母を宿主として用いる場合の発現ベクターとして、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等が挙げられる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとして、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等が挙げられる。
　動物細胞用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）のプロモーター及びエンハンサー等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　酵母用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、酵母中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ　１プロモーター、ｇａｌ　１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１　プロモーター及びＣＵＰ　１プロモーター等が挙げられる。
　昆虫細胞用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、昆虫細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等が挙げられる。
（a‐3）形質転換体からコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造する方法
　（a‐2）で得られる形質転換体を培地で培養し、培養物中にコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産させ、該培養物から採取することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造することができる。
　培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association，vol.199，p.519 (1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science，vol.122，p.501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology，vol.8，p.396 (1959)］、１９９培地［Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，vol.73，p.1 (1950)］又はこれら培地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等を用いることができる。酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＹＰＤ培地等が挙げられる。昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばグレース昆虫培地等が挙げられる。
　形質転換体を用いてコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法として、宿主細胞内に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外膜上に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外に分泌させる方法としては、例えば特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第１９９４／２３０２１号等に記載の方法等が挙げられる。
　宿主細胞から生産されたコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片は、例えば、以下のようにして、調製することができる。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製品を得ることができる。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体を回収する。回収したコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を正常な立体構造に戻した後、前記と同様の調製法によりコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を得ることができる。
（b）ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法
　ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法としては、例えば、ヒトから採取した血液を遠心分離することによって得られる血清から、前述の（a‐3）に記載の通常のタンパク質の単離精製法を用いて、コアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法等が挙げられる。
（c）ヒト血液試料等から調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することによりコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法
　ヒト血液試料等から調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することによりコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法としては、例えば、前述（b）記載の方法により調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧを、プロテアーゼにより可変領域とＦｃ領域とに切断した後、前述の（a‐3）に記載の通常のタンパク質の単離精製法を用いて、該Ｆｃ領域断片を調製する方法等が挙げられる。プロテアーゼとしては、例えばペプシン、パパイン等が挙げられる。コアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理する時間としては、コアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得ることができる時間であれば特に制限はなく、通常、１～４８時間であり、２～２４時間が好ましい。コアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理する温度は、コアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得ることができる温度であれば特に制限はなく、通常、０～５０℃であり、５～４５℃が好ましく、２０～４０℃が特に好ましい。
（d）試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法
　試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法としては、例えば、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が結合したアスパラギンを用いたペプチドの固相合成法［J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1，vol.3，p.549 (1998)］等により作製したコアフコースが結合したＮ結合型糖鎖が結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片と、それ以外の部分のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片とをネイティブケミカルライゲーション法［Science，vol.226，p.5186 (1994)］等を用いて連結する方法等が挙げられる。
（工程[ii]）
　工程[ii]は、工程[i]で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作製する工程である。
　抗体産生細胞としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得る抗体産生細胞であれば特に制限はなく、例えば、免疫原を免役した非ヒト動物の脾臓、リンパ節、又は末梢血から得られるＢ細胞等が挙げられる。
　ミエローマ細胞としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得るミエローマ細胞であれば特に制限はなく、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology，vol.18，p.1 (1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology，vol.6，p.511 (1976）］、ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature，vol.276，p.269 (1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J.Immunology，vol.123，p.1548 (1979)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature，vol.256，p.495 (1975)］等が挙げられる。
　細胞の融合方法としては、抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、電気パルス法等が挙げられる。
（工程[iii]）
　工程[iii]は、工程［ii］で作製したハイブリドーマを培養する工程であり、ハイブリドーマを培養する方法としては、例えば、選択培地［１０％（ｖ／ｖ）　ＢＭ－ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１、２％（ｖ／ｖ）　ＨＡＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）］を用い、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
（工程[iv]）
　工程[iv]は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマのみを選択する工程であり、当該ハイブリドーマのみを選択する方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ又は非コアフコシル化ヒトＩｇＧを固相化したマイクロタイタープレートの各ウェルに、工程[iii]記載のハイブリドーマの培養方法によって得られる培養上清を分注し２５℃で反応させる。各ウェルを洗浄液［０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液］で洗浄した後、酵素等で標識した抗ＩｇＧ抗体を分注して反応させる。各ウェルを洗浄液で洗浄後、各ウェルの標識量を測定することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、培養上清中の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体、及び標識化抗ＩｇＧ抗体からなる免疫複合体Ａ、又は、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ、培養上清中の抗非コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体、及び標識化抗ＩｇＧ抗体からなる免疫複合体Ｂが形成したウェルを検出することができ、培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又は非コアフコシル化ヒトＩｇＧに結合するか否かを判定することができる。この結果から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマのみを選択することができる。
　ハイブリドーマの選択に用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば、前述の工程（i）の（a）～（d）の方法等により製造することができる。
　ハイブリドーマの選択に用いる非コアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば、下記に示す、（e）遺伝子工学的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを製造する方法、（f）化学合成法等の方法により製造することができる。
（e）遺伝子工学的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを製造する方法
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧは、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法等に従い、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターを作製した後、該組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を作製し、該形質転換体に非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させることにより、製造することができる。具体的には、以下の（e‐1）～（e‐3）の手順で行うことができる。
（e‐1）非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターの作製
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターは、前述の（a‐1）の方法により作製することができる。
（e‐2）形質転換体の作製
　（e‐1）で得られた組換えベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する形質転換体を得ることができる。
　組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、組換えベクターを宿主細胞へ導入し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載の方法等が挙げられる。
　宿主細胞としては、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産し得る宿主細胞であれば特に制限はなく、例えば、Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性を低下又は欠損させた動物細胞、糖鎖付加能のない原核細胞等が挙げられる。
　Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素としては、例えば、Ｆｕｔ８等が挙げられる。
　Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性を低下又は欠損させた動物細胞としては、Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性が低下又は欠損した動物細胞であれば特に制限はなく、例えば、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＣＯＳ細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＣＨＯ細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＨＢＴ５６３７細胞等が挙げられる。
　Ｆｕｔ８活性を低下又は欠損させる方法としては、アンチセンス法、リボザイム法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.1886 (1999)]、相同組換え法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1994)；Gene Targeting,A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press (1993)］、RNA-DNA oligonucleotide（ＲＤＯ）法、RNA interference（ＲＮＡｉ）法[Nature，vol.391，p.806 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.95，p.15502 (1998)；Nature，vol.395，p.854 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.5049 (1999)；Cell，vol.95，p.1017 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.1451 (1999)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，vol.95，p.13959 (1998)；Nature Cell Biol.，vol.2，p.70 (2000)]、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法[Nature Genetics，vol.25，p.35 (2000)]等が挙げられる。
　糖鎖付加能のない原核細胞を有する原核生物としては、例えばエシェリヒア属等に属する微生物等が挙げられ、エシェリヒア属等に属する微生物としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、大腸菌ＤＨ５α等が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターは、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものを用いることができる。
　動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載の発現ベクター等が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載のプロモーター等が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合の組換えベクターにおけるヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産率を向上させることができる。さらに、前記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列を含む発現ベクターを用いることができる。リボソーム結合配列としては、例えばシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列等が挙げられる。また、該発現ベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもロシュ社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry，vol.48，p.669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric.Biol.Chem.，vol.53，p.277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.82，p.4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（アジレント・テクノロジー社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J.Bacteriol.，vol.172，p.2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３（東洋紡社製）等が挙げられる。
　糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃ　Ｔ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の組換えベクターにおいて、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。
　前記組換えベクターにおけるヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とする非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産率を向上させることができる。さらに、前記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
（e‐3）形質転換体から非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造する方法
　（e‐2）で得られる形質転換体を培地で培養し、培養物中に非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産させ、該培養物から採取することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造することができる。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、前述の（a‐3）に記載の培地等が挙げられる。
　糖鎖付加能のない原核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地等が挙げられる。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法として、宿主細胞内に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外膜上に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外に分泌させる方法としては、例えば特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第１９９４／２３０２１号等に記載の方法等が挙げられる。
　形質転換体を用いて、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製品を得ることができる。
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体を回収する。回収した非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を正常な立体構造に戻した後、前記と同様の単離精製法により非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の精製標品を得ることができる。
（f）非コアフコシル化ヒトＩｇＧの化学合成法
　非コアフコシル化ヒトＩｇＧの化学合成法としては、例えば、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖が結合したアスパラギンを用いたペプチドの固相合成法［J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1，vol.3，p.549 (1998)］等により作製したコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖が結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片と、それ以外の部分のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片とをネイティブケミカルライゲーション法［Science，vol.226，p.5186 (1994)］等を用いて連結する方法等が挙げられる。
（工程[v]）
　工程[v]は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程である。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する方法としては、例えば、前述の工程[iv]の方法で選択されたハイブリドーマを工程[iii]の方法で培養し、得られる培養上清中から、抗体に結合する分子を用いて、該抗体を採取する方法等が挙げられる。
　工程[v]における抗体に結合する分子としては、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に結合できる分子であれば特に制限はなく、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合する抗体等が挙げられる。
［２］コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法
　本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法である。本発明の測定方法の具体的態様を以下に示す。
・測定方法１（サンドイッチ法１）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体１を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体１と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体の免疫複合体２を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体２を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体２の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体２の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体２の標識物質を測定すればよい。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。
・測定方法２（サンドイッチ法２）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体３を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体３と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体４を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体４を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体４の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体４の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体４の標識物質を測定すればよい。
　Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が不溶性担体に固定化されている場合、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｂ－ｂの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体のＦｃ領域－Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体のＦｃ領域と結合する抗体。
・測定方法３（競合法１）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させ、不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体５、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体６を生成させる工程；
（２）工程（１）で不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体５における標識物質を測定する工程；
（３）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（２）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と標識物質の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４）工程（３）で作成された検量線と、工程（２）で測定された標識物質の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。
　工程（１）において、試料と、不溶性担体上に固定化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させた後、該反応の反応液に該標識化競合物質を添加してもよい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｃ－ｃの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合する抗体。
・測定方法４（競合法２）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料を、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と反応させ、不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体７を生成させる工程；
（２）工程（１）で不溶性担体上に生成した免疫複合体７を測定する工程；
（３）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（２）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体７の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４）工程（３）で作成された検量線と、工程（２）で測定された免疫複合体７の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていてもよい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（２）において、免疫複合体７の標識物質を測定すればよい。
　工程（１）において、試料と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させた後、該反応の反応液に、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を添加してもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｄ－ｄの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン。
・測定方法５（抗原特異的なコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法１）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗原と試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体８を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体８と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体９を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体９を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体９の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体９の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体９の標識物質を測定すればよい。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が不溶性担体に固定化されている場合、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｅ－ｅの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン。
・測定方法６（抗原特異的なコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法２）
　以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体１０を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体１０と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗原の免疫複合体１１を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体１１を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体１１の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体１１の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。
　工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体１１の標識物質を測定すればよい。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｆ－ｆの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。
　本発明の測定方法における試料としては、本発明の測定方法を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血（血液）、血球、血清、血漿、髄液、尿、精漿、羊水、唾液、組織、培養細胞が挙げられ、血清及び血漿が好ましい。
　本発明における、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧとしては、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであれば特に制限はなく、例えばコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ、及び、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが含まれる。
　本発明における、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧのいずれかの部分と結合する抗体であれば特に制限はなく、例えばコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗Ｎ結合型糖鎖抗体等が挙げられる。
　本発明における、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの競合物質としては、本発明の前記競合法１又は２による測定方法を可能とする競合物質であれば特に制限はなく、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に対する結合の強さが、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に対するコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの結合の強さと同程度であるものが好ましい。このような競合物質としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧそのものが例示される。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合し得る抗原であれば特に制限はなく、例えば、前述の抗原等が挙げられる。
　本発明の測定方法は、ドライケミストリーでも溶液中の反応でも適用可能である。本発明の測定方法において、抗原抗体反応、すなわち、測定方法１、２、５、６における工程（１）及び工程（２）、並びに、測定方法３、４における工程（１）における反応温度としては、本発明の測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、通常、０～５０℃であり、４～４０℃が好ましい。反応時間としては、本発明の測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、通常、１分間～７２時間であり、５分間～２０時間が好ましい。
　洗浄工程において使用される洗浄液としては、本発明における抗原抗体反応の反応液を除去し得る洗浄液であれば特に制限はなく、例えばリン酸緩衝化生理食塩水［０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（以下、ＰＢＳと記す。）］、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等を挙げることができる。該界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
　本発明の測定方法における不溶性担体としては、本発明の測定方法を可能とする不溶性担体であれば特に制限はない。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられ、９６ウェル／枚のポリスチレン製マイクロタイタープレート等が好ましい。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の不溶性担体との結合、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と不溶性担体との結合、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と不溶性担体との結合、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と不溶性担体との結合としては、物理吸着、化学結合等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体に固定化してもよく、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を直接、不溶性担体に固定化する方法としては、例えば本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質の溶液を、不溶性担体であるポリスチレン製マイクロタイタープレートに具備されているウェルに添加して、１時間から１日間、４～３０℃でインキュベートすることにより、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質をウェルに物理吸着させて固定化する方法等が挙げられる。
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を、間接的に不溶性担体に固定化する方法としては、例えばビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との特異的結合を介して、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を不溶性担体に固定化する方法等が挙げられる。また、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。
　リンカーとしては、例えば、不溶性担体表面の官能基と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が有する官能基の両者を共有結合できる分子であれば特に制限はなく、例えば、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質の官能基及び不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えばアリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
　測定方法１、２、５及び６における工程（３）において、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体（免疫複合体２；免疫複合体４；免疫複合体９；免疫複合体１１）を測定する方法は、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法等が挙げられる。また、測定方法１の工程（２）におけるＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が、標識物質で標識化されたＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体である場合、測定方法２及び測定方法５の工程（２）における本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が、標識物質で標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片である場合、及び、測定方法６の工程（２）におけるコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、標識物質で標識化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原である場合、工程（３）において、各測定方法における工程（２）で生成した免疫複合体を測定する方法としては、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体中の標識物質を測定する方法等が挙げられる。
　測定方法３における工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体５を測定する方法は、工程（１）で生成した免疫複合体５を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法、標識物質を測定する方法等が挙げられる。
　測定方法４における工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定する方法は、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法等が挙げられる。また、工程（１）における本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が、標識物質で標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片である場合、工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定する方法としては、工程（１）で生成した免疫複合体中の標識物質を測定する方法等が挙げられる。
　標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、FITC（フルオレッセイン　イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ－イソチオシアナート）等が挙げられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔ［Science，vol.281，p.2016-2018 (1998)］、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。発光物質としては、例えば、アクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem.，vol.37(9)，p.1534-1539 (1991)に示されたものが好ましい。放射性同位元素としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等が挙げられる。
　タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His His His His His His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等が挙げられる。
　Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの競合物質、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原の各物質の標識物質による標識化は、該各物質の官能基と標識物質の官能基との間で、リンカーを介して又は介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。
　リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、NHS又はその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性～弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
　リンカーとしては、例えば、該各物質の官能基に反応する官能基と、標識物質の官能基に反応する官能基の両方の官能基を分子内に有するものが挙げられ、第２抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子が好ましく、その中でも、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基である分子が特に好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。
　放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、例えば文献［Antibody Immunoconj. Radiopharm.，vol.3，p.60 (1990)］記載の方法が挙げられる。
　標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術［Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)］に従って、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体及び標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ等でクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。
　検出工程、すなわち、測定方法１、２、５及び６の工程（３）、及び、測定方法３及び４の工程（２）において、測定方法１、２、５及び６の工程（２）で生成した免疫複合体中の標識物質の量、及び、測定方法３及び４の工程（１）で生成した免疫複合体中の標識物質の量を測定する場合、標識物質の量の測定は、標識物質に応じて適切な方法を選択することができる。標識物質が発色物質、すなわち、ある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ－ウェルカウンター等により測定することができる。
　標識物質が酵素である場合、標識物質の量の測定とは、酵素活性を測定することを意味する。酵素の基質を該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、酵素活性、すなわち、標識物質の量を測定することができる。酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
　ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ－フェニレンジアミン、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
　酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジ（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
　蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。該蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
　発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。
　酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３－（２'－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３'－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２－クロロ－５－｛４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２'－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標））、３－｛４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２'－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ（登録商標））、９－［（フェニルオキシ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］－１０－メチルアクリダン・二ナトリウム、９－［（４－クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］－１０－メチルアクリダン・二ナトリウム（Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）　ＡＰＳ－５）等が挙げられる。
　酵素がβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法又は蛍光法等によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、β－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えば、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン－プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］又はその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等が挙げられる。
　酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。
　標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素及び酵素以外の物質（物質Ａとする）である場合は、物質Ａに特異的に結合する物質（物質Ｂ）を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識化物質Ｂと、検出工程で生成した物質Ａを含有する免疫複合体とを反応させて、物質Ａ及び標識化物質Ｂを含有する免疫複合体を生成させて、生成したこの免疫複合体中の標識化物質Ｂの量を前述の方法により測定することにより、試料中の測定対象成分を測定することができる。物質Ｂとしては、例えば物質Ａに対する抗体、アビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ストレプトアビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ビオチン（物質Ａが、アビジン、ストレプトアビジンの場合）等が挙げられる。物質Ａに対する抗体としては、抗体フラグメントでもよく、抗体フラグメントとしては、例えば前述のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。
　本発明の測定方法において、抗原抗体反応、すなわち、測定方法１、２、５及び６の工程（１）及び工程（２）、及び、測定方法３及び４の工程（１）は水性媒体中で行われてもよい。また、本発明の測定方法において、検出工程は水性媒体中で行われてもよい。本発明の測定方法において使用される水性媒体としては、本発明の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１～１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
　グッド緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２－［Ｎ－（２－アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２－｛Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２－ヒドロキシ－３－｛［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（３－スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１～０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
　本発明の測定方法においては、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。
［３］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬
　本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬は、本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法に用いられる試薬であり、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有することを特徴とする試薬である。本発明の測定試薬の具体的態様を以下に示す。
・測定試薬１
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
・測定試薬２
　不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｇ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｇ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｇとｇの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。
・測定試薬３
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
・測定試薬４
　不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質により標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。
・測定試薬５
　不溶性担体に固定化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていることが好ましい。また、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は、試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とが含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。
・測定試薬６
　不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。
・測定試薬７
　不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていてもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。
・測定試薬８
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
・測定試薬９
　不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は、試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。
・測定試薬１０
　不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。
　本発明の測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点から、キットの形態を取ることもできる。キットの形態としては、例えば２試薬系キット、３試薬系キット等が挙げられる。本発明の測定キットの具体的態様を以下に示す。
・測定キット１
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第２試薬とを含むキット。
・測定キット２
　不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第２試薬とを含むキット。
　Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質により標識化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット３の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット３
　一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット４
　不溶性担体に固定化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていることが好ましい。Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は、試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット５の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット５
　一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット６
　不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含む第２試薬とを含有するキット。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット７の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット７
　一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット８
　不溶性担体に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていてもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット９の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット９
　一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット１０
　本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第２試薬とを含むキット。
・測定キット１１
　不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は、試料とコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット１２の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット１２
　一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット１３
　不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第２試薬とを含有するキット。
　コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット１４の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。
・測定キット１４
　一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第３試薬とを含むキット。
　一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。
　本発明の測定試薬及び測定キットにおける抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、標識物質、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、不溶性担体としては、例えば前述の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、標識物質、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、不溶性担体がそれぞれ挙げられる。
　本発明の測定試薬及び測定キットは、必要に応じて、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を含有することができる。水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤としては、例えば前述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等がそれぞれ挙げられる。本発明の測定試薬及び測定キットの形態としては、本発明の測定方法を可能とする形態であれば特に制限はなく、例えば溶液形態、凍結乾燥形態等の形態を取ることができる。
［４］コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法
　本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる精製方法である。本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いて、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製できれば特に制限はなく、例えば以下の工程を含む精製方法等が挙げられる。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる工程；
（３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収する工程。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。すなわち、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化されている不溶性担体は、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製に好適に使用される。試料としては、例えば前述の試料等が挙げられる。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、工程（１）と工程（２）の間に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化されている不溶性担体に結合した試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を洗浄液で洗い流す工程が含まれていてもよい。洗浄液としては、不溶性担体上に生成した、コアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を安定に保持し、不溶性担体から該免疫複合体を遊離させることなく、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を洗い流すことができる洗浄液であれば特に制限はなく、例えばＰＢＳ緩衝液等が挙げられる。
　抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体からコアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させるために溶離液が使用される。溶離液としては、工程（１）で生成した免疫複合体を遊離させることなく、該免疫複合体からコアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる溶液であれば特に制限はなく、例えばグリシン－塩酸溶液等が挙げられる。
　工程（３）において、遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収し、精製されたコアフコシル化ヒトＩｇＧを得ることができる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
　Ｔｒｉｓ（和光純薬工業社製）、ＥＤＴＡ（同仁化学研究所社製）、塩化カリウム（和光純薬工業社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、リン酸水素二ナトリウム（関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム（関東化学社製）、リン酸二水素カリウム（和光純薬工業社製）、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）、クマシー・ブリリアント・ブルー（ナカライテスク社製）、ＢＳＡ（プロライアント社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；関東化学社製）、ＴＭＢ－ＯＮＥ（主成分：３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン；ケム・エン・テック社製）、０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸（和光純薬工業社製）、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、エチレングリコール（和光純薬工業社製）、グリシン（関東化学社製）、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、クエン酸（和光純薬工業社製）、クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、重炭酸アンモニウム（和光純薬工業社製）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール；シグマアルドリッチ社製）、ヨードアセトアミド（和光純薬工業社製）、塩酸（和光純薬工業社製）、酢酸（和光純薬工業社製）、アセトニトリル（和光純薬工業社製）、グアニジン（和光純薬工業社製）、トリエチルアミン（和光純薬工業社製）、メタノール（和光純薬工業社製）、無水酢酸（和光純薬工業社製）、ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）、ＭＴＴ（１－メチル－３－ｐ－トリルトリアゼン、東京化成工業社製）。
［参考例１］抗原の調製
（１）抗原発現ベクターの調製
（１－１）変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を有するベクターｐＢＳｈＣγ４ＳＰの構築
　国際公開第１９９７／１０３５４号に記載の野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４を用いて、野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域（ヒンジ領域）の１０８番目のＳｅｒがＰｒｏに置換された変異型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域を有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した。
本改変を行うことによりＩｇＧヒンジ領域を介した２量体形成が安定化することが知られている（モレキュラー・イムノロジー、３０，１０５，１９９３）。
　鋳型としてプラスミドｐＢＳｈＣγ４の１ｎｇを含む５０μＬの反応液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％　ゼラチン、２００μＭ　ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ１、０．５μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ２及び２ｕｎｉｔｓのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて２分間、５５℃にて２分間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行った。
　該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い精製した後、制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉ（タカラバイオ社製）で処理し、０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い、増幅断片を回収した。
　プラスミドｐＢＳｈＣγ４を制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉで切断後、Ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）処理により５’末端のリン酸を除去し、同様に０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて添付の使用説明書に従い、プラスミド断片を回収した。前記で回収した増幅断片とプラスミドｐＢＳｈＣγ４由来のプラスミド断片を連結し、目的のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した。
（１－２）ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域の部分配列を含むｃＤＮＡのクローニング
　以下に示すＰＣＲを行うことにより、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ断片を増幅した。０．２ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含む反応液に、前記（１－１）で構築したｐＢＳｈＣγ４ＳＰ　２５ ｎｇ、１μｍｏｌ／Ｌ 前記の制限酵素サイトを有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅する２種類のプライマー、及び２．５単位のＫＯＤ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲを行った。
　反応条件は９８℃　１５秒間、６８℃　３０秒間のサイクルを２５サイクルで行った。該反応液を２％アガロースゲル電気泳動で分離後、約７００ ｂｐのＰＣＲ産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに導入した。本プラスミドをｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＮｏｔＩＢａｍＨＩとした。
（１－３）ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡの合成
　５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトを有するＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ断片を、固相合成法により合成した。
（１－４）動物細胞用発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩの構築
　国際公開第１９９７／１０３５４号に記載されているヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約９．８　ｋｂｐのプラスミド断片を回収した。回収したＤＮＡ断片の５’及び３’末端をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。
　得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離し、抗体軽鎖の発現ユニットが除かれていることを制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）及びＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）消化により確認した。該プラスミドをｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩと命名した。
（１－５）ヒトＩｇＧ４　Ｆｃ領域発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの作製
　前記（１－２）で作製したｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＮｏｔＩＢａｍＨＩを、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化することにより得られる断片、及び、前記（１－３）で作製した、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトを有するＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ断片を、前記（１－４）で得られたｐＫＡＮＴＥＸ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩをＮｏｔＩ及びＳａｌＩ消化して得られる約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片に連結することにより、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に、該ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＣ末端にＦＬＡＧタグを付加した融合蛋白質を発現するためのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ　ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを得た（図２）。
　該ｐＫＡＮＴＥＸ　ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを、公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）で大腸菌ＤＨ５αに導入した。アンピシリン耐性を獲得した大腸菌ＤＨ５αを１００ｍＬのＬＢ培地（ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス社製）に播種し、３７℃で１２時間培養を行った後に菌体を回収し、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ(キアゲン社製)を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。該プラスミドＤＮＡ ３０μｇを、制限酵素ＢｓｐＥＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて３７℃で１２時間反応させ、線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出処理及びエタノール沈殿を行い、回収した該線状化ＤＮＡを、プラスミド溶解液［１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ］に溶解し、抗原発現ベクターを調製した。
（２）抗原ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの発現
　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，８７，６１４（２００４）に記載の方法に従い、ＣＨＯ細胞のゲノム上のすべてのＦｕｔ８をコードする遺伝子をすべて破壊したＦｕｔ８ノックアウトＣＨＯ細胞（以下、Ｆｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞と記載する）を樹立した。樹立したＦｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞及びその親株であるＣＨＯ細胞に、エレクトポレーション法により（１）で調製した抗原発現ベクター、すなわち、線状化プラスミドＤＮＡ　ｐＫＡＮＴＥＸ　ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを導入した。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は以下の手順で行った。基本培地［１０％（ｖ／ｖ）　ウシ胎児血清（インビトロジェン社製)、５０μｇ／ｍＬ　Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）］で継代した各ＣＨＯ細胞を、Ｋ－ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化カリウム、２．７　ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、８．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸水素二ナトリウム、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸二水素カリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化マグネシウム］に懸濁して８×１０６個／ｍＬとし、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液２００μＬ（１．８×１０６個）を前記（１）で調製した線状化プラスミドＤＮＡ　ｐＫＡＮＴＥＸ　ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ　１０μｇと混合した。この細胞－ＤＮＡ混合液を電極間距離が２ｍｍであるＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ(バイオラッド社製)へ移した後、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　ＩＩ(バイオラッド社製)を用いて、パルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。この細胞懸濁液を基本培地１０ｍＬに混和し、７５ｃｍ２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に播種し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。３日間培養した後、Ｇ４１８（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して、さらに１０日間培養した。１０日後、１８２ｃｍ２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に継代し、コンフルエントになるまで培養を続けた。コンフルエントになった時点で、ＣＨＯ細胞用無血清培地Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＣＤＭ４ＣＨＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に培地交換を行い、１週間培養後に培養上清を回収した。
（３）抗原ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの精製
　（２）で培養を行った培養上清を、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径セルロースアセテートメンブレン（コーニング社製）を用いて上清を濾過した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）をＰＢＳ緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］で平衡化後、濾過済み培養上清をカラムに通塔し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａに結合したｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを０．１ｍｏｌ／Ｌ　グリシン－ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを含む溶出液の溶媒を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）でＰＢＳ緩衝液に置換後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのアミノ酸配列から導かれるモル吸光係数を用いてｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ濃度を算出した。ＣＨＯ細胞及びＦｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞の約３００ｍＬの培養上清から、それぞれ約５ｍｇのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを得た。精製したｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ　２．５μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果を図３に示す。いずれの細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧも、還元条件下においては分子量約３０ｋＤａの位置にバンドが観察された。また非還元条件においては、還元条件でみられたバンドの約２倍の分子量を示す位置にバンドが観察されたことから、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧは２量体として存在していることがわかった。
（４）精製ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのレクチン反応性
　前記（３）で精製した、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ及びＦｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにおけるＮ結合型糖鎖及びコアフコースの有無を確認するため、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する各種レクチンの反応性を解析した。それぞれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧをＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルのＥＩＡ用プレート（ヌンク社製）に該ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置し、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェル、又はＦｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェルを作製した。この際、ＰＢＳ緩衝液のみを５０μＬ分注したウェルを用意し、ブランク用ウェルとした。ついで、各ウェルにブロッキング液［１％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。その後ブロッキング液を捨て、３５０μＬの洗浄液［０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］で３回洗浄した後、試料希釈液［ブロッキング液を洗浄液で１０倍に希釈した溶液］で５，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識レンズマメレクチン（以下、ＬＣＡレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は５，０００倍希釈したビオチン標識ヒイロチャワンタケレクチン（以下、ＡＡＬレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は２，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識コンカナバリンＡレクチン（以下、ＣｏｎＡレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は１，０００倍に希釈したぺルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチ社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１時間静置した。ビオチン標識ＡＡＬレクチンを分注したウェルについてのみ、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１時間静置した。その後、全てのウェルを３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダー（Ｅｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）を用いて反応の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図４に示す。本実験で使用したＬＣＡレクチン及びＡＡＬレクチンはコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖に結合する性質を有し、ＣｏｎＡレクチンはコアフコースの有無に関わらずＮ結合型糖鎖に結合する性質を有する。図４において、ＣｏｎＡレクチンはいずれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにも反応し、ＬＣＡレクチン、ＡＡＬレクチンはＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにのみ反応したことから、いずれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにもＮ結合型糖鎖は存在するが、コアフコースはＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにのみ存在し、Ｆｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧには存在しない事がわかった。すなわち、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を持ち、Ｆｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧはコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖を持つことが判明した。以下、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧをコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、Ｆｕｔ８ＫＯ　ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと称する。
［実施例１］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の産生
（１）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
　Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.102，p.15791 (2005)に記載の方法に従い、ゲノム上のすべてのＦｕｔ８をコードする遺伝子を破壊したＦｕｔ８ＫＯマウスを作出し、このＦｕｔ８ＫＯマウスを免疫対象動物として使用した。参考例１で調製したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ　５０μｇを、２ｍｇのアルミニウムゲル（コスモ・バイオ社製）及び百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに、作出した６週齢のＦｕｔ８ＫＯマウスに投与し、さらに２週間後、３週間後、４週間後に５０μｇのコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを１回ずつ投与した（計４回投与）。免疫を終了したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ培地（ギブコ社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した後、上清を捨て、赤血球溶解バッファー（シグマアルドリッチ社製）で１～２分間処理して赤血球を除去し、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄して脾臓細胞を取得し、細胞融合に用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
　マウス骨髄腫細胞として８－アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｕ１を用意し、ＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）を用いて２×１０７個以上の細胞が得られるまで培養した。
（３）細胞融合
　前記（１）で得られた脾臓細胞と前記（２）で得られた骨髄腫細胞とを、１０：１の細胞数の比になるよう混合した後、該細胞混合液を１２００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した。該細胞混合液から上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした。この細胞混合液を２５℃で攪拌しながら、該細胞混合液に１ｍＬのＰＥＧ１５００（ロシュ社製）を１分間かけて添加した。その後、１分間毎にＲＰＭＩ培地１～２ｍＬを４回加えた後、全量が５０ｍＬになるようにＲＰＭＩ培地を加えた。該細胞液を９００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した後、上清を捨て、細胞を３７℃に温めた選択培地［１０％（ｖ／ｖ）　ＢＭ－ｃｏｎｄｉｍｅｄ　Ｈ１（ロシュ社製）、２％（ｖ／ｖ）　ＨＡＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×、ギブコ社製）を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）］１００ｍＬ中で穏やかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％　ＣＯ２インキュベーター中、３７℃ で１０～１４日間培養した。
（４）ハイブリドーマ株の選択
　参考例１で取得したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で 各５μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１２時間静置し、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェル、及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相されたウェルを作製した。この際、ＰＢＳ緩衝液のみを５０μＬ分注したウェルを用意し、ブランク用ウェルとした。抗原溶液を除去した後、参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェルで分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１００倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、２５℃で１時間静置した。希釈ハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェル添加した後、プレートリーダーを用いて反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを固相したウェルで強く発色し、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを固相したウェルで弱く、あるいは発色しないハイブリドーマ株を選択し、限界希釈法により２回のクローニングを繰り返した。その結果、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－４Ｅ１１、１８－４Ｆ１１、１８－６Ａ７、１８－６Ｄ４、１８－６Ｆ９、１８－９Ｅ１０、１８－１０Ｇ１、１８－１１Ｅ５、１８－１２Ｆ７、２５－４Ｆ５、２５－４Ｈ７、２５－４Ｈ８の１４株を得た。ハイブリドーマ株１８－３Ｄ１１は、２０１６年８月３０日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０２３４２として寄託され、２０１７年８月４日付で受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として受託されている。プレートに固相したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する各ハイブリドーマ株培養上清の反応性を図５に示す。なお、図５に示した「抗ＦＬＡＧ抗体」のグラフは、ハイブリドーマ株上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いた結果を示したグラフであり、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧがほぼ同量プレートに固相されていることを示している。
（５）抗体クラス・サブタイプ・軽鎖タイプの同定
　（４）で取得したハイブリドーマ株の培養上清を用いて、各ハイブリドーマ株が産出する抗体の抗体クラス（アイソタイプ）、サブクラス、軽鎖タイプを、ＩｓｏＱｕｉｃｋモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット　マウス用（シグマアルドリッチ社製）を用いて判定した。判定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例２］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の反応性解析
（１）ビアコアによるｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性解析
　蛋白質は、プレートに固相することで変性し、特殊な立体構造をとることが一般的に知られている。そのため、プレートに固相した抗原には反応するものの、非固相状態の抗原（すなわち、プレートに固相化せずに、溶液中に存在する抗原）には反応しない抗体を取得してしまうことが度々生じる。実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生する抗体が、非固相状態のコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにも反応するか、加えて非固相状態においてもコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを明確に区別する抗体であるか、Ｂｉａｃｏｒｅ　２０００ （ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を使用し、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）により解析した。
　Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に同封のＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）　ａｎｔｉｂｏｄｙを、添付のプロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に固定化した。参考例１で取得したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、又は非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを、固定化したＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）　ａｎｔｉｂｏｄｙに捕捉させた後、ハイブリドーマ株の培養上清をセンサーチップ上に流し、センサーチップ上に捕捉された各ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を評価した。結果を図６に示す。（４）の結果と同様に、いずれのハイブリドーマ株由来の抗体も、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ（実線）に反応するが、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ（破線）には反応しないことが判明した。なお、図６の右下に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体とｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉されたコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ量及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ量がほぼ同量であることを示している。
（２）天然コアフコシル化抗原に対する反応性
　実施例１で取得したハイブリドーマ株の培養上清を用いて、各ハイブリドーマ株が産生する抗体の、天然コアフコシル化抗原に対する反応性を抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した。
　天然コアフコシル化抗原として、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖で修飾されていることが公知である、ヒト母乳由来ラクトフェリン（シグマアルドリッチ社製）、ウシ血液由来サイログロブリン（シグマアルドリッチ社製）、ヒト血液由来ＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）を用いた。該天然コアフコシル化抗原を、参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調製し、参考例１と同様の方法で、各抗原が固相化されたウェルを作製した。参考例１（４）記載の試料希釈液で１００倍希釈したハイブリドーマ株の培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈されたハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図７に示す。取得したハイブリドーマ株が生産する抗体は、天然ヒトＩｇＧのコアフコースには反応するが、ヒトラクトフェリン、ウシサイログロブリンのコアフコースには反応しないことが判明した。なお、図７に示した「ＬＣＡレクチン」のグラフは、ペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチンをハイブリドーマ培養上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに用いた結果を示す。
（３）抗体クラス（アイソタイプ）に対する反応性
　ヒトの抗体クラス（アイソタイプ）、ウサギＩｇＧに対する反応性を抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した。ヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）、ヒト免疫グロブリンＡ（リーバイオソリューションズ社製）、ヒト免疫グロブリンＭ（イムノリージェント社製）、ウサギＩｇＧ（ダコ社製）を参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調整した。この各抗原溶液を９６ウェルのＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗原をプレートに固相した。抗原溶液を除去し、次いで参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１０倍希釈したハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈したハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図８に示す。評価したハイブリドーマ株が生産する抗体は、ヒトＩｇＧのコアフコースには反応するが、ヒト免疫グロブリンＡ、ヒト免疫グロブリンＭ、ウサギＩｇＧのコアフコースには反応しないことが判明した。なお、図８に示した「ＬＣＡレクチン」のグラフは、ペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチンをハイブリドーマ培養上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに用いた結果を示す。
（４）ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性
　ヒトＩｇＧの各サブクラスに対する反応性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用し、表面プラズモン共鳴法にて解析した。Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔに同封のＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｆｃ）　ａｎｔｉｂｏｄｙを添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに固定化した。ヒトＩｇＧ１（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ２（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ３（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ４（フィッツジェラルド社製）をセンサーチップ上に固定化したマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体に捕捉させた後、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清をセンサーチップ上に流し、各ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を評価した。結果を図９に示す。いずれのハイブリドーマ株由来の抗体も、すべてのヒトＩｇＧサブクラスに結合することが判明した。なお、図９に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉された各ヒトＩｇＧサブクラス抗原量を示している。
（５）過ヨウ素酸ナトリウムによる、コアフコースを変性させたヒトＩｇＧの調製
　前記（２）、（３）、（４）で明らかになった、天然ヒトＩｇＧに対する反応性が、コアフコースに依存したものであるかを確認するため、以下のようにして過ヨウ素酸ナトリウム処理によりコアフコースのジオール構造を酸化開裂し、コアフコースを変性させたヒトＩｇＧを調製した。
　参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で調製した２ｍｇ／ｍＬの各サブクラスのヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４）溶液１００μＬに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ　過ヨウ素酸ナトリウム溶液を１０μＬ、ＰＢＳ緩衝液を９０μＬ加え、４℃で１２時間インキュベートした。その後、エチレングリコール溶液を２００μＬ加えて反応を停止した。過ヨウ素酸ナトリウム処理によるコアフコースの変性を確認するため、ＬＣＡレクチンの反応性を評価した。過ヨウ素酸ナトリウム処理した各サブクラスのヒトＩｇＧをＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルのＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗原をプレートに固相した。抗原溶液を除去し、次いで参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチン、あるいは試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈標識レクチン、抗体溶液を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。得られた結果を図１０に示す。過ヨウ素酸ナトリウム処理により、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４へのＬＣＡレクチン反応性がほぼ消失したことがわかった。これにより、過ヨウ素酸ナトリウム処理により、コアフコースが変性したヒトＩｇＧが調製されたことが確認された。
（６）過ヨウ素酸ナトリウム処理したヒトＩｇＧに対する反応性
　前記（５）で調製した過ヨウ素酸ナトリウム処理した各ヒトＩｇＧ各サブクラス抗原、すなわちコアフコースが変性したヒトＩｇＧを用いて、実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生する抗体のヒトＩｇＧに対する反応性が、コアフコース依存的であるかを、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用し、表面プラズモン共鳴法により解析した。Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔに同封のマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体を添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに固定化した。過ヨウ素酸ナトリウム処理した、あるいは処理していないヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４を、センサーチップ上に固定化したマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体に捕捉させた後、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清をセンサーチップ上に流し、過ヨウ素酸ナトリウム処理された、あるいはされていない各ヒトＩｇＧサブクラス抗原に対する反応性を評価した。結果を図１１に示す。いずれのハイブリドーマ株由来の抗体においても、コアフコースが変性したヒトＩｇＧに対する反応性はほぼ消失、あるいは大きく減衰した。なお、図１１の最下段に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉された、過ヨウ素酸ナトリウム処理された各サブクラスのヒトＩｇＧ、及び、過ヨウ素酸ナトリウム処理されていない各サブクラスのヒトＩｇＧの量を示す。これにより、実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生するモノクローナル抗体が、コアフコース依存的にヒトＩｇＧに反応する抗体であることが確認された。
［実施例３］コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製
（１）抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の精製
　実施例１で取得したハイブリドーマ株の内、１８－３Ｄ１１株を５２０ｍＬのハイブリドーマ用無血清培地Ｈｙｃｌｏｎｅ　ＳＦＭ４ＭＡｂ－Ｕｔｉｌｉｔｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養し、培養上清を回収した。３０００ｒｐｍ、１０分間、２５℃で遠心分離を行い、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径セルロースアセテートメンブレンを用いて上清を濾過し、最終濃度３ｍｏｌ／Ｌとなる様に塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、ｐＨ８．９に調整した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で平衡化した後、濾過済みの前記上清をカラムに通塔した。その後、ＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａに結合した１８－３Ｄ１１株由来の抗体（以下、１８－３Ｄ１１抗体と記載する）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ　グリシン－ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）を通過させることによりで溶出した。その後、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、１８－３Ｄ１１抗体を含む溶出液の溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した後、ＰＢＳ緩衝液に置換された１８－３Ｄ１１抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度を吸光光度計（Ｕ－３０００、日立製作所社製）で測定し、モル吸光係数１．４として１８－３Ｄ１１抗体濃度を算出し、約２．５ｍｇの１８－３Ｄ１１抗体を得た。
（２）コアフコシル化ヒトＩｇＧ親和性精製カラムの調製
　コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準物質として用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製するための親和性カラムを以下のようにして調製した。前記（１）で精製した１８－３Ｄ１１抗体２ｍｇを、ＰＤ－１０カラムを用いてカップリング溶液［０．２ｍｏｌ／Ｌ　炭酸水素ナトリウム、０．５ｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３］に置換し、１．６８ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を調製した。「はじめてのリガンドカップリングハンドブック」（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に記載の方法に従い、この抗体溶液１ｍＬをＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）にカップリングした。算出したカップリング効率は９０．３％であった。
（３）コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製
　前記（２）で調製したアフィニティーカラムを用いて、ヒト血液から精製されたヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）から、以下のようにしてコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製した。アフィニティーカラムを１０ｍＬの参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で平衡化し、ＰＢＳ緩衝液で１．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したヒトＩｇＧ６ｍＬをカラムに添加した。１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄後、５ｍＬのクエン酸緩衝液［０．１ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸（和光純薬工業社製）溶液と０．１ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）溶液をｐＨ３．７になる様に混合した緩衝液］をカラムに添加し、カラムに結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧを溶出した。この操作を複数回繰り返し、最終的に約２８０μｇのコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製した。
［実施例４］コアフコシル化ヒトＩｇＧの糖鎖構造解析
（１）コアフコシル化ヒトＩｇＧからのＮ結合型糖鎖の分離
　実施例３で精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧの溶媒を、ＰＤ－１０カラムを用いて参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液に置換した後、限外濾過により濃縮して２．１ｍｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液を調製した。このコアフコシル化ヒトＩｇＧ試料５０μＬに、５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ　重炭酸アンモニウム水溶液、５μＬの１２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＴＴ水溶液を添加してよく撹拌した後、６０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０μＬの１２３ｍｍｏｌ／Ｌ　ヨードアセトアミド水溶液を添加し、遮光下、２５℃で1時間インキュベートした。その後、１ｍｍｏｌ／Ｌ　塩酸で４０ユニット／μＬに調整した蛋白質分解酵素トリプシン（シグマアルドリッチ社製）を１０μＬ添加し、３７℃、１時間反応させ、コアフコシル化ヒトＩｇＧをペプチドに消化した。反応終了後、９０℃、５分間の熱処理によりトリプシンを失活させた後、Ｎ結合型糖鎖の還元末端を切断するＮ-グリコシダーゼＦ（ロシュ社製）を５ユニット添加し、３７℃、１２時間反応させることでペプチドからＮ結合型糖鎖を遊離させた。
（２）Ｎ結合型糖鎖の捕捉とシアル酸の保護
　糖鎖精製標識化キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト社製）を用い、キットに付属の糖鎖結合性ポリマービーズに純水５００μＬを加え、よく撹拌した後、５０μＬのポリマービーズ分散液を分取し、キットに付属の反応用チューブの底部に注入した。卓上遠心機で数秒間遠心分離して水を排出し、白色に乾いたポリマービーズに１８０μＬの２％　酢酸／アセトニトリル溶液［２％（ｖ／ｖ）　酢酸、９８％（ｖ／ｖ）　アセトニトリル］と、前記（１）の反応液２０μＬを添加し、チューブの蓋をあけた状態で８０℃、1時間インキュベートし、Ｎ結合型糖鎖をポリマービーズに結合させた。溶媒が完全に蒸発し、ポリマービーズが乾燥していることを確認後、２００μＬの２ｍｏｌ／Ｌ　グアニジンで２回、２００μＬの純水で２回、２００μＬの１％　トリエチルアミン／メタノール溶液［１％（ｖ／ｖ）　トリエチルアミン、９９％（ｖ／ｖ）　メタノール］で２回、ポリマービーズを洗浄した。次に１００μＬの１０％　無水酢酸／メタノール溶液［１０％（ｖ／ｖ）　無水酢酸、９０％（ｖ／ｖ）　メタノール］を加え、２５℃で３０分間インキュベートして、ポリマービーズ上の官能基をキャッピングした。卓上遠心機で数秒間遠心分離して１０％　無水酢酸／メタノール溶液を排出した後、２００μＬの１０ ｍｍｏｌ／Ｌ　塩酸で２回、２００μＬのメタノールで２回、２００μＬのＤＭＳＯで２回洗浄した。次に１００μＬのＭＴＴ／ＤＭＳＯ溶液［ＭＴＴ　７４．６ｍｇを１ｍＬのＤＭＳＯで溶解］を添加し、チューブの蓋をあけた状態で６０℃、１時間インキュベートし、Ｎ結合型糖鎖に存在するシアル酸をメチルエステル化して保護した。卓上遠心機で数秒間遠心分離してＭＴＴ／ジメチルスルホキシド溶液を排出した後、２００μＬのメタノールで２回、２００μＬの純水で２回、ポリマービーズを洗浄した。
（３）Ｎ結合型糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ測定用標識化
　次に、前記（２）で得られたポリマービーズに、２０μＬのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ用標識化合物溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（住友ベークライト社製、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットに付属）］を添加し、続いて１８０μＬの２％　酢酸／アセトニトリル溶液を添加して、チューブの蓋をあけた状態で８０℃、１時間インキュベートした。これによりポリマービーズから糖鎖を遊離させ、その還元末端をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ用標識化合物で標識化した。溶媒が完全に蒸発し、ポリマービーズが乾燥していることを確認後、５０μＬの純水を加え、卓上遠心機で数秒間遠心分離して標識化Ｎ結合型糖鎖を回収した。
（４）未反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ用標識化合物の除去
　キットに付属のクリーンアップカラム（未反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ用標識化合物除去用カラム）を２００μＬの純水で１回、２００μＬのアセトニトリルで２回洗浄後、回収した標識化Ｎ結合型糖鎖溶液５０μＬに９５０μＬのアセトニトリルを加えた試料を全量添加し、１０分間自然落下によりクリーンアップカラムを通過させた。卓上遠心機で数秒間遠心分離して残りの溶液を通過させた後、３００μＬのアセトニトリルで２回クリーンアップカラムを洗浄した。卓上遠心機で数秒間遠心分離し、クリーンアップカラムからアセトニトリルを完全に除去した後、純水５０μＬを添加し、さらに数秒間遠心分離して標識化Ｎ結合型糖鎖溶液を回収した。
（５）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ解析
　ＭＡＬＤＩマトリックスグレードの２，５－ジヒドロキシ安息香酸（和光純薬工業社製）１０ｍｇに、３００μＬのアセトニトリル、７００μＬの純水を加えて溶解し、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液１μＬに、（４）で回収した標識化Ｎ結合型糖鎖溶液１μＬを混合した。ＭＡＬＤＩターゲットプレートにこの混合液１μＬをスポットし、静置して乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ａｕｔｏｆｌｅｘ　ＩＩＩ　ｓｍａｒｔｂｅａｍ（ブルカー・ダルトニクス社製）でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ解析を行った。得られたＭＳスペクトルを図１２に示す。また糖鎖構造推定ソフトＧｌｙｃｏＭｏｄ　Ｔｏｏｌ［Proteomics，vol.1，p.340 (2001)］を用いて各質量ピークに推定された糖鎖構造を表２に示す。一方、比較対象として同様に分析した、実施例１で得られた抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製する前のヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）から得られたＭＳスペクトルを図１３に、推定されたＮ結合型糖鎖構造を表３に示す。表中、質量電荷比（ｍ／ｚ）はピーク毎の実測イオン質量、「ｄｍａｓｓ」は推定されたＮ結合型糖鎖構造の理論イオン質量と実測イオン質量の差を示す。また推定糖鎖構造において、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミン、「Ｍａｎ」はマンノース、「ＮｅｕＡｃ」はＮ－アセチルノイラミン酸、「Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ」はフコース、「ＨｅｘＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン、「Ｈｅｘ」はマンノース又はガラクトースを示す。抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製する前のヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）においては、実測イオン質量（ｍ／ｚ）１７４６．６９２、１９０８．７５６、２０７０．８１８、２３７５．９４０、２６８１．０２６にフコース（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）を含まないＮ結合型糖鎖構造による微小ピークが検出されたのに対し、抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製した後のヒトＩｇＧではこれらのピークが消失し、推定されたＮ結合型糖鎖構造すべてがフコース（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）を持つことが判明した。このことから、抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）を用いた精製により取得したヒトＩｇＧは、ほぼ１００％コアフコシル化ヒトＩｇＧであり、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準物質として適当であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例５］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の構築
（１）抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体固相化プレートの調製
　９６ウェルのＥＩＡ用プレートに、参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗体をプレートに固相した。抗体溶液を除去後、参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェルで分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去後、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定に使用した。
（２）ぺルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の調製
　実施例３（１）で精製した２００μｇの１８－３Ｄ１１抗体を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所社製）を用いて、添付マニュアルに従いぺルオキシダーゼで標識した。キットに付属のＳｔｏｒａｇｅ　Ｂｕｆｆｅｒでぺルオキシダーゼ標識１８－３Ｄ１１抗体を懸濁し、これをぺルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体溶液とした。
（３）標準物質の調製
　実施例３（３）で精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧを、参考例１（４）記載の試料希釈液で７２５．５ｎｇ／ｍＬ、３６２．８ｎｇ／ｍＬ、１８１．４ｎｇ／ｍＬ、９０．７ｎｇ／ｍＬ、４５．４ｎｇ／ｍＬ、２２．７ｎｇ／ｍＬ、１１．３ｎｇ／ｍＬの各濃度に調整した。この２倍希釈系列を標準曲線を得るための標準物質とし、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定に使用した。
（４）コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定
　前記（１）で調製した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体固相化プレートに、前記（３）で調製した標準物質、あるいは参考例１（４）記載の試料希釈液で１００，０００倍あるいは２００，０００倍に希釈したヒト血清検体を５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１時間静置した後、試料を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回ウェルを洗浄した。次に（２）で調製したペルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体溶液を試料希釈液で１０，０００倍に希釈し、この溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１時間静置した後、標識抗体溶液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回ウェルを洗浄した。ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。得られた標準曲線を図１４に示す。ヒト血清検体中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度は、得られた吸光度を標準曲線で換算し、検体希釈液による希釈率を補正して算出した。
［実施例６］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の性能評価
（１）希釈直線性試験
　実施例５で構築したコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の希釈直線性試験を実施した。３種類の健常人血清検体（検体Ｉ～III）（アリエス社製）を準備し、各々を参考例１（４）記載の試料希釈液で１００，０００倍希釈した。この希釈検体と試料希釈液を、その混合比が１０容：０容（希釈率：１０／１０）、９容：１容希釈率：９／１０）、８容：２容希釈率：８／１０）、７容：３容（希釈率：７／１０）、６容：４容（希釈率：６／１０）、５容：５容（希釈率：５／１０）、４容：６容（希釈率：４／１０）、３容：７容（希釈率：３／１０）、２容：８容（希釈率：２／１０）、１容：９容（希釈率：１／１０）となるように混合し、１０段階希釈系列を調製した。これらのコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を実施例５（４）記載の方法で測定し、１００，０００倍希釈検体のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度の実測値と、希釈倍率から理論的に算出される理論濃度とから対理論率［対理論率（％）＝実測値（ｎｇ／ｍＬ）／理論値（ｎｇ／ｍＬ）×１００］を算出した。結果を表４に示す。いずれの検体、いずれの希釈率においても対理論率は９０～１１０％の範囲内であり、本測定系は良好な希釈直線性を示した。希釈直線性は、検体中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を非特異的に測り込む等により不良となることから本測定系はコアフコシル化ヒトＩｇＧを特異的に測定することができることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（２）添加回収試験
　実施例５で構築したコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の添加回収率を評価するため、３種類の検体に、それぞれ２種類の標準物質（標準物質ａ、標準物質ｂ）を添加した検体を調製し、該検体を用いて添加回収試験を実施した。本試験において、標準物質（ａ）として７２５．５ｎｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液、標準物質（ｂ）として１８１．４ｎｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液を用いた。
　３種類の健常人血清検体（検体Ｉ～III）（アリエス社製）を準備し、各々を参考例１（４）記載の試料希釈液で２００，０００倍希釈した。この２００，０００倍希釈検体９容に試料希釈液１容を混合した検体試料（以下、Ａと記載する）を調製した。標準物質（ａ）又は標準物質（ｂ）の標準物質溶液１容に試料希釈液９容を混合した標準物質試料（以下、Ｂと記載する）を調製した。さらに２００，０００倍希釈検体９容に標準物質（ａ）又は標準物質（ｂ）の標準物質溶液１容を混合した添加検体試料（以下、Ｃと記載する）を調整した。これら試料のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を実施例５（４）記載の方法で測定し、検体に添加した標準物質の回収率［添加回収率（％）＝Ｃ（ｎｇ／ｍＬ）／｛Ａ（ｎｇ／ｍＬ）＋Ｂ（ｎｇ／ｍＬ）｝×１００］を算出した。結果を表５に示す。いずれの検体、いずれの標準物質添加量においても添加回収率は９０～１１０％の範囲内に収束しており、本測定系は良好な添加回収率を示した。添加回収率は、検体中に含まれる多様な成分（マトリックス）の影響を測定系が受けると不良となることから、本測定系は検体成分の影響を受けずに、コアフコシル化ヒトＩｇＧを正確に測定することができることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　本発明により、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の製造方法、該抗体を用いるコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法、該抗体を含有するコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬、該抗体を用いるコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法、及び、該抗体が固定化された不溶性担体が提供される。これらは、臨床診断において有用である。

Claims (30)

  1. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しないことを特徴とする、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片。
  2. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、請求項１に記載の抗体又は該抗体断片。
  3. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体断片。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  4. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧが、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原と結合するヒト免疫グロブリンＧである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体断片。
  5. 　抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体断片。
  6. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより産生される、請求項５に記載の抗体又は該抗体断片。
  7. 　請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  8. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマ。
  9. 　以下の工程を含有することを特徴とする、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体の製造方法。
    （１）コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程；
    （２）工程（１）で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
    （３）工程（２）で得られるハイブリドーマを培養する工程；
    （４）工程（３）で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
    （５）工程（４）で選択されたハイブリドーマを培養し、当該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体を採取する工程。
  10. 　非ヒト動物が、α１－６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 　コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  13. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法。
  14. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で生成した免疫複合体と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体の免疫複合体を生成させる工程；
    （３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
  15. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で生成した免疫複合体と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
    （３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
  16. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料を、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と反応させ、該不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧとの免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体における標識化競合物質を測定する工程。
  17. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料を、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体、又は該抗体断片及び、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質と反応させ、該不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した免疫複合体を測定する工程。
  18. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料と、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原とを反応させて、抗原とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で生成した免疫複合体と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
    （３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
  19. 　以下の工程を含有する、請求項１３に記載の測定方法。
    （１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧとの免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で生成した免疫複合体と、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗原の免疫複合体を生成させる工程；
    （３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
  20. 　コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、請求項１８又は１９に記載の測定方法。
  21. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体または該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。
  22. 　さらに、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体を含む、請求項２１に記載の測定試薬。
  23. 　不溶性担体上に固定化された請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。
  24. 　不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質、及び、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。
  25. 　さらに、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原を含む、請求項２１に記載の測定試薬。
  26. 　コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、請求項２５に記載の測定試薬。
  27. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法。
  28. 　以下の工程を含む、請求項２７に記載の精製方法。
    （１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧと抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
    （２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧを遊離させる工程；
    （３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧを回収する工程。
  29. 　抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体上に固定化されている、請求項２７又は２８に記載の精製方法。
  30. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体。
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