WO2017221910A1 - 新規スギ花粉タンパク質 - Google Patents

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cedar
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seq
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年弘 長田
悠喜 田中
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Taiho Pharmaceutical Co Ltd
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Taiho Pharmaceutical Co Ltd
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • Pollenosis is an allergic disease that develops by inhaling pollen scattered in the air and presents symptoms such as allergic conjunctivitis such as itching and pain in the eyes, rhinitis, skin inflammation or asthma.
  • Many plants that cause hay fever are known, but the most common hay fever in Japan is cedar pollinosis (allergic disease caused by cedar pollen).
  • cedar pollinosis allergic disease caused by cedar pollen.
  • the prevalence of cedar pollinosis is estimated to be 19.4% as of 2001 (Non-patent Document 1), and it is estimated that at least 20 million people suffer from cedar pollinosis. It is no exaggeration to say that it is a national illness.
  • Non-Patent Document 2 Japanese cedar pollinosis patients is expected to increase easily in the future, and there is a risk of damaging the health of the Japanese people.
  • Non-patent Document 3 it has been reported that the prevalence of cedar pollinosis increased 2.6 times from 1980 to 2000.
  • Cry j 1, Cry j 2, and Cry j 3 have been reported as main cedar pollen allergens related to the development of Japanese cedar pollinosis (Non-Patent Documents 4, 5, and 6), and in particular, Cry j 1 Standardized Japanese cedar pollen extract (Non-patent Document 7) based on them has been developed for Cry j 2, and allergen immunotherapy for Japanese cedar pollinosis has been carried out in Japan.
  • Non-patent Document 8 there are also groups of patients who do not succeed in allergen immunotherapy. It has been suggested that there is a novel allergen that has not yet been identified in Japanese cedar pollen (Non-patent Document 8), and a novel novel allergen protein for the purpose of more useful immunotherapy for Japanese cedar pollinosis Is required.
  • the present invention relates to providing a novel cedar pollen protein, a diagnostic agent, a preventive agent, a therapeutic agent and the like for allergic diseases caused by cedar pollen using the same.
  • cedar pollen protein of the present invention is a protein selected from the following (a) to (c).
  • A a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • b consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • Protein having pollen allergen activity c
  • a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having cedar pollen allergen activity
  • the cedar pollen protein of the present invention comprises a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the above (b)) is included.
  • the cedar pollen protein which consists of such an amino acid sequence the isoform of the cedar pollen protein which has an amino acid sequence shown by sequence number 2, etc. are mentioned, for example.
  • the several amino acids to be deleted, substituted or added mean, for example, 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids.
  • the above addition or deletion includes addition or deletion of 1 to several amino acids at both ends. Specific examples of isoforms include deletion of 4 residues at the C-terminus.
  • the cedar pollen protein of the present invention has 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 when the corresponding sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is appropriately aligned as long as it has cedar pollen allergen activity.
  • Proteins consisting of proteins having the same identity ((c) above) are included.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • a basic local alignment search tool at the National Center for Biological Information (BLAST) is used, and a method of calculating an optional parameter with an initial setting value can be applied.
  • cedar pollen protein of the present invention may form a fusion with a sequence useful for purification such as multiple histidine residues, a protein for ensuring stability during recombinant production, and the like.
  • Polynucleotide encoding cedar pollen protein encodes the above cedar pollen protein, and preferably (d) a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, (e) SEQ ID NO: A polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by 1 under stringent conditions and encodes a protein having cedar pollen allergen activity, (f) represented by SEQ ID NO: 1 Examples thereof include a polynucleotide that encodes a protein consisting of a base sequence having 90% or more identity with the base sequence and having cedar pollen allergen activity.
  • polynucleotides (e) and (f) include variants of the polynucleotide (d). Such variants include naturally occurring allelic variants and non-naturally occurring variants that can be generated using mutagenesis techniques well known in the art.
  • the polynucleotide of the present invention includes not only double-stranded DNA but also various single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the DNA.
  • the antisense strand can be used as a probe or the like.
  • DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning, chemical synthesis techniques, or a combination thereof.
  • a nucleotide sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence) is added to the polynucleotide according to the present invention. It may be.
  • the stringent conditions include, for example, conditions described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition, J. Sambrook et. Al, 1989). That is, in a solution containing 6 ⁇ SSC (composition of 1 ⁇ SSC: 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA. Examples of the conditions include hybridization with a probe at 65 ° C. for 8 to 16 hours. Further, the identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferably 95% or more, more preferably 98% or more. For the identity of the base sequence, for example, a method of using BLAST and calculating an optional parameter with an initial setting value can be applied.
  • polynucleotide variants include, for example, the 4th a of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is g, the 898th t is c, the 1029th g is a, and the 1643th t is a. Are each mutated.
  • the polynucleotide encoding a cedar pollen protein of the present invention can be cloned from a cedar pollen.
  • a cloning method known means such as a shotgun method and a PCR method can be used. The method of using it is mentioned.
  • a probe that specifically hybridizes with a part of the base sequence of the polynucleotide of the present invention may be prepared, and a genomic DNA library or cDNA library may be screened using the probe.
  • any probe having any sequence and length may be used as long as it specifically hybridizes to at least part of the polynucleotide according to the present invention or its complementary strand.
  • the method of synthesizing a polynucleotide artificially is mentioned. (Kosuri S et. Al., Nature Methods 11, 499-507, 2014)
  • the polynucleotide of the present invention can also be obtained by obtaining a sequence that hybridizes to a polynucleotide containing a part or all of the polynucleotide of the present invention using an appropriate principle. Examples thereof include a PCR method using a polynucleotide containing a part of the polynucleotide of the present invention as a primer, and a method using a polynucleotide containing a part of the polynucleotide of the present invention as a probe.
  • primers are prepared from the 5 ′ side and 3 ′ side sequences (or their complementary sequences) of the polynucleotide of the present invention, and genomic DNA ( Alternatively, by performing an amplification reaction such as PCR using cDNA) as a template and amplifying a DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide can be obtained.
  • amplification means such as PCR
  • the polynucleotide provided by the present invention can also be prepared by modifying the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 by a method such as planned or random mutagenesis.
  • the design of the mutation when introducing the mutation systematically can be performed, for example, by taking into account the characteristic sequence on the polynucleotide sequence.
  • methods for randomly introducing mutations include a PCR method and a mutagen treatment method.
  • site-directed mutagenesis can be mentioned, and more specifically, for example, using Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit (Takara Bio) etc. Can do.
  • the recombinant PCR method (PCR protocols, Academic Press, New York, 1990) can also be used.
  • cedar pollen protein of the present invention can be obtained by separating and purifying from cedar pollen.
  • the separation and purification method is not particularly limited.
  • the cedar pollen extract may be separated and purified using a conventionally known method such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like.
  • the host is not particularly limited as long as it is a living cell that can be transformed. Examples include animal cells, plants, or plant-derived cells.
  • the vector for inserting the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is replicable in the above-mentioned host, and can be appropriately determined according to the type of host to be introduced, the introduction method, and the like.
  • plasmid DNA, phage DNA, viral vector and the like can be mentioned.
  • the vector DNA used for the construction of the expression vector a widely spread and easily available DNA is used.
  • Examples include pUC19 (Takara Bio), pTV118N (Takara Bio), pMAMneo (Clontech), pGEX (GE Healthcare), pET160 (Invitrogen), pDEST (Invitrogen), pIEx (Merck Millipore), pBacPAK (Clontech), etc. .
  • virus vectors examples include baculovirus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors such as human immunodeficiency virus (HIV), adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors (AAV vectors), herpes viruses, vaccinia viruses, Examples thereof include DNA viruses and RNA viruses such as poxvirus, poliovirus, sinbisvirus, Sendai virus, and simian virus-40 (SV-40).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • AAV vectors adeno-associated virus vectors
  • herpes viruses examples thereof include DNA viruses and RNA viruses such as poxvirus, poliovirus, sinbisvirus, Sendai virus, and simian virus-40 (SV-40).
  • a protoplast method, a competent cell method, an electroporation method, or the like can be used.
  • the obtained transformant may be cultured under suitable conditions using a medium containing an assimilating carbon source, nitrogen source, metal salt, vitamin and the like.
  • the cedar pollen protein of the present invention can be obtained from the culture solution thus obtained by collecting and purifying the protein by a general method. For example, when Escherichia coli is used as the host, the methods described in pET System Manual, 10th edition (Novagen), etc. may be mentioned.
  • the cedar pollen protein of the present invention becomes a preventive or therapeutic agent for allergic disease caused by cedar pollen, and is administered to a human (patient) in need thereof. It can be used to prevent or treat allergic diseases caused by pollen.
  • allergic diseases caused by cedar pollen include allergic diseases caused by a specific antigen of cedar pollen. Specifically, for example, atopic bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopy Include dermatitis.
  • Such an agent for preventing or treating allergic diseases caused by cedar pollen can be used, for example, as a desensitizing therapeutic agent for allergic diseases caused by cedar pollen.
  • the cedar pollen protein of the present invention is reported as the main cedar pollen allergens related to the development of cedar pollinosis CryCj 1, Cry j 2, Cry j No homology with Cry j 1, Cry j 2, or Cry j 3, which is considered to be a protein different from the previously known ones. Become.
  • the cedar pollen protein of the present invention is used as it is or dried to form a powder, or as required.
  • conventional additives such as adjuvants and various additives such as stabilizers, excipients, solubilizers, emulsifying agents, buffering agents, soothing agents, preservatives, coloring agents, etc.
  • powdered purified cedar pollen protein can be dissolved in physiological saline supplemented with phenol and used as a stock solution for antigen for desensitization treatment.
  • the preventive or therapeutic agent for allergic diseases caused by cedar pollen of the present invention can be carried out by a usual administration route such as transdermal, oral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal administration. Furthermore, it can also be used as transdermal, transmucosal drugs such as lozenges, sublingual tablets, eye drops, intranasal sprays, poultices, creams, lotions and the like.
  • the dose and frequency of administration of the preventive or therapeutic agent for allergic diseases caused by cedar pollen of the present invention vary depending on the administration route, symptoms, etc., but for example, it is in the range of about 0.1 to 1000 ⁇ g per adult.
  • the dose is appropriately selected and administered once to several times a week.
  • the cedar pollen protein of the present invention becomes a diagnostic agent for allergic diseases caused by cedar pollen and can be used to diagnose allergic diseases caused by cedar pollen.
  • a diagnostic agent for allergic diseases caused by cedar pollen is used, for example, as a skin reaction diagnosis for allergic diseases caused by cedar pollen, that is, as an intradermal test or prick test reagent.
  • diagnosis using patient serum or plasma is possible by preparing a specific IgE antibody test reagent.
  • the cedar pollen protein of the present invention When used as a diagnostic reagent for skin reaction, the cedar pollen protein of the present invention obtained by the above-described method is used, for example, by drying to form a powder, which is dissolved in physiological saline containing phenol or glycerin and diluted. .
  • IgE antibody test reagent IgE antibody in a patient sample is bound to the cedar pollen protein of the present invention in an aqueous phase or solid phase, and based on the principle of Fluoro enzyme immunoassay, Chemiluminescence enzyme immunoassay, enzymeme immunoassay, etc.
  • a detection method is not limited to these.
  • the antibody to the cedar pollen protein of the present invention is an antibody that can specifically bind to the cedar pollen protein of the present invention.
  • the above antibody means an immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fc fragment), for example, polyclonal antibody, monoclonal antibody, single chain antibody, anti-antibody Examples include, but are not limited to, idiotype antibodies and humanized antibodies.
  • the antibody can be produced using various known methods, and the production method is not particularly limited.
  • the above antibody can be used for identification of an organism expressing the cedar pollen protein of the present invention, or a tissue or cell thereof. For example, it can be used to measure the presence or absence of cedar pollen protein in the atmosphere, indoor space, or human mucous membrane. The measurement can be performed by a known immunological method, for example, by the ELISA method.
  • EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by these Examples.
  • Example 1 Rough purification of new cedar pollen protein ⁇ Rough purification of cedar pollen protein> To 2 g of cedar pollen, 50 mL of an extraction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 9.0) was added and subjected to ultrasonic crushing for 10 minutes. Subsequently, after mixing at room temperature for 10 minutes, the supernatant was obtained by centrifugation (10,000 g, 10 minutes). The supernatant was further ultracentrifuged (50,000 g, 60 minutes), and the supernatant was recovered.
  • an extraction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 9.0
  • the supernatant was removed by centrifugation (1,000 g, 10 minutes), and the protein adsorbed on the resin was eluted.
  • the same procedure was carried out using 0.025 M NaCl-containing extraction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 9.0), 0.05 M NaCl-containing extraction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 9.0), and 0.1 M NaCl-containing extraction buffer (20 mM Tris).
  • the gel in the vicinity of the molecular weight 70 kDa band was chopped, and the pieces were combined and washed with water and acetonitrile, and subjected to alkylation treatment with DTT and iodoacetamide. Subsequently, trypsin was added to the sample, and a hydrolysis reaction was performed by incubating at 37 ° C. for 16 hours. After the reaction, peptides were extracted from the gel pieces using 25 mM ammonium bicarbonate, 5% formic acid, and acetonitrile. Finally, the extraction solution was dried under reduced pressure.
  • the dried sample is dissolved in a solvent consisting of water, acetonitrile and trifluoroacetic acid (volume ratio 98: 2: 0.1), and LC-MS / MS system (Paradigm MS4 (Michrom Bioresources), MS / MS: LTQ OrbiTrap XL mass spectrometer (ThermoFisher)).
  • Example 2 Preparation of purified recombinant protein ⁇ Extraction of cedar total RNA> 2 g of cedar male flowers (buds) frozen and ground in liquid nitrogen were added to and mixed with a 50 mL tube containing 25 mL of Plant RNA Isolation Reagent (Invitrogen), and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. After centrifugation at 2 ° C. (2600 ⁇ g, 5 minutes), the upper layer was filtered through a mesh having a mesh size of 100 ⁇ m by decanting. Subsequently, 1 / 5-fold amount of 5M NaCl and 3 / 5-fold amount of chloroform were added to the collected filtrate. After centrifugation at 2 ° C.
  • Plant RNA Isolation Reagent Invitrogen
  • RNA pellet was washed with 10 mL of 75% ethanol. Furthermore, after centrifugation at 2 ° C. (2600 ⁇ g, 5 minutes), after removing the supernatant, the total RNA was dried at room temperature and then dissolved in 200 ⁇ L of RNase free water.
  • DNase treatment was performed using RNase-Free DNase Set (Qiagen). Specifically, 15 ⁇ L Buffer RDD and 5 ⁇ L DNase I stock solution were added to 180 ⁇ L of the total RNA solution supernatant and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Subsequently, total RNA was cleaned up using RNeasy mini kit (Qiagen). That is, after DNase treatment, 700 ⁇ L of Buffer RLT and 500 ⁇ L of ethanol were added to 200 ⁇ L of the sample, and then added to the column attached to the RNeasy mini kit and centrifuged (8000 ⁇ g, 15 seconds).
  • RNeasy mini kit Qiagen
  • CDNA was synthesized from the obtained clean-up total RNA using Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). 2 ⁇ g of total RNA was dissolved in 8 ⁇ L of purified water, 1 ⁇ L of 50 ⁇ M oligo (dT) 20 and 1 ⁇ L of 10 mM dNTP were added, and incubated at 65 ° C. for 5 minutes.
  • a primer set used for cloning was designed and subjected to the following examination. That is, in order to obtain the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1, using cedar cDNA as a template, Primer 1 (GATTTCATGRCAGCGACAG: SEQ ID NO: 3) as a sense primer and downstream Primer 2 (CATGRCAGCGACAGSGAT: SEQ ID NO: 4), as an antisense primer Nested PCR was performed by KOD Fx Neo (TOYOBO) using Primer 3 (TCAAAGTTGATGCAACAATTG: SEQ ID NO: 5). The PCR product was purified by Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the purified PCR product was incorporated into pCR 2.1-TOPO TA Vector using the TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Thermo Fischer) kit to prepare a vector containing the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1.
  • Recombinant protein with a Flag tag added to the C-terminus of the primary amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (excluding amino acids from the 1st to 26th positions, which is presumed to be the signal sequence portion), was added to the SysCex Corporation ProCube (registered trademark) service. Then, it was carried out according to the method of JP 2014-195411 A. That is, the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 from the vector prepared above (excluding the 1-78th polynucleotide encoding the 1-26 amino acid presumed to be the signal sequence portion) is used as the silkworm expression signal sequence.
  • FIG. 1 shows the result of SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein.
  • Example 3 Confirmation of Allergen Activity of Purified Recombinant Protein
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated from 30 mL of peripheral blood obtained from a Japanese cedar pollinosis patient (ImmunoCAP score ⁇ 2). Suspended in RPMI-1640 medium with activated autologous plasma to 1.11 ⁇ 10 6 cells / mL. The prepared cell suspension (180 ⁇ L) and 20 ⁇ L of the recombinant protein solution of the present invention (concentration: 100 ⁇ g / mL) were seeded in a 96-well plate (2 ⁇ 10 5 cells / well). After culturing at 37 ° C.
  • FIG. 2 shows the result of calculating the value obtained by dividing the 3 H-thymidine incorporation amount when the purified recombinant protein was added by the incorporation amount when the purified recombinant protein was not added as a stimulation index.
  • a stimulation index of 1.8 or higher is regarded as a positive standard (Shigeyuki Uchida et al., Liver Vol. 30, No. 4, 439-443, 1989). By following this criterion, 3 out of 4 cases (75%) were judged positive. From the above results, it was shown that the recombinant protein of the present invention was frequently sensitized at the T cell level in patients with cedar pollinosis.
  • Basophils stimulated and activated by allergens are known to enhance CD203c expression (De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146: 177-189, 2008).
  • Basophil activation in the blood of cedar pollinosis patients (ImmunoCAP score ⁇ 2) or healthy subjects (ImmunoCAP score ⁇ 2) was analyzed using an Allergenicity kit (Beckman Coulter) based on this principle.
  • 20 ⁇ L of the recombinant protein solution of the present invention was added to 100 ⁇ L of heparin-collected whole blood to a final concentration of 3 ⁇ g / mL, and 20 ⁇ L of PBS ( ⁇ ) was added to the negative control sample. Subsequently, 20 ⁇ L of an antibody cocktail containing CD3-PC7, CRTH2-FITC and CD203c-PE was added to all the samples and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 100 ⁇ L of the reaction stop solution and 2 mL of hemolytic fixative were added and reacted at room temperature for 10 minutes.
  • the data show the ratio of CD203c positive basophils (%) in each negative control sample from the ratio of CD203c positive basophils (%) in the protein solution-stimulated sample of the present invention, 1.6 or more, which is twice the maximum value of 0.8% in healthy subjects The value of was determined as positive.
  • FIG. 3 in 2 of 2 healthy subjects, enhanced expression of CD203c was not observed when recombinant protein was added, whereas in 7 cases (54%) of 13 patients with cedar pollinosis CD203c expression was enhanced and the difference was significant (p ⁇ 0.05, Welch's t test). Therefore, it was shown that cedar pollinosis patients frequently have IgE binding to the recombinant protein of the present invention, and that the recombinant protein of the present invention has allergen activity.

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Abstract

新規なスギ花粉タンパク質、及びそれを用いたスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等の提供。　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質

Description

新規スギ花粉タンパク質
　本発明は、スギ花粉に由来する新規なタンパク質、及び該タンパク質の利用に関する。
　花粉症は、空中に飛散している花粉を吸入することにより発症し、眼のかゆみや痛み等のアレルギー性結膜炎、鼻炎、皮膚の炎症あるいは喘息等の症状を呈するアレルギー疾患である。花粉症の原因となる植物は数多く知られているが、日本でもっとも多い花粉症はスギ花粉症（スギ花粉を原因とするアレルギー疾患）である。２００３年の報告では、スギ花粉症の有病率は２００１年時点で１９．４％と推定されており（非特許文献１）、少なくとも２０００万人以上がスギ花粉症に苦しんでいることが推定され、国民病と言っても過言ではない。
　スギ花粉症のさらに深刻な問題のうちの一つに、スギ花粉飛散量の経年増加が挙げられる。スギ花粉の飛散量は花粉飛散期前年の夏季の平均気温に正の相関することが知られており、日本の平均気温の上昇に伴い、スギ花粉飛散量が年々増加していることが報告されている（非特許文献２）。それに伴い、今後もスギ花粉症患者の増加が容易に予想され、日本国民の健康を損なう恐れがある。実際、３８報を用いたメタアナリシスの結果によると１９８０年から２０００年にかけてスギ花粉症有病率は２．６倍に上昇したことが報告されている（非特許文献３）。
　これらスギ花粉症治療には抗ヒスタミン薬等の使用をはじめとした一連の対症療法が用いられているが、スギ花粉症の根治が期待できる唯一の治療法として、アレルゲン免疫療法（減感作療法）が期待されている。これは、アレルギー疾患の原因となるアレルゲンを皮下や舌下等に投与することにより、アレルギー症状の緩和を期待する治療法である。これらアレルゲン免疫療法の開発や、その治療効果の向上には原因アレルゲンの特定とその理解が欠かせない。
　スギ花粉症の発症に関連する主なスギ花粉アレルゲンとして、これまでにCry j 1、Cry j 2、Cry j 3が報告されており（非特許文献４、５、および６）、特にCry j 1、およびCry j 2はそれらを主成分とした標準化スギ花粉エキス（非特許文献７）が開発され、日本におけるスギ花粉症に対するアレルゲン免疫療法が実施されてきた。しかしながら、アレルゲン免疫療法が奏功しない患者群も存在する。スギ花粉中にはいまだ同定されていない新規アレルゲンが存在することが示唆されており（非特許文献８）、より有用性の高いスギ花粉症の免疫療法を目的とした、特徴的な新規アレルゲンタンパク質が求められている。
Okuda M，Ann Allergy Asthma Immunol. ，91:288-296，2003 Yamada T, et al., J Allergy Clin Immunol., 133:632-639, 2014 Kaneko Y, et al., Int Arch Allergy Immunol., 136:365-371, 2005 Yasueda H, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 71:77-86, 1983 Sakaguchi M, et al., Allergy, 45:309-312, 1990 Fujimura T, et al., Allergy, 62:547-553, 2007 Yasueda H, et al., Allergol. Int., 46:135-140, 1997 Fujimura T, et al., Int Arch Allergy Immunol., 133:125-135, 2004
　本発明は、新規なスギ花粉タンパク質、及びそれを用いたスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等を提供することに関する。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく検討したところ、スギ花粉粗抗原から、スギ花粉症患者由来のリンパ球ならびに血清中ＩｇＥと高い反応性を示す新たなタンパク質を発見し、これがスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、又は治療薬として有用であることを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の１）～１３）に係るものである。
　１）以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　２）以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　３）以下の（ｄ）～（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、スギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
　４）上記１）のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
　５）上記１）のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
　６）上記１）のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
　７）モノクローナル抗体である上記６）のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
　８）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、上記１）のスギ花粉タンパク質の使用。
　９）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、上記１）のスギ花粉タンパク質の使用。
　１０）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、上記１）のスギ花粉タンパク質。
　１１）スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、上記１）のスギ花粉タンパク質。
　１２）上記１）のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
　１３）上記１）のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
　本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬、予防薬、及び治療薬等に利用することができる。当該スギ花粉タンパク質は、Cry j 1、Cry j 2、その他既知スギ花粉タンパク質とは相同性を持たないアミノ酸一次配列を有することから、これらと組み合わせることによって、より有用な減感作治療が可能となる。
精製したリコンビナントスギ花粉タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した図である。 スギ花粉症患者(ImmunoCAP Score≧2)４名の末梢血単核細胞を用いて、精製リコンビナントタンパク質添加による増殖反応を測定した結果を示す図である。 スギ花粉症患者(ImmunoCAP Score≧2)１３名の末梢血中の好塩基球が、精製リコンビナントタンパク質により活性化されCD203cの発現が増強した一方、健常者(ImmunoCAP Score＜2)２名の末梢血中の好塩基球ではCD203cの発現が変化しないことを示したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
スギ花粉タンパク質
　本発明のスギ花粉タンパク質は、以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるタンパク質である。
　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
　本発明のスギ花粉タンパク質には、スギ花粉アレルゲン活性を有する限り、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（上記（ｂ））が包含される。このようなアミノ酸配列からなるスギ花粉タンパク質としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するスギ花粉タンパク質のアイソフォーム等が挙げられる。
　ここで、欠失、置換又は付加される数個のアミノ酸とは、例えば１～１０個、さらに好ましくは１～５個のアミノ酸を意味する。また、上記の付加又は欠失には、両末端への１～数個のアミノ酸の付加や欠失が含まれる。
　アイソフォームの具体例としては、例えば、Ｃ末端の４残基の欠失が挙げられる。
　ここで、「スギ花粉アレルゲン活性」とは、肥満細胞上のＩｇＥと結合し、アトピー性のヒトに即時型アレルギー反応を引き起こす活性（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）のみならず、単に血清中のＩｇＥと結合する活性が包含される。ＩｇＥと結合する活性は、国際公開第２０１２／１０５５４１パンフレット等に記載の手法で測定できる。
　また、本発明のスギ花粉タンパク質には、スギ花粉アレルゲン活性を有する限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質からなるタンパク質（（上記（ｃ））が包含される。
　ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該アミノ酸配列の同一性は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）を使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
　また、本発明のスギ花粉タンパク質は、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保するためのタンパク質等との融合体を形成してもよい。
スギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド
　本発明のポリヌクレオチドは、上記スギ花粉タンパク質をコードするものであり、好適には、（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｆ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｅ）及び（ｆ）のポリヌクレオチドには、（ｄ）のポリヌクレオチドの変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
　本発明のポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各種１本鎖ＤＮＡやＲＮＡをも包含する。アンチセンス鎖は、プローブ等として利用可能である。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドに対し、本発明にかかるポリペプチドをコードする塩基配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列が付加していてもよい。
　ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual (Second Edition, J.Sambrook et.al, 1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
　また、配列番号１で示される塩基配列との同一性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。当該塩基配列の同一性は、例えばBLASTを使用し、オプションパラメータを初期設定値で計算する方法が適用できる。
　上記ポリヌクレオチドの変異体としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列の４番目のaがgに、８９８番目のtがcに、１０２９番目のｇがａに、１６４３番目のｔがaに、それぞれ変異したものが挙げられる。
スギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得
　本発明のスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、スギ花粉からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
　例えば、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、当該プローブを用いてゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行えばよい。このようなプローブとしては、本発明にかかるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いかなる配列および長さのものを用いてもよい。また人工的にポリヌクレオチドを合成する方法が挙げられる。(Kosuri S et. al., Nature Methods 11, 499-507, 2014)
　また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。例えば、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が挙げられる。
　例えば、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法は、本発明のポリヌクレオチドの５'側および３'側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等の増幅反応を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、当該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
　また、本発明で提供するポリヌクレオチドは、例えば、計画的な若しくはランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを改変することにより作製することもできる。
　ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、ポリヌクレオチド配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。また、ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ法(PCR protocols,Academic Press,New York,1990)を用いることもできる。
スギ花粉タンパク質の製造
　本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉から分離精製することにより得ることができる。分離精製方法は特に限定されるものではないが、例えば、スギ花粉抽出液をゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等の従来公知の手法を用いて分離・精製すればよい。
　また、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込むことにより作製された組換えベクターを宿主細胞に導入して、スギ花粉タンパク質を細胞内或いは細胞外に発現させて、採取することが可能である。
　宿主としては、形質転換が可能な生細胞であれば特に限定されず、例えば大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母や糸状菌等の真菌類、Ｓｆ９細胞等の昆虫培養細胞、カイコ等の昆虫、動物細胞、植物又は植物由来細胞等が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、上記の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。
　例えば、プラスミド DNA、ファージDNA、ウイルスベクター等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターDNAは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pUC19（タカラバイオ）、pTV118N （タカラバイオ）、pMAMneo（クロンテック）、pGEX（GEヘルスケア）、pET160（Invitrogen）、pDEST（Invitrogen）、pIEx（メルクミリポア）、pBacPAK（クロンテック）等が挙げられる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が挙げられる。
　当該組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によってタンパク質の採取、精製を行い、本発明のスギ花粉タンパク質を得ることができる。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合は、pET System Manual, 10th edition (Novagen) に記載の方法等が挙げられる。
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤
　本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤となり、それを必要とするヒト（患者）に投与してスギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するために使用できる。
　ここで、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患としては、スギ花粉の特異抗原が原因となるあらゆるアレルギー疾患が挙げられ、具体的には、例えばアトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
　斯かるスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、例えば、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患に対する減感作療法剤として用いることができる。
　本発明のスギ花粉タンパク質は、GENETYX Ver.12を用いたアミノ酸相同性解析の結果、スギ花粉症の発症に関連する主なスギ花粉アレルゲンとして報告されているCry j 1、Cry j 2、Cry j 3との相同性は見られず、従来公知のCry j 1、Cry j 2、Cry j 3とは異なるタンパク質であると考えられ、これらと組み合わせることによって、より有用な減感作治療が可能となる。
　本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を減感作治療剤として用いる場合、本発明のスギ花粉タンパク質をそのまま、或いは乾燥して粉末状とし、又は必要に応じて一般的に用いられるアジュバントや各種の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
　例えば、粉末状の精製されたスギ花粉タンパク質を、フェノールを添加した生理食塩水に溶解し、減感作治療用抗原の原液として用いることができる。
　本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤は、通常の投与経路例えば経皮、経口、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等の投与方法により行うことができる。更に、例えば、トローチ、舌下錠、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、クリーム剤、ローション剤等の経皮、経粘膜薬としても使用することができる。
　本発明のスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤の投与量及び投与回数は、投与経路、症状などに応じて異なるが、例えば、成人１回あたり約0.1～1000μgの範囲となるように適宜選択し、毎週１から数回程度投与される。
スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断
　本発明のスギ花粉タンパク質は、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬となり、スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するために使用できる。
　斯かるスギ花粉を原因とするアレルギー疾患診断薬は、例えばスギ花粉を原因とするアレルギー疾患に対する皮膚反応診断、すなわち皮内テスト又はプリックテスト試薬等として用いられる。加えて、特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬を調製することで患者血清または血漿を用いた診断が可能である。（鼻アレルギー診療ガイドライン－通年性鼻炎と花粉症－2013年版、株式会社ライフ・サイエンス）
　皮膚反応診断試薬として用いる場合、前記の方法により取得された本発明のスギ花粉タンパク質を、例えば乾燥して粉末状とし、これをフェノールまたはグリセリンを含む生理食塩水に溶解し、希釈して用いられる。特異的ＩｇＥ抗体検査用試薬としては、水相中または固相上で本発明のスギ花粉タンパク質に患者検体中のＩｇＥ抗体を結合させ、Fluoro enzyme immunoassay、Chemiluminescence enzyme immunoassay、enzyme immunoassay等の原理に基づき検出する方法が挙げられるが、検出方法はこれらに限定されない。
スギ花粉タンパク質に対する抗体
　本発明のスギ花粉タンパク質に対する抗体は、本発明のスギ花粉タンパク質と特異的に結合することができる抗体である。上記抗体とは免疫グロブリン(IgA、IgD、IgE、IgG、IgMおよびこれらのFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fcフラグメント）を意味し、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
　上記抗体は、種々の公知の方法を用いて作製することができ、作製方法は特に限定されるものではない。
　上記抗体は、本発明のスギ花粉タンパク質を発現する生物体またはその組織もしくは細胞の同定などに利用することができる。例えば、大気中や屋内の空間またはヒトの粘膜におけるスギ花粉タンパク質の有無等を測定するために利用することができる。該測定は公知の免疫学的方法により行うことができ、例えばELISA法により行うことができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１　新規スギ花粉タンパク質の粗精製
＜スギ花粉タンパク質の粗精製＞
　2gのスギ花粉に抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)50mLを加え、10分間超音波破砕を行った。続いて室温にて10分間混和した後、遠心(10,000g、10分)して上清を得た。この上清をさらに超遠心分離(50,000g、60分)し、上清を回収した。この上清17mLに対し、抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)で平衡化させたQ sepharose high performance樹脂 (GEヘルスケア)懸濁液を等量加え、30分間室温で振盪させた。遠心分離により(1,000g、10分)上清を除去後、抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)にて50mLまでメスアップし、転倒混和後、再度遠心分離することで樹脂を洗浄した。続いて、洗浄した樹脂に0.0125M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)を10mL加え、5分間室温で振盪させた。遠心分離(1,000g、10分)により上清を除去し樹脂に吸着したタンパク質を溶出させた。同じ操作を、0.025M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、 0.05M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)、0.1M NaCl含有抽緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.2M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.4M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0) 、0.6M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)で繰り返した。最後に、0.6M NaCl含有抽出緩衝液(20mM Tris-HCl、pH9.0)を用いて溶出させたタンパク質溶液を粗精製液として回収した。
＜部分内部アミノ酸配列の同定＞
　回収した粗精製液を、100,000MWCOスピンカラムにて濃縮操作を行った。濃縮したサンプルに対し、Novex（登録商標） NuPAGE（登録商標） SDS-PAGE system（invitrogen）の一般的なプロトコルを用いて還元及びSDS-PAGEを行った。電気泳動後のSDS-PAGEゲルは、SilverQuest（登録商標） Silver Staining Kit（ThermoFisher）の標準プロトコルを用いて銀染色した。続いて本発明タンパク質内部の部分アミノ酸配列を明らかにするために、プロテアーゼにより限定分解して得られる断片の解析を行った。即ち、分子量70 kDaバンド付近のゲルを細断後、細片をまとめて水及びアセトニトリルで洗浄し、DTT及びヨードアセトアミドによるアルキル化処理に供した。続いてサンプルにトリプシンを加え、37℃で16時間保温して加水分解反応を行った。反応後、25 mM 重炭酸アンモニウム、5%ギ酸、及びアセトニトリルを用いてゲル片からペプチドを抽出した。最後に抽出溶液を減圧下で乾燥した。乾燥済みのサンプルを、水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸からなる溶媒（体積比 98:2:0.1）に溶解させ、LC-MS/MSシステム（Paradigm MS4（Michrom Bioresources社）、MS/MS： LTQ OrbiTrap XL質量分析計（ThermoFisher））にて分析した．カラムは分析用 C18 カラム L-Column Micro(化学物質評価研究機構）を、移動相A（[水]：[アセトニトリル]：[ギ酸]  =  98:2:0.1（体積比））及び移動相B（ [水]：[アセトニトリル]：[ギ酸]  =  5:95:0.1（体積比））を選択した．サンプルを添加後、アセトニトリル送液勾配（分, %B）： (0, 5) → (20, 35) → (25, 90) → (30, 90) → (30.01, 5) → (40, 5)条件で溶出、分画し、MS/MSにてペプチド分子量を測定した。得られた分子量はMascot（Matrix Science）ソフトウェアを用いてペプチド配列を決定した。その結果、部分配列WIVDEATGLRが得られた。
実施例２　精製リコンビナントタンパク質の調製
＜スギtotal RNAの抽出＞
　液体窒素中で凍結粉砕したスギ雄花（葯）2gを、Plant RNA Isolation Reagent (Invitrogen)25mLが入っている50mLチューブに添加して混和した後、室温にて５分間静置した。
　4℃にて遠心(2600 x g、5分)の後、上層をデカントにより網目サイズ100μmのメッシュで濾過した。続いて回収した濾液に１／５倍量の5M NaClと３／５倍量のクロロホルムを加えた。4℃にて遠心(2600 x g、30分)の後、上層20mLを回収し、９／１０倍量のイソプロピルアルコールを加え、撹拌した。室温にて10分間静置した後、4℃にて遠心(2600 x g、30分)し、RNAを沈殿させた。上清を除去後、RNAペレットに75%エタノール10mLを加えて洗浄した。さらに4℃にて遠心(2600 x g、5分)の後、上清除去後Total RNAを室温で乾燥してから、200μLのRNase free waterに溶解させた。室温にて遠心(12000 x g、3分)後、RNase-Free DNase Set（キアゲン）を用いてDNase処理を行った。すなわちTotal RNA溶液上清180μLに15μL Buffer RDD、5μL DNase I stock solutionを加え室温にて10分間静置させて実施した。続いてRNeasy mini kit（キアゲン）を用いてtotal RNAのクリーンアップを実施した。すなわち、DNase処理後サンプル200μLに700μLのBuffer RLT、500μLのエタノールを添加後，RNeasy mini kit添付のカラムに添加し遠心(8000x g、15秒)した。
　続いて、カラムに500μLのBuffer RPEを加え室温にて遠心(8000x g、15秒)し，本操作を2回繰り返した。次に、30μLのRNase free waterをカラムに加え室温にて遠心(8000x g、1分)し、得られた溶液をクリーンアップ済みtotal RNAとして回収した。
　＜スギcDNAの作製＞
　得られたクリーンアップ済みtotal RNAから、Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてcDNAを合成した。Total RNA 2μgを8μLの精製水に溶解し、50μM oligo(dT)20を1μL、10mM dNTPを1μL加えてから、65℃で5分間インキュベートした。サンプルを氷上で冷却した後、10X RT bufferを2μL、25mM MgCl2を4μL、0.1M DTTを2μL、RNaseOUT(40U/μL)を1μL、SuperScript III Reverse Transcriptaseを1μL加えて混和した。50℃で50分間インキュベートした後、85℃で5分間処理して反応を停止した。続いてサンプルにRNase Hを1μL加え37℃で20分間インキュベートすることで、スギcDNAとした。
　＜クローニング＞
　得られた部分配列WIVDEATGLRについて、GENETYX Ver.12.0.4ソフトウェアを用いてcDNA配列の推定を行い、ForestGEN (http://forestgen.ffpri.affrc.go.jp/ja/index.html)データベースにてホモロジー検索を行った。その結果、cluster ID: Cj5792がヒットした。さらにヒットしたCj5796の相同遺伝子であるVitis vinifera由来未同定タンパク遺伝子配列gi|157358255|emb|CAO65892.1| は、ForestGEN cluster ID: Cj822が含まれていることを見出した。加えて、Cj5792及びCj822はスギcDNAライブラリーBY882225.1、 BY900252.1とそれぞれ高い相同性を有していた。これら情報に基づき、クローニングに用いるプライマーセットをデザインし下記検討に供した。即ち、配列番号１で示すポリヌクレオチドを得るため、スギのcDNAを鋳型として、センスプライマーとしてPrimer 1(GATTTCATGRCAGCGACAG：配列番号３)及びその下流のPrimer 2(CATGRCAGCGACAGSGAT：配列番号４)、アンチセンスプライマーとしてPrimer 3(TCAAAGTTGATGCAACAATTG：配列番号５)を用いて、KOD Fx Neo(TOYOBO)によりnested PCRを行った。PCR産物をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)にて精製した。精製したPCR産物をTOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Thermo Fischer）キットを用いてpCR 2.1-TOPO TA Vectorに組み込み、配列番号1で示すポリヌクレオチドを含むベクターを作製した。
　＜リコンビナントタンパク質の精製＞
　配列番号２に示すアミノ酸一次配列（シグナル配列部分と推測される１－２６番目までのアミノ酸は除く）のＣ末端にFlagタグを付加したリコンビナントタンパク質を、シスメックス株式会社のProCube（登録商標）サービスにて、特開2014-195411公報の方法に従って実施した。すなわち、前述で作製したベクターから配列番号1で示すポリヌクレオチド（シグナル配列部分と推測される１－２６のアミノ酸をコードする１－７８番目までのポリヌクレオチドは除く）を、カイコ発現用シグナル配列を有し、FlagタグをC末端に融合発現するトランスファープラスミドに組換え、バキュロウイルスを作成後、カイコ蛹に接種後、7日目に得られた蛹を磨砕バッファー（20mM Trs-HCl, 100mM NaCl, Complete EDTA free 1錠/50mL, フェニルチオウレア）で磨砕した。磨砕物を超遠心後、上清を回収し、DDDDK-tagged Protein PURIFICATION GEL(MBL)を用いて添付文書に準じてアフィニティ精製することで、精製リコンビナントタンパク質を調製した。精製したリコンビナントタンパク質をSDS-PAGEにより解析した結果を図1に示す。
実施例３　精製リコンビナントタンパク質のアレルゲン活性確認
　(i) スギ花粉症患者リンパ球増殖応答
　スギ花粉症患者(ImmunoCAP score≧2)より得た末梢血30mLより末梢血単核細胞を単離し、10%非働化自己血漿入りRPMI-1640培地に1.11×106cells/mLとなるよう懸濁した。調製した細胞懸濁液180μLと、20μLの本発明のリコンビナントタンパク質溶液(濃度100μg/mL)を96 穴プレートに播種した(2×105cells/well)。37℃、5% CO2条件で3日間培養した後、3H-チミジンを添加し、16時間後までの取込量を放射活性として測定することにより細胞増殖を評価した。精製リコンビナントタンパク質添加時の3H-チミジン取込量を非添加時の取込量で除した値をStimulation indexとして算出した結果を、図2に示す。一般に、臨床検査におけるリンパ球刺激試験では、Stimulation index 1.8以上が陽性基準とされている（内田重行ら、肝臓　30巻4号439-443, 1989）。この基準に則ることにより、4例中3例（75%）が陽性と判定された。以上の結果より、スギ花粉症患者において高頻度に本発明のリコンビナントタンパク質にT細胞レベルで感作されていることが示された。
　(ii) スギ花粉症患者好塩基球の活性化
　アレルゲンで刺激され活性化された好塩基球では、CD203cの発現が増強することが知られている（De Weck, AL. et al., Int. Arch. Allergy Immunol., 146:177-189, 2008）。この原理に基づくAllergenicityキット(ベックマン・コールター)を用いて、スギ花粉症患者(ImmunoCAP score≧2)又は健常者 (ImmunoCAP score<2)血液中の好塩基球活性化を解析した。すなわち、ヘパリン採血した全血100μLに本発明のリコンビナントタンパク質溶液20μLを最終濃度 3 μg/mLとなるように加え、陰性対照サンプルにはPBS(-)20μLを加えた。続いて全てのサンプルにCD3-PC7，CRTH2-FITC及びCD203c-PEを含む抗体カクテル20μLを加え、37℃で15分間インキュベートした。反応停止液100μLと溶血固定液2mLを加え、室温で10分間反応させた。遠心(200 x g、5分)後、上清を除去し、リン酸緩衝液(PBS) 3mLを加えて再び遠心した。上清を除去後、細胞を0.1%ホルムアルデヒド加PBSに懸濁し、フローサイトメーター(FACScanto、BD Biosciences)により測定した。得られたデータについて、CD3-PC7陰性かつCRTH2-FITC陽性であることを指標として血球の中の好塩基球を選別し、CD203cの発現強度を解析した。データは、本発明タンパク質溶液刺激サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）から各陰性対照サンプルにおけるCD203c陽性好塩基球割合（％）を示し、健常者における最高値0.8%の2倍にあたる1.6以上の値を陽性と判定した。その結果、図3で示した通り健常者2例中2例にて、リコンビナントタンパク質添加時におけるCD203cの発現増強が認められなかった一方、スギ花粉症患者において13例中7例（54％）でCD203cの発現増強が認められ、その差は有意であった（p<0.05, Welch's t test）。従って、スギ花粉症患者は頻度よく本発明のリコンビナントタンパク質に結合するIgEを有しており、さらに本発明のリコンビナントタンパク質にアレルゲン活性があることが示された。

Claims (13)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質。
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
  2. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるスギ花粉タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
    　（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    　（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
    　（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質
  3. 　以下の（ｄ）～（ｆ）から選択されるポリヌクレオチド。
    　（ｄ）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
    　（ｅ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、スギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    　（ｆ）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つスギ花粉アレルゲン活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
  4. 　請求項１記載のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤。
  5. 　請求項１記載のスギ花粉タンパク質を有効成分とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬。
  6. 　請求項１記載のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
  7. 　モノクローナル抗体である請求項６記載のスギ花粉タンパク質に対する抗体。
  8. 　スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療剤を製造するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質の使用。
  9. 　スギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断薬を製造するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質の使用。
  10. 　スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を予防又は治療するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質。
  11. 　スギ花粉を原因とするアレルギー疾患を診断するための、請求項１記載のスギ花粉タンパク質。
  12. 　請求項１記載のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の予防又は治療方法。
  13. 　請求項１記載のスギ花粉タンパク質を患者に投与することを特徴とするスギ花粉を原因とするアレルギー疾患の診断方法。
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