WO2017171491A1 - 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition having a prophylactic or therapeutic effect of an inflammatory disease comprising a stem cell extract, and more particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease comprising a stem cell extract, using the pharmaceutical composition It relates to a method for preventing or treating an inflammatory disease, a food composition for improving an inflammatory disease comprising the stem cell extract and a cosmetic composition for preventing or improving an inflammatory skin disease comprising a stem cell extract.
  • Inflammation is a manifestation of normal and protective in vivo defense mechanisms that are localized to tissue damage caused by physical trauma, harmful chemicals, microbial infections or irritants in metabolites in vivo. This inflammation is triggered by various inflammatory mediators produced from damaged tissues and migrating cells. In normal cases, the living body restores normal structure and function by neutralizing or eliminating pathogens and regenerating upper and lower tissues through inflammatory reactions. Otherwise, the living body may progress to a disease state such as chronic inflammation. Among these, the pathological state of the abscess formed by the invasion of bacteria is called an inflammatory disease.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • UC ulcerative colitis
  • CD Crohn's disease
  • the pathogenesis of the inflammatory bowel disease is not yet known in detail, but it is known that abnormalities in immune function are involved. Immunological factors involved in this include innate immunity, cytokine production, activation of CD4, and the like. This is known. In particular, cytokines play an important role. Tumor nerosis cytokine (TNF- ⁇ ), Interluekin (IL) -1, IL-6, and IL-8 production at the site of inflammation are ulcerative Significantly increased in patients with colitis and Crohn's disease.
  • TNF- ⁇ Tumor nerosis cytokine
  • IL-6 Interluekin
  • IL-8 Interluekin
  • Drugs used to treat these inflammatory bowel diseases include 5-aminosalicylic acid (5-ASA) -based drugs (eg, sulfasalazine) that block the production of steroidal immunosuppressants, prostaglandins, Mesalazine and the like are used, and they are not only effective in treating inflammatory bowel disease but also cause serious side effects such as fullness, headache, rash, liver disease, leukopenia, agranulocytosis, and male infertility. Use is limited. In order to solve this problem, studies are being actively conducted to develop ingredients that can treat inflammatory bowel disease using natural products having relatively no side effects. For example, International Patent Publication No.
  • 5-ASA 5-aminosalicylic acid
  • WO 2004/098624 discloses a technique for treating colitis using water extracts of the king, and Korean Patent Publication No. 2015-0142213 discloses inflammation comprising a water-soluble extract of three hundred seconds as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a growth disease is disclosed.
  • the therapeutic agents derived from these natural products are excellent in safety, the therapeutic effect shows a lower level than the conventional therapeutic agents with side effects, and does not recover the inflamed intestinal tissue.
  • the present inventors have diligently researched to develop an inflammatory disease treatment agent that can recover tissues damaged by inflammation without causing side effects, and as a result, stem cell extracts can recover tissues damaged by inflammation, The present invention has been completed.
  • One object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising stem cell extract.
  • Still another object of the present invention is to provide a food composition for improving inflammatory disease comprising a stem cell extract.
  • Still another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory skin disease, comprising a stem cell extract.
  • Still another object of the present invention is to provide a stem cell extract for preventing or treating inflammatory diseases.
  • the pharmaceutical composition comprising the stem cell extract of the present invention can not only recover the cells damaged by inflammation, but also improve the symptoms of animals with inflammatory diseases, and thus are widely used for the development of safe and effective therapeutic agents for inflammatory diseases.
  • Figure 1a is a schematic diagram showing the co-culture method of Caco2 cells and Raw264.7 cells.
  • Figure 1b is a micrograph showing the results of E-cadherin fluorescence staining of caco2 cells and co-culture of Caco2 cells and Raw264.7 cells, and treated with LPS, and then treated with the extract of stem cells (hUC-MSC).
  • Figure 1c is a graph showing the level change of IL-17 in the culture medium according to the treatment of the stem cells (hUC-MSC) extract after co-culture of Caco2 cells and Raw264.7 cells, LPS treatment.
  • Figure 1d is a graph showing the change in the level of IL-10 in the culture medium according to the treatment of the stem cells (hUC-MSC) extract after co-culture of Caco2 cells and Raw264.7 cells, LPS treatment.
  • Figure 2a is a schematic diagram showing a method of treating stem cells or extracts thereof to Raw264.7 cells treated with LPS.
  • Figure 2b is a graph showing the change in the level of IL-17 in the culture after the treatment of stem cells or extracts thereof L26 treated Raw264.7 cells.
  • Figure 2c is a graph showing the change in the level of IL-10 in the culture after the treatment of stem cells or extracts thereof L26 treated Raw264.7 cells.
  • Figure 2d is a graph showing the change in the level of NO in the culture after the treatment of stem cells or extracts thereof L26 treated Raw264.7 cells.
  • Figure 3a is a graph showing the weight recovery level according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in chronic colitis model.
  • Figure 3b is a graph showing the change in DAI (disease activity index) according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the chronic colitis model.
  • Figure 3c is a photograph and graph comparing the length of the colon according to whether the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the chronic colitis model.
  • Figure 3d is a graph showing the change in MPO activity according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in chronic colitis model.
  • Figure 3e is a micrograph showing the tissue of the colon according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the chronic colitis model.
  • Figure 4a is a graph showing the weight recovery level according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the acute colitis model.
  • Figure 4b is a graph showing the change in DAI according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the acute colitis model.
  • Figure 4c is a graph showing the change in MPO activity according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the acute colitis model.
  • Figure 4d is a photograph and graph comparing the length of the large intestine according to the administration of the stem cell (hUC-MSC) extract in the acute colitis model.
  • Figure 5a is a graph showing the weight recovery level according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 5b is a graph showing the change in DAI according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 5c is a photograph and graph comparing the length of the colon according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 5d is a graph comparing the level of pathological symptoms according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 5e is a graph comparing the level of IL-17 according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 5f is a graph comparing the level of IL-10 according to the administration of stem cells (hUC-MSC) or its extract (MSC-Ex) in the chronic colitis model.
  • Figure 6a is a graph showing the change in the expression level of iNOS according to the treatment of the stem cell (hUC-MSC) extract in LPS-treated HaCaT cells.
  • Figure 6b is a graph showing the change in the expression level of IL-1 ⁇ according to the treatment of stem cells (hUC-MSC) extract in LPS-treated HaCaT cells.
  • Figure 6c is a graph showing the change in the expression level of TNF- ⁇ according to the treatment of stem cells (hUC-MSC) extract in LPS-treated HaCaT cells.
  • Figure 7 is a graph showing the change of sphingomyelin activity according to the treatment of stem cells (hUC-MSC) extract in LPS-treated HaCaT cells.
  • Figure 8a is a graph showing the change in the level of IL-6 expression according to the treatment of stem cells (hUC-MSC) extract in LPS-treated C2C12 cells.
  • Figure 8b is a Western blot analysis picture showing the change in the level of PPAR ⁇ according to the treatment of stem cells (hUC-MSC) extract in LPS-treated C2C12 cells.
  • the present inventors conducted various studies to develop an inflammatory disease therapeutic agent that can recover tissues damaged by inflammation without causing side effects, and thus, stem cell extracts were discovered.
  • the stem cell extract showed an effect of restoring the cells damaged by inflammation in the inflammatory cell model, and in view of the effect of restoring the cells damaged by the inflammation, the stem cell extract showed an improved effect than the stem cells. It was.
  • the inflammatory response can be treated in a disease model animal in which an inflammatory bowel disease used as an example of an inflammatory disease in which the inflammatory cells may appear.
  • stem cell extracts As such, in the treatment of inflammatory diseases, techniques using stem cell extracts have not been known so far and were first developed by the present inventors.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising a stem cell extract.
  • stem cell refers to a cell having the ability to differentiate into various tissues, that is, an 'undifferentiated cell'.
  • the stem cell is not particularly limited thereto, but may be, for example, embryonic stem cells, adult stem cells, pluripotent stem cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells) As another example, it may be mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells derived from human tissues, mesenchymal stem cells derived from human tissues, multipotent stem cells or amniotic epithelial cells, and the like.
  • Mesenchymal stem cells selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta, and as another example, human umbilical cord blood-derived intermediate Human stem cells (Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell; hUCB-MSC) and the like.
  • stem cell extract refers to a stem cell suspension obtained by treating the stem cells by lysis, crushing, permeation, or the like, a liquid extract obtained by filtering the suspension, or a dry powder of the liquid extract. it means.
  • inflammatory disease refers to a tumor necrosis factor- (TNF- ⁇ ) secreted by immune cells such as macrophages by excessively promoting the human immune system due to harmful stimuli such as inflammation-inducing factors or irradiation.
  • proinflammatory substances inflammatory cytokines
  • ⁇ IL-1
  • IL-6 interleukin-1
  • NO nitric oxide
  • the inflammatory disease is not particularly limited thereto, but may be, for example, allergic inflammatory disease, inflammatory skin disease, inflammatory eye disease, inflammatory bone disease, inflammatory muscle disease, inflammatory bowel disease, and the like.
  • allergic inflammatory diseases such as allergic rhinitis, angioedema, allergic conjunctivitis
  • Inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, eczema dermatitis, photodermatitis, seborrheic dermatitis, herpes dermatitis, squamous gland, scleroderma, necrotic pneumonia, pemphigus, vesicular epidermal detachment
  • Inflammatory eye diseases such as blepharitis, degenerative or inflammatory ophthalmitis
  • Inflammatory bone disease such as arthritis, rheumatoid arthritis, spondylitis
  • Inflammatory muscle diseases such as systemic sclerosis, dermatitis,
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • Ulcerative colitis mainly invades mucous membranes, and frequently causes ulcers or ulcers.
  • a type of diffuse nonspecific inflammation of unknown origin, which is accompanied by a variety of systemic symptoms, including bloody diarrhea, and Crohn's disease is the discontinuity of the entire gastrointestinal tract from the mucosa to the entire intestinal tract from the oral cavity to the anus.
  • atopic dermatitis refers to a chronic inflammatory skin disease characterized by dryness, pruritis, erythematous eczema, skin barrier dysfunction is also reported as a major cause. Specifically, when abnormalities in barrier function such as increased transepidermal water loss, decreased amount of water in the stratum corneum, and increased skin surface pH are observed, the results are reported to be related to the severity of the lesion. (Allergy Asthma Respir Dis 1 (1): 20-28, March 2013).
  • prevention means any action that inhibits or delays an inflammatory disease by administration of the pharmaceutical composition.
  • the term "treatment” refers to any activity that is clinically involved in altering the natural process of an individual or cell to be treated, which can be performed during or to prevent a clinical pathology.
  • the desired therapeutic effect includes preventing the occurrence or recurrence of the disease, alleviating the symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, slowing the progression of the disease, and reducing the disease state. Or temporarily alleviate, drive off, or improve the prognosis.
  • the treatment may be interpreted as including all the actions of the symptoms of inflammatory diseases improved or cured by administration of the pharmaceutical composition, but is not particularly limited thereto.
  • the stem cell extract in the present invention can recover the damaged cells in the LPS-treated cell model (Fig. 1a to 1d), showing a superior recovery effect than the stem cells in the cell model ( 2a to 2c), it can be seen that it can be used for the treatment of various inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease as a result of confirming the therapeutic effect of the stem cell extract against inflammatory bowel disease, the symptoms of chronic or acute inflammatory bowel inflammation model induced by the treatment of dextran sulphate sodium (DSS) can be improved. It was confirmed (Figs. 3a to 3d and 4a to 4c).
  • the pharmaceutical composition may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions, which carriers may be unnatural carriers.
  • the carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions of the present invention in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, may be used according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, and the like in the stem cell extract.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It can have one formulation.
  • the content of the stem cell extract included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in 0.0001 to 50% by weight relative to the total weight of the final composition, preferably in an amount of 0.001 to 10% by weight can do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention, the amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment
  • Effective dose levels are well-known for individual types and severities, age, gender, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other medical fields. It can be determined according to known factors.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of addiction of the disease, the age, weight, sex, history, or type of substance used as an active ingredient of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at about 0.1 ng to about 100 mg / kg, preferably 1 ng to about 10 mg / kg, per adult, and the frequency of administration of the composition of the present invention is specifically Although not limited, it can be administered once a day or several times in divided doses.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject having or likely to develop an inflammatory disease.
  • the term "individual" of the present invention means any animal which includes or is likely to develop the inflammatory disease.
  • an inflammatory disease can be alleviated or treated.
  • the term “relaxation” refers to any action by which administration of a composition according to the present invention improves or benefits an inflammatory disease.
  • treatment means any action by which the composition according to the present invention is administered to a subject in need of such treatment so that the treatment of the inflammatory disease is carried out or beneficially achieved.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "administration" refers to introducing a pharmaceutical composition of the present invention to a subject in any suitable manner, and the route of administration may be administered via various routes, oral or parenteral, as long as the target tissue can be reached. .
  • the pharmaceutical composition may be appropriately administered to a subject according to conventional methods, routes of administration, and dosages used in the art, depending on the purpose or need.
  • routes of administration may be administered orally, parenterally, subcutaneously, intraperitoneally, pulmonary, and intranasally, and parenteral infusions include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal or subcutaneous administration.
  • an appropriate dosage and frequency of administration may be selected according to methods known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention to be actually administered may include the type of symptom to be treated, route of administration, sex, and health condition , Diet, the age and weight of the individual, and the severity of the disease may be appropriately determined.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to inhibit or mitigate the increase in vascular permeability at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical use, and the effective dose level may include the type and severity, age, It may be determined according to sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a food composition for improving inflammatory disease, comprising a stem cell extract.
  • the composition comprising the stem cell extract comprises 0.01 to 100% by weight, more preferably 1 to 80% by weight relative to the total weight of the food composition.
  • food When food is a beverage, it may be included in a ratio of 1 to 30 g, preferably 3 to 20 g, based on 100 ml.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like. For example, it may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) and chromium (Cr) may be included. It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • preservatives can be added.
  • the additive is selected according to the type of food
  • a food composition comprising the stem cell extract can be prepared for the functional food for the prevention or improvement of inflammatory diseases.
  • processed foods that improve the shelf life at the same time by modifying the properties of agricultural products, livestock products or aquatic products using the composition.
  • processed foods include, for example, sweets, beverages, alcoholic beverages, fermented foods, canned foods, milk processed foods, land processed foods, noodles and the like.
  • Confections include biscuits, pies, cakes, breads, candies, jelly, gum, cereals (including meal substitutes such as grain flour).
  • Beverages include carbonated drinks, functional hot drinks, juices (eg, apples, pears, grapes, aloes, citrus fruits, peaches, carrots, tomato juices, etc.), Sikhye, and the like.
  • Alcoholic beverages include sake, whiskey, shochu, beer, liquor, fruit wine, and the like.
  • Fermented foods include soy sauce, miso, and red pepper paste.
  • Canned food includes canned seafood (eg, canned tuna, mackerel, saury, canned seashells, etc.), canned livestock (eg beef, pork, chicken, turkey canned, etc.), canned produce (corn, peaches, canned apples, etc.).
  • Milk processed foods include cheese, butter, yogurt, and the like.
  • Processed meat products include pork cutlet, beef cutlet, chicken cutlet and sausage. Includes sweet and sour pork, nuggets, breadfruits and more. Noodles, such as sealed packaging fresh noodles, are included.
  • the composition may be used in retort food, soups and the like.
  • the term "functional food” of the present invention is the same term as a food for special health use (FOSHU), and in addition to the nutritional supply, the medical and medical effects are processed so that the bioregulatory function appears efficiently It means high food.
  • the term "health food” refers to a food having an active health maintenance or promotion effect compared to a general food
  • a health supplement food refers to a food for health supplement purposes. Accordingly, the terms functional foods, health foods, and dietary supplements are favored, and the foods may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. in order to obtain useful effects in preventing or improving inflammatory diseases. Can be.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory skin disease, comprising a stem cell extract.
  • the stem cell extract preferably based on the total weight of the cosmetic composition may be contained in 0.0001% by weight to 10% by weight, more preferably 0.0005% by weight to 10% by weight It may be contained as.
  • the stem cell extract in an appropriate amount, there is an advantage that the economic and yet effective effect is sufficiently exhibited to achieve the object of the present invention.
  • the cosmetic composition according to the present invention is a solution, an external ointment, a cream, a foam, a nourishing lotion, a flexible lotion, a pack, a flexible water, an emulsion, a makeup base, an essence, a soap, a liquid detergent, a bath, a sunscreen cream, a sun oil, a suspension, Emulsions, pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches and sprays may be prepared in a formulation selected from the group consisting of, but not limited to It is not.
  • the cosmetic composition of the present invention may be preferably prepared as a semi-solid preparation, such as external ointment, lotion, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers formulated in general skin cosmetics, and as conventional components, for example, oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners , Chelating agents, pigments, preservatives, fragrances and the like may be appropriately blended, but is not limited thereto.
  • one or more cosmetically acceptable carriers formulated in general skin cosmetics, and as conventional components, for example, oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners , Chelating agents, pigments, preservatives, fragrances and the like may be appropriately blended, but is not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the dosage form.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is an ointment
  • a paste, a cream or a gel as a carrier component, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, Zinc oxide or the like may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, etc. may be used as the carrier component, and in particular, in the case of a spray, additionally chloro Propellants, such as, but not limited to, fluorohydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • a solvent, a solubilizer or an emulsifier may be used as the carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl Benzoate, propylene glycol, 1,3-butylglycol oil and the like can be used, and in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn seed oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan Fatty acid ester of may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • suspensions such as liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester as carrier components
  • liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester
  • microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxyde, bentonite, agar or tracant may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the formulation of the present invention is a soap
  • alkali metal salts of fatty acids fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolyzates, isethionates, lanolin derivatives, aliphatic alcohols, vegetable oils, glycerol, sugars and the like
  • carrier components May be, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • hUC-MSC Human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in Petri dishes are scraped for cell harvesting after washing twice with physiological saline without trypsin to exclude the addition of foreign substances.
  • hUC-MSC Human umbilical cord mesenchymal stem cells
  • the obtained cells were suspended by adding 100 ⁇ l of saline per petri dish, and stabilized on ice for 15 minutes to stop various enzyme reactions in the cells.
  • Cold stabilized hUC-MSC was used to alternate the liquid nitrogen and constant temperature bath to freeze and thaw cells three times to crush the cells.
  • the crushed cells were centrifuged (13,000 rpm, 15 minutes), and the obtained supernatant was used as a stem cell extract.
  • protease inhibitor protease inhibitor
  • Caco2 cells Cold Epithelial Colorectal adenocarcin, colorectal adenocarcin cell line
  • Caco2 cells Cold Epithelial Colorectal adenocarcin, colorectal adenocarcin cell line
  • RAW264.7 cells macrophages
  • transwells with differentiated caco2 cells were mounted on top (FIG. 1A).
  • the lower culture was treated with LPS to induce an inflammatory response, and the stem cell extract prepared in Example 1 was treated at 30 ⁇ g / mL in the upper culture, followed by incubation for 24 hours.
  • the lower culture was collected to measure the amount of inflammatory cytokines IL-17 and anti-inflammatory cytokines IL-10, and cultured caco2 cells were subjected to E-cadherin (adherens junction) fluorescence staining (Fig. 1b to 1d).
  • the level of IL-10 was slightly increased when LPS was treated, but the level of IL-10 was rapidly increased when stem cell extract was treated.
  • the level of IL-17 increased by the treatment of LPS was decreased by the treatment of hUC-MSC or its extract, and IL-17 when treated with its extract rather than when treated with hUC-MSC. It is confirmed that the level of is relatively further reduced.
  • the level of IL-10 was slightly increased when LPS was treated, but the level of IL-10 was rapidly increased when hUC-MSC or its extracts were treated. When the extract was treated, it was confirmed that the level of IL-10 was further increased.
  • the level of NO increased by LPS treatment was reduced by the treatment of stem cells or stem cell extracts, the effect of reducing the level of NO shows a higher level of stem cell extract than stem cells It was confirmed.
  • the inflammatory response increased by the treatment of LPS could be recovered by using the stem cells or extracts thereof, it can be seen that the recovery effect is further improved when using the stem cell extract rather than the stem cells there was.
  • Example 4 DSS ( dextran sulphate sodium) induced chronic Enteritis Therapeutic Effect Analysis of Stem Cell Extracts Using Model
  • Examples 2 and 3 confirmed that the inflammatory response increased by the treatment of LPS can be recovered by using the stem cell extract, to confirm whether this effect can be applied to the actual inflammatory disease, DSS (dextran The treatment effect of inflammatory bowel disease was analyzed using sulphate sodium) induced chronic enteritis or DSS induced acute enteritis.
  • Example 4-1 DSS-induced Chronic Enteritis Therapeutic Effect Analysis of Stem Cell Extracts Using Model
  • the measured body weight was set as the reference weight (100%) before administration of DSS and scored by dividing the change in body weight after administration of DSS into five levels (0 points: 0-1%, 1 point: 1-to-1) 5%, 2 points: 5-10%, 3 points: 10-20% and 4 points: 20% or more).
  • the average value obtained from the scores obtained for the measured body weight, stool status, and the presence or absence of blood stool was set as the DAI (disease activity index).
  • MPO Myeloperoxidase
  • the rat group administered with the stem cell extract was confirmed that the weight gain rate is improved compared to the rat group (control) administered PBS.
  • MPO activity was reduced in the rat group administered with the stem cell extract, it was confirmed that the infiltration of inflammatory cells is reduced.
  • the cells showing the inflammatory response was observed in the colon tissue of the rat group administered PBS, but the cells showing the inflammatory response was not observed in the colon tissue of the rat group administered the stem cell extract.
  • Example 4-2 Acute DSS Induction Enteritis Therapeutic Effect Analysis of Stem Cell Extracts Using Model
  • C71BL / 6 rats were fed with 4% DSS for 5 days to prepare a DSS-induced acute enteritis model, and from the third day of feeding, PBS (Phosphate buffered saline, 100 ⁇ l) or the stem cell extract prepared in Example 1 (injection: 100 ⁇ g / 100 ⁇ l) was administered through the abdominal cavity over 5 days. During the whole procedure, body weight, stool status and blood stool were recorded daily, and the length of the colon was measured at the sacrifice of mice the day after the last injection (FIGS. 4A-4D).
  • the rat group administered with the stem cell extract was confirmed that the level of weight loss is somewhat reduced compared to the rat group administered with PBS.
  • Example 4-3 DSS-induced chronic Enteritis Anti-inflammatory Effects of Stem Cells and Stem Cell Extracts in Models
  • Example 4-1 The same experiment as in Example 4-1, except that the stem cell extract MSC-Ex (30 ⁇ g / mL) obtained from the same number of stem cells (1x10 ⁇ 5 cells) used in Example 1 was treated. Was performed (FIGS. 5A-5F).
  • the colon length between the stem group and the rat group to which the stem cell extract was administered was recovered compared to the colon length of the rat group to which the PBS was administered, and the colon length between the stem group and the rat group to which the stem cell extract was administered was It was confirmed that there was no particular difference.
  • the pathological symptoms between the stem cells and the rat group to which the stem cell extract was administered was reduced compared to the pathological symptoms of the rat group to which PBS was administered, and the stem rather than the pathological symptoms between the rat groups to which the stem cells were administered. It was confirmed that the pathological symptoms of the rat group to which the cell extract was administered were relatively reduced.
  • the level of IL-17 was lower in the rat group to which the stem cells and stem cell extracts were administered, compared to the rat group to which PBS was administered, and in the rat group to which the stem cells and stem cell extracts were administered. It was confirmed that the level of IL-17 did not show any particular difference.
  • IL-10 levels were higher in the rat group to which the stem cells and stem cell extracts were administered than to the rat group to which PBS was administered, and in the rat group to which the stem cells and stem cell extracts were administered. It was confirmed that the level of IL-10 showed no particular difference.
  • Example 5-1 expressed in keratinocytes On inflammation marker Effect of Stem Cell Extracts on
  • RNA was obtained from each cultured cell, and real-time PCR analysis was performed using the obtained total RNA and the following primers to analyze changes in expression levels of inflammatory markers iNOS, IL-1 ⁇ , and TNF- ⁇ (FIG. 6A). To 6c). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • TNF ⁇ -F 5'-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • TNF ⁇ -R 5'-CTGCCCAGACTCGGCAA-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • IL-1 ⁇ -F 5'-AAAAGCTTGGTGATGTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • IL-1 ⁇ -R 5'-TTTCAACACGCAGGACAGG-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • iNOS-F 5'-TCAGCCAAGCCCTCACCTAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • iNOS-R 5'-CCAATCTCTGCCTATCCGTCTC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • GAPDH-F 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • GAPDH-R 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Example 5-2 Effect of Stem Cell Extracts on the Level of Ceramide Produced in Keratinocytes
  • ceramide which is a constituent of lipids produced in each cell obtained in Example 5-1
  • the protein extracted from each cell is applied to a spingomyelinase (SMase) assay kit (Cayman).
  • SMase spingomyelinase
  • the activity of sphingomyelinase producing ceramide was analyzed (FIG. 7).
  • C2C12 cells which are a kind of myoblasts, were treated with LPS (1 ⁇ g / mL), incubated for 4 hours, replaced with medium containing normal or stem cell extracts, and further cultured for 24 hours.
  • RNA was obtained from the cultured cells, and the change in the expression level of the inflammatory marker IL-6 was analyzed by real-time PCR analysis using the obtained total RNA and the following primers (FIG. 8A). At this time, GAPDH was used as the internal control group.
  • IL-6-F 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • IL-6-R 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • the L2 treatment of C2C12 cells induce an inflammatory response to increase the expression level of the inflammatory marker IL-6, after the stem cell extract was confirmed that the increased IL-6 expression level is reduced It was.
  • the stem cell extracts can restore the damage of inflammatory cells commonly found in inflammatory diseases, and the recovery effect is confirmed that stem cell extracts are superior to stem cells, and indeed inflammatory bowel disease is developed.
  • the stem cell extracts As a result of confirming the effect of the stem cell extract in the animal model, it was found that the symptoms of the animal model in which chronic or acute inflammatory bowel disease was developed.
  • the stem cell extract of the present invention may have an effect of preventing or treating various inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환 개선용 식품조성물 및 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 추출물을 포함하는 약학 조성물은 염증에 의해 손상된 세포를 회복시킬 수 있을 뿐만 아니라, 염증성 질환이 발병된 동물의 증상을 개선시킬 수 있으므로, 안전하면서도 효과적인 염증성 질환 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료효과를 갖는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 상기 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환 개선용 식품조성물 및 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 대하여 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포 (migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개인자에 의하여 촉발된다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 이 중에 세균의 침입에 의해 형성되는 농양의 병리적 상태를 염증성 질환이라고 한다.
상기 염증성 질환의 일종인 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환으로, 비교적 청년층부터 발병하며 복통, 발열, 설사, 하혈 등의 증상을 수반한다. 대체로, 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)과 크론병(Cron's disease, CD)의 2가지 형태로 분류되는데, 궤양성 대장염은 주로 점막을 침범하여, 자주 문드러짐이나 궤양을 형성하는 대장의 원인불명의 확산성 비특이성 염증(diffuse nonspecific inflammation)의 일종으로서, 혈성 설사를 비롯하여 다양한 전신 증상을 수반하고, 크론병은 구강에서 항문까지 전 소화관을 비연속성으로 점막에서 장관(腸管) 전 층에 궤양, 섬유화, 협착과 병변(病變)이 진전되는 원인불명의 육아종성 염증성 병변으로, 복통, 만성 설사, 발열, 영양장애 등의 전신 증상을 수반한다.
상기 염증성 장질환의 발병원인은 아직까지 구체적으로 밝혀져 있지 않으나, 면역기능의 이상이 관여하는 것으로 알려져 있는데, 이에 관여하는 면역학적 요인으로는 선천적 면역성, 사이토카인(Cytokine)의 생성, CD4의 활성화 등이 알려져 있다. 특히, 사이토카인이 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는데, 염증 부위에서 종양괴사인자(Tumor nerosis cytokine; TNF-α), 인터루킨(Interluekin; IL)-1, IL-6, IL-8 생성이 궤양성 대장염과 크론병 환자에게 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.
이러한 염증성 장질환을 치료하기 위하여 사용되는 약물로는 스테로이드성 면역억제제, 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물(예, 설파살라진 등), 메살라진 등이 사용되고 있는데, 이들은 염증성 장질환의 치료효과가 미미할 뿐만 아니라 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등의 심각한 부작용을 유발하기 때문에, 상기 치료제의 사용이 제한되고 있다. 이러한 문제점을 해소하기 위하여, 비교적 부작용이 없는 천연물을 이용하여 염증성 장질환을 치료할 수 있는 성분을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 WO 2004/098624호에는 왕대의 물추출물을 이용하여 대장염을 치료하는 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0142213호에는 삼백초의 수용성 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 천연물로부터 유래된 치료제는 안전성은 우수하지만, 치료효과는 부작용이 있는 종래의 치료제보다 낮은 수준을 나타내고, 염증이 발생된 장조직을 회복시키지는 못한다는 단점이 있다.
본 발명자들은 부작용을 유발하지 않으면서도, 염증에 의해 손상된 조직을 회복시킬 수 있는 염증성 질환 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 줄기세포 추출물이 염증에 의해 손상된 조직을 회복시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 염증성 질환이 발병되거나 또는 발병될 가능성이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 추출물을 포함하는 염증성 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 추출물의 염증성 질환 예방 또는 치료용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 줄기세포 추출물을 포함하는 약학 조성물은 염증에 의해 손상된 세포를 회복시킬 수 있을 뿐만 아니라, 염증성 질환이 발병된 동물의 증상을 개선시킬 수 있으므로, 안전하면서도 효과적인 염증성 질환 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 Caco2세포와 Raw264.7세포의 공동배양 방법을 나타내는 개략도이다.
도 1b는 Caco2세포와 Raw264.7세포를 공동배양하고, LPS를 처리한 후, 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 caco2세포의 E-cadherin 형광염색 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 1c는 Caco2세포와 Raw264.7세포를 공동배양하고, LPS를 처리한 후, 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 배양액 내 IL-17의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 Caco2세포와 Raw264.7세포를 공동배양하고, LPS를 처리한 후, 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 배양액 내 IL-10의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 LPS가 처리된 Raw264.7세포에 줄기세포 또는 그의 추출물을 처리하는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2b는 LPS가 처리된 Raw264.7세포에 줄기세포 또는 그의 추출물을 처리한 후, 배양액 내 IL-17의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 LPS가 처리된 Raw264.7세포에 줄기세포 또는 그의 추출물을 처리한 후, 배양액 내 IL-10의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 2d는 LPS가 처리된 Raw264.7세포에 줄기세포 또는 그의 추출물을 처리한 후, 배양액 내 NO의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여에 따른 체중 회복수준을 나타내는 그래프이다.
도 3b는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 DAI(disease activity index)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3c는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 대장의 길이를 비교한 사진 및 그래프이다.
도 3d는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 MPO activity의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3e는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 대장의 조직을 나타내는 현미경사진이다.
도 4a는 급성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여에 따른 체중 회복수준을 나타내는 그래프이다.
도 4b는 급성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 DAI의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 급성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 MPO activity의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4d는 급성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 투여여부에 따른 대장의 길이를 비교한 사진 및 그래프이다.
도 5a는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 체중 회복수준을 나타내는 그래프이다.
도 5b는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 DAI의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 대장의 길이를 비교한 사진 및 그래프이다.
도 5d는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 병리학적 증상의 수준을 비교한 그래프이다.
도 5e는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 IL-17의 수준을 비교한 그래프이다.
도 5f는 만성대장염모델에서 줄기세포(hUC-MSC) 또는 그의 추출물(MSC-Ex)의 투여에 따른 IL-10의 수준을 비교한 그래프이다.
도 6a는 LPS가 처리된 HaCaT 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 iNOS의 발현수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 LPS가 처리된 HaCaT 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 IL-1β의 발현수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 LPS가 처리된 HaCaT 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 TNF-α의 발현수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7은 LPS가 처리된 HaCaT 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 스핑고마이엘리나제의 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 LPS가 처리된 C2C12 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 IL-6의 발현수준의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 LPS가 처리된 C2C12 세포에서 줄기세포(hUC-MSC) 추출물의 처리여부에 따른 PPARα의 수준의 변화를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
본 발명자들은 부작용을 유발하지 않으면서도, 염증에 의해 손상된 조직을 회복시킬 수 있는 염증성 질환 치료제를 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 줄기세포 추출물을 발굴하게 되었다. 상기 줄기세포 추출물은 염증세포 모델에서 염증에 의해 손상된 세포를 회복시키는 효과를 나타내었고, 이러한 염증에 의해 손상된 세포를 회복시키는 효과의 관점에서 볼 때, 줄기세포 보다도 줄기세포 추출물이 더욱 향상된 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 상기 염증세포가 나타날 수 있는 염증성 질환의 일 예로서 사용된 염증성 장질환이 발병된 질환 모델 동물에서 염증반응을 치료할 수 있음을 확인하였다.
이처럼, 염증성 질환의 치료에 있어서, 줄기세포 추출물을 사용하는 기술은 지금까지 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "줄기세포"란, 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화세포'를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능줄기세포, 다능성 줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells) 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포 등이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 유래의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 등이 될 수 있고, 또 다른 예로서, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell;hUCB-MSC) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "줄기세포 추출물"이란, 상기 줄기세포를 용해, 파쇄, 투과 등의 방법으로 처리하여 수득한 줄기세포 현탁액, 상기 현탁액을 여과하여 수득한 액상 추출물, 상기 액상 추출물의 건조분말 등을 의미한다.
본 발명의 용어 "염증성 질환(Inflammatory disease)"이란, 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 알레르기성 염증질환, 염증성 피부질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환, 염증성 장질환 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 알레르기 비염, 맥관부종, 알러지성 결막염 등의 알레르기성 염증질환; 아토피피부염, 건선, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증 등의 염증성 피부질환; 안검염, 퇴행성 또는 염증성 안구염 등의 염증성 안구질환; 관절염, 류마티스관절염, 척추염 등의 염증성 골관절질환; 전신성 경화증, 피부근염, 다발성근염, 염증성 근병변 등의 염증성 근육질환; 궤양성 대장염, 크론병 등의 염증성 장질환이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)"이란, 복통, 발열, 설사, 하혈 등의 증상을 수반하면서, 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환을 의미한다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)과 크론병(Cron's disease, CD)의 2가지 형태로 분류되는데, 궤양성 대장염은 주로 점막을 침범하여, 자주 문드러짐이나 궤양을 형성하는 대장의 원인불명의 확산성 비특이성 염증(diffuse nonspecific inflammation)의 일종으로서, 혈성 설사를 비롯하여 다양한 전신 증상을 수반하고, 크론병은 구강에서 항문까지 전 소화관을 비연속성으로 점막에서 장관(腸管) 전 층에 궤양, 섬유화, 협착과 병변(病變)이 진전되는 원인불명의 육아종성 염증성 병변으로, 복통, 만성 설사, 발열, 영양장애 등의 전신 증상을 수반한다.
본 발명의 용어 "아토피 피부염"이란, 건조증, 소양증, 홍반성 습진을 특징으로 하는 만성 염증성 피부질환을 의미하는데, 피부 장벽 기능 이상도 주요 발병 원인으로 보고되고 있다. 구체적으로 경피수분손실(transepidermal water loss)의 증가, 각질층 내 수분량의 감소, 피부 표면 pH의 증가와 같은 장벽 기능의 이상이 관찰되면, 이러한 이상이 병변의 중증도와 연관이 있다는 결과가 지속적으로 보고되고 있다 (Allergy Asthma Respir Dis 1(1):20-28, March 2013).
본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 약학 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 상기 약학 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 줄기세포 추출물은 LPS가 처리된 세포모델에서 손상된 세포를 회복시킬 수 있고(도 1a 내지 1d), 상기 세포모델에서 줄기세포 보다도 우수한 회복효과를 나타내어(도 2a 내지 2c), 다양한 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 염증성 질환의 일 예로서, 염증성 장질환에 대한 줄기세포 추출물의 치료효과를 확인한 결과, DSS(dextran sulphate sodium)의 처리에 의해 유도된 만성 또는 급성 염증성 장염증 모델의 증상을 호전시킬 수 있음을 확인하였다(도 3a 내지 3d 및 4a 내지 4c).
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 줄기세포 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물에 포함된 줄기세포 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 염증성 질환이 발병되거나 또는 발병될 가능성이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 염증성 질환이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 조직을 포함하는 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 염증성 질환을 완화 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어, "완화"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 조성물을 염증성 질환의 치료가 요구되는 개체에 투여하여 염증성 질환의 치료가 수행되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 질환 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 줄기세포 추출물을 포함하는 조성물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함한다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1~30g, 바람직하게는 3 ~ 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질 산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
한편, 상기 줄기세포 추출물을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 염증성 질환의 예방 또는 개선용 기능성식품을 제조할 수 있다.
구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게한 가공식품을 제조할 수 있다. 이런 가공식품에는 예들 들어, 과자, 음료, 주류, 발효식품, 통조림, 우유가공식품, 육륙가공식품, 국수 등을 포함한다. 과자는 비스킷, 파이, 케익, 빵, 캔디, 젤리, 껌, 시리얼(곡물푸레이크 등의 식사대용품류 포함) 등을 포함한다. 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예들 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토 쥬스 등), 식혜 등을 포함한다. 주류는 청주, 위스키, 소주, 맥주, 양주, 과실주 등을 포함한다. 발효식품은 간장, 된장, 고추장 등을 포함한다. 통조림은 수산물 통조림(예들 들어, 참치, 고등어, 꽁치, 소라 통조림 등), 축산물 통조림(쇠고기, 돼지고기, 닭고기, 칠면조 통조림 등), 농산물 통조림(옥수수, 복숭아, 파일애플 통조림 등)을 포함한다. 우유가공식품은 치즈, 버터, 요구르트 등을 포함한다. 육류가공식품은 돈까스, 비프까스, 치킨까스, 소세지. 탕수육, 너겟류, 너비아니 등을 포함한다. 밀봉포장생면 등의 국수를 포함한다. 이 외에도 상기 조성물은 레토르트식품, 스프류 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성식품(functional food)"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 본 발명에서 용어,“건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 염증성 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 줄기세포 추출물은, 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 바람직하게는 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 함유될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 함유될 수 있다. 상기 함량 범위 내에서, 상기 줄기세포 추출물을 적절한 양으로 사용하여 경제적이면서도 그의 효과가 충분히 발휘되어 본 발명의 목적을 달성하기에 보다 적합해지는 이점이 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 바람직하게는 외용 연고, 로션 등과 같은 반고형 제제로 제조될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포 추출물의 제조
페트리디쉬에 배양된 인간 제대유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSC)를 이물질 첨가를 배제하기 위해 트립신을 사용하지 않고, 생리식염수로 2회 세척한 후에 세포수거용 스크래퍼(scraper)로 긁어서 1.5㎖ 튜브에 담고, 이를 원심분리(13,000rpm, 5분)하여 침전된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포에 각 페트리디쉬당 100㎕의 생리식염수를 가하여 현탁시키고, 세포 내 각종 효소반응을 중지시키기 위해 얼음에서 15분 동안 안정화 시켰다. 차갑게 안정화된 hUC-MSC를 액체질소와 항온수조를 번갈아 사용하여 세포를 얼리고 녹이는 과정을 3회 반복하여 세포를 파쇄하였다. 그런 다음, 상기 파쇄된 세포를 원심분리(13,000 rpm, 15분) 하여, 수득한 상층액을 줄기세포 추출물로 사용하였다. 이때, 세포 내의 불순물 추가를 최소화하기 위하여 단백질 분해 효소 억제제(protease inhibitor) 등의 사용을 모두 배제 하였다.
실시예 2: Caco2세포와 Raw264 . 7세포 공동배양 모델
Caco2세포(Colon Epithelial Colorectal adenocarcin, 대장선암세포주)를 트랜스웰에 깔고 3일에 한번씩 배양액을 교체해 주면서 2주간 분화를 유도하였다. 6웰 플레이트에 RAW264.7세포(대식세포)를 배양한 후, 분화된 caco2세포가 있는 트랜스웰을 윗쪽에 장착하였다(도 1a). 아래쪽 배양액에 LPS를 처리해 염증반응을 유도하고 윗쪽 배양액에 상기 실시예 1에서 제조된 줄기세포 추출물을 30 ㎍/mL 농도로 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 아래쪽 배양액을 모아 염증성 사이토카인인 IL-17과 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양을 측정하고 배양된 caco2세포는 E-cadherin(adherens junction) 형광염색을 실시하였다(도 1b 내지 1d).
도 1b에서 보듯이, 분화된 caco2세포에 LPS를 처리하면 세포가 손상되었으나, 이에 줄기세포 추출물을 처리하면, 손상된 세포가 다시 회복됨을 확인하였다.
도 1c에서 보듯이, LPS의 처리에 의하여 증가된 IL-17의 수준은 줄기세포 추출물의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
도 1d에서 보듯이, LPS를 처리한 경우에는 IL-10의 수준이 다소 증가하였으나, 줄기세포 추출물을 처리하면 IL-10의 수준이 급격히 증가됨을 확인하였다.
도 1b 내지 1d에서 보듯이, LPS의 처리에 의하여 증가되는 염증성 반응을 줄기세포 추출물을 이용하여 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: 줄기세포와 줄기세포 추출물의 효과 비교실험
RAW264.7세포를 배양한 후 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하고, 염증반응을 유도한 세포에 hUC-MSC 세포(1 x 105개) 자체를 처리하거나 또는 실시예 1의 방법으로 수득한 그의 추출물 (30 ㎍/mL)을 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다(도 2a). 배양이 종료된 후, 각 배양액에 포함된 염증성 사이토카인인 IL-17과 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양을 측정하였다(도 2b 및 2c).
도 2b에서 보듯이, LPS의 처리에 의하여 증가된 IL-17의 수준은 hUC-MSC 또는 그의 추출물의 처리에 의하여 감소되었고, hUC-MSC를 처리한 경우보다는 그의 추출물을 처리한 경우에 IL-17의 수준이 상대적으로 더욱 감소됨을 확인하였다.
도 2c에서 보듯이, LPS를 처리한 경우에는 IL-10의 수준이 다소 증가하였으나, hUC-MSC 또는 그의 추출물을 처리하면 IL-10의 수준이 급격히 증가하였고, hUC-MSC를 처리한 경우보다는 그의 추출물을 처리한 경우에 IL-10의 수준이 상대적으로 더욱 증가됨을 확인하였다.
한편, 상기 RAW264.7세포를 배양한 후 LPS, 줄기세포 또는 줄기세포 추출물을 각각 개별적으로 또는 조합하여 처리한 후, 각 배양액에 포함된 NO의 수준을 측정하였다(도 2d).
도 2d에서 보듯이, LPS 처리에 의해 증가되는 NO의 수준은 줄기세포 또는 줄기세포 추출물의 처리에 의해 감소되었고, 상기 NO의 수준을 감소시키는 효과는 줄기세포 보다는 줄기세포 추출물이 더욱 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
도 2b 내지 2d에서 보듯이, LPS의 처리에 의하여 증가되는 염증성 반응은 줄기세포 또는 그의 추출물을 이용하여 회복시킬 수 있었고, 상기 줄기세포 보다는 줄기세포 추출물을 사용한 경우에 더욱 회복효과가 향상됨을 알 수 있었다.
실시예 4: DSS( dextran sulphate sodium) 유도 만성 장염증 모델을 이용한 줄기세포 추출물의 치료효과 분석
상기 실시예 2 및 3의 결과로부터 LPS의 처리에 의하여 증가되는 염증성 반응을 줄기세포 추출물을 이용하여 회복시킬 수 있음을 확인하였으므로, 이러한 효과가 실질적인 염증성 질환에 적용될 수 있는지를 확인하고자, DSS(dextran sulphate sodium) 유도 만성 장염증 모델 또는 DSS 유도 급성 장염증 모델을 이용한 줄기세포 추출물의 염증성 장질환의 치료효과를 분석하였다.
실시예 4-1: DSS 유도 만성 장염증 모델을 이용한 줄기세포 추출물의 치료효과 분석
C71BL/6 쥐에 2% DSS를 5일간 급수 후에 5일간 휴식시키는 과정을 3회 반복하여, DSS 유도 만성 장염증 모델을 제작하고, 실험시작 25일째 부터 PBS(Phosphate buffered saline, 100 ㎕) 또는 실시예 1에서 제조된 줄기세포 추출물(주사량: 100 ㎍/100 ㎕)를 10일에 걸쳐 복강을 통해 투여하였다. 전체 과정을 진행하는 동안, 매일 체중과 변의 상태, 혈변의 유무를 기록하고 마지막 주사 다음날 쥐를 희생하여 대장의 길이를 측정하였으며, 상기 대장을 10% 포르말린 용액에 즉시 고정한 후, 파라핀 블록을 제작하고, 이를 0.4㎛ 두께로 자른 조직을 헤마톡실린&에오신(H&E)으로 염색하였다(도 3a 내지 3e).
상기 측정된 체중은, DSS를 투여하기 전의 체중을 기준(100%)으로 설정하고, DSS 투여한 후 체중의 변화를 5단계로 나누어 점수화하였다(0점:0-1%, 1점:1-5%, 2점:5-10%, 3점:10-20% 및 4점:20%이상).
또한, 변의 상태는 3단계로 나누어 점수화하였다(0점:설사없음, 2점:무정형,수분감끈적함 및 4점:설사).
아울러, 혈변의 유무 역시 3단계로 나누어 점수화하였다(0점:정상, 2점:가벼운 혈변 및 4점:심각한 혈변).
상기 측정된 체중, 변의상태 및 혈변의 유무에 대하여 얻어진 점수로부터 얻어진 평균값을 DAI(disease activity index)로 설정하였다.
끝으로, 장조직의 염증세포의 침윤 정도를 확인하기 위해 MPO(Myeloperoxidase) activity를 수행하였다.
도 3a에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹(대조군)에 비해 체중 증가율이 향상됨을 확인하였다.
도 3b에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹에 비해 DAI 수준이 감소됨을 확인하였다.
도 3c에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹의 대장길이와 PBS를 투여한 쥐그룹의 대장길이의 차이는 나타나지 않음을 확인하였다.
도 3d에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹에서 MPO activity가 감소되었으므로, 염증세포의 침윤이 감소됨을 확인하였다.
도 3e에서 보듯이, PBS를 투여한 쥐그룹의 대장조직에서는 염증반응을 나타내는 세포가 관찰되었으나, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹의 대장조직에서는 염증반응을 나타내는 세포가 관찰되지 않았다.
상기 도 3a 내지 3e의 결과를 종합하면, DSS 유도 만성 장염증 모델의 증상을 줄기세포 추출물을 이용하여 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-2: DSS 유도 급성 장염증 모델을 이용한 줄기세포 추출물의 치료효과 분석
C71BL/6 쥐에 4% DSS를 5일간 급수하여, DSS 유도 급성 장염증 모델을 제작하고, 급수 3일째부터 PBS(Phosphate buffered saline, 100 ㎕) 또는 실시예 1에서 제조된 줄기세포 추출물(주사량: 100 ㎍/100 ㎕)를 5일에 걸쳐 복강을 통해 투여하였다. 전체 과정을 진행하는 동안, 매일 체중와 변의 상태, 혈변의 유무를 기록하고 마지막 주사 다음날 쥐를 희생하여 대장의 길이를 측정하였다(도 4a 내지 4d)
도 4a에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹에 비해 체중가 감소되는 수준이 다소 완화됨을 확인하였다.
도 4b에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹에 비해 DAI 수준이 감소됨을 확인하였다.
도 4c에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹에서 MPO activity가 감소됨을 확인하였다.
도 4d에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹의 대장길이와 PBS를 투여한 쥐그룹의 대장길이에 비하여 회복됨을 확인하였다.
상기 도 4a 내지 4d의 결과를 종합하면, DSS 유도 급성 장염증 모델의 증상을 줄기세포 추출물을 이용하여 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-3: DSS 유도 만성 장염증 모델에서 줄기세포 및 줄기세포 추출물의 항염증 효과 분석
실시예 1에서 사용된 줄기세포(1x10^5 cells) 와 동일수의 줄기세포에서 얻어진 줄기세포 추출물MSC-Ex(30 μg/mL)을 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 4-1과 동일한 실험을 수행하였다(도 5a 내지 5f).
도 5a에서 보듯이, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹 간의 체중은 특별한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
도 5b에서 보듯이, 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 줄기세포를 투여한 쥐그룹에 비해 상대적으로 낮은 수준의 DAI 값을 나타냄을 확인하였다.
도 5c에서 보듯이, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹 간의 대장길이는 PBS를 투여한 쥐그룹의 대장길이에 비하여 회복되었고, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹 간의 대장길이는 특별한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
도 5d에서 보듯이, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹 간의 병리학적 증상은 PBS를 투여한 쥐그룹의 병리학적 증상에 비하여 감소되었고, 줄기세포를 투여한 쥐그룹 간의 병리학적 증상 보다는 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹의 병리학적 증상이 상대적으로 감소됨을 확인하였다.
도 5e에서 보듯이, IL-17의 수준은 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹보다 낮은 수준을 나타내었고, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹에서의 IL-17의 수준은 특별한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
도 5f에서 보듯이, IL-10의 수준은 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹이 PBS를 투여한 쥐그룹보다 높은 수준을 나타내었고, 줄기세포와 줄기세포 추출물을 투여한 쥐그룹에서의 IL-10의 수준은 특별한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 도 5a 내지 5f의 결과를 종합하면, DSS 유도 만성 장염증 모델의 증상에 대한 치료효과는 줄기세포 보다는 줄기세포 추출물을 사용하는 경우에, 더욱 향상됨을 알 수 있었다.
실시예 5: 아토피성 피부염에 대한 줄기세포 추출물의 효과 분석
실시예 5-1: 각질형성 세포에서 발현되는 염증마커에 대한 줄기세포 추출물의 효과
인간의 각질형성세포의 일종인 HaCaT 세포에 LPS(100μg/mL)를 처리하고 24시간 동안 배양하거나 또는 상기 LPS를 처리하고 4시간 동안 배양한 후 줄기세포 추출물(30 μg/mL)을 처리하여 배양하였다.
배양된 각 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 수득한 총 RNA와 하기 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하여, 염증마커인 iNOS, IL-1β 및 TNF-α의 발현수준 변화를 분석하였다(도 6a 내지 6c). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
TNFα-F: 5'-GGAGAAGGGTGACCGACTCA-3'(서열번호 1)
TNFα-R: 5'-CTGCCCAGACTCGGCAA-3'(서열번호 2)
IL-1α-F: 5'-AAAAGCTTGGTGATGTCTGG-3'(서열번호 3)
IL-1α-R: 5'-TTTCAACACGCAGGACAGG-3'(서열번호 4)
iNOS-F: 5'-TCAGCCAAGCCCTCACCTAC-3'(서열번호 5)
iNOS-R: 5'-CCAATCTCTGCCTATCCGTCTC-3'(서열번호 6)
GAPDH-F: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(서열번호 7)
GAPDH-R: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(서열번호 8)
도 6a에서 보듯이, HaCaT 세포에서 LPS의 처리에 의하여 증가된 iNOS의 발현수준은 줄기세포 추출물의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
도 6b에서 보듯이, HaCaT 세포에서 LPS의 처리에 의하여 증가된 IL-1β의 발현수준은 줄기세포 추출물의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
도 6c에서 보듯이, HaCaT 세포에서 LPS의 처리에 의하여 증가된 TNF-α의 발현수준은 줄기세포 추출물의 처리에 의하여 감소됨을 확인하였다.
상기 도 6a 내지 6c의 결과를 종합하면, 각질형성세포에서 LPS 처리에 의해 증가된 염증마커의 수준이 줄기세포 추출물의 처리에 의해 감소됨을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 각질형성 세포에서 생성되는 세라마이드의 수준에 대한 줄기세포 추출물의 효과
상기 실시예 5-1에서 수득한 각 세포에서 생성되는 지질의 구성성분인 세라마이드의 수준을 측정하고자, 상기 각 세포에서 추출한 단백질을 스핑고마이엘리나아제(sphingomyelinase, SMase) 분석키트(Cayman)에 적용하여 세라마이드를 생성하는 스핑고마이엘리나제의 활성을 분석하였다(도 7).
도 7에서 보듯이, HaCaT 세포에서 LPS의 처리에 의하여 감소된 스핑고마이엘리나제의 활성은 줄기세포 추출물의 처리에 의하여 회복됨을 확인하였다.
실시예 5-3: 근원세포의 염증반응에 대한 줄기세포 추출물의 효과
근원세포(myoblast)의 일종인 C2C12 세포에 LPS(1μg/mL)를 처리하고 4시간 동안 배양한 다음, 정상 배지 또는 줄기세포 추출물이 포함된 배지로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다.
상기 배양된 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 수득한 총 RNA와 하기 프라이머를 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행함으로써, 염증마커인 IL-6의 발현수준 변화를 분석하였다(도 8a). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
IL-6-F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3'(서열번호 9)
IL-6-R: 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3'(서열번호 10)
도 8a에서 보듯이, C2C12세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하면 염증마커인 IL-6의 발현수준이 증가하고, 이후 줄기세포 추출물을 처리하면 증가된 IL-6의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
한편, 세포의 분화를 촉진시켜 손상된 피부장벽을 재구성하고, 염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 경로를 억제하는 물질로 알려진 PPARα(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha)의 수준을 상기 C2C12 세포에서 웨스턴블럿 방법을 통해 분석하였다(도 8b).
도 8b에서 보듯이, C2C12세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하면 PPARα의 수준이 감소되지만, 이후 줄기세포 추출물을 처리하면 감소된 PPARα의 수준이 회복됨을 확인하였다.
상술한 결과를 종합하면, 줄기세포 추출물은 염증성 질환에서 공통적으로 발견되는 염증세포의 손상을 회복시킬 수 있고, 이러한 회복효과는 줄기세포 보다도 줄기세포 추출물이 우수함을 확인하였으며, 실제로 염증성 장질환이 발병된 동물모델을 대상으로 상기 줄기세포 추출물의 효과를 확인한 결과, 만성 또는 급성 염증성 장질환이 발병된 동물모델의 증상을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 줄기세포 추출물은 다양한 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 만능줄기세포, 다능성 줄기세포 또는 유도만능줄기세포인 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 추출물은 줄기세포를 용해, 파쇄 또는 투과방법으로 처리하여 수득한 줄기세포 현탁액, 상기 현탁액을 여과하여 수득한 액상 추출물 또는 상기 액상 추출물의 건조분말인 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 알레르기성 염증질환, 염증성 피부질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환 또는 염증성 장질환인 것인, 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염증성 피부질환은 아토피피부염, 건선, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 알러지 및 과민증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 염증성 장질환인 것인, 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 염증성 질환이 발병되거나 또는 발병될 가능성이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법.
  8. 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 질환 개선용 식품 조성물.
  9. 줄기세포 추출물을 포함하는, 염증성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 염증성 피부질환은 아토피피부염, 건선, 접촉성피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 알러지 및 과민증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인, 화장료 조성물.
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