WO2017164409A1 - 疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチン - Google Patents

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啓徳 中神
森下　竜一
昭子 天満
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国立大学法人大阪大学
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    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to a conjugate vaccine that targets an in vivo protein that causes disease.
  • a site that causes immunity induction such as antibody induction against a target protein may be used by binding to a carrier protein.
  • carrier proteins KLH (Keyhole limpet hemocyanin), OVA (Ovalbumin), BSA (Bovine serum albumin) and the like are known.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Non-Patent Document 2 KLH, OVA, BSA, etc. have antigenicity per se, and the antigenicity of the carrier protein itself may become a problem when immunizing by conjugating an epitope that is not highly antigenic.
  • the present inventors have disclosed that a conjugate of an epitope peptide of DPP4 and KLH is used for the prevention or treatment of diabetes (Patent Document 1).
  • the present inventors also developed a DNA vaccine comprising a polynucleotide encoding an IL-17A epitope peptide and a polynucleotide encoding a hepatitis B virus core antigen polypeptide as a disease involving IL-17A as an exacerbation factor. It is disclosed for use in the prevention or treatment of (systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis, etc.) (Patent Document 2).
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • rheumatoid arthritis etc.
  • the present invention relates to a vaccine containing a complex in which a carrier protein is linked to an epitope of an in vivo protein that is a cause of a disease, wherein the vaccine protein has a low antigenicity and has an antibody-producing ability effective as a vaccine.
  • the issue is to provide.
  • a vaccine comprising a complex of a peptide consisting of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an in vivo protein epitope that causes disease.
  • the in vivo protein is one selected from the group consisting of DPP4, IL-17A, IgE, S100A9 and PCSK9.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence in which the epitope of S100A9 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 with one or two amino acids deleted, substituted or added The vaccine according to [2] above.
  • An effective amount of a complex of a peptide consisting of an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an epitope of an in vivo protein causing a disease is administered to an animal.
  • a method for preventing or treating a disease caused by the in vivo protein is administered to an animal.
  • a peptide comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 for producing a medicament for preventing or treating a disease caused by an in vivo protein, and the in vivo protein Of complex with other epitopes.
  • FIG. 5 is a view showing the results of evaluating the antibody production effect of an OSK-1-DPP4 conjugate in which an OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and a mouse DPP4 epitope peptide (SEQ ID NO: 17) are linked using ⁇ -Acp as a linker. . It is a figure which shows the result of having compared the antibody production effect of OSK-1-DPP4 conjugate, and the antibody production effect of conjugate (KLH-DPP4) of KLH and the epitope peptide (sequence number 17) of mouse
  • FIG. It is a figure which shows the result of having evaluated the antibody production effect by an OSK-1-IL-17A conjugate. It is a figure which shows the result of having evaluated the medicinal effect of OSK-1-IL-17A conjugate with the skin state of the imiquimod-induced psoriasis like dermatitis model mouse.
  • FIG. 6 is a view showing the results of F4 / 80 staining of the skin on the 12th day from the initiation of psoriasis induction in an imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mouse administered with OSK-1-IL-17A conjugate or KLH-IL-17A conjugate. is there.
  • FIG. 6 is a view showing the results of F4 / 80 staining of the skin on the 12th day from the initiation of psoriasis induction in an imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mouse administered with OSK-1-IL-17A conjugate or KLH-IL-17A conjugate. is there.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of Gr-1 staining of the skin on the 12th day from the initiation of psoriasis induction in an imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mouse administered with OSK-1-IL-17A conjugate or KLH-IL-17A conjugate. is there. It is a figure which shows the result of having measured the blood IL-17 density
  • the present invention provides a conjugate vaccine that targets in vivo proteins that cause disease.
  • the vaccine of the present invention is a vaccine comprising a complex of a peptide consisting of the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (ELKLIFLHRLKRLRKRLRKRK) and an epitope of an in vivo protein causing a disease. I just need it.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be referred to as OSK-1 peptide or OSK-1.
  • conjugate and “complex” are used synonymously.
  • vaccine means a composition comprising an immunogen that causes an immune response when administered to an animal. Therefore, the vaccine of the present invention can be rephrased as an immunogenic composition.
  • the vaccine of the present invention is not limited to those administered prophylactically, and may be administered therapeutically after the onset of a disease.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 examples include an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is done. Preferably, it is an amino acid sequence in which 1 to 3, more preferably 1 to 2, and still more preferably 1 amino acid is deleted, substituted or added.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably a peptide having substantially the same quality of activity as the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antibody producing ability by a complex with an epitope of an in vivo protein is equivalent to the antibody producing ability by a complex of the same in vivo protein epitope and a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. (For example, about 0.5 to 2 times).
  • the in vivo protein causing the disease is not particularly limited, and examples thereof include DPP4, IL-17A, IgE, S100A9, and PCSK9.
  • in vivo protein means an endogenous protein.
  • DPP4 (Dipeptidyl Peptidase-4) is an enzyme that degrades incretin involved in insulin secretion.
  • Incretin is a gastrointestinal hormone that promotes insulin secretion during high blood sugar levels such as after meals and lowers blood glucose levels. Therefore, if the function of DPP4 is inhibited to suppress the degradation of incretin, the concentration of incretin is increased, insulin secretion is promoted, and diabetes symptoms can be improved. Therefore, many DPP4 inhibitors have been developed and approved as antidiabetic agents. Therefore, it can be expected to treat diabetes with a vaccine that induces anti-DPP4 antibodies.
  • the epitope of human DPP4 used in the OSK-1-DPP4 conjugate is not particularly limited as long as it is an epitope capable of producing an antibody that inhibits the function of DPP4 (neutralizing antibody). It can be used suitably.
  • ENSTFDEFG SEQ ID NO: 2)
  • NKRQLITEE SEQ ID NO: 3
  • -KTNYRLKLYS SEQ ID NO: 4
  • YSDESLQYPK SEQ ID NO: 5
  • PHFDKSKKY SEQ ID NO: 6
  • GLPTPEDDNLD SEQ ID NO: 7
  • FSKEAKYYQ SEQ ID NO: 8
  • NSSVFLENSTFDEFG accession numbers of the amino acid sequence of human DPP4 and the base sequence of the gene encoding human DPP4 are NP_001926 (NCBI) and NM_001935 (NCBI), respectively.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 9 has an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added, and produces an antibody that inhibits the function of DPP4. Possible peptides are also suitable as epitopes of human DPP4 for use in OSK-1-DPP4 conjugates.
  • IL-17A is a homodimeric glycoprotein and is also simply referred to as IL-17.
  • IL-17A is mainly produced from activated T cells and acts on a wide range of cells such as fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, and macrophages to produce various factors such as inflammatory cytokines, chemokines, and cell adhesion factors. It is known to induce inflammation.
  • Human anti-human IL-17A monoclonal antibody (secukinumab) has been used as a treatment for psoriasis vulgaris and psoriatic arthritis.
  • IL-17A is also involved in various cancers such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, inflammatory bowel disease, non-small cell lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer, arteriosclerosis, etc. It has been reported to do. Therefore, it can be expected that these IL-17A-related diseases are treated with vaccines that induce anti-IL-17A antibodies.
  • the epitope of human IL-17A used in the OSK-1-IL-17A conjugate is not particularly limited as long as it is an epitope capable of producing an antibody that inhibits the function of IL-17A (neutralizing antibody).
  • a peptide consisting of an amino acid sequence can be preferably used.
  • RSSDYYNR (SEQ ID NO: 10) PKRSSDYYNRSTSPW (SEQ ID NO: 11) CPNSEDKNFPR (SEQ ID NO: 29) RNEDPERYPS (SEQ ID NO: 30) NRSTSPW (SEQ ID NO: 31) ⁇ LHRNEDP (SEQ ID NO: 32) RYPSVIWEA (SEQ ID NO: 33) PKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 34) -TNPKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 35) -TNTNPKRSSDYYNR (SEQ ID NO: 36)
  • accession numbers of the amino acid sequence of human IL-17A and the base sequence of the gene encoding human IL-17A are NP_002181 (NCBI) and NM_002190 (NCBI), respectively.
  • a peptide capable of producing an antibody that inhibits can also be suitably used as an epitope of human IL-17A used in the OSK-1-IL-17A conjugate.
  • a peptide consisting of a partial sequence containing the amino acid sequence at positions 3-10 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is also suitable as an epitope of human IL-17A used for the OSK-1-IL-17A conjugate. is there.
  • allergens are caused by specific substances (allergens).
  • allergens enter the body, the immune system is activated and IgE is produced.
  • the produced IgE antibody is retained in a state of binding to mast cells and basophils.
  • chemical mediators such as histamine and leukotriene are released to cause allergic symptoms.
  • an allergic reaction has occurred for a certain allergen, specific IgE for that allergen is excessively produced, and this causes allergic symptoms to worsen.
  • anti-human IgE antibody omalizumab
  • it can be expected to treat allergic diseases such as bronchial asthma, hay fever, allergic conjunctivitis, and atopic dermatitis with a vaccine that induces anti-IgE antibodies.
  • the epitope of human IgE used in the OSK-1-IgE conjugate is not particularly limited as long as it is an epitope capable of producing an antibody that inhibits the function of IgE (neutralizing antibody). It can be used suitably.
  • YQCRVTHPHLP SEQ ID NO: 12
  • accession numbers of the amino acid sequence of the human immunoglobulin ⁇ chain constant region and the base sequence of the gene encoding the human immunoglobulin ⁇ chain constant region are P01854 (UniProtKB) and NG_001019 (NCBI), respectively.
  • peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, a peptide comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added, and capable of producing an antibody that inhibits the function of IgE, It is suitable as an epitope of human IgE used in OSK-1-IgE conjugate.
  • the S100 protein is a calcium-binding protein having two EF-hands that are expressed specifically in cell types, and 20 types of subfamilies have been confirmed so far.
  • S100A9 (also referred to as MRP14) belongs to the low molecular weight calcium binding S100 protein and is known to be associated with various inflammatory diseases. In patients with numerous inflammatory diseases including cellular arteritis, cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, skin disease, chronic inflammatory bowel disease, chronic bronchitis, some malignant tumors, and autoimmune diseases, S100A9 serum levels have been shown to increase. Further, it has been reported that blocking S100A9 may prevent thrombus without increasing the risk of bleeding. Therefore, it can be expected that the anti-S100A9 antibody-inducing vaccine prevents thrombus formation in atherothrombosis, myocardial infarction or cerebral infarction.
  • the epitope of human S100A9 used in the OSK-1-S100A9 conjugate is not particularly limited as long as it is an epitope capable of producing an antibody (neutralizing antibody) that inhibits the function of S100A9, but a peptide comprising the following amino acid sequence: It can be used suitably.
  • GHHHKPGGLGE SEQ ID NO: 13
  • accession numbers of the amino acid sequence of human S100A9 and the base sequence of the gene encoding human S100A9 are NP_002956 (NCBI) and NM_002965 (NCBI), respectively.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added, and capable of producing an antibody that inhibits the function of S100A9 It is suitable as an epitope of human S100A9 used in the OSK-1-S100A9 conjugate.
  • PCSK9 prote convertase subtilisin / kexin type 9
  • PCSK9 degrades the LDL receptor expressed on the surface of hepatocytes and Have been shown to reduce the ability to take up LDL-C in the blood.
  • Anti-human PCSK9 monoclonal antibody ebolocoumab
  • RNAi drugs that inhibit the function of PCSK9 have been developed. Therefore, it can be expected to treat hypercholesterolemia with a vaccine that induces anti-PCSK9 antibody.
  • the epitope of human PCSK9 used in the OSK-1-PCSK9 conjugate is not particularly limited as long as it can produce an antibody (neutralizing antibody) that inhibits the function of PCSK9. It can be used suitably.
  • -LRPRGQPNQC SEQ ID NO: 14
  • -SRHLAQASQ SEQ ID NO: 15
  • SRSGKRRRGER SEQ ID NO: 16
  • accession numbers of the amino acid sequence of human PCSK9 and the base sequence of the gene encoding human PCSK9 are NP_777596 (NCBI) and NM_174936 (NCBI), respectively.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 14 to 16 above, comprising an amino acid sequence in which one or two amino acids are deleted, substituted or added, and producing an antibody that inhibits the function of PCSK9 Possible peptides are also suitable as epitopes for human PCSK9 used in OSK-1-PCSK9 conjugates.
  • the epitope sequence of the experimental animal corresponding to the above human epitope sequence.
  • the corresponding epitope sequence of the experimental animal to be used can be designed by obtaining the amino acid sequence of the target protein using a known database (NCBI or the like) and aligning it with the corresponding human amino acid sequence.
  • Table 1 shows mouse epitope sequences corresponding to the human epitope sequences of SEQ ID NOs: 2 to 16 above.
  • the full length amino acid sequence of human DPP4 is NP_001926
  • the full length amino acid sequence of mouse DPP4 is AAH22183
  • the full length amino acid sequence of human IL-17A is NP_002181
  • the full length amino acid sequence of mouse IL-17A is NP_034682
  • the full length amino acid sequence of human IgE P01854 mouse IgE full length amino acid sequence P06336, human S100A9 full length amino acid sequence NP_002956, mouse S100A9 full length amino acid sequence CAC14292, human PCSK9 full length amino acid sequence NP_777596, mouse PCSK9 full length amino acid sequence NP_705793 Based on the amino acid sequence registered by session number.
  • the size of the epitope of the in vivo protein used in the vaccine of the present invention is not particularly limited, but is preferably 20 amino acids or less, more preferably 15 amino acids or less, further preferably 13 amino acids or less, further preferably 12 amino acids or less, 11 Amino acids or less are more preferred, and 10 amino acids or less are more preferred. Although a minimum is not specifically limited, 3 or more amino acids are preferable, 4 or more amino acids are more preferable, 5 or more amino acids are more preferable, and 6 or more amino acids are more preferable.
  • the complex of the OSK-1 peptide and the epitope of the in vivo protein may be linked directly or via a linker (synonymous with spacer).
  • the linker is not particularly limited as long as it can link the epitope of OSK-1 peptide and in vivo protein.
  • aminocarboxylic acids such as ⁇ -aminoalanine, ⁇ -aminobutyric acid, ⁇ -aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid, 12-aminolauric acid, glutamic acid, and p-aminobenzoic acid can be used.
  • L-amino acids existing in natural proteins and their D-amino acids can also be used.
  • ⁇ -aminocaproic acid is used as a linker, but it is not limited thereto.
  • the order of ligation in the complex of the OSK-1 peptide and the epitope of the in vivo protein is not particularly limited.
  • the N-terminal side may be the OSK-1 peptide and the C-terminal side may be the in vivo protein epitope, and conversely the N-terminal side is the in vivo protein.
  • the OSK-1 peptide may be used on the C-terminal side.
  • the N-terminal side is the OSK-1 peptide and the C-terminal side is the epitope sequence of the in vivo protein.
  • the N-terminal amino acid is preferably acetylated.
  • the C-terminal amino acid of the complex is preferably amidated. More preferably, the N-terminal amino acid of the complex is acetylated and the C-terminal amino acid is amidated.
  • a complex of an OSK-1 peptide and an epitope of an in vivo protein can be produced as a fusion protein.
  • a fusion gene encoding a fusion protein of an epitope of OSK-1 peptide and in vivo protein is prepared, and a recombinant expression vector in which the gene is inserted is constructed, It can be produced by introducing it into a suitable host cell, expressing it as a recombinant protein, and purifying it.
  • the complex between the OSK-1 peptide and the in vivo protein epitope uses the above fusion gene and a known in vitro transcription / translation system (for example, a cell-free protein synthesis system derived from rabbit reticulocyte, wheat germ or Escherichia coli). Can be manufactured.
  • a cell-free protein synthesis system derived from rabbit reticulocyte, wheat germ or Escherichia coli.
  • the complex is expressed on the phage surface without isolation and purification. It is also possible to administer the subject animal as it is.
  • a complex of an OSK-1 peptide and an epitope of an in vivo protein can be produced by a solid phase synthesis method (Fmoc method, Boc method) or a liquid phase synthesis method according to a known general peptide synthesis protocol. it can.
  • the complex is a direct link between the OSK-1 peptide and the in vivo protein epitope, or the complex is the link between the OSK-1 peptide and the in vivo protein epitope via an appropriate amino acid.
  • epitopes of OSK-1 peptide and in vivo protein may be synthesized separately, and then the two peptides may be linked using an appropriate linker.
  • the linker can be introduced by a method well known in peptide synthesis chemistry.
  • a peptide fragment up to the linker position is prepared by a standard method, and the linker is used with a condensing agent that is used in peptide synthesis chemistry under standard conditions using an appropriately protected amino group of an aminocarboxylic acid used as a linker.
  • the desired amino acid at the next position may be introduced.
  • a solid phase peptide synthesis method often used in an automatic peptide synthesizer is an example.
  • aminocarboxylic acid protecting group used in such an operation examples include a tBOC (tert-Butyl OxyylCarbonyl) group, FMOC (Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl) group, and the like.
  • condensing agent examples include carbodiimide compounds such as DCC (N, N'-Dicyclohexylcarbodiimide) and EDC ((N- (3-Dimethylaminopropyl) propyl-N'-ethylcarbodiimide), CDI (1,1'- carbonyldiimidazole) and the like.
  • Imidazole compounds such as BOP (benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate), HBTU (O- (Benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate)
  • Uronium salt compounds such as HCTU (O- (6-Chlorobenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) can be used.
  • the vaccine of the present invention is useful in that it can induce an antibody that inhibits the function of a protein in a living body that causes a disease without including an adjuvant.
  • the vaccine of the present invention may contain one or more adjuvants.
  • the vaccine of the present invention contains an adjuvant, it can be appropriately selected from known adjuvants.
  • aluminum adjuvant for example, aluminum salt such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate or a combination thereof), Freund's adjuvant (complete or incomplete), TLR ligand (for example, CpG, Poly (I : C), Pam3CSK4, etc.), BAY, DC-chol, pcpp, monophosphoryl lipid A, QS-21, cholera toxin, formylmethionyl peptide and the like.
  • it is an aluminum adjuvant, a TLR ligand, or a combination thereof.
  • the compounding amount of the adjuvant is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of the adjuvant.
  • an aluminum adjuvant aluminum hydroxide
  • CpG calcium phosphate
  • about 1 to 100 times the amount of aluminum adjuvant and about 1 to 50 times the amount of CpG may be added to the fusion protein of the present invention in a mass ratio. preferable.
  • the vaccine of the present invention can be administered by oral administration or parenteral administration.
  • parenteral administration include intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, intranasal administration, transdermal administration, transmucosal administration, sublingual administration, and inhalation administration.
  • parenteral administration and more preferred is intradermal administration, subcutaneous administration or intramuscular administration.
  • the means for parenteral administration includes microneedle injection, needleless injection, stamping and the like.
  • the vaccine of the present invention can be formulated by appropriately combining a complex of an OSK-1 peptide and an in vivo protein epitope, a pharmaceutically acceptable carrier, and an additive.
  • preparations for oral administration such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches It can be set as the formulation for administration. What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • additives used in solid preparations for oral administration include excipients such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, and corn starch; binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and magnesium aluminate metasilicate Dispersing agents such as corn starch; disintegrating agents such as calcium calcium glycolate; lubricants such as magnesium stearate; solubilizing agents such as glutamic acid and aspartic acid; stabilizers; hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose, etc.
  • excipients such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, and corn starch
  • binders such as hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and magnesium aluminate metasilicate Dispersing agents such as corn starch
  • disintegrating agents such as calcium calcium glycolate
  • lubricants such as magnesium stearate
  • solubilizing agents such as
  • Water-soluble polymers such as cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, etc .; sucrose, powdered sugar, sucrose, fructose, glucose, lactose, reduced maltose water candy, powder returned Maltose water syrup, glucose fructose liquid sugar, fructose glucose liquid sugar, honey, sorbitol, maltitol, mannitol, xylitol, erythritol, aspartame, saccharin, sodium saccharin, etc., white sugar, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc. Coating agents and the like.
  • Liquid preparations for oral administration are prepared by dissolving, suspending or emulsifying in commonly used diluents.
  • the diluent include purified water, ethanol, a mixed solution thereof and the like.
  • this liquid agent may contain a wetting agent, a suspending agent, an emulsifier, a sweetening agent, a flavoring agent, a fragrance, a preservative, a buffering agent and the like.
  • additives used for injections for parenteral administration include isotonic agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol; phosphate buffer Buffers such as acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer; methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoic acid Preservatives such as propyl, butyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax; hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol Thickeners such as sodium hydrogen sulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascor
  • solubilizers for injections, suitable solubilizers, for example, alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, lysolecithin, and pluronic polyol You may mix
  • Liquid preparations such as injections can be stored after removing moisture by freezing or lyophilization. The freeze-dried preparation is used by adding distilled water for injection at the time of use and re-dissolving it.
  • the vaccine of the present invention can be administered to any animal (human or non-human) having an immune system.
  • mammals such as humans, monkeys, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats, guinea pigs, rats and mice; and birds such as chickens, ducks and geese.
  • the vaccine of the present invention is useful as an animal drug, it is preferable to target human children and adults.
  • the number of administrations and the administration interval of the vaccine of the present invention are not particularly limited.
  • a single dose may be administered, or multiple doses may be administered at intervals of about 2 days to about 8 weeks.
  • the dose of the vaccine varies depending on the administration subject, administration method, etc., but the single dose is preferably about 0.01 ⁇ g to about 10 mg, more preferably about 0.1 ⁇ g to about 1 mg, more preferably about 1 ⁇ g to More preferably, it is about 0.1 mg.
  • the present invention includes a method for preventing or treating a disease caused by a target biological protein, comprising administering an effective amount of the vaccine of the present invention to an animal.
  • the present invention also includes the vaccine of the present invention for use in the prevention or treatment of diseases caused by in vivo proteins.
  • the present invention includes the use of the vaccine of the present invention for producing a medicament for the prevention or treatment of diseases caused by in vivo proteins.
  • OSK-1 used as a carrier protein for an epitope of an in vivo protein causing a disease is a peptide consisting of 20 amino acids, and since the antigenicity of OSK-1 itself is very low, the carrier Undesirable effects and side effects derived from the antigenicity of the protein can be reduced. On the other hand, since OSK-1 has a strong adjuvant effect despite being a short peptide, it can confer an antibody-producing ability effective as a vaccine.
  • antibodies produced by the complex of OSK-1 and an epitope of an in vivo protein contain not only Th2 type IgG1, but also Th1 type IgG2a, IgG2b, and IgG3, so there are side effects such as allergic reactions. This is very useful in that it can be reduced. Further, when a carrier protein derived from a natural product such as KLH is used, a problem of impurities occurs. However, since OSK-1 can be produced by synthesis, such a problem can be avoided. In addition, since OSK-1 is a short peptide, it is advantageous in that the production cost can be suppressed.
  • This crude peptide was purified using a reverse phase HPLC column (ODS) by elution with a gradient of 0.1% TFA-H 2 O / CH 3 CN. Fractions containing the desired product were collected and lyophilized to obtain the desired peptide.
  • the amino acid sequence of the synthesized peptide was confirmed using an amino acid sequencer G1000A (Hewlett Packard), PPSQ-23A (Shimadzu Corporation) or ProcisLC (ABI), and the N-terminal of the obtained peptide was acetylated.
  • Example 1 Examination of antibody production by OSK-1-DPP4 conjugate 1
  • An OSK-1-DPP4 conjugate (Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-ENSTFESFG) in which an OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and an epitope peptide of mouse DPP4 (SEQ ID NO: 17) are linked (conjugated) using ⁇ -Acp as a linker.
  • the antibody production effect by X ⁇ -Acp)) was evaluated.
  • the group composition was 2 groups (6 mice / group): saline group and OSK-1-DPP4 conjugate group (100 ⁇ g / mouse).
  • Balb / c mice were intradermally administered 3 times at 2-week intervals. Blood was collected before administration and every 2 weeks after administration until 8 weeks later, and the antibody titer against the DPP4 epitope peptide was measured by ELISA.
  • Example 2 Examination of antibody production by OSK-1-DPP4 conjugate 2
  • Antibody production by the same OSK-1-DPP4 conjugate as in Example 1 was confirmed by the antibody (KLH-DPP4) conjugate of KLH (Keyhole limpet hemocyanin) and the epitope peptide of mouse DPP4 (SEQ ID NO: 17). Comparison with production effect.
  • the group composition is KLH-DPP4 conjugate group (20 ⁇ g / mouse), OSK-1-DPP4 conjugate group (100 ⁇ g / mouse), OSK-1-DPP4 conjugate (100 ⁇ g / mouse) + Alum (Alhydrogel 2% (InvivoGen) 1 mg / mouse) was used in 3 groups (2 animals / group).
  • Balb / c mice were intradermally administered 3 times at 2-week intervals. Blood samples were collected before administration, every 2 weeks until 6 weeks and after 12 weeks, and the antibody titer against the DPP4 epitope peptide was measured by ELISA.
  • the results are shown in FIG.
  • the OSK-1-DPP4 conjugate was found to have the same antibody production ability as the KLH-DPP4 conjugate.
  • a synergistic effect was observed in the combination group of OSK-1-DPP4 conjugate and Alum.
  • Example 3 Analysis of IgG subclass of produced antibody
  • the IgG subclass of IgG antibody produced by the same OSK-1-DPP4 conjugate as in Examples 1 and 2 was compared to the IgG subclass of IgG antibody produced by the same KLH-DPP4 conjugate as in Example 2.
  • the group composition was OSK-1-DPP4 conjugate group (100 ⁇ g / mouse), KLH-DPP4 conjugate (20 ⁇ g / mouse) + Alum (Alhydrogel 2% (InvivoGen) 1 mg / mouse) combination group, KLH-DPP4 conjugate ( 20 ⁇ g / mouse) + OSK-1 (100 ⁇ g / mouse) combined group.
  • mice were intradermally administered 3 times at 2-week intervals and once 9 weeks after the start of administration, for a total of 4 times, and blood was collected 11 weeks after administration, and the antibody titer of IgG antibody against the DPP4 epitope peptide was determined as IgG subclass. Each was measured by ELISA.
  • IgG1 which is a Th2-type IgG
  • OSK-1-DPP4 conjugate group high production was also observed in IgG2a and IgG2b, which are Th1 type IgG.
  • the antibody titers of Th1 type IgG2b and IgG3 were high.
  • the group composition was saline group, WT1 peptide (100 ⁇ g / mouse) + poly (I: C) (InvivoGen; Poly (I: C) HMW VacciGrade, 50 ⁇ g / mouse) group, WT1 peptide (100 ⁇ g / mouse) + OSK ⁇
  • the vaccine was administered to C57BL / 6J mice once a week for four times, and B16F10 melanoma cells (1 ⁇ 10 5 cells / mouse) were transplanted into the back skin one week after the fourth administration. The vaccine was administered again one week after cell transplantation. After cell transplantation, body weight and tumor diameter were measured twice a week. The tumor diameter was measured using a digital caliper, and the major axis ⁇ minor axis 2 was defined as the tumor volume.
  • the tumor volume results are shown in FIG. 4, and the survival rate results are shown in FIG.
  • the OSK-1 peptide was administered as an adjuvant together with the WT1 peptide vaccine, no tumor growth inhibitory effect or life prolonging effect was observed.
  • the SK-1-WT1 conjugate group a tumor growth inhibitory effect and a life prolonging effect were observed.
  • C57BL / 6J mice were transplanted with B16F10 melanoma cells (3 ⁇ 10 5 cells / mouse) into the dorsal skin, and the vaccine was administered intradermally on the same day.
  • the day of cell transplantation was Day 0, and the vaccine was administered to Day 7, 14, 21, 28, 35.
  • the tumor diameter was measured twice a week using a digital caliper, and the major axis ⁇ minor axis 2 was taken as the tumor volume.
  • the results of tumor volume are shown in FIG. 6, and the results of survival rate are shown in FIG.
  • the tumor growth inhibitory effect of the OSK-1-WT1 conjugate is weak, but the tumor volume is lower than that of the physiological saline administration group (negative control) until Day 32. It changed.
  • the OSK-1-WT1 conjugate showed a life-prolonging effect equivalent to that of the WT1 peptide + poly (I: C) group and the cisplatin group.
  • OSK-1-DPP4 conjugate 3 OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1), 7 types of epitope peptides of mouse DPP4 (SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8, 18, 19, 20) and 1 type of epitope peptide of human DPP4 (SEQ ID NO: 9) Eight kinds of OSK-1-DPP4 conjugates each conjugated with ⁇ -Acp as a linker were produced. Hereinafter, each OSK-1-DPP4 conjugate is represented by “OSK1-DDP4-SEQ ID NO”.
  • OSK-1-DPP4 conjugate containing 6 kinds of mouse DPP4 epitope peptides (SEQ ID NOs: 3, 5, 6, 8, 18, 19) at a dose of 100 ⁇ g / mouse to Balb / c mice every 2 weeks was administered intradermally three times.
  • blood was collected every 2 weeks from administration, and the antibody titer against each epitope peptide was measured by ELISA.
  • Table 2 shows antibody titers 4 weeks after the first administration.
  • Antibody titers are shown as half maximum values. The half maximum value is a dilution ratio of serum showing half the maximum absorbance in the measuring instrument, and was calculated by creating a sigmoid curve of serum dilution ratio and absorbance.
  • OSK-1-DPP4 conjugates OSK1-DDP4-6, OSK1-DDP4-9 and OSK1-DDP4-12, were skinned 3 times at 2-week intervals in Balb / c mice at a dose of 250 ⁇ g per animal. It was administered internally. Blood was collected 4 weeks, 9 weeks and 13 weeks after the first administration, and the antibody titer against each epitope peptide was measured by ELISA. The results are shown in Table 3. Antibody titers are shown as half maximum values.
  • Example 5 Evaluation of OSK-1-DPP4 conjugate by HbA1c value
  • the OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and the DPP4 epitope peptide (SEQ ID NO: 6) were combined with ⁇ -Acp as a linker, and the OSK-1-DPP4 conjugate was administered at a dose of 100 ⁇ g per fat.
  • DIO SERIES DIET D12492, CLEA Japan, Inc. was administered intradermally to Balb / c mice that were ingested ad libitum 3 times every 2 weeks.
  • a portion of blood collected 57 days after the first administration was quickly dispensed into an EDTA-treated tube and mixed by inversion to prepare EDTA-treated blood.
  • HbA1c value (%, NGSP) of the OSK-1-DPP4 conjugate group showed an improvement of -0.4% compared to the HbA1c value of the control group (KLH administration group).
  • Example 6 Evaluation of OSK-1-DPP4 conjugate by oral glucose tolerance test (OGTT)]
  • An OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and two kinds of DPP4 epitope peptides (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 9) were respectively conjugated with two kinds of OSK-1-DPP4 conjugates using ⁇ -Acp as a linker, Balb / c mice that received a high fat diet (DIO SERIES DIET D12492, CLEA Japan, Inc.) at a dose of 250 ⁇ g per mouse were intradermally administered 3 times every 2 weeks. Further, on day 63 after the initial administration, 250 ⁇ g of OSK-1-DPP4 conjugate was intradermally administered per animal.
  • ⁇ -Acp high fat diet
  • an oral glucose tolerance test (OGTT) was performed. Fasting was performed for about 16 hours from the day before the OGTT was performed, and the fasted state was maintained during the OGTT. A 20% glucose solution was orally administered once at a dose of 5 mL / kg. Blood sampling and blood glucose level measurement were performed without anesthesia. The tail of the animal was lightly scratched with a razor, and the sugar concentration in the leaking blood was measured with a blood glucose self-monitoring device (Nipro Freestyle Freedom).
  • the blood glucose level was measured before and after glucose loading at a total of 5 points in time at 30, 60, 90 and 120 minutes, and the area under the blood glucose increase curve AUC (time * mg / dl) of each administration group from the change in concentration over time. was calculated.
  • AUC time * mg / dl
  • Example 7 Examination of IgE production by OSK-1-DPP4 conjugate
  • the production of IgE against the target protein by OSK1-DPP4-17 was compared with KLH-DPP4-17 in which the carrier protein was changed to KLH.
  • KLH-DPP4-17 group KLH-DPP4-17 was mixed and administered intradermally so that 20 ⁇ g / mouse and Alum (Alhydrogel 2% (InvivoGen)) were 1 mg / mouse.
  • the OSK-1-DPP4-17 group was administered intradermally at 100 ⁇ g / mouse.
  • Balb / c mice were intradermally administered 3 times at 2-week intervals, and then the fourth administration was performed at 11 weeks. Blood was collected on week 21, and the amount of IgE antibody against DPP4 in the serum was measured by ELISA.
  • OSK-1-IL-17A conjugate (1) Production of OSK-1-IL-17A conjugate OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and 10 kinds of epitope peptides of mouse IL-17A (SEQ ID NOs: 21, 22, 31-33, 37-41) Ten types of OSK-1-IL-17A conjugates each conjugated with ⁇ -Acp as a linker were produced.
  • OSK1-IL-SEQ ID NO As representative examples of these conjugates containing four types of epitope peptides (SEQ ID NOs: 21, 31, 32, and 40), FIGS. 9 to 12 show (A) amino acid analysis results and (B) HPLC analysis results, respectively. Other conjugates gave substantially similar analysis results.
  • Example 9 Evaluation of OSK-1-IL-17A conjugate by imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mouse (1)
  • the imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model was used as the psoriasis model.
  • 6 weeks old BALB / c mice were given 3 kinds of OSK-1-IL-17A conjugates (OSK1-IL-31, OSK1-IL-32, OSK1-IL-40) at a dose of 500 ⁇ g per mouse, Intradermal administration was performed 3 times every 2 weeks.
  • the skin condition (erythema, thickness, symptom range of white scale) was observed every day for 8 days (0-7 days) from the start of psoriasis induction, and each of 5 stages (0: none, 1: mild, 2) : Moderate, 3: severe, 4: very severe). Ear thickness was measured daily using digital calipers for 8 days (day 0-7) from the beginning of psoriasis induction. The result of the skin condition is shown in FIG. 14, and the result of the ear thickness is shown in FIG. The four OSK-1-IL-17A conjugates used were shown to inhibit imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis.
  • Example 10 Evaluation of OSK-1-IL-17A conjugate by imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mouse (2)]
  • OSK1-IL-21 as an OSK-1-IL-17A conjugate
  • Balb / c mice were treated every 3 weeks at a dose of 100 ⁇ g, 300 ⁇ g or 1000 ⁇ g every 2 weeks. It was administered intradermally.
  • KLH-IL-21 in which the carrier protein was changed to KLH was intradermally administered to Balb / c mice 3 times every 2 weeks at a dose of 20 ⁇ g per animal.
  • FIG. 17 shows changes in the skin state during the psoriasis-like dermatitis induction period (day 0 to 12), and FIG. 18 shows changes in the ear thickness during the psoriasis-like dermatitis induction period (day 0 to 7). It was shown to.
  • the keratinization tendency was stained by involucrin staining, which is the final marker of keratinization, with F4 / 80, which is a macrophage marker, and Gr-1, which is a granulocyte marker, to detect immune cells.
  • RNA in skin tissue was extracted using RNeasy Fibros Tissue Mini Kit.
  • Messenger RNAs of IL-17A, IL-17F, IL-22 and IL-23 inflammation-related factors were measured by real-time PCR using Taqman Gene Expression Assays primers and probes.
  • messenger RNA of various factors increased in mice not administered with OSK-1-IL-17A conjugate, but the expression of messenger RNA of each factor was suppressed in the OSK-1-IL-17A conjugate administration group. It was.
  • Examples 9 and 10 imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis model mice were used.
  • W. Jiang et al. (“A Toll-Like Receptor 7, 8, and 9 Antagonist Inhibits Th1 and Th17 Responses and Inflammasome Activation in a Model of IL-23-Induced Psoriasis” W. Jiang, et , 1784 Journal of Investigative Dermatology (2013), Volume 133).
  • mice using C57BL / 6 mice aged 6 to 8 weeks, 0.5 mg of mouse IL-23 was dissolved in 20 mL of PBS, and the test was performed on days 0, 2, 4, 6, 10, 12, and 14, for example.
  • Dermatitis is induced by intradermal injection in the animal's left ear. Mice that have induced dermatitis are randomly grouped and administered a test substance or a control substance (eg, PBS).
  • the test substance or control substance is administered subcutaneously on days 3, 6, 9, 12, and 15.
  • the thickness of the pinna is measured with a digital caliper.
  • the pinna is collected and used for histopathological examination.
  • Example 11 Investigation of antibody production by OSK-1-IgE conjugate
  • An OSK-1-IgE conjugate in which an OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and a mouse IgE epitope peptide (SEQ ID NO: 23) are conjugated using ⁇ -Acp as a linker was prepared, and a dose of 100 ⁇ g or 250 ⁇ g per animal was produced. Then, the Balb / c mice were intradermally administered 3 times at 2-week intervals. Blood was collected every 2 weeks from the administration, and the antibody titer against each epitope peptide was measured by ELISA. The antibody titers after 8 weeks are shown in Table 5. Antibody titers are shown as half maximum values.
  • Example 12 Examination of antibody production by OSK-1-PCSK9 conjugate
  • An OSK-1 peptide (SEQ ID NO: 1) and three kinds of mouse PCSK9 epitope peptides (SEQ ID NO: 25, 26, 27) were respectively conjugated with three kinds of OSK-1-PCSK9 conjugates each having ⁇ -Acp as a linker.
  • the antibody titers after 8 weeks are shown in Table 6. Antibody titers are shown as half maximum values.
  • Example 13 Evaluation of OSK-1-PCSK9 conjugate by PCSK9 concentration in blood
  • concentration of PCSK9 in serum collected from mice (OSK-1-PCSK9 conjugate administration group) administered with OSK1-PCSK9-27 at a dose of 250 ⁇ g was measured before administration and 2, 4, and 6 weeks after administration. It was measured.
  • an OSK-1 administration group was provided, administration and blood collection were performed according to the same schedule, and the PCSK9 concentration in serum was measured.
  • Mouse Protein Convert 9 / PCSK9 Quantikine ELISA Kit R & D systems
  • mice in the KLH administration group were administered KLH in an amount equal to KLH contained in the conjugate administered to the conjugate administration group.
  • KLH-PCSK9 conjugate or KLH alone was mixed with an equal volume of Freund's adjuvant (Wako Pure Chemical Industries) and administered subcutaneously. Freund's complete adjuvant was used for the first time, and Freund's incomplete adjuvant was used for the second and subsequent times. A total of 3 times (Days 0, 14, and 28), the conjugate was administered, and blood was collected 24 weeks after the final administration to measure lipid levels.
  • the values of CM (chylomicron) and VLDL were reduced to about half
  • TG neutral fat

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Abstract

本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９等の疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含み、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有するワクチンを提供する。

Description

疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチン
　本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチンに関するものである。
　天然痘などの感染症の予防に古くから使われてきたワクチンの技術を癌や生活習慣病などの治療に用いる試みがされている。このような治療用ワクチンでは、標的タンパクに対する抗体誘導等の免疫誘導を引き起こす部位（エピトープ部位）をキャリアタンパク質に結合して用いる場合がある。そのようなキャリアタンパクとしてはＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン）、ＯＶＡ（Ovalbumin：オボアルブミン）、ＢＳＡ（Bovine serum albumin：ウシ血清アルブミン）等が知られている。例えば、ＩＮＦ－αの改変体を抗原部位として用いＫＬＨに結合したものを投与し全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を治療することが試みられている（非特許文献１）。
　しかしながら、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＢＳＡ等は、それ自体が抗原性を有しており、抗原性が高くないエピトープをコンジュゲートして免疫する場合に、キャリアタンパク自体の抗原性が問題となる場合があった（非特許文献２）。
　本発明者らは、ＤＰＰ４のエピトープペプチドとＫＬＨとのコンジュゲートを、糖尿病の予防または治療に用いることを開示している（特許文献１）。また、本発明者らは、ＩＬ－１７ＡのエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドとＢ型肝炎のウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンを、ＩＬ－１７Ａが増悪因子として関与する疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ等）の予防または治療に用いることを開示している（特許文献２）。
ＷＯ２０１５／０３３８３１ ＷＯ２０１５／０９９１６７
ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 65, No. 2, February 2013, pp 447-456. N.E. van Houten, M.B. Zwick1, A. Menendez, and J.K. Scott Vaccine. 2006 May 8; 24(19): 4188-4200.
　本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープにキャリアタンパク質を連結した複合体を含有するワクチンであって、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有するワクチンを提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチン。
［２］生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である前記［１］に記載のワクチン。
［３］ＩＬ－１７Ａのエピトープが、配列番号１０、１１、２９～３６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１０、１１、２９～３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［４］ＤＰＰ４のエピトープが、配列番号２～９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号２～９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［５］ＩｇＥのエピトープが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［６］Ｓ１００Ａ９のエピトープが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［７］ＰＣＳＫ９のエピトープが、配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである前記［２］に記載のワクチン。
［８］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと生体内タンパク質のエピトープが、ε－アミノカプロン酸を介して連結されている前記［１］～［７］のいずれかに記載のワクチン。
［９］前記複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されている前記［１］～［８］のいずれかに記載のワクチン。
［１０］前記複合体のＣ末端のアミノ酸がアミド化されている前記［１］～［９］のいずれかに記載のワクチン。
［１１］配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含む免疫原性組成物。
［１２］生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である前記［１１］に記載の免疫原性組成物。
［１３］配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体の有効量を、動物に投与することを含む、前記生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法。
［１４］生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体。
［１５］生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体の使用。
　本発明により、キャリアタンパク質の抗原性が低く、かつワクチンとして有効な抗体産生能を有する、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープにキャリアタンパク質を連結した複合体を含有するワクチンを提供することができる。
ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）を、ε－Ａｃｐをリンカーとして連結したＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生作用を評価した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの抗体産生作用と、ＫＬＨとマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）とのコンジュゲート（ＫＬＨ－ＤＰＰ４）の抗体産生作用を比較した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧのサブクラスを解析し、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍ併用群およびＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートとＯＳＫ－１併用群と比較した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とＷＴ１プペプチド（配列番号２８）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートを予め投与したマウスにがん細胞を皮下移植し、腫瘍増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートを予め投与したマウスにがん細胞を皮下移植し、延命効果を評価した結果を示す図である。 マウスにがん細胞を皮下移植し、移植と同日からＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートの投与を開始した場合の腫瘍増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。 マウスにがん細胞を皮下移植し、移植と同日からＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートの投与を開始した場合の延命効果を評価した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートンによる標的タンパクに対するＩｇＥ産生を、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートによる標的タンパクに対するＩｇＥ産生と比較した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１ペプチドとマウスＩＬ－１７Ａのエピトープペプチド（配列番号２１）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＯＳＫ－１ペプチドとマウスＩＬ－１７Ａのエピトープペプチド（配列番号３１）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＯＳＫ－１ペプチドとマウスＩＬ－１７Ａのエピトープペプチド（配列番号３２）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＯＳＫ－１ペプチドとマウスＩＬ－１７Ａのエピトープペプチド（配列番号４０）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートによる抗体産生作用を評価した結果を示す図である。 イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの皮膚状態により、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。 イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの耳の厚さにより、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から６日目の皮膚状態を示す図である。 イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの皮膚状態により、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートとＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの薬効を比較した結果を示す図である。 イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの耳の厚さにより、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートとＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの薬効を比較した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をインボルクリン染色した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をＦ４／８０染色した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスの乾癬誘導開始から１２日目の皮膚をＧｒ－１染色した結果を示す図である。 ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートまたはＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを投与したイミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスにおける血中ＩＬ－１７濃度を測定した結果を示す図である。 血中ＰＣＳＫ９濃度により、ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートの薬効を評価した結果を示す図である。
　本発明は、疾患の要因となる生体内タンパク質を標的とするコンジュゲートワクチンを提供する。本発明のワクチンは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ）と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチンであればよい。本明細書において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをＯＳＫ－１ペプチドまたはＯＳＫ－１と記載する場合がある。なお、本明細書において、「コンジュゲート」と「複合体」は同義に使用される。
　本明細書において「ワクチン」は、動物に投与することにより免疫反応を引き起こす免疫原を含む組成物を意味する。それゆえ、本発明のワクチンは、免疫原性組成物と換言することができる。本発明のワクチンは、予防的に投与されるものに限定されず、疾患が発症した後に治療的に投与されるものであってもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～４個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列が挙げられる。好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列である。配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をからなるペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドが好ましい。具体的には、生体内タンパク質のエピトープとの複合体による抗体産生能が、同一の生体内タンパク質のエピトープと配列番号１に示されるアミノ酸配列をからなるペプチドとの複合体による抗体産生能と同等（例えば、約０．５～２倍）であることが挙げられる。
　疾患の要因となる生体内タンパク質は特に限定されないが、例えば、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９、ＰＣＳＫ９などが挙げられる。なお、本明細書において、「生体内タンパク質」は内在性タンパク質（endogenous protein）を意味する。
　ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチターゼ－４：Dipeptidyl Peptidase-4）は、インスリン分泌に関わるインクレチンを分解する酵素である。インクレチンは食事後などの高血糖時においてインスリン分泌を促進し、血糖値を低下させる消化管ホルモンである。そこで、ＤＰＰ４の機能を阻害してインクレチンの分解を抑えれば、インクレチン濃度が上昇し、インスリン分泌が促進されて糖尿病の症状を改善することができる。それゆえ、多数のＤＰＰ４阻害薬が糖尿病治療薬として開発、承認されている。したがって、抗ＤＰＰ４抗体を誘導するワクチンにより、糖尿病を治療することが期待できる。
　ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートに使用されるヒトＤＰＰ４のエピトープは、ＤＰＰ４の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＥＮＳＴＦＤＥＦＧ（配列番号２）
・ＮＫＲＱＬＩＴＥＥ（配列番号３）
・ＫＮＴＹＲＬＫＬＹＳ（配列番号４）
・ＹＳＤＥＳＬＱＹＰＫ（配列番号５）
・ＰＰＨＦＤＫＳＫＫＹ（配列番号６）
・ＧＬＰＴＰＥＤＮＬＤ（配列番号７）
・ＦＳＫＥＡＫＹＹＱ（配列番号８）
・ＮＳＳＶＦＬＥＮＳＴＦＤＥＦＧ（配列番号９）
　なお、ヒトＤＰＰ４のアミノ酸配列およびヒトＤＰＰ４をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_001926（NCBI）およびNM_001935（NCBI）である。
　また、上記配列番号２～９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＰＰ４の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートに使用されるヒトＤＰＰ４のエピトープとして好適である。
　ＩＬ－１７Ａ（インターロイキン１７Ａ：interleukin-17A）は、ホモ２量体の糖タンパク質であり、単にＩＬ－１７とも称される。ＩＬ－１７Ａは主に活性化Ｔ細胞より産生され、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、マクロファージなど広範囲にわたる細胞に作用して、炎症性サイトカイン、ケモカイン、細胞接着因子などの種々の因子を誘導して炎症を誘導することが知られている。ヒト型抗ヒトＩＬ－１７Ａモノクローナル抗体（セクキヌマブ）は、尋常性乾癬および関節症性乾癬の治療薬として使用されている。また、ＩＬ－１７Ａは、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患などの自己免疫疾患、非小細胞性肺癌、大腸癌、膵臓癌をはじめとする様々な癌、動脈硬化症などに関与することが報告されている。したがって、抗ＩＬ－１７Ａ抗体を誘導するワクチンにより、これらのＩＬ－１７Ａが関与する疾患を治療することが期待できる。
　ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ－１７Ａのエピトープは、ＩＬ－１７Ａの機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号１０）
・ＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲＳＴＳＰＷ（配列番号１１）
・ＣＰＮＳＥＤＫＮＦＰＲ（配列番号２９）
・ＲＮＥＤＰＥＲＹＰＳ（配列番号３０）
・ＮＲＳＴＳＰＷ（配列番号３１）
・ＬＨＲＮＥＤＰ（配列番号３２）
・ＲＹＰＳＶＩＷＥＡ（配列番号３３）
・ＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３４）
・ＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３５）
・ＴＮＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲ（配列番号３６）
　なお、ヒトＩＬ－１７Ａのアミノ酸配列およびヒトＩＬ－１７Ａをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_002181（NCBI）およびNM_002190（NCBI）である。
　また、上記配列番号１０、１１、２９～３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＩＬ－１７Ａの機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ－１７Ａのエピトープとして好適に用いることができる。さらに、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の第３－１０位のアミノ酸配列を含む部分配列からなるペプチドも、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートに使用されるヒトＩＬ－１７Ａのエピトープとして好適である。
　アレルギーは特定の物質（アレルゲン）により引き起こされ、アレルゲンが体内に入ると免疫系が作動しＩｇＥが産生される。産生されたＩｇＥ抗体は肥満細胞や好塩基球に結合した状態で保持され、再びアレルゲンが体内に入ってくるとＩｇＥとアレルゲンが結合しヒスタミンやロイコトリエンといったケミカルメディエーターが放出されアレルギー症状を引き起こす。あるアレルゲンに対してアレルギーを発症している場合、そのアレルゲンに対する特異的ＩｇＥが過剰に産生され、このことによりアレルギー症状は悪化していく。ＩｇＥの働きを阻害し、または無効化することによりアレルギー症状を緩和することが可能であり、抗ヒトＩｇＥ抗体（オマリズマブ）が気管支喘息の治療に用いられている。したがって、抗ＩｇＥ抗体を誘導するワクチンにより、気管支喘息、花粉症、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患を治療することが期待できる。
　ＯＳＫ－１－ＩｇＥコンジュゲートに使用されるヒトＩｇＥのエピトープは、ＩｇＥの機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＹＱＣＲＶＴＨＰＨＬＰ（配列番号１２）
　なお、ヒト免疫グロブリンε鎖定常領域のアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンε鎖定常領域をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれP01854（UniProtKB）およびNG_001019（NCBI）である。
　また、上記配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＩｇＥの機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ－１－ＩｇＥコンジュゲートに使用されるヒトＩｇＥのエピトープとして好適である。
　Ｓ１００タンパク質は、細胞種特異的に発現する２個のＥＦ－ｈａｎｄを持つカルシウム結合性タンパク質であり、現在までに２０種類のサブファミリーが確認されている。Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４とも称される。）は低分子量カルシウム結合性Ｓ１００タンパク質に属しており、種々の炎症性疾患に関連していることがわかっている。また、細胞性動脈炎、嚢胞性線維症、慢性関節リウマチ、皮膚病、慢性炎症性腸疾患、慢性気管支炎、いくつかの悪性腫瘍、および自己免疫疾患を含む数多くの炎症性疾患の患者において、Ｓ１００Ａ９血清レベルが亢進することが明らかにされている。また、Ｓ１００Ａ９を遮断すると、出血のリスクを上げずに血栓が予防される可能性があることが報告されている。したがって、抗Ｓ１００Ａ９抗体を誘導するワクチンにより、アテローム血栓症、心筋梗塞や脳梗塞における血栓形成を予防することが期待できる。
　ＯＳＫ－１－Ｓ１００Ａ９コンジュゲートに使用されるヒトＳ１００Ａ９のエピトープは、Ｓ１００Ａ９の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＧＨＨＨＫＰＧＬＧＥ（配列番号１３）
　なお、ヒトＳ１００Ａ９のアミノ酸配列およびヒトＳ１００Ａ９をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_002956（NCBI）およびNM_002965（NCBI）である。
　また、上記配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓ１００Ａ９の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ－１－Ｓ１００Ａ９コンジュゲートに使用されるヒトＳ１００Ａ９のエピトープとして好適である。
　ＰＣＳＫ９（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9）は、家族性高コレステロール血症の原因遺伝子であることが同定され、その後の研究からＰＣＳＫ９は肝細胞表面に発現しているＬＤＬ受容体を分解し、肝臓が血中のＬＤＬ－Ｃを取り込む能力を低下させることがわかっている。ＰＣＳＫ９の機能を阻害することにより、ＬＤＬ受容体の分解を抑制し、血中コレステロールの肝臓への取り込みを促進することによって血中コレステロール値を低下させることが可能である。抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（エボロクマブ）が家族性高コレステロール血症および高コレステロール血症の治療に使用されており、ＰＣＳＫ９の機能を阻害するＲＮＡｉ医薬が開発されている。したがって、抗ＰＣＳＫ９抗体を誘導するワクチンにより、高コレステロール血症を治療することが期待できる。
　ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートに使用されるヒトＰＣＳＫ９のエピトープは、ＰＣＳＫ９の機能を阻害する抗体（中和抗体）を産生可能なエピトープであれば特に限定されないが、以下のアミノ酸配列からなるペプチドを好適に用いることができる。
・ＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣ（配列番号１４）
・ＳＲＨＬＡＱＡＳＱ（配列番号１５）
・ＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲ（配列番号１６）
　なお、ヒトＰＣＳＫ９のアミノ酸配列およびヒトＰＣＳＫ９をコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNP_777596（NCBI）およびNM_174936（NCBI）である。
　また、上記配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ＰＣＳＫ９の機能を阻害する抗体を産生可能なペプチドも、ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートに使用されるヒトＰＣＳＫ９のエピトープとして好適である。
　なお、本発明のワクチンの効果を確認するために、実験動物（マウス等）を用いて実験を行う場合、上記のヒトエピトープ配列に対応する実験動物のエピトープ配列を用いて実験を行うことが好ましい。用いる実験動物の対応するエピトープ配列は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）を用いて標的タンパク質のアミノ酸配列を取得し、対応するヒトのアミノ段配列とアライメントすることにより設計することができる。表１に、上記配列番号２～１６のヒトエピトープ配列に対応するマウスエピトープ配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１において、ヒトＤＰＰ４の全長アミノ酸配列はNP_001926、マウスＤＰＰ４の全長アミノ酸配列はAAH22183、ヒトＩＬ－１７Ａの全長アミノ酸配列はNP_002181、マウスＩＬ－１７Ａの全長アミノ酸配列はNP_034682、ヒトＩｇＥの全長アミノ酸配列はP01854、マウスＩｇＥの全長アミノ酸配列はP06336、ヒトＳ１００Ａ９の全長アミノ酸配列はNP_002956、マウスＳ１００Ａ９の全長アミノ酸配列はCAC14292、ヒトＰＣＳＫ９の全長アミノ酸配列はNP_777596、マウスＰＣＳＫ９の全長アミノ酸配列はNP_705793の各アクセッション番号で登録されているアミノ酸配列に基づく。
　本発明のワクチンに使用される生体内タンパク質のエピトープの大きさは特に限定されないが、２０アミノ酸以下が好ましく、１５アミノ酸以下がより好ましく、１３アミノ酸以下がさらに好ましく、１２アミノ酸以下がさらに好ましく、１１アミノ酸以下がさらに好ましく、１０アミノ酸以下がさらに好ましい。下限は特に限定されないが、３アミノ酸以上が好ましく、４アミノ酸以上がより好ましく、５アミノ酸以上がさらに好ましく、６アミノ酸以上がさらに好ましい。
　ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、両者が直接連結されていてもよく、リンカー（スペーサーと同義）を介して連結されていてもよい。リンカーはＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを連結できるものであれば特に限定されない。例えば、β－アミノアラニン、γ－アミノ酪酸、ε－アミノカプロン酸、７－アミノヘプタン酸、１２－アミノラウリン酸、グルタミン酸、ｐ－アミノ安息香酸等のアミノカルボン酸を用いることができる。また、天然のタンパク質に存在するＬ－アミノ酸やそれらのＤ－アミノ酸も用いることができる。本願明細書の実施例ではε－アミノカプロン酸をリンカーとして使用しているが、これに限定されない。
　ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体における連結順序は特に限定されず、Ｎ末端側がＯＳＫ－１ペプチドでＣ末端側が生体内タンパク質のエピトープでもよく、逆にＮ末端側が生体内タンパク質のエピトープでＣ末端側がＯＳＫ－１ペプチドでもよい。好ましくは、Ｎ末端側がＯＳＫ－１ペプチドでＣ末端側が生体内タンパク質のエピトープの順序である。
　当該複合体はそのＮ末端のアミノ酸がアセチル化されていることが好ましい。また、当該複合体はそのＣ末端のアミノ酸がアミド化されていることが好ましい。より好ましくは、複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されており、かつＣ末端のアミノ酸がアミド化されていることである。
　ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、融合タンパク質として製造することができる。具体的には、公知の遺伝子工学的手法により、ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープの融合タンパク質をコードする融合遺伝子を作製し、当該遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させ、精製することにより製造することができる。ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、上記融合遺伝子と公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽または大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系等）を用いて、製造することができる。また、バクテリオファージを用い、その表面にＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体を組み換えタンパク質として発現させる場合は、当該複合体を単離、精製せずに、ファージ表面に発現させたままで対象動物に投与することも可能である。
　また、ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。複合体がＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを直接連結したものである場合、または複合体がＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとを適当なアミノ酸を介して連結したものである場合は、複合体の全体を一度に合成することができる。また、ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープを別々に合成し、その後に２つのペプチドを、適当なリンカーを用いて連結してもよい。
　リンカーの導入は、ペプチド合成化学でよく知られた方法で行うことができる。まず標準的な手法によりリンカー位置までのペプチド断片を作成し、リンカーとして用いるアミノカルボン酸のアミノ基を適切に保護したものを用いて標準的な条件下ペプチド合成化学で用いられる縮合剤で当該リンカー基を縮合し、次いで、リンカー基の保護基を脱保護してから、次の位置の目的のアミノ酸を導入すればよい。例えばペプチド自動合成機でよく用いられる固相法ペプチド合成法はその一例である。このような操作で用いられるアミノカルボン酸の保護基としては、ｔＢＯＣ（tert-Butyl Oxy Carbonyl）基、ＦＭＯＣ（Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl）基等が挙げられる。縮合剤としては、例えばＤＣＣ（N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide）、ＥＤＣ（（N-（3-Dimethylaminopropyl） -N'-ethylcarbodiimide）等のカルボジイミド系化合物、ＣＤＩ（1,1'- カルボニルジイミダゾール）等のイミダゾール系化合物、ＢＯＰ（benzotriazol-1-yloxytris（dimethylamino）phosphonium hexafluorophosphate）等のホスホニウム塩系化合物、ＨＢＴＵ（O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）、ＨＣＴＵ（O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium hexafluorophosphate）等のウロニウム塩系化合物などを用いることができる。また、上記の条件を適切に組み合わせれば、ＯＳＫ－１の所定のペプチド断片と表的の生体内タンパクエピトープ部位配列のペプチド断片をそれぞれ作製して適切に保護した後、適切な保護を施したリンカー基を用い、縮合または脱保護のステップを適宜組み合わせて操作することにより所望のコンジュゲートを得ることもできる。
　本発明のワクチンは、アジュバントを含まなくても疾患の要因となる生体内タンパク質の機能を阻害する抗体を誘導することができる点で有用性が高い点で有用である。ただし本発明のワクチンは、１種以上のアジュバントを含んでいてもよい。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、公知のアジュバントの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ－ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ－２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。好ましくは、アルミニウムアジュバント、ＴＬＲリガンドまたはこれらの組み合わせである。本発明のワクチンがアジュバントを含む場合、アジュバントの配合量は特に限定されず、アジュバントの種類等により適宜選択すればよい。例えば、アルミニウムアジュバント（水酸化アルミニウム）およびＣｐＧを併用する場合、本発明の融合タンパク質に対して質量比でアルミニウムアジュバントが約１～１００倍量、ＣｐＧが約１～５０倍量を配合することが好ましい。
　本発明のワクチンは、経口投与または非経口投与により投与することができる。非経口投与としては、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与、吸入投与などが挙げられる。好ましくは、非経口投与であり、より好ましくは、皮内投与、皮下投与または筋肉内投与である。また、非経口投与の手段には、マイクロニードル注射、無針注射、スタンプ等が含まれる。
　本発明のワクチンは、ＯＳＫ－１ペプチドと生体内タンパク質のエピトープとの複合体と薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口投与用製剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口投与用製剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　経口投与用の固形製剤に用いられる添加剤としては、例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等の結合剤；トウモロコシデンプン等の分散剤；繊維素グリコール酸カルシウム等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；グルタミン酸、アスパラギン酸等の溶解補助剤；安定剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース類、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子類等の水溶性高分子；白糖、粉糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、還元麦芽糖水アメ、粉末還元麦芽糖水アメ、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、ハチミツ、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、アスパルテーム、サッカリン、サッカリンナトリウム等の甘味剤、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等のコーティング剤等が挙げられる。
　経口投与用の液体製剤は、一般的に用いられる希釈剤に溶解、懸濁又は乳化されて製剤化される。希釈剤としては、例えば、精製水、エタノール、それらの混液等が挙げられる。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
　非経口投与用の注射剤に用いられる添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。注射剤等の液状製剤は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
　本発明のワクチンは、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明のワクチンは動物薬として有用であるが、ヒトの小児および成人を対象とすることが好ましい。
　本発明のワクチンの投与回数および投与間隔は特に限定されない。例えば、単回投与でもよく、約２日～約８週間の間隔で複数回投与してもよい。ワクチン投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、１回投与量を約０．０１μｇ～約１０ｍｇとすることが好ましく、約０．１μｇ～約１ｍｇとすることがより好ましく、約１μｇ～約０．１ｍｇとすることがさらに好ましい。
　本発明には、本発明のワクチンの有効量を動物に投与することを含む、標的生体タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法が含まれる。
　また、本発明には、生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、本発明のワクチンが含まれる。
　さらに、本発明には、生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、本発明のワクチンの使用が含まれる。
　本発明のワクチンにおいて、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープのキャリアタンパク質として用いられるＯＳＫ－１は２０個のアミノ酸からなるペプチドであり、ＯＳＫ－１自身の抗原性は非常に低いので、キャリアタンパク質の抗原性に由来する好ましくない効果や副作用を低減することができる。一方、ＯＳＫ－１は短いペプチドであるにも関わらず強いアジュバント効果を有するので、ワクチンとして有効な抗体産生能を付与することができる。また、ＯＳＫ－１と生体内タンパク質のエピトープとの複合体により産生される抗体には、Ｔｈ２タイプのＩｇＧ１だけでなくＴｈ１タイプのＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３が多く含まれるので、アレルギー反応等の副作用を低減することができる点で非常に有用である。さらに、ＫＬＨ等の天然物由来のキャリアタンパク質を使用する場合には不純物の問題が生じるが、ＯＳＫ－１は合成により製造できるのでこのような問題を回避することができる。また、ＯＳＫ－１は短いペプチドであるので、製造コストを抑えることができる点でも有利である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔ペプチドの製造例〕
　文献「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）」および「第５版　実験化学講座１６　有機化合物の合成ＩＶ」等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水等の混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ－Ｈ２０／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む画分を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーＧ１０００Ａ（Hewlett Packard）、ＰＰＳＱ－２３Ａ（島津製作所）またはＰｒｏｃｉｓｃＬＣ（ABI社）を用いて確認し、得られたペプチドのＮ末端をアセチル化した。
〔実施例１：ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討１〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）を、ε－Ａｃｐをリンカーとして連結（コンジュゲート）したＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート（Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-ENSTFESFG (X = ε-Acp)）による抗体産生作用を評価した。群構成は、生理食塩水群およびＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）の２群とした（６匹／群）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに８週後まで採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　結果を図１に示した。ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの投与により、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体産生が認められた。
〔実施例２：ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討２〕
　実施例１と同じＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生作用を、ＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin：スカシガイヘモシアニン）とマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号１７）とのコンジュゲート（ＫＬＨ－ＤＰＰ４）の抗体産生作用と比較した。群構成は、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲート群（20μg/mouse）、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート（100μg/mouse）＋Ａｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen）1 mg/mouse）併用群の３群とした（２匹／群）。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに６週後までと、１２週後に採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　結果を図２に示した。ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートはＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートと同等の抗体産生能が認められた。また、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍの併用群では、相乗効果が認められた。
〔実施例３：産生された抗体のＩｇＧサブクラスの解析〕
　実施例１および２と同じＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスを、実施例２と同じＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートにより産生されたＩｇＧ抗体のＩｇＧサブクラスと比較した。群構成は、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート群（100μg/mouse）、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲート（20μg/mouse）＋Ａｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen）1 mg/mouse）併用群、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲート（20μg/mouse）＋ＯＳＫ－１（100μg/mouse）併用群の３群とした。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回および投与開始から９週後に１回、合計４回皮内投与した後、投与後１１週に採血し、ＤＰＰ４エピトープペプチドに対するＩｇＧ抗体の抗体価をＩｇＧサブクラスごとにＥＬＩＳＡにより測定した。
　結果を図３に示した。ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートとＡｌｕｍの併用群では、Ｔｈ２タイプのＩｇＧであるＩｇＧ１が特に高い傾向であった。一方、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート群では、Ｔｈ１タイプのＩｇＧであるＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂにも高い産生が認められた。また、ＫＬＨ－ＤＰＰ４コンジュゲートとＯＳＫ－１の併用群では、同様にＴｈ１タイプであるＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体価が高かった。
〔参考例１：ＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートによるによる抗腫瘍効果の検討１〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とＷＴ１ペプチド（配列番号２８）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲート（Ac-ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK-X-RMFPNAPYL (X = ε-Acp)）による抗腫瘍効果を評価した。また、ＷＴ１ペプチドワクチンの抗腫瘍効果に対するＯＳＫ－１ペプチドのアジュバント効果について検討した。群構成は、生理食塩水群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen；Poly(I:C) HMW VacciGrade、50μg/mouse）群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ＯＳＫ－１ペプチド（100μg/mouse）群、ＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲート（350μg/mouse）群の４群とした（６匹／群）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにワクチンを週に１回、４回投与し、４回目の投与から１週間後にＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（１×１０５cells/mouse）を背部皮内に移植した。細胞移植から１週間後に再度ワクチンを投与した。細胞移植後、週に２回体重および腫瘍径を測定した。腫瘍径はデジタルノギスを用いて測定し、長径×短径２を腫瘍体積とした。
　腫瘍体積の結果を図４に、生存率の結果を図５に示した。ＯＳＫ－１ペプチドをアジュバントとしてＷＴ１ペプチドワクチンと共に投与した場合、腫瘍増殖抑制効果および延命効果は認められなかった。ＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲート群では、腫瘍増殖抑制効果および延命効果が認められた。
〔参考例２：ＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートによるによる抗腫瘍効果の検討２〕
　参考例１と同じＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートによる抗腫瘍効果を評価した。群構成は、生理食塩水群、ＷＴ１ペプチド（100μg/mouse）＋ポリ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen；Poly(I:C) HMW VacciGrade、50μg/mouse）群、ＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲート（350μg/mouse）群、シスプラチン（5mg/kg）群の４群とした（１０匹／群）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（３×１０５cells/mouse）を背部皮内に移植し、同じ日にワクチンを皮内投与した。細胞移植日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ７、１４、２１、２８、３５にワクチンを投与した。細胞移植後、週に２回、デジタルノギスを用いて腫瘍径を測定し、長径×短径２を腫瘍体積とした。
　腫瘍体積の結果を図６に、生存率の結果を図７に示した。細胞移植日と同時にワクチン投与を開始した場合、ＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートの腫瘍増殖抑制効果は弱いものの、Ｄａｙ３２までは生理食塩水投与群（陰性対照）と比較して腫瘍体積は低い値を推移した。また、ＯＳＫ－１－ＷＴ１コンジュゲートは、ＷＴ１ペプチド＋ポリ（Ｉ：Ｃ）群およびシスプラチン群と同等の延命効果が認められた。
〔実施例４：ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによる抗体産生の検討３〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）と７種類のマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号３，５，６，８，１８，１９，２０）および１種類のヒトＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号９）を、それぞれε－Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした８種類のＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを製造した。以下、各ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを「ＯＳＫ１－ＤＤＰ４－配列番号」で表記する。
　６種類のマウスＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号３，５，６，８，１８，１９）を含むＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり１００μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　初回投与から４週後の抗体価を表２に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。Half maximum値は、測定機における最大吸光度の半分の吸光度示す血清の希釈倍率であり、血清希釈倍率と吸光度のシグモイド曲線を作成して算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＯＳＫ１－ＤＤＰ４－６、ＯＳＫ１－ＤＤＰ４－９およびＯＳＫ１－ＤＤＰ４－１２の３種類のＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。初回投与から４週後、９週後および１３週後に採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　結果を表３に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例５：ＨｂＡ１ｃ値によるＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの評価〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号６）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり１００μｇの用量で、高脂肪食（DIO SERIES DIET D12492、日本クレア株式会社）を自由摂取させたＢａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。初回投与後５７日に採取した血液の一部を速やかにＥＤＴＡ処理済みチューブに分注し、転倒混和させて、ＥＤＴＡ処理血液を調製した。ＨｂＡ１ｃ測定用に約２０μＬをマイクロチューブに分注し、ＨｂＡ１ｃ測定機器クオラボ（ニプロ）を用いて測定した。その結果、ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート群のＨｂＡ１ｃ値（％、NGSP）はコントロール群（ＫＬＨ投与群）のＨｂＡ１ｃ値と比較して、－０．４％の改善を示した。
〔実施例６：経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）によるＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートの評価〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）と２種類のＤＰＰ４のエピトープペプチド（配列番号６および配列番号９）を、それぞれε－Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした２種類のＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを、１匹あたり２５０μｇの用量で、高脂肪食（DIO SERIES DIET D12492、日本クレア株式会社）を自由摂取させたＢａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。さらに初回投与後６３日目に１匹あたり２５０μｇのＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートを皮内投与した。初回投与後７７日目に経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）を実施した。ＯＧＴＴ実施前日から約１６時間の絶食を行い、ＯＧＴＴ実施中は絶食状態を維持した。２０％グルコース液を５ｍＬ／ｋｇの用量で単回経口投与した。採血および血糖値測定は無麻酔下で行った。動物の尾を軽く剃刀にて傷付け、漏出する血液中の糖濃度を血糖自己測定器（ニプロフリースタイルフリーダム）にて測定した。血糖値は、糖負荷前、糖負荷後３０、６０、９０および１２０分の計５時点で測定し、経時的な濃度推移より各投与群の血糖上昇曲線下面積ＡＵＣ（time*mg/dl）を算出した。その結果、２種類のＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲート投与群のＡＵＣは、どちらもコントロール群（ＫＬＨ投与群）のＡＵＣと比較して低下した。
〔実施例７：ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４コンジュゲートによるＩｇＥ産生の検討〕
　ＯＳＫ１－ＤＰＰ４－１７による標的タンパクに対するＩｇＥ産生を、キャリアタンパク質をＫＬＨに変更したＫＬＨ－ＤＰＰ４－１７と比較した。ＫＬＨ－ＤＰＰ４－１７群は、ＫＬＨ－ＤＰＰ４－１７が２０μｇ／ｍｏｕｓｅおよびＡｌｕｍ（Alhydrogel 2%（InvivoGen））が１ｍｇ／ｍｏｕｓｅになるように混合し皮内投与した。ＯＳＫ－１－ＤＰＰ４－１７群は１００μｇ／ｍｏｕｓｅで皮内投与した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与し、さらに１１週目に４回目の投与を行った。２１週目に採血し、血清中のＤＰＰ４に対するＩｇＥ抗体量をＥＬＩＳＡにより測定した。
　結果を図８に示した。ＫＬＨ－ＤＰＰ４－１７群では、標的タンパクに対するＩｇＥ産生が見られたが、ＯＳＫ１－ＤＰＰ４－１７群では、標的タンパクに対するＩｇＥ産生は見られなかった。
〔実施例８：ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートによる抗体産生の検討〕
（１）ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの製造
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）と１０種類のマウスＩＬ－１７Ａのエピトープペプチド（配列番号２１，２２，３１～３３，３７～４１）を、それぞれε－Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした１０種類のＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを製造した。以下、各ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを「ＯＳＫ１－ＩＬ－配列番号」で表記する。これらの代表例として４種類のエピトープペプチド（配列番号２１，３１，３２，４０）を含むコンジュゲートについて、図９～１２にそれぞれ（Ａ）アミノ酸分析結果および（Ｂ）ＨＰＬＣ分析結果を示した。他のコンジュゲートも実質的に同様の分析結果を得た。
（２）抗体価の測定
　１０種類のＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートを表４に記載の用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与前、投与から２週間おきに６週後まで採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　初回投与から６週後の結果を表４に示した。また、２，４，６週後の抗体価の変化を図１３に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例９：イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスによるＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの評価（１）〕
　乾癬モデルとして、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎モデルを使用した。６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに３種類のＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート（OSK1-IL-31、OSK1-IL-32、OSK1-IL-40）を、１匹あたり５００μｇの用量で、２週間おきに３回皮内投与した。３回目のワクチン投与から２週間後に背中を剃毛し、さらに脱毛クリームを用いて脱毛した皮膚に、１日あたりイミキモド６２．５ｍｇ分のベセルナクリーム５％（商品名、持田製薬）を、８日間毎日塗布することにより乾癬を誘導した。耳に塗布する場合は、片耳につき１日あたりイミキモド０．３５ｍｇ分のベセルナクリーム５％を、８日間毎日塗布することにより乾癬症状を誘導した。
　乾癬誘導開始から８日間（０～７日目）、皮膚状態（紅斑、肥厚度、白色鱗屑の症状範囲）を毎日観察し、各０～４の５段階（０：なし、１：軽度、２：中等症、３：重症、４：きわめて重症）で点数化して評価した。耳の厚さは、乾癬誘導開始から８日間（０～７日目）、デジタルノギスを用いて毎日測定した。皮膚状態の結果を図１４に、耳の厚さの結果を図１５に示した。用いた４種類のＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートは、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎を抑制することが示された。
〔実施例１０：イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスによるＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの評価（２）〕
（１）皮膚状態および耳の厚さ
　ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートとしてＯＳＫ１－ＩＬ－２１を用い、１匹あたり１００μｇ、３００μｇまたは１０００μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。また、キャリアタンパク質をＫＬＨに変更したＫＬＨ－ＩＬ－２１を、１匹あたり２０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに３回皮内投与した。ＫＬＨ－ＩＬ－２１については、１回目の投与ではフロイント完全アジュバント（SIGMA）５０μＬ／ｍｏｕｓｅを、２回目および３回目の投与ではフロイント不完全アジュバント（SIGMA）５０μＬ／ｍｏｕｓｅを、アジュバントとして混合し投与した。用いたワクチンおよびベセルナクリーム５％を１３日間毎日塗布したこと以外は、上記実施例９と同じ手順で行った。
　乾癬誘導開始から６日目の皮膚状態を写真撮影し、図１６に示した。乾癬様皮膚炎誘発期間中（０～１２日目）の皮膚の状態の変化を図１７に示し、乾癬様皮膚炎誘発期間中（０～７日目）の耳の厚さの変化を図１８に示した。これらの結果により、ＫＬＨ－ＩＬ－１７ＡコンジュゲートよりＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートのほうが、イミキモド誘発乾癬様皮膚炎を強く抑制できることが示された。
（２）免疫組織化学染色
　イミキモド塗布により乾癬様皮膚炎を誘導した際に皮膚に存在している免疫細胞およびインボルクリンの発現を免疫組織化学染色により検出した。
　乾癬誘導開始から１２日目の背部皮膚および耳介を採取し、４％ＰＦＡで固定後、パラフィン包埋を行った。切片作成後、脱パラフィン、抗原賦活化処理を行い、非特異反応ブロッキング、一次抗体反応、標識二次抗体反応を行った。角化の最終マーカーであるインボルクリン染色により角化傾向を、マクロファージのマーカーであるＦ４／８０および顆粒球のマーカーであるＧｒ－１でそれぞれ染色し、免疫細胞を検出した。
　インボルクリン染色の結果を図１９に、Ｆ４／８０染色の結果を図２０に、Ｇｒ－１染色の結果を図２１にそれぞれ示した。これらの結果から、正常皮膚では有棘層上部に認められるインボルクリンの発現が、イミキモド塗布により表皮の広い範囲に広がり角化の亢進が起こっていることが確認された。ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群では、ＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群より、この現象が顕著に抑制されている所見が認められた。また、イミキモドを塗布した皮膚、耳介においてＦ４／８０に陽性を示すマクロファージや、Ｇｒ－１に陽性を示す顆粒球の増加がより顕著に認められた。一方、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群では、ＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群より、これらの免疫細胞の浸潤が顕著に抑制されていた。
（３）ＩＬ－１７の血中濃度
　乾癬誘導開始前（０日目）および乾癬誘導開始から１２日目に採血し、血清中のＩＬ－１７濃度を、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１７Ａ／Ｆ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（R&D systems社）を用いて測定した。
　結果を図２２に示した。（Ａ）はイミキモドを塗布していないマウス（０日目）の結果であり、（Ｂ）はイミキモドを塗布したマウス（１２日目）の結果である。（Ｂ）に示したように、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群はＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群に比べ、ＩＬ－１７Ａ／Ｆの血中濃度が低かった。また、（Ａ）に示したように、コンジュゲート投与後イミキモド塗布開始前の血中ＩＬ－１７Ａ／Ｆは、ＫＬＨ－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群のみ上昇が認められた。
（４）乾癬部位における炎症関連因子の発現
　乾癬誘導開始から１２日目に乾癬部位の皮膚を採取し、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して皮膚組織中のＲＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓのプライマーおよびプローブを使用し、リアルタイムＰＣＲ法によって、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２およびＩＬ－２３の炎症関連因子のメッセンジャーＲＮＡを測定した。
　その結果、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート非投与のマウスでは各種因子のメッセンジャーＲＮＡが上昇したが、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲート投与群では、各因子のメッセンジャーＲＮＡの発現は抑制されていた。
　上記実施例９，１０では、イミキモド誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスを用いたが、ＯＳＫ－１－ＩＬ－１７Ａコンジュゲートの薬効の評価には、ＩＬ－２３誘発性乾癬様皮膚炎モデルマウスを使用することもできる。具体的には、例えば、Ｗ. Ｊｉａｎｇら（”A Toll-Like Receptor 7, 8, and 9 Antagonist Inhibits Th1 and Th17 Responses and Inflammasome Activation in a Model of IL-23-Induced Psoriasis” W. Jiang, et al, 1784 Journal of Investigative Dermatology (2013), Volume 133）の記載に従って実施することができる。すなわち、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを用い、０．５ｍｇのマウスＩＬ－２３を２０ｍＬのＰＢＳに溶解し、例えば０、２、４、６、１０、１２および１４日目に、被験動物の左耳に皮内注射することにより、皮膚炎を誘導する。皮膚炎を誘導したマウスを無作為に群分けし、被験物質または対照物質（例えばＰＢＳ）を投与する。例えば、３、６、９、１２および１５日目に、被験物質または対照物質を皮下投与する。例えば１８日目に耳介の厚さをデジタルノギスで測定する。また、耳介を採取して、病理組織学的検査に供する。
〔実施例１１：ＯＳＫ－１－ＩｇＥコンジュゲートによる抗体産生の検討〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）とマウスＩｇＥのエピトープペプチド（配列番号２３）を、ε－ＡｃｐをリンカーとしてコンジュゲートしたＯＳＫ－１－ＩｇＥコンジュゲートを製造し、１匹あたり１００μｇまたは２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　８週後の抗体価を表５に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔実施例１２：ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートによる抗体産生の検討〕
　ＯＳＫ－１ペプチド（配列番号１）と３種類のマウスＰＣＳＫ９のエピトープペプチド（配列番号２５，２６，２７）を、それぞれε－Ａｃｐをリンカーとしてコンジュゲートした３種類のＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートを製造し、１匹あたり１００μｇまたは２５０μｇの用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間隔で３回皮内投与した。投与から２週おきに採血し、各エピトープペプチドに対する抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。
　８週後の抗体価を表６に示した。抗体価はhalf maximum値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
〔実施例１３：血中のＰＣＳＫ９濃度によるＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲートの評価〕
　実施例１２において、ＯＳＫ１－ＰＣＳＫ９－２７を２５０μｇの用量で投与したマウス（ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群）から、投与前および投与２、４、６週後に採取した血清中のＰＣＳＫ９濃度を測定した。コントロールとして、ＯＳＫ－１投与群を設け、同じスケジュールで投与および採血を行い、血清中のＰＣＳＫ９濃度を測定した。測定には、Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ９／ＰＣＳＫ９ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（R&D systems）を使用した。ここで、ＰＣＳＫ９抗体を投与すると血中ＰＣＳＫ９濃度の上昇が認められることが報告されている。この現象は抗体によりＰＣＳＫ９タンパクが安定化し体内からの消失が遅くなるためだと考えられている。このことから、ワクチン投与による血中ＰＣＳＫ９値の上昇は、ワクチン投与により産生された抗体が標的タンパクと作用していることを示す現象のひとつであると考えられる（Peptide-Based Anti-PCSK9 Vaccines - An Approach for Long-Term LDLc Management, PLoS One. 2014; 9(12), An Anti-PCSK9 Antibody Reduces LDL-Cholesterol On Top Of A Statin And Suppresses Hepatocyte SREBP-Regulated Genes; Int.J.Biol.Sci.2012, 8(3):310-327） 。
　結果を図２３に示した。ＯＳＫ－１－ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群では、投与前にと比較して、投与後２～６週間後の血中のＰＣＳＫ９値が上昇した。
〔参考例３： ＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲートの血中脂質量に対する効果〕
　ＫＬＨとマウスＰＣＳＫ９のエピトープペプチド（配列番号２６）をコンジュゲートしたＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲートを使用した。７週齢のＡｐｏＥ欠損マウスを日本チャールズリバーから購入した。ＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲート低用量群（5μg（PCSK9ペプチド）／mouse）、ＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲート高用量群（50μg（PCSK9ペプチド）／mouse）、ＫＬＨ投与群およびコントロールとして生理食塩水投与群を設けた。ＫＬＨ投与群のマウスには、コンジュゲート投与群に投与したコンジュゲートに含まれるＫＬＨと等量のＫＬＨを投与した。投与前にＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲートまたはＫＬＨ単独を等容積のフロイントアジュバント（和光純薬）と混合し、皮下投与した。初回はフロイント完全アジュバントを使用し、２回目以降はフロイント不完全アジュバントを使用した。合計３回（０、１４および２８日目）コンジュゲートを投与し、最終投与の２４週後に採血して脂質量を測定した。その結果、ＫＬＨ－ＰＣＳＫ９コンジュゲート投与群では、ＣＭ（カイロミクロン）、ＶＬＤＬの値が約半分に低下し、ＴＧ（中性脂肪）の値が約３分の２に低下した。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (15)

  1. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含むワクチン。
  2. 　生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である請求項１に記載のワクチン。
  3. 　ＩＬ－１７Ａのエピトープが、配列番号１０、１１、２９～３６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１０、１１、２９～３６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
  4. 　ＤＰＰ４のエピトープが、配列番号２～９のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号２～９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
  5. 　ＩｇＥのエピトープが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
  6. 　Ｓ１００Ａ９のエピトープが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、または配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
  7. 　ＰＣＳＫ９のエピトープが、配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列、または配列番号１４～１６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１または２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである請求項２に記載のワクチン。
  8. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと生体内タンパク質のエピトープが、ε－アミノカプロン酸を介して連結されている請求項１～７のいずれかに記載のワクチン。
  9. 　前記複合体のＮ末端のアミノ酸がアセチル化されている請求項１～８のいずれかに記載のワクチン。
  10. 　前記複合体のＣ末端のアミノ酸がアミド化されている請求項１～９のいずれかに記載のワクチン。
  11. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体を含む免疫原性組成物。
  12. 生体内タンパク質が、ＤＰＰ４、ＩＬ－１７Ａ、ＩｇＥ、Ｓ１００Ａ９およびＰＣＳＫ９からなる群より選択される１種である請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  13. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、疾患の要因となる生体内タンパク質のエピトープとの複合体の有効量を、動物に投与することを含む、前記生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療方法。
  14. 　生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療に用いるための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体。
  15. 　生体内タンパク質が要因となる疾患の予防または治療用医薬を製造するための、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記生体内タンパク質のエピトープとの複合体の使用。
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