WO2017150695A1 - 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びアンブレインの製造方法 - Google Patents

変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びアンブレインの製造方法 Download PDF

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佐藤　努
琴音 奥野
稔彦 竹花
誠治 小池
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国立大学法人新潟大学
株式会社Adeka
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01034—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (NADPH) (1.1.1.34)
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01137—Sporulenol synthase (4.2.1.137)

Definitions

  • Ambergris is a high-quality fragrance that has been used around the world since the 7th century, and is also used as a herbal medicine. It is thought that dragon whales were formed by sperm whales that formed the indigestion of food (octopus, squid, etc.) by stone formation and excretion, but the detailed production mechanism is unknown.
  • the main component of Ryu Rinka is an emblem, and it is thought that Ryu Rinka is oxidatively decomposed by sunlight and oxygen while floating on the sea to produce compounds with various fragrances.
  • Patent Document 1 discloses that a novel sulfonic acid derivative is produced from ambrenolide as a method for efficiently producing (+)-ambrain easily and inexpensively, and an optically active ⁇ -cyclogeranyl halide is added thereto.
  • a method is disclosed that includes the step of coupling.
  • Non-Patent Document 1 discloses 2-((1R) synthesized from ( ⁇ ) (5,5,8a-trimethyloctahydro-1H-spiro [naphthalene-2,2′-oxirane] -1-yl) methanol.
  • 3-deoxyakileol A which is a monocyclic triterpene, from squalene by using a squalene-hopene cyclizing enzyme mutant enzyme (D377C, D377N, Y420H, Y420W, etc.).
  • Non-Patent Documents 2 to 4 The present inventors obtained 3-deoxyacireol A by reacting squalene with a mutant squalene-hopene cyclase capable of producing 3-deoxyacireol A from squalene, and further tetraprenyl- ⁇ -curcumene.
  • Patent Document 2 It was found that an emblem can be produced by reacting a cyclizing enzyme (Patent Document 2).
  • the method of Patent Document 2 is a multistage reaction, and there is room for improvement in yield. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing an umbrella that can be obtained easily.
  • the present inventors have found that a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase having a specific mutation has an activity of generating ambrain from squalene. It was.
  • the production of ambrain from squalene is achieved by the production of 3-deoxyakileol A from squalene by the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention.
  • the production of ambrain from squalene indicates that the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention produces ambrain from bicyclic 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene. Is achieved. It is surprising that the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention exhibits such enzyme activity. The present invention is based on these findings.
  • the present invention [1] A mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in which aspartic acid as the fourth amino acid residue of the DXDD motif is substituted with an amino acid other than aspartic acid, (a) the mutant tetraprenyl - ⁇ -curcumene cyclase is based on the above DXDD motif, QXXXGX (W / F) motif at a position separated by 100 amino acid residues or more on the N-terminal side, and a position separated by 10-50 amino acid residues on the N-terminal side QXXXXXX (G / A) X (F / W / Y) motif, QXXXGX (F / W / Y) motif 20 to 50 amino acid residues away on the C-terminal side, and 50 to 120 amino acid residues on the C-terminal side A QXXXGXW motif at a distant position, and a QXXXGX (F / W)
  • An amino acid sequence substituted by the amino acid of or represented by SEQ ID NO: 13 A polypeptide having an amino acid sequence in which the 378th aspartic acid from the N-terminal side in the amino acid sequence is substituted with an amino acid other than aspartic acid; In the amino acid sequence in which the 373rd aspartic acid from the N-terminal side in the amino acid sequence represented is substituted with an amino acid other than aspartic acid, one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added.
  • an embrane can be synthesized in one step using squalene as a substrate without using a mutant squalene-hopene cyclase in combination.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase used in the present invention can produce 3-deoxyacireol A from squalene.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase used in the present invention can generate an ambrain from a bicyclic triterpene (8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene).
  • FIG. 3 is a diagram showing a conventional pathway for synthesizing an umbrain using squalene as a substrate, using a mutant squalene-hopene cyclase and a tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase.
  • FIG. 2 is a diagram showing two pathways for generating ambrain from squalene using the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention.
  • FIG. 3 is a drawing showing the rate of umbrain production that increases in proportion to the increase in enzyme reaction time when the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention is reacted with squalene.
  • FIG. 5 is a diagram showing a product when a wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene is reacted with squalene.
  • FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained by analyzing a product of a yeast transformant containing a mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase by gas chromatography.
  • Mutant TC is a yeast expressing a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase (D373C) gene
  • wild-type TC is a yeast expressing a wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene. It is.
  • the monocyclic product is 3-deoxyachilleol A and the bicyclic product is 8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene.
  • FIG. 3 is a view showing amino acid sequences of a wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase and a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in which the 373rd aspartic acid is substituted with cysteine.
  • mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention is an amino acid in which aspartic acid, which is the fourth amino acid residue of the DXDD motif, is other than aspartic acid
  • mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase has 100 amino acids on the N-terminal side based on the DXDD motif.
  • QXXXGX (W / F) motif at a position more than a residue
  • QXXXX (G / A) X (F / W / Y) motif at a position 10 to 50 amino acid residues on the N-terminal side, and 20 on the C-terminal side
  • QXXXGX (F / W / Y) motif at a position separated by ⁇ 50 amino acid residues
  • QXXXGXW motif at a position separated by 50-120 amino acid residues on the C-terminal side
  • a QXXXGX (F / W) motif at a position 120 to 170 amino acid residues away from the C-terminal side
  • a QXXXGXW motif at a position more than 170 amino acid residues away from the C-terminal side
  • each motif or sequence represents a single letter abbreviation for an amino acid
  • X means any amino acid. That is, in the case of the QXXXGX (W / F) motif, from the N-terminal side to the C-terminal side, glutamine (Q), three arbitrary amino acids (X), glycine (G), arbitrary amino acids (X), Either tryptophan (W) or phenylalanine (F) is sequenced.
  • “having a QXXXGX (W / F) motif at a position more than 100 amino acid residues on the N-terminal side based on the DXDD motif” means that 100 amino acid residues are left between the DXDD motif and the QXXXGX (W / F) motif. It means that more than one group exists, and the same applies to the identification of other motifs. The same applies hereinafter unless otherwise specified.
  • the polypeptide constituting the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is: (1) A polypeptide in which the 373rd aspartic acid from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than aspartic acid, or the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 A polypeptide in which the 378th aspartic acid is substituted with an amino acid other than aspartic acid, (2) An amino acid sequence in which the 373rd aspartic acid from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid other than aspartic acid, or the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 The amino acid sequence in which the aspartic acid at position 378 is substituted with an amino acid other than aspart
  • the polypeptide constituting the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15.
  • aspartic acid, the fourth amino acid residue of the DXDD motif, is substituted with cysteine.
  • Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase
  • TC Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase
  • Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase can produce bicyclic 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene using squalene as a substrate (Non-patent Document 5). Furthermore, tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase selectively cyclizes the non-cyclized end of bicyclic 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene to cyclize both ends. The compounds onoselan oxide and 14 ⁇ -hydroxyonocera-8 (26) -ene can be produced (Non-patent Document 6).
  • Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is classified into EC 4.2.1.129, a reaction that produces baciterpenol A from water and tetraprenyl- ⁇ -curcumene, or an 8 ⁇ -hydroxypolypoda from squalene. It is an enzyme that can catalyze the reaction to produce 13,17,21-triene.
  • Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase has, for example, bacteria such as Bacillus genus, Brevibacillus genus, Paenibacillus genus, or Geobacillus genus.
  • Bacillus bacteria examples include Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, and Bacillus licheniformis. Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is separated from the DDDD motif by a QXXXGX (W / F) motif at a position separated by 100 amino acid residues or more on the N-terminal side and by 10-50 amino acid residues on the N-terminal side.
  • the squalene-hopene cyclizing enzyme described later also has the above-mentioned motif, but further has a QXXXGXW motif at a position separated by 170 amino acid residues or more on the C-terminal side of the DXDD motif.
  • tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase does not have the QXXXGXW motif.
  • squalene-hopene cyclase has a feature that it has a GXGFP sequence at the C-terminal side of the QXXXGXW motif, and its fourth amino acid is phenylalanine (F).
  • Tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase also has a GXGXP sequence similar to the GXGFP sequence, but the fourth amino acid is not phenylalanine, such as leucine (L), methionine (M), or arginine (R).
  • L leucine
  • M methionine
  • R arginine
  • mutant TC substitution of aspartic acid
  • mutant TC substitution of aspartic acid
  • substitution with an amino acid other than aspartic acid, or the 378th aspartic acid from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is substituted with an amino acid other than aspartic acid.
  • Amino acids other than aspartic acid are not limited as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • FIG. 8 shows the amino acid sequences of the wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase from Bacillus megaterium and the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in which the 373rd aspartate was replaced with cysteine.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can generate 3-deoxyacireol A from squalene, and 8 ⁇ Ambrain can be produced from -hydroxypolypoda-13,17,21-triene.
  • the wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of Bacillus subtilis and the 378th aspartic acid are substituted with amino acids other than aspartic acid (particularly cysteine), whereby the mutant tetraprenyl- ⁇ of the present invention is used.
  • Curcumene cyclase can produce 3-deoxyacireol A from squalene and can produce ambrain from 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene.
  • the origin of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention is not particularly limited, and all tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase can be used. That is, the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in which the fourth amino acid residue of the DXDD motif is substituted with an amino acid other than aspartic acid (preferably cysteine or glycine) The effect can be shown.
  • a QXXXGX (W / F) motif is located at a position 100 amino acid residues or more away from the N-terminal side, and a QXXXXX (G / A) X is located 10 to 50 amino acid residues away from the N-terminal side.
  • Aspartic acid which is the fourth amino acid residue of the DXDD motif, is an amino acid other than aspartic acid (preferably cysteine or Mutant Tetorapureniru - ⁇ - curcumene cyclase which is substituted glycine) may indicate the effect of the present invention.
  • the identity of the amino acid sequences of the polypeptides of Bacillus subtilis and Bacillus megaterium is about 50%.
  • each of the enzymes is squalene 3 -Deoxyacireol A can be produced, and umbrains can be produced from 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of Bacillus megaterium tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 is the tetraprenyl- ⁇ -curcumene of Bacillus subtilis. Amino acid sequence of cyclase.
  • mutant SHC mutant squalene-hopene cyclase
  • monocyclic 3-deoxyacireol A is used as an intermediate as shown in FIG. Produced by a route (hereinafter sometimes referred to as a monocyclic route) and a route having 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene as an intermediate (hereinafter sometimes referred to as a bicyclic route). Is done.
  • bicyclic pathway 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene is produced from squalene by mutant TC. Then, the mutant TC generates an embrane from 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene.
  • Conventional wild-type TC was able to convert squalene to 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene, but converts 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene to ambrain. I could't.
  • the mutant TC of the present invention is capable of converting 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene to ambrain, so that squalene is converted to 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13, as shown in FIG.
  • Two reactions: conversion to 17,21-triene (reaction (c) in FIG. 2) and conversion from 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene to ambrain (reaction (d) in FIG. 2) Can be performed by one enzyme.
  • the mutant TC of the present invention is produced by converting squalene to 3-deoxyacireol A (reaction (a)) and converting 3-deoxyacireol A to ambrain (reaction) in the process of producing umbrain from squalene. (B)), conversion of squalene to 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene (reaction (c)), and conversion of 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene to ambrain
  • the four reactions (reaction (d)) can be performed with one enzyme.
  • DXDD motif As described above, in the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention, for example, the 373rd substitution from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 The 378th substitution from the N-terminal side is present in a region called DXDD motif. That is, the DXDD motif is located at positions 370 to 373 from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or from position 375 to 378 from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the substitution of the 373rd or 378th amino acid from the N-terminal side is the substitution of aspartic acid, which is the fourth amino acid residue from the N-terminal side, in the DXDD motif with an amino acid other than aspartic acid.
  • the DXDD motif aspartic acid is extremely conserved, and the fourth amino acid residue from the N-terminal side is usually aspartic acid.
  • the present invention has been found that tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase has an umbrain-producing activity using squalene as a substrate by mutating a specific amino acid having high conservation.
  • the polypeptide of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention is an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 13. It may be a polypeptide consisting of a sequence. And the said polypeptide is a polypeptide which shows umbrain production
  • polypeptide that does not show an umbrain producing activity using squalene as a substrate is not included in the polypeptide of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added means that the amino acid has been altered by amino acid substitution or the like.
  • the number of amino acid modifications can be, for example, 1 to 330, 1 to 300, 1 to 250, 1 to 200, 1 to 150, 1 to 100, or 1 to 50, preferably Is 1-30, more preferably 1-10, still more preferably 1-5, and most preferably 1-2.
  • modified amino acid sequences of mutant peptides that can be used in the present invention are preferably amino acid sequences having one or several (preferably 1, 2, 3, or 4) conservative substitutions of the amino acids. Can be.
  • the polypeptide of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention is a polypeptide comprising an amino acid sequence having 40% or more identity with the amino acid sequence with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 13. It may be.
  • the said polypeptide is a polypeptide which shows umbrain production
  • the amino acid sequence having 45% or more identity more preferably 50% or more amino acid sequence, more preferably 60% or more amino acid sequence, more preferably 70% or more amino acid sequence, more preferably Is a polypeptide comprising an amino acid sequence of 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably an amino acid sequence of which the identity is 95% or more, and generates an embrane from squalene It is a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase comprising a polypeptide having activity.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 13 “an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added” or “an amino acid sequence having identity of 40% or more” Although the amino acid sequence of No. 1 or 13 is substituted, this amino acid sequence substitution is a conservative substitution that maintains the function of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention. “Conservative substitution” means, but is not limited to, replacing an amino acid residue with another chemically similar amino acid residue. For example, when a certain hydrophobic residue is substituted by another hydrophobic residue, a certain polar residue is substituted by another polar residue having the same charge, and the like.
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, and the like.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, and the like.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • aspartic acid which is the fourth amino acid residue of the DXDD motif, is mutated (substituted) to an amino acid other than aspartic acid by using squalene as a substrate.
  • This is a positive substitution (mutation) for conferring the activity to be generated, but the conservative substitution is a substitution for maintaining the activity to generate an umbrain using squalene as a substrate. It can be implemented.
  • FIG. 9 shows tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of Bacillus megaterium (SEQ ID NO: 1), Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 13), and Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 17), and Alicyclobacillus acid caldarius.
  • SEQ ID NO: 1 Bacillus megaterium
  • SEQ ID NO: 13 Bacillus subtilis
  • SEQ ID NO: 17 Bacillus licheniformis
  • Alicyclobacillus acid caldarius An alignment of squalene-hopene cyclase (SEQ ID NO: 18) is shown.
  • a QXXXGX (W / F) motif (hereinafter referred to as a motif in the present invention) at a position separated by 100 amino acid residues or more on the N-terminal side based on the DXDD motif.
  • a motif in the present invention a QXXXGX (W / F) motif at a position separated by 100 amino acid residues or more on the N-terminal side based on the DXDD motif.
  • two motifs A are provided at positions separated by 100 amino acid residues or more on the N-terminal side.
  • a QXXXXXX (G / A) X (F / W / Y) motif (hereinafter also referred to as motif B in the present invention) is present at the position of 10 to 50 amino acid residues on the N-terminal side.
  • said QXXXXXX (G / A) X (F / W / Y) is QXXXX (G / A) DW.
  • the DXDD motif has a QXXXGX (F / W / Y) motif (hereinafter also referred to as motif C in the present invention) at a position 20 to 50 amino acid residues away from the C-terminal side, and the above QXXXGX ( The F / W / Y) motif is preferably QNXXGG (W / F).
  • motif D QXXXGXW motif
  • the QXXXGXW motif is QXX (N / D) G (S / A) W is preferable.
  • the DXDD motif has a QXXXGX (F / W) motif (hereinafter also referred to as motif E in the present invention) at a position 120 to 170 amino acid residues away from the C-terminal side, and the above QXXXGX (F / W) More preferably, the motif is QXX (D / N) G (S / G) (F / W).
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention has all the motifs A to E in addition to the DXDD motif.
  • mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention does not have a QXXXGXW motif at a position separated by 170 amino acid residues or more on the C-terminal side based on the DXDD motif.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can be obtained using a known gene recombination technique or the like. For example, Bacillus megaterium chromosomal DNA is obtained, and tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is amplified by PCR or the like using appropriate primers. The obtained gene is incorporated into an appropriate vector, and the gene sequence is determined. When the fourth amino acid residue from the N-terminal side of the DXDD motif is aspartic acid, the mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclization of the present invention is introduced by introducing a mutation to the other amino acid. A gene encoding the enzyme can be obtained.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can be obtained by incorporating and expressing the gene in a host such as yeast.
  • a host such as yeast.
  • tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is known to exist in bacteria of the genus Bacillus and the like.
  • An enzyme derived from Bacillus subtilis (accession number: AB618206), Bacillus licheniformis It is also possible to obtain a derived enzyme (accession number: AAU41134) and the like.
  • the gene encoding the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can be obtained by a known synthetic gene synthesis method, for example, the method of Khorana et al. (Gupta et al., 1968), the method of Narang et al. Scarpulla et al., 1982) or the method of Rossi et al. (Rossi et al., 1982). Then, the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can be obtained by expressing the synthesized gene.
  • polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention. That is, a polynucleotide encoding a polypeptide in which aspartic acid, which is the fourth amino acid residue from the N-terminal side in the DXDD motif, is mutated (substituted) to an amino acid other than aspartic acid can be exemplified.
  • polynucleotide of the present invention for example, SEQ ID NO: 2, which encodes a polypeptide in which aspartic acid, which is the fourth amino acid residue from the N-terminal side of the DXDD motif, is mutated (substituted) to cysteine
  • a polynucleotide including a sequence consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 can be exemplified.
  • generates an embrane from squalene can be mentioned.
  • polynucleotide” in the present specification includes both DNA and RNA.
  • the polynucleotide of the present invention is preferably changed to an optimal codon base sequence according to the microorganism or host cell into which it is introduced.
  • the microorganism of the present invention is a microorganism having the polynucleotide of the present invention. That is, it is not particularly limited as long as the polynucleotide of the present invention is contained in the cell, and examples thereof include Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Actinomyces, baker's yeast, Neisseria gonorrhoeae, and red bread mold. .
  • the microorganism of the present invention preferably further comprises a polynucleotide encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase (hereinafter sometimes referred to as HMGR).
  • HMGR is an enzyme that converts hydroxymethylglutaryl CoA to mevalonic acid in the farnesyl pyrophosphate synthesis pathway.
  • squalene which is a substrate of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention, is generated.
  • the production of squalene in the microorganism can be promoted, and the production of ambrain using the microorganism can be increased.
  • the polypeptide of hydroxymethylglutaryl CoA reductase is not particularly limited as long as it has hydroxymethylglutaryl CoA reductase activity, but preferably (1) amino acid sequence No. 514 represented by SEQ ID NO: 3 In the amino acid sequence of ⁇ 1022, and (2) one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence consisting of 514 to 1022 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more) of the amino acid sequence or (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 with the amino acid sequence consisting of 514 to 1022 An amino acid sequence or (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and (2) represented by SEQ ID NO: 3.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is 80% or more A polypeptide consisting of an amino acid sequence. Hydroxymethylglutaryl CoA reductase comprising the above amino acid sequence exhibits excellent reductase activity. Accordingly, the polypeptide comprising the amino acid sequence of Nos. 514 to 1022 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence excluding the membrane-binding region of hydroxymethylglutaryl CoA reductase, and hydroxymethylglutaryl CoA reductase It exhibits excellent activity.
  • SEQ ID NO: 4 shows one embodiment of a nucleic acid sequence (base sequence) encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase.
  • the vector of the present invention is a vector comprising a DNA having a polynucleotide encoding the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase. That is, the vector of the present invention is not particularly limited as long as it includes the polynucleotide according to the present invention.
  • the vector according to the present invention is added to a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used. The vector obtained by inserting can be mentioned.
  • the expression vector is preferably a vector that is capable of autonomous replication in Escherichia coli, baker's yeast, or the like as a host or can be integrated into a chromosome and has high expression efficiency of a foreign protein.
  • the expression vector for expressing the polynucleotide is preferably a recombinant vector which is capable of autonomous replication in a microorganism and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA and a transcription termination sequence. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained.
  • examples of expression vectors include pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega) ), PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pQE-30 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48,669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK +, pBluescriptII SK (-) (manufactured by Stratagene), pTrS30 (FERMBP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharp) Novagen), pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18 [gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Shuzo) PSTV29 (Takara Shuzo), pUC118 (Takara Shuzo), pPA1 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • any promoter can be used so long as it can be expressed in cells such as Escherichia coli and baker's yeast.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, and the like can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrpx2), a tac promoter, a letI promoter, and a lacT7 promoter can also be used.
  • a promoter that functions as a strong promoter and capable of mass production of the target protein is preferable. More preferred.
  • the inducible promoter include a cold shock gene cspA promoter whose expression is induced at low temperatures, a T7 promoter induced by the addition of IPTG as an inducer, and the like.
  • a promoter that always expresses a target gene regardless of tissue, that is, a constitutive promoter is more preferable.
  • Constitutive promoters include alcohol dehydrogenase 1 gene (ADH1), translation elongation factor TF-1 ⁇ gene (TEF1), phosphoglycerate kinase gene (PGK1), triose phosphate isomerase gene (TPI1), triose phosphate dehydrogenase gene (TDH3), The promoter of pyruvate kinase gene (PYK1) is mentioned.
  • the transformant of the present invention is not particularly limited as long as it includes the polynucleotide according to the present invention.
  • the polynucleotide according to the present invention is integrated into the chromosome of a host cell. It can be a transformant, or it can be a transformant contained in the form of a vector containing the polynucleotide according to the present invention. Further, it can be a transformant expressing the polypeptide according to the present invention, or can be a transformant not expressing the polypeptide according to the present invention.
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by transforming a desired host cell with the vector according to the present invention or with the polynucleotide itself according to the present invention.
  • the host cell is not particularly limited, but a strain that is easy to handle, such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Actinomyces, yeast, Neisseria gonorrhoeae, and Akapan mold, is preferable, but insect cells, plant cells, animal cells, etc. may be used. Is possible. However, in order to produce an enzyme by an enzymatic method (in vitro biosynthesis by an enzymatic reaction using squalene as a substrate), Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, and Aspergillus are preferred, and Escherichia coli is most preferred.
  • yeast is most preferable for fermentation production (biosynthesis in vivo by a host using glucose or the like as a carbon source).
  • the most preferred yeast strain includes sake yeast. Particularly preferred is Sake Yeast Association No. 7 or 701. Association No. 701 yeast has the advantage that it does not form high bubbles with the no-foam yeast bred from Association No. 7, but the other properties are the same.
  • the transformant of the present invention is preferably a vector containing a DNA having a polynucleotide encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase. Have. By including the vector, it is possible to increase the production amount in the production of an umbrain using the transformant. Hydroxymethylglutaryl CoA reductase is the one described in the section of “Microorganism”.
  • the above “having a vector containing a DNA having a polynucleotide encoding a hydroxymethylglutaryl CoA reductase” includes the above “DNA having a polynucleotide encoding a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase” “Vector” may include DNA having a polynucleotide encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase, or “vector including DNA having a polynucleotide encoding mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase” And “vectors containing DNA having a polynucleotide encoding hydroxymethylglutaryl CoA reductase” may be prepared and transformed.
  • the method for producing an ambrain according to the present invention is characterized in that an ambrain is obtained by reacting a mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase with squalene.
  • Mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase can be produced by culturing a transformant obtained by introducing an enzyme expression vector into bacteria or the like.
  • the medium used for culturing the transformant may be a commonly used medium, and is appropriately selected according to the type of host. For example, when culturing E. coli, LB medium or the like is used. Antibiotics according to the type of selection marker may be added to the medium.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase may be a product obtained by extracting and purifying an enzyme from a culture solution obtained by culturing a transformant capable of expressing the enzyme. In addition, it is expressed in advance as a fusion protein in which a trigger factor (TF) or His tag or the like is fused to the N-terminal side or C-terminal side of the polypeptide of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention and purified, etc. May be made easier. Moreover, you may use the extract containing the enzyme extracted from the transformant in a culture solution as it is. A known method may be applied as an enzyme extraction method from the transformant. The enzyme extraction step may include, for example, disrupting the transformant in an extraction solvent and separating the cell contents from the transformant fragments. The obtained cell contents contain the target mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase.
  • TF trigger factor
  • a known method capable of disrupting the transformant and recovering the enzyme solution may be applied.
  • Examples thereof include ultrasonic disruption and glass bead disruption.
  • the crushing conditions are not particularly limited as long as the enzyme is not inactivated, such as 10 ° C. or less and 15 minutes.
  • Examples of the method for separating the cell contents from the crushed pieces of microorganisms include sedimentation separation, centrifugation, filtration separation, and combinations of these two or more separation methods. Separation conditions using these methods are known to those skilled in the art, and in the case of centrifugation, for example, 8,000 ⁇ g to 15,000 ⁇ g and 10 minutes to 20 minutes.
  • the extraction solvent may be one that is usually used as a solvent for enzyme extraction, and examples thereof include a Tris-HCl buffer solution and a potassium phosphate buffer solution.
  • the pH of the extraction solvent is preferably from 3 to 10, more preferably from 6 to 8, from the viewpoint of enzyme stability.
  • the extraction solvent may contain a surfactant.
  • the surfactant include nonionic surfactants and zwitterionic surfactants.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as poly (oxyethylene) sorbitan monooleate (Tween 80), alkyl glucosides such as n-octyl ⁇ -D-glucoside, sucrose stearate, etc. Sucrose fatty acid esters and polyglycerin fatty acid esters such as polyglycerin stearate.
  • zwitterionic surfactants include N, N-dimethyl-N-dodecylglycine betaine, which is an alkylbetaine.
  • Triton X-100 Triton X-100
  • polyoxyethylene (20) cetyl ether Brij-58
  • nonylphenol ethoxylate Tegitol NP-40
  • concentration of the surfactant in the extraction solvent is preferably 0.001% by mass to 10% by mass, more preferably 0.10% by mass to 3.0% by mass, and 0.10% by mass from the viewpoint of enzyme stability. % To 1.0% by mass is more preferable.
  • the extraction solvent preferably contains a reducing agent such as dithiothreitol or ⁇ -mercaptoethanol from the viewpoint of enzyme activity.
  • a reducing agent such as dithiothreitol or ⁇ -mercaptoethanol
  • dithiothreitol is preferable.
  • concentration of dithiothreitol in the extraction solvent is preferably 0.1 mM to 1 M, more preferably 1 mM to 10 mM. Due to the presence of dithiothreitol in the extraction solvent, structures such as disulfide bonds in the enzyme are easily retained, and the enzyme activity tends to increase.
  • the extraction solvent preferably contains a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) from the viewpoint of enzyme activity.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • concentration of EDTA in the extraction solvent is preferably 0.01 mM to 1 M, more preferably 0.1 mM to 10 mM. Due to the presence of EDTA in the extraction solvent, metal ions that can lower the enzyme activity are chelated, so that the enzyme activity tends to increase more.
  • the extraction solvent may contain known components that can be added to the enzyme extraction solvent.
  • Mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase may be used alone or in combination of two or more.
  • the conditions for the reaction of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase and squalene are not particularly limited as long as the enzyme reaction can proceed.
  • the reaction temperature and reaction time can be appropriately selected based on the activity of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase. From the viewpoint of reaction efficiency, the reaction temperature and reaction time are, for example, 4 ° C. to 100 ° C. and 1 hour to 30 days, and preferably 30 ° C. to 60 ° C. and 16 hours to 20 days.
  • the pH condition is, for example, 3 to 10 and preferably 6 to 8 from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction, and a commonly used buffer or the like can be used. Further, for example, the same extraction solvent used in the enzyme extraction step can be used. Alternatively, an extract containing a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase (eg, a cell-free extract) may be used as it is in the reaction as an enzyme solution.
  • a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase eg, a cell-free extract
  • the concentration ratio between the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase and the substrate squalene in the umbrain production reaction is 1 as the molar concentration ratio of the substrate to the enzyme (substrate / enzyme) from the viewpoint of reaction efficiency. ⁇ 10000 is preferable, 10 to 5000 is more preferable, 100 to 3000 is more preferable, and 1000 to 2000 is still more preferable.
  • the concentration of squalene used in the enzyme reaction is preferably 0.000001% by mass to 10% by mass and more preferably 0.00001% by mass to 1% by mass with respect to the total mass of the reaction solvent from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the reaction step in which the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase reacts with squalene may be repeated a plurality of times. Thereby, the yield of an umbrain can be raised.
  • the timing and amount of charging should be set appropriately according to the concentration of the mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in the reaction solution, the base mass remaining in the reaction solution, etc. Can do.
  • the microorganism or transformant of the present invention is cultured.
  • Umbrain can be produced by culturing host cells transformed with the microorganism or expression vector.
  • the yeast may be cultured in a commonly used YPD medium or the like.
  • Yeast introduced with a homologous recombination or yeast having an expression vector is pre-cultured, further inoculated in a YPD medium or the like, and cultured for 24 to 240 hours, preferably about 72 to 120 hours.
  • Umbrain secreted into the medium can be used as it is or after being purified by a known method. Specific examples of the purification method include solvent extraction, recrystallization, distillation, column chromatography, and HPLC.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention can convert squalene to monocyclic 3-deoxyacetylol A, and in the bicyclic pathway, 8 ⁇ - Although the mechanism by which hydroxypolypoda-13,17,21-triene can be converted into ambrain has not been analyzed in detail, it is estimated as follows. However, the present invention is not limited by the following estimation.
  • the mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention includes the QXXXGX (W / F) motif (motif A), the QXXXX (G / A) X (F / W / Y) motif (motif B ), QXXXGX (F / W / Y) motif (motif C), QXXXGXW motif (motif D), and QXXXGX (F / W) motif (motif E).
  • the mutant DXDD motif in which the fourth aspartic acid of the DXDD motif is substituted with an amino acid other than aspartic acid is cyclized with tetraprenyl- ⁇ -curcumene.
  • an amino acid other than aspartic acid preferably cysteine or glycine
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase of the present invention does not have the QXXXGXW motif that squalene-hopene cyclase has.
  • the squalene-hopene cyclase has the motifs A to E.
  • Example 1 In this example, cloning of the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase and construction of an expression vector were performed.
  • the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene was introduced into the pCold-TF vector (NdeI-XhoI site).
  • a polynucleotide encoding a wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase was obtained by PCR using Bacillus megaterium chromosomal DNA as a template. The polynucleotide was inserted into the NdeI-XhoI site of the pCold-TF vector.
  • Example 2 the enzyme activity of the mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase was examined using squalene, 3-deoxyacireol A, or 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene as a substrate.
  • the transformant prepared in Example 1 was inoculated into ampicillin (50 mg / L) -containing LB medium (1 L) and cultured with shaking at 37 ° C. for 3 hours. After culturing, 0.1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added and shaken at 15 ° C. for 24 hours to induce expression of mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Squalene 250 ⁇ g was mixed with Triton X-100 (5 mg) and solubilized, and then added to buffer A (1 mL) to prepare a squalene solution. The total amount of this squalene solution was added to the cell-free extract A (4 mL) to prepare a reaction solution, which was incubated at 30 ° C. for 64 hours. In the reaction solution, the molar ratio (substrate / enzyme) between squalene (substrate) and mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase (enzyme) was about 200.
  • Ambrain was obtained by reacting mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase with squalene. In addition, 3-deoxyacireol A and 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene were also produced. Therefore, the mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase causes the ambrane to be formed by the monocyclic pathways (a) and (b) and the bicyclic pathways (c) and (d) shown in FIG. It is thought that it is generated.
  • Example 3 The operation of Example 2 was repeated except that the incubation was carried out at 30 ° C. for 5 days instead of incubating at 30 ° C. for 64 hours to produce an embrane.
  • FIG. 4 shows the product amounts of squalene, ambrain, 3-deoxyacireol A, and 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene after 5 days, 10 days, and 15 days. Over time, it is considered that squalene is converted to 3-deoxyacireol A and 8 ⁇ -hydroxypolypoda-13,17,21-triene, which are further converted to ambrain.
  • FIG. 5 after 5 days of the enzyme reaction, the rate of formation of the umbrain relative to squalene was 8%. Ten days after the enzyme reaction, the rate of formation of umbrain relative to squalene increased to 20%. After 15 days of the enzyme reaction, the production rate of umbrain relative to squalene increased further to 50%.
  • an embrane can be synthesized in one step using squalene as a substrate without using a mutant squalene-hopene cyclase.
  • Example 4 the HMGR gene and the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene were cloned in order to obtain transformants that allow yeast to express HMGR and the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase. It was.
  • the HMGR gene was obtained from an ML-236B resistant strain obtained by culturing yeast ( Saccharomycopsis fibuligera ) using a medium containing ML-236B (SEQ ID NO: 4, hereinafter obtained from the ML-236B resistant strain).
  • HMGR gene may also be referred to as “ADK4653” or “ADK4653 gene”).
  • mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene The wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene is a codon in Saccharomyces cerevisiae based on the amino acid sequence of the enzyme. Optimized and synthesized. The synthesized gene was inserted into the cloning site (restriction enzyme EcoRV site) of the vector pUCF (Fusmac). Next, an amino acid substitution mutation was introduced into the wild type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene.
  • tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene in which the amino acid at position 373 of wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase was substituted from aspartate to cysteine was obtained.
  • the vector into which the mutation was introduced was prepared using PrimeSTAR DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) and using the mutation-introducing primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, according to the instruction manual.
  • a protein expression shuttle vector (pAUR123, Takara Bio Inc.) in which the truncated HMGR (tHMGR) gene was cloned in Example 4 (1) was used.
  • a protein expression shuttle vector (pAUR123, Takara Bio Inc.) in which the truncated HMGR (tHMGR) gene was cloned in Example 4 (1) was used.
  • an expression cassette composed of a phosphoglycerate kinase gene (PGK1) promoter derived from Saccharomyces cerevisiae and a CYC1 terminator was inserted between the base sequence positions 6982 and 1 of the vector pAUR123.
  • an expression vector fragment containing a mutant HMGR (tHMGR) gene was prepared by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 using this vector as a template.
  • a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene fragment was prepared in the same manner using the vector obtained in Example 4 (2) as a template and the primers shown in SEQ ID NOs: 11 and 12.
  • PCR products were subjected to restriction enzyme (DPNI) treatment after amplification confirmation by agarose gel electrophoresis, and purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up column (MACHEREY-NAGEL).
  • DPNI restriction enzyme
  • Cloning of the target gene into the vector prepared in Example 4 (3) was performed using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) according to the user manual.
  • the reaction solution was directly used for transformation with E. coli competent cells (HST08, Takara Bio Inc.). For positive clones, it was confirmed that the target gene was introduced by colony PCR, and an expression vector was obtained.
  • Example 5 yeast transformants were obtained using the vector obtained in Example 4 (3). Using the transformant, production of squalene, umbrain, monocyclic compound (3-deoxyachilleol A) or bicyclic compound (8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene) was confirmed.
  • Transformation of yeast Sake yeast Saccharomyces cerevisiae association 701 was transformed with the expression vector obtained in Example 4 (3).
  • the vector was previously cut with a restriction enzyme (EcoO65I (BstEII, BstPI), Takara Bio Inc.) at one position in the resistance marker gene and used in a linear form to introduce a gene by homologous recombination.
  • Yeast transformation was performed using Frozen-EZ Yeast Transformation II (ZYMO RESARCH) in accordance with a standard method of lithium acetate. The obtained clone was confirmed to have the target gene introduced by colony PCR.
  • Comparative Example 2 >> In this comparative example, the cloned ADK4653 gene and wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene were cloned.
  • a vector was constructed in the same manner as in Example 4 (3) using the wild-type gene before the mutation was introduced.
  • Comparative Example 3 a yeast transformant was obtained using the vector obtained in Comparative Example 2. Using the transformant, production of squalene, umbrain, monocyclic compound (3-deoxyachilleol A) or bicyclic compound (8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene) was confirmed. (1) Transformation of yeast and (2) production of squalene, umbrain, monocyclic compound or bicyclic compound by yeast transformant were carried out in the same manner as in Example 5.
  • Example 5 The cells obtained in Example 5 and Comparative Example 3 were crushed and then extracted with hexane to prepare a sample. After centrifuging 3 mL of the culture solution to remove the supernatant, 1.5 mL of zirconia beads (YTZ ball, ⁇ 0.5 mm, Nikkato) were added to the cells and pulverized with a bead crusher (Tytec Corp., uT-12) ( 3200 rpm / min) was repeated 5 times for 1 minute. Hexane 1.5mL was added to the crushing liquid, it extracted, repeating stirring for 1 minute (1800 rpm / min) 3 times with the said bead crusher, and the organic layer was collect
  • the extract was dried under a nitrogen gas stream, redissolved in 400 uL of hexane, and subjected to GC analysis.
  • a gas chromatograph GC-2014 (Shimadzu Corporation) was used, and an HP5 capillary column (30 m ⁇ 0.32 mm ⁇ 0.25 ⁇ m, Agilent Technologies) was used, and the detector was FID.
  • the analysis conditions were: SPL temperature 300 ° C., FID temperature 320 ° C., split ratio 30.0, total flow rate 25.0 mL / min, linear velocity 19.3 cm / sec, column temperature 220-300 ° C. (heating rate 1 ° C./min) ), And maintained at 300 ° C. for 10 minutes.
  • FIG. 7 The result of analysis by gas chromatograph is shown in FIG. From the host in which the mutant HMGR gene and the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene of Examples 4 and 5 were simultaneously expressed, squalene, umbrain, monocyclic compound (3-deoxyachilleol A) and bicyclic The compound (8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene) was detected (FIG. 7). The production of squalene in sake yeast expressing the mutant HMGR gene (shortened) shows a marked increase, confirming the enhancement of the mevalonate pathway, which is strictly regulated as a rate-limiting step in metabolism. did it.
  • the bicyclic compound (8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene), which is not originally produced by sake yeast, can be produced by co-expression of the wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene.
  • no ambrain or monocyclic compound (3-deoxyachilleol A) was detected and produced.
  • the yeast is not produced in yeast.
  • HMGR hydroxymethylglutaryl CoA reductase
  • a mutant HMGR gene (short form) having a specific amino acid sequence is expressed in yeast, thereby allowing downstream of the mevalonate pathway. It is known that production of compounds, especially squalene, will increase dramatically. Therefore, co-expression of the mutant HMGR gene (shortened) and the wild-type tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene enables the production of ambrain in yeast.
  • Example 6 a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase derived from Bacillus subtilis was prepared to produce an embrain.
  • the amino acid identity of Bacillus subtilis and Bacillus megaterium tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase is 50%.
  • a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene was synthesized based on the amino acid sequence of tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase derived from Bacillus subtilis (GenBank accession number: AB618206).
  • the gene was designed so that aspartic acid, which is the fourth amino acid of the DXDD motif, was replaced with cysteine, synthesized with optimization for expression in E. coli, and inserted into the NdeI-XhoI site of the pCold-TF vector.
  • a transformant of Escherichia coli BL21 (DE3) was prepared using the obtained expression vector containing the mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase gene. Thereafter, as in Example 2, a cell-free extract containing a mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase was obtained.
  • squalene 50 ⁇ g was mixed with Tween-80 (1 mg) and solubilized, and then buffer B [50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1 v / v% Tween-80, 0.1 w / v% sodium ascorbate, 2.5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA] (1 mL) was added to prepare a squalene solution. The total amount of this squalene solution was added to a cell-free extract (4 mL) to obtain a reaction solution, which was incubated at 30 ° C. for 64 hours.
  • buffer B 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.1 v / v% Tween-80, 0.1 w / v% sodium ascorbate, 2.5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA
  • the molar ratio (substrate / enzyme) between squalene (substrate) and mutant tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase (enzyme) was about 1000.
  • 15 mass% potassium hydroxide-containing methanol (6 mL) was added to the reaction solution to stop the enzyme reaction.
  • n-hexane (5 mL) was added to the reaction solution, and the reaction product was extracted three times.
  • the obtained fraction was concentrated and analyzed by a gas chromatography mass spectrometer (GC-MS), and it was confirmed that ambrain was produced.
  • the umbrain by using a mutated tetraprenyl- ⁇ -curcumene cyclase in the production of an umbrain, the umbrain can be produced in one step using squalene as a substrate.
  • Umbrain obtained by the present invention can be used as a raw material for production of pharmaceuticals, for example.

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Abstract

本発明の目的は、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。　前記課題は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、（ａ）前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、及びＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって解決することができる。

Description

変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びアンブレインの製造方法
　龍涎香（ambergris）は、７世紀ごろから世界各地で使用されてきた高級香料であり、漢方薬としても使用されている。龍涎香は、マッコウクジラが食物（タコ、イカ等）の不消化物を消化管分泌物により結石化させ、排泄したものと考えられているが、詳細な生成メカニズムは不明である。龍涎香の主成分はアンブレインであり、龍涎香が海上を浮遊する間に日光と酸素によって酸化分解を受け、各種の香りを持つ化合物を生成すると考えられている。
　龍涎香の主成分アンブレインは、香料又は薬剤として用いられているが、自然界から大量に入手することは不可能である。このため、種々の有機合成法が提案されている。
　例えば、特許文献１には、（＋）－アンブレインを簡便かつ安価に効率よく製造する方法として、アンブレノリドから、新規なスルホン酸誘導体を製造し、これにγ－シクロゲラニルハライドの光学活性体をカップリングさせる工程を含む方法が開示されている。
　また、非特許文献１には、（±）（５，５，８ａ－トリメチルオクタヒドロ－１Ｈ－スピロ［ナフタレン－２，２’－オキシラン］－１－イル）メタノールから合成した２－（（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）－２－（メトキシメトキシ）－２，５，５，８ａ－テトラメチルデカヒドロナフタレン－１－イル）アセトアルデヒドと、（±）メチル　６－ヒドロキシ－２，２－ジメチルシクロヘキサンカルボキシレートから合成した５－（（４－（（Ｓ）－２，２－ジメチル－６－メチレンシクロヘキシル）ブタン－２－イル）スルホニル）－１－フェニル－１Ｈ－テトラゾールとを、Ｊｕｌｉａカップリング反応によって収束的合成して、アンブレインを得る方法が開示されている。
　しかしながら、従来のアンブレインの有機合成法は、多くの合成段階を必要とすることから、反応系が複雑であり、事業化には至っていない。
特開平１０－２３６９９６号公報 国際公開ＷＯ２０１５／０３３７４６号パンフレット
Tetrahedron Asymmetry, (2006) Vol.17, pp.3037-3045 Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp.2189-2198 Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242 Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670 J. Am. Chem. Soc., (2011) Vol.133, pp.17540-17543 J. Am. Chem. Soc., (2013) Vol.135, pp.18335-18338
　一方、スクアレン－ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３－デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている（非特許文献２～４）。
　本発明者らは、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン－ホペン環化酵素をスクアレンに反応させることによって、３－デオキシアキレオールＡを得、さらにテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を反応させることによって、アンブレインの製造ができることを見出した（特許文献２）。
　しかしながら、特許文献２の方法は多段階反応であり、また収率についても改善の余地があった。
　従って、本発明の目的は、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、アンブレインを効率よく製造する方法について鋭意研究した結果、特定の変異を有する変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを生成する活性を有することを見出した。このスクアレンからアンブレインの産生は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することにより達成されるものである。また、スクアレンからアンブレインの産生は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することにより達成されるものである。本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素がこのような酵素活性を示すことは、驚くべきことである。
　本発明は、こうした知見に基づくものである。
　従って、本発明は、
［１］ＤＸＤＤモチーフの第４番目アミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［２］前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、［１］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［３］前記配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸、又は前記配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸が、システイン又はグリシンに置換している、［１］又は［２］に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを有する微生物、
［６］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを更に有する［５］に記載の微生物、
［７］［４］に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター、
［８］［７］に記載のベクターを有する形質転換体、
［９］ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを更に有する［８］に記載の形質転換体、
［１０］［１］～［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、及び
［１１］［５］又は［６］に記載の微生物、又は［８］又は［９］に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法、
に関する。
　本発明によれば、変異型スクアレン－ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。また、微生物発酵により培養液に含まれる炭素源から効率的にアンブレインを合成することができる。
　本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができる。また、本発明に用いる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性トリテルペン（８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン）からアンブレインを生成することができる。
変異型スクアレン－ホペン環化酵素及びテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を使用する、スクアレンを基質とした従来のアンブレイン合成経路を示した図である。 本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いたスクアレンからアンブレインを生成する２つの経路を示した図である。 スクアレン（Ａ）、３－デオキシアキレオールＡ（Ｂ）、又は２環性トリテルペン（Ｃ）を基質として用いて、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を反応させた場合の生成物を示した図である。 本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を、スクアレンを基質として反応させた場合に産生される３－デオキシアキレオールＡ、２環性トリテルペン、及びアンブレインの量の５日、１０日及び１５日後の変化を示したグラフである。 本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させた場合の、酵素反応時間の増加に比例して上昇するアンブレイン生成率を示す図面である。 野生型のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子をスクアレンに反応させた場合の生成物を示した図である。 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む酵母形質転換体の生産物をガスクロマトグラフィーにより分析したクロマトグラムを示した図である。変異型ＴＣは、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（Ｄ３７３Ｃ）遺伝子を発現させた酵母であり、野生型ＴＣは、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を発現させた酵母である。単環性プロダクトは3-deoxyachilleol Aであり、二環性プロダクトは8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-trieneである。 野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示した図である。 バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス、及びバチルス・リケニフォルミスのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列、並びにアリシクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン－ホペン環化酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。
　以下、本発明について詳述する。
［１］変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、（ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す。
　ここで、各モチーフや配列を定義しているアルファベットはアミノ酸の一文字略号を表しており、「Ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。すなわち、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの場合、Ｎ末端側からＣ末端側に向かってグルタミン（Ｑ）、任意のアミノ酸（Ｘ）が３つ、グリシン（Ｇ）、任意のアミノ酸（Ｘ）、さらにトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）のいずれか、が配列することを示す。また、「ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフを有する」とは、ＤＸＤＤモチーフとＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの間に１００アミノ酸残基以上存在することを意味するものとし、その他モチーフの特定についても同様である。以下、特に記載のない限り同様である。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である。
　また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の最も好ましい態様としては、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるBacillus megaterium由来のポリペプチド、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるBacillus subtilis由来のポリペプチドを挙げることができる。これらの変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに置換している。
（テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素）
　テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、ＴＣと称することがある）は、片末端に単環を有する３－デオキシアキレオールＡを基質として利用し、アンブレインを生成することができる。すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、３－デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３－デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することができる。
　また、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンを基質とし、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成することができる（非特許文献５）。更に、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、２環性の８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物のオノセランオキサイドと１４β－ヒドロキシオノセラ－８（２６）－エンを生成することができる（非特許文献６）。
　すなわち、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＥＣ４．２．１．１２９に分類され、水とテトラプレニル－β－クルクメンからバチテルペノールＡを生成する反応、又は、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを生成する反応を触媒し得る酵素である。
　テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、例えばバチルス属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、又はジオバチルス属などの細菌が有している。バチルス属の細菌としては、枯草菌（バチルス・サブチルス）、バチルス・メガテリウム、又はバチルス・リケニフォルミスを挙げることができる。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有している。後述のスクアレン－ホペン環化酵素も、前記のモチーフを有しているが、更にＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有している。一方、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していない。更に、スクアレン－ホペン環化酵素は、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフのＣ末側にＧＸＧＦＰ配列を有し、その４番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）であるという特徴を有する。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素もＧＸＧＦＰ配列に似たＧＸＧＸＰ配列を有するが、４番目のアミノ酸がフェニルアラニンではなく、例えばロイシン（L）、メチオニン（M）、又はアルギニン（R）などである。
（アスパラギン酸の置換）
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（以下、変異型ＴＣと称することがある）においては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している。アスパラギン酸以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを挙げることができるが、好ましくはシステイン又はグリシンであり、より好ましくはシステインである。図８にバチルス・メガテリウムの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示す。
　３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。また、バチルス・サブチリスの野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及び３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（特には、システイン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の由来は、特に限定されるものではなく、全てのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いることができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有しており、ＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有しておらず、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。例えば、バチルス・サブチルスとバチルス・メガテリウムとのポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は５０％程度であるが、実施例に示すように、本発明の特徴を有することにより、いずれの酵素もスクアレンから３－デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインを生成することができる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１３に記載のアミノ酸配列はバチルス・サブチルスのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列である。
　図１に記載のように、従来スクアレンからアンブレインを生成する場合、スクアレンを変異型スクアレン－ホペン環化酵素（以下、変異型ＳＨＣと称することがある）によって、３－デオキシアキレオールＡに変換し、そして３－デオキシアキレオールＡを野生型のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって、アンブレインに変換することによって製造されていた（特許文献２）。
　一方、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いて、スクアレンからアンブレインを生成する場合、図２に示すように単環性の３－デオキシアキレオールＡを中間体とする経路（以下、単環性経路と称することがある）と、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを中間体とする経路（以下、２環性経路と称することがある）によって製造される。
（単環性経路）
　前記単環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから単環性の３－デオキシアキレオールＡが生成される。そして変異型ＴＣによって、３－デオキシアキレオールＡからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、３－デオキシアキレオールＡをアンブレインに変換することができたが、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換することが可能であり、従って図２に示すように、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡへの変換（図２の反応（ａ））及び３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（図２の反応（ｂ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
（２環性経路）
　一方、２環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンが生成される。そして変異型ＴＣによって、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、スクアレンを８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換することができたが、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換することが可能であり、従って図２に示すようにスクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンへの変換（図２の反応（ｃ））及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインへの変換（図２の反応（ｄ））の２つの反応を１つの酵素によって、行うことが可能になった。
　本発明の変異型ＴＣは、スクアレンからアンブレインを製造する工程において、スクアレンから３－デオキシアキレオールＡへの変換（反応（ａ））、３－デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（反応（ｂ））、スクアレンから８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンへの変換（反応（ｃ））、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンからアンブレインへの変換（反応（ｄ））の４つの反応を１つの酵素で行うことができる。
（ＤＸＤＤモチーフ）
　前記のとおり、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素において、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目の置換又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目の置換は、ＤＸＤＤモチーフと呼ばれる領域に存在する。すなわち、ＤＸＤＤモチーフは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７０～３７３番目、又は配列番号１２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から３７５～３７８番目に位置する。Ｎ末端側から３７３番目、又は３７８番目のアミノ酸の置換は、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたものである。ＤＸＤＤモチーフのアスパラギン酸は極めて保存性が高く、通常Ｎ末端側から４番目のアミノ酸残基はアスパラギン酸である。本発明は、この保存性の高い特定のアミノ酸を変異させることで、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を有するようになることを見出したものである。
（１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列）
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、例えば１～３３０個、１～３００個、１～２５０個、１～２００個、１～１５０個、１～１００個、又は１～５０個であることができ、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、最も好ましくは１～２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
（アミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列）
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１又は配列番号１３のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記ポリペプチドは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。より好ましくは該同一性が４５％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは６０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは８０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列、最も好ましくは該同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、且つスクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリペプチドからなる変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素である。
　前記配列番号１又は１３のアミノ酸配列において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」又は「同一性が４０％以上であるアミノ酸配列」は、配列番号１又は１３のアミノ酸配列が置換されたものであるが、このアミノ酸配列の置換は、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の機能を維持する保存的置換である。「保存的置換」とは、限定されるものではないが、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素におけるＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸へ変異（置換）させるのは、スクアレンを基質としてアンブレイン生成する活性を付与するための、積極的な置換（変異）であるが、前記保存的置換はスクアレンを基質としてアンブレインを生成する活性を維持するための置換であり、当業者であれば容易に実施することのできるものである。
（変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のモチーフ）
　図９にバチルス・メガテリウム（配列番号１）、バチルス・サブチリス（配列番号１３）、及びバチルス・リケニフォルミス（配列番号１７）のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素、並びにアリシクロバチルス・アシドカリダリウスのスクアレン－ホペン環化酵素（配列番号１８）のアラインメントを示した。本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＡということもある）を有する。好ましくは、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にモチーフＡを２個有する。
　また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１０～５０アミノ酸残基の位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＢということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）がＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）ＤＷであることが好ましい。
　また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＣということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフがＱＮＸＸＧＧ（Ｗ／Ｆ）であることが好ましい。
　また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（以下、本発明においてモチーフＤということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフがＱＸＸ（Ｎ／Ｄ）Ｇ（Ｓ／Ａ）Ｗであることが好ましい。
　また、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（以下、本発明においてモチーフＥということもある）を有し、前記ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフがＱＸＸ（Ｄ／Ｎ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）（Ｆ／Ｗ）であることがより好ましい。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、ＤＸＤＤモチーフのほかに上記モチーフＡ～Ｅすべてを有するものである。
　また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さないものである。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、公知の遺伝子組換え技術などを用いて取得することができる。例えば、バチルス・メガテリウムの染色体ＤＮＡを取得し、適当なプライマーを用いて、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を、ＰＣＲなどによって増幅する。得られた遺伝子を、適当なベクターに組み込み、遺伝子配列を決定する。ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸である場合は、それ以外のアミノ酸への変異を導入することによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードする遺伝子を取得することができる。その遺伝子を、酵母等の宿主に組み込み、発現させることによって、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を得ることが可能である。
　またテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、バチルス・メガテリウムの他に、バチルス属等の細菌に存在することが知られており、バチルス・サブチリス由来酵素（アクセッション番号：ＡＢ６１８２０６），バチルス・リケニフォルミス由来酵素（アクセッション番号：ＡＡＵ４１１３４）等を取得することも可能である。
　また、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードする遺伝子は、公知の合成遺伝子の合成方法、例えば、Ｋｈｏｒａｎａらの方法（Ｇｕｐｔａ　ｅｔ　ａｌ．，１９６８）、Ｎａｒａｎｇらの方法（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８２）、又はＲｏｓｓｉらの方法（Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９８２）によって合成することも可能である。そして、合成された遺伝子を発現させることにより、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を得ることができる。
［２］ポリヌクレオチド
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。すなわち、ＤＸＤＤモチーフのうち、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異（置換）されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
　具体的には、本発明のポリヌクレオチドとして、例えばＤＸＤＤモチーフの、Ｎ末端側から第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに変異（置換）されたポリペプチドをコードする配列番号２、又は配列番号１４で表される塩基配列からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
　更には、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、スクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
　また、本発明のポリヌクレオチドは、それを導入する微生物又は宿主細胞に合わせて、最適なコドンの塩基配列に変更することが好ましい。
［３］微生物
　本発明の微生物は、本発明のポリヌクレオチドを有する微生物である。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に含む限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、パン酵母、麹菌、又はアカパンカビを挙げることができる。
《ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ》
　本発明の微生物は、好ましくはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（以下、ＨＭＧＲと称することがある）をコードするポリヌクレオチドを更に有する。
　ＨＭＧＲはファルネシルピロリン酸の合成経路において、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素である。ファルネシルピロリン酸が２分子結合することにより、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の基質であるスクアレンが生成される。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの活性を向上させることによって、微生物におけるスクアレンの生成を促進し、微生物を用いたアンブレインの製造を増加させることができる。
　前記ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼのポリペプチドは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ活性を有する限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番のアミノ酸配列、（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番からなるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番からなるアミノ酸配列との同一性が８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）であるアミノ酸配列或いは（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列、（２）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　前記のアミノ酸配列からなるヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、優れたレダクターゼ活性を示す。従って、配列番号３で表されるアミノ酸配列の５１４番～１０２２番のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの膜結合領域を除いたアミノ酸配列であり、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの優れた活性を示すものである。配列番号４にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードする核酸配列（塩基配列）の１つの態様を示す。
［４］ベクター
　本発明のベクターは、上記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターである。すなわち、本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
　発現ベクターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、外来タンパク質の発現効率の高いものが好ましい。前記ポリヌクレオチドを発現させるための発現ベクターは、微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、前記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　より具体的には、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ－３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ－５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ－３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄII、ｐＣｏｌｄIII、ｐＣｏｌｄIV、ｐＮＩＤＮＡ、ｐＮＩ－ＨｉｓＤＮＡ（タカラバイオ社製）等を例示することができる。
　プロモーターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞中で発現することができるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での生合成）で酵素を生産するには、強いプロモーターとして機能し、目的タンパク質の大量生産が可能なプロモーターが好ましく、誘導型プロモーターがより好ましい。誘導型プロモーターとしては、例えば低温で発現誘導されるコールドショック遺伝子cspAのプロモーター、誘導剤であるＩＰＴＧの添加により誘導されるＴ７プロモーター等をあげることができる。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）においては、上記プロモーターの中でも組織を問わず常時目的遺伝子を発現させるプロモーター、すなわち構成的プロモーターであることがより好ましい。構成的プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）、翻訳伸長因子ＴＦ－１α遺伝子（ＴＥＦ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ＰＹＫ１）のプロモーターが挙げられる。
［５］形質転換体
　本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
　宿主細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、酵母、麹菌、アカパンカビ等取り扱いが容易な菌株が好ましいが、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることも可能である。しかしながら、酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での生合成）で酵素を生産するには、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、麹菌が好ましく、大腸菌が最も好ましい。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）で最も好ましくは酵母である。最も好ましい酵母株としては、清酒酵母が挙げられる。特に好ましくは、清酒酵母協会７号又は７０１号が挙げられる。協会７０１号酵母は、協会７号から育種された泡なし酵母で高泡を形成しない特長があるが、他の性質は同じである。
　発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）においては、本発明の形質転換体は、好ましくはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを有する。前記ベクターを含むことによって、形質転換体を用いたアンブレインの製造における産生量を増加させることができる。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼは、前記「微生物」の項に記載のものである。
なお、上記「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを有する」とは、上記「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」にヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡが含まれるようにしてもよく、また「変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」と「ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター」をそれぞれ調製し、形質転換させてもよい。
［６］アンブレインの製造方法
　本発明のアンブレインの製造方法は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とするものである。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成できる。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記酵素を発現可能な形質転換体を培養することにより得られた培養液から酵素を抽出し精製したものであってもよい。また、あらかじめ本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のポリペプチドのＮ末側又はＣ末側にトリガーファクター（TF）又はＨｉｓタグなどを融合させた融合タンパク質として発現させ、精製などを容易にしてもよい。また、培養液中の形質転換体から抽出された酵素を含む抽出液をそのまま用いてもよい。形質転換体からの酵素の抽出方法は、公知の方法を適用してよい。酵素の抽出工程は、例えば、形質転換体を抽出溶媒中で破砕し、細胞内容物を形質転換体の破砕片と分離することを含んでよい。得られた細胞内容物には、目的とする変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が含まれている。
　形質転換体の破砕方法としては、形質転換体を破砕して、酵素液を回収可能な公知の方法を適用してよく、例えば、超音波破砕、ガラスビーズ破砕等が挙げられる。破砕の条件は、特に制限はなく、１０℃以下及び１５分間などの、酵素が失活しない条件であればよい。
　細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法としては、沈降分離、遠心分離、濾過分離及びこれらの２つ以上の分離方法の組み合わせ等が挙げられる。これらの方法を用いた分離条件は当業者には公知であり、遠心分離の場合には例えば、８，０００×ｇ～１５，０００×ｇ及び１０分間～２０分間である。
　抽出溶媒としては、酵素抽出の溶媒として通常用いられるものでよく、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。抽出溶媒のｐＨは、酵素の安定性の点で、３～１０が好ましく、６～８がより好ましい。
　抽出溶媒には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコシド等のアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステル等のポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるＮ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ドデシルグリシンベタイン等が挙げられる。これら以外にも、トライトンＸ－１００（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Brij-58）、ノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の当技術分野で一般的に用いられる界面活性剤が利用可能である。
　抽出溶媒中の界面活性剤の濃度は、酵素の安定性の観点から、０．００１質量％～１０質量％が好ましく、０．１０質量％～３．０質量％がより好ましく、０．１０質量％～１．０質量％が更に好ましい。
　抽出溶媒には、酵素活性の観点から、ジチオスレイトール、β－メルカプトエタノール等の還元剤が含まれていることが好ましい。還元剤としては、ジチオスレイトールが好ましい。抽出溶媒中のジチオスレイトールの濃度は、０．１ｍＭ～１Ｍが好ましく、１ｍＭ～１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にジチオスレイトールが存在することによって、酵素におけるジスルフィド結合等の構造が保持されやすくなり、酵素活性がより上昇する傾向がある。
　抽出溶媒には、酵素活性の観点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤が含まれていることが好ましい。抽出溶媒中のＥＤＴＡの濃度は、０．０１ｍＭ～１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ～１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にＥＤＴＡが存在することによって、酵素活性を低下させ得る金属イオンがキレートされるため、酵素活性がより上昇する傾向がある。
　抽出溶媒には、上記の成分以外に、酵素抽出溶媒に添加可能な公知の成分が含まれていてよい。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃～１００℃及び１時間～３０日であり、３０℃～６０℃及び１６時間～２０日が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３～１０であり、６～８が好ましい。
　反応溶媒は、酵素反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、通常用いられる緩衝液等を用いることができる。また、例えば、酵素の抽出工程で使用する抽出溶媒と同一のものを用いることができる。また、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む抽出液（例えば、無細胞抽出液）を酵素液としてそのまま反応に用いてもよい。
　アンブレイン生成反応における変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と、その基質であるスクアレンとの濃度比は、反応効率の観点から、酵素に対する基質のモル濃度比（基質／酵素）として、１～１００００が好ましく、１０～５０００がより好ましく、１００～３０００がより好ましく、１０００～２０００が更に好ましい。
　酵素反応に用いるスクアレンの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％～１０質量％が好ましく、０．００００１質量％～１質量％がより好ましい。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとが反応する反応工程は、複数回繰り返してもよい。これにより、アンブレインの収率を高めることができる。反応工程を複数回繰り返す場合には、基質となるスクアレンを反応系に再投入する工程、公知の方法により酵素を失活させた後、反応液中の反応生成物を回収及び精製する工程等を含むものであってもよい。スクアレンの再投入を行う場合には、反応液中の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の濃度、反応液中に残存する基質量等によって、投入する時期、投入量を適宜設定することができる。
　本発明のアンブレインの製造方法の別の実施態様においては、本発明の微生物又は形質転換体を培養することを特徴とする。
　前記微生物又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、アンブレインを製造することができる。例えば、酵母について記載すると、酵母は通常用いられるＹＰＤ培地などで培養すればよい。相同組換えにより遺伝子導入された酵母、又は発現ベクターを有する酵母を前培養し、更にＹＰＤ培地などに植菌し、そして２４～２４０時間、好ましくは７２～１２０時間程度培養する。培地中に分泌されたアンブレインは、そのまま、又は公知の方法により精製して用いることができる。精製方法としては、具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ等が挙げられる。
　《作用》

　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素が、前記単環性経路において、スクアレンを単環性の３－デオキシアキレオールＡに変換できるメカニズム、及び前記２環性経路において、８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンをアンブレインに変換できるメカニズムは詳細に解析されたわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は以下の推定によって限定されるものではない。　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記のとおり、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ（モチーフＡ）、ＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＢ）、ＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ（モチーフＣ）、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフ（モチーフＤ）、及びＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ（モチーフＥ）を有している。本発明の変異型ＴＣにおいては、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくは、システイン又はグリシン）に置換された変異型ＤＸＤＤモチーフが、テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素に広く存在する前記モチーフＡ～Ｅと何らかの相互作用により酵素活性が安定的に発揮される可能性がある。
　一方で、本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素においては、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない。スクアレン－ホペン環化酵素は、前記モチーフＡ～Ｅを有しているが、変異型ＤＸＤＤモチーフに変換しても、本発明の効果は得られないため、スクアレン－ホペン環化酵素が有しているＱＸＸＸＧＸＷモチーフは、本発明で得られる酵素活性を抑制的に働いている可能性がある。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
　本実施例では、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子をpCold-TFベクター（NdeI-XhoI部位）へ導入した。
　バチルス・メガテリウム染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを取得した。前記ポリヌクレオチドをpCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られたベクターを鋳型として用いて、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換されるように、クイックチェンジ法により部位特異的変異を導入し、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターを得た。
　続いて、得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
《実施例２》
　本実施例では、スクアレン、３－デオキシアキレオールＡ、又は８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンを基質として、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の酵素活性を検討した。
　実施例１で作製した形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（１Ｌ）に植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。培養後、０．１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、１５℃で２４時間振とうを行い、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の発現を誘導した。
　その後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した菌体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、３０ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５　ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、２０分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，３００×ｇ、２０分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ａとした。
　スクアレン（２５０μｇ）をＴｒｉｔｏｎＸ－１００（５ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ａ（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液Ａ（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約２００であった。
　インキュベート後に、メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ－ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
　得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、GC/MSでの解析結果を図３に示す。
（ただし、「ＢｍｅＴＣ　Ｄ３７３Ｃ」はバチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸（Ｄ）からシステイン（Ｃ）へ変異させたものであることを示す。また、「ＳＱ」は「スクアレン」を示し、「単環」「単環性プロダクト」は「３－デオキシアキレオールＡ」を示し、「２環」「２環性プロダクト」は「８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエン」を示す。以下同じ。）
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素とスクアレンとを反応させることによって、アンブレインが得られた。また、３－デオキシアキレオールＡ及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンも産生されていた。従って、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によって、図２に記載の（ａ）及び（ｂ）の単環性経路、並びに（ｃ）及び（ｄ）の２環性経路によってアンブレインが生成されていると考えられる。また、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と３－デオキシアキレオールＡとを反応させることによって、アンブレインが得られ、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンとを反応させることによっても、アンブレインが得られた。これらの結果は、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素により、前記単環性経路、及び２環性経路によってアンブレインが生成されていることを支持している。
《実施例３》
　３０℃で６４時間インキュベートする代わりとして３０℃で５日間インキュベートしたことを除いては、実施例２の操作を繰り返して、アンブレインを製造した。
　図４は、５日後、１０日後、及び１５日後のスクアレン、アンブレイン、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンの生成物量を示す。経時的に、スクアレンが、３－デオキシアキレオールＡ、及び８α－ヒドロキシポリポダ－１３，１７，２１－トリエンに変換され、更にそれらがアンブレインに変換されていると考えられる。図５に示すように、酵素反応５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は８％であった。酵素反応１０日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率は２０％まで増加した。酵素反応１５日後には、スクアレンに対するアンブレインの生成率はさらに５０％まで増加した。
　本発明の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素によれば、変異型スクアレン－ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。
《比較例１》
　変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に代えて、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を使用すること以外、実施例１～実施例３と同様の操作を行い、変異を有さないテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であってもスクアレンからアンブレインを生成できるのか検討した。
　その結果、図６に示すように、アンブレインを生成できるのはテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素と３－デオキシアキレオールＡを反応させた時のみであり、スクアレンを基質としてアンブレインを合成することはできなかった。
《実施例４》
　本実施例では、酵母にＨＭＧＲ及び変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を発現させる形質転換体を得るために、ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。
　酵母（Saccharomycopsis fibuligera）を、ＭＬ－２３６Ｂを含む培地を用いて培養して得られた、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株からＨＭＧＲ遺伝子を取得した（配列番号４、以下、該ＭＬ－２３６Ｂ耐性株から得られたＨＭＧＲ遺伝子を「ＡＤＫ４６５３」又は「ＡＤＫ４６５３遺伝子」と呼ぶこともある）。
（１）変異型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子（短縮型）のクローニング及び発現ベクターの構築
　ＭＬ－２３６Ｂ耐性株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５及び６に示したプライマーを用いてＰＣＲ法により変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型、配列番号４の１５４０～３０６６番の塩基配列）を増幅した。
　ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動による確認後に、発現用ベクターｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社）に挿入し、ＭＬ－２３６Ｂ耐性株の短縮型ＨＭＧＲ（以下、「ＡＤＫ４６５３＿ｔＨＭＧＲ」ということもある）の発現ベクターを取得した。
（２）変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニング
　野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、当該酵素のアミノ酸配列をもとに、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＵＣＦ（ファスマック社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入した。次に、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子に対しアミノ酸置換変異を導入した。具体的には、野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素の第３７３位のアミノ酸をアスパラギン酸からシステインに置換した変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を取得した。
　変異を導入したベクターの調製は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用し、配列番号７及び８に示した変異導入用プライマーを用いて、取扱説明書に従って行った。
（３）発現ベクターの構築
　発現ベクターの構築には、実施例４（１）で短縮型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子をクローニングしたタンパク質発現用のシャトルベクター（ｐＡＵＲ１２３、タカラバイオ社）を使用した。
　先ず出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネターから構成される発現カセットを上記ベクターｐＡＵＲ１２３の塩基配列６９８２位および１位の間に挿入した。次に本ベクターを鋳型として、ＰＣＲ法により配列番号９及び１０に示したプライマーを用いて変異型ＨＭＧＲ（ｔＨＭＧＲ）遺伝子を含む発現ベクター断片を調製した。
　また実施例４（２）で取得したベクターを鋳型として、同様にして配列番号１１及び１２に示したプライマーを用いて変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子断片を調製した。
　ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動による増幅確認の後に、制限酵素（ＤＰＮＩ）処理を行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社）を使用して精製を行った。目的遺伝子の実施例４（３）で作成したベクターへのクローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用し、ユーザーマニュアルに従って反応を行った。反応液は、そのまま大腸菌コンピテントセル（ＨＳＴ０８、タカラバイオ社）による形質転換に使用した。陽性クローンは、コロニーＰＣＲにより目的遺伝子が導入されていることを確認し、発現ベクターを取得した。
《実施例５》
　本実施例では、実施例４（３）で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。
（１）酵母の形質転換
　実施例４（３）で得られた発現ベクターを用いて清酒酵母（Saccharomyces cerevisiae　協会７０１号）を形質転換した。ベクターは、あらかじめ制限酵素（ＥｃｏＯ６５Ｉ（BstEII、BstPＩ）、タカラバイオ社）により耐性マーカー遺伝子内の一箇所で切断し、直鎖状にして使用することで相同組換えによる遺伝子導入を行った。酵母の形質転換は、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ　Ｙｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　II（ＺＹＭＯ　ＲＥＳＡＲＣＨ社）を使用し、定法である酢酸リチウム法に準じた方法で行った。得られたクローンは、コロニーＰＣＲにより目的遺伝子が導入されていることを確認した。
（２）酵母形質転換体によるスクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産
（酵母形質転換体の培養）
　短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子プロモーター（ＡＤＨ１）により、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター（ＰＧＫ１）により共に構成的に発現させた。清酒酵母が本来有しているＨＭＧＲ遺伝子に加え、形質転換により導入されたＡＤＫ４６５３遺伝子の過剰発現によりメバロン酸経路が増強されることを、当該経路の代謝産物であるスクアレンを測定することで確認した。また清酒酵母が本来は生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産の有無を確認した。
　培養は、容量５００ｍＬのバッフル付き三角フラスコを使用し、ＹＰＤ培地５０ｍＬ（グルコース濃度５％）にＹＰＤ培地で２４時間前培養した培養液を０．５ｍＬ接種し、２８℃、２５０ｒｐｍで旋回攪拌しながら培養した。５日後にサンプルを採取し、菌体中に蓄積されたスクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の分析を行った。
《比較例２》
　本比較例では、短縮型ＡＤＫ４６５３遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子のクローニングを行った。テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子は、変異を導入前の野生型遺伝子を用いて、実施例４（３）と同様の方法でベクターを構築した。
《比較例３》
　本比較例では、比較例２で得られたベクターを用いて、酵母の形質転換体を取得した。その形質転換体を用いて、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）の生産を確認した。（１）酵母の形質転換及び（２）酵母形質転換体によるスクアレン、アンブレイン、単環性化合物又は二環性化合物の生産については、実施例５と同様の方法で行った。
（生産物の分析）
　前記実施例５及び比較例３で得られた菌体を破砕後にヘキサン抽出して試料を調製した。培養液３ｍＬを遠心して上清を除いた後、菌体にジルコニアビーズ（ＹＴＺボール、φ０．５ｍｍ、ニッカトー社）を１．５ｍＬ容量添加し、ビーズクラッシャー（タイテック社、ｕＴ－１２）による粉砕（３２００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を１分間５回繰り返した。破砕液にヘキサン１．５ｍＬを加え、上記ビーズクラッシャーにより１分間の攪拌（１８００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を３回繰り返しながら抽出し、遠心分離（１６０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）後に、有機層を回収した。抽出物を窒素ガス気流下で乾固し、４００ｕＬのヘキサンに再溶解しＧＣ分析に供した。ＧＣ分析は、ガスクロマトグラフＧＣ－２０１４（島津製作所社）により、ＨＰ５キャピラリーカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｕｍ、アジレント・テクノロジー社）、検出器はＦＩＤを使用した。分析条件は、ＳＰＬ温度３００℃、ＦＩＤ温度３２０℃、スプリット比３０．０、全流量２５．０ｍＬ／ｍｉｎ、線速度１９．３ｃｍ／ｓｅｃ、カラム温度２２０－３００℃（昇温速度１℃／ｍｉｎ）、３００℃１０ｍｉｎ保持に設定した。
　ガスクロマトグラフによる分析結果を図７に示した。実施例４及び５の変異型ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主から、スクアレン、アンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）および二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）を検出した（図７）。
　変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しており、代謝の律速段階として、本来厳密に制御されているメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しないアンブレイン、単環性化合物（3-deoxyachilleol A）又は二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できた。つまり、変異型ＨＭＧＲ遺伝子および変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主を分子育種することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になることを示している。
　一方、比較例２及び３の変異型ＨＭＧＲ遺伝子および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を同時に発現させた宿主では、スクアレンおよび二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）を検出した。変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を発現させた清酒酵母のスクアレンの生産量は、顕著な増加を示しておりメバロン酸経路の増強効果が確認できた。また野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現により、本来清酒酵母が生産しない二環性化合物（8a-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene）が生産されることが確認できたが、アンブレイン、又は単環性化合物（3-deoxyachilleol A）は検出されず、生産されていないことを確認した。つまり野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を発現しても、酵母ではアンブレインは生産されないことを示している。
　またメバロン酸経路の酵素の１つであるＨＭＧＲ（ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ）として、特定のアミノ酸配列を有する変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）を酵母で発現させることによって、メバロン酸経路の下流の化合物、特にはスクアレンの生産量が飛躍的に増加することが知られている。よって変異型ＨＭＧＲ遺伝子（短縮型）および野生型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子の同時発現することにより、酵母でのアンブレインの生産が可能になる。
《実施例６》
　本実施例では、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）由来の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を作成し、アンブレインを製造した。なお、バチルス・サブチリスと、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸の同一性は５０％である。
　バチルス・サブチリス由来のテトラプレニル－β－クルクメン環化酵素のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ６１８２０６）をもとに変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を合成した。遺伝子は、ＤＸＤＤモチーフの４番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がシステインに置換されるように設計し、大腸菌での発現に最適化して合成し、pCold-TFベクターのNdeI-XhoI部位に挿入した。得られた変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。
　その後、実施例２と同様に、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を含む無細胞抽出液を得た。
　続いて、スクアレン（５０μｇ）をＴｗｅｅｎ－８０（１ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ｂ［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ－８０、０．１ｗ／ｖ％のアスコルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有］（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約１０００であった。
　インキュベート後に、１５質量％水酸化カリウム含有メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ－ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
　得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０、容量比）に供し、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１００：２０画分を得た。得られた画分を濃縮し、ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）による分析を行い、アンブレインが生成していることを確認した。
　本発明によれば、アンブレインの生産において、変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を用いることにより、スクアレンを基質として用いて１ステップでアンブレインを製造することができる。本発明によって得られる、アンブレインは、例えば医薬品などの生産の原料として用いることができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims (11)

  1. 　ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素であって、
    （ａ）前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０～５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０～１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０～１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有し、そしてＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さず、
    （ｂ）配列番号１又は１３で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして
    （ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
    変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
  2. 　前記変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
    （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
    （２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
    （３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
    （４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
    （５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
    （６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列、又は配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
    である、請求項１に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
  3. 　前記配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸、又は前記配列番号１３で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７８番目のアスパラギン酸が、システイン又はグリシンに置換している、請求項１又は２に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド。
  5. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを有する微生物。
  6. 　ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを更に有する請求項５に記載の微生物。
  7. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター。
  8. 　請求項７に記載のベクターを有する形質転換体。
  9. 　ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターを更に有する請求項８に記載の形質転換体。
  10. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法。
  11. 　請求項５又は６に記載の微生物、又は請求項８又は９に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111094571A (zh) * 2017-09-01 2020-05-01 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
WO2021193806A1 (ja) * 2020-03-25 2021-09-30 国立大学法人新潟大学 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113970598B (zh) * 2020-07-22 2023-01-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种联合型代谢标志物及应用和试剂盒与评分方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JPS63233798A (ja) 1986-10-09 1988-09-29 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ５′−グアニル酸の製造法
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
US5160735A (en) 1989-06-19 1992-11-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Plasminogen activator
JPH10236996A (ja) 1997-02-21 1998-09-08 Kuraray Co Ltd 光学活性なアンブレインの製造方法および該製造方法に有用な中間体化合物並びに該中間体化合物の製造方法
WO2015033746A1 (ja) 2013-09-05 2015-03-12 国立大学法人新潟大学 アンブレインの製造方法
WO2015156369A1 (ja) * 2014-04-09 2015-10-15 株式会社Adeka 変異酵素及び前記変異酵素を用いたテルペノイドの製造方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
US4686191A (en) 1981-12-25 1987-08-11 Hakko Kogyo Co., Ltd. Kyowa Recombinant plasmid containing human interferon-beta gene
US4939094A (en) 1985-08-28 1990-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused antigen polypeptide
JPS63233798A (ja) 1986-10-09 1988-09-29 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ５′−グアニル酸の製造法
US5160735A (en) 1989-06-19 1992-11-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Plasminogen activator
JPH10236996A (ja) 1997-02-21 1998-09-08 Kuraray Co Ltd 光学活性なアンブレインの製造方法および該製造方法に有用な中間体化合物並びに該中間体化合物の製造方法
WO2015033746A1 (ja) 2013-09-05 2015-03-12 国立大学法人新潟大学 アンブレインの製造方法
WO2015156369A1 (ja) * 2014-04-09 2015-10-15 株式会社Adeka 変異酵素及び前記変異酵素を用いたテルペノイドの製造方法

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"GenBank", Database accession no. AB 618206
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 53, 1989, pages 277
AGRICULTURAL BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 48, 1984, pages 669
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 63, 1999, pages 2189 - 2198
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 65, 2001, pages 2233 - 2242
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 66, 2002, pages 1660 - 1670
GENE, vol. 33, 1985, pages 103
J. AM. CHEM. SOC., vol. 133, 2011, pages 17540 - 17543
J. AM. CHEM. SOC., vol. 135, 2013, pages 18335 - 18338
J. BACTERIOL., vol. 172, 1990, pages 2392
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 4306
S ATO, TSUTOMU ET AL.: "Bifunctional Triterpene/ Sesquarterpene Cyclase: Tetraprenyl-p-curcumene Cyclase Is Also Squalene Cyclase in Bacillus megaterium", J. AM. CHEM. SOC., vol. 133, 2011, pages 17540 - 17543, XP055325758, ISSN: 1520-5126 *
SATO, TSUTOMU: "Functional Analysis of the DXDDTA Motif in Squalene-Hopene Cyclase by Site-directed Mutagenesis Experiments: Initiation Site of the Polycyclization Reaction and Stabilization Site of the Carbocation Intermediate of the Initially Cyclized A-Ring", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM, vol. 63, no. 12, 1999, pages 2189 - 2198, XP055325754, ISSN: 1347-6947 *
See also references of EP3441463A4
TETRAHEDRON ASYMMETRY, vol. 17, 2006, pages 3037 - 3045
UEDA DAIJIRO ET AL.: "Cyclization of Squalene from Both Termini: Identification of an Onoceroid Synthase and Enzymatic Synthesis of Ambrein", J. AM. CHEM. SOC., vol. 135, 2013, pages 18335 - 18338, XP055325753, ISSN: 1520-5126 *
ZHUANG, XUN ET AL.: "Building Terpene Production Platforms in Yeast", BIOTECHNOL . BIOENG., vol. 112, no. 9, 2015, pages 1854 - 1864, XP055541275, ISSN: 1097-0290 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111094571A (zh) * 2017-09-01 2020-05-01 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
CN111094571B (zh) * 2017-09-01 2023-10-27 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
WO2021193806A1 (ja) * 2020-03-25 2021-09-30 国立大学法人新潟大学 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法

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