WO2017115675A1 - グルコサミン残基の３－ｏ－硫酸化率が高いヘパラン硫酸 - Google Patents

グルコサミン残基の３－ｏ－硫酸化率が高いヘパラン硫酸 Download PDF

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WO2017115675A1
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polysaccharide
molecular weight
ratio
heparosan
glcn
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PCT/JP2016/087689
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Inventor
森　健一
友梨子 土倉
山崎　俊介
朋子 清水
康博 三原
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味の素株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a novel sulfated polysaccharide having anticoagulant activity.
  • Sulfated polysaccharides having anticoagulant activity are useful, for example, in the medical field.
  • heparin various heparan sulfates such as heparin are known as sulfated polysaccharides having anticoagulant activity. That is, heparin is an anticoagulant and is used for the treatment of thromboembolism and disseminated intravascular coagulation (DIC), prevention of blood coagulation in artificial dialysis and extracorporeal circulation, etc. .
  • Heparin exhibits anticoagulant action through activation of antithrombin III, an anticoagulant factor.
  • Antithrombin III inhibits thrombin, factor Xa (an active form of factor X), and other serine proteases by binding to their active serine sites.
  • Thrombin is a blood coagulation factor
  • factor Xa is a factor involved in thrombin maturation. Heparin binds to this antithrombin III and changes its structure to activate the inhibitory action.
  • Thrombin has a higher affinity for the heparin-antithrombin III complex than factor Xa.
  • low molecular weight heparin having an average molecular weight of 4000 to 6000 Da obtained by enzymatic / chemical treatment and fractionation of heparin has few bleeding side effects and has been frequently used in recent years.
  • Low molecular weight heparin has a short sugar chain and can bind to antithrombin III, but hardly binds to thrombin.
  • thrombin needs to bind to heparin, whereas in the inhibition of factor Xa by the heparin-antithrombin III complex, factor Xa becomes heparin. There is no need to join. Therefore, low molecular weight heparin hardly inhibits the action of thrombin, whereas it can inhibit the action of factor Xa.
  • heparosan which is a sugar chain skeleton of heparin
  • heparosan is produced by fermentation using microorganisms such as Escherichia coli K5 strain, and an anticoagulant polysaccharide similar to heparin using chemical or enzymatic methods.
  • lowering the molecular weight using chemical, enzymatic, or physical techniques is a method of linking sugar chains from 1 by chemical synthesis (Patent Document 1).
  • the heparin-like polysaccharide produced by a method mainly using chemical conversion has a high 3-O-sulfation ratio of the glucosamine residue, but a part of the glucuronic acid residue is also 3-O-sulfated.
  • This 3-O-sulfated glucuronic acid residue has a structure that does not exist in animal-derived heparin, and there are concerns about side reactions in vivo.
  • a heparin-like polysaccharide produced by a method mainly using enzyme conversion has the same sulfation pattern as animal-derived heparin, but its anticoagulant activity is about half that of animal-derived products.
  • An object of the present invention is to provide a novel sulfated polysaccharide having anticoagulant activity.
  • the inventors of the present application have included a repeating structure of a disaccharide unit consisting of a hexuronic acid (HexA) residue and an ⁇ -D-glucosamine (GlcN) residue, and the 3-O-sulfation of the GlcN residue.
  • HexA hexuronic acid
  • GlcN ⁇ -D-glucosamine
  • a polysaccharide having anticoagulant activity comprising a repeating structure of disaccharide units represented by the following general formula (I):
  • R 1 to R 5 satisfy the following conditions:
  • R 1 , R 2 , R 4 , and R 5 each independently represent hydrogen or a sulfate group;
  • R 3 represents hydrogen, a sulfate group, or an acetyl group; At least a portion of R 3 is a sulfate group;
  • the ratio of sulfate groups in R 4 is 13% or more; Ratio of sulfate groups in R 5 is 50% or more.
  • the polysaccharide, wherein the ratio of sulfate groups in R 1 is 0% to 80%.
  • Ratio of sulfate groups in R 1 of the iduronic acid residue is a 0% to 100%, the polysaccharide.
  • the polysaccharide, wherein the ratio of sulfate groups in R 1 of the glucuronic acid residue is 0% to 50%.
  • the polysaccharide, wherein the ratio of sulfate groups in R 2 is less than 1%.
  • the polysaccharide, wherein the ratio of sulfate groups in R 3 is 70% to 100%.
  • GlcA-GlcN (NS3S6S), GlcA (2S) -GlcN (NS6S), IdoA (2S) -GlcN (NS6S), GlcA-GlcN (NS6S), IdoA (2S) -GlcN (NS), IdoA1 (NS), S
  • the polysaccharide comprising one or more disaccharide units selected from (NS3S), IdoA-GlcN (NS6S), and GlcA-GlcN (NS), with a total content of 50% or more.
  • the polysaccharide wherein the ratio of Anti-Factor Xa activity / Anti-Factor IIa activity is 1.5 or more.
  • the said polysaccharide whose ratio (Mw / Mn) of the weight average molecular weight (Mw) and number average molecular weight (Mn) measured by gel permeation chromatography using pullulan as a standard is 1.5 or less.
  • the polysaccharide which is a free form, a pharmacologically acceptable salt thereof, or a mixture thereof.
  • the polysaccharide, wherein the salt is selected from an ammonium salt, a sodium salt, a lithium salt, and a calcium salt.
  • a pharmaceutical composition comprising the polysaccharide.
  • the composition is used for prevention, amelioration, and / or treatment of symptoms caused by blood coagulation.
  • the composition as described above, wherein the symptom is disseminated intravascular coagulation syndrome, thromboembolism, blood coagulation in artificial dialysis, or blood coagulation in extracorporeal circulation.
  • a novel sulfated polysaccharide having anticoagulant activity can be provided.
  • the polysaccharide of the present invention is a novel sulfated polysaccharide having anticoagulant activity.
  • the polysaccharide of the present invention may be referred to as “heparan sulfate”.
  • the polysaccharide of the present invention may be composed of a single type of sugar chain or a mixture of a plurality of types of sugar chains.
  • the polysaccharide of the present invention is usually obtained as a mixture of a plurality of types of sugar chains.
  • “A mixture of a plurality of types of sugar chains” refers to a combination of two or more types of sugar chains having different structures (number of sugar linkages, molecular weight, types and positions of substituents, etc.).
  • each parameter for specifying the polysaccharide of the present invention indicates a corresponding parameter in the sugar chain unless otherwise specified.
  • each parameter that specifies the polysaccharide of the present invention indicates an average value of the corresponding parameter in the entire mixture unless otherwise specified. The same applies to other polysaccharides such as intermediates in producing the polysaccharide of the present invention.
  • Each parameter specifying the polysaccharide of the present invention can be determined by a known method used for detection or identification of a compound such as a polysaccharide.
  • a technique for example, disaccharide analysis, molecular weight analysis (for example, gel permeation chromatography (GPC)), ultraviolet-visible absorbance detector (UV) and differential refractive index detector (RI) are used.
  • GPC gel permeation chromatography
  • UV ultraviolet-visible absorbance detector
  • RI differential refractive index detector
  • Disaccharide analysis can be performed by a conventional method.
  • the disaccharide analysis can be performed by, for example, a previously reported (T.Imanari, et.al., “High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminominoglycan-derived oligosaccharides.”, 27. It can be implemented according to conditions. That is, for example, if necessary, N-sulfated polysaccharide is decomposed into unsaturated disaccharide using heparinase, and the amount of each constituent disaccharide can be quantified by separating and quantifying the decomposed product. it can.
  • heparinase examples include heparinase I, heparinase II, and heparinase III.
  • Heparinase can be used alone or in appropriate combination.
  • the heparinase to be used can be appropriately selected according to various conditions such as the type of hexuronic acid (HexA) residue contained in the polysaccharide.
  • Heparinase II and III can be used in combination for disaccharide analysis of polysaccharides containing ⁇ -D-glucuronic acid (GlcA) residues.
  • heparinase I and II can be used in combination for the disaccharide analysis of a polysaccharide containing an ⁇ -L-iduronic acid (IdoA) residue.
  • the amount of each constituent disaccharide can be quantified by decomposing the polysaccharide into nitrous acid and separating and quantifying the decomposed product. Separation and quantification of the decomposed product can be performed by, for example, a known technique used for identification of a compound such as HPLC or LC / MS.
  • Specific examples of the conditions for disaccharide analysis include the conditions described in the Examples. Based on the amount of each constituent disaccharide, the content of the target disaccharide unit can be calculated.
  • the bond between C4 and C5 is usually a double bond in the resulting non-reducing end HexA residue.
  • the HexA residue in which the bond between C4 and C5 is a double bond has no distinction between an IdoA residue and a GlcA residue. Therefore, when it is necessary to distinguish between an IdoA residue and a GlcA residue, IdoA such as nitrite decomposition is used.
  • a disaccharide analysis may be performed by a technique that can distinguish a residue from a GlcA residue.
  • the parameters for specifying other polysaccharides such as intermediates in producing the polysaccharide of the present invention can be determined in the same manner.
  • the average molecular weight (number average molecular weight (Mn) and weight average molecular weight (Mw)) of heparan sulfate can be directly measured using pullulan as a standard unless otherwise specified.
  • the true average molecular weight of heparan sulfate may be indirectly calculated by proportional calculation based on a molecule whose true average molecular weight is known (eg, enoxabalin sodium).
  • the average molecular weight of heparan sulfate may be measured directly or indirectly, but it is preferably measured directly.
  • the polysaccharide of the present invention is specifically a polysaccharide having anticoagulant activity, which contains a repeating structure of disaccharide units represented by the following general formula (I).
  • each of R 1 , R 2 , R 4 , and R 5 independently represents hydrogen (—H) or a sulfate group (—SO 3 H).
  • R 3 represents hydrogen (—H), a sulfate group (—SO 3 H), or an acetyl group (—COCH 3 ).
  • R 1 ⁇ R 5 are both selected independently in each repeating unit and each sugar chain.
  • the type of hexuronic acid (HexA) residue is also independently selected for each repeating unit and each sugar chain.
  • the polysaccharide of the present invention may contain the above repeating structure as a main component.
  • “The polysaccharide of the present invention contains the above repeating structure as a main constituent” means that 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% (all) of the polysaccharide of the present invention. It may consist of the above repeating structure.
  • the phrase “the polysaccharide of the present invention contains the above-mentioned repeating structure as a main constituent” substantially means that 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the polysaccharide of the present invention ( All) may be composed of the above disaccharide units (the disaccharide units represented by the general formula (I)).
  • the ratio of the portion consisting of the disaccharide unit is also referred to as “the content rate of the disaccharide unit”. That is, the content rate of the said disaccharide unit in the polysaccharide of this invention may be 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100%, for example.
  • the content rate of the said disaccharide unit can be measured by disaccharide analysis, for example. That is, the content rate of the disaccharide unit can be calculated, for example, as a ratio (molar ratio) of the total amount of the disaccharide unit to the total amount of the disaccharide when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis.
  • the average number of repeating disaccharide units, the average number of sugar linkages, the number average molecular weight (Mn), and the weight average molecular weight (Mw) can all be set as appropriate.
  • the average repeating number of the disaccharide unit may be, for example, 3 or more, 4 or more, 5 or more, or 6 or more, and is 50 or less, 30 or less, 20 or less, 15 or less, 12 or less, or 9 or less. It may be a combination thereof.
  • the average number of repetitions of the disaccharide unit may be, for example, 3 to 15, or 6 to 9.
  • the average number of sugar linkages may be, for example, 6 or more, 8 or more, 10 or more, or 12 or more, and is 100 or less, 60 or less, 40 or less, 30 or less, 24 or less, or 18 or less. It may be present or a combination thereof. Specifically, the average number of sugar linkages may be, for example, 6 to 60, 6 to 30, or 12 to 18 residues.
  • the average number of repetitions and the average number of sugar linkages can be determined, for example, by a technique used for detection or identification of the compounds as exemplified above. Specifically, the average number of repetitions and the average number of sugar linkages can be determined based on, for example, molecular weight. The molecular weight can be measured by a conventional method.
  • the molecular weight is measured by gel permeation chromatography (Gel Permeation Chromatography; GPC), and water-based size exclusion chromatography (SEC) (SEC) using an ultraviolet-visible absorbance detector (UV) and a differential refractive index detector (RI) (SEC). -RI / UV method, European Pharmacopoeia (EP) compliant).
  • GPC Gel Permeation Chromatography
  • SEC water-based size exclusion chromatography
  • UV ultraviolet-visible absorbance detector
  • RI differential refractive index detector
  • EP European Pharmacopoeia
  • the number average molecular weight (Mn) may be, for example, 7000 or more, 8000 or more, 10,000 or more, 12000 or more, 15000 or more, or 18000 or more as a value measured by GPC using pullulan as a standard, 150,000 or less, 100,000 Hereinafter, it may be 60000 or less, 50000 or less, 43000 or less, or 40000 or less, or a combination thereof.
  • the number average molecular weight (Mn) is a value measured by GPC using pullulan as a standard. Specifically, the number average molecular weight (Mn) may be, for example, 8000 to 60000, or 12000 to 40000, or 18000 to 43000. Good.
  • the weight average molecular weight (Mw) may be, for example, 9000 or more, 10000 or more, 12000 or more, 15000 or more, 21000 or more, or 25000 or more as a value measured by GPC using pullulan as a standard. Hereinafter, it may be 100,000 or less, 80,000 or less, 60000 or less, or 50000 or less, or a combination thereof.
  • the weight average molecular weight (Mw) is a value measured by GPC using pullulan as a standard. Specifically, the weight average molecular weight (Mw) may be, for example, 10,000 to 100,000, or 15,000 to 50,000, or 25,000 to 60,000. Good.
  • the ratio (Mw / Mn) between the weight average molecular weight (Mw) and the number average molecular weight (Mn) is a value measured by GPC using pullulan as a standard. 9.9 or less, 1.8 or less, 1.7 or less, 1.6 or less, 1.55 or less, 1.5 or less, 1.45 or less, 1.4 or less, 1.35 or less, 1.3 or less, 1 .25 or less, or 1.2 or less, or a combination thereof.
  • the ratio of the weight average molecular weight to the number average molecular weight (Mw / Mn) is a value measured by GPC using pullulan as a standard, specifically, for example, 1 to 1.6, 1 to 1.5, or 1 to 1.4 may be sufficient.
  • the disaccharide unit is composed of a hexuronic acid (HexA) residue (in the formula, the left sugar residue) and an ⁇ -D-glucosamine (GlcN) residue (in the formula, the right sugar residue).
  • HexA hexuronic acid
  • GlcN ⁇ -D-glucosamine
  • the HexA residue side (left side) is also referred to as “non-reducing end side”
  • the GlcN residue side (right side) is also referred to as “reducing end side”.
  • the hexuronic acid residue is a ⁇ -D-glucuronic acid (GlcA) residue or an ⁇ -L-iduronic acid (IdoA) residue.
  • hexuronic acid (HexA) is used as a general term for ⁇ -D-glucuronic acid (GlcA) and ⁇ -L-iduronic acid (IdoA).
  • ⁇ -D-glucosamine (GlcN) encompasses all possible derivatives depending on the choice of R 3 , R 4 , and R 5 unless otherwise specified.
  • the polysaccharide of the present invention may have the above repeating structure so that the disaccharide unit is present in part or all of the non-reducing end.
  • 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the disaccharide units at the non-reducing terminal of the polysaccharide of the present invention may be the above disaccharide units. That is, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the sugar residues at the non-reducing terminal of the polysaccharide of the present invention may be HexA residues.
  • the polysaccharide of the present invention may have the above repeating structure so that the disaccharide unit is present at a part or all of the reducing end.
  • 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the disaccharide unit at the reducing end of the polysaccharide of the present invention may be the disaccharide unit. That is, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the reducing end of the polysaccharide of the present invention may be a GlcN residue.
  • the said disaccharide unit exists in the terminal of sugar chain, you may read appropriately the terminal glycosidic bond as a suitable structure as a terminal.
  • the glycosidic bond at the C-4 position of the HexA residue at the non-reducing end may be read as, for example, a hydroxyl group (—OH) or as a double bond between C4 and C5.
  • the HexA residue in which the bond between C4 and C5 is a double bond has no distinction between an IdoA residue and a GlcA residue
  • when calculating each parameter specifying a polysaccharide such as the polysaccharide of the present invention Unless otherwise specified, it corresponds to a HexA residue, but is treated as not corresponding to either an IdoA residue or a GlcA residue.
  • the glycosidic bond at the C-1 position of the GlcN residue at the reducing end may be read as, for example, a hydroxyl group (—OH).
  • the polysaccharide of the present invention may contain a structure represented by the following general formula (II).
  • a part or all of the polysaccharide of the present invention may have a structure represented by the following general formula (II).
  • a structure represented by the following general formula (II) For example, 50% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of the number of sugar chains constituting the polysaccharide of the present invention May have a structure represented by the following general formula (II).
  • all of R 1 to R 5 are as described above.
  • n represents the number of repeating disaccharide units in the formula.
  • N means that the polysaccharide of the present invention can achieve the average number of repeating disaccharide units, the average number of sugar linkages, the number average molecular weight (Mn), the weight average molecular weight (Mw), or a combination thereof as described above. May be set. “N” can be calculated by further converting the weight average molecular weight in terms of pullulan using the molecular weight of the low molecular weight heparin preparation enoxaparin sodium (Sanofi-Aventis (France)).
  • the value 3.75 obtained by dividing the GPC method measurement value 16215 of enoxaparin sodium by the measurement value 4325 of the EP-compliant SEC-RI / UV method is used as a conversion factor, and the weight molecular weight in terms of pullulan conversion of the polysaccharide of the present invention is calculated. It can be determined by dividing by a conversion factor of 3.75 and a heparin disaccharide average molecular weight of 665.4. In each sugar chain, “n” may be, for example, 3 to 200, 3 to 100, or 3 to 50.
  • n is specifically an average value of the entire mixture of sugar chains, for example, the average number of repeating disaccharide units in the polysaccharide of the present invention exemplified above (for example, 3 to 30, 3 to 15 Or 6-9).
  • the ratio of IdoA residues to HexA residues may be, for example, 0% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more. It may be 100% or less, 90% or less, 80% or less, 70% or less, or 60% or less, or a combination thereof. Specifically, the epimerization rate may be, for example, 0% to 70%, 20% to 70%, or 30% to 60%.
  • the “HexA residue” in calculating the epimerization rate means an IdoA residue and a GlcA residue, and excludes a HexA residue in which the bond between C4-C5 is a double bond.
  • the epimerization rate can be measured, for example, by disaccharide analysis. That is, when the polysaccharide of the present invention was subjected to a disaccharide analysis, the epimerization rate was determined based on the total amount of the above disaccharide units in which the HexA residue was an IdoA residue or a GlcA residue. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of a certain disaccharide unit.
  • the bond between C4 and C5 of the HexA residue may be a double bond.
  • the position of the HexA residue where the bond between C4 and C5 is a double bond is not particularly limited.
  • the bond between C4 and C5 may be a double bond in the non-reducing terminal HexA residue. That is, for example, 50% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more of the HexA residue in which the bond between C4-C5 is a double bond, or 100 % May be present at the non-reducing end. Further, for example, 50% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% of HexA residues in which the bond between C4-C5 is not a double bond May exist other than at the non-reducing end.
  • the bond may be a double bond.
  • the bond may not be a double bond.
  • R 1 represents hydrogen (—H) or a sulfate group (—SO 3 H).
  • the ratio of sulfate groups in R 1 may or may not be the same for the IdoA residue and the GlcA residue.
  • the ratio of sulfate groups in R 1 of all HexA residues also referred to as “2-O-sulfation rate of HexA residues”
  • the ratio of sulfate groups in R 1 of IdoA residues (“2- also called O- sulfation ratio ")
  • 2-O- sulfation ratio of GlcA residue "in R 1 of GlcA residues) respectively, for example, 0% or more, 5% 10% or more, 15% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more, or 100% Or less, 95% or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 70% or less
  • the 2-O-sulfation rate of the HexA residue may be, for example, 0% to 80%, 10% to 70%, or 15% to 70%.
  • the 2-O-sulfation rate of the IdoA residue may be, for example, 0% to 100%, 15% to 100%, or 30% to 100%.
  • the 2-O-sulfation rate of the GlcA residue may be, for example, 0% to 50%, 0% to 40%, or 0% to 30%.
  • the ratio of sulfate groups in R 1 can be measured, for example, by disaccharide analysis.
  • the 2-O-sulfation rate of the HexA residue is the HexA residue in which the HexA residue is 2-O-sulfated with respect to the total amount of the above disaccharide units when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of the disaccharide unit as a residue. Further, the 2-O-sulfation rate of the IdoA residue is determined by the ratio of the HexA residue to the total amount of the above disaccharide units in which the HexA residue is an IdoA residue when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis.
  • the 2-O-sulfation rate of the GlcA residue is determined by the ratio of the HexA residue to the total amount of the above disaccharide units in which the HexA residue is a GlcA residue when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of the disaccharide unit which is a 2-O-sulfated GlcA residue.
  • R 2 represents hydrogen (—H) or a sulfate group (—SO 3 H).
  • the ratio of sulfate groups in R 2 may or may not be the same for the IdoA residue and the GlcA residue.
  • Sulfate group R 2 is not present in the native heparin. Thus, for example, in view of concerns about side reactions in vivo, the ratio of sulfate groups in R 2 can be be less is preferable.
  • the ratio of sulfate groups in R 2 of the entire HexA residue (also referred to as “3-O-sulfation rate of HexA residue”), the ratio of sulfate groups in R 2 of IdoA residue (“3- The ratio of sulfate groups in R 2 of the GlcA residue (also referred to as “3-O-sulfation rate of the GlcA residue”) is, for example, less than 15% and 10%, respectively. Less than, less than 5%, less than 3%, less than 1%, less than 0.5%, less than 0.1%, or zero.
  • the ratio of sulfate groups in R 2 can be measured, for example, by disaccharide analysis.
  • the 3-O-sulfation rate of the HexA residue is the HexA residue in which the HexA residue is 3-O-sulfated with respect to the total amount of the above disaccharide units when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of the disaccharide unit as a residue. Further, the 3-O-sulfation rate of the IdoA residue is determined by the ratio of the HexA residue to the total amount of the above disaccharide units in which the HexA residue is an IdoA residue when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis.
  • the 3-O-sulfation rate of the GlcA residue is determined by the ratio of the HexA residue to the total amount of the above disaccharide units in which the HexA residue is a GlcA residue when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of the disaccharide unit which is a 3-O-sulfated GlcA residue.
  • R 3 represents hydrogen (—H), a sulfate group (—SO 3 H), or an acetyl group (—COCH 3 ). At least a part of R 3 is a sulfate group.
  • the ratio of sulfate groups in R 3 (also referred to as “N-sulfation rate”) may be, for example, 60% or more, 70% or more, or 80% or more, 100% or less, 95% or less, or 90% % Or less, or a combination thereof. Specifically, the N-sulfation rate may be, for example, 70% to 100%, or 80% to 95%.
  • the ratio of the acetyl group in R 3 (also referred to as "N- acetylation ratio”) is, for example, 0% or more, more than 1%, 1.5% or more, 3% or more, more than 5%, 7% or more, 9% Or may be 11% or more, and may be 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 33% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, or 17% or less. It may be a combination thereof. Specifically, the N-acetylation rate may be, for example, 0% to 33%, 1% to 33%, 7% to 33%, 7% to 30%, or 11% to 17%.
  • the N-sulfation rate and N-acetylation rate can be measured, for example, by disaccharide analysis. That is, the N-sulfation rate is the above-mentioned disaccharide unit in which the GlcN residue is a Nlc-sulfated GlcN residue with respect to the total amount of the disaccharide unit when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio).
  • the N-acetylation rate is the above-mentioned disaccharide in which the GlcN residue is a GlcN residue having an N-acetylation rate relative to the total amount of the disaccharide unit when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of unit quantities.
  • the position of the GlcN residue in which R 3 is hydrogen, sulfate group, or acetyl group is not particularly limited.
  • R 3 may be hydrogen or an acetyl group.
  • R 4 represents hydrogen (—H) or a sulfate group (—SO 3 H).
  • Also referred to as "GlcN 3-O-sulfation ratio of residue" or simply “3-O-sulfation ratio” ratio of sulfate groups in R 4 is more than 13%.
  • the 3-O-sulfation rate of the GlcN residue may be, for example, 45% or less, 40% or less, or 33% or less. Specifically, the 3-O-sulfation rate of the GlcN residue may be, for example, 13% to 45%, 13% to 40%, or 13% to 33%.
  • the 3-O-sulfation rate of the GlcN residue can be measured, for example, by disaccharide analysis.
  • the 3-O-sulfation rate of the GlcN residue is determined based on the GlcN in which the GlcN residue is 3-O-sulfated with respect to the total amount of the disaccharide unit when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the amount of the disaccharide unit as a residue.
  • R 5 represents hydrogen (—H) or a sulfate group (—SO 3 H). At least a portion of R 5 is sulfuric acid group.
  • the ratio of sulfate groups in R 5 (also referred to as “6-O-sulfation rate of GlcN residue” or simply “6-O-sulfation rate”) is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more. 80% or more, or 90% or more, 100% or less, or 95% or less, or a combination thereof.
  • the 6-O-sulfation rate may be, for example, 50 to 100%, 60 to 100%, or 70 to 100%.
  • the 6-O-sulfation rate can be measured, for example, by disaccharide analysis.
  • the 6-O-sulfation rate is a GlcN residue in which the GlcN residue is 6-O-sulfated with respect to the total amount of the disaccharide unit when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis. It can be calculated as a ratio (molar ratio) of the above disaccharide units.
  • polysaccharide of the present invention examples include GlcA-GlcN (NS3S6S), GlcA (2S) -GlcN (NS6S), IdoA (2S) -GlcN (NS6S), GlcA-GlcN (NS6S), IdoA (2S). ) -GlcN (NS), IdoA (2S) -GlcN (NS3S), IdoA-GlcN (NS6S), and GlcA-GlcN (NS), including, for example, all disaccharide units May be.
  • GlcA-GlcN (NS3S6S), GlcA (2S) -GlcN (NS6S), IdoA (2S) -GlcN (NS6S), GlcA-GlcN (NS6S), IdoA (2S) -GlcN (NS), GlcA (2S) -GlcN (NS)
  • the total content of (2S) -GlcN (NS3S), IdoA-GlcN (NS6S), and GlcA-GlcN (NS) is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% It may be above.
  • the total content can be measured, for example, by disaccharide analysis.
  • the total content is, for example, GlcA-GlcN (NS3S6S), GlcA (2S) -GlcN (NS6S), IdoA (2S) relative to the total amount of disaccharide when the polysaccharide of the present invention is subjected to disaccharide analysis.
  • the position and type of the substituent are indicated in parentheses, and R 1 to R 5 not indicated in parentheses indicate hydrogen (—H).
  • the polysaccharide of the present invention has anticoagulant activity.
  • the anticoagulant activity specifically means anticoagulant activity.
  • Anti-coagulant activity includes Anti-Factor Xa activity and Anti-Factor IIa activity.
  • the polysaccharide of the present invention may have, for example, at least Anti-Factor Xa activity.
  • the Anti-Factor Xa activity in the polysaccharide of the present invention may be, for example, 100 IU / mg or more, 200 IU / mg or more, 300 IU / mg or more, or 400 IU / mg or more.
  • the anti-factor Xa activity in the polysaccharide of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, 5000 IU / mg or less, 2000 IU / mg or less, or 1000 IU / mg or less.
  • the polysaccharide of the present invention may have a high Anti-Factor Xa activity / Anti-Factor IIa activity ratio.
  • the ratio of Anti-Factor Xa activity / Anti-Factor IIa activity in the polysaccharide of the present invention may be, for example, 1.5 or more, 2 or more, 2.5 or more, or 3 or more.
  • the anti-factor Xa activity / anti-factor IIa activity ratio in the polysaccharide of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 50 or less, 20 or less, or 10 or less.
  • Both Anti-Factor Xa activity and Anti-Factor IIa activity can be measured by conventional methods. Specific examples of methods for measuring Anti-Factor Xa activity and Anti-Factor IIa activity include the methods described in the Examples.
  • the polysaccharide of the present invention may be a free form, a salt, or a mixture thereof. That is, the term “polysaccharide of the present invention (eg, heparan sulfate)” means a free polysaccharide, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified. That is, any functional group capable of forming a salt present in the polysaccharide of the present invention may be a free form, a salt, or a combination thereof, unless otherwise specified. . Specifically, for example, any functional group capable of forming a salt in general formula (I) and general formula (II) may be a free form or a salt unless otherwise specified. It may be a combination thereof.
  • any functional group capable of forming a salt in general formula (I) and general formula (II) may be a free form or a salt unless otherwise specified. It may be a combination thereof.
  • sulfate groups of R 1 ⁇ R 5 (-SO 3 H), R 3 is hydrogen (-H) GlcN
  • examples thereof include an amino group (—NH 2 ) of a residue and a carboxyl group (—COOH) of a HexA residue. That is, for example, the term “sulfate group” indicates a free-form sulfate group, a sulfate-formed sulfate group, or a combination thereof, unless otherwise specified.
  • the description of the sulfate group can be applied to other functional groups capable of forming a salt.
  • the salt include a pharmacologically acceptable salt.
  • the pharmacologically acceptable salt can be appropriately selected according to various conditions such as the utilization mode of the polysaccharide of the present invention.
  • the pharmacologically acceptable salt include the following. That is, for example, as a salt for an acidic group such as a sulfate group, specifically, an ammonium salt, a salt with an alkali metal such as sodium, potassium or lithium, a salt with an alkaline earth metal such as calcium or magnesium, aluminum And salts with organic amines such as salts, zinc salts, triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine, and salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • a salt for a basic group such as an amino group
  • a salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid
  • organic carboxylic acids such as maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hybenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, malic acid
  • organic sulfonic acid such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid.
  • the salt may be selected from, for example, ammonium salt, sodium salt, lithium salt, calcium salt.
  • 1 type of salt may be used and 2
  • the method for producing the polysaccharide of the present invention is not particularly limited.
  • the polysaccharide of the present invention can be produced, for example, by induction from another polysaccharide (that is, using another polysaccharide as a raw material).
  • Other polysaccharides include glycosaminoglycan (GAG).
  • GAG glycosaminoglycan
  • Examples of GAG include N-acetylheparosan (also simply referred to as “heparosan”) and heparan sulfate other than the polysaccharide of the present invention.
  • Heparosan is a disaccharide repeating structure consisting of a glucuronic acid (GlcA) residue and an N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) residue [ ⁇ 4) - ⁇ -GlcA- (1 ⁇ 4) - ⁇ -GlcNAc- (
  • the polysaccharide of the present invention using other polysaccharides as a raw material can be produced, for example, by a physical method, a chemical method, an enzymatic method, or a combination thereof.
  • a polysaccharide can be produced, and the polysaccharide of the present invention can be totally synthesized from raw materials such as a monosaccharide.
  • the polysaccharide of the present invention can be produced by, for example, partially N-deacetylating heparosan and then depolymerizing it with heparinase III, and converting the resulting low molecular weight product into the polysaccharide of the present invention. That is, the method for producing the polysaccharide of the present invention includes (A) a step of partially N-deacetylating heparosan, (B) a step of reducing the molecular weight of the product of step A with heparinase III, and ( C) The process of producing
  • Step A is also referred to as “N-deacetylation step”, step B as “low molecular weight reduction step”, and step C as “heparan sulfate production step”. According to this method, in particular, the polysaccharide of the present invention having a desired average molecular weight can be produced efficiently.
  • Heparosan can be produced, for example, by fermentation using a bacterium having the ability to produce heparosan (also referred to as “heparosan producing bacteria”) (WO2015 / 050184).
  • the term “bacteria having heparosan-producing ability (heparosan-producing bacteria)” refers to bacteria having an ability to accumulate heparosan in a medium so that heparosan can be produced and recovered when cultured in the medium.
  • the bacterium having heparosan-producing ability may be, for example, a bacterium that can accumulate heparosan in an amount of 50 mg / L or more, 100 mg / L or more, 200 mg / L or more, or 300 mg / L or more in the medium.
  • Bacterium type is not particularly limited.
  • Examples of the bacterium include bacteria belonging to the genus Escherichia.
  • Examples of the genus Escherichia include, but are not particularly limited to, bacteria classified into the genus Escherichia by classification known to experts in microbiology.
  • Examples of Escherichia bacteria include, for example, the book by Neidhardt et al. (Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some derivatives of Escherichia coli. (Ed.), Listed in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology / Second Edition, American Society for Microbiology, Washington, DC).
  • Examples of Escherichia bacteria include Escherichia coli.
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli K-12 strain such as W3110 strain (ATCC 27325) and MG1655 strain (ATCC 47076); Escherichia coli K5 strain (ATCC 23506); BL21 (DE3) strain, etc. Coli B strains; and their derivatives.
  • strains can be distributed, for example, from the American Type Culture Collection (address 12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive distribution using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • the BL21 (DE3) strain is available, for example, from Life Technologies (product number C6000-03).
  • the bacterium having heparosan-producing ability may be inherently heparosan-producing ability or may be modified to have heparosan-producing ability.
  • Escherichia coli K5 strain ATCC 23506
  • Bacteria having heparosan-producing ability can be obtained, for example, by imparting heparosan-producing ability to the bacteria as described above.
  • a bacterium that originally has heparosan-producing ability may be modified and used so that heparosan-producing ability is increased.
  • Heparosan production ability can be imparted by introducing a gene encoding a protein involved in heparosan production.
  • proteins involved in heparosan production include glycosyltransferases and heparosan excretion carrier proteins.
  • one kind of gene may be introduced, or two or more kinds of genes may be introduced.
  • the gene can be introduced in the same manner as the method for increasing the number of gene copies described below.
  • glycosyltransferase as used herein has the activity of catalyzing the reaction of extending a heparosan chain by adding N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) and / or glucuronic acid (GlcA) to the non-reducing end of the sugar chain. It refers to protein. This activity is also referred to as “glycosyltransferase activity”. Examples of the gene encoding glycosyltransferase include kfiA gene, kfiC gene, and pmHS1 gene.
  • Examples of the kfiA gene and the kfiC gene include the kfiA gene and the kfiC gene of Escherichia coli K5 strain.
  • the KfiA protein encoded by the kfiA gene of Escherichia coli K5 strain adds GlcNAc to the sugar chain non-reducing end using UDP-GlcNAc as a substrate.
  • the KfiC protein encoded by the kfiC gene of Escherichia coli K5 strain adds GlcA to the sugar chain non-reducing end using UDP-GlcA as a substrate.
  • the kfiA and kfiC genes of the Escherichia coli K5 strain together with the kfiB and kfiD genes constitute the kfiABCD operon (also referred to as Region 2).
  • the base sequence of the region containing the kfiABCD operon of Escherichia coli K5 strain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the kfiA, kfiB, kfiC, and kfiD genes correspond to the sequence at positions 445 to 1164, the sequence at positions 1593 to 3284, the sequence at positions 4576 to 6138, and the sequence at positions 6180 to 7358, respectively.
  • the amino acid sequences of the KfiA, KfiB, KfiC, and KfiD proteins of Escherichia coli K5 strain are shown in SEQ ID NOs: 2 to 5, respectively.
  • PmHS1 gene includes pmHS1 gene of Pasteurella multocida type D strain.
  • the PmHS1 protein encoded by the pmHS1 gene of Pasteurella multocida type D strain adds GlcNAc and GlcA alternately to the non-reducing end of the sugar chain using both UDP-GlcNAc and UDP-GlcA as substrates.
  • heparosan excretion carrier protein refers to a protein having an activity to excrete heparosan chains out of the cell membrane. This activity is also referred to as “heparosan excretion activity”.
  • Genes encoding heparosan efflux carrier proteins include the kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS, and kpsT genes.
  • Examples of the kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS, and kpsT genes include the kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS, and kpsT genes of the Escherichia coli K5 strain and the Escherichia coli B strain.
  • the kpsC, kpsD, kpsE, and kpsS genes of these strains together with the kpsF and kpsU genes constitute the kpsFEDUCS operon (also referred to as Region 1).
  • the kpsM and kpsT genes of these strains constitute the kpsMT operon (also referred to as Region 3).
  • the gene to be introduced can be appropriately selected according to the type of bacteria used. That is, the ability to produce heparosan can be imparted to a bacterium by modifying the bacterium to have both a gene encoding a glycosyltransferase and a gene encoding a heparosan efflux carrier protein.
  • Escherichia coli B strain has a gene encoding a heparosan efflux carrier protein but does not have a gene encoding a glycosyltransferase. Therefore, the ability to produce heparosan can be imparted to the Escherichia coli B strain by introducing a gene encoding a glycosyltransferase.
  • Escherichia coli K-12 strain does not have both a gene encoding a glycosyltransferase and a gene encoding a heparosan efflux carrier protein. Therefore, by introducing both a gene encoding a glycosyltransferase and a gene encoding a heparosan efflux carrier protein, the ability to produce heparosan can be imparted to Escherichia coli K-12 strain.
  • examples of the Escherichia bacterium having heparosan-producing ability include, for example, Escherichia coli K5 strain; Escherichia coli B strain such as BL21 (DE3) strain into which kfiA gene and kfiC gene derived from Escherichia coli K5 strain are introduced.
  • Escherichia coli K-12 strain such as the W3110 strain and the MG1655 strain; , KpsS, and kpsT genes introduced strains; and derivatives thereof.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pVK9-kfiABCD described in the Examples as a strain obtained by introducing the kfiA gene and the kfiC gene derived from the Escherichia coli K5 strain into the Escherichia coli B strain (WO2015 / 050184).
  • a bacterium having heparosan-producing ability may be modified so that expression of a gene originally possessed by the bacterium among genes encoding proteins involved in heparosan production is enhanced. That is, for example, Escherichia coli K5 strain may be modified so that expression of one or more genes encoding proteins involved in heparosan production is enhanced. Further, for example, Escherichia coli B strain may be modified so that expression of one or more genes encoding heparosan excretion carrier protein is enhanced.
  • the bacterium having heparosan-producing ability may be modified in other ways as long as the heparosan-producing ability is not impaired.
  • a bacterium having the ability to produce heparosan may be modified to enhance expression of one or more genes selected from the kfiB, kfiD, kpsF, and kpsU genes. That is, for example, when introducing a gene encoding a glycosyltransferase, Region 2 may be introduced together, and when introducing a gene encoding a glycosyltransferase and a gene encoding a heparosan excretion carrier protein, Region 1 ⁇ 3 may be introduced together.
  • Examples of the kfiB gene and the kfiD gene include the kfiB gene and the kfiD gene of Escherichia coli K5 strain.
  • Examples of the kpsF gene and kpsU gene include the kpsF gene and kpsU gene of Escherichia coli K5 strain and Escherichia coli B strain.
  • Bacteria having the ability to produce heparosan are rbsR, rbsK, rbsB, hsrA, glgB, glgX, micF, rcsD, rcsB, ybiX, ybiI, ybiJ, ybiC, ybiB, rfaH, nusG, pcoR, coS, hSr.
  • yhcO aaeB, aaeA, aaeX, g1455, alpA, g1453, yrbA, mlaB, mlaC, mlaD, mlaE, mlaF, yrbG, norW, ybjI, ybjJ, ybjK, rybB, yjthr, thjr, thr psuK, ytfT, yjfF, fbp, yagU, paoA, paoB, gsiC, gsiD, yliE, irp2, irp1, bhsA, ycfS, lepB, rnc, era, dapA gcvR, bcp, hyfA, rpoE, nadB, yfiC, srmB, g1414, g1413,
  • “enhanced gene expression” not only means that the expression level of the target gene is increased in the strain in which the target gene is originally expressed, but also in the strain in which the target gene is not originally expressed.
  • “enhanced gene expression” includes, for example, introducing the gene into a strain that does not retain the target gene and expressing the gene.
  • Gene expression can be enhanced, for example, by increasing the copy number of the gene or increasing transcription or translation of the gene.
  • the gene copy number can be increased, for example, by introducing a vector carrying the gene into the host or introducing the gene onto the host chromosome.
  • the gene to be introduced can be obtained, for example, by cloning from an organism having the gene or chemical synthesis. The acquired gene can be used as it is or after being appropriately modified.
  • Gene transcription and translation can be increased by modifying gene expression regulatory sequences such as promoters and SD sequences.
  • NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
  • NCBI is the base sequence of a gene used for modification of bacteria such as conferring heparosan-producing ability, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene.
  • a public database such as WO2015 / 050184 or published technical report number 2015-501775.
  • the gene used for modification of bacteria encodes a protein in which the original function is maintained
  • it is not limited to the above-exemplified genes and genes having a known base sequence. It may be.
  • Variants include known gene homologues and artificially modified forms. “The original function was maintained” means that, for example, in glycosyltransferases, protein variants have glycosyltransferase activity, and in heparosan excretion carrier proteins, protein variants have heparosan excretion activity It means having.
  • one or several genes at one or several positions in the amino acid sequence of a known protein may be used for modification of bacteria such as imparting heparosan production ability.
  • 1-30, preferably 1-20, more preferably 1-10, even more preferably 1-5, particularly preferably 1-3) amino acids are substituted, deleted, inserted or added It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence.
  • the gene used for modification of bacteria such as imparting heparosan-producing ability is, for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more with respect to the amino acid sequence of a known protein.
  • it may be a gene encoding a protein having an identity of 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the description about such variants can be applied mutatis mutandis to other proteins such as heparinase III and genes encoding the same.
  • Heparosan is accumulated in the medium by culturing heparosan-producing bacteria.
  • the culture conditions for heparosan-producing bacteria are not particularly limited as long as a desired amount of heparosan is obtained.
  • the culture conditions for heparosan-producing bacteria can be appropriately set according to various conditions such as the configuration of the expression system of the gene involved in heparosan production and the type of host.
  • the culture can be carried out aerobically at 30 to 37 ° C. for 16 to 72 hours using a liquid medium containing various organic components and inorganic components such as a carbon source, a nitrogen source, and micronutrients. (WO2015 / 050184).
  • Heparosan may be used in the N-deacetylation step while contained in the culture solution, or may be collected from the culture solution and then used in the N-deacetylation step.
  • the means for recovering heparosan from the culture solution is not particularly limited. Examples of means for recovering heparosan include known techniques used for separation and purification of compounds, such as membrane treatment and precipitation.
  • the culture supernatant can be separated from the culture solution, and then heparosan in the supernatant can be precipitated and recovered by adding an organic solvent miscible with water such as ethanol or methanol (WO2015 / 050184).
  • the amount of the organic solvent to be added may be, for example, 2.5 to 3.5 times the amount of the supernatant.
  • Heparosan may be appropriately subjected to a treatment such as purification, dilution, concentration, drying, and dissolution, and then subjected to an N-deacetylation step. Purification may be performed to the desired degree. These treatments may be performed alone or in appropriate combination.
  • N-deacetylation process is a process in which heparosan is partially N-deacetylated.
  • the N-deacetylation step produces partially N-deacetylated heparosan.
  • the product of the N-deacetylation step (partially N-deacetylated heparosan) is also referred to as “N-deacetylated heparosan”.
  • “Partial N-deacetylation of heparosan” means that heparosan is N-deacetylated so that a part of the N-acetyl group of heparosan remains.
  • the site of the glucosamine residue having an N-acetyl group can be preferentially cleaved in the molecular weight reduction step, and thus has a desired average molecular weight.
  • the polysaccharide of the present invention can be produced efficiently.
  • the degree of N-deacetylation is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention can be produced.
  • the N-deacetylation step can be carried out, for example, so that the residual ratio of N-acetyl groups has the following value.
  • the residual ratio of N-acetyl groups may be, for example, 1% or more, 1.5% or more, 3% or more, 5% or more, 7% or more, 9% or more, or 11% or more. % Or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 33% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, or 17% or less, or a combination thereof.
  • the residual ratio of the N-acetyl group may be, for example, 1% to 33%, 7% to 33%, 7% to 30%, or 11% to 17%.
  • the residual rate of N-acetyl groups of 7% to 30% is generally present in a ratio of one N-acetyl group to 6-28 sugar residues (one disaccharide unit to 3-14 units). Is equivalent to In addition, for example, the remaining ratio of N-acetyl groups of 11% to 17% is generally at a ratio of one N-acetyl group per 12-18 sugar residues (one disaccharide unit per 6-9 units). Equivalent to existing.
  • the degree of N-deacetylation that is, the residual ratio of N-acetyl groups
  • the residual ratio of N-acetyl groups can be measured as the above-mentioned N-acetylation ratio.
  • the remaining N-acetyl group may be appropriately removed after the molecular weight reduction step.
  • N-deacetylation may be further performed at any timing after the molecular weight reduction step, or N-deacetylation and N-sulfation may be further performed.
  • the means for performing the N-deacetylation step is not particularly limited as long as the desired degree of N-deacetylation is obtained.
  • the N-deacetylation step can be performed chemically using, for example, a deacetylating agent.
  • a deacetylating agent include sodium hydroxide and hydrazine.
  • N-deacetylation using sodium hydroxide include, for example, a previously reported (Kuberan B. et al., (2003) “Chemogeneticmatic Synthesis of Classical and Non-Classical Anticoagulant Heparan. 278 (52): 52613-52621. And US2011128820A1) can be referred to. That is, N-deacetylation can be carried out, for example, by dissolving heparosan in an aqueous sodium hydroxide solution and heating. The concentration of each component in the reaction system, the reaction temperature, and the reaction time can be appropriately set so as to obtain a desired degree of N-deacetylation.
  • the heparosan concentration may be, for example, 0.05% (w / v) to 50% (w / v).
  • the sodium hydroxide concentration may be, for example, 1M-5M.
  • the reaction temperature may be, for example, 40-80 ° C.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 30 hours.
  • N-deacetylation using hydrazine The conditions for N-deacetylation using hydrazine are described in, for example, the previously reported ([1] Glycobiology, 10 (2000) 159-171 [2] Carbohydrate Research, 290 (1996) 87-96 [3] Biochem. 217 (1984) 187-197).
  • Specific examples of N-deacetylation conditions using hydrazine include the conditions described in the Examples. That is, N-deacetylation can be performed, for example, by dissolving heparosan in an aqueous hydrazine solution containing sulfuric acid or hydrazine sulfate, replacing the gas phase with an inert gas such as nitrogen, and heating.
  • hydrazine examples include anhydrous hydrazine and hydrazine monohydrate.
  • hydrazine monohydrate may be used as a hydrazine aqueous solution as it is or after being appropriately diluted.
  • the reaction can be stopped by ice cooling. Subsequently, the sugar chain terminal can be reduced with iodine.
  • the concentration of each component in the reaction system, the reaction temperature, and the reaction time can be appropriately set so as to obtain a desired degree of N-deacetylation.
  • the heparosan concentration may be, for example, 0.05% (w / v) to 50% (w / v).
  • the hydrazine concentration may be, for example, 10% (w / v) to 70% (w / v).
  • the concentration of sulfuric acid or hydrazine sulfate may be, for example, 0.01M to 0.1M.
  • the reaction temperature may be, for example, 60-118 ° C.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 20 hours. Specifically, for example, when N-deacetylation is performed under the conditions described in the examples, the reaction time may be, for example, 4 to 5 hours.
  • N-deacetylated heparosan By carrying out N-deacetylation in this manner, N-deacetylated heparosan is produced.
  • N-deacetylated heparosan may be used in the molecular weight reduction step while contained in the reaction solution in the N-deacetylation step, or may be recovered from the reaction solution and used in the molecular weight reduction step.
  • the means for recovering N-deacetylated heparosan from the reaction solution is not particularly limited. Examples of means for recovering N-deacetylated heparosan include known techniques used for separation and purification of compounds, such as membrane treatment and precipitation.
  • N-deacetylated heparosan may be subjected to treatments such as purification, neutralization, desalting, dilution, concentration, drying, dissolution, etc., as appropriate, and then to the molecular weight reduction step. Purification may be performed to the desired degree. These treatments may be performed alone or in appropriate combination.
  • Low molecular weight reduction step is a step of reducing the molecular weight by cleaving N-deacetylated heparosan with heparinase III. N-deacetylated heparosan having a low molecular weight is generated by the low molecular weight process.
  • the product obtained by the molecular weight reduction process (low molecular weight N-deacetylated heparosan) is also referred to as “low molecular weight N-deacetylated heparosan”.
  • the degree of molecular weight reduction is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention can be produced.
  • the average molecular weight of the low molecular weight N-deacetylated heparosan described later is the average molecular weight of the polysaccharide of the present invention described later (for example, 1000 to 150,000 as a value measured by GPC using pullulan as a standard, preferably Can be carried out so as to have a number average molecular weight (Mn) of 8000 to 60,000 and a weight average molecular weight (Mw) of 2,000 to 300,000, preferably 10,000 to 100,000.
  • Mn number average molecular weight
  • Mw weight average molecular weight
  • the degree of molecular weight reduction can be confirmed, for example, by measuring the molecular weight.
  • the molecular weight can be measured by a conventional method.
  • the molecular weight was measured by gel permeation chromatography (Gel Permeation Chromatography; GPC), water-based size exclusion chromatography (SEC) using an ultraviolet-visible absorbance detector (UV) and a differential refractive index detector (RI) (SEC-).
  • GPC Gel Permeation Chromatography
  • SEC water-based size exclusion chromatography
  • UV ultraviolet-visible absorbance detector
  • RI differential refractive index detector
  • EP European Pharmacopoeia
  • Specific examples of conditions for measuring molecular weight by GPC include the conditions described in Examples.
  • the number average molecular weight (Mn) of the low molecular weight N-deacetylated heparosan may be, for example, 1000-150,000, 3000-36000, or 4000-26000 as measured by GPC using pullulan as a standard, or It may be 5000-36000, or 12000-26000.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the low molecular weight N-deacetylated heparosan is, for example, 2000 to 300000, 5000 to 60000, 6000 to 70000, or 9000 to 35000 as a value measured by GPC using pullulan as a standard. Alternatively, it may be 7000-60000, or 17000-35000.
  • the molecular weight can be measured after performing a part or all of the heparan sulfate production step such as the sulfation step described later to confirm the degree of molecular weight reduction.
  • a change in molecular weight according to the performed step can be taken into consideration.
  • the number average molecular weight (Mn) of the product is, for example, 1000 to 150,000 as a value measured by GPC using pullulan as a standard.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the product is, for example, 2000-300000, 5000-150,000, 5000-100000, 8000- It may be 70000, 8000-41000, or 21000-41000.
  • Heparinase III refers to an enzyme (typically EC 4.2.2.8, which cleaves the site of an N-sulfated or N-acetylated glucosamine residue in glycosaminoglycans such as heparosan. ).
  • the heparinase III used in the present invention is not particularly limited as long as it can preferentially cleave the site of the glucosamine residue having an N-acetyl group in N-deacetylated heparosan.
  • “Preferentially cleave the site of the glucosamine residue having an N-acetyl group” means that the site of the glucosamine residue having an N-acetyl group is more than the site of a glucosamine residue having no N-acetyl group. It means cutting with priority. “Preferentially cleave a glucosamine residue site having an N-acetyl group” means a glucosamine residue that cleaves a glucosamine residue site having an N-acetyl group but does not have an N-acetyl group. The site may be substantially uncut. “Cleaving the glucosamine residue site” means that the ⁇ -1,4 glycosidic bond between the glucosamine residue and the downstream (reducing terminal side) glucuronic acid (GlcA) residue is cleaved.
  • heparinase III The origin of heparinase III is not particularly limited, and any origin such as a microorganism, an animal, or a plant may be used. Moreover, as heparinase III, variants, such as a well-known heparinase III homolog or artificially modified substance, may be used. Specific examples of heparinase III include bacterial heparinase III such as Flavobacterium heparinum, Bacteroides thetaiomicron, Bacteroides eggerthii.
  • the nucleotide sequence of the hepC gene encoding the heparinase III of Flavobacterium heparinum ATCC 13125 and the amino acid sequence of heparinase III (HepC) are shown in SEQ ID NOs: 16 and 17, respectively.
  • Heparinase III can be produced by expressing the same gene in a host having a gene encoding heparinase III (heparinase III gene).
  • a host having a heparinase III gene is also referred to as a host having heparinase III.
  • the host having the heparinase III gene may originally have the heparinase III gene, or may be modified so as to have the heparinase III gene. Examples of the host having the heparinase III gene inherently include bacteria from which heparinase III is derived.
  • Examples of the host modified to have the heparinase III gene include a host into which the heparinase III gene has been introduced.
  • the host into which the heparinase III gene is introduced is not particularly limited as long as it can express a functional heparinase III.
  • Hosts include bacteria, actinomycetes, yeasts, fungi, plant cells, insect cells, and animal cells.
  • bacteria include Enterobacteriaceae bacteria and coryneform bacteria.
  • Examples of Enterobacteriaceae include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli.
  • Examples of coryneform bacteria include bacteria belonging to the genus Corynebacterium such as Corynebacterium glutamicum.
  • a host that originally has a heparinase III gene may be used by modifying it so that expression of the heparinase III gene is enhanced.
  • the heparinase III gene can be expressed, and a culture containing heparinase III is obtained.
  • the culture conditions of the host can be appropriately set according to various conditions such as the configuration of the expression system of the heparinase III gene and the type of host.
  • Heparinase III can also be produced by expressing the heparinase III gene in a cell-free protein synthesis system.
  • heparinase III a commercially available product can be used.
  • Heparinase III may be used as it is contained in the culture or the like, or may be used after being recovered from the culture or the like. That is, as heparinase III, purified heparinase III (purified enzyme) may be used, or any fraction containing heparinase III may be used. The recovery of heparinase III can be carried out by a known technique for separating and purifying proteins. Heparinase III may be purified to the desired extent. Heparinase III may be used in a free state, or may be used in the state of an immobilized enzyme immobilized on a solid phase such as a resin.
  • the fraction containing heparinase III is not particularly limited as long as heparinase III is contained so that heparinase III can act on N-deacetylated heparosan.
  • a fraction containing heparinase III a culture of a host having the heparinase III gene, a cell recovered from the same culture (cultured cell), a crushed product of the cell, a lysate of the cell, Extracts of cells (cell-free extract), treated cells such as immobilized cells obtained by immobilizing the same cells with a carrier such as acrylamide or carrageenan, culture supernatants collected from the same culture, partial purification of them Product (crude product). Any of these fractions may be used alone or together with purified heparinase III.
  • the molecular weight reduction step can be performed by allowing heparinase III to act on N-deacetylated heparosan. Specifically, the action of heparinase III on N-deacetylated heparosan can be achieved by allowing heparinase III and N-deacetylated heparosan to coexist in the reaction solution. That is, the molecular weight reduction step can be performed in an appropriate reaction solution.
  • the molecular weight reduction step may be performed by a batch method or a column method.
  • the step of reducing the molecular weight can be carried out by mixing heparinase III and N-deacetylated heparosan in the reaction solution in the reaction vessel.
  • the molecular weight reduction step may be performed by standing or may be performed by stirring or shaking.
  • the step of reducing the molecular weight can be carried out by passing a reaction solution containing N-deacetylated heparosan through a column packed with immobilized bacterial cells or immobilized enzyme.
  • the reaction solution include an aqueous medium (aqueous solvent) such as water and an aqueous buffer solution.
  • the reaction solution may contain components other than N-deacetylated heparosan, if necessary, in addition to N-deacetylated heparosan.
  • components other than N-deacetylated heparosan include metal ions and pH buffering agents.
  • the kind and concentration of components contained in the reaction solution can be appropriately set according to various conditions such as the properties of heparinase III used.
  • reaction solution pH, reaction temperature, reaction time, concentration of various components, etc. are not particularly limited as long as the desired degree of molecular weight reduction can be obtained. That is, the reaction conditions can be appropriately set so as to obtain a desired degree of molecular weight reduction. Specific examples of the reaction conditions include the conditions described in the examples.
  • concentration of N-deacetylated heparosan in the reaction solution may be, for example, 0.05% (w / v) to 50% (w / v).
  • the concentration of heparinase III in the reaction solution is, for example, 6.3 IU / L to 6.3 ⁇ 10 4 IU / L, or 6.3 ⁇ 10 1 IU / L to 6.3 ⁇ 10 3 IU / L. Good.
  • the pH of the reaction solution may be, for example, usually 6.0 to 10.0, preferably 6.5 to 9.0.
  • the reaction temperature may be, for example, usually 15 to 50 ° C., preferably 15 to 45 ° C., more preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction time may be, for example, usually 5 minutes to 20 hours, preferably 10 minutes to 10 hours.
  • the reaction time may be, for example, 5 to 10 hours.
  • the flow rate of the reaction solution may be a rate such that the reaction time is in the range of the reaction time exemplified above.
  • the activity of heparinase III can be measured, for example, based on the enzyme and substrate-dependent production of unsaturated hexuronic acid by carrying out an enzyme reaction at pH 7.0 and 37 ° C. using heparosan as a substrate.
  • the production of unsaturated hexuronic acid can be measured as an increase in A232 nm.
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of unsaturated hexuronic acid per minute is defined as one international unit (IU).
  • heparinase III, N-deacetylated heparosan, and other components may be additionally supplied to the reaction solution alone or in any combination. These components may be supplied once or a plurality of times, or may be supplied continuously.
  • reaction conditions may be uniform from the start to the end of the low molecular weight process, or may change during the process of the low molecular weight process.
  • the reaction conditions change during the process of reducing the molecular weight is not limited to the reaction conditions changing temporally, but includes that the reaction conditions change spatially.
  • reaction conditions change spatially means that, for example, when a low molecular weight reduction step is performed using a column type, the reaction conditions such as reaction temperature and enzyme concentration differ depending on the position on the flow path. Say.
  • low molecular weight N-deacetylated heparosan is generated.
  • the low molecular weight N-deacetylated heparosan may be used in the heparan sulfate production step while being contained in the reaction solution in the low molecular weight production step, or may be recovered from the reaction solution and used in the heparan sulfate production step.
  • the means for recovering the low molecular weight N-deacetylated heparosan from the reaction solution is not particularly limited. Examples of means for recovering low molecular weight N-deacetylated heparosan include known techniques used for separation and purification of compounds, such as membrane treatment and precipitation.
  • the low molecular weight N-deacetylated heparosan may be subjected to a treatment such as purification, dilution, concentration, drying, and dissolution as appropriate, and then to a heparan sulfate production step. Purification may be performed to the desired degree. These treatments may be performed alone or in appropriate combination.
  • Heparan sulfate production step is a step of producing the polysaccharide of the present invention from low molecular weight N-deacetylated heparosan.
  • the heparan sulfate production step includes, for example, converting low molecular weight N-deacetylated heparosan to N-sulfation, C5-epimerization, 2-O-sulfation, 3-O-sulfation of GlcN residues, and 6- One or more, for example all, steps selected from O-sulfating steps may be included.
  • the kind of process included in the heparan sulfate production process is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, the type of process included in the heparan sulfate production process can be appropriately set according to the structure of the polysaccharide of the present invention.
  • the heparan sulfate production step may include, for example, at least N-sulfation, 3-O-sulfation of GlcN residues, and 6-O-sulfation.
  • the execution order of each step included in the heparan sulfate production step is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained.
  • the execution order of each step included in the heparan sulfate production step can be appropriately set according to various conditions such as means for performing each step and substrate specificity of the enzyme used in each step.
  • the steps included in the heparan sulfate generation step may or may not be performed separately. That is, some or all of the steps included in the heparan sulfate production step may be performed simultaneously in part or all of the time period.
  • the heparan sulfate production step may be performed, for example, in the order of the following steps C1 and C3: (C1) N-sulfation; (C3) 3-O-sulfation and 6-O-sulfation of GlcN residues.
  • the heparan sulfate production step may be performed, for example, in the order of the following steps C1, C2, and C3: (C1) N-sulfation; (C2) C5-epimerization and 2-O-sulfation; (C3) 3-O-sulfation and 6-O-sulfation of GlcN residues.
  • Step C2 may be performed in the order of C5-epimerization and 2-O-sulfation, or may be performed in the order of 2-O-sulfation and C5-epimerization. Further, in step C2, C5-epimerization and 2-O-sulfation may be carried out simultaneously in part or all of the periods.
  • Step C3 may be performed, for example, in the order of 3-O-sulfation and 6-O-sulfation of GlcN residues, and in the order of 6-O-sulfation and 3-O-sulfation of GlcN residues. May be implemented.
  • the heparan sulfate production step is performed in the order of N-sulfation, C5-epimerization, 2-O-sulfation, 3-O-sulfation of GlcN residues, and 6-O-sulfation.
  • Each process will be described on the assumption that this is done.
  • the types of steps included in the heparan sulfate production step and the execution order of the steps are different from those, the description can be appropriately read according to the type of the selected step and the set execution order.
  • N-sulfation is a step of sulfating the amino group of low molecular weight N-deacetylated heparosan.
  • N-sulfation can be performed chemically using, for example, a sulfating reagent.
  • the sulfating reagent include sulfur trioxide complexes such as sulfur trioxide pyridine complex (PySO 3 ) and sulfur trioxide trimethylamine complex (TMASO 3 ).
  • the reaction conditions for N-sulfation can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the reaction conditions for N-sulfation include, for example, a previously reported (Kuberan B.
  • N-sulfation reaction conditions include those described in the Examples.
  • the degree of N-sulfation is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, N-sulfation can be performed, for example, so as to obtain the N-sulfation rate exemplified above.
  • N-sulfation can be performed, for example, such that 90% or more, 95% or more, 99% or more, or all of the N-deacetylated glucosamine residues are N-sulfated.
  • the degree of N-sulfation (that is, N-sulfation rate) can be confirmed by, for example, disaccharide analysis.
  • C5 epimerization is a step of isomerizing a glucuronic acid (GlcA) residue in a product obtained by N-sulfation to an iduronic acid (IdoA) residue.
  • C5 epimerization can be carried out enzymatically using, for example, C5-epimerase.
  • C5-epimerase is not particularly limited as long as it can catalyze the isomerization of a glucuronic acid (GlcA) residue to an iduronic acid (IdoA) residue.
  • C5-epimerase having an appropriate substrate specificity may be selected and used.
  • C5-epimerase may be derived from any source such as animals, plants, and microorganisms.
  • C5-epimerase for example, human C5-epimerase can be used.
  • C5-epimerase variants such as known C5-epimerase homologs and artificially modified products may be used.
  • the description of the production method and utilization mode of C5-epimerase the description of the production method and utilization mode of heparinase III can be applied mutatis mutandis.
  • the reaction conditions for C5 epimerization can be appropriately set by those skilled in the art.
  • Reaction conditions for C5 epimerization include, for example, the previously reported (Chen J, et al., “Enzymatic redesigning of bioactive heparan sulfate.” J Biol. Chem. 2005 Dec. 30: 228: 252). Can be referred to. Specific examples of the reaction conditions for C5 epimerization include the conditions described in the examples. The degree of C5 epimerization is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, C5 epimerization can be performed so as to obtain the epimerization rate exemplified above.
  • 2-O-sulfation is a step of sulfating the 2-O position of the IdoA residue in the product obtained by C5 epimerization.
  • 2-O-sulfation can be carried out enzymatically using, for example, 2-O-sulfating enzyme (2-OST).
  • the 2-OST is not particularly limited as long as it can catalyze the sulfation of the 2-O position of the IdoA residue.
  • 2-OST may also be able to catalyze sulfation at the 2-O position of the GlcA residue.
  • 2-OST may also be capable of catalyzing sulfation at the 2-O position of the HexA residue where the bond between C4-C5 is a double bond.
  • 2-OST having an appropriate substrate specificity may be selected and used.
  • 2-OST may be derived from any of animals, plants, microorganisms and the like.
  • 2-OST for example, hamster 2-OST can be used.
  • 2-OST variants such as known 2-OST homologs and artificially modified products may be used.
  • the description of the production method and utilization mode of heparinase III can be applied mutatis mutandis.
  • the reaction conditions for 2-O-sulfation can be appropriately set by those skilled in the art.
  • reaction conditions for 2-O-sulfation for example, the previously reported (Chen J, et al., “Enzymatic redeching of bioactive heparan sulfate.” J Biol. Chem. 2005 Dec. ) Conditions can be referred to. Specific examples of the reaction conditions for 2-O-sulfation include the conditions described in the examples.
  • the degree of 2-O-sulfation is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, 2-O-sulfation can be carried out so as to obtain the 2-O-sulfation rate exemplified above.
  • Isomerization of GlcA residue to IdoA residue by C5-epimerase is a reversible equilibrium reaction. That is, when C5 epimerization is performed using C5-epimerase, a part of the IdoA residue generated by C5 epimerization can be converted back to a GlcA residue.
  • 2-O-sulfated hexuronic acid (HexA) residues are generally not substrates for C5-epimerase.
  • the IdoA residue generated by C5 epimerization can be sequentially 2-O-sulfated, and thus IdoA Residues can be prevented from being converted back to GlcA residues. Therefore, for example, the C5 epimerization rate can be increased by coupling C5 epimerization and 2-O-sulfation.
  • C5 epimerization and 2-O-sulfation may be carried out simultaneously in part or all of the periods.
  • C5 epimerization and 2-O-sulfation can be performed together by allowing the product of N-sulfation, C5-epimerase and 2-OST to coexist in the reaction system.
  • Specific examples of the conditions for the coupling reaction of C5 epimerization and 2-O-sulfation include the conditions described in the Examples.
  • 6-O-sulfation is a step of sulfating the 6-O position of the N-sulfated glucosamine (GlcNS) residue in the product of 2-O-sulfation.
  • 6-O-sulfation can be carried out enzymatically using, for example, 6-O-sulfating enzyme (6-OST).
  • 6-OST is not particularly limited as long as it can catalyze sulfation at the O-6 position of an N-sulfated glucosamine (GlcNS) residue.
  • 6-OST having an appropriate substrate specificity may be selected and used.
  • 6-OST may be derived from any of animals, plants, microorganisms and the like. Examples of 6-OST include 6-OST-1, 6-OST-2, and 6-OST-3. As 6-OST, for example, hamster 6-OST-1 or mouse 6-OST-3 can be used.
  • 6-OST a known 6-OST homolog or a variant such as an artificially modified product may be used.
  • the description of the production method and utilization mode of heparinase III can be applied mutatis mutandis.
  • the reaction conditions for 6-O-sulfation can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the reaction conditions for 6-O-sulfation using 6-OST include, for example, a previously reported (Chen J, et al., “Enzymatic redesigning of biological heparan sulfate.” J Biol Chem. ): 42817-25.) Can be referred to.
  • 6-O-sulfation can also be performed chemically using, for example, a sulfating reagent.
  • a sulfating reagent examples include sulfur trioxide complexes such as sulfur trioxide pyridine complex (PySO 3 ) and sulfur trioxide trimethylamine complex (TMASO 3 ).
  • the reaction conditions for 6-O-sulfation can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the reaction conditions for 6-O-sulfation using a sulfating reagent for example, the conditions described in the previous report (US 8227449 B2 (Jul. 24, 2012)) can be referred to.
  • Specific examples of the reaction conditions for 6-O-sulfation using a sulfating reagent include those described in the Examples.
  • 6-O-sulfation using a sulfating reagent can be carried out in an organic solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF).
  • the reaction temperature of 6-O-sulfation may be, for example, -20 ° C to 5 ° C, preferably -20 ° C to 0 ° C.
  • the amount of the sulfating reagent used for 6-O-sulfation is, for example, 1.5 to 10 molar equivalents, preferably 2 to 5 molar equivalents relative to the amount of hydroxyl groups to be subjected to 6-O-sulfation. It may be.
  • the degree of 6-O-sulfation is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, 6-O-sulfation can be carried out so as to obtain the 6-O-sulfation rate exemplified above.
  • the 3-O-sulfation of the GlcN residue is a step of sulfating the 3-O position of the N-sulfated / 6-O-sulfated glucosamine residue in the product by 6-O-sulfation.
  • the 3-O-sulfation of the GlcN residue can be performed enzymatically using, for example, 3-O-sulfating enzyme (3-OST).
  • 3-OST is not particularly limited as long as it can catalyze the sulfation of the O-3 position of the N-sulfated / 6-O-sulfated glucosamine residue.
  • 3-OST having an appropriate substrate specificity may be selected and used.
  • 3-OST may be derived from any source such as animals, plants, and microorganisms. Examples of 3-OST include 3-OST-1, 3-OST-2, 3-OST-3, 3-OST-4, and 3-OST-5.
  • 3-OST for example, mouse 3-OST-1 can be used.
  • 3-OST a known variant such as 3-OST homolog or artificially modified product may be used.
  • the description of the production method and utilization mode of heparinase III can be applied mutatis mutandis.
  • the reaction conditions for 3-O-sulfation of GlcN residues can be appropriately set by those skilled in the art.
  • As the reaction conditions for 3-O-sulfation of GlcN residues for example, the previously reported (Chen J, et al., “Enzymatic redesigning of biological heparan sulfate.” J Biol Chem. 30:52 Dec. 42817-25.) Can be referred to.
  • Specific examples of the reaction conditions for 3-O-sulfation of GlcN residues include the conditions described in the Examples.
  • the degree of 3-O-sulfation of the GlcN residue is not particularly limited as long as the polysaccharide of the present invention is obtained. That is, the 3-O-sulfation of the GlcN residue can be carried out so as to obtain the 3-O-sulfation rate of the GlcN residue exemplified above.
  • the product of each step may be used for the next step while being contained in the reaction solution of each step, or may be recovered from the reaction solution and used for the next step.
  • the means for recovering each product from the reaction solution is not particularly limited. Examples of means for recovering each product include known techniques used for separation and purification of compounds, such as membrane treatment and precipitation.
  • the product from each step may be subjected to treatment such as purification, dilution, concentration, drying, dissolution, enzyme deactivation, etc., as appropriate, and then to the next step. Purification may be performed to the desired degree. These treatments may be performed alone or in appropriate combination.
  • the polysaccharide of the present invention is produced.
  • the polysaccharide of the present invention can be appropriately recovered from the reaction solution.
  • the polysaccharide of the present invention can be recovered by a known method used for separation and purification of compounds. Examples of such a method include an ion exchange resin method, a membrane treatment method, a precipitation method, and a crystallization method. These methods can be used in appropriate combination.
  • the polysaccharide of the present invention to be recovered may contain components such as components and water used in producing the polysaccharide of the present invention in addition to the polysaccharide of the present invention.
  • the polysaccharide of the present invention may be provided as a mixture containing the polysaccharide of the present invention, for example.
  • the polysaccharide of the present invention may be purified to a desired degree.
  • the polysaccharide of the present invention can be appropriately set according to various conditions such as the utilization mode of the polysaccharide of the present invention.
  • the polysaccharide of the present invention may be provided after being purified to a pharmacologically acceptable level so as to be formulated and used as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • the purity of the polysaccharide of the present invention is, for example, 30% (w / w) or more, 50% (w / w) or more, 70% (w / w) or more, 80% (w / w) or more. , 90% (w / w) or more, or 95% (w / w) or more.
  • the polysaccharide of the present invention can be used by blending it in the composition as an active ingredient. That is, the present invention provides a composition containing the polysaccharide of the present invention.
  • the composition is also referred to as “the composition of the present invention”. Examples of the composition include a pharmaceutical composition.
  • the composition of the present invention may be for prevention, amelioration, and / or treatment of symptoms caused by blood coagulation, for example. That is, the composition of the present invention may be, for example, an agent for preventing, ameliorating, and / or treating symptoms caused by blood coagulation.
  • Symptoms caused by blood coagulation include disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), thromboembolism (venous thrombosis, myocardial infarction, pulmonary embolism, cerebral embolism, limb arterial thromboembolism, during and after surgery Thromboembolism), blood coagulation in artificial dialysis, blood coagulation in extracorporeal circulation.
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • thromboembolism venous thrombosis, myocardial infarction, pulmonary embolism, cerebral embolism, limb arterial thromboembolism, during and after surgery Thromboembolism
  • blood coagulation in artificial dialysis blood coagulation in extracorporeal circulation.
  • composition of the present invention contains the polysaccharide of the present invention.
  • the composition of the present invention may consist only of the polysaccharide of the present invention, or may contain other components.
  • the “other components” are not particularly limited as long as they are pharmacologically acceptable. Examples of the “other components” include components used by blending with pharmaceuticals.
  • composition of the present invention may be formulated in any dosage form.
  • dosage form include solutions, suspensions, powders, tablets, pills, capsules, and injections.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives.
  • binders for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives.
  • disintegrants for example, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents
  • the concentration of the polysaccharide of the present invention in the composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an effective amount according to the use of the composition of the present invention. That is, the concentration of the polysaccharide of the present invention in the composition of the present invention may be a concentration effective for prevention, amelioration, and / or treatment of symptoms caused by blood coagulation, for example.
  • the concentration of the polysaccharide of the present invention in the composition of the present invention is appropriately set according to various conditions such as the anticoagulant activity of the polysaccharide of the present invention, the dosage form of the composition of the present invention, and the mode of use of the composition of the present invention. be able to.
  • the concentration of the polysaccharide of the present invention in the composition of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, 0.01% or more, 0.1% or more, or 1% or more, and 100% or less, 10% or less. Or 1% or less, or a combination thereof.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating, and / or treating a symptom caused by blood coagulation, which comprises administering a composition of the present invention to a subject.
  • a composition of the present invention may be added to blood outside the body.
  • administering the composition of the present invention to a subject is not limited to administration to living organisms such as humans, but includes addition to non-living organisms such as blood. That is, the “target” referred to here may be, for example, a living organism such as a human or a non-living organism such as blood.
  • composition of the present invention can be administered to a subject as it is, or diluted, dissolved, or dispersed with a pharmacologically acceptable solvent such as water, physiological saline, or a buffer solution. Needless to say, such dilution, dissolution, or dispersion is included in the range of the composition of the present invention.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include oral administration, invasive administration such as injection, and transdermal administration.
  • the administration method can be appropriately set according to various conditions such as the use of the composition of the present invention.
  • the dosage of the composition of the present invention can be appropriately set according to various conditions such as the anticoagulant activity of the polysaccharide of the present invention, the concentration of the polysaccharide of the present invention, the administration method, age, sex, and degree of symptoms.
  • Example 1 Preparation of heparosan (1) Heparosan fermentation Heparosan producing bacteria (Escherichia coli BL21 (DE3) / pVK9-kfiABCD strain) described in Example 1 of WO2015 / 050184 and a culture solution containing heparosan under culture conditions Got.
  • Heparosan fermentation Heparosan producing bacteria (Escherichia coli BL21 (DE3) / pVK9-kfiABCD strain) described in Example 1 of WO2015 / 050184 and a culture solution containing heparosan under culture conditions Got.
  • Example 2 N-Deacetylation of Heparosan 1) 61 mL of Hydrazine ⁇ H 2 O and 4.7 mL of 1N sulfuric acid were added to 1.22 g of heparosan, and the gas phase was replaced with nitrogen, followed by heating to 100 ° C. and 4.75. Reacted for hours. 2) After stopping the reaction by cooling with ice, 61 mL of 16% NaCl aqueous solution and 610 mL of MeOH were added and centrifuged, and the supernatant was removed. The obtained precipitate was dissolved in 50 mL of H 2 O, and then desalted and concentrated using an Amicon UF membrane (3 kDa).
  • Example 3 Reduction of molecular weight of N-deacetylated heparosan (1) Preparation of heparinase III ⁇ Construction of expression plasmid for hepC gene derived from Flavobacterium heparinum> A hepC gene encoding heparinase III was cloned from Flavobacterium heparinum (ATCC 13125) into a pMIV-Pnlp0 vector (US Patent Application Publication No. 20050196846) to construct a hepC gene expression plasmid pMIV-Pnlp0-hepC.
  • pMIV-Pnlp0-ter incorporates a strong nlp0 promoter (Pnlp0) and an rrnB terminator, and can function as an expression unit by inserting a target gene between the promoter and the terminator.
  • Pnlp0 indicates the promoter of the wild-type nlpD gene derived from Escherichia coli K-12 strain.
  • a DNA fragment containing about 300 bp of the promoter region (Pnlp0) of the nlpD gene was obtained by PCR using the chromosomal DNA of Escherichia coli MG1655 as a template and primer P1 (SEQ ID NO: 6) and primer P2 (SEQ ID NO: 7). Restriction enzyme SalI and PaeI sites are designed at the 5 'end of these primers, respectively.
  • the PCR cycle was as follows.
  • the obtained fragment was treated with SalI and PaeI and inserted into the SalI-PaeI site of pMIV-5JS (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-99668) to obtain plasmid pMIV-Pnlp0.
  • the base sequence of the PaeI-SalI fragment of the Pnlp0 promoter inserted into this pMIV-Pnlp0 plasmid is as shown in SEQ ID NO: 8.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 11) containing about 300 bp of the terminator region of rrnB gene is obtained by PCR using primer P3 (SEQ ID NO: 9) and primer P4 (SEQ ID NO: 10). did. Restriction enzymes XbaI and BamHI sites are designed at the 5 'ends of these primers, respectively.
  • the PCR cycle was as follows.
  • a DNA chain comprising the ORF (Su H. et. Al., Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62: 2723-2734) of the hepC gene of Flavobacterium heparinum (ATCC 13125) was artificially synthesized.
  • the DNA fragment of the hepC gene was amplified by PCR using the DNA strand as a template and primer P5 (SEQ ID NO: 12) and primer P6 (SEQ ID NO: 13) as primers.
  • PrimeStar polymerase (TaKaRa) was used and the reaction composition described in the protocol was used. The PCR cycle was as follows. After 94 ° C. for 5 minutes, 98 ° C.
  • a DNA fragment of pMIV-Pnlp0 was obtained by PCR using pMIV-Pnlp0 as a template DNA and primers P7 (SEQ ID NO: 14) and primer P8 (SEQ ID NO: 15) as primers.
  • primers P7 SEQ ID NO: 14
  • primer P8 SEQ ID NO: 15
  • PrimeStar polymerase was used and the reaction composition described in the protocol was used. The PCR cycle was as follows. After 94 ° C. for 5 minutes, 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 6 minutes for 30 cycles, and finally 4 ° C. incubation.
  • Both obtained DNA fragments were ligated using an In-Fusion (registered trademark) HD cloning kit (Clontech) to construct a hepC gene expression plasmid pMIV-Pnlp0-hepC.
  • the base sequence of the cloned hepC gene is shown in SEQ ID NO: 16, and the amino acid sequence of heparinase III (HepC) encoded by it is shown in SEQ ID NO: 17.
  • HepC gene expression plasmid pMIV-Pnlp0-hepC was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain (Life Technologies) by electroporation (Cell; 80 ⁇ L, 200 ⁇ , 25 ⁇ F, 1.8 kV, cuvette; 0.1 mL)
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pMIV-Pnlp0-hepC strain was obtained. This strain was precultured overnight at 37 ° C.
  • Example 4 N-sulfation of low molecular weight N-deacetylated heparosan 1 g of low molecular weight N-deacetylated heparosan obtained in Example 3 was dissolved in 50 mL of milliQ water and 20 mg / mL NaHCO 3. / 20 mg / mL Trimethylamine ⁇ SO 3 aqueous solution (50 mL) was added and reacted at 55 ° C. overnight. 2) EtOH 1 L was added and mixed, centrifuged, and the supernatant was removed to obtain N-sulfated low molecular weight heparosan.
  • N-sulfated low molecular weight heparosan was dissolved in milliQ water to 500 ⁇ L, and disaccharide analysis was performed to determine the yield relative to N-deacetylated heparosan. Moreover, it used for GPC analysis and calculated
  • N-sulfated low molecular weight heparosan The disaccharide analysis of N-sulfated low molecular weight heparosan has been reported (T.Imanari, et.al., “High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglyc. -293 (1996)). That is, N-sulfated low molecular weight heparosan was decomposed into unsaturated disaccharides using heparinase II and III, and the decomposition products were analyzed by HPLC to quantify the amount of each constituent disaccharide.
  • N-deacetylated heparosan was performed.
  • the disaccharide analysis of N-deacetylated heparosan was conducted after N-deacetylated heparosan was N-sulfated. That is, after N-deacetylated heparosan was N-sulfated, it was decomposed into unsaturated disaccharides using heparinase II and III, and the decomposition products were analyzed by HPLC to quantify the amount of each constituent disaccharide. .
  • N-sulfation of N-deacetylated heparosan was performed in the same manner as N-sulfation of low molecular weight N-deacetylated heparosan.
  • the disaccharide analysis was performed according to the following procedure. 1) Heparinase II0.2U (Sigma), heparinase III 0.02-0.03 mIU, polysaccharide sample 5 ⁇ g, and enzyme digestion buffer (100 mM CH 3 COONa, 10 mM (CH 3 COO) 2 Ca, pH 7.0) 10 ⁇ L are mixed. Then, it was made up to 100 ⁇ L with milliQ water to prepare a reaction solution. 2) The reaction solution was reacted at 37 ° C. for 16 hours or longer, and then boiled at 100 ° C. for 2 minutes to stop the reaction.
  • enzyme digestion buffer 100 mM CH 3 COONa, 10 mM (CH 3 COO) 2 Ca, pH 7.0
  • the yield was calculated from the total amount of the constituent disaccharides generated from each polysaccharide sample. That is, the yield was calculated as the ratio (molar ratio) of the total amount of disaccharides produced from N-sulfated low molecular weight heparosan to the total amount of disaccharides produced from N-deacetylated heparosan. At this time, it was confirmed that 99% or more of the amino groups generated by N-deacetylation were N-sulfated in the obtained N-sulfated low molecular weight heparosan.
  • the residual ratio of N-acetyl groups in N-deacetylated heparosan was calculated based on the amount of each constituent disaccharide produced from N-deacetylated heparosan. That is, the residual ratio of acetyl groups was calculated as the ratio (molar ratio) of the amount of disaccharides having N-acetyl groups to the total amount of disaccharides. The residual ratio of acetyl groups was 14.9%.
  • N-sulfated low molecular weight heparosan and heparan sulfate were subjected to gel filtration by HPLC (GPC analysis).
  • GS520 Shodex, Asahipak GS-520HQ, 7.5 mm ⁇ 300 mm, particle diameter 7 ⁇ m
  • 100 mM potassium dihydrogen phosphate aqueous solution was used as the eluent
  • the flow rate was 0.6 mL / min
  • the column temperature was 40 ° C.
  • Analysis was performed at a detection wavelength of 200 nm.
  • Average molecular weights (Mn and Mw) were calculated using pullulan molecular weight markers (Shodex, STANDARD P-82, molecular weight range 5900 to 708000) as a standard.
  • Example 5 Coupling reaction of C5 epimerization and 2-O-sulfation (1) Expression and purification of C5-epimerase
  • C5-epimerase the catalytic site of human-derived C5-epimerase (Gln29-Asn617), A fusion protein (MBP-C5-epimerase) with maltose binding protein (MBP) was used. Therefore, the base sequence encoding the catalytic site was cloned into a pMAL-c2x vector (New England Biolabs) to construct an MBP-C5-epimerase expression plasmid pMAL-c2x-MBP-C5epi. According to the pMAL-c2x vector, the cloned gene is expressed as a fusion protein with MBP.
  • MBP-C5-c2x vector New England Biolabs
  • Jin-ping Li et al. Li J. et.al., Jour. Biol. Chem. 1997, 272: 28158- 28163 synthesized human C5-epimerase cDNA by means of artificial gene synthesis (Thermo Fisher). Prepared by Scientific Co., Ltd.).
  • the base sequence encoding the catalytic site of C5-epimerase (Gln29-Asn617) was obtained by PCR using C5-epi fw (SEQ ID NO: 18) and C5-epi rv (SEQ ID NO: 19) as primers. The containing DNA fragment was obtained.
  • PrimeStar polymerase (TaKaRa) was used and the reaction composition described in the protocol was used.
  • the PCR cycle was as follows. After 94 ° C. for 5 minutes, 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 2 minutes for 30 cycles, and finally 4 ° C. incubation.
  • a pMAL-c2x DNA fragment was obtained by PCR using pMAL-c2x (SEQ ID NO: 20, New England BioLabs) as a template DNA and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as primers.
  • PrimeStar polymerase was used and the reaction composition described in the protocol was used.
  • the PCR cycle was as follows. After 94 ° C. for 5 minutes, 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 6 minutes for 30 cycles, and finally 4 ° C. incubation. Both DNA fragments obtained were ligated using an In-Fusion (registered trademark) HD cloning kit (Clontech), and the base sequence encoding the catalytic site of C5-epimerase and the MBP gene originally contained in pMAL-c2x were fused. The MBP-C5-epimerase expression plasmid pMAL-c2x-MBP-C5epi was constructed. SEQ ID NOs: 23 and 24 show the base sequence of the C5-epimerase insert fragment (base sequence encoding the catalytic site of C5-epimerase) and the amino acid sequence encoded by it.
  • MBP-C5-epimerase expression plasmid pMAL-c2x-MBP-C5epi and chaperonin expression plasmid pGro7 were electroporated to the Escherichia coli Origami B (DE3) strain (Novagen) (Cell; 80 ⁇ L, 200 ⁇ , 25 ⁇ F, 1.8 kV, cuvette; 0.1 mL) to obtain Origami B (DE3) / pMAL-c2x-MBP-C5epi / pGro7 strain.
  • This strain was added to LB medium (1.0% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 1.0% (w / v) NaCl) at 100 ⁇ g / mL ampicillin, 25 ⁇ g / mL.
  • the medium was inoculated into a medium supplemented with lamphenicol, and precultured overnight at 37 ° C. Thereafter, the culture solution was inoculated to a final concentration of 1% in LB medium in which 100 mL of Sakaguchi flask was spread. After shaking culture at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • arabinose Wang Chemical Industries, Ltd.
  • 2-O-sulfating enzyme (2-OST) As 2-O-sulfating enzyme (2-OST), the 94th tyrosine residue of 2-OST derived from Chinese hamster is isoleucine. A fusion protein (MBP-2-OST) of the mutant catalytic site (Arg51-Asn356) and maltose-binding protein (MBP), which was converted to ⁇ , was used. Therefore, the base sequence encoding the catalytic site was cloned into a pMAL-c2x vector (New England Biolabs) to construct an expression plasmid pMAL-c2x-MBP-2OST for MBP-2-OST.
  • pMAL-c2x vector New England Biolabs
  • a pMAL-c2x DNA fragment was obtained by PCR using pMAL-c2x as a template DNA and oligonucleotides of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 as primers.
  • PrimeStar polymerase was used and the reaction composition described in the protocol was used. The PCR cycle was as follows. After 94 ° C. for 5 minutes, 98 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 6 minutes for 30 cycles, and finally 4 ° C. incubation.
  • the MBP-2OST expression plasmid pMAL-c2x-MBP-2OST and the chaperonin expression plasmid pGro7 were introduced into Escherichia coli Origami B (DE3) strain (Novagen) in the same manner as in Example 5 (1).
  • Origami B (DE3) / pMAL-c2x-MBP-2OST / pGro7 strain was obtained. This strain was inoculated into a medium obtained by adding 100 ⁇ g / mL ampicillin and 25 ⁇ g / mL chloramphenicol to LB medium, and precultured overnight at 37 ° C.
  • the culture solution was inoculated to a final concentration of 1% in LB medium in which 100 mL of Sakaguchi flask was spread.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • arabinose has a final concentration of 0.
  • the mixture was added to 2%, and further cultured at 22 ° C. overnight.
  • Purified MBP-2-OST was prepared from the culture solution by the following procedure. First, the culture solution was centrifuged, and the cells were collected. Subsequently, the microbial cells were ultrasonically crushed to obtain a microbial cell extract. Subsequently, the bacterial cell extract was mixed with Amyrose resin (New England Biolabs) equilibrated with 20 mM Tris (pH 7.5) and 200 mM NaCl to adsorb MBP-2-OST to the resin.
  • Amyrose resin New England Biolabs
  • ⁇ Test solution> Heparin standard solution: 1 mg / mL NaNO 2 aqueous solution: reagent 49.5mg dissolved aqueous citric acid solution H 2 O1mL: dissolve the reagents 384.2mg into H 2 O1mL DNPH solution: dissolve reagent 20.4mg (50% water) in acetonitrile 1mL
  • C5-epimerization rate (sum of the ratio of IdoA (2S) -GlcN (NS) and IdoA-GlcN (NS)) is 58%, 2-O-sulfation rate (GlcA (2S) -GlcN (NS) and IdoA) (2S) -GlcN (NS) ratio) was confirmed to be 65%.
  • Example 6 6-O-sulfation reaction ⁇ Purification before reaction> 30 mL of the enzyme reaction solution (reaction solution after C5 epimerization and 2-O-sulfation coupling reaction) obtained in Example 5 was centrifuged (7000 G, 30 minutes), and the supernatant was 0.45 ⁇ m. Filtered with a filter. Charge 27.3 g of filtrate into 15 g of weak anion exchange resin packed in a Pharmacia column (model number: XK26) (DIAION, WA-30 manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd., adjusted to pH 5.5 in advance with 25.6 mM NaH 2 PO 4 ).
  • the polysaccharide component was adsorbed and 480 mL of a washing solution (0.5 M NaCl + 25.6 mM NaH 2 PO 4 (pH 5.5)) was passed through (flow rate: 6.4 mL / min).
  • a washing solution 0.5 M NaCl + 25.6 mM NaH 2 PO 4 (pH 5.5)
  • 230 mL of the eluent (2M NaCl + 25.6 mM NaH 2 PO 4 (pH 5.5)
  • was passed flow rate 6.4 mL / min) to obtain an eluent containing a polysaccharide component.
  • the obtained eluent was charged in Amicon-3K (manufactured by Merck Millipore) and centrifuged (4000G). 100 mL of water was further added to the obtained concentrated liquid, and centrifugation was performed again. This washing operation was carried out three times to obtain 11 g of washing concentrate.
  • This washing operation was carried out twice to obtain 3.92 g of washing concentrate.
  • the obtained washing concentrate was sampled, and disaccharide composition analysis was performed by nitrous acid decomposition in the same procedure as in Example 5. As a result, it was confirmed that 76.5 mg of the reaction product (polysaccharide) was contained in 3.92 g of the washing concentrate in terms of the amount of disaccharide units.
  • Example 7 3-O-sulfation reaction of GlcN residue (1)
  • 3-O-sulfating enzyme (3-OST) expression strain Amino acid sequence of mouse-derived 3-OST-1 (NCBI-Protein ID: NP — 034604; SEQ ID NO: 29) was obtained from the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genes) database.
  • the 3-OST-1 catalyst optimized for codon usage of Escherichia coli with reference to a previous report (Edavettal SC et al., J Biol Chem. 2004; 279 (24) 25789-97)
  • a DNA fragment containing the base sequence (SEQ ID NO: 30) encoding the site (Gly48-His311) was synthesized.
  • the obtained DNA fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of the pETDuet-1 vector (Novagen) to construct a 3-OST-1 expression plasmid pETDuet-3-OST-1.
  • 3-OST-1 since 3-OST-1 with His-Tag added to the N-terminal side is expressed, 3-OST-1 can be purified using a His tag.
  • This expression plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain in the same manner as in Example 5 (1) to obtain a 3-OST-1 expression strain pETDuet-3-OST-1 / BL21 (DE3) strain .
  • the cells obtained as a precipitate are suspended in 160 mL of equilibration buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0), and centrifuged again (4 ° C., 8,000 rpm, 5 minutes). Washed. After the washing operation was repeated twice, the cells obtained as a precipitate were suspended again in 160 mL of equilibration buffer, and subjected to ultrasonic disruption (190 W, 20 minutes) while cooling with ice water. The disrupted solution was centrifuged (4 ° C., 8,000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • equilibration buffer 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0
  • ultrasonic disruption 190 W, 20 minutes
  • the obtained cell-free extract was applied to a column in which 5 mL of a HisTALON Superflow Cartridge column (manufactured by Clontech) previously equilibrated with an equilibration buffer was connected to adsorb 3-OST-1 and washed buffer (50 mM) After washing with sodium phosphate, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.0), 3-OST-1 was eluted with elution buffer (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 150 mM imidazole, pH 7.0). An active fraction of -1 was obtained.
  • the obtained active fraction was subjected to buffer exchange (50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.0) using a PD-10 column (manufactured by GE Healthcare) according to the manual.
  • the enzyme solution after the buffer exchange was used as purified 3-OST-1 in subsequent experiments.
  • Example 8 Purification of reaction product 371 g of the enzyme reaction solution obtained in Example 7 (reaction solution after 3-O-sulfation reaction of GlcN residue) was centrifuged (8000 G, 30 minutes), and then The clear was filtered through a 0.45 ⁇ m filter. The filtrate was charged in Amicon-3K (manufactured by Merck Millipore) and centrifuged (4000G). To the obtained concentrated liquid, 200 mL of water was further added and centrifuged again. This washing operation was performed three times to obtain 11.6 g of a washing concentrate.
  • Amicon-3K manufactured by Merck Millipore
  • Example 9 Quality analysis of purified polysaccharide The items shown in Table 5 were measured for the purified polysaccharide obtained in Example 8. The measuring method will be described later. The results are shown in Table 5.
  • Example 10 Preparation of sulfated polysaccharides having different structures Preparation of multiple types of sulfated polysaccharides having different parameters such as epimerization rate, 2-O-sulfation rate, 3-O-sulfation rate of GlcN residues, Evaluation of anticoagulant activity was performed.
  • Preparation of Reagents / Substrate Solution One vial of substrate agent was dissolved in 20 mL of milli-Q water.
  • Antithrombin III solution 1 vial of antithrombin III agent was dissolved in 10 mL of milli-Q water.
  • -Factor Xa solution 1 vial of factor Xa agent was dissolved in 10 mL of milli-Q water.
  • Buffer solution The attached vial was used as it was.
  • Normal plasma 1 vial of normal plasma was dissolved in 1.0 mL of milli-Q water.
  • Reaction stop solution Milli-Q water was added to 20 mL of glacial acetic acid (special grade) to make the total volume 40 mL.
  • Heparin standard solution Primary diluted heparin solution (35 IU / mL): Heparin 1750 IU was dissolved in 50 mL of milli-Q water. Secondary diluted heparin solution (0.175 IU / mL): 900 ⁇ L of buffer solution was accurately added to 100 ⁇ L of primary diluted heparin solution and mixed. Further, 950 ⁇ L of the buffer solution was accurately added to 50 ⁇ L of the mixed solution and mixed. Heparin standard solution: The secondary diluted heparin solution was diluted and mixed as shown in Table 9.
  • Diluted solution A was obtained by diluting or dissolving purified polysaccharide with MilliQ so that the substrate concentration was 2 ⁇ g / mL. Reagents were added to diluent A at the ratios shown in Table 10 to prepare specimens.
  • Measurement Procedure A sample of 200 ⁇ L was accurately collected in each of the measurement and sample blank microtubes, and heated and stirred at 37 ° C. for 4 minutes. 100 ⁇ L of Factor Xa solution was added to the measurement microtube, mixed well, allowed to stand for 30 seconds, and then heated at 37 ° C. for exactly 30 seconds. 200 ⁇ L of a substrate solution preliminarily heated to 37 ° C. was added to the measurement microtube, mixed well, allowed to stand for 30 seconds, and then heated accurately at 37 ° C. for 180 seconds. 300 ⁇ L of the reaction stop solution was added to each microtube and mixed immediately. 800 ⁇ L of the reaction solution was dispensed into a UV cell, and the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm.
  • Activated partial thromboplastin time (aPTT) measurement calcium chloride solution (0.025 mol / L GMY-300A) manufactured by Sysmex Corporation
  • Activated partial thromboplastin time kit Actin FSL GAC-200A manufactured by Sysmex Corporation Normal control plasma Did cytolol Level 1 GCA-110A Low molecular weight heparin standard product manufactured by Sysmex Corporation: Japanese Pharmacy Law standard product (Anti-Factor IIa: 670 IU manufactured by Pharmaceuticals and Medical Devices Regulatory Science Foundation)
  • -Equipment used Semi-automatic blood coagulation analyzer (CA-104, manufactured by Sysmex Corporation)
  • Measurement procedure A standard solution (diluted series of low molecular weight heparin standard) or a test solution (purified polysaccharide solution) 10 ⁇ L, actin 50 ⁇ L, and control plasma 50 ⁇ L were added to a cuvette, and immediately inserted into the detection section, and the light-shielding lid was closed. After stirring for 3 minutes, 50 ⁇ L of calcium chloride solution was added from the introduction part. The clotting time was automatically displayed. Based on the calibration curve calculated from the standard solution, the Anti-Factor IIa activity of the test solution was determined. The concentration at which 1 mL of blood coagulation was inhibited for 1 hour was defined as 1 IU / mL.
  • Foreign solution Foreign reagent (F9252-100 mL) manufactured by Aldrich was diluted 2-fold with water.
  • Albumin standard solution It was diluted to 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg / mL using a standard solution (2 mg / mL) manufactured by Thermo Scientific.
  • ⁇ Disaccharide analysis> A disaccharide composition analysis was performed by nitrous acid decomposition in the same procedure as in Example 5, and the content of GlcA-GlcN (NS3S6S) was calculated.
  • Example 11 Reduction of molecular weight of N-sulfated heparosan having a high residual ratio of acetyl groups (1) N-deacetylation of heparosan 1) 6 mL of 2M NaOH was added to 120 mg of heparosan, heated to 48 ° C., and heated to 4 ° C. Reaction was performed for 1 hour. 2) After 2 mL of 6N HCl was added to stop the reaction, 45 mL of MeOH was added and centrifuged, and the supernatant was removed.
  • the obtained precipitate was dissolved in 8 mL of 0.25M NaHCO 3 and then desalted and concentrated using an Amicon UF membrane (3 kDa) to obtain 6 mL of an N-deacetylated heparosan solution.
  • the residual ratio of acetyl groups in the obtained N-deacetylated heparosan was 27.6% (described later).
  • Example 12 Control of molecular weight of low molecular weight N-sulfated heparosan depending on N-acetyl group residual ratio (1) N-deacetylation of heparosan N-deacetylation of heparosan in the same manner as in Example 11 Then, N-deacetylated heparosan having an N-acetyl group residual ratio of 2.6% to 29.6% was obtained by controlling the reaction time.
  • Example 13 Preparation of low molecular weight N-sulfated heparosan for observing the difference in activity depending on the molecular weight Since the residual amount of N-acetyl group affects the activity of heparan sulfate, the influence of the difference in molecular weight on the activity is examined. For the purpose, low molecular weight N-sulfated heparosan having different molecular weights with the same residual amount of N-acetyl groups was prepared. The molecular weight was controlled by the reaction time of the low molecular weight reaction.
  • N-deacetylation of heparosan Heparosan was subjected to an N-deacetylation reaction in the same manner as in Example 11 to obtain N-deacetylated heparosan having an N-acetyl group residual ratio of 29.4%.
  • (2) Reduction of molecular weight by heparinase III reaction Reduction of the molecular weight of N-deacetylated heparosan obtained in (1) was reacted with heparinase III under the same conditions as in Example 11, and the molecular weight was determined according to the amount of enzyme added and the reaction time. 4 types of low molecular weight N-deacetylated heparosan were obtained.
  • N-sulfation of low molecular weight N-deacetylated heparosan Four types of low molecular weight N-deacetylated heparosan obtained in (2) were subjected to N-sulfation reaction under the same conditions as in Example 11. To obtain N-sulfated low molecular weight heparosan. (4) The yield and molecular weight distribution of the obtained N-sulfated low molecular weight heparosan were determined by the same method as in Example 4.
  • Example 14 Preparation of sulfated polysaccharides with different molecular weights
  • C5-epimerase As C5-epimerase, a human C5-epimerase catalytic site (Gly101-Asn617) and a C-terminal 3 amino acid-substituted maltose binding protein (MBP *, previously reported (Rob J .Center, et.al., "Crystallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimerb inte. (MBP * -C5-epimerase (G101)) was used.
  • MBP * C-terminal 3 amino acid-substituted maltose binding protein
  • a C-terminal region DNA fragment of MBP * was obtained by PCR reaction using pMAL-c2x (SEQ ID NO: 20, New England BioLabs) as a template DNA and oligonucleotides of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 as primers. .
  • recognition sites for restriction enzymes BglII, BamHI, BamHI, SacI, XhoI, and NotI were added to the 5 'end and 3' end.
  • pMAL-c2x plasmid DNA and MBP * C-terminal region DNA fragment were cleaved with BglII and HindIII, and ligation reaction was performed to obtain pMAL-MBP * plasmid.
  • the base sequence of the pMAL-MBP * plasmid is shown in SEQ ID NO: 33.
  • a DNA fragment of C5-epimerase (G101) was obtained by PCR reaction using the pMAL-c2x-MBP-C5epi plasmid prepared in Example 5 as template DNA and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 as primers. .
  • a restriction enzyme NotI was added to the 5 'end and a recognition site for the restriction enzyme XhoI was added to the 3' end.
  • the pMAL-c2x-MBP-C5epi plasmid DNA and the C5-epimerase (G101) DNA fragment were cleaved with NotI and XhoI, and a ligation reaction was performed to obtain a pMAL-MBP * -C5epi (G101) plasmid.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment (the nucleotide sequence encoding the catalytic site of C5-epimerase (Gly101-Asn617)) and the amino acid sequence encoded by it are shown in SEQ ID NOs: 36 and 37.
  • Example 5 the MBP * -C5-epimerase (G101) expression plasmid pMAL-MBP * -C5epi (G101) and the chaperonin expression plasmid pGro7 (TaKaRa) were transformed into Escherichia coli Origami B (DE3) strain (Novagen) ) To obtain an Origami B (DE3) / pMAL-MBP * -C5epi (G101) / pGro7 strain. Using this strain, a bacterial cell extract was prepared in the same manner as in Example 5.
  • 2-O-sulfating enzyme (2-OST) As 2-O-sulfating enzyme (2-OST), the 94th tyrosine residue of 2-OST derived from Chinese hamster is isoleucine. A fusion protein (MBP * -2-OST (D68)) with the catalytic site (Asp68-Asn356) of the mutant converted to MB and MBP * was used.
  • a DNA fragment of 2-OST (D68) was obtained by PCR reaction using the pMAL-c2x-MBP-2OST plasmid prepared in Example 5 as template DNA and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 as primers. .
  • a restriction enzyme NotI was added to the 5 'end and a recognition site for the restriction enzyme XhoI was added to the 3' end.
  • the pMAL-c2x-MBP-2OST plasmid DNA and 2-OST (D68) DNA fragment were cleaved with NotI and XhoI, and ligation reaction was performed to obtain the pMAL-MBP * -2OST (D68) plasmid.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment (the nucleotide sequence encoding the catalytic site of 2-OST (Asp68-Asn356)) and the amino acid sequence encoded by it are shown in SEQ ID NOs: 40 and 41.
  • MBP * -2-OST (D68) expression plasmid pMAL-MBP * -2OST (D68) and chaperonin expression plasmid pGro7 (TaKaRa) were transformed into Escherichia coli Origami B (DE3) strain (Novagen) in the same manner as in Example 5.
  • Origami B (DE3) / pMAL-MBP * -2OST (D68) / pGro7 strain was obtained in the same manner as in Example 5.
  • 6-O-sulfation reaction 4-No For the enzyme reaction solution 9 (after the coupling reaction of C5 epimerization and 2-O-sulfation, or the reaction solution of C5 epimerization single reaction), purification and 6-O-sulfuric acid were carried out in the same manner as in Example 6. Reaction was performed to obtain a washing concentrate.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of kfiABCD operon of Escherichia coli K5 strain
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of KfiA protein of Escherichia coli K5 strain
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of KfiB protein of Escherichia coli K5 strain
  • SEQ ID NO: 4 Escherichia -Amino acid sequence of KfiC protein of coli K5 strain
  • SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence of KfiD protein of Escherichia coli K5 strain
  • SEQ ID NO: 12-15 primer SEQ ID NO: primer SEQ

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Abstract

本発明は、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖を提供する。具体的には、本発明は、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基とα－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）残基からなる二糖単位の繰り返し構造を含み、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率が１３％以上である、多糖を提供する。

Description

グルコサミン残基の３－Ｏ－硫酸化率が高いヘパラン硫酸
　本発明は、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖に関する。抗凝固活性を有する硫酸化多糖は、例えば、医療分野で有用である。
　抗凝固活性を有する硫酸化多糖としては、例えば、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）等の各種ヘパラン硫酸が知られている。すなわち、ヘパリンは抗凝固薬の一つであり、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）や播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）の治療、人工透析や体外循環での血液凝固防止などに用いられる。
　ヘパリンは、抗凝固因子であるアンチトロンビンＩＩＩの活性化を通じて、抗凝固作用を示す。アンチトロンビンＩＩＩは、トロンビン、第Ｘａ因子（第Ｘ因子の活性型）、およびその他のセリンプロテアーゼを、その活性セリン部位と結合することで阻害する。なお、トロンビンは血液凝固因子であり、第Ｘａ因子はトロンビンの成熟に関与する因子である。ヘパリンは、このアンチトロンビンＩＩＩと結合し、その構造を変化させて阻害作用を活性化する。トロンビンは、ヘパリン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体に対して、第Ｘａ因子よりも高い親和性を有する。
　また、ヘパリンを酵素／化学処理および分画して得られる平均分子量４０００－６０００Ｄａの低分子ヘパリンは、出血の副作用が少なく、近年使用頻度が増えてきている。低分子ヘパリンは、糖鎖が短いため、アンチトロンビンＩＩＩとは結合できるが、トロンビンとはほとんど結合できない。ここで、ヘパリン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体によるトロンビンの阻害では、トロンビンがヘパリンに結合する必要があるのに対し、ヘパリン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体による第Ｘａ因子の阻害では、第Ｘａ因子がヘパリンに結合する必要はない。そのため、低分子ヘパリンは、トロンビンの作用をほとんど阻害しないのに対し、第Ｘａ因子の作用は阻害できる。
　現在、大部分のヘパリン製剤は、豚腸粘膜からの抽出品である。しかしながら、２００８年に不純物混入を原因とする死亡事故が発生したことから、品質管理された非動物由来ヘパリンの製造開発が検討されてきた。
　非動物由来ヘパリンを製造する方法は多数報告されており、それらの方法は大きく２つに大別される。１つ目は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ５株等の微生物を用いてヘパリンの糖鎖骨格となるヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）を発酵法で生産し、化学的または酵素的手法を用いてヘパリンに類似する抗凝固多糖類に変換し、次いで化学的、酵素的、または物理的手法を用いて低分子化する方法である（非特許文献１、２）。２つ目は、化学合成法で１から糖鎖を連結していく方法である（特許文献１）。
　ヘパロサンを出発物質としてヘパリンを製造する方法としては、化学変換を主とする方法と酵素変換を主とする方法が報告されており、生成されるヘパリン類似多糖類の構造上の特徴および抗凝固活性強度が異なる（特許文献２、３）。
　化学変換を主とする方法で生成されるヘパリン類似多糖類では、グルコサミン残基の３－Ｏ－硫酸化比率が高い反面、グルクロン酸残基の一部も３－Ｏ－硫酸化されている。この３－Ｏ－硫酸化されたグルクロン酸残基は動物由来ヘパリンには存在しない構造であり、生体内での副反応が懸念されている。
　一方、酵素変換を主とする方法で生成されるヘパリン類似多糖類では、動物由来ヘパリンと同一の硫酸化パターンを有する反面、抗凝固活性は動物由来品の半分程度である。
　以上の先行知見より、動物由来ヘパリンと同一の硫酸化パターンを有し、且つ、高い抗凝固活性を示すヘパリン類似多糖類は知られていない。
ＵＳ２０１２０１１６０６６ ＵＳ８２２７４４９ ＵＳ２０１２０３２２１１４
Ｌｉｎｄａｈｌ　Ｕ．　ｅｔ　ａｌ．（２００５）Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４８（２）：３４９－３５２ Ｚｈａｎｇ　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　１３０（３９）：１２９９８－１３００７
　本発明は、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖を提供することを課題とする。
　本願発明者らは、鋭意検討の結果、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基とα－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）残基からなる二糖単位の繰り返し構造を含み、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率が高い、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
　下記一般式（Ｉ）に示す二糖単位の繰り返し構造を含む、抗凝固活性を有する多糖：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　式中、Ｒ１～Ｒ５は、以下の条件を満たす：
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、水素または硫酸基を示す；
　Ｒ３は、水素、硫酸基、またはアセチル基を示す；
　Ｒ３の少なくとも一部が硫酸基である；
　Ｒ４における硫酸基の比率が、１３％以上である；
　Ｒ５における硫酸基の比率が、５０％以上である。
［２］
　前記二糖単位の含有率が、９０％以上である、前記多糖。
［３］
　前記多糖を構成する糖鎖の総数の５０％以上の数の糖鎖が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなる、前記多糖：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　式中、Ｒ１～Ｒ５は、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１～Ｒ５と同一である；
　式中、ｎは、平均値として３～３０である。
［４］
　前記多糖を構成する糖鎖の総数の５０％以上の数の糖鎖が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなる、前記多糖：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　式中、Ｒ１～Ｒ５は、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１～Ｒ５と同一である；
　式中、ｎは、平均値として３～１５である。
［５］
　平均糖連結数が６～６０残基である、前記多糖。
［６］
　平均糖連結数が６～３０残基である、前記多糖。
［７］
　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される数平均分子量が８０００～６００００である、前記多糖。
［８］
　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される数平均分子量が１２０００～４００００である、前記多糖。
［９］
　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量が１００００～１０００００である、前記多糖。
［１０］
　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量が１５０００～５００００である、前記多糖。
［１１］
　前記二糖単位のヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の比率が０％～７０％である、前記多糖。
［１２］
　Ｒ１における硫酸基の比率が、０％～８０％である、前記多糖。
［１３］
　イズロン酸残基のＲ１における硫酸基の比率が、０％～１００％である、前記多糖。
［１４］
　グルクロン酸残基のＲ１における硫酸基の比率が、０％～５０％である、前記多糖。
［１５］
　Ｒ２における硫酸基の比率が、１％未満である、前記多糖。
［１６］
　Ｒ３における硫酸基の比率が、７０％～１００％である、前記多糖。
［１７］
　Ｒ３におけるアセチル基の比率が、０％～３３％である、前記多糖。
［１８］
　Ｒ４における硫酸基の比率が、４５％以下である、前記多糖。
［１９］
　Ｒ５における硫酸基の比率が、７０％～１００％である、前記多糖。
［２０］
　ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ）、ＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、およびＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）から選択される１またはそれ以上の二糖単位を、５０％以上の総含有率で含む、前記多糖。
［２１］
　Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性／Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性比が、１．５以上である、前記多糖。
［２２］
　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．５以下である、前記多糖。
［２３］
　フリー体、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの混合物である、前記多糖。
［２４］
　前記塩が、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカルシウム塩から選択される、前記多糖。
［２５］
　前記多糖を含む医薬組成物。
［２６］
　血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療用である、前記組成物。
［２７］
　前記症状が、播種性血管内凝固症候群、血栓塞栓症、人工透析における血液凝固、または体外循環における血液凝固である、前記組成物。
　本発明によれば、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖を提供することができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の多糖
　本発明の多糖は、抗凝固活性を有する新規な硫酸化多糖である。本発明の多糖を、「ヘパラン硫酸」という場合がある。本発明の多糖は、単一の種類の糖鎖からなるものであってもよく、複数の種類の糖鎖の混合物であってもよい。本発明の多糖は、通常は、複数種の糖鎖の混合物として得られる。「複数種の糖鎖の混合物」とは、構造（糖連結数、分子量、および置換基の種類や位置、等）の異なる２種またはそれ以上の糖鎖の組み合わせをいう。本発明の多糖が単一の種類の糖鎖からなるものである場合にあっては、本発明の多糖を特定する各パラメータは、特記しない限り、当該糖鎖における該当パラメータを示す。本発明の多糖が複数の種類の糖鎖の混合物である場合にあっては、本発明の多糖を特定する各パラメータは、特記しない限り、当該混合物全体における該当パラメータの平均値を示す。本発明の多糖を製造する際の中間体等の他の多糖についても同様である。
　本発明の多糖を特定する各パラメータは、例えば、多糖等の化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により決定することができる。そのような手法としては、例えば、二糖分析、分子量分析（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＰＣ））、紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＲＩ／ＵＶ法）、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。これらの手法は、決定すべきパラメータの種類に応じて適宜選択できる。例えば、二糖構造やその含有率は、二糖分析により決定することができる。二糖分析は常法により実施できる。二糖分析は、例えば、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”　Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５－２９３（１９９６））の条件に従い実施することができる。すなわち、例えば、必要に応じてＮ－硫酸化した多糖をヘパリナーゼ（Ｈｅｐａｒｉｎａｓｅ）を用いて不飽和二糖に分解し、分解物を分離定量することにより、各構成二糖の量を定量することができる。ヘパリナーゼとしては、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩが挙げられる。ヘパリナーゼは、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用できる。用いるヘパリナーゼは、多糖に含まれるヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、β－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基を含む多糖の二糖分析には、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを組み合わせて利用することができる。また、例えば、α－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基を含む多糖の二糖分析には、ヘパリナーゼＩおよびＩＩを組み合わせて利用することができる。また、多糖を亜硝酸分解し、分解物を分離定量することにより、各構成二糖の量を定量することができる。分解物の分離定量は、例えば、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ等の化合物の同定に用いられる公知の手法により実施することができる。二糖分析の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。各構成二糖の量に基づき、標的の二糖単位の含有率を算出することができる。なお、ヘパリナーゼＩＩＩ等のヘパリナーゼで多糖を切断する場合、通常、それにより生じる非還元末端のＨｅｘＡ残基においてＣ４－Ｃ５間の結合が二重結合となる。Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基はＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別がないため、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別が必要な場合は、亜硝酸分解等のＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基を区別できる手法により二糖分析を実施すればよい。本発明の多糖を製造する際の中間体等の他の多糖を特定する各パラメータについても同様に決定できる。
　本発明において、ヘパラン硫酸の平均分子量（数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ））は、特に断りがなければ、プルランを標準として直接的に測定することができる。あるいは、ヘパラン硫酸の真の平均分子量は、真の平均分子量が既知である分子（例、エノキサバリンナトリウム）を基準に比例計算により間接的に算出してもよい。本発明では、上記のとおりヘパラン硫酸の平均分子量を直接的に測定しても、間接的に算出してもよいが、直接的に測定することが好ましい。
　本発明の多糖は、具体的には、下記一般式（Ｉ）に示す二糖単位の繰り返し構造を含む、抗凝固活性を有する多糖である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、水素（－Ｈ）または硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）を示す。式中、Ｒ３は、水素（－Ｈ）、硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）、またはアセチル基（－ＣＯＣＨ３）を示す。なお、Ｒ１～Ｒ５は、いずれも、各繰り返し単位および各糖鎖において独立に選択される。また、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基の種類も、各繰り返し単位および各糖鎖において独立に選択される。
　本発明の多糖は、上記繰り返し構造を主要な構成要素として含んでいてよい。「本発明の多糖が上記繰り返し構造を主要な構成要素として含む」とは、本発明の多糖の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％（全て）の部分が上記繰り返し構造からなることであってよい。「本発明の多糖が上記繰り返し構造を主要な構成要素として含む」とは、実質的には、本発明の多糖の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％（全て）の部分が上記二糖単位（一般式（Ｉ）に示す二糖単位）からなることであってよい。上記二糖単位からなる部分の比率を「上記二糖単位の含有率」ともいう。すなわち、本発明の多糖における上記二糖単位の含有率は、例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％であってよい。上記二糖単位の含有率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、上記二糖単位の含有率は、例えば、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、二糖の総量に対する上記二糖単位の総量の比率（モル比）として算出できる。
　本発明の多糖における、上記二糖単位の平均繰り返し数、平均糖連結数、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）は、いずれも適宜設定できる。上記二糖単位の平均繰り返し数は、例えば、３以上、４以上、５以上、または６以上であってもよく、５０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１２以下、または９以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。上記二糖単位の平均繰り返し数は、具体的には、例えば、３～１５、または６～９であってもよい。平均糖連結数（残基数）は、例えば、６以上、８以上、１０以上、または１２以上であってもよく、１００以下、６０以下、４０以下、３０以下、２４以下、または１８以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。平均糖連結数は、具体的には、例えば、６～６０、６～３０、または１２～１８残基であってもよい。平均繰り返し数や平均糖連結数は、例えば、上記例示したような化合物の検出または同定に用いられる手法により決定することができる。平均繰り返し数や平均糖連結数は、具体的には、例えば、分子量に基づいて決定することができる。分子量の測定は常法により実施できる。分子量の測定法としては、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＰＣ）、および紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＲＩ／ＵＶ法、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）準拠）が挙げられる。ＧＰＣによる分子量の測定条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、７０００以上、８０００以上、１００００以上、１２０００以上、１５０００以上、または１８０００以上であってもよく、１５００００以下、１０００００以下、６００００以下、５００００以下、４３０００以下、または４００００以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、具体的には、例えば、８０００～６００００、または１２０００～４００００であってもよく、あるいは、１８０００～４３０００であってもよい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、９０００以上、１００００以上、１２０００以上、１５０００以上、２１０００以上、または２５０００以上であってもよく、２０００００以下、１５００００以下、１０００００以下、８００００以下、６００００以下、または５００００以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、具体的には、例えば、１００００～１０００００、または１５０００～５００００であってもよく、あるいは、２５０００～６００００であってもよい。重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、１以上であってもよく、２．０以下、１．９以下、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５５以下、１．５以下、１．４５以下、１．４以下、１．３５以下、１．３以下、１．２５以下、または１．２以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。重量平均分子量と数平均分子量の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、具体的には、例えば、１～１．６、１～１．５、または１～１．４であってもよい。
　上記二糖単位は、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基（式中、左側の糖残基）とα－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）残基（式中、右側の糖残基）からなる。上記二糖単位において、ＨｅｘＡ残基側（左側）を「非還元末端側」、ＧｌｃＮ残基側（右側）を「還元末端側」ともいう。ヘキスロン酸残基は、β－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基またはα－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基である。すなわち、本発明において、「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、β－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびα－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）の総称として用いる。「ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）」という用語は、すなわち「β－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）」および「α－Ｌ－イズロン酸（ＩｄｏＡ）」という用語は、特記しない限り、Ｒ１およびＲ２の選択に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。「α－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）」という用語は、特記しない限り、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の選択に応じて取り得る全ての誘導体を包含する。
　本発明の多糖は、非還元末端の一部または全部に上記二糖単位が存在するように、上記繰り返し構造を有していてよい。例えば、本発明の多糖の非還元末端の二糖単位の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％が上記二糖単位であってよい。すなわち、例えば、本発明の多糖の非還元末端の糖残基の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％がＨｅｘＡ残基であってよい。また、本発明の多糖は、還元末端の一部または全部に上記二糖単位が存在するように、上記繰り返し構造を有していてよい。例えば、本発明の多糖の還元末端の二糖単位の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％が上記二糖単位であってよい。すなわち、例えば、本発明の多糖の還元末端の９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％がＧｌｃＮ残基であってよい。なお、上記二糖単位が糖鎖の末端に存在する場合、末端のグリコシド結合は、末端として適切な構造として適宜読み替えてよい。すなわち、非還元末端におけるＨｅｘＡ残基のＣ－４位のグリコシド結合は、例えば、水酸基（－ＯＨ）として読み替えてもよいし、Ｃ４－Ｃ５間の二重結合として読み替えてもよい。なお、Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基は、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基の区別がないため、本発明の多糖等の多糖を特定する各パラメータを算出する際には、特記しない限り、ＨｅｘＡ残基には該当するが、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基のいずれにも該当しないものとして扱う。また、還元末端のＧｌｃＮ残基のＣ－１位のグリコシド結合は、例えば、水酸基（－ＯＨ）として読み替えてもよい。
　本発明の多糖は、より具体的には、下記一般式（ＩＩ）に示す構造を含んでいてよい。例えば、本発明の多糖の一部または全部（すなわち、本発明の多糖を構成する糖鎖の一部または全部）が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなるものであってよい。例えば、本発明の多糖を構成する糖鎖の総数の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％の数の糖鎖が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなるものであってもよい。式中、Ｒ１～Ｒ５は、いずれも、上述した通りである。式中、「ｎ」は、同式における上記二糖単位の繰り返し数を示す。「ｎ」は、本発明の多糖が上述したような上記二糖単位の平均繰り返し数、平均糖連結数、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、またはそれらの組み合わせを達成できるように設定されてよい。「ｎ」は、プルラン換算の重量平均分子量を低分子量ヘパリン製剤エノキサパリンナトリウム（サノフィ・アベンティス社（フランス））の分子量を用いてさらに換算することによって算出できる。具体的には、エノキサパリンナトリウムのＧＰＣ法測定値１６２１５をＥＰ準拠ＳＥＣ－ＲＩ／ＵＶ法での測定値４３２５で除した値３．７５を換算係数とし、本発明の多糖のプルラン換算の重量分子量を換算係数３．７５およびヘパリン二糖平均分子量６６５．４で除することによって求めることができる。各糖鎖において、「ｎ」は、例えば、３～２００、３～１００、または３～５０であってよい。また、「ｎ」は、具体的には、糖鎖の混合物全体における平均値として、例えば、上記例示した本発明の多糖における上記二糖単位の平均繰り返し数（例えば、３～３０、３～１５、または６～９）であってよい。
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　ＨｅｘＡ残基におけるＩｄｏＡ残基の比率（「エピメリ化率」ともいう）は、例えば、０％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、または５０％以上であってもよく、１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、または６０％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。エピメリ化率は、具体的には、例えば、０％～７０％、２０％～７０％、または３０％～６０％であってもよい。ただし、エピメリ化率を算出する際の「ＨｅｘＡ残基」とは、ＩｄｏＡ残基およびＧｌｃＡ残基をいい、Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基は除くものとする。エピメリ化率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、エピメリ化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、ＨｅｘＡ残基がＩｄｏＡ残基またはＧｌｃＡ残基である上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基がＩｄｏＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。ＨｅｘＡ残基のＣ４－Ｃ５間の結合は二重結合であってもよい。Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基の位置は特に制限されない。例えば、特に、非還元末端のＨｅｘＡ残基においてＣ４－Ｃ５間の結合が二重結合であってもよい。すなわち、例えば、Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％が、非還元末端に存在していてもよい。また、例えば、Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合でないＨｅｘＡ残基の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％が、非還元末端以外に存在していてもよい。また、例えば、非還元末端のＨｅｘＡ残基の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％において、Ｃ４－Ｃ５間の結合が２重結合であってもよい。また、例えば、非還元末端以外のＨｅｘＡ残基の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％において、Ｃ４－Ｃ５間の結合が２重結合でなくてもよい。
　Ｒ１は、水素（－Ｈ）または硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）を示す。Ｒ１における硫酸基の比率は、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基とで、同一であってもよく、なくてもよい。ＨｅｘＡ残基全体でのＲ１における硫酸基の比率（「ＨｅｘＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率」ともいう）、ＩｄｏＡ残基のＲ１における硫酸基の比率（「ＩｄｏＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率」ともいう）、ＧｌｃＡ残基のＲ１における硫酸基の比率（「ＧｌｃＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率」ともいう）は、それぞれ、例えば、０％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってもよく、１００％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、または３０％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。ＨｅｘＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、具体的には、例えば、０％～８０％、１０％～７０％、または１５％～７０％であってもよい。ＩｄｏＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、具体的には、例えば、０％～１００％、１５％～１００％、または３０％～１００％であってもよい。ＧｌｃＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、具体的には、例えば、０％～５０％、０％～４０％、または０％～３０％であってもよい。Ｒ１における硫酸基の比率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、ＨｅｘＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が２－Ｏ－硫酸化されたＨｅｘＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＩｄｏＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、ＨｅｘＡ残基がＩｄｏＡ残基である上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が２－Ｏ－硫酸化されたＩｄｏＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＧｌｃＡ残基の２－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、ＨｅｘＡ残基がＧｌｃＡ残基である上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が２－Ｏ－硫酸化されたＧｌｃＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
　Ｒ２は、水素（－Ｈ）または硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）を示す。Ｒ２における硫酸基の比率は、ＩｄｏＡ残基とＧｌｃＡ残基とで、同一であってもよく、なくてもよい。Ｒ２の硫酸基は、天然のヘパリンには存在しない。よって、例えば、生体内での副反応の懸念等の観点から、Ｒ２における硫酸基の比率は低いのが好ましい場合があり得る。ＨｅｘＡ残基全体でのＲ２における硫酸基の比率（「ＨｅｘＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率」ともいう）、ＩｄｏＡ残基のＲ２における硫酸基の比率（「ＩｄｏＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率」ともいう）、ＧｌｃＡ残基のＲ２における硫酸基の比率（「ＧｌｃＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率」ともいう）は、それぞれ、例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、またはゼロであってよい。Ｒ２における硫酸基の比率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、ＨｅｘＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が３－Ｏ－硫酸化されたＨｅｘＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＩｄｏＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、ＨｅｘＡ残基がＩｄｏＡ残基である上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が３－Ｏ－硫酸化されたＩｄｏＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、ＧｌｃＡ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、ＨｅｘＡ残基がＧｌｃＡ残基である上記二糖単位の総量に対する、ＨｅｘＡ残基が３－Ｏ－硫酸化されたＧｌｃＡ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
　Ｒ３は、水素（－Ｈ）、硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）、またはアセチル基（－ＣＯＣＨ３）を示す。Ｒ３の少なくとも一部は硫酸基である。Ｒ３における硫酸基の比率（「Ｎ－硫酸化率」ともいう）は、例えば、６０％以上、７０％以上、または８０％以上であってもよく、１００％以下、９５％以下、または９０％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ－硫酸化率は、具体的には、例えば、７０％～１００％、または８０％～９５％であってもよい。Ｒ３におけるアセチル基の比率（「Ｎ－アセチル化率」ともいう）は、例えば、０％以上、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ－アセチル化率は、具体的には、例えば、０％～３３％、１％～３３％、７％～３３％、７％～３０％、または１１％～１７％であってもよい。Ｎ－硫酸化率およびＮ－アセチル化率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、Ｎ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＧｌｃＮ残基がＮ－硫酸化されたＧｌｃＮ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。また、Ｎ－アセチル化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＧｌｃＮ残基がＮ－アセチル化率されたＧｌｃＮ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。Ｒ３が水素、硫酸基、またはアセチル基であるＧｌｃＮ残基の位置は特に制限されない。例えば、特に、還元末端のＧｌｃＮ残基においてＲ３が水素またはアセチル基であってもよい。すなわち、例えば、Ｒ３が水素またはアセチル基であるＧｌｃＮ残基の５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％が、還元末端に存在していてもよい。
　Ｒ４は、水素（－Ｈ）または硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）を示す。Ｒ４における硫酸基の比率（「ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率」または単に「３－Ｏ－硫酸化率」ともいう）は、１３％以上である。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、例えば、４５％以下、４０％以下、または３３％以下であってもよい。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、具体的には、例えば、１３％～４５％、１３％～４０％、または１３％～３３％であってもよい。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＧｌｃＮ残基が３－Ｏ－硫酸化されたＧｌｃＮ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
　Ｒ５は、水素（－Ｈ）または硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）を示す。Ｒ５の少なくとも一部は硫酸基である。Ｒ５における硫酸基の比率（「ＧｌｃＮ残基の６－Ｏ－硫酸化率」または単に「６－Ｏ－硫酸化率」ともいう）は、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよく、１００％以下、または９５％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。６－Ｏ－硫酸化率は、具体的には、例えば、５０～１００％、６０～１００％、または７０～１００％であってもよい。６－Ｏ－硫酸化率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、６－Ｏ－硫酸化率は、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、上記二糖単位の総量に対する、ＧｌｃＮ残基が６－Ｏ－硫酸化されたＧｌｃＮ残基である上記二糖単位の量の比率（モル比）として算出できる。
　本発明の多糖は、具体的には、例えば、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ）、ＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、およびＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）から選択される１またはそれ以上、例えば全て、の二糖単位を含んでいてよい。本発明の多糖におけるＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ）、ＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、およびＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総含有率は、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であってよい。上記総含有率は、例えば、二糖分析により測定することができる。すなわち、上記総含有率は、例えば、本発明の多糖を二糖分析に供した際の、二糖の総量に対するＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ）、ＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、およびＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量の比率（モル比）として算出できる。なお、このような二糖単位の表記において、括弧内に置換基の位置と種類を付記し、括弧内に付記されないＲ１～Ｒ５は水素（－Ｈ）を示す。
　本発明の多糖は、抗凝固活性を有する。抗凝固活性とは、具体的には、抗凝血活性を意味する。抗凝固活性としては、Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性やＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性が挙げられる。本発明の多糖は、例えば、少なくともＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性を有していてよい。本発明の多糖におけるＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性は、例えば、１００ＩＵ／ｍｇ以上、２００ＩＵ／ｍｇ以上、３００ＩＵ／ｍｇ以上、または４００ＩＵ／ｍｇ以上であってよい。また、本発明の多糖におけるＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性は、上限は特にないが、例えば、５０００ＩＵ／ｍｇ以下、２０００ＩＵ／ｍｇ以下、または１０００ＩＵ／ｍｇ以下であってもよい。また、本発明の多糖は、高いＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性／Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性比を有していてよい。本発明の多糖におけるＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性／Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性比は、例えば、１．５以上、２以上、２．５以上、または３以上であってよい。また、本発明の多糖におけるＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性／Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性比は、上限は特にないが、例えば、５０以下、２０以下、または１０以下であってもよい。Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性およびＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性は、いずれも、常法により測定することができる。Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性およびＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性の測定法として、具体的には、例えば、実施例に記載の方法が挙げられる。
　本発明の多糖は、フリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの混合物であってもよい。すなわち、「本発明の多糖（例えばヘパラン硫酸）」という用語は、特記しない限り、フリー体の多糖、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味する。すなわち、本発明の多糖に存在する塩を形成し得る官能基は、いずれも、特記しない限り、フリー体であってもよく、塩を形成していてもよく、それらの組み合わせであってもよい。具体的には、例えば、一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）における塩を形成し得る官能基は、いずれも、特記しない限り、フリー体であってもよく、塩を形成していてもよく、それらの組み合わせであってもよい。一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）における塩を形成し得る官能基としては、Ｒ１～Ｒ５の硫酸基（－ＳＯ３Ｈ）、Ｒ３が水素（－Ｈ）である場合のＧｌｃＮ残基のアミノ基（－ＮＨ２）、ＨｅｘＡ残基のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）が挙げられる。すなわち、例えば、「硫酸基」という用語は、特記しない限り、フリー体の硫酸基、もしくは塩を形成した硫酸基、またはそれらの組み合わせを示す。当該硫酸基についての説明は、塩を形成し得る他の官能基にも準用できる。塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられる。薬理学的に許容される塩は、本発明の多糖の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。薬理学的に許容される塩としては、以下のようなものが挙げられる。すなわち、例えば、硫酸基等の酸性基に対する塩としては、具体的には、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。塩は、例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩から選択されてもよい。なお、塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
＜２＞本発明の多糖の製造法
　本発明の多糖を製造する手法は特に制限されない。本発明の多糖は、例えば、他の多糖からの誘導により（すなわち、他の多糖を原料として）製造することができる。他の多糖としては、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が挙げられる。ＧＡＧとしては、Ｎ－アセチルヘパロサン（単に「ヘパロサン」ともいう）や本発明の多糖以外のヘパラン硫酸が挙げられる。ヘパロサンは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）－β－ＧｌｃＡ－（１→４）－α－ＧｌｃＮＡｃ－（１→］より構成される多糖である。他の多糖を原料とする本発明の多糖の製造は、例えば、物理的手法、化学的手法、酵素法、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。具体的には、他の多糖を原料として、例えば、所定の分子量への調整、所定の比率での異性化、所定の比率での官能基の導入または除去、またはそれらの組み合わせにより、本発明の多糖を製造することができる。また、本発明の多糖は、単糖等の原料から全合成することもできる。
　以下、ヘパロサンから本発明の多糖を製造する方法の一例を説明する。
　本発明の多糖は、例えば、ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化した後にヘパリナーゼＩＩＩで低分子化し、生成した低分子化物を本発明の多糖に変換することにより、製造することができる。すなわち、本発明の多糖を製造する方法としては、（Ａ）ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化する工程、（Ｂ）前記工程Ａによる生成物をヘパリナーゼＩＩＩで低分子化する工程、および（Ｃ）前記工程Ｂによる生成物から本発明の多糖を生成する工程、を含む、方法が挙げられる。工程Ａを「Ｎ－脱アセチル化工程」、工程Ｂを「低分子化工程」、工程Ｃを「ヘパラン硫酸生成工程」ともいう。この方法によれば、特に、所望の平均分子量を有する本発明の多糖を効率よく製造することができる。
＜２－１＞ヘパロサンの製造
　ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン生産能を有する細菌（「ヘパロサン生産菌」ともいう）を利用した発酵法により製造できる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。
　本発明において、「ヘパロサン生産能を有する細菌（ヘパロサン生産菌）」とは、培地で培養したときに、ヘパロサンを生成し、回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、５０ｍｇ／Ｌ以上、１００ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上、または３００ｍｇ／Ｌ以上の量のヘパロサンを培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
　細菌の種類は特に制限されない。細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔらの著書（Ｂａｃｋｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．１９９６．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２，ｐ．２４６０－２４８８．Ｔａｂｌｅ　１．Ｉｎ　Ｆ．Ｄ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ（ｅｄ．），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ　２７３２５）やＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ　４７０７６）等のエシェリヒア・コリＫ－１２株；エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ　２３５０６）；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株；およびそれらの派生株が挙げられる。
　これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１０８，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号Ｃ６０００－０３）。
　ヘパロサン生産能を有する細菌は、本来的にヘパロサン生産能を有するものであってもよく、ヘパロサン生産能を有するように改変されたものであってもよい。本来的にヘパロサン生産能を有する細菌としては、エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ　２３５０６）が挙げられる。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にヘパロサン生産能を付与することにより取得できる。また、本来的にヘパロサン生産能を有する細菌を、ヘパロサン生産能が増大するよう改変して用いてもよい。
　ヘパロサン生産能は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、付与できる。ヘパロサン生産に関与するタンパク質としては、グリコシルトランスフェラーゼやヘパロサン排出担体タンパク質が挙げられる。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。遺伝子の導入は、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。
　ここでいう「グリコシルトランスフェラーゼ」とは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）および／またはグルクロン酸（ＧｌｃＡ）を糖鎖非還元末端に付加し、ヘパロサン鎖を伸長する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「グリコシルトランスフェラーゼ活性」ともいう。グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、ｋｆｉＡ遺伝子、ｋｆｉＣ遺伝子、ｐｍＨＳ１遺伝子が挙げられる。
　ｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡ遺伝子がコードするＫｆｉＡタンパク質は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを基質として、ＧｌｃＮＡｃを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＣ遺伝子がコードするＫｆｉＣタンパク質は、ＵＤＰ－ＧｌｃＡを基質として、ＧｌｃＡを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡおよびｋｆｉＣ遺伝子は、ｋｆｉＢおよびｋｆｉＤ遺伝子とともに、ｋｆｉＡＢＣＤオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ２ともいう）を構成する。エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡＢＣＤオペロンを含む領域の塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列中、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ、ｋｆｉＤ遺伝子は、それぞれ、４４５～１１６４位の配列、１５９３～３２８４位の配列、４５７６～６１３８位の配列、６１８０～７３５８位の配列に相当する。エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＡ、ＫｆｉＢ、ＫｆｉＣ、ＫｆｉＤタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２～５に示す。
　ｐｍＨＳ１遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ　タイプＤ株のｐｍＨＳ１遺伝子が挙げられる。パスツレラ・ムルトシダ　タイプＤ株のｐｍＨＳ１遺伝子がコードするＰｍＨＳ１タンパク質は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃおよびＵＤＰ－ＧｌｃＡの両方を基質として、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＡを交互に糖鎖非還元末端に付加する。
　ここでいう「ヘパロサン排出担体タンパク質」とは、細胞膜を通してヘパロサン鎖を細胞外へ排出する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「ヘパロサン排出活性」ともいう。ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子としては、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子が挙げられる。ｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株やエシェリヒア・コリＢ株のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子が挙げられる。これらの株のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、およびｋｐｓＳ遺伝子は、ｋｐｓＦおよびｋｐｓＵ遺伝子とともに、ｋｐｓＦＥＤＵＣＳオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ１ともいう）を構成する。また、これらの株のｋｐｓＭおよびｋｐｓＴ遺伝子は、ｋｐｓＭＴオペロン（Ｒｅｇｉｏｎ３ともいう）を構成する。
　導入する遺伝子は、用いる細菌の種類等に応じて適宜選択できる。すなわち、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を有するように細菌を改変することにより、細菌にヘパロサン生産能を付与することができる。例えば、エシェリヒア・コリＢ株は、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子を有するが、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリＢ株にヘパロサン生産能を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ－１２株は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ－１２株にヘパロサン生産能を付与することができる。
　すなわち、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子を導入した株；Ｗ３１１０株やＭＧ１６５５株等のエシェリヒア・コリＫ－１２株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子、ならびにエシェリヒア・コリＫ５株またはエシェリヒア・コリＢ株由来のｋｐｓＣ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＳ、およびｋｐｓＴ遺伝子を導入した株；ならびにそれらの派生株が挙げられる。エシェリヒア・コリＢ株にエシェリヒア・コリＫ５株由来のｋｆｉＡ遺伝子およびｋｆｉＣ遺伝子を導入した株として、具体的には、例えば、実施例に記載のエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９－ｋｆｉＡＢＣＤ（ＷＯ２０１５／０５０１８４）が挙げられる。
　また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、同細菌がもともと有する遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株を、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＢ株を、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。
　また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産能を損なわない限り、その他の改変がなされていてもよい。例えば、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＤ、ｋｐｓＦ、およびｋｐｓＵ遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入の際には、Ｒｅｇｉｏｎ２をまとめて導入してもよく、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の導入の際には、Ｒｅｇｉｏｎ１～３をまとめて導入してもよい。ｋｆｉＢ遺伝子およびｋｆｉＤ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＢ遺伝子およびｋｆｉＤ遺伝子が挙げられる。ｋｐｓＦ遺伝子およびｋｐｓＵ遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ５株やエシェリヒア・コリＢ株のｋｐｓＦ遺伝子およびｋｐｓＵ遺伝子が挙げられる。
　また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ｒｂｓＲ、ｒｂｓＫ、ｒｂｓＢ、ｈｓｒＡ、ｇｌｇＢ、ｇｌｇＸ、ｍｉｃＦ、ｒｃｓＤ、ｒｃｓＢ、ｙｂｉＸ、ｙｂｉＩ、ｙｂｉＪ、ｙｂｉＣ、ｙｂｉＢ、ｒｆａＨ、ｎｕｓＧ、ｐｃｏＲ、ｐｃｏＳ、ｐｃｏＥ、ｙｈｃＮ、ｙｈｃＯ、ａａｅＢ、ａａｅＡ、ａａｅＸ、ｇ１４５５、ａｌｐＡ、ｇ１４５３、ｙｒｂＡ、ｍｌａＢ、ｍｌａＣ、ｍｌａＤ、ｍｌａＥ、ｍｌａＦ、ｙｒｂＧ、ｎｏｒＷ、ｙｂｊＩ、ｙｂｊＪ、ｙｂｊＫ、ｒｙｂＢ、ｙｊｊＹ、ｙｊｔＤ、ｔｈｒＬ、ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｆｒｕＡ、ｐｓｕＫ、ｙｔｆＴ、ｙｊｆＦ、ｆｂｐ、ｙａｇＵ、ｐａｏＡ、ｐａｏＢ、ｇｓｉＣ、ｇｓｉＤ、ｙｌｉＥ、ｉｒｐ２、ｉｒｐ１、ｂｈｓＡ、ｙｃｆＳ、ｌｅｐＢ、ｒｎｃ、ｅｒａ、ｄａｐＡ、ｇｃｖＲ、ｂｃｐ、ｈｙｆＡ、ｒｐｏＥ、ｎａｄＢ、ｙｆｉＣ、ｓｒｍＢ、ｇ１４１４、ｇ１４１３、ｎｕｏＥ、ｎｕｏＦ、ｎｕｏＧ、ｇｌｍＺ、ｈｅｍＹ、ｈｅｍＸ、ｈｅｍＤ、ｒｌｍＬ、ａｒｔＱ、ａｒｔＭ、ａｒｔＪ、ｒｌｍＣ、ｙｂｊＯ、ｙｅｊＯ、ｙｅｊＭ、ｙｅｊＬ、ｒｐｏＳ、ｙｇｂＮ、ｙｇｂＭ、ｙｇｂＬ、ｇ３７９８、ｇ３７９７、ｇ３７９６、ｇ３７９５、ｇ３７９４、ｇ３７９３、ｇ３７９２、ｒｙｊＡ、ｓｏｘＲ、ｓｏｘＳ、ｙｊｃＣ、ｙｊｃＢ、ｅｆｅＵ、ｅｆｅＯ、ｓｌｙＡ、ｈｎｓ、ｐｇｍ、ｇａｌＦ、ｕｇｄ、ｇｌｍＵ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＭ、およびｒｃｓＡ遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるように改変されていてもよい（ＷＯ２０１５／０５０１８４、公開技報番号２０１５－５０１７７５）。これらの遺伝子としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ＭＧ１６５５株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｋ５株等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの遺伝子や、その他各種細菌の遺伝子が挙げられる。
　「遺伝子の発現が増強される」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が増強される」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。遺伝子の発現は、例えば、遺伝子のコピー数を増大させることや、遺伝子の転写や翻訳を増大させることにより、増強することができる。遺伝子のコピー数は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを宿主に導入することや、同遺伝子を宿主の染色体上に導入することにより、増大させることができる。導入する遺伝子は、例えば、同遺伝子を有する生物からのクローニングや、化学合成により、取得できる。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。遺伝子の転写や翻訳は、プロモーターやＳＤ配列等の遺伝子の発現調節配列を改変することにより、増大させることができる。
　ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等の公用データベースや、ＷＯ２０１５／０５０１８４や公開技報番号２０１５－５０１７７５等の文献から取得できる。
　なお、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。バリアントとしては、公知の遺伝子のホモログや人為的改変体が挙げられる。「元の機能が維持された」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼにあっては、タンパク質のバリアントがグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することをいい、ヘパロサン排出担体タンパク質にあっては、タンパク質のバリアントがヘパロサン排出活性を有することをいう。例えば、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個（例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列に対して、例えば、５０％以上、６５％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このようなバリアントについての記載は、ヘパリナーゼＩＩＩ等の他のタンパク質やそれをコードする遺伝子にも準用できる。
　ヘパロサン生産菌を培養することにより、培地中にヘパロサンが蓄積する。ヘパロサン生産菌の培養条件は、所望の量のヘパロサンが得られる限り、特に制限されない。ヘパロサン生産菌の培養条件は、ヘパロサン生産に関与する遺伝子の発現系の構成や宿主の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。培養は、例えば、炭素源、窒素源、微量栄養素等の各種有機成分や無機成分を含有する液体培地を用いて、３０～３７℃で、１６～７２時間、好気的に実施することができる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。
　ヘパロサンは、培養液に含まれたままＮ－脱アセチル化工程に供してもよく、培養液から回収してからＮ－脱アセチル化工程に供してもよい。培養液からヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。例えば、培養液から培養上清を分離し、次いで、エタノールやメタノール等の水と混和する有機溶媒の添加により上清中のヘパロサンを沈降させ、回収することができる（ＷＯ２０１５／０５０１８４）。添加する有機溶媒の量は、例えば、上清液量の２．５～３．５倍量であってよい。ヘパロサンは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、Ｎ－脱アセチル化工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
＜２－２＞Ｎ－脱アセチル化工程
　Ｎ－脱アセチル化工程は、ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化する工程である。Ｎ－脱アセチル化工程により部分的にＮ－脱アセチル化されたヘパロサンが生成する。Ｎ－脱アセチル化工程による生成物（部分的にＮ－脱アセチル化されたヘパロサン）を「Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン」ともいう。「ヘパロサンを部分的にＮ－脱アセチル化する」とは、ヘパロサンのＮ－アセチル基の一部が残存するように、ヘパロサンをＮ－脱アセチル化することをいう。ヘパロサンのＮ－アセチル基の一部を残存させることにより、低分子化工程においてＮ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断することができ、以て、所望の平均分子量を有する本発明の多糖を効率よく製造することができる。Ｎ－脱アセチル化の程度は、本発明の多糖を製造できる限り、特に制限されない。Ｎ－脱アセチル化工程は、例えば、Ｎ－アセチル基の残存率が下記のような値となるように実施することができる。すなわち、Ｎ－アセチル基の残存率は、例えば、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ－アセチル基の残存率は、具体的には、例えば、１％～３３％、７％～３３％、７％～３０％、または１１％～１７％であってもよい。例えば、Ｎ－アセチル基の残存率７％～３０％は、概ね、Ｎ－アセチル基が６～２８糖残基に１つ（二糖単位として３～１４単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。また、例えば、Ｎ－アセチル基の残存率１１％～１７％は、概ね、Ｎ－アセチル基が１２～１８糖残基に１つ（二糖単位として６～９単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。Ｎ－脱アセチル化の程度（すなわちＮ－アセチル基の残存率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。Ｎ－アセチル基の残存率は、上述したＮ－アセチル化率として測定できる。
　なお、残存するＮ－アセチル基は、低分子化工程後に適宜除去してもよい。例えば、低分子化工程後のいずれかのタイミングで、さらにＮ－脱アセチル化を実施してもよいし、さらにＮ－脱アセチル化とＮ－硫酸化を実施してもよい。
　Ｎ－脱アセチル化工程を実施する手段は、所望のＮ－脱アセチル化の程度が得られる限り、特に制限されない。Ｎ－脱アセチル化工程は、例えば、脱アセチル化剤を利用して化学的に実施できる。脱アセチル化剤としては、水酸化ナトリウムやヒドラジンが挙げられる。
　水酸化ナトリウムを利用したＮ－脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，（２００３）“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ｈｅｐａｒａｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：５２６１３－５２６２１．やＵＳ２０１１２８１８２０Ａ１）の条件を参照することができる。すなわち、Ｎ－脱アセチル化は、例えば、ヘパロサンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、加熱することにより実施できる。各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間は、所望のＮ－脱アセチル化の程度が得られるように、適宜設定することができる。ヘパロサン濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）～５０％（ｗ／ｖ）であってよい。水酸化ナトリウム濃度は、例えば、１Ｍ～５Ｍであってよい。反応温度は、例えば、４０～８０℃であってよい。反応時間は、例えば、５分～３０時間であってよい。
　ヒドラジンを利用したＮ－脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（［１］Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（２０００）１５９－１７１　［２］Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９０（１９９６）８７－９６　［３］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７（１９８４）１８７－１９７）の条件を参照することができる。また、ヒドラジンを利用したＮ－脱アセチル化の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。すなわち、Ｎ－脱アセチル化は、例えば、ヘパロサンを、硫酸または硫酸ヒドラジンを含有するヒドラジン水溶液に溶解し、気相を窒素等の不活性ガスで置換し、加熱することにより実施できる。ヒドラジンとしては、無水ヒドラジンやヒドラジン１水和物が挙げられる。例えば、ヒドラジン１水和物を、そのまま、あるいは適宜希釈して、ヒドラジン水溶液として利用してよい。加熱後、氷冷により反応を停止することができる。次いで、ヨウ素により糖鎖末端を還元できる。各成分の反応系での濃度、反応温度、反応時間は、所望のＮ－脱アセチル化の程度が得られるように、適宜設定することができる。ヘパロサン濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）～５０％（ｗ／ｖ）であってよい。ヒドラジン濃度は、例えば、１０％（ｗ／ｖ）～７０％（ｗ／ｖ）であってよい。硫酸または硫酸ヒドラジン濃度は、例えば、０．０１Ｍ～０．１Ｍであってよい。反応温度は、例えば、６０～１１８℃であってよい。反応時間は、例えば、５分～２０時間であってよい。具体的には、例えば、実施例に記載の条件でＮ－脱アセチル化を実施する場合、反応時間は、例えば、４～５時間であってもよい。
　このようにしてＮ－脱アセチル化を実施することにより、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンが生成する。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、Ｎ－脱アセチル化工程の反応液に含まれたまま低分子化工程に供してもよく、反応液から回収して低分子化工程に供してもよい。反応液からＮ－脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、適宜、精製、中和、脱塩、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、低分子化工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
＜２－３＞低分子化工程
　低分子化工程は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩＩで切断し、低分子化する工程である。低分子化工程により低分子化されたＮ－脱アセチル化ヘパロサンが生成する。低分子化工程による生成物（低分子化されたＮ－脱アセチル化ヘパロサン）を「低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン」ともいう。低分子化の程度は、本発明の多糖を製造できる限り、特に制限されない。低分子化工程は、例えば、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの平均分子量が後述する本発明の多糖の平均分子量（例えば、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００～１５００００、好ましくは、８０００～６００００の数平均分子量（Ｍｎ）および２０００～３０００００、好ましくは、１００００～１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ））となるように実施することができる。
　低分子化の程度は、例えば、分子量を測定することにより確認することができる。分子量の測定は常法により実施できる。分子量の測定法としては、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＧＰＣ）および紫外可視吸光度検出器（ＵＶ）および示差屈折率検出器（ＲＩ）を使用した水系サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＳＥＣ－ＲＩ／ＵＶ法、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）準拠）が挙げられる。ＧＰＣによる分子量の測定条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの数平均分子量（Ｍｎ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、１０００～１５００００、３０００～３６０００、または４０００～２６０００であってよく、あるいは、５０００～３６０００、または１２０００～２６０００であってよい。低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの重量平均分子量（Ｍｗ）は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、例えば、２０００～３０００００、５０００～６００００、６０００～７００００、または９０００～３５０００であってよく、あるいは、７０００～６００００、または１７０００～３５０００であってよい。また、後述する硫酸化工程等のヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後に分子量を測定して、低分子化の程度を確認することもできる。ヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後に分子量を測定する場合は、実施した工程に応じた分子量の変動を考慮することができる。ヘパラン硫酸生成工程の一部または全部を実施した後の生成物の分子量を測定する場合、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、同生成物の数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、１０００～１５００００、２０００～１０００００、４０００～８００００、７０００～４２０００、または１５０００～３００００であってよく、同生成物の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、２０００～３０００００、５０００～１５００００、５０００～１０００００、８０００～７００００、８０００～４１０００、または２１０００～４１０００であってよい。
　「ヘパリナーゼＩＩＩ」とは、ヘパロサン等のグリコサミノグリカンの、Ｎ－硫酸化またはＮ－アセチル化されたグルコサミン残基の部位を切断する酵素（典型的には、ＥＣ　４．２．２．８）をいう。本発明において用いられるヘパリナーゼＩＩＩは、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの、Ｎ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断できるものであれば、特に制限されない。「Ｎ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を、Ｎ－アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位よりも優先的に切断することをいう。「Ｎ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断する」とは、Ｎ－アセチル基を有するグルコサミン残基の部位は切断するが、Ｎ－アセチル基を有さないグルコサミン残基の部位は実質的に切断しないことであってもよい。「グルコサミン残基の部位を切断する」とは、グルコサミン残基とその下流（還元末端側）のグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基との間のα－１，４グリコシド結合を切断することをいう。
　ヘパリナーゼＩＩＩの由来は特に制限されず、微生物、動物、植物等いずれの由来のものを用いてもよい。また、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、公知のヘパリナーゼＩＩＩのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。ヘパリナーゼＩＩＩとして、具体的には、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ等の細菌のヘパリナーゼＩＩＩが挙げられる。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ＡＴＣＣ　１３１２５のヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列およびヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号１６および１７にそれぞれ示す。
　ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリナーゼＩＩＩをコードする遺伝子（ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子）を有する宿主に同遺伝子を発現させることにより製造できる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を、ヘパリナーゼＩＩＩを有する宿主ともいう。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主は、本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するものであってもよく、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主としては、上記のようなヘパリナーゼＩＩＩが由来する細菌が挙げられる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有するように改変された宿主としては、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子が導入された宿主が挙げられる。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を導入する宿主は、機能するヘパリナーゼＩＩＩを発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。細菌としては、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌やコリネ型細菌が挙げられる。腸内細菌科の細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。また、本来的にヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子の発現が増強されるよう改変して用いてもよい。ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主を培養することにより、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を発現させることができ、ヘパリナーゼＩＩＩを含有する培養物が得られる。宿主の培養条件は、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子の発現系の構成や宿主の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。
　また、ヘパリナーゼＩＩＩは、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　また、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、市販品を用いることもできる。
　ヘパリナーゼＩＩＩは、培養物等に含まれたまま使用してもよく、培養物等から回収してから使用してもよい。すなわち、ヘパリナーゼＩＩＩとしては、精製されたヘパリナーゼＩＩＩ（精製酵素）を使用してもよく、ヘパリナーゼＩＩＩを含有する任意の画分を使用してもよい。ヘパリナーゼＩＩＩの回収は、タンパク質を分離精製する公知の手法により実施することができる。ヘパリナーゼＩＩＩは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパリナーゼＩＩＩは、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。ヘパリナーゼＩＩＩを含有する画分は、ヘパリナーゼＩＩＩがＮ－脱アセチル化ヘパロサンに作用できるように含有される限り特に制限されない。ヘパリナーゼＩＩＩを含有する画分としては、ヘパリナーゼＩＩＩ遺伝子を有する宿主の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）が挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよく、精製されたヘパリナーゼＩＩＩと共に利用されてもよい。
　低分子化工程は、ヘパリナーゼＩＩＩをＮ－脱アセチル化ヘパロサンに作用させることにより、実施できる。ヘパリナーゼＩＩＩをＮ－脱アセチル化ヘパロサンに作用させることは、具体的には、ヘパリナーゼＩＩＩとＮ－脱アセチル化ヘパロサンとを反応液中に共存させることにより達成できる。すなわち、低分子化工程は、適当な反応液中で実施できる。低分子化工程は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、ヘパリナーゼＩＩＩとＮ－脱アセチル化ヘパロサンとを混合することにより、低分子化工程を実施できる。低分子化工程は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体または固定化酵素を充填したカラムにＮ－脱アセチル化ヘパロサンを含有する反応液を通液することにより、低分子化工程を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。
　反応液は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンに加えて、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン以外の成分を必要に応じて含有してよい。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン以外の成分としては、金属イオンやｐＨ緩衝剤が挙げられる。反応液に含有される成分の種類や濃度は、用いるヘパリナーゼＩＩＩの性質等の諸条件に応じて適宜設定できる。
　低分子化工程の条件（反応液のｐＨ、反応温度、反応時間、各種成分の濃度等）は、所望の低分子化の程度が得られる限り特に制限されない。すなわち、反応条件は、所望の低分子化の程度が得られるように、適宜設定することができる。反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。反応液中のＮ－脱アセチル化ヘパロサンの濃度は、例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）～５０％（ｗ／ｖ）であってよい。反応液中のヘパリナーゼＩＩＩ濃度は、例えば、６．３ＩＵ／Ｌ～６．３×１０４ＩＵ／Ｌ、または６．３×１０１ＩＵ／Ｌ～６．３×１０３ＩＵ／Ｌであってよい。反応液のｐＨは、例えば、通常６．０～１０．０、好ましくは６．５～９．０であってよい。反応温度は、例えば、通常１５～５０℃、好ましくは１５～４５℃、より好ましくは２０～４０℃であってよい。反応時間は、例えば、通常５分～２０時間、好ましくは１０分～１０時間であってよい。具体的には、例えば、実施例に記載の条件で低分子化を実施する場合、反応時間は、例えば、５～１０時間であってもよい。カラム法の場合、反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
　ヘパリナーゼＩＩＩの活性は、例えば、ヘパロサンを基質としてｐＨ７．０、３７℃で酵素反応を実施し、酵素および基質依存的な不飽和ヘキスロン酸の生成に基づいて測定できる。不飽和ヘキスロン酸の生成は、Ａ２３２ｎｍの増加として測定できる。１分間に１μｍｏｌの不飽和ヘキスロン酸を生成する酵素量を１国際単位（ＩＵ）と定義する。
　低分子化工程の過程において、ヘパリナーゼＩＩＩ、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応液に供給してもよい。これらの成分は、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。
　また、反応条件は、低分子化工程の開始から終了まで均一であってもよく、低分子化工程の過程において変化してもよい。「反応条件が低分子化工程の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で低分子化工程を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
　このようにして低分子化工程を実施することにより、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンが生成する。低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、低分子化工程の反応液に含まれたままヘパラン硫酸生成工程に供してもよく、反応液から回収してヘパラン硫酸生成工程に供してもよい。反応液から低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段は、特に制限されない。低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、ヘパラン硫酸生成工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
＜４＞ヘパラン硫酸生成工程
　ヘパラン硫酸生成工程は、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンから本発明の多糖を生成する工程である。ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを、Ｎ－硫酸化、Ｃ５－エピメリ化、２－Ｏ－硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化、および６－Ｏ－硫酸化する工程から選択される１またはそれ以上、例えば全て、の工程を含んでいてよい。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類は、本発明の多糖の構造に応じて適宜設定できる。ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、少なくとも、Ｎ－硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化、および６－Ｏ－硫酸化の工程を含んでいてよい。
　ヘパラン硫酸生成工程に含まれる各工程の実施順序は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる各工程の実施順序は、各工程を実施する手段や各工程に用いられる酵素の基質特異性等の諸条件に応じて適宜設定できる。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程は、それぞれ別個に実施してもよく、そうでなくてもよい。すなわち、ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の一部または全部を、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。
　ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、下記工程Ｃ１およびＣ３の順に実施されてよい：
（Ｃ１）Ｎ－硫酸化；
（Ｃ３）ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化および６－Ｏ－硫酸化。
　ヘパラン硫酸生成工程は、例えば、下記工程Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３の順に実施されてよい：
（Ｃ１）Ｎ－硫酸化；
（Ｃ２）Ｃ５－エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化；
（Ｃ３）ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化および６－Ｏ－硫酸化。
　工程Ｃ２は、Ｃ５－エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化の順に実施されてもよいし、２－Ｏ－硫酸化およびＣ５－エピメリ化の順に実施されてもよい。また、工程Ｃ２において、Ｃ５－エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化は、一部または全部の期間において同時に実施されてもよい。
　工程Ｃ３は、例えば、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化および６－Ｏ－硫酸化の順に実施されてもよく、６－Ｏ－硫酸化およびＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化の順に実施されてもよい。
　以下、特記しない限り、ヘパラン硫酸生成工程が、Ｎ－硫酸化、Ｃ５－エピメリ化、２－Ｏ－硫酸化、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化、および６－Ｏ－硫酸化の順に実施されることを前提として、各工程について説明する。ヘパラン硫酸生成工程に含まれる工程の種類および各工程の実施順序がそれとは異なる場合は、選択した工程の種類および設定した実施順序に応じて適宜説明を読み替えることができる。
　Ｎ－硫酸化は、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのアミノ基を硫酸化する工程である。Ｎ－硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することができる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。Ｎ－硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。Ｎ－硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ　Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，（２００３）“Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ｈｅｐａｒａｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：５２６１３－５２６２１．；ＵＳ８２２７４４９Ｂ２（Ｊｕｌ．２４、２０１２））の条件を参照することができる。また、Ｎ－硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。Ｎ－硫酸化の程度は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、Ｎ－硫酸化は、例えば、上記例示したＮ－硫酸化率が得られるように実施することができる。また、Ｎ－硫酸化は、例えば、Ｎ－脱アセチル化されたグルコサミン残基の９０％以上、９５％以上、９９％以上、または全てがＮ－硫酸化されるように実施することができる。Ｎ－硫酸化の程度（すなわちＮ－硫酸化率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。
　Ｃ５エピメリ化は、Ｎ－硫酸化による生成物中のグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基をイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基へ異性化する工程である。Ｃ５エピメリ化は、例えば、Ｃ５－エピメラーゼを利用して酵素的に実施することができる。Ｃ５－エピメラーゼは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基のイズロン酸（ＩｄｏＡ）残基への異性化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、Ｃ５エピメリ化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有するＣ５－エピメラーゼを選択して用いてもよい。Ｃ５－エピメラーゼは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。Ｃ５－エピメラーゼとしては、例えば、ヒトのＣ５－エピメラーゼを利用することができる。また、Ｃ５－エピメラーゼとしては、公知のＣ５－エピメラーゼのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。Ｃ５－エピメラーゼの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。Ｃ５エピメリ化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。Ｃ５エピメリ化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００５　Ｄｅｃ　３０；２８０（５２）：４２８１７－２５．）の条件を参照することができる。また、Ｃ５エピメリ化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。Ｃ５エピメリ化の程度は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、Ｃ５エピメリ化は、上記例示したエピメリ化率が得られるように実施することができる。
　２－Ｏ－硫酸化は、Ｃ５エピメリ化による生成物中のＩｄｏＡ残基の２－Ｏ位を硫酸化する工程である。２－Ｏ－硫酸化は、例えば、２－Ｏ－硫酸化酵素（２－ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。２－ＯＳＴは、ＩｄｏＡ残基の２－Ｏ位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。２－ＯＳＴは、さらに、ＧｌｃＡ残基の２－Ｏ位の硫酸化を触媒できてもよい。２－ＯＳＴは、さらに、Ｃ４－Ｃ５間の結合が二重結合であるＨｅｘＡ残基の２－Ｏ位の硫酸化を触媒できてもよい。また、２－Ｏ－硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する２－ＯＳＴを選択して用いてもよい。２－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。２－ＯＳＴとしては、例えば、ハムスターの２－ＯＳＴを利用することができる。また、２－ＯＳＴとしては、公知の２－ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。２－ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。２－Ｏ－硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。２－Ｏ－硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００５　Ｄｅｃ　３０；２８０（５２）：４２８１７－２５．）の条件を参照することができる。また、２－Ｏ－硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。２－Ｏ－硫酸化の程度は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、２－Ｏ－硫酸化は、上記例示した２－Ｏ－硫酸化率が得られるように実施することができる。
　Ｃ５－エピメラーゼによるＧｌｃＡ残基のＩｄｏＡ残基への異性化は、可逆平衡反応である。すなわち、Ｃ５－エピメラーゼを利用してＣ５エピメリ化を実施する場合、Ｃ５エピメリ化により生成したＩｄｏＡ残基の一部はＧｌｃＡ残基へ再度変換され得る。一方、２－Ｏ－硫酸化されたヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基は、一般的に、Ｃ５－エピメラーゼの基質とならない。よって、例えば、Ｃ５エピメリ化と２－Ｏ－硫酸化をカップリングして実施することにより、Ｃ５エピメリ化により生成したＩｄｏＡ残基を逐次２－Ｏ－硫酸化することができ、以て、ＩｄｏＡ残基がＧｌｃＡ残基へ再度変換されるのを阻止することができる。したがって、Ｃ５エピメリ化と２－Ｏ－硫酸化をカップリングして実施することにより、例えば、Ｃ５エピメリ化率を高めることができる。このように、Ｃ５エピメリ化と２－Ｏ－硫酸化を、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。例えば、Ｎ－硫酸化による生成物と、Ｃ５－エピメラーゼおよび２－ＯＳＴとを反応系に共存させることにより、Ｃ５エピメリ化と２－Ｏ－硫酸化をまとめて実施することができる。Ｃ５エピメリ化と２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応の条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。
　６－Ｏ－硫酸化は、２－Ｏ－硫酸化による生成物中のＮ－硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基の６－Ｏ位を硫酸化する工程である。
　６－Ｏ－硫酸化は、例えば、６－Ｏ－硫酸化酵素（６－ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。６－ＯＳＴは、Ｎ－硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）残基のＯ－６位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、６－Ｏ－硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する６－ＯＳＴを選択して用いてもよい。６－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。６－ＯＳＴとしては、６－ＯＳＴ－１、６－ＯＳＴ－２、６－ＯＳＴ－３が挙げられる。６－ＯＳＴとしては、例えば、ハムスターの６－ＯＳＴ－１やマウスの６－ＯＳＴ－３を利用することができる。また、６－ＯＳＴとしては、公知の６－ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。６－ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。６－Ｏ－硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。６－ＯＳＴを利用した６－Ｏ－硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００５　Ｄｅｃ　３０；２８０（５２）：４２８１７－２５．）の条件を参照することができる。
　６－Ｏ－硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することもできる。硫酸化試薬としては、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。６－Ｏ－硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。硫酸化試薬を利用した６－Ｏ－硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（ＵＳ８２２７４４９Ｂ２（Ｊｕｌ．２４、２０１２））の条件を参照することができる。また、硫酸化試薬を利用した６－Ｏ－硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。硫酸化試薬を利用した６－Ｏ－硫酸化は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒中で実施することができる。６－Ｏ－硫酸化の反応温度は、例えば、－２０℃～５℃、好ましくは－２０℃～０℃であってよい。６－Ｏ－硫酸化に使用する硫酸化試薬の量は、６－Ｏ－硫酸化の対象となる水酸基の量に対し、例えば、１．５～１０モル当量、好ましくは２～５モル当量であってよい。
　６－Ｏ－硫酸化の程度は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、６－Ｏ－硫酸化は、上記例示した６－Ｏ－硫酸化率が得られるように実施することができる。
　ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化は、６－Ｏ－硫酸化による生成物中のＮ－硫酸化・６－Ｏ－硫酸化グルコサミン残基の３－Ｏ位を硫酸化する工程である。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化は、例えば、３－Ｏ－硫酸化酵素（３－ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。３－ＯＳＴは、Ｎ－硫酸化・６－Ｏ－硫酸化グルコサミン残基のＯ－３位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化と他の工程の順序によっては、適切な基質特異性を有する３－ＯＳＴを選択して用いてもよい。３－ＯＳＴは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。３－ＯＳＴとしては、３－ＯＳＴ－１、３－ＯＳＴ－２、３－ＯＳＴ－３、３－ＯＳＴ－４、３－ＯＳＴ－５が挙げられる。３－ＯＳＴとしては、例えば、マウスの３－ＯＳＴ－１を利用することができる。また、３－ＯＳＴとしては、公知の３－ＯＳＴのホモログや人為的改変体等のバリアントを利用してもよい。３－ＯＳＴの製造法および利用態様については、ヘパリナーゼＩＩＩの製造法および利用態様についての記載を準用できる。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化の反応条件は、当業者が適宜設定することができる。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化の反応条件としては、例えば、既報（Ｃｈｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｒｅｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｒａｎ　ｓｕｌｆａｔｅ．”Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００５　Ｄｅｃ　３０；２８０（５２）：４２８１７－２５．）の条件を参照することができる。また、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化の反応条件として、具体的には、例えば、実施例に記載の条件が挙げられる。ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化の程度は、本発明の多糖が得られる限り、特に制限されない。すなわち、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化は、上記例示したＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率が得られるように実施することができる。
　各工程による生成物は、各工程の反応液に含まれたまま次の工程に供してもよく、反応液から回収して次の工程に供してもよい。反応液から各生成物を回収する手段は、特に制限されない。各生成物を回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。各工程による生成物は、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解、酵素の失活等の処理に供してから、次の工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
　このようにしてヘパラン硫酸生成工程を実施することにより、本発明の多糖が生成する。本発明の多糖は適宜反応液から回収することができる。本発明の多糖の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収される本発明の多糖は、本発明の多糖以外に、本発明の多糖を製造する際に用いられた成分や水分等の成分を含んでいてもよい。すなわち、本発明の多糖は、例えば、本発明の多糖を含有する混合物として提供されてもよい。本発明の多糖は、所望の程度に精製されていてよい。本発明の多糖は、本発明の多糖の利用態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、本発明の多糖は、医薬組成物の有効成分として配合して利用するために薬理学的に許容される程度に精製して提供されてよい。本発明の多糖の純度は、具体的には、例えば、３０％（ｗ／ｗ）以上、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、または９５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
＜３＞本発明の多糖の利用
　本発明の多糖は、有効成分として組成物に配合して利用できる。すなわち、本発明は、本発明の多糖を含有する組成物を提供する。同組成物を、「本発明の組成物」ともいう。組成物としては、医薬組成物が挙げられる。本発明の組成物は、例えば、血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療用のものであってよい。すなわち、本発明の組成物は、例えば、血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療剤であってよい。血液凝固に起因する症状としては、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓塞栓症（静脈血栓症、心筋梗塞症、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症、手術中・術後の血栓塞栓症等）、人工透析における血液凝固、体外循環における血液凝固が挙げられる。
　本発明の組成物は、本発明の多糖を含有する。本発明の組成物は、本発明の多糖のみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。「その他の成分」としては、薬理学的に許容されるものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、医薬品に配合して利用される成分が挙げられる。
　例えば、本発明の組成物は、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
　本発明の組成物における本発明の多糖の濃度は、本発明の組成物の用途に応じた有効量であれば特に制限されない。すなわち、本発明の組成物における本発明の多糖の濃度は、例えば、血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療に有効な濃度であってよい。本発明の組成物における本発明の多糖の濃度は、本発明の多糖の抗凝固活性、本発明の組成物の剤型、本発明の組成物の使用態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の組成物における本発明の多糖の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．０１％以上、０．１％以上、または１％以上であってもよく、１００％以下、１０％以下、または１％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
　本発明の組成物を対象に投与することにより、同対象における血液凝固に起因する症状を予防、改善、および／または治療することができる。すなわち、本発明は、本発明の組成物を対象に投与することを含む、血液凝固に起因する症状を予防、改善、および／または治療する方法を提供する。また、例えば、人工透析または体外循環における血液凝固の防止等を目的とする場合には、本発明の組成物を体外で血液に添加すればよい。「本発明の組成物を対象に投与すること」には、ヒト等の生物に投与する場合に限られず、血液等の非生物に添加する場合も含まれる。すなわち、ここでいう「対象」とは、例えば、ヒト等の生物であってもよく、血液等の非生物であってもよい。
　本発明の組成物は、そのまま、あるいは水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、溶解、または分散等し、対象に投与することができる。なお、このように希釈、溶解、または分散等した場合にも、本発明の組成物の範囲に含まれることは言うまでもない。投与方法としては、特に制限されないが、例えば、経口投与、注射等の侵襲的投与、経皮投与が挙げられる。投与方法は、例えば、本発明の組成物の用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の組成物の投与量は、本発明の多糖の抗凝固活性、本発明の多糖の濃度、投与方法、年齢、性別、症状の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。
　以下、実施例をもとに、本発明をより具体的に説明する。
実施例１：ヘパロサンの調製
（１）ヘパロサン発酵
　ＷＯ２０１５／０５０１８４の実施例１に記載のヘパロサン生産菌（エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９－ｋｆｉＡＢＣＤ株）および培養条件にてヘパロサンを含有する培養液を得た。
（２）ヘパロサンの精製
　培養液から遠心分離により培養上清を回収した。培地成分を除去するために１ｍＬの培養上清をＵＦ膜を用いてｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、２５０μＬまで濃縮した。ＵＦ膜濃縮液２５０μＬに５００μＬの１００％エタノールを加え、遠心分離によってヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、ヘパロサンを得た。残りの培養上清から同様の手順でヘパロサンを精製し、ヘパロサン計１０ｇを得た。
実施例２：ヘパロサンのＮ－脱アセチル化
１）　ヘパロサン１．２２ｇにＨｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏ６１ｍＬと１Ｎ硫酸４．７ｍＬを添加し、気相を窒素置換後、１００℃に加温し、４．７５時間反応させた。
２）　氷冷により反応を停止させた後、１６％ＮａＣｌ水溶液６１ｍＬおよびＭｅＯＨ６１０ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿をＨ２Ｏ５０ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮した。
３）　得られた濃縮液に２倍量のＨ２Ｏおよび等量の１Ｍ　ＮａＨＣＯ３を添加後、０．２Ｍ　Ｉ２／０．４Ｍ　ＫＩ溶液を黄色に呈色するまで滴下した。その後Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏを滴下し、余剰のヨウ素をヨウ素イオンに還元後、再度ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、濃縮液を減圧乾固してＮ－脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたＮ－脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は１４．９％であった（後述）。
実施例３：Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの低分子化
（１）ヘパリナーゼＩＩＩの調製
＜Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドの構築＞
　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ　１３１２５）よりヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子をｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０ベクター（米国特許出願公開２００５０１９６８４６号）にクローニングし、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｈｅｐＣを構築した。ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｔｅｒには強力なｎｌｐ０プロモーター（Ｐｎｌｐ０）とｒｒｎＢターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Ｐｎｌｐ０」はエシェリヒア・コリＫ－１２株由来の野生型ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーターを示す。
　発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（配列番号６）及びプライマーＰ２（配列番号７）を用いたＰＣＲによって、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで処理し、ｐＭＩＶ－５ＪＳ（特開２００８－９９６６８）のＳａｌＩ－ＰａｅＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ－ＳａｌＩ断片の塩基配列は配列番号８に示したとおりである。
　次に、ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（配列番号９）及びプライマーＰ４（配列番号１０）を用いたＰＣＲによって、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号１１）を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｔｅｒを取得した。
　次に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ　１３１２５）のｈｅｐＣ遺伝子のＯＲＦ（Ｓｕ　Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，６２：２７２３－２７３４）を含むＤＮＡ鎖を人工合成した。そのＤＮＡ鎖をテンプレートとして、プライマーＰ５（配列番号１２）及びプライマーＰ６（配列番号１３）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｈｅｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃８分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０をテンプレートＤＮＡとし、プライマーＰ７（配列番号１４）及びプライマーＰ８（配列番号１５）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｈｅｐＣを構築した。クローニングされたｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に、それがコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。
＜エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株のｈｅｐＣ遺伝子発現株の構築及びヘパリナーゼＩＩＩ酵素液の調製＞
　ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｈｅｐＣをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ライフテクノロジーズ社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ；８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ、キュベット；０．１ｍＬ）により導入し、ヘパリナーゼＩＩＩ生産株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＩＶ－Ｐｎｌｐ０－ｈｅｐＣ株を得た。この株を２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール添加ＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を、坂口フラスコに３００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度２％ｖ／ｖとなるよう植菌した。３７℃にて４時間振とう培養を行い、培養を終了した。遠心分離後、菌体を０．８５％ＮａＣｌにて２回洗浄し、３０ｍＬの５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）にて懸濁した。懸濁液を超音波破砕に供して菌体を破砕した。細胞破砕液を遠心分離し、上清（無細胞抽出液）としてヘパリナーゼＩＩＩ酵素液を調製した。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
　実施例２で得られたＮ－アセチル基残存率１４．９％のＮ－脱アセチル化ヘパロサン１ｇおよび３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２ｍＬを１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解し、３７℃にて５．３時間反応させた。反応液に１６％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬおよびＥｔＯＨ９００ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを得た。
実施例４：低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化
１）　実施例３で得られた低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン１ｇをｍｉｌｌｉＱ水５０ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ　ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ　Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を５０ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
２）　ＥｔＯＨ１Ｌを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
３）　得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水に溶解して５００μＬとし、二糖分析を行ってＮ－脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を求めた。また、ＧＰＣ分析に供し、分子量分布を求めた。手順を以下に示す。
＜二糖分析＞
　Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンの二糖分析は、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５－２９３（１９９６））の条件に従い実施した。すなわち、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。
　同様に、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析を実施した。なお、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンをＮ－硫酸化してから実施した。すなわち、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンをＮ－硫酸化した後、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化は、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化と同様に実施した。
　二糖分析は、具体的には、以下の手順で実施した。
１）　ヘパリナーゼＩＩ０．２Ｕ（Ｓｉｇｍａ）、ヘパリナーゼＩＩＩ０．０２～０．０３ｍＩＵ、多糖サンプル５μｇ、および酵素消化用ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ，ｐＨ７．０）１０μＬを混合し、ｍｉｌｌｉＱ水で１００μＬにメスアップし、反応溶液とした。
２）　反応溶液を３７℃で１６時間以上反応させた後、１００℃にて２分間煮沸し、反応を停止させた。
３）　０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した溶液を二糖分析用サンプルとした。
４）　分析は、カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒子径５μｍを用い、温度は５０℃、流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２３０ｎｍ、溶離液はＡ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、１．２ｍＭ　Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを用い、Ｂ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、０．１Ｍ　ＣｓＣｌを用い、Ｂ液１－９０％のグラジエント条件で行った。
　各多糖サンプルから生成した構成二糖の量の合計から、収率を算出した。すなわち、収率は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖の全量に対する、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンから生成した二糖の全量の比率（モル比）として算出した。また、この時、得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、Ｎ－脱アセチル化により生じたアミノ基の９９％以上がＮ－硫酸化されていることを確認した。
　また、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンから生成した各構成二糖の量に基づき、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンにおけるＮ－アセチル基の残存率を算出した。すなわち、アセチル基の残存率は、二糖の総量に対する、Ｎ－アセチル基を有する二糖の量の比率（モル比）として算出した。アセチル基の残存率は、１４．９％であった。
＜ＧＰＣ分析＞
　Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサン及びヘパラン硫酸（ｍｉｌｌｉＱ水に１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したもの）をＨＰＬＣによるゲルろ過（ＧＰＣ分析）に供した。カラムにはＧＳ５２０（Ｓｈｏｄｅｘ、Ａｓａｈｉｐａｋ　ＧＳ－５２０ＨＱ、７．５ｍｍ×３００ｍｍ，粒子径７μｍ）を、溶離液には１００ｍＭリン酸二水素カリウム水溶液を用い、流速０．６ｍＬ／分、カラム温度４０℃、検出波長２００ｎｍで分析した。平均分子量（ＭｎおよびＭｗ）は、プルランの分子量マーカー（Ｓｈｏｄｅｘ、ＳＴＡＮＤＡＲＤ　Ｐ－８２、分子量範囲５９００～７０８０００）を標準として算出した。
実施例５：Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応
（１）Ｃ５－エピメラーゼの発現と精製
　Ｃ５－エピメラーゼとしては、ヒト由来のＣ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｎ２９－Ａｓｎ６１７）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ－Ｃ５－エピメラーゼ）を利用した。そのため、同触媒部位をコードする塩基配列をｐＭＡＬ－ｃ２ｘベクター（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングし、ＭＢＰ－Ｃ５－エピメラーゼの発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉを構築した。ｐＭＡＬ－ｃ２ｘベクターによれば、クローニングした遺伝子がＭＢＰとの融合タンパク質として発現する。
　発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。Ｊｉｎ－ｐｉｎｇ　Ｌｉらの報告（Ｌｉ　Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：２８１５８－２８１６３）を参照して、ヒト由来のＣ５－エピメラーゼのｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｃ５－ｅｐｉ　ｆｗ（配列番号１８）及びＣ５－ｅｐｉ　ｒｖ（配列番号１９）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｎ２９－Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（配列番号２０、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号２１及び配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社）を用いて連結し、Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列とｐＭＡＬ－ｃ２ｘにもともと含まれるＭＢＰ遺伝子の融合した、ＭＢＰ－Ｃ５－エピメラーゼの発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉを構築した。Ｃ５－エピメラーゼ挿入断片の塩基配列（Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号２３および２４に示す。
　ＭＢＰ－Ｃ５－エピメラーゼ発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉおよびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ；８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ、キュベット；０．１ｍＬ）により導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉ／ｐＧｒｏ７株を得た。この株をＬＢ培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）に１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した培地に植菌し、３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を坂口フラスコに１００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度１％となるよう植菌した。３７℃にて３時間振とう培養後、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭ、アラビノース（和光純薬工業社）を終濃度０．２％となるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。
　培養液を遠心分離後、菌体を回収し、洗浄液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ）により１回洗浄し、同洗浄液にて懸濁した。得られた懸濁液にＦａｓｔＢｒｅａｋ（プロメガ社）を添加し、３０℃で１０分間から１時間保温後、９，１００ｇにて１０分間遠心分離を行い、得られた上清を菌体抽出液とした。
（２）２－Ｏ－硫酸化酵素（２－ＯＳＴ）の発現と精製
　２－Ｏ－硫酸化酵素（２－ＯＳＴ）としては、チャイニーズハムスター由来の２－ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体の触媒部位（Ａｒｇ５１－Ａｓｎ３５６）と、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質（ＭＢＰ－２－ＯＳＴ）を利用した。そのため、同触媒部位をコードする塩基配列をｐＭＡＬ－ｃ２ｘベクター（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングし、ＭＢＰ－２－ＯＳＴの発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴを構築した。
　発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。小林らの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：１３９８０－１３９８５）を参照して、チャイニーズハムスター由来の２－ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体のｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により作製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、２－ＯＳＴ　ｆｗ（配列番号２５）及び２－ＯＳＴ　ｒｖ（配列番号２６）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、２－ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｒｇ５１－Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃２分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘをテンプレートＤＮＡとし、配列番号２１及び配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、２－ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列とｐＭＡＬ－ｃ２ｘにもともと含まれるＭＢＰ遺伝子の融合した、ＭＢＰ－２－ＯＳＴの発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴを構築した。２－ＯＳＴ挿入断片の塩基配列（２－ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号２７および２８に示す。
　ＭＢＰ－２ＯＳＴ発現プラスミドｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴおよびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ実施例５（１）と同様の手法により導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴ／ｐＧｒｏ７株を得た。この株をＬＢ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した培地に植菌し、３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を坂口フラスコに１００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度１％となるよう植菌した。３７℃にて３時間振とう培養後、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭ、アラビノース（和光純薬工業社）を終濃度０．２％となるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。
　培養液から以下の手順で精製ＭＢＰ－２－ＯＳＴを調製した。まず、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。次いで、菌体を超音波破砕し菌体抽出液を得た。次いで、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ　ＮａＣｌにより平衡化したＡｍｙｌｏｓｅ　ｒｅｓｉｎ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）に菌体抽出液を混和しＭＢＰ－２－ＯＳＴをレジンに吸着させた。その後、レジンの４倍量の平衡化バッファーにて洗浄し、１０ｍＭのマルトースを添加した平衡化バッファー（溶出バッファー）を添加し、ＭＢＰ－２－ＯＳＴが含まれるフラクションを分取し、精製ＭＢＰ－２－ＯＳＴとした。
（３）酵素反応（Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応）
　調製されたＭＢＰ－Ｃ５－エピメラーゼ菌体抽出液及び精製ＭＢＰ－２－ＯＳＴを用い、Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化を行った。１６６ｍｇの実施例４で得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサン、５０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、および１ｍＭ　ＰＡＰＳの混合液７０３ｍＬに、終濃度０．９ｍｇ／ｍＬとなるようＣ５－エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液１０８ｍＬと、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう精製ＭＢＰ－２－ＯＳＴ１６．９ｍＬを加えて総量８２８ｍＬの反応液を調製し、３７℃で２４時間反応させた。
（４）変換率の定量
　変換率（Ｃ５エピメリ化率および２－Ｏ－硫酸化率）の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。
＜試薬＞
ＮａＮＯ２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７６３２－００－０，ＭＷ：６９．０１）
クエン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７７－９２－９，ＭＷ：１９２．１）
２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１９－２６－６，ＭＷ：１９８．１）５０％含水品（略：ＤＮＰＨ）
Ｈｅｐａｒｉｎ（Ａｌｄｒｉｃｈ製）
＜試験液＞
Ｈｅｐａｒｉｎ標準溶液：１ｍｇ／ｍＬ
ＮａＮＯ２水溶液：試薬４９．５ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
クエン酸水溶液：試薬３８４．２ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
ＤＮＰＨ溶液：試薬２０．４ｍｇ（５０％含水）をアセトニトリル１ｍＬに溶解
＜ＬＣ－ＭＳ分析条件＞
＜ＬＣ条件＞
カラム：住化分析センター製ＯＤＳ　Ｚ－ＣＬＵＥ３μｍ　２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム槽温度：５０℃
溶離液流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３６５ｎｍ
注入量：５μＬ
溶離液組成：Ａ液　５０ｍＭ－ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．５）
　　　　　　Ｂ液　ＭｅＣＮ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜ＭＳ条件＞
イオン化法　　　；エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ（＋／－））
ＤＬ温度　　　　：２５０℃
ヒートブロック　：２５０℃
ネブライザーガス流速：１．５Ｌ／ｍｉｎ
ドライガス流速　：１５Ｌ／ｍｉｎ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜分析手順および結果＞
　１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にＨｅｐａｒｉｎ標準液、クエン酸ｂｕｆｆｅｒ水溶液２０μＬ、ＮａＮＯ２水溶液１０μＬを順に添加し、混合溶液を６５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液４０μＬにＤＮＰＨ溶液２０μＬを添加し、４５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成をＬＣ－ＭＳで分析した。Ｈｅｐａｒｉｎ標準液を分析して得られるＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のピークから換算係数（１ｍｇ×ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ純度／ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ値）を算出し、被験液中の各二糖誘導体のａｒｅａ値からその濃度を求めた。算出された二糖構造とその割合を表３に示す。表中、Ｎ－アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。Ｃ５－エピメリ化率（ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の割合の和）は５８％、２－Ｏ－硫酸化率（ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の割合の和）は６５％であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例６：６－Ｏ－硫酸化反応
＜反応前の精製＞
　実施例５で得られた酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応後の反応液）３０ｍＬを遠心分離し（７０００Ｇ、３０分）、その上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾過液２７．３ｇをファルマシア製カラム（型番：ＸＫ２６）に充填した弱アニオン交換樹脂１５ｇ（ＤＩＡＩＯＮ、ＷＡ－３０三菱化学製　事前に２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ５．５に調整）に投入して多糖成分を吸着し、洗浄液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））４８０ｍＬを通液した（流速：６．４ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、溶離液（２Ｍ　ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））２３０ｍＬを通液し（流速６．４ｍＬ／ｍｉｎ）、多糖成分を含む溶離液を得た。得られた溶離液をＡｍｉｃｏｎ－３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水１００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液１１ｇを取得した。
＜イオン交換＞
　強カチオン交換樹脂（ＤＩＡＩＯＮ、ＵＢＫ５５０三菱化学製　予め１Ｍ塩酸でＨ型に変換）３ｍＬに洗浄濃縮液１１ｇを通液した後（ｐＨ２．２５）、トリブチルアミン２．３６ｍｇ／エタノール１０μＬの混合液１．８ｍＬを添加して中和した（ｐＨ８．３６）。得られた中和液を凍結乾燥した。
＜６－Ｏ－硫酸化反応＞
　アルゴン気流下で凍結乾燥物全量にＤＭＦ１．９２ｍＬ及び三酸化硫黄ピリジン付加物７６．４ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、－１０℃で４８時間撹拌した。反応液に５Ｍ酢酸Ｎａ水溶液２．８ｍＬ及び水３１ｍＬを添加して室温で１時間撹拌することで反応を停止した。反応停止液を０．２μｍのフィルターで濾過し、その濾過液をＡｍｉｃｏｎ－３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水２０ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を２回実施して洗浄濃縮液３．９２ｇを取得した。得られた洗浄濃縮液をサンプリングし、実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行った。その結果、洗浄濃縮液３．９２ｇ中に二糖単位の量に換算して７６．５ｍｇの反応生成物（多糖）が含まれていることを確認した。
実施例７：ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化反応
（１）３－Ｏ－硫酸化酵素（３－ＯＳＴ）発現株の作製
　マウス由来３－ＯＳＴ－１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＤ：ＮＰ＿０３４６０４；配列番号２９）をＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）データベースより取得した。既報（Ｅｄａｖｅｔｔａｌ　Ｓ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（２４）２５７８９－９７）を参考に、エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅに合わせて最適化した、同３－ＯＳＴ－１の触媒部位（Ｇｌｙ４８－Ｈｉｓ３１１）をコードする塩基配列（配列番号３０）を含むＤＮＡ断片を合成した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ－ＳａｌＩサイトに挿入して、３－ＯＳＴ－１発現プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ－３－ＯＳＴ－１を構築した。この発現プラスミドによれば、Ｎ末端側にＨｉｓ－Ｔａｇが付加された３－ＯＳＴ－１が発現するため、Ｈｉｓタグによる３－ＯＳＴ－１の精製が可能となる。この発現プラスミドをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株へ実施例５（１）と同様の手法で導入し、３－ＯＳＴ－１発現株ｐＥＴＤｕｅｔ－３－ＯＳＴ－１／ＢＬ２１（ＤＥ３）株を得た。
（２）３－ＯＳＴ－１の発現と精製
　エシェリヒア・コリｐＥＴＤｕｅｔ－３－ＯＳＴ－１／ＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に接種し、３７　℃で一晩静置培養した。寒天培地上に生育した菌体２０μＬをＬＢ培地１ｍＬに懸濁し、そのうち５０μＬをＯｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＴＢ培地（メルク社、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）５０ｍＬを張り込んだ坂口フラスコに添加した。植菌した坂口フラスコ１６本を２２℃、１２０往復／分で２４～２６時間振とう培養した後に、遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、５分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を１６０ｍＬの平衡化バッファー（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に懸濁し、再度遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、５分）することによって菌体を洗浄した。洗浄操作を２回繰り返した後、沈殿として得られた菌体を１６０ｍＬの平衡化バッファーに再度懸濁し、氷水で冷やしながら超音波破砕（１９０Ｗ、２０分間）を行った。破砕液を遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、１０分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め平衡化バッファーで平衡化したＨｉｓＴＡＬＯＮ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅカラム５ｍＬ（クロンテック社製）を３本連結したカラムにアプライして３－ＯＳＴ－１を吸着し、洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）にて洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．０）により３－ＯＳＴ－１を溶出し、３－ＯＳＴ－１の活性画分を得た。得られた活性画分を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いマニュアルに従ってバッファー交換（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）した。バッファー交換後の酵素溶液を精製３－ＯＳＴ－１として以降の実験に用いた。
（３）酵素反応（ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化反応）
　実施例６で得られた反応生成物全量、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２２１μＭ　ＰＡＰＳの混合液３２６．５ｍＬを調製した。水浴中で予め３７℃に保温した同混合液に終濃度２３４ｍｇ／Ｌとなるよう精製３－ＯＳＴ－１　５６ｍＬを添加して全量３８２．５ｍＬの反応液を調製し、反応を開始した。３７℃で緩やかに撹拌しながら反応を進行させ、２４時間経過後に９０℃２０分加熱し酵素を失活させた。
（４）ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率の定量
　実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例８：反応生成物の精製
　実施例７で得られた酵素反応液（ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化反応後の反応液）３７１ｇを遠心分離し（８０００Ｇ、３０分）、その上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。その濾過液をＡｍｉｃｏｎ－３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水２００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液１１．６ｇを取得した。その洗浄濃縮液をファルマシア製カラム（型番：ＸＫ１６）に充填した弱アニオン交換樹脂７．５ｇ（ＤＩＡＩＯＮ、ＷＡ－３０三菱化学製　事前に２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ５．５に調整）に投入して多糖成分を吸着し、洗浄液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））５００ｍＬを通液した（流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、溶離液（２Ｍ　ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））５００ｍＬを通液し（流速３．０ｍＬ／ｍｉｎ）、多糖成分を含む溶離液を得た。得られた溶離液１７１ｇをＡｍｉｃｏｎ－５０Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた透過液を更にＡｍｉｃｏｎ－３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００　Ｇ）を行った。得られた濃縮液に水１００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液８．５８ｇを取得した。得られた洗浄濃縮液を凍結乾燥して精製多糖４１ｍｇを取得した。
実施例９：精製多糖の品質分析
　実施例８で得られた精製多糖について、表５に示す項目の測定を実施した。測定法は後述する。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例１０：構造の異なる硫酸化多糖の作製
　エピメリ化率、２－Ｏ－硫酸化率、ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化率等のパラメータの異なる複数種の硫酸化多糖の作製し、抗凝固活性の評価を実施した。
（１）Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応
　実施例５（３）と同様の反応液組成で総量１００ｍＬの反応液を調製し、０時間、４時間、８時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表６に示す。表中、Ｎ－アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（２）６－Ｏ－硫酸化反応
　得られた酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応後の反応液）各１００ｍＬについて、実施例６と同様の手順で精製および６－Ｏ－硫酸化反応を行い、洗浄濃縮液を取得した。得られた洗浄濃縮液をサンプリングし、実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行った。その結果、各サンプルについて、洗浄濃縮液中に二糖単位の量に換算して約８０μｇの反応生成物（多糖）が含まれていることを確認した。
（３）ＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化反応
　得られた６－Ｏ－硫酸化反応の反応生成物について、実施例７と同様の反応液組成で総量３００μＬの反応液を調製し、２４時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表７に示す。表中、４時間および８時間のサンプルについては、未同定ピークのデータは割愛し、表に示す二糖単位の総量を１００％とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（４）精製多糖の抗凝固活性
　実施例８と同様の手順でＧｌｃＮ残基の３－Ｏ－硫酸化反応の反応生成物を精製し、抗凝固活性の測定を実施した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
＜測定法＞
　実施例９および１０において、各項目は以下に示す手順で測定した。
＜Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ＞
・使用キット：テストチーム　ヘパリンＳ（清水メディカル製）
・低分子ヘパリン標準品：日本薬局法標準品（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団製　Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ：１７５０ＩＵ）
・使用器具：
　　ミキサー＆恒温機：Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ　ｃｏｍｐａｃｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製）
　　ＵＶ吸光度計：ＰＤ－３０３Ｓ（（株）アペル製）
　　ＵＶ－セル：アクリル製角セル（光路長１０ｍｍ）
試薬の調製
・基質液：基質剤１バイアルをミリＱ水２０ｍＬで溶解した。
・アンチトロンビンＩＩＩ液：アンチトロンビンＩＩＩ剤１バイアルをミリＱ水１０ｍＬに溶解した。
・ファクターＸａ液：ファクターＸａ剤１バイアルをミリＱ水１０ｍＬに溶解した。
・緩衝液：付属のバイアルをそのまま使用した。
・正常血漿：正常血漿剤１バイアルをミリＱ水１．０ｍＬで溶解した。
・反応停止液：氷酢酸（特級）２０ｍＬにミリＱ水を加え全量を４０ｍＬにした。
・ヘパリン標準液：
　　一次希釈ヘパリン溶液（３５ＩＵ／ｍＬ）：ヘパリン１７５０ＩＵをミリＱ水５０ｍＬに溶解した。
　　二次希釈ヘパリン液（０．１７５ＩＵ／ｍＬ）：一次希釈ヘパリン溶液１００μＬに緩衝液９００μＬを正確に加えて混合した。更に、混合液５０μＬに緩衝液９５０μＬを正確に加えて混合した。
　　ヘパリン標準液：二次希釈ヘパリン溶液を表９に示す通りに希釈して混和した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
検体（測定サンプル）の調製
　基質濃度が２μｇ／ｍＬになるように精製多糖をミリＱで希釈又は溶解し、希釈液Ａを得た。希釈液Ａに表１０に示す割合で試薬を添加し、検体を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
測定手順
　測定用及び検体ブランク用マイクロチューブのそれぞれに検体２００μＬを正確に採取して、３７℃で４分加温撹拌した。測定用マイクロチューブにファクターＸａ液１００μＬを加えてよく混和し３０秒静置した後、３７℃で正確に３０秒間加温した。測定用マイクロチューブに予め３７℃に加温した基質液２００μＬを加えてよく混和し３０秒静置した後、３７℃で正確に１８０秒間加温した。各マイクロチューブに反応停止液３００μＬを加え、直ちに混和した。ＵＶセルに反応液８００μＬを分注し、波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。同様に、各希釈系列のヘパリン標準液について測定を行い、ヘパリン標準液から算出される検量線を基に、検体のＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性を求めた。１ｍＬの血液凝固を１時間抑制する濃度を１　ＩＵ／ｍＬと定義した。
＜Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ＞
・使用試薬および使用キット：
　　活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）測定用塩化カルシウム溶液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ　ＧＭＹ－３００Ａ）シスメックス（株）製
　　活性化部分トロンボプラスチン時間キット　アクチンＦＳＬ　ＧＡＣ－２００Ａ　シスメックス（株）製
　　正常コントロール血漿　デイドサイトロール　レベル１　ＧＣＡ－１１０Ａ　シスメックス（株）製
　　低分子ヘパリン標準品：日本薬局法標準品（医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団製　Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ：６７０　ＩＵ）
・使用器具：
　　半自動血液凝固測定装置（ＣＡ－１０４　シスメックス（株）製）
測定手順
　キュベットに標準液（低分子ヘパリン標準品の希釈系列）又は被験液（精製多糖の溶液）１０μＬ、アクチン５０μＬ、コントロール血漿５０μＬを加え、直ちに検出部に挿入し遮光蓋を閉じた。３分撹拌した後、導入部から塩化カルシウム溶液５０μＬを添加した。凝固時間が自動的に表示された。標準液から算出される検量線を基に、被験液のＡｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性を求めた。１ｍＬの血液凝固を１時間抑制する濃度を１　ＩＵ／ｍＬと定義した。
＜ＬＰＳ分析法＞
・使用機器：Ｔｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒ　ＥＴ－６０００（和光純薬製）
・使用試薬：ライセート試薬（ｌｉｍｕｌｕｓ　ＥＳ－ＩＩ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｔｅｓｔ　Ｗａｋｏ）
　　　　　　標準ＬＰＳ（ＪＰＳＥ１００００）
・ＬＰＳ標準溶液（ＥＵ／ｍＬ）：０．０１，０．１，１
測定手順
　ＥＳ－ＩＩシングルテストワコーにＬＰＳ標準溶液又は被験液（精製多糖の溶液）２００μＬ分注し、ミキサーで５秒撹拌した。チューブ内に大きな気泡がないことを確認してから、Ｔｏｘｉｎｏｍｅｔｅｒのポジション１に挿入した（自動的に測定開始）。透過率９４．９％になる時間を求め、ＬＰＳ標準溶液から算出される検量線を基に、被験液中のＬＰＳ濃度を求めた。
＜タンパク質分析＞
・使用機器：プレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ　ＭＡＸ１９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ製）
・使用試薬：
　　ＮａＯＨ／Ｎａ２ＣＯ３溶液：ＮａＯＨ２ｇ及びＮａ２ＣＯ３１０ｇを水に溶解し全量を５００ｍＬに調整した。
　　硫酸銅／酒石酸Ｎａ溶液：硫酸銅５水和物２．５ｇ及び酒石酸Ｎａ２水和物５．９６ｇを水に溶解し全量を５００ｍＬに調整した。
　　硫酸銅アルカリ溶液：ＮａＯＨ／Ｎａ２ＣＯ３溶液５ｍＬ及び硫酸銅／酒石酸Ｎａ溶液１ｍＬを混合した（用時調製）。
　　フォーリン水溶液：Ａｌｄｒｉｃｈ製フォーリン試薬（Ｆ９２５２－１００ｍＬ）を水で２倍希釈した。
　　アルブミン標準液：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製の標準液（２ｍｇ／ｍＬ）を用いて０．１２５，０．２５，０．５，１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
測定手順
　１．５ｍＬマイクロチューブにアルブミン標準液又は被験液（精製多糖の溶液）２０μＬと硫酸銅アルカリ溶液３００μＬを分注し、ミキサーで撹拌後１０分間静置した。更にフォーリン水溶液３０μＬを添加して撹拌後３０分静置した。得られた発色液３００μＬを９６穴プレートに注ぎ７５０ｎｍの吸光度を求めた。アルブミン標準液から算出される検量線を基に、被験液中のタンパク質濃度を求めた。
＜二糖分析＞
　実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行い、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）の含有率を算出した。
＜平均分子量測定＞
　実施例４と同様の手順でプルランの分子量マーカーを標準としてＧＰＣ分析を行い、平均分子量（ＭｎおよびＭｗ）を算出した。
実施例１１：高アセチル基残存率を有するＮ－硫酸化ヘパロサンの分子量の低減化
（１）ヘパロサンのＮ－脱アセチル化
１）　ヘパロサン１２０ｍｇに２Ｍ　ＮａＯＨ６ｍＬを添加し、４８℃に加温し、４．１時間反応させた。
２）　６Ｎ　ＨＣｌ２ｍＬを添加して反応を停止させた後、ＭｅＯＨ４５ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿を０．２５Ｍ　ＮａＨＣＯ３　８ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、６ｍＬのＮ－脱アセチル化ヘパロサン溶液を得た。得られたＮ－脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は２７．６％であった（後述）。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
　（１）で得られたＮ－アセチル基残存率２７．６％のＮ－脱アセチル化ヘパロサン溶液６ｍＬおよび１０ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２２１μＬを１Ｍ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）０．６ｍＬと混合した後にｍｉｌｌｉＱ水を添加して１２ｍＬとし、３７℃にて８時間反応させた。反応液にＥｔＯＨ　８６ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを得た。
（３）低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化
１）　（２）で得られた低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン全量をｍｉｌｌｉＱ水６ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ　ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ　Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を６ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
２）　ＥｔＯＨ８６ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
３）　得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で平均分子量を求めた。
実施例１２：Ｎ－アセチル基残存率に依存した低分子化Ｎ－硫酸化ヘパロサンの分子量の制御
（１）ヘパロサンのＮ－脱アセチル化
　実施例１１と同様にしてヘパロサンをＮ－脱アセチル化反応に供し、反応時間を制御することによりＮ－アセチル基残存率が２．６％～２９．６％のＮ－脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
　（１）で得られたＮ－脱アセチル化ヘパロサンの低分子化を実施例１１と同様の条件でヘパリナーゼＩＩＩと反応させ、低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（３）低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化
　（２）で得られた低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを実施例１１と同様の条件でＮ－硫酸化反応に供し、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
（４）平均分子量の集計
　得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で平均分子量を求めた。得られた収率および平均分子量（プルラン換算）の結果を表１１に示す。
　表１１の結果により、Ｎ－アセチル基残存率を高くすることにより分子量を低減させるように制御できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例１３：分子量による活性の違いを見るための低分子化Ｎ－硫酸化ヘパロサンの調製
　Ｎ－アセチル基の残存量がヘパラン硫酸の活性に影響するため、分子量の違いの活性への影響を調べる目的でＮ－アセチル基の残存量の等しい異なる分子量の低分子化Ｎ－硫酸化ヘパロサンを調製した。分子量は、低分子化反応の反応時間で制御した。
（１）ヘパロサンのＮ－脱アセチル化
　実施例１１と同様にしてヘパロサンをＮ－脱アセチル化反応に供し、Ｎ－アセチル基残存率が２９．４％のＮ－脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
　（１）で得られたＮ－脱アセチル化ヘパロサンの低分子化を実施例１１と同様の条件でヘパリナーゼＩＩＩと反応させ、酵素添加量と反応時間で分子量を制御し、４種類の低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを取得した。
（３）低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化
　（２）で得られた低分子化Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン４種類を実施例１１と同様の条件でＮ－硫酸化反応に供し、Ｎ－硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
（４）得られたＮ－硫酸化低分子化ヘパロサンについて、実施例４と同一の手法で収率および分子量分布を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
実施例１４：分子量の異なる硫酸化多糖の作製
（１）Ｃ５－エピメラーゼの発現と精製
　Ｃ５－エピメラーゼとしては、ヒト由来のＣ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１－Ａｓｎ６１７）と、Ｃ末端３アミノ酸を置換したマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ＊，既報（Ｒｏｂ　Ｊ．Ｃｅｎｔｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｃｒｉｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｒｉｍｅｒｉｃ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｇｐ２１　ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｓ　ａ　ｃｈｉｍｅｒａ　ｗｉｔｈ　ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　７，　１６１２－１６１９　（１９９８）））との融合タンパク質（ＭＢＰ＊－Ｃ５－エピメラーゼ（Ｇ１０１））を利用した。
　発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。まず、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（配列番号２０、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号３１及び配列番号３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、ＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片を得た。上記ＰＣＲ反応においては、５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ－ｃ２ｘプラスミドＤＮＡおよびＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊プラスミドを得た。ｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊プラスミドの塩基配列を配列番号３３に示す。
　実施例５で作製したｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉプラスミドをテンプレートＤＮＡとし、配列番号３４及び配列番号３５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、Ｃ５－エピメラーゼ（Ｇ１０１）のＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応において、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩ、３’末端に制限酵素ＸｈｏＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－Ｃ５ｅｐｉプラスミドＤＮＡおよびＣ５－エピメラーゼ（Ｇ１０１）のＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）プラスミドを得た。挿入断片の塩基配列（Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１－Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号３６および３７に示す。実施例５と同様の方法によりＭＢＰ＊－Ｃ５－エピメラーゼ（Ｇ１０１）発現プラスミドｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）およびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－Ｃ５ｅｐｉ（Ｇ１０１）／ｐＧｒｏ７株を得た。この株を用いて、実施例５と同様の方法により、菌体抽出液を調製した。
（２）２－Ｏ－硫酸化酵素（２－ＯＳＴ）の発現と精製
　２－Ｏ－硫酸化酵素（２－ＯＳＴ）としては、チャイニーズハムスター由来の２－ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８－Ａｓｎ３５６）と、ＭＢＰ＊との融合タンパク質（ＭＢＰ＊－２－ＯＳＴ（Ｄ６８））を利用した。
　発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。実施例５で作製したｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴプラスミドをテンプレートＤＮＡとし、配列番号３８及び配列番号３９のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、２－ＯＳＴ（Ｄ６８）のＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応において、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩ、３’末端に制限酵素ＸｈｏＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ－ＭＢＰ－２ＯＳＴプラスミドＤＮＡおよび２－ＯＳＴ（Ｄ６８）のＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－２ＯＳＴ（Ｄ６８）プラスミドを得た。挿入断片の塩基配列（２－ＯＳＴの触媒部位（Ａｓｐ６８－Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列）及びそれがコードするアミノ酸配列を、配列番号４０および４１に示す。実施例５と同様の方法によりＭＢＰ＊－２－ＯＳＴ（Ｄ６８）発現プラスミドｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－２ＯＳＴ（Ｄ６８）およびシャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）をエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）へ導入し、Ｏｒｉｇａｍｉ　Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊－２ＯＳＴ（Ｄ６８）／ｐＧｒｏ７株を得た。この株を用いて、実施例５と同様の方法により、２－ＯＳＴ精製蛋白質を調製した。
（３）Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応
　実施例１３で調製した１４ｍｇ　Ｎ－硫酸化ヘパロサンＮｏ．１、Ｎｏ．２、またはＮｏ．３、５０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、および０．５ｍＭ　ＰＡＰＳを反応液組成とした混合液６８．９ｍｌに、終濃度０．０９ｍｇ／ｍＬのＣ５－エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液０．７ｍｌおよび終濃度０．０７ｍｇ／ｍＬの２－ＯＳＴ精製蛋白質０．４　ｍｌを加えて総量７０ｍＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で１０時間反応させた。
　実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１３に示す。表中、Ｎ－アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（４）Ｃ５エピメリ化反応
　実施例１３で調製した１４ｍｇ　Ｎ－硫酸化ヘパロサンＮｏ．１、Ｎｏ．２、またはＮｏ．３、５０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ　ＮａＣｌを反応液組成とした混合液５．４ｍｌに、終濃度１．０ｍｇ／ｍＬのＣ５－エピメラーゼ発現菌体の菌体抽出液０．６ｍｌを加えて総量５ｍＬの反応液をそれぞれ調製し、３７℃で２４時間反応させた。使用したＣ５－エピメラーゼは実施例１４（１）と同一のもの使用した。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物に含まれる二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
（５）６－Ｏ－硫酸化反応
　得られたＮｏ．４－Ｎｏ．９の酵素反応液（Ｃ５エピメリ化および２－Ｏ－硫酸化のカップリング反応後、または、Ｃ５エピメリ化単独反応の反応液）について、実施例６と同様の手順で精製および６－Ｏ－硫酸化反応を行い、洗浄濃縮液を取得した。
（６）３－Ｏ－硫酸化反応
　得られた６－Ｏ－硫酸化反応の反応生成物各８０μｇについて、実施例７と同様の反応液組成で総量３００μＬの反応液を調製し、２４時間３７℃で反応させた。実施例５と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。算出された二糖構造とその割合を表１５に示す。未同定ピークのデータは割愛し、表に示す二糖単位の総量を１００％とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（７）精製多糖の抗凝固活性
　実施例８と同様の手順で３－Ｏ－硫酸化反応の反応生成物を精製し、抗凝固活性の測定を実施した。結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
＜配列表の説明＞
配列番号１：エシェリヒア・コリＫ５株のｋｆｉＡＢＣＤオペロンの塩基配列
配列番号２：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＡタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＢタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＣタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５：エシェリヒア・コリＫ５株のＫｆｉＤタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６、７：プライマー
配列番号８：野生型ｎｌｐＤプロモーター（Ｐｎｌｐ０）を含むＰａｅＩ－ＳａｌＩ断片の塩基配列
配列番号９、１０：プライマー
配列番号１１：ｒｒｎＢターミネーターの塩基配列
配列番号１２～１５：プライマー
配列番号１６：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ＡＴＣＣ　１３１２５のｈｅｐＣ遺伝子の塩基配列
配列番号１７：Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ　ＡＴＣＣ　１３１２５のＨｅｐＣタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１８、１９：プライマー
配列番号２０：ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ
配列番号２１、２２：プライマー
配列番号２３：Ｃ５－エピメラーゼ挿入断片の塩基配列（ヒト由来Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位をコードする塩基配列）
配列番号２４：ヒト由来Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位のアミノ酸配列
配列番号２５、２６：プライマー
配列番号２７：２－ＯＳＴ挿入断片の塩基配列（チャイニーズハムスター由来２－ＯＳＴ変異体の触媒部位をコードする塩基配列）
配列番号２８：チャイニーズハムスター由来２－ＯＳＴ変異体の触媒部位のアミノ酸配列
配列番号２９：マウス由来３－ＯＳＴ－１のアミノ酸配列
配列番号３０：エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅに合わせて最適化した、マウス由来３－ＯＳＴ－１の触媒部位（Ｇｌｙ４８－Ｈｉｓ３１１）をコードする塩基配列
配列番号３１、３２：プライマー
配列番号３３：ｐＭＡＬ－ＭＢＰ＊
配列番号３４、３５：プライマー
配列番号３６：Ｃ５－エピメラーゼ（Ｇ１０１）挿入断片の塩基配列（ヒト由来Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１－Ａｓｎ６１７）をコードする塩基配列）
配列番号３７：ヒト由来Ｃ５－エピメラーゼの触媒部位（Ｇｌｙ１０１－Ａｓｎ６１７）のアミノ酸配列
配列番号３８、３９：プライマー
配列番号４０：２－ＯＳＴ（Ｄ６８）挿入断片の塩基配列（チャイニーズハムスター由来２－ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８－Ａｓｎ３５６）をコードする塩基配列）
配列番号４１：チャイニーズハムスター由来２－ＯＳＴ変異体の触媒部位（Ａｓｐ６８－Ａｓｎ３５６）のアミノ酸配列

Claims (27)

  1. 　下記一般式（Ｉ）に示す二糖単位の繰り返し構造を含む、抗凝固活性を有する多糖：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式中、Ｒ１～Ｒ５は、以下の条件を満たす：
    　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立に、水素または硫酸基を示す；
    　Ｒ３は、水素、硫酸基、またはアセチル基を示す；
    　Ｒ３の少なくとも一部が硫酸基である；
    　Ｒ４における硫酸基の比率が、１３％以上である；
    　Ｒ５における硫酸基の比率が、５０％以上である。
  2. 　前記二糖単位の含有率が、９０％以上である、請求項１に記載の多糖。
  3. 　前記多糖を構成する糖鎖の総数の５０％以上の数の糖鎖が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなる、請求項１または２に記載の多糖：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　式中、Ｒ１～Ｒ５は、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１～Ｒ５と同一である；
    　式中、ｎは、平均値として３～３０である。
  4. 　前記多糖を構成する糖鎖の総数の５０％以上の数の糖鎖が、下記一般式（ＩＩ）に示す構造からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の多糖：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　式中、Ｒ１～Ｒ５は、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１～Ｒ５と同一である；
    　式中、ｎは、平均値として３～１５である。
  5. 　平均糖連結数が６～６０残基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の多糖。
  6. 　平均糖連結数が６～３０残基である、請求項１～５のいずれか１項に記載の多糖。
  7. 　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される数平均分子量が８０００～６００００である、請求項１～６のいずれか１項に記載の多糖。
  8. 　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される数平均分子量が１２０００～４００００である、請求項１～７のいずれか１項に記載の多糖。
  9. 　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量が１００００～１０００００である、請求項１～８のいずれか１項に記載の多糖。
  10. 　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量が１５０００～５００００である、請求項１～９のいずれか１項に記載の多糖。
  11. 　前記二糖単位のヘキスロン酸残基におけるイズロン酸残基の比率が０％～７０％である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多糖。
  12. 　Ｒ１における硫酸基の比率が、０％～８０％である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の多糖。
  13. 　イズロン酸残基のＲ１における硫酸基の比率が、０％～１００％である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の多糖。
  14. 　グルクロン酸残基のＲ１における硫酸基の比率が、０％～５０％である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の多糖。
  15. 　Ｒ２における硫酸基の比率が、１％未満である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の多糖。
  16. 　Ｒ３における硫酸基の比率が、７０％～１００％である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の多糖。
  17. 　Ｒ３におけるアセチル基の比率が、０％～３３％である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の多糖。
  18. 　Ｒ４における硫酸基の比率が、４５％以下である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の多糖。
  19. 　Ｒ５における硫酸基の比率が、７０％～１００％である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の多糖。
  20. 　ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ６Ｓ）、ＧｌｃＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮ（ＮＳ３Ｓ）、ＩｄｏＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）、およびＧｌｃＡ－ＧｌｃＮ（ＮＳ）から選択される１またはそれ以上の二糖単位を、５０％以上の総含有率で含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の多糖。
  21. 　Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ活性／Ａｎｔｉ－Ｆａｃｔｏｒ　ＩＩａ活性比が、１．５以上である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の多糖。
  22. 　プルランを標準としてゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．５以下である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の多糖。
  23. 　フリー体、もしくはその薬理学的に許容される塩、またはそれらの混合物である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の多糖。
  24. 　前記塩が、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカルシウム塩から選択される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の多糖。
  25. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の多糖を含む医薬組成物。
  26. 　血液凝固に起因する症状の予防、改善、および／または治療用である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 　前記症状が、播種性血管内凝固症候群、血栓塞栓症、人工透析における血液凝固、または体外循環における血液凝固である、請求項２６に記載の組成物。
     
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