CN116103275B - 一种葡萄糖醛酸c5-差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法 - Google Patents
一种葡萄糖醛酸c5-差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种葡萄糖醛酸C5‑差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法。本发明的葡萄糖醛酸C5‑差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3所示。本发明的葡萄糖醛酸C5‑差向异构酶活性高，利用哺乳动物人胚肾细胞293F成功实现可量化生产的。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种葡萄糖醛酸C5-差向异构酶、其核苷酸序列、表达载体、细胞株及其构建方法，以及利用所述细胞株分泌的人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶，和利用所述人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶生产肝素的方法。
背景技术
作为一种特殊类型的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)，肝素(Hep)是目前在临床上使用历史最长的糖类药物(Nat Prod Rep，2009.26(3)：313-21)。作为广泛使用的抗凝血药物，肝素主要用于手术和肾透析过程中预防静脉，动脉及肺部的血栓形成及其他血栓栓塞性疾病。在肝素发挥抗血栓/凝血作用的同抗凝血酶ATIII具有高亲和结合力的五糖序列基本单位中，艾杜糖醛酸(IdoA)的存在对于保持结构的柔性以及结合抗凝血酶的能力至关重要，GlcA转化为IdoA后的结合能力增加了2000倍以上(Trends Biotechnol.2001，19(9)：356-62；Handb Exp Pharmacol，2012(207)：3-22)。不同于在所有细胞表面表达的硫酸乙酰肝素，肝素主要在肥大细胞中表达，但两者具有相同的多糖骨架，并且享有共同的生物合成路线(Handb Exp Pharmacol，2012.207：23-41)。两者的主要区别在于Hep中硫酸化程度也更高，同时艾杜糖醛酸含量更高(＞80％)，(Annu Rev Biochem，2014.83：129-57.)。负责肝素体内生物合成转化D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)为L-艾杜糖醛酸(L-IdoA)的同样也是葡萄糖醛酸C5-差向异构酶(D-glucuronyl C5-epimerase，GLCE)。
目前肝素原料主要从猪小肠粘膜及牛肺中提取获得，然而由于动物来源肝素在提取工艺，质量控制方面存在问题，导致了2008年的“肝素钠事件”(Nat Prod Rep，2009.26(3)：313-21；N Engl J Med，2008.358(23)：2457-67)。生产非动物来源的肝素以取代这些动物组织中分离的传统模式已成为一种重要的发展趋势。其中使用微生物生产的肝素前体(Heparosan)进行诸如硫酸化和差向异构化反应的化学酶催化方法生产肝素是一种重要的很有前景的被认为是有可能替代的肝素制备方法(US11203772；US8227449；WO9614425；WO0246379；US2003023079；US2012322114；WO2018135027；Nat Prod Rep，2014.31(12)：1676-85；Science，2011.334(6055)：498-501；Carbohydr Polym，2015.122：399-407)。
Heparosan是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的二糖重复结构[→4)-β-GlcA-(1→4)-α-GlcNAc-(1→]n组成的多糖，它是某些细菌如E.coli K5的荚膜多糖中的一种成分。肝素结构中的L-艾杜糖醛酸对于肝素发挥药理活性至关重要。因此，为了使肝素前体生产硫酸乙酰肝素及肝素，需要使部分己糖醛酸残基发生差向异构化反应，即，使部分D-葡萄糖醛酸残基差向异构化为L-艾杜糖醛酸的反应(葡萄糖醛酸C5-差向异构反应)，而该关键步骤反应需要使用GLCE来实现。
迄今已报道了多种哺乳动物来源的C5-差向异构酶的利用(WO0246379；US8227449)，包括从直接从牛肝提取纯化的(蛋白已发生部分水解)(J Biol Chem 1994，269：26953-8，70μg/4.5kg组织；WO9614425)，昆虫表达系统重组表达牛肺的(US2003023079；J Biol Chem 1997，272：28158-63.；NZ500268；WO9848006)，小鼠肝的(WO0246379；J Biol Chem.2001，276(23)：20069-77.(昆虫细胞表达纯化))，CHO细胞表达系统重组表达小鼠的(WO2005014656；J Biol Chem.2001，276(24)：21538-43，10.2pmol/min/mg)，以及大肠杆菌系统重组表达的N-端融合MBP蛋白的人、仓鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、线虫等的C5-差向异构酶(WO2018135027)。另外还鉴定了纯化的海洋细菌来源的C5-差向异构酶(大肠杆菌重组表达收率20mg/L，J Biol Chem.2013，288(34)：24332-9)。然而，它们并未能实现酶的大量表达和纯化，同时也没有足够的C5-差向异构化活性。譬如，牛肝提取纯化的C5-差向异构酶，蛋白已发生部分水解，产率仅有70μg/4.5kg组织(J Biol Chem 1994，269：26953-8)，酶活力也仅有1200pmol/min/μg(J Biol Chem 1994，269：26953-8；Glycobiology 10，159-171；ACS Chem Biol.2015，10(4)：1064-71.)。而目前使用较多的是利用PMAL-c2x载体和原核表达系统大肠杆菌Origami B菌株表达纯化的N-端融合MBP蛋白的重组人C5-差向异构酶(E53-N617)，其纯度不高，酶活力仅有150pmol/min/μg(BiochemBiophys Res Commun.2006，339(2)：597-602；J Biol Chem.2010，285(15)：11106-13；ACSChem Biol.2015，10(4)：1064-71)。因此，有必要获得更有效的可以实现一定生产量的C5-差向异构酶。
另外，小鼠、人等哺乳动物组织的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶表达量非常低，迄今为止还没有抗体能够实现免疫印记检测。同时，除了我们前期发表的文献报道之外(SciRep.2016，6：31242；Glycobiology.2021，31(8)：1018-1025)，尚没有在哺乳动物细胞原位成功实现过表达活性葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的报道(Prog Mol Biol TranslSci.2010，93：59-78)。
发明内容
本发明在哺乳动物人胚肾细胞HEK293原位过表达高活性葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的研究中，发现糖基化及半胱氨酸对葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的活性均有影响，在此基础上，提供一种高活性的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶及其编码核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的表达载体，并构建了制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株，利用该细胞株成功实现可量化生产的、迄今为止报道的最高活性的重组人葡萄糖醛酸C5差向异构酶的制备。
基于此，本发明的第一个方面，提供一种葡萄糖醛酸C5-差向异构酶(hGLCE)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。
本发明的第二个方面，提供一种编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子，其具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，提供一种表达载体，其包含本发明第二个方面所述的编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子。
在具体的实施方式中，所述表达载体为慢病毒表达载体，选自pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-Neo慢病毒质粒。
在具体的实施方式中，所述慢病毒表达载体进一步包含编码信号肽和/或标签的核酸分子。在一个实施方式中，所述信号肽为IgG kappa分泌信号肽，其氨基酸序列如SEQID NO：5所示。在一个实施方式中，所述编码IgG kappa分泌信号肽的核酸分子具有SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述标签为flag-6XHis标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。在一个实施方式中，所述编码flag-6XHis标签的核酸分子具有如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述信号肽和/或标签可以位于葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的N端。
在具体的实施方式中，将编码N端融合信号肽和/或标签的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子通过XhoI/BamHI双酶切位点插入慢病毒质粒pLVX-IRES-Puro慢病毒表达载体。
在具体的实施方式中，所述慢病毒表达载体进一步包含筛选标记。
本发明的第四个方面，提供一种制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶(hGLCE)的细胞株的构建方法，其包括如下步骤：
(1)将本发明第三个方面所述的表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞(优选为HEK293T细胞)，包装成携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒；
(2)用所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，得到制备重组hGLCE的细胞株。
在具体的实施方式中，步骤(1)中，包装质粒选自psPAX2和pMD2.G，或pRSV-Rev和pMDLg/pRRE载体系统；优选地，包装质粒为psPAX2和pMD2.G。
在具体的实施方式中，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞的方法包括但不限于脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法等；在一个优选的实施方式，采用磷酸钙共沉淀。
在具体的实施方式中，步骤(2)中，可以通过筛选标记筛选得到生产重组hGLCE的细胞株。在具体的实施方式中，步骤(2)中，筛选方法可为：将所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，经筛选标记筛选，并鉴定克隆细胞重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶表达量，获得表达量最高的克隆，作为所述制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株。在一个实施方式中，所述筛选标记可以是嘌呤霉素抗性基因。具体的筛选方法可为：所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞48小时后，收集细胞并有限稀释至96孔板中，用嘌呤霉素(3μg/ml)筛选1～2周后，陆续长出克隆，转移至24孔板，收集培养上清液进行免疫印迹表达量鉴定后，以鉴定的表达量最高的克隆为所述制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株。
本发明的第五个方面，提供一种细胞株，其由第四个方面所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法构建得到。
本发明的第六个方面，提供一种葡萄糖醛酸C5-差向异构酶，其由本发明的第五个方面所述细胞株悬浮培养分泌得到。
本发明的第七个方面，提供一种生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法，包括由本发明的第五个方面所述细胞株悬浮培养分泌得到葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的步骤。
在具体的实施方式中，所述悬浮培养的培养基为包含100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素的Freestyle无血清培养基；
在具体的实施方案中，所述悬浮培养的方法为：将处于对数生长期状态良好的细胞培养于振荡摇床过夜后，以DNA∶PEI(1∶3)的比例在培养基中加入DNA/PEI混合物，振荡培养扩增，收集培养液，离心得到含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液；
在具体的实施方案中，还包括对含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液的纯化步骤，所述纯化方法包括：将含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液过Ni Sepharose6Fast Flow填料后，用洗涤液(300mM NaCl，50mM K2HPO4，20mM咪唑pH 8)洗涤，洗脱液(300mM NaCl，50mM K2HPO4，250mM咪唑pH 8)洗脱，并经过超滤浓缩和脱盐置换为磷酸缓冲液后，得到纯化的蛋白。
本发明的第八个方面，提供一种利用葡萄糖醛酸C5-差向异构酶生产肝素的方法，其中，所述葡萄糖醛酸C5-差向异构酶为本发明的第一个方面或本发明第六个方面所述的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶。
有益效果
本发明利用哺乳动物人胚肾细胞293F成功实现可量化生产的、迄今为止报道的最高活性的重组人葡萄糖醛酸C5差向异构酶的制备，该重组表达的葡萄糖醛酸C5差向异构酶活性高于一般报道的10倍。
附图说明
图1显示实施例1中用pCDNA3.1和慢病毒载体pLVX载体构建的原位全长hGLCE以及C末端融合Myc标签的hGLCE载体瞬时转染HEK293细胞72小时后，A)免疫印迹检测hGLCE表达量；B)同位素法检测酶活性；以及C)激光共聚焦免疫荧光检测过表达的hGLCE细胞器定位。
图2是显示实施例2中检测内源性过表达的hGLCE的存在形式结果图，其中，A)还原性和非还原性SDS-PAGE电泳后，免疫印迹检测hGLCE的结果；B)空载对照(mock)和野生(WT)及不同位点半胱氨酸(C)突变为丙氨酸(A)hGLCE瞬时转染HEK293细胞72小时后，收细胞裂解液免疫印迹检测的hGLCE表达量；C)同位素法测定的酶活性。
图3显示实施例3中糖基化影响内源性过表达hGLCE的酶活性结果，其中，A)空载对照(mock)和野生(WT)及不同N糖基化位点天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)hGLCE瞬时转染HEK293细胞72小时后，收细胞裂解液免疫印迹检测的hGLCE表达量；B)同位素法测定的酶活性。
图4显示实施例4中hGLCE主要的酶活性位点检测结果。其中，A)空载对照(mock)和野生(WT)及不同酪氨酸位点突变体hGLCE(酪氨酸(Y)突变为丙氨酸(A))瞬时转染HEK293细胞72小时后，收细胞裂解液免疫印迹检测的hGLCE表达量；B)同位素法测定的酶活性。
图5显示实施例5中慢病毒载体构建的载体在293F细胞外的瞬时表达结果，其中，A)载体构建示意图；B)瞬时转染72小时后分别收集细胞和上清培养基，免疫印记检测hGLCE表达量；C)瞬时转染1L 293F细胞7天后，分离纯化培养基中hGLCE_N29-N617的蛋白凝胶电泳考马斯亮蓝染色图。
图6显示实施例6中慢病毒感染介导构建的分泌型细胞克隆的hGLCE_N29-N617表达，其中，A)30倍浓缩后包装的慢病毒以不同比例加入量感染贴壁生长的293F细胞72小时后，收集上清培养基免疫印记检测的hGLCE表达量；B)30倍浓缩慢病毒感染的293F细胞有限稀释法克隆筛选免疫印记检测上清培养基中分泌表达的hGLCE量；C)利用克隆1稳定株悬浮培养表达纯化后获得的hGLCE_N29-N617在还原(R)和非还原(NR)条件下的纯度鉴定SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图；D)分子排阻-多角度光散射(SEC-MALS)测定的分子量结果图。
图7显示实施例7中hGLCE_N29-N617酶活性的测定结果，其中，A)完全N位硫酸化的K5多糖(CNSK5PS)底物同hGLCE_N29-N617孵育24小时后1H-NMR检测结构变化；B)底物同酶孵育不同时间(15，30，45，60，120，240，480，640，1020，1440分钟)后核磁1H-NMR检测并定量计算艾杜糖醛酸的转化率(IdoA％)时间依赖关系曲线。
图8显示实施例7中hGLCE_N29-N617酶活性的测定结果，其中，A)初始速度线性关系曲线时间内，底物同酶分别孵育5，10，20，30，40分钟后核磁1H-NMR检测图谱；B)艾杜糖醛酸的转化率(IdoA％)时间依赖拟合关系曲线。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
主要试剂：
哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3.1，慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Puro，包装质粒pMD2.G和psPAX2均购自Invitrogen。
抗Myc小鼠单抗购自Abmart。
抗beta-actin小鼠单抗，抗高尔基体细胞器标记ERGIC53/p58小鼠单抗购自Merck。
4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)以及羊抗兔Alexa Fluor-488，羊抗小鼠Alexa Fluor-594抗体购自Invitrogen。
抗GLCE兔多抗由商业服务公司Innovagen(瑞典)制备提供。
hGLCE有关全长或截短序列以及定点突变基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成并克隆至相关载体。
HEK293，HEK293T细胞购自ATCC。
293F细胞和培养基DMEM、Freestyle购自Invitrogen。
细胞转染试剂HD-Fugene购自Promega。
PEI购自Polysciences。
Ni Sepharose 6Fast Flow填料和PD-10柱购自Cytiva。
主要设备：
高效液相色谱仪：美国Waters 2695串联2996二极管阵列和2414示差折光检测器；
核磁共振波谱仪：美国Bruker AVANCEIII；
超速离心机：美国贝克曼L-100K；
激光共聚焦显微镜：德国蔡司Zeiss LSM 700。
实施例1：慢病毒载体实现高活性hGLCE的内源性高表达
质粒构建：
质粒1：普通哺乳动细胞表达载体pCDNA3.1+全长hGLCE基因(NCBI Gene ID：2603)(pCDNA3.1-hGLCE)；
质粒2：慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro+全长hGLCE基因(pLVX-hGLCE)；
质粒3：慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro+C末端融合有MYC标签的hGLCE基因(pLVX-hGLCE-MYC)；
空载体对照质粒：pLVX-IRES-Puro。
质粒通过转化DH5α大肠杆菌菌株进行扩增，并用Qiagen质粒抽提试剂盒进行纯化。
细胞培养和转染：
人胚肾HEK293贴壁细胞用包含10％胎牛血清(FBS)，100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基培养于5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中。
收集处于指数生长期的HEK293细胞，以5X105/ml细胞密度接种于24孔板，过夜培养后分别将质粒1/2/3和空载对照质粒使用HD-Fugene转染细胞(按照说明书操作(Promega))72小时后，用RIPA裂解液(中国碧云天)裂解收集细胞裂解液。
蛋白免疫印迹：
细胞用RIPA裂解液(中国碧云天)冰上裂解并用BCA试剂盒(美国Invitrogen)测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液煮沸变性，经十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺电泳(SDS-PAGE)后，半干转(美国Bio-rad)至硝酸纤维素膜(美国Pall)，经脱脂奶粉封闭，一抗孵育，洗涤，辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育洗涤，最后经底物ECL孵育显影拍照。
同位素法GLCE酶活性测试：
同位素法GLCE酶活性利用酶能催化[5-3H]-N-硫酸化K5多糖释放3H形成3H2O的原理进行检测(Sci Rep.2016Aug 11；6：31242)。90％汇合的转染细胞用裂解液(50mM HEPESpH7.4，100mM KCl，1％Triton X-100，15mM EDTA，含蛋白酶抑制剂)在冰上孵育裂解30分钟并离心后，BCA法(美国thermo)测定裂解液中蛋白浓度，同[5-3H]-N-硫酸化K5多糖底物(5000cpm)37℃孵育16小时后，与5mL双相闪烁液混合(三体积INSTA-FLUOR PLUS(PerkinElmer 6013167)加一体积异戊醇)后，在液体闪烁分析仪(PerkinElmer)上读数定量释放的3H2O的来确定酶的活性。
免疫荧光：
贴壁生长在多聚赖氨酸包被的盖玻片上的转染细胞用磷酸缓冲溶液(PBS)清洗，4％多聚赖氨酸固定15分钟后，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST(含有0.3％Triton X-100的磷酸缓冲液)封闭。然后与稀释的一抗在4℃的湿室中孵育过夜。三次洗涤后，细胞再同荧光标记的二抗室温孵育1小时。PBS重复洗涤后，盖玻片用含有DAPI的VectShield封片剂(Vector Laboratories)封片后，荧光共聚焦显微镜扫描拍摄照片。
结果：
HEK293细胞用普通哺乳动细胞表达载体pCDNA3.1和慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro构建的全长hGLCE质粒以及C末端融合有MYC标签的hGLCE质粒，HD-Fugene转染72小时后，免疫印迹和酶活性测试表明，同对照相比，pCDNA3.1构建的内源性hGLCE表达质粒不能实现hGLCE的高表达(图1.A)以及酶活性的提高(图1.B)，而慢病毒构建的内源性全长hGLCE表达质粒瞬时转染后免疫印迹能检测到hGLCE的高表达(图1.A)，同时酶活性也提高了4倍以上(图1.B)。同慢病毒构建的全长hGLCE相比，C末端融合MYC标签的hGLCE虽能实现内源性的高表达(图1.A)，但酶活性却显著降低，只有对照的1.5倍(图1.B)，表明C末端为重要的活性位点，融合Myc标签后显著降低酶的活性。而进一步用免疫荧光激光共聚焦检测慢病毒表达载体pLVX-IRES-Puro构建的全长hGLCE质粒瞬时转染的HEK293细胞则表明，高表达的hGLCE定位于58K标记物的高尔基体内，能跟高尔基体实现共定位(图1.C)。
因此慢病毒载体构建的全长hGLCE表达载体实现了定位于高尔基体的内源性hGLCE的高表达和酶的高活性。
实施例2：内源性过表达的hGLCE主要以二硫键连接形成二聚体的形式存在
慢病毒载体构建的全长hGLCE表达载体瞬时转染HEK293细胞72小时后，分别用含(还原)和不含巯基乙醇(非还原)的上样缓冲液裂解细胞，SDS-PAGE电泳后，免疫印迹实验表明，还原性条件下hGLCE主要以分子量在72kD的单体形式存在，而在非还原性条件下，则以分子量在140kD左右的二聚体形式存在(图2.A)。这表明过表达的hGLCE主要以二硫键连接形成二聚体的形式存在于高尔基体中。
进一步构建hGLCE的半胱氨酸突变为丙氨酸的6个突变体(C3A，C17A，C31A，C190A，C256A)，并通过转染和免疫印迹检测表达量(图2.B)，以及同位素法酶活性检测表明，C109A突变体的酶活相比于野生型(WT)和其他6个突变体(C3A，C17A，C31A，C190A，C256A)急剧降低至几乎同对照(mock)相同的水平(图2.C)，说明二硫键的形成位点可能在C109，并且该二硫键对于维持酶的高活性具有重要性。
因此，慢病毒载体构建的内源性过表达的hGLCE主要以C109位点形成二硫键连接形成二聚体的形式存在，并且该位点二硫键对于维持酶的高活性至关重要。
实施例3糖基化影响内源性原位过表达hGLCE的酶活性
糖基化会影响哺乳动物细胞蛋白的正确折叠以及酶的活性。通过慢病毒载体构建野生型(WT)全长hGLCE以及N糖基化位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺的突变体(N225Q，N303Q，N393Q)，转染HEK293细胞后收集蛋白裂解液，免疫印迹检测GLCE表达表明(图3.A)，N225Q、N303Q、N393Q三个突变体分子量均比野生型hGLCE降低，其中N303Q和N393Q几乎同等程度的比N225Q还要低，表明N225的糖基化程度糖链比N303和N393的要低。而同步通过同位素法检测hGLCE的酶活性表明(图3.B)，同野生型相比，三个N糖基化位点单一突变都会降低酶的活性，酶活性顺序依次为WT＞N303Q＞N225Q＞N393Q，其中N393Q只保留了野生型的40％活性，表明N393位点的糖基化对于维持hGLCE的活性具有非常重要的作用。
因此，N糖基化会影响内源性过表达hGLCE的酶活性，hGLCE的活性需要N糖基化才能更好的维持。
实施例4hGLCE的主要酶活性位点
慢病毒载体构建的野生(WT)及不同酪氨酸位点突变体hGLCE(Y168A，Y222A，Y500A，Y560A，Y578A)瞬时转染HEK293细胞72小时后，细胞裂解液免疫印迹检测hGLCE表达量，结果表明同WT相比，各突变体均具有几乎相同的GLCE表达量(图4.A)。进一步用同位素法测定细胞裂解液中hGLCE酶活性表明，WT酶活性较空载对照(mock)增加了6.3倍，而各突变体则同空载对照(mock)处于同一水平，表明表达的各突变体hGLCE均未能显示明显的酶活力(图4.B)。
因此，Y168、Y222、Y500、Y560以及Y578均为hGLCE的关键性活性位点，突变后将失去酶的活性。
实施例5慢病毒载体构建的载体分泌表达hGLCE_N29-N617可实现293F细胞外的瞬时高表达
细胞培养：
293F细胞贴壁培养时用包含10％胎牛血清(FBS)，100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基培养于5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中；悬浮培养时用包含100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素的Freestyle无血清培养基，以5X105～5X106/ml的细胞密度，110rpm的转速震荡培养于置于5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中celltron摇床上的含有挡板的三角烧瓶中(美国康宁)。
质粒构建和转染：
将编码N端融合了小鼠IgG kappa分泌信号肽和flag-6XHis标签的截短去除了跨膜和胞外肽段的hGLCE片段N29_N617或E53_N617的核酸分子(SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10)，通过XhoI/BamHI双酶切位点插入慢病毒质粒pLVX-IRES-Puro，并经测序确认正确(上海生工生物工程股份有限公司)。
质粒通过转化DH5α大肠杆菌菌株进行扩增，并用Qiagen质粒抽提试剂盒进行纯化。
蛋白瞬时表达和纯化：
收集处于对数生长期状态良好的悬浮培养的转染293F细胞，以0.5X106细胞/mL的密度培养于振荡摇床过夜后，以DNA∶PEI(1∶3)的比例加入DNA/PEI混合物，振荡培养扩增6天后，离心收集上清，过Ni Sepharose 6Fast Flow填料后，用洗涤液(300mM NaCl，50mMK2HPO4，20mM咪唑pH 8)洗涤，洗脱液(300mM NaCl，50mM K2HPO4，250mM咪唑pH 8)洗脱，并经过超滤浓缩和脱盐置换为磷酸缓冲液后，得到纯化的蛋白。
结果：
根据野生型全长hGLCE蛋白的结构域构建了包含高尔基体内部结构域的两个截短蛋白hGLCE_N29-N617和hGLCE_E53-N617慢病毒表达质粒(图5.A)，瞬时转染贴壁生长的293F细胞72小时，分别收集上清和细胞裂解液，GLCE抗体免疫荧光检测hGLCE表达量表明，hGLCE_N29-N617和hGLCE_E53-N617都能在细胞内高表达，然而hGLCE_N29-N617而非hGLCE_E53-N617能分泌到培养基中实现分泌表达(图5.B)。进一步通过瞬时转染1L 293F细胞7天后，通过亲和纯化培养基中分泌的蛋白获得了SDS-PAGE纯度在95％以上的hGLCE_N29-N617，且明显是糖基化的，比预测的氨基酸序列分子量高(图5.C)，BCA蛋白浓度测定表明瞬时转染293F细胞的收率为1.1mg/L。
因此，不同结构域表达产物会影响表达量，hGLCE_N29-N617能够实现分泌表达，而hGLCE_E53-N617则不能，而且瞬时转染质粒分泌表达的水平较低。
实施例6慢病毒感染介导构建的分泌型细胞克隆可实现hGLCE_N29-N617的高表达
慢病毒包装和浓缩：
慢病毒的包装参见文章描述(Sci Rep.2016Aug 11，6：31242)，简单的说，构建的hGLCE_N29-N617慢病毒表达载体同包装质粒psPAX2和pMD2.G三质粒系统磷酸钙法共转染HEK293T细胞，同时用质粒pLVX-IRES-ZsGreen1作为检测病毒滴度的对照，72小时后收包含病毒颗粒的培养基上清，超速离心体积浓缩30倍后，用pLVX-IRES-ZsGreenl质粒包装制备的表达荧光的慢病毒通过有限稀释法测定滴度后，冻存于-80℃。
慢病毒感染及细胞筛选：
浓缩后的慢病毒感染贴壁生长的293F哺乳动物表达细胞48小时后，收集并有限稀释至96孔板中，用嘌呤霉素(3μg/ml)筛选1～2周后，陆续长出克隆，转移至24孔板收集上清进行免疫印迹表达量鉴定后，扩增和保存细胞，以鉴定的表达量最高的克隆为种子用于后续hGLCE_N29-N617蛋白的表达和纯化。
293F细胞的悬浮培养表达hGLCE_N29-N617分泌蛋白：
血清培养基复苏贴壁293F细胞培养后，换为FreeStye无血清培养基挡板三角瓶，120rpm二氧化碳培养箱震荡培养。以0.5X106细胞/ml密度接种至新的摇瓶，振荡培养至第7天后，收集上清培养基进行hGLCE_N29-N617蛋白的分离纯化。
体积排阻色谱-多角度激光散射(SEC-MALS)：
Waters2695HPLC在线色谱柱WTC-050S5(美国Wyatt)平衡缓冲液(50mM HEPES，pH7.4)0.5ml/min平衡过夜后，上样纯化后的蛋白并通过SEC-MALS检测器(美国怀亚特WyattDAWN HELEOS II)检测分析绝对分子量。
结果：
30倍浓缩后包装的慢病毒(通过同步制备的表达荧光蛋白病毒测定滴度为3X107TU/mL)以不同比例加入量感染贴壁生长的293F细胞72小时后，收集上清培养基免疫印记检测hGLCE表达量表明，随着病毒滴度和浓度的增加表达量呈现递增趋势，其中30X慢病毒颗粒感染的细胞表达量最高(图6.A)。而后对30X慢病毒颗粒感染的贴壁293细胞进行有限稀释克隆筛选后(图6.B)，不同克隆号的稳定细胞株表达量差异较大，其中克隆1分泌表达hGLCE_N29-N617的量最高，因此选用其作为纯化和制备hGLCE_N29-N617的稳定细胞株。利用克隆1稳定株悬浮培养表达纯化后制备hGLCE_N29-N617的得率为20mg/L，利用还原(R)和非还原(NR)条件下的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色纯度鉴定表明(图6.C)，hGLCE_N29-N617纯度达98％，并且部分蛋白是以通过二硫键形成二聚体的形式存在。而后利用分子排阻-多角度光散射(SEC-MALS)测定的hGLCE_N29-N617重均分子量Mw为1.653X105Da，形成的是比较对称的单一峰，表明，纯化获得的是二聚体形式的hGLCE_N29-N617。
实施例7hGLCE_N29-N617具有很高的酶活性
核磁共振法检测酶活性：
利用核磁共振波谱1H-NMR的变化来检测hGLCE_N29-N617的酶活性参见文献(ACSChem Biol.2015，10(4)：1064-71)。具体的，10μg/mL的酶同含有1mg/mL的完全N-硫酸化K5多糖底物在3mL酶反应缓冲液(25mM MOPS，5mM CaCl2，pH7.0)中，37℃孵育不同时间后，快速煮沸10分钟灭活酶终止反应，真空冷冻干燥后，溶于氘氧化氢，1H-NMR检测核磁波谱的变化，对增加的艾杜糖醛酸(IdoA)特征峰和相应的葡萄糖醛酸(GlcA)的特征峰进行归属和面积积分，计算转化率％IdoA，对酶促反应初始速率以转化率随时间变化进行线性拟合后，得到斜率(d(IdoA％)/dt，min-1)，而后计算酶活力(IU/mg)＝[底物(1000ug/mL)/二糖单元分子量(417μg/μmol)]X斜率(d(IdoA％)/dt)/酶量(mg/mL)。
结果：
利用合成的完全N-硫酸化K5多糖为底物，同纯化制备的hGLCE_N29-N617酶孵育24h后，1H-NMR波谱检测显示(图7.A)，化学位移δ5.6附近的H1(α-GlcNS(-GlcA))和δ4.55附近的H1(β-GlcA)由于发生了GlcA向IdoA的转化而使得峰面积降低，转化出现了新的δ5.35附近的H1(α-GlcNS(-IdoA))以及δ5.1附近的H1(α-IdoA)。进一步通过跟踪不同时间点(0，15，30，45，60，120，240，480，640，1020，1440分钟)核磁变化并计算为IdoA转化率的变化可知(图7.B)，酶促反应速率呈现典型的饱和曲线，在1小时以内基本呈线性关系，最大转化率达到35％左右，而后趋于平缓，在4小时后基本达到饱和的43％左右，再延长孵育时间也不能催化更多的GlcA转化为IdoA。而后进一步通过在线性范围内的1个小时内(5，10，20，40min)跟踪检测1H-NMR波谱(图8.A)并转化为不同时间点的IdoA转换率(图8.B)，计算酶比活力：
比活力＝1000*0.6656/417/100/0.01μmol/min/mg＝1.60μmol/min/mg＝1.60IU/mg
这是目前为止，文献报道的活性最高的重组表达的葡萄糖醛酸C5差向异构酶，高于一般报道的10倍(ACS Chem Biol.2015，10(4)：1064-71)。
Claims (20)
1.一种表达载体，其包含编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子；
所述表达载体为慢病毒表达载体，选自pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-Neo慢病毒质粒；
所述慢病毒表达载体包含编码信号肽和标签的核酸分子；
所述信号肽为IgG kappa分泌信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述标签为flag-6XHis标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述信号肽和标签位于所述葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的N端。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，编码IgG kappa分泌信号肽的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，编码flag-6XHis标签的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求1所述表达载体，其特征在于，将编码N端融合信号肽和标签的葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子通过XhoI/BamHI双酶切位点插入慢病毒质粒pLVX-IRES-Puro构建慢病毒表达载体。
6.根据权利要求1所述表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体包含筛选标记。
7.一种制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞，包装成携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒；
(2)用所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，得到制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株。
8.根据权利要求7所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，
步骤(1)中，包装质粒为psPAX2和pMD2.G载体系统。
9.根据权利要求7所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞的方法包括脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。
10.根据权利要求9所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T或293FT细胞的方法为磷酸钙共沉淀。
11.根据权利要求9所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，将慢病毒表达载体同包装质粒共转染HEK293T。
12.根据权利要求7所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，通过筛选标记筛选得到生产重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株；所述筛选方法为：将所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞，经筛选标记筛选，并鉴定克隆细胞重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶表达量，获得表达量最高的克隆，作为所述制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株。
13.根据权利要求12所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，所述筛选标记是嘌呤霉素抗性基因。
14.根据权利要求12所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，具体的筛选方法为：所述携带编码葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的核酸分子的慢病毒感染293F细胞48小时后，收集细胞并有限稀释至96孔板中，用嘌呤霉素筛选1～2周后，陆续长出克隆，转移至24孔板，收集培养上清液进行免疫印迹表达量鉴定后，以鉴定的表达量最高的克隆为所述制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株。
15.根据权利要求14所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法，其特征在于，嘌呤霉素的浓度为3μg/ml。
16.一种细胞株，其由权利要求7-15任一项所述的制备重组人葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的细胞株的构建方法构建得到。
17.一种生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法，包括由权利要求16所述细胞株悬浮培养分泌得到葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的步骤。
18.根据权利要求17所述的生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法，其特征在于，所述悬浮培养的培养基为包含100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素的Freestyle无血清培养基。
19.根据权利要求17所述的生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法，其特征在于，所述悬浮培养的方法为：将处于对数生长期状态良好的细胞培养于振荡摇床过夜后，以DNA:PEI为1：3的比例在培养基中加入DNA/PEI混合物，振荡培养扩增，收集培养液，离心得到含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液。
20.根据权利要求19所述的生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法，其特征在于，所述生产葡萄糖醛酸C5-差向异构酶方法还包括对含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液的纯化步骤，所述纯化方法包括：将含有葡萄糖醛酸C5-差向异构酶的上清液过Ni Sepharose6Fast Flow填料后，用含300mM NaCl，50mM K2HPO4，20mM咪唑，pH为8的洗涤液洗涤，用含300mM NaCl，50mM K2HPO4，250mM咪唑，pH为8的洗脱液洗脱，并经过超滤浓缩和脱盐置换为磷酸缓冲液后，得到纯化的蛋白。
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| Enzyme overexpression–an exercise toward understanding regulation of heparan sulfate biosynthesis;Jianping Fang等;《Sci Rep》;第11卷(第6期);全文，尤其是第6页第4段。 * |
| Using Engineered 2-O-Sulfotransferase to Determine the Activity of Heparan Sulfate C5-epimerase and Its Mutants;Kai Li等;《J Biol Chem》;第285卷(第15期);参见全文，尤其是第11106页右栏第2段，第11107页左栏第2段，第11109页右栏第2段，第11110页右栏第1段，图5。 * |
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