WO2017059647A1 - 一种动物皮张的鉴定方法 - Google Patents

一种动物皮张的鉴定方法 Download PDF

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郝向慧
郭尚伟
段小波
周祥山
田守生
徐云鹏
王静
黄一凡
王玉娇
张云霞
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Definitions

  • the invention relates to a method for identifying animal skins, in particular to a method for identifying mink skin by using liquid chromatography-mass spectrometry, which can be used for identification and differentiation of molting, horse skin, mink skin and cowhide.
  • Ejiao is a traditional Chinese patent medicine. It has been used for thousands of years and has the effects of nourishing blood, nourishing yin, moistening and stopping bleeding. According to the Chinese Pharmacopoeia, Ejiao is a solid glue made from dried or fresh skin of Equus asinus L. Pure gelatin must come from 100% suede to ensure the efficacy of the product.
  • liquid chromatography-mass spectrometry The method for the determination of liquid chromatography-mass spectrometry is very mature. As long as the characteristic components with stable animal-derived components are found, they can be used for detection.
  • the reported liquid-mass spectrometry method has been used to identify the components of traditional Chinese medicine including bovine-derived components and pigs. Although skin-derived components, turtle-derived components, and deer-derived components have been reported as methods for detecting molting-derived components, they are actually common components of the thrips and cannot distinguish between molting and horseskin. At present, there is still no liquid-mass spectrometer to distinguish the detection methods of cockroaches, horses and cockroaches.
  • the main object of the present invention is to provide an identification method for animal skin sheets according to the above problems and deficiencies, which can be used for rapid identification and differentiation of molting, horse skin, suede and cowhide, and the method is accurate in identification.
  • the rate is 100%, with the advantages of strong specificity, good reproducibility, simple operation, low cost of detecting consumables, and suitable for batch operation.
  • test solution after the skin sample is removed from the hair, the subcutaneous fat layer and its impurities, trypsin is used for enzymatic hydrolysis;
  • Multi-reaction monitoring was carried out by electrospray positive ion mode (ESI+), and m/z 386.3 ⁇ 0.1% ⁇ 402.3 ⁇ 0.1%, 499.3 ⁇ 0.1%, m/z393.3 ⁇ 0.1% ⁇ 402.3 ⁇ 0.1%, 499.3 ⁇ 0.1%, m/z 690.8 ⁇ 0.1% ⁇ 752.4 ⁇ 0.1%, 809.5 ⁇ 0.1%, MRM scanning as detection ion pair;
  • ESI+ electrospray positive ion mode
  • the animal skin comprises suede, horseskin, suede and cowhide.
  • the preparation of the test solution in the step (1) comprises: removing the hair, the subcutaneous fat layer and the impurities thereof from the sample to be tested, and then cutting into pieces having a particle diameter of 2 mm or less, and weighing 0.01. g In a 1.5 ml EP tube, 1 ml of a pH 8.0, 1% (w/w) NH 4 HCO 3 solution was added, 100 ⁇ l of a 2 mg/ml trypsin solution was added, and the solution was hydrolyzed at 37 ° C for 6 h, and filtered through a microporous membrane.
  • the liquid phase conditions used in the detection of the LC/MS method described in the step (2) are: 2.1 mm ⁇ 100 mm, 1.8 ⁇ m C 18 reversed phase column, and the mobile phase A is 0.1. % (v / v) formic acid solution, mobile phase B is acetonitrile, flow rate 0.3 ml / min; gradient elution: 0 ⁇ 25min, 2% ⁇ 20% (v / v) B.
  • M/z 386.3 ⁇ 402.3, 499.3, m/z 393.3 ⁇ 402.3, 499.3, m/z 690.8 ⁇ 752.4, 809.5 as the detection ion pair for MRM scanning.
  • the invention investigates a large number of different kinds of raccoon, different horse species and their skin, further proves the reliability of the method. Among them, Guanzhong, Dezhou, Guangling, Jinnan, Jiami, Biyang, Huaiyang, Qingyang, North China, Xinjiang, Southwest, etc.; horses include Mongolian horses, Ilima, Southwest Horse, Yunnan Horse, Baise Horse, Guizhou Horse, Sanhe Ma, Balikun Ma and so on.
  • Figure 1 is a graph of total ion flow in animal skin MRM scan mode.
  • Materials Various animal skins, including suede, horseskin, suede, horseskin, and cowhide.
  • Reagents ammonium bicarbonate (analytical grade), trypsin (sequence pure, purchased from China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products).
  • subcutaneous fat layer and its impurities from the sample to be tested After removing the hair, subcutaneous fat layer and its impurities from the sample to be tested, cut into pieces with a particle size of 2 mm or less, weigh 0.01 g into a 1.5 ml EP tube, and add 1 ml of 1% (w/w) NH 4 HCO. 3 solution (pH 8.0), 100 ⁇ l of 2 mg/ml trypsin solution was added, and the solution was hydrolyzed at 37 ° C for 6 h, and filtered through a microporous membrane.
  • Mass spectrometry conditions electrospray positive ion mode (ESI + ) for multi-reaction monitoring, select m/z 386.3 ⁇ 402.3, 499.3, m/z 393.3 ⁇ 402.3, 499.3, m/z 690.8 ⁇ 752.4, 809.5, as detection The ion pair is subjected to an MRM scan.
  • ESI + electrospray positive ion mode
  • the liquid chromatography-mass spectrometry technology is used to accurately identify and distinguish the molting, horse skin, suede, and cowhide, especially the identification of suede.
  • the method is specific and easy to operate. Low cost of testing consumables and suitable for batch operation.

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Abstract

一种利用液质联用技术鉴定动物皮张的方法，可用于驴皮、马皮、骡皮、牛皮的鉴定区分。所述方法包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)液质联用仪检测；(3)根据质谱图判别皮样属于何种动物的皮。使用所述方法用于驴皮、马皮、骡皮、牛皮的鉴定区分，鉴定准确率100％，具有专属性强、重现性好、操作简单等优势。

Description

一种动物皮张的鉴定方法 技术领域
本发明涉及一种鉴定动物皮张的方法，特别涉及一种利用液质联用技术鉴定驴皮的方法，可用于驴皮、马皮、骡皮、牛皮的鉴定区分。
背景技术
阿胶是中国传统中成药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润燥，止血的功效。中国药典规定，阿胶为马科动物驴(Equus asinus L.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。
目前在收购驴皮时，需要对驴皮进行鉴定，防止以马皮、骡皮和牛皮等冒充驴皮。采用眼睛直接观察进行驴皮真伪的鉴定方法，经常存在判断错误或模棱两可的现象，具有一定主观性，无法准确区分皮张，对于形态相似的马皮、骡皮和驴皮则更加难以区分。而DNA分子鉴定的方法虽然可以区分驴皮和马皮，但对于驴皮与骡皮的区分略显乏力，且操作较为繁琐，存在假阴性和假阳性现象，检测耗材成本较为昂贵，所需时间也较长，很难实现批量检测。
液质联用技术测定方法已很成熟，只要找到动物源性成分稳定存在的特征性成分，便可用于检测；已报道的液质联用方法鉴别胶类中药的成分包括牛皮源性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、鹿源性成分等，虽有驴皮源性成分检测方法的报道，但实为驴马共有成分，无法区分驴皮和马皮。目前仍没有用液质联用仪区分驴、马、骡的检测方法，这不但因为稳定存在的特征性成分的寻找、鉴定及确认工作本身需付出巨大努力，而且驴与马、骡的亲缘关系非常近，它们在生物学本质上的差异也十分有限。建立一种快速鉴别区分驴皮、马皮、骡皮和牛皮的检测方法，这对于阿胶原料驴皮的快速鉴定具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种动物皮张的鉴定方法，可用于驴皮、马皮、骡皮、牛皮的快速鉴定区分，该方法鉴定准确 率100％，具有专属性强、重现性好、操作简单、检测耗材成本低、适于批量操作等优势。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一种动物皮张的鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)供试品溶液的制备：将皮样除去毛、皮下脂肪层及其杂质后，采用胰蛋白酶酶解；
(2)液质联用仪检测：采用电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测，选择m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％，作为检测离子对进行MRM扫描；
(3)根据质谱图判别皮样属于何种动物的皮，其中相同母离子对应的两个子离子应同时检出的质谱峰方可作为目的峰用于判别：
a)若只检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，未检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％的质谱峰，则该皮样为驴皮；
b)若只检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，未检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为牛皮；
c)若只检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，未检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为马骡皮或马皮；
d)若全部检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为驴骡皮。
在本发明中，优选的，所述动物皮包括驴皮、马皮、骡皮和牛皮。
在本发明中，优选的，步骤(1)中供试品溶液的制备包括：将待测皮张样品除去毛、皮下脂肪层及其杂质后，剪成粒径2mm以下的碎屑，称取0.01g于1.5mlEP管中，加入1ml的pH8.0，1％(w/w)NH4HCO3溶液，加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液100μl，37℃恒温酶解6h，微孔滤膜过滤。
在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的液质联用仪检测中所采用的液相 条件为：2.1mm×100mm，1.8μm C18反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，2％～20％(v/v)B。
在本发明中，优选的，选择m/z386.3→402.3、499.3，m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5作为检测离子对进行MRM扫描。
采用本发明的方法，能够快速鉴别区分驴皮、马皮、骡皮和牛皮。本发明考察了大量的不同驴种的驴皮、不同马种的马皮及其骡皮，进一步证明了方法的可靠性。其中驴种包括关中驴、德州驴、广灵驴、晋南驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等；马种包括蒙古马、伊利马、西南马、云南马、百色马、贵州马、三河马、巴里坤马等。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1是动物皮MRM扫描模式下总离子流图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
实施例1动物皮张的鉴定
1、材料和试剂
材料：各种动物皮，包括驴皮、马皮、驴骡皮、马骡皮、牛皮。
试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。
2、检测方法
(1)动物皮张的酶解溶液的制备
将待测皮张样品除去毛、皮下脂肪层及其杂质后，剪成粒径2mm以下的碎屑，称取0.01g于1.5ml EP管中，加入1ml的1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)，加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液100μl，37℃恒温酶解6h，微孔滤膜过滤。
(2)液质联用仪检测
取5μl酶解溶液的续滤液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，2％～20％(v/v)B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)进行多反应监测，选择m/z386.3→402.3、499.3，m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5，作为检测离子对进行MRM扫描。
结果见图1，5.62～5.72min的质谱峰为m/z386.3→402.3、m/z386.3→499.3，两离子对同时检出；7.99～8.10min的质谱峰为m/z393.3→402.3、m/z393.3→499.3，两离子对同时检出；19.46～19.56min的质谱峰为m/z690.8→752.4、m/z690.8→809.5，两离子对同时检出。驴皮样品中只检出m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5的质谱峰，未检出m/z386.3→402.3、499.3的质谱峰；马皮和马骡皮样品中只检出m/z386.3→402.3、499.3，未检出m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5的质谱峰；驴骡皮样品中检出m/z386.3→402.3、499.3，m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5的质谱峰；牛皮样品中只检出m/z393.3→402.3、499.3，未检出m/z386.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5的质谱峰。
综上所述，针对各动物物种皮张的特征离子，利用液质联用技术，准确鉴定区分了驴皮、马皮、骡皮、牛皮，尤其是鉴定驴皮，该方法专属性强、操作简单、检测耗材成本低、适于批量操作。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims (5)

  1. 一种动物皮张的鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
    (1)供试品溶液的制备：将皮样除去毛、皮下脂肪层及其杂质后，采用胰蛋白酶酶解；
    (2)液质联用仪检测：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％，作为检测离子对进行MRM扫描；
    (3)根据质谱图判别皮样属于何种动物的皮，其中相同母离子对应的两个子离子应同时检出的质谱峰方可作为目的峰用于判别：
    a)若只检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，未检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％的质谱峰，则该皮样为驴皮；
    b)若只检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，未检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为牛皮；
    c)若只检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，未检出m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为马骡皮或马皮；
    d)若全部检出m/z386.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z393.3±0.1％→402.3±0.1％、499.3±0.1％，m/z690.8±0.1％→752.4±0.1％、809.5±0.1％的质谱峰，则该皮样为驴骡皮。
  2. 根据权利要求1的动物皮张的鉴定方法，其特征在于，所述动物皮包括驴皮、马皮、骡皮和牛皮。
  3. 根据权利要求1的动物皮张的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中供试品溶液的制备包括：将待测皮张样品除去毛、皮下脂肪层及其杂质后，剪成粒径2mm以下的碎屑，称取0.01g于1.5ml EP管中，加入1ml的pH8.0，1％(w/w)NH4HCO3溶液，加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液100μl，37℃恒温酶解6h，微孔滤膜 过滤。
  4. 根据权利要求1的动物皮张的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中所述的液质联用仪检测中所采用的液相条件为：2.1mm×100mm，1.8μm C18反相色谱柱，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～25min，2％～20％B。
  5. 根据权利要求1的动物皮张的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中选择m/z386.3→402.3、499.3，m/z393.3→402.3、499.3，m/z690.8→752.4、809.5作为检测离子对进行MRM扫描。
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