WO2017010759A1 - 시료 내 약물-내성 박테리아 검출용 프로브 및 이의 용도 - Google Patents

시료 내 약물-내성 박테리아 검출용 프로브 및 이의 용도 Download PDF

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민선준
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박연준
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Definitions

  • a probe for detecting drug-resistant bacteria in a sample, a composition, a kit, and a detection method comprising the same.
  • the above-mentioned substrates can be prepared by labeling antibiotics with fluorophores and quencher or by modifying them with fluorescent moieties.
  • pro-fluoresces in previously reported fluorescent substrates do not share any structural similarity with CAZ, resulting in selective signaling for CAZ-resistant strains.
  • One aspect is a compound represented by the formula (1);
  • Another aspect is to provide a probe for detecting antibiotic resistant bacteria comprising the compound represented by Chemical Formula 1.
  • Another aspect is to provide a reagent composition for detecting antibiotic resistant bacteria comprising the compound represented by the formula (1).
  • Another aspect is to provide an antibiotic resistant bacterial infection diagnostic kit comprising the compound represented by the formula (1).
  • Another aspect is to provide an antibiotic resistant bacteria detection method comprising the step of contacting the compound represented by Formula 1 with a biological sample.
  • One aspect provides a compound represented by Formula 1 below.
  • R ⁇ 1> may be chosen from the substituent at the 7th position of the core structure of a cephalosporin antibiotic.
  • A may be selected from the group consisting of S, O, SO, SO 2 , and CH 2 .
  • L may be a linker connecting Z to the core structure. Specifically, L is ,
  • R L is a single bond, a C 1-6 alkylene group, a C 2-6 alkenylene group, or a C 2-6 alkynylene group
  • R 3 and R 4 are each independently a C 1-6 alkyl group, C 2-6 alkenyl group, or C 2-6 alkynyl group
  • R 5 is a single bond or C 1-6 alkenyl group
  • R 6 and R 7 are each independently hydrogen or C 1-6 alkyl group, C 2 -6 alkenyl group, or C 2-6 alkynyl group
  • n is an integer from 1 to 4
  • m is an integer from 1 to 9
  • * is a binding site to the core structure
  • * ' is a binding site to Z Can be.
  • Z is a fluorescent moiety.
  • R 1 is selected from the group consisting of H, -NH 2 , and -NHCO-R ', and R' is -CH 2 -CN, -CH 2 S-CF 3 , , ,
  • R L is Wherein R L , *, and * 'are as defined above.
  • R L may be a single bond, methyl or ethyl.
  • a C 1 -C 6 alkyl group means a linear or branched aliphatic hydrocarbon monovalent group having 1 to 6 carbon atoms, and specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isobutyl group, and a sec-butyl group. , ter-butyl group, pentyl group, iso-amyl group, or hexyl group and the like.
  • the C 1 -C 6 alkylene group may mean a divalent group having the same structure as the C 1 -C 6 alkyl group.
  • the C 1 -C 6 alkenyl group has a structure including at least one carbon double bond in the middle or terminal of the C 1 -C 6 alkyl group, and specific examples thereof include an ethenyl group, a propenyl group, a butenyl group, and the like. It may include.
  • the C 1 -C 6 alkenylene group may mean a divalent group having the same structure as the C 1 -C 6 alkenyl group.
  • the C 1 -C 6 alkynyl group has a structure including at least one carbon triple bond in the middle or the terminal of the C 1 -C 6 alkyl group, and specific examples thereof include an ethynyl group, or a propynyl group. ) May be included.
  • the C 1 -C 6 alkynylene group may mean a divalent group having the same structure as the C 1 -C 6 alkynyl group.
  • fluorescent moiety refers to a fluorescent molecule or derivative or conjugate thereof that absorbs light of a certain frequency (eg, UV light) and generates a fluorescent signal as it is separated from Formula 1 can do.
  • the fluorescent moiety may be a quenchcher dye.
  • fluorescent moieties include phenolic dyes such as umbelliferone, fluorescein and resorphin; Aromatic amines, other compounds such as rhodamine, and the like.
  • the fluorescent moiety may be selected from coumarin and related dyes; Xanthene dyes such as fluorescein, rhodol, and rhodamine; Resorupine; Cyanine dyes; Bimaines; Acridine; Isoindole; dansyl dyes; Aminophthalic hydrazides such as luminol and isoluminol derivatives; Aminophthal imides; Aminonaphthalimide; Aminobenzofuran; Aminoquinoline; Dicyanohydroquinone; BODIPY; And europium and terbium composites and compounds associated therewith.
  • Xanthene dyes such as fluorescein, rhodol, and rhodamine
  • Resorupine Cyanine dyes
  • Bimaines Acridine
  • Isoindole Dansyl dyes
  • Aminophthalic hydrazides such as luminol and isolumin
  • the BODIPY is from the group consisting of pyridyl BODIPY, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570 and combinations thereof It may be selected.
  • the fluorescent moiety may additionally include free carboxyl groups, esters (eg, N-hydrosuccinimide (NHS) esters) or maleimide derivatives, and may also contain streptavidin, biotin, paloidine, amine, azide Or iodoacetamide conjugates.
  • esters eg, N-hydrosuccinimide (NHS) esters
  • maleimide derivatives may also contain streptavidin, biotin, paloidine, amine, azide Or iodoacetamide conjugates.
  • the fluorescent moiety may be bound to a cephalosporin-based compound through the linker. Therefore, the fluorescent moiety according to one embodiment is to be separated from the formula 1 by ⁇ -lactamase or extended spectrum ⁇ -lactamase (ESBL) together with L (linker) to fluoresce. Can be.
  • the compound of Formula 1 may be a compound represented by Formula 2;
  • the compound of Formula 1 may be prepared by combining a linker with a fluorescent moiety to prepare a linker-fluorescent moiety complex; And it may be prepared by a method comprising the step of replacing the functional group (B) of the carbon portion 3 of the cephalosporin-based antibiotic represented by the following formula (3) to the complex of the linker-fluorescent moiety.
  • the compound of Formula 1 may be prepared as disclosed in FIG. 2.
  • the compound according to one embodiment emits a high fluorescence signal (e.g., 2.5 times or more fluorescence) in the presence of ⁇ -lactamase or ESBL in the sample and can be confirmed visually, negative
  • a high fluorescence signal e.g., 2.5 times or more fluorescence
  • the presence of antibiotic-resistant bacteria expressing ⁇ -lactamase or ESBL can be efficiently detected, such as compounds for detecting antibiotic-resistant bacteria, reagent compositions, antibiotic-resistant bacterial infection diagnostic kits, antibiotic-resistant bacteria detection methods, and antibiotics. It can be usefully used for the diagnosis of resistant bacterial infections.
  • Another aspect provides a probe for detecting antibiotic resistant bacteria comprising the compound represented by Chemical Formula 1.
  • Another aspect is to provide a reagent composition or assay composition for detecting antibiotic resistant bacteria comprising the compound represented by the formula (1).
  • Another aspect provides the use of a compound represented by Formula 1 for the preparation of a probe, assay composition, or reagent composition for detecting antibiotic resistant bacteria.
  • the compound represented by the formula (1) is as described above.
  • the antibiotic resistant bacterium may refer to a bacterium that is not effectively antibacterial by an antibiotic including beta-lactam.
  • the antibiotic resistant bacterium may be a bacterium expressing ⁇ -lactamase or expanded-spectrum ⁇ -lactamase (ESBL).
  • bacteria expressing the ⁇ -lactamase or ESBL include Enterobacter spp. spp . ), Escherichia spp. spp . ), Salmonella species (Samonella spp . ), Proteus species (Proteus spp . ), Citrobacter spp . , Morganella species spp .
  • the antibiotic to which the bacterium is resistant may include an antibiotic having a beta-lactam ring, and may be, for example, a penicillin antibiotic, or a cephalosporin antibiotic.
  • penicillin-based homeostasis may generally include amino-penicillin (eg, amoxicillin, ampicillin, epicillin, etc.) or carboxy-penicillin (eg, carbenicillin, temocillin, etc.).
  • cephalosporin-based antibiotics examples include first-generation cephalosporins (eg, cefazoline, cephalotin, cephapyrin, etc.) and second-generation cephalosporins (eg, cephachlor, cephamandol, cefminox, etc.) Exhibits a variety of resistance to, but are not limited to, three-generation cephalosporins (e.g., ceftazidime, cytotaxime, seppicsim, cytodimide, aztreonam, etc.) and four-generation cephalosporins (e.g., cefepime, cefepirom, Ceftquinom, zozofran, and the like).
  • first-generation cephalosporins eg, cefazoline, cephalotin, cephapyrin, etc.
  • second-generation cephalosporins eg, cephachlor, cephamandol, cefminox, etc
  • Another aspect provides an antibiotic resistant bacterial infection diagnostic kit comprising the compound represented by Chemical Formula 1.
  • Another aspect provides a method of detecting antibiotic resistant bacteria comprising contacting a compound represented by Formula 1 with a biological sample.
  • Another aspect provides a method of diagnosing an antibiotic resistant bacterial infection comprising contacting a compound represented by Formula 1 with a biological sample.
  • Another aspect provides the use of a compound represented by Formula 1 above for the manufacture of an antibiotic resistant bacterial infection diagnostic kit.
  • antibiotic resistance bacteria are as described above.
  • Fluorescence generated from the compound represented by Chemical Formula 1 may be an indicator of the presence of ESBL or bacteria including the same in a sample, and may be used to diagnose an infectious disease caused by the bacteria. .
  • infectious disease refers to a disease or condition that relates to the presence of an organism (infectious agent) in or in contact with a subject or patient, in particular a “bacterial infectious disease. "Can mean.
  • "beta-lactam antibiotic resistant bacterial infection disease” may refer to an antibiotic resistant bacterial infection disease that is not effectively treated by beta-lactam containing antibiotics.
  • diagnosis refers to determining an individual's susceptibility to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, an individual suffering from a particular disease or condition To determine prognosis (eg, identifying an infectious disease or condition, responsiveness to treatment of the disease and determining its effect), or to provide information about therametrics (eg, treatment efficacy) Monitoring the state of an object).
  • the subject may be a mammal, including a human.
  • the detecting or diagnosing method comprises the steps of contacting the compound of Formula 1 with a target sample; And detecting fluorescence generated from the compound of Formula 1 in the target sample.
  • the contacting may include adding the biological sample or the target sample pretreated to the composition comprising the compound of Formula 1. Pretreatment of the sample can be carried out as appropriate for the intended use by those skilled in the art.
  • the fluorescence signal analysis can be carried out using a variety of methods known in the art, which are read and processed by a suitable apparatus available in the art. For example, protocols and procedures known in the art can be used, including fluorescence analyzers, microplate readers, automated processing with robotic devices, and laser scanning systems.
  • the sample may be a supernatant of biological samples or bacterial cell cultures obtained from lysates of bacterial cells, or animal organs or cells (e.g., blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, secretions, lymph, dialysate, body fluids). , Urine, stool, etc.).
  • lysates of bacterial cells or animal organs or cells (e.g., blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, secretions, lymph, dialysate, body fluids). , Urine, stool, etc.).
  • ⁇ -lactamase or ESBL can be detected with high sensitivity, which can be applied to various biochemical studies, as well as conventional pH indicator-based methods. It is possible to clinically detect antibiotic-resistant bacteria that are not possible in Korea, and to analyze the antibiotic-resistant bacteria with high sensitivity from the target sample for molecular diagnosis of antibiotic-resistant bacterial infections, and to apply them effectively for medical purposes such as in vitro diagnosis. It can be effective.
  • 1 is a chemical reaction result showing hydrolysis of ceftazidime (top panel) and BODIPY-based fluorescent substrate (bottom panel) by ⁇ -lactamase.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a process of synthesizing a probe compound according to one embodiment.
  • 3A shows a probe (1 ⁇ M) according to one embodiment when the probe according to one embodiment is excited at 490 nm before (black line) and after reaction (red line) with TEM-1 ⁇ -lactamase. Fluorescence emission profile of; Inset images show the probe solution in the absence (left) and presence (right) of the enzyme;
  • Figure 3b is a result showing the signal increase in the enzymatic degradation of the probe (200 nM) according to one embodiment according to the concentration of TEM-1 ⁇ -lactamase.
  • 4A is a graph showing time-dependent fluorescence signal increase in enzymatic response to a probe (2 ⁇ M) according to one embodiment.
  • 4B is a graph showing Michaelis-Menton plot for the enzymatic digestion of 4.
  • 5A is a graph showing fluorescence signal results measured at 30, 60 and 90 minutes after treatment of a probe according to one embodiment to CAZ-resistant bacterial lysate; Signals observed from bacteria treated with MIC ⁇ 0.5 mg / mL or MIC> 0.5 mg / mL CAZ were expressed as hatched bars or empty bars, respectively.
  • 5B is a graph showing the results of plotting the fluorescence intensity measured in response to CAZ-resistant bacterial lysate of a probe according to one embodiment against the MIC of CAZ; Fluorescence intensity is the intensity at 90 minutes minus the intensity at 0 minutes.
  • 6A is a graph showing fluorescence signal results measured 30 minutes, 60 minutes and 90 minutes after treatment of a probe according to one embodiment to CAZ and CTX resistant bacterial lysates;
  • FIG. 6B is a graph showing the results of plotting fluorescence intensities measured in response to CAZ and CTX resistant bacterial lysates of probes against MIC of CAZ and CTX according to one embodiment;
  • Fluorescence intensity is the intensity at 90 minutes minus the intensity at 0 minutes;
  • ESBL producers are shown as triangles and each data value is the average of two independent experiments;
  • Triangles enclosed in circles represent CTX-M-9 strains.
  • FIG. 7 is a graph showing fluorescence intensity measured in the reaction of a probe with CAZ and / or CTX resistant bacterial lysate according to one embodiment; S and R represent sensitivity and resistance to antibiotics, respectively; Fluorescence intensity is the intensity at 90 minutes minus the intensity at 0 minutes.
  • TEM-1 ⁇ -lactamase was purchased from Prospec (USA). Unless otherwise stated, all materials were purchased from Sigma-Aldrich (USA) and used without further purification. Profiles of UV absorption spectra and fluorescence emission spectra were recorded on a Libra S22 UV / Vis spectrophotometer (Biochrom, UK) and F-7000 fluorescence spectrometer (Hitachi, Japan), respectively. Fluorescence intensities of the synthesized probes used in pH-dependent experiments and enzyme assays were measured in an Appliskan TM multimode microplate reader (Thermo Scientific, USA).
  • BODIPY-based fluorescent probes were synthesized as shown in FIG. 2. Condensation of 4-pyridinecarboxaldehyde and 2,4-dimethylpyrrole in the presence of trifluoroacetic acid according to a previously reported procedure (J. Bartelmess and WW Weare, Dyes Pigm., 2013, 97, 1.) Bispyrrole pyridine (Compound 1) was first synthesized by oxidizing with DDQ. Treatment of compound 1 with boron trifluoride diethyl etherate and Hunig's base provided BODIPY derivative 2 as a dark red powder. Next, RF Brown, MD Kinnick, JM Jr.
  • I the refractive index of the solvent.
  • I is the integrated fluorescence intensity and OD is the absorbance at the excitation wavelength.
  • the integrated fluorescent region was obtained from the emission spectrum of the compound using an F-7000 fluorescence spectrometer.
  • Enzyme kinetic analysis was performed for signaling characterization of the probe for ⁇ -lactamase.
  • TEM-1 Bla 0.1-2.0 U / ⁇ L of TEM-1 Bla was added to the fluorescent probe (2-150 ⁇ ) present in 100 mM Tris-HCl (pH 7) in 96-black wells. Fluorescence intensity was measured immediately after enzyme treatment and signal intensity was continuously monitored for 60 minutes at 5 minute intervals in a microplate reader and the results are shown in FIG. 3. The control group was not treated with TEM-1 Bla.
  • increased intensities were plotted according to the probe concentration, the results are shown in FIG. 4. The parameters were then obtained by curve non-linear fitting.
  • the sensitivity of the probe to the detection of TEM-1 was found to be low as 0.03125 U / mL. As a result, it can be seen that the probe can successfully detect the enzyme activity of Bla.
  • intensity measurements on probes of various concentrations provided kcat of 12 ⁇ 1 s ⁇ 1 and Km of 51 ⁇ 12 ⁇ M.
  • CAZ and / or CTX-resistant bacteria were used to evaluate the performance of fluorescence tests with dual-reactive probes.
  • the strains were provided by several Korean hospitals or Dr. Nordmann (Swizterland). The above strains were previously screened for ESBL production using a disk strengthening method (W. Song, IK Bae, YN Lee, CH Lee, SH Lee and SH Jeong, J Clin Microbiol, 2007, 45, 1180) and blaCTX-M Was characterized for ⁇ -lactamase content at the molecular level through multiplex PCR and sequencing.
  • test strains were isolated from Muller-Hinton agar (Asan, South Korea) and incubated at 37 ° C. for 16-24 hours prior to fluorescence testing. Extraction of bacterial proteins was performed as previously described (P. Nordmann, L. Poirel and L. Dortet, Emerg. Infect. Dis., 2012, 18, 1503.). Briefly, the test strains of one calculated inoculation loop (10 ⁇ L) are reproduced in 150 ⁇ L of 200 mM Tris-HCl lysis buffer (B-PERII, bacterial protein extraction reagent; Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA) It was cloudy, vortexed for 1 minute and further reacted at room temperature for 30 minutes.
  • B-PERII Tris-HCl lysis buffer
  • Fluorescent signals were measured using an Infinite F200pro (Tecan Croup Ltd., Manndorf, Switzerland) microplate reader in power mode. The excitation and emission wavelengths were set to 485 nm (20 nm bandwidth) and 535 nm (25 nm bandwidth), respectively. In each well a polystyrene black 96 bottomed well microplate (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) with a maximum volume of 130 ⁇ L was used. The fluorescence signal of each test sample was measured every 5 minutes for 90 minutes, and the results are shown in FIGS. 5 to 7. As a positive control, a phenol red assay was performed. Specifically, for the phenol red assay, 30 ⁇ L of supernatant was reported as previously reported (P.
  • the CAZ and / or CTX resistant bacteria are clearly distinguished from drug-sensitive bacteria having a minimum inhibitory concentration (MIC) of less than 0.5 mg / mL or 1 ug / ml. It became.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the fluorescence intensity was increased in CAZ-resistant and CTX-sensitive strains, CAZ-sensitive and CTX-resistant strains, and strains resistant to both CAZ and CTX, but CAZ and CTX It can be seen that the fluorescence intensity did not increase in both strains sensitive to both.
  • the probe according to one embodiment can detect strains resistant to cephalosporin-based antibiotics.
  • the probe according to one embodiment can effectively detect antibiotic resistant bacteria.
  • bacteria Four or more bacteria were found in the fungus, including Citrobacter freundii and Kluyvera cryocrescens, Escherichia coli and Klebsiella oxytoca, Citrobacter braakii and Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli and Enterobacter cloacae, respectively.
  • Treatment of anaerobic samples was carried out as follows. After centrifugation of 10 mL blood culture, the supernatant except for salivation was removed. After washing three times with 10 ml brine, the flotation was suspended by adding 0.5 ml brine to the saline and transferred to two 1.5 ml tubes of 100 ul and 400 ul each. After the centrifugation again, discard the supernatant of the tube dispensed 400 ul B-PER 300 ul, vortexing was performed at 4 °C for 30 minutes. After lysing (lysis) the sample was centrifuged and the supernatant was used for fluorescence intensity measurement. After dispensing 100 ul of the tube, the supernatant was removed after centrifugation, DW 100 ul was added thereto, heated at 10 ° C. for 10 minutes, and centrifuged to use the supernatant for PCR experiments.
  • Treatment of aerobic samples was carried out as follows. After centrifugation of 10 mL blood culture, the supernatant was removed, and 1 ml of ammonium chloride and 5 ml of 5% saponin solution were mixed with sap and left for 10 minutes. After removing the supernatant after centrifugation and washed three times with 10 ml brine, the same process as the anaerobic sample.
  • the ROC curve was confirmed with respect to the above result.
  • the probe according to the embodiment showed the best results with a 10 minute AUC of 0.967, so the sensitivity and specificity were calculated from the values of this time zone.
  • Urine samples were used from Gangnam St. Mary's Hospital.
  • Target strains were 53 ESBL positive strains, of which Escherichia was a 10 a 43 gaeyeotgo coli, Klebsiella pneumoniae, ESBL negative strains of 51 dogs Escherichia There were 43 coli , 5 Klebsiella pneumoniae , and 3 Klebsiella oxytoca .
  • Pretreatment of urine samples was performed as follows. The supernatant was discarded by centrifuging 7 ml of urine at 4000 g and the pellet was washed twice with 7 ml of PBS. In the final washing process, pellets were dissolved in 350 ul of PBS, 70 ul was used for DNA separation, and 180 ul was centrifuged again and placed in 200 ul of B-PER solution and vortexed for 30 minutes.
  • ESBL detection CTX or CAZ resistance detection Inspection responsiveness Specificity responsiveness Specificity Probe of Example 1 63.0% (34/54) 80% (40/50) 64.8% (35/54) 82% (41/50) Phenolic red 31.5% (17/54) 100% (50/50) 31.5% (17/54) 100% (50/50)
  • the probe according to one embodiment can detect ESBL expressing bacteria and antibiotic resistant bacteria with high sensitivity and specificity even in actual clinical samples.
  • the probe according to one embodiment can detect ⁇ -lactamase or ESBL with high sensitivity, which can be applied to various biochemical studies, as well as in conventional pH indicator-based methods. It is possible to clinically detect antibiotic resistant bacteria, and to analyze molecular resistance of antibiotic resistant bacterial infections and to analyze antibiotic resistant bacteria with high sensitivity from a target sample.

Abstract

시료 내 약물-내성 박테리아 검출용 프로브, 이를 포함하는 조성물, 키트, 및 검출 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 화합물 및 그를 포함하는 프로브에 의하면, β-락타마제 또는 ESBL을 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 pH 지시인자-기반된 방법에서 가능하지 않은 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있어, 체외 진단과 같은 의약 용도로 효과적으로 적용할 수 있는 효과가 있다.

Description

시료 내 약물-내성 박테리아 검출용 프로브 및 이의 용도
시료 내 약물-내성 박테리아 검출용 프로브, 이를 포함하는 조성물, 키트, 및 검출 방법에 관한 것이다.
항생제 내성 박테리아의 출현은 공중 위생에 대한 위협을 초래하였다. 내성의 가장 일반적인 기작들 중 하나가 항생제의 β-락탐 고리를 절단할 수 있는 β-락타마제(Bla)의 발현으로, 이는 상기 약물의 활성 손실을 일으킨다. 더욱이, 확장된 스펙트럼의 β-락타마제(ESBL) 생산자로 분류된 상당한 수의 상술한 박테리아들은 하나의 타입의 약물뿐 아니라 다양한 β-락탐-기반된 항생제에 대한 내성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 상기 약물 내성 박테리아를 치료하는 차세대 항생제의 개발이 시간-소모적이고 비용이 많이 드는 과정인 반면에, 초기 검출 및 민감성 검출에 기반된 상기 감염된 개인의 동정은 관련 상황을 다루는 선택적인 방법으로, 이는 상기 약물-내성 박테리아에 의한 감염이 광범위하게 번지는 것을 예방할 수 있다. 상기 박테리아를 빠르고 효율적으로 검출하는 두 개의 접근방법들이 있다: (1) pH 센서-기반된 프로브 및 (2)형광성 기질 프로브. 대부분 β-락탐 항생제의 가수분해는 용액의 pH를 낮추어, 박테리아의 약물 내성을 검출하기 위해 pH 지시인자로 용이하게 모니터링될 수 있다. 하지만, 상기 용액의 pH는 반응 환경에 의해 매우 다양할 수 있기 때문에 상기 pH 지시인자-기반된 Bla 어세이는 종종 거짓-음성 결과들을 제공한다. 특히, Bla에 의한 세팔로스포린-유래 β-락탐 항생제인 세프타지딤(ceftazidime, CAZ)의 가수분해는 약물의 효소적 분해에 따라 배출되는 피리딘의 완충 효과로 인해 배지의 산성을 유도하지 않는다. CAZ의 가수분해를 직접적으로 모니터링하기 위해, 산성 센서 대신에 Bla의 형광성 기질을 이용할 수 있다. 상술한 기질은 항생제를 형광물질(fluorophores) 및 퀀처로 표지하거나 또는 형광성 모이어티로 변형시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 이전에 보고된 형광성 기질 내 프로-형광물질은 CAZ와 어떠한 구조적 유사성을 공유하지 않아 CAZ-내성 스트레인들에 대한 선택적 시그널링을 초래할 수 있다.
상술한 단점들을 극복하기 위해 ESBL을 발현하는 항생제 내성 박테리아의 존재를 보다 정확하고 효율적으로 검출할 수 있는 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물;
[화학식 1]
Figure PCTKR2016007476-appb-I000001
(코어 구조(core-structure)-L-Z)을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016007476-appb-I000002
(코어 구조(core-structure)-L-Z).
식 중, R1은 세팔로스포린계 항생제의 코어 구조의 7번 위치의 치환기로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 A는 S, O, SO, SO2, 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 L은 코어 구조와 Z를 연결하는 링커일 수 있다. 구체적으로, 상기 L은
Figure PCTKR2016007476-appb-I000003
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000004
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000005
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000006
, 또는
Figure PCTKR2016007476-appb-I000007
이고, RL은 단일결합이거나, C1-6 알킬렌기, C2-6 알케닐렌기, 또는 C2-6 알키닐렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, 또는 C2-6 알키닐기이고, R5는 단일결합이거나, C1-6 알케닐기이고, R6 및 R7는 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, 또는 C2-6 알키닐기이고, n은 1 내지 4의 정수이고, m은 1 내지 9의 정수이고, *는 코어 구조와의 결합 부위이고, *'는 Z와의 결합 부위일 수 있다.
상기 Z는 형광 모이어티이다.
또한 식 중 상기 R1은 H, -NH2, 및 -NHCO-R'로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 -CH2-CN, -CH2S-CF3,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000008
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000009
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000010
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000011
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000012
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000013
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000014
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000015
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000016
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000017
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000018
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000019
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000020
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000021
,
Figure PCTKR2016007476-appb-I000022
,
및
Figure PCTKR2016007476-appb-I000023
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서,
상기 L은
Figure PCTKR2016007476-appb-I000024
이고, 상기 식 중 RL, *, 및 *'는 상기에서 정의한 바와 같다. 예를 들면, 상기 RL은 단일결합이거나, 메틸 또는 에틸일 수 있다.
본 명세서 중 C1-C6알킬기는 탄소수 1 내지 6의 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소 1가(monovalent) 그룹을 의미하며, 구체적인 예에는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소부틸기, sec-부틸기, ter-부틸기, 펜틸기, iso-아밀기, 또는 헥실기 등을 포함할 수 있다. 본 명세서 중 C1-C6 알킬렌기는 상기 C1-C6 알킬기와 동일한 구조를 갖는 2가(divalent) 그룹을 의미할 수 있다.
본 명세서 중 C1-C6알케닐기는 상기 C1-C6알킬기의 중간 또는 말단에 하나 이상의 탄소 이중 결합을 포함한 구조를 가지며, 이의 구체적인 예에는, 에테닐기, 프로페닐기, 또는 부테닐기 등을 포함할 수 있다. 본 명세서 중 C1-C6알케닐렌기는 상기 C1-C6알케닐기와 동일한 구조를 갖는 2가 그룹을 의미할 수 있다.
본 명세서 중 C1-C6알키닐기는 상기 C1-C6알킬기의 중간 또는 말단에 하나 이상의 탄소 삼중 결합을 포함한 구조를 가지며, 이의 구체적인 예에는, 에티닐기(ethynyl), 또는 프로피닐기(propynyl) 등을 포함할 수 있다. 본 명세서 중 C1-C6알키닐렌기는 상기 C1-C6알키닐기와 동일한 구조를 갖는 2가 그룹을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광성 모이어티(fluorescent moiety)"는 화학식 1로부터 분리됨에 따라 특정 주파수의 광(예컨대, UV 광)을 흡수하여 형광 시그널을 발생시키는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 형광성 모이어티는 퀀칭 염료(quencher dye)일 수 있다. 형광성 모이어티의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인 및 레소루핀 같은 페놀성 염료(dyes); 방향성 아민, 및 로다민 같은 다른 화합물들 등을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 형광성 모이어티는 쿠마린 및 이와 관련된 염료; 플루오레세인, 로돌, 및 로다민 같은 크산텐(xanthene) 염료; 레소루핀; 시아닌 염료; 바이메인 염료(bimanes); 아크리딘; 이소인돌; 단실(dansyl) 염료; 루미놀 및 이소루미놀 유도체 같은 아미노프탈성 히드라지드(aminophthalic hydrazides); 아미노프탈 이미드; 아미노나프탈이미드; 아미노벤조퓨란; 아미노퀴놀린; 디시아노히드로퀴논; BODIPY; 및 유로퓸 및 터븀 복합체 및 이와 관련된 화합물을 포함할 수 있다. 상기 BODIPY는 피리딜 BODIPY, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 형광성 모이어티는 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 또한 스트렙타비딘, 바이오틴, 팔로이딘, 아민, 아자이드 또는 이오도아세트아미드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 형광성 모이어티는 상기 링커를 통해 세팔로스포린계 화합물에 결합된 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 형광성 모이어티는 L(링커)과 함께 β-락타마제 또는 확장된 스텍트럼 β-락타마제(extended spectrum β-lactamase: ESBL)에 의해 상기 화학식 1로부터 분리되어 형광을 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다;
[화학식 2]
Figure PCTKR2016007476-appb-I000025
.
상기 화학식 1의 화합물은,
하기 화학식 3으로 표시되는 세팔로스포린계 항생제의 3번 탄소 부위의 기능기(B)를 링커로 치환하는 단계; 및 상기 링커를 통해 세팔로스포린계 항생제의 코어 구조와 연결된 형광 모이어티를 결합시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물은 링커와 형광 모이어티를 결합시키 링커-형광 모이어티 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 링커-형광 모이어티의 복합체로 하기 화학식 3으로 표시되는 세팔로스포린계 항생제의 3번 탄소 부위의 기능기(B)를 치환하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2016007476-appb-I000026
예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물은 도 2에 개시된 바와 같이 제조되는 것일 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 화합물은 시료내 β-락타마제 또는 ESBL의 존재 시 높은 형광 시그널(예를 들면, 2.5배 이상의 형광)을 방출하고 이를 육안으로도 확인할 수 있어, 음성 대조군과 비교하여 β-락타마제 또는 ESBL을 발현하는 항생제 내성 박테리아의 존재를 효율적으로 검출할 수 있어, 항생제 내성 박테리아 검출용 화합물, 시약 조성물, 항생제 내성 박테리아 감염 진단 키트, 항생제 내성 박테리아 검출 방법, 항생제 내성 박테리아 감염 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
이하에서, 상기 화학식 1의 용도를 상세히 설명한다.
다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물 또는 어세이 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브, 어세이 조성물, 또는 시약 조성물의 제조를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다.
화학식 1로 표시되는 화합물에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 항생제 내성 박테리아는 베타-락탐을 포함하는 항생제에 의해 효과적으로 항균되지 않는 박테리아를 의미할 수 있다. 상기 항생제 내성 박테리아는 β-락타마제 또는 확장된-스펙트럼 β-락타마제(ESBL)를 발현하는 박테리아인 것일 수 있다. 상기 β-락타마제 또는 ESBL을 발현하는 박테리아의 예는 엔테로박터 종(Enterobacter spp .), 에스체리시아 종(Escherichia spp .), 살모넬라 종(Samonella spp .), 프로테우스 종(Proteus spp .), 시트로벡터 종(Citrobacter spp .), 모르가넬라 종(Morganella spp .), 박테로이데스 종(Bacteroides spp .), 프로비덴시아 종(Providencia spp .), 세라티아 종(Serratia spp), 클렙시엘라 종(Klebsiellaspp .), 쉬겔라 종(Shigella spp .), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp .), 아시네토박터 종(Acinetobacter spp .) 또는 클루이베라 종(Kluyvera spp .)을 포함할 수 있다. 또한, 계속해서 예를 들면, 상기 박테리아의 예는 엔테로박터클로아케(E. cloacae), 엔테로박터 애로게네스(E. aerogenes), 에스체리시아 콜라이(E. coli), 살모넬라 엔테리카(S. enterica), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 파라티피(S. paratyphi), 프로테우스 불가리스(P. vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(P. mirabilis), 시트로박터 브라아키(C. braaki), 시트로박터 프레운디(C.freundii), 시트로박터 디베르수스(C. diversus), 모르가넬라 모르가니(M.morganii), 박테로이데스 프라길리스(B. fragilis), 박테로이데스 불가투스(B.bulgatus), 프로비덴시아 레트게리(P. rettgeri), 프로비덴시아 스투아르티(P.stuartii), 세라티아 마르세센스(S. marcescens), 세라티아 폰티콜라(S.fonticola), 세라티아 리쿼파시엔스(S. liquefaciens), 클렙시엘라 뉴모니아(K.pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(K. oxytoca), 쉬겔라 디센테리애(S.dysenteriae), 쉬겔라 소네이(S. sonnei), 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa),아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 클루이베라 아스코르바타(K. ascorbata) 및 클루이베라 게오르기아나(K. georgiana)를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 박테리아가 내성을 갖는 항생제는 베타-락탐 고리를 갖는 항생제를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 페니실린계 항생제, 또는 세팔로스포린계 항생제일 수 있다. 상기 페니실린계 항상제의 예는 일반적으로 아미노-페니실린(예컨대, 아목시실린, 암피실린, 에피실린, 등) 또는 카르복시-페니실린(예컨대, 카르베니실린, 테모실린, 등)을 포함할 수 있다. 상기 세팔로스포린계 항생제의 예는 1-세대 세팔로스포린(예컨대, 세파졸린, 세팔로틴, 세파피린 등) 및 2-세대 세팔로스포린(예컨대, 세파클로르, 세파만돌, 세프미녹스, 등)에 다양한 내성을 나타내지만, 3-세대 세팔로스포린(예컨대, 세프타지딤, 세포탁심, 세픽심, 세포디짐, 아즈트레오남 등) 및 4-세대 세팔로스포린(예컨대, 세페핌, 세프피롬, 세프퀴놈, 세포조프란, 등)을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 항생제 내성 박테리아 감염 진단 키트의 제조를 위한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 항생제 내성 박테리아에 대해서는 상기한 바와 같다.
일 양상에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 발생되는 형광은 시료 내 ESBL 또는 이를 포함하는 박테리아의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 이를 통해 상기 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환의 진단에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감염 질환(infectious disease)"은 대상자(subject) 또는 환자 내에 또는 이와 접촉하는 생물체(감염성 제제)의 존재와 관계되는 질환 또는 상태, 특히 "박테리아 감염 질환(bacterial infectious disease)"을 의미할 수 있다. 예를 들어, "베타-락탐 항생제 내성 박테리아 감염 질환"은 베타-락탐 포함 항생제들에 의해 효과적으로 치료되지 않는 항생제 내성 박테리아 감염 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)(예컨대, 감염 질환 또는 상태의 동정, 상기 질환의 치료에 대한 반응성 및 이의 효과 판단)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함할 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함하는 포유류 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 검출하는 방법 또는 진단하는 방법은 상기 화학식 1의 화합물을 목적 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 목적 시료에서 상기 화학식 1의 화합물로부터 발생된 형광을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 접촉시키는 단계를 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물에 전처리된 상기 생물학적 시료 또는 목적 시료를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료의 전처리는 통상의 당업자가 목적하는 용도에 맞게 적절하게 수행할 수 있다.
목적 시료와 접촉(반응)시켜 상기 화학식 1의 화합물의 가수분해에 따른 형광 방출을 측정함으로써 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써 항생제 내성 박테리아에 의한 감염 질환을 진단하거나 항생제 내성 박테리아를 검출할 수 있다. 상기 형광 시그널 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시될 수 있으며, 당업계에서 이용 가능한 적합한 장치(apparatus)에 의해 판독되고 프로세싱된다. 예를 들어, 형광 분석기, 마이크로플레이트 판독기, 로봇 장치들을 이용한 자동화 프로세싱, 레이저 스캐닝 시스템을 포함하는 당업계에 알려진 프로토콜 및 과정들이 이용될 수 있다.
상기 시료는 박테리아 세포의 용해물로부터 얻어지는 생물학적 시료들 또는 박테리아 세포 배양액의 상층액, 또는 동물 기관 또는 세포(예컨대, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 분비물, 림프액, 투석액(dialysate), 체액(sap), 소변, 대변 등)을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 화합물 및 그를 포함하는 프로브에 의하면, β-락타마제 또는 ESBL을 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 pH 지시인자-기반된 방법에서 가능하지 않은 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있어, 체외 진단과 같은 의약 용도로 효과적으로 적용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 β-락타마제에 의한 세프타지딤(위쪽 패널) 및 BODIPY-기반된 형광성 기질(아래쪽 패널)의 가수분해를 보여주는 화학반응 결과이다.
도 2는일 구체예에 따른 프로브 화합물의 합성 과정을 나타내는 도면이다. a) i)CF3CO2H, CH2Cl2/EtOH(14:1), 상온, 72시간; 및 ii)DDQ(2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone), 상온, 4시간; b) i-Pr2NEt, BF3·OEt2, CH2Cl2, 상온, 12시간, 21%(2 단계); c) i) MSTFA, CH2Cl2 , 40℃, 2시간; ii) TMSI, CH2Cl2, 0℃ 내지 상온, 1시간; 및 iii) 2, CH3CN, 상온, 12시간, 33%. DDQ = 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논/MSTFA = N-메틸-N-(트리메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드/이오도트리메틸실란.
도 3a는 일 구체예에 따른 프로브가 TEM-1 β-락타마제와 반응 전(검은색 선) 및 반응 후(빨간색 선)에 490 nm에서 여기하는 경우, 일 구체예에 따른 프로브(1 μM)의 형광 방출 프로파일을 나타낸다; 삽입(inset) 이미지는 효소의 부존재(왼쪽) 및 존재(오른쪽) 하에서 상기 프로브 용액을 나타낸다;
도 3b는 TEM-1 β-락타마제의 농도에 따라 일 구체예에 따른 프로브(200 nM)의 효소적 분해에서의 시그널 증가를 보여주는 결과이다.
도 4a는 일 구체예에 따른 프로브(2 μM)에 대한 효소 반응에서 시간-의존적 형광 시그널 증가를 보여주는 그래프이다.
도 4b는 4의 효소적 분해에 대한 미카엘리스-멘톤 플롯을 보여주는 그래프이다.
도 5a는 CAZ-내성 박테리아 용해물에 일 구체예에 따른 프로브의 처리 후 30분, 60분 및 90분째에 측정된 형광 시그널 결과를 나타내는 그래프이다; MIC < 0.5 mg/mL 또는 MIC ≥ 0.5 mg/mL CAZ으로 처리된 박테리아로부터 관찰된 시그널들은 각각 빗금 막대 또는 빈 막대로 표현하였다.
도 5b는 일 구체예에 따른 프로브의 CAZ-내성 박테리아 용해물과의 반응에서 측정된 형광 강도를 CAZ의 MIC에 대해 플롯팅한 결과를 나타내는 그래프이다; 형광 강도는 90분에서의 강도에서 0분에서의 강도를 뺀 값이다.
도 6a는 CAZ 및 CTX 내성 박테리아 용해물에 일 구체예에 따른 프로브의 처리 후 30분, 60분 및 90분째에 측정된 형광 시그널 결과를 나타내는 그래프이다; (MICCAZ + MICCTX) < 1 ug/ml 또는 (MICCAZ + MICCTX) > 1 ug/ml < 0.5 mg/mL 또는 MIC ≥ 0.5 mg/mL CAZ으로 처리된 박테리아로부터 관찰된 시그널들은 각각 빈 막대 또는 빗금 막대로 표현하였다; ESBL 생산 균주는 별표로 표시하였다.
도 6b는 일 구체예에 따른 프로브의 CAZ 및 CTX 내성 박테리아 용해물과의 반응에서 측정된 형광 강도를 CAZ 및 CTX의 MIC에 대해 플롯팅한 결과를 나타내는 그래프이다; 형광 강도는 90분에서의 강도에서 0분에서의 강도를 뺀 값이다; ESBL 생산자는 삼각형으로 나타내었고, 각 데이터 값은 두 개의 독립된 실험의 평균 값이다; 동그라미 내에 들어가있는 삼각형은 CTX-M-9 균주를 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 프로브의 CAZ 및/또는 CTX 내성 박테리아 용해물과의 반응에서 측정된 형광 강도를 나타낸 그래프이다; S 및 R는 각각 항생제에 대한 민감성 및 내성을 나타낸다; 형광 강도는 90분에서의 강도에서 0분에서의 강도를 뺀 값이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예
TEM-1 β-락타마제는 Prospec(USA)로부터 구매하였다. 다르게 기재되지 않는 한, 모든 물질들은 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구매하여 추가적인 정제없이 이용하였다. UV 흡수 스펙트럼 및 형광 방출 스펙트럼의 프로파일은 각각 Libra S22 UV/Vis 분광 광도계(Biochrom, UK) 및 F-7000 형광 분광계(Hitachi, Japan)에서 기록하였다. pH-의존성 실험들 및 효소 어세이에서 이용된 합성된 프로브의 형광 강도는 Appliskan™ 멀티모드 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific, USA)에서 측정하였다.
실시예 1. 항생제 내성 박테리아 검출을 위한 프로브의 제조
BODIPY-기반된 형광성 프로브는 도 2에 도시된 대로 합성하였다. 이전에 보고된 과정(J. Bartelmess and W. W. Weare, Dyes Pigm., 2013, 97, 1.)에 따라, 트리플루오로아세트산의 존재 하에서 4-피리딘카르복스알데히드와 2,4-디메틸피롤의 응축시킨 후 DDQ로 산화시킴으로써 비스피롤 피리딘 (화합물 1)을 먼저 합성하였다. 보론 트리플루오리드 디에틸 에테레이트 및 휘니그 염기(Hunig's base)를 이용한 화합물 1의 처리는 암적색 파우더로서 BODIPY 유도체 2를 제공하였다. 다음으로, 브라운 등(R. F. Brown, M. D. Kinnick, J. M. Jr. Morin, R. T.Vasileff, F. T. Counter, E. O. Davidson, P. W. Ensminger, J. A. Eudaly, J. S.Kasher, A. S. Katner, J.Med. Chem, 1990, 33, 2114.)에 의해 보고된 방법에 따른 3단계 순서로 화합물 2와 세포탁심 (화합물 3)의 커플링 반응을 실시하였다. MSTFA를 이용한 화합물 3의 실릴화는 상응하는 TMS 에스테르를 산출하였고, 이후 디클로메탄에 녹여진 이오도트리메틸실란과 반응시켜 3'-요오드 중간산물을 생산하였다. 마지막으로, BODIPY 2로 요오드의 대체는 붉은색 분말의 프로브 (화합물 4)를 생산하였다. 상기의 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
1.1. 1,3,5,7-테트라메틸-8-(4-피리딜)-4,4'-디-플루오로보라디아자인다센(1,3,5,7-Tetramethyl-8-(4-pyridyl)-4,4'-di-fluoroboradiazaindacene)(2)의 제조
Figure PCTKR2016007476-appb-I000027
2,4-디메틸피롤(300 μL, 2.91 mmol) 및 4-피리딘카르복스알데히드(137 μL, 1.46 mmol)를 에탄올/디클로메탄의 산소 제거된 1:14(v/v) 혼합물(30mL)에 녹였다. 여러 점적의 트리플루오로아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 상온에서 72시간 동안 교반시켰다. 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(330 mg, 1.46 mmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 추가적으로 4시간 동안 교반시켰다. 이후 용매를 감압 하에서 제거하였고, 결과 잔류물을 건조 디클로로메탄(30 mL)에 용해시켰다. 이후 N,N-디이소프로필에틸아민(1.49 mL, 8.32 mmol) 및 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트(1.59 mL, 12.85 mmol)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 12시간 동안 교반시켰다. 형성된 암적색 침전물을 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 상기 조 물질을 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄/에틸 아세테이트, 4:1(v/v))로 정제하여 암적색 분말의 화합물 2(100 mg, 21%)를 생산하였다.
Melting Point(MP): 235.3-236.2℃. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.78 (d, J = 4.4, 1.6 Hz, 2H), 7.30 (dd, J = 4.3, 1.6 Hz, 2H), 6.01 (s, 2H), 2.56 (s, 6H), 1.41(s, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 156.9, 150.7, 143.6, 142.7, 137.7, 130.4, 123.3, 121.8, 14.62, 14.58.
1.2. (E)-10-(1-((7-(2-(2-아미노티아졸-4-일)-2-(메톡시이미노)아세트아미도)-2-카르복시-8-옥소-5-티아-1-아자비시클로[4.2.0]옥트-2-엔-3-일)메틸)피리딘-1-이움-4-일)-5,5-디플루오로-1,3,7,9-테트라메틸-5H-디피롤로[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]디아자보리닌-4-이움-5-우이드 이오디드((E)-10-(1-((7-(2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-(methoxyimino)acetamido)-2-Carboxy-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-3-yl)methyl)pyridin-1-ium-4-yl)-5,5-Difuoro-1,3,7,9-tetramethyl-5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinin-4-ium-5-uide iodide)(4)의 제조
Figure PCTKR2016007476-appb-I000028
세포탁심 (화합물 3)(80 mg, 0.18 mmol)을 질소 대기 하에서 디클로메탄(5 mL)에 현탁하였다. N-메틸-N-(트리메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드(127 μL,0.68 mmol)를 첨가하고 혼합물을 40℃까지 잠시 동안 가온 하였다. 세펨트리메틸실릴 에스테르의 균질성 용액을 상온까지 냉각시킨 후 트리메틸실릴 이오디드(77 μL, 0.54 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 교반시킨 후, 용매를 진공 하에서 증발시켜 오일로서 3'-아이오도메틸 세펨을 제조하였다. 상기 잔류물을 아세토니트릴(4 mL)에 녹이고 테트라히드로퓨란(64 μL, 0.8 mmol)을 첨가하여 과량의 트리메틸실릴 이오디드를 파괴시켰다. 피리딘-치환된 BODIPY 2(59 mg, 0.18)를 아세토니트릴(1 mL)에 용해시키고, 일정 부분을 상기 반응 용액에 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 12시간 동안 교반시킨 후 5% 메탄올성 아세톤(20 mL)에 첨가하여 트리메틸실릴 기를 가수분해시켰다. 수소 아이오다이드 염(hydrogen iodide salt)으로 분리된 상기 조 산물을 여과하였으며 에틸 아세테이트/디클로로메탄으로 세척하고 진공 하에서 건조시켰다. 상기 결과 고체(디클로로메탄에 녹지 않음)를 열여과(hot filtration)로 정제하여 붉은색 분말(50 mg, 33%)인 화합물 4를 생산하였다.
MP: 107.0-110.0℃(decomp). 1H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 9.23 (d, J =6.8 Hz, 2H), 8.23 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.80 (s, 1H), 6.07 (s, 2H), 5.80 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 5.79 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 5.19 (d,J = 5.2 Hz, 1H), 3.91 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.69 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 3.27(d, J = 18.4 Hz, 1H), 2.41 (s, 6H), 1.37 (s, 6H). HRMS-ESI (m/z): C32H32BF2N8O5S2 + 721.1998에 대해 산출된 [M]+는 721.1997이었다.
1.3. 양자 수율의 결정
상기 합성된 프로브의 형광성 양자 수율(Φ F )은 방정식 (1)을 이용하여 피리딜 BODIPY (화합물 2)의 알려진 값(디클로로메탄에서 Φ ref = 0.3)(Bartelmess,J., Weare, W.W., Dyes Pigm. 2013, 97 (1), 1.)에 기반하여 산출하였다.
Figure PCTKR2016007476-appb-I000029
식 중, η는 용매의 굴절률(refractive index)이다. I는 통합된 형광 강도이고, OD는 여기 파장에서의 흡광도이다. 상기 통합된 형광성 영역은 F-7000 형광 분광계를 이용한 상기 화합물의 방출 스펙트럼으로부터 얻었다. 그 결과, 상기 실시예 1.에서 합성된 프로브의 상대적인 양자 수율(Φ fl )은 피리딜 BODIPY의 양자 수율(Φ fl = 0.3)에 대해 상대적으로 0.09로 결정되었다.
실험예 1. β-락타마제에 대한 프로브의 시그널링 특성 분석
β-락타마제에 대한 프로브의 시그널링 특성 분석을 위해 효소 동역학 분석을 수행하였다.
구체적으로, 96-블랙 웰에 100 mM Tris-HCl(pH 7)에 존재하는 형광성 프로브(2 내지 150 μM)에 0.1 내지 2.0 U/μL의 TEM-1 Bla를 첨가하였다. 효소 처리 후 즉시 형광 강도를 측정하였고 시그널 강도를 마이크로플레이트 판독기에서 5분 간격으로 60분 동안 지속적으로 모니터링하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 대조군에는 TEM-1 Bla를 처리하지 않았다. 또한, 상기 효소에 의한 상기 프로브의 분해 반응의 촉매 상수(kcat ) 및 미카엘리스 상수(Km )를 결정하기 위해, 증가된 강도들이 프로브 농도에 따라 플롯팅되었고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이후, 상기 파라미터들은 곡선의 비-선형 피팅(fitting)에 의해 얻었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 상기 프로브를 효소와 반응시키는 경우, 512 nm에서의 형광 강도가 2.5-배까지 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 턴-온(turn-on) 녹색 시그널은 광 조사기(490 nm) 하에서 육안에서조차 확인할 수 있었다.
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, TEM-1의 검출에 대한 상기 프로브의 민감성은 0.03125 U/mL으로 낮음을 알 수 있었다. 상기의 결과로 상기 프로브가 성공적으로 Bla의 효소 활성을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 시그널을 시간에 따라 측정하는 경우, 형광 강도는 개시 시간에 빠르게 증가하여 45분 후에 포화된 값에 도달하였음을 알 수 있었다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도의 프로브에서의 강도 측정은 12±1 s-1의 kcat 및 51±12 μM의 Km을 제공하였다. kcat /Km 값에 의해 추정된 TEM-1의 효소적 효율은 230,000 s-1M-1이었고, 이것은 TEM-1에 의한 형광성 기질 CC1(kcat = 52±1 s-1 및 Km = 70±7 μM) 및 CCF2(kcat = 29±1 s-1 및 Km =23± 1μM)의 가수분해에 대해 이전에 보고된 값들(W. Gao, B. Xing, R. Y. Tsien and J.Rao, J Am Chem Soc.,2003, 125, 11146.)보다 현저하게 높은 값이다.
실험예 2. 박테리아 용해물에서의 CAZ 및/또는 CTX-내성 박테리아의 검출
CAZ 및/또는 CTX-내성 박테리아의 검출에 상기 실시예 1에서 합성된 프로브를 이용하고자 시도하여 형광성 기질의 실제적인 유용성을 추가적으로 테스트하였다.
구체적으로, 확장된-스펙트럼 β-락타마제(ESBL)를 검출함에 있어서, 이중-반응성 프로브를 이용한 형광 테스트의 실행을 평가하는 데, CAZ 및/또는 CTX-내성 박테리아를 이용하였다. 상기 균주들은 여러 한국 병원들 또는 Nordmann 박사(Swizterland)로부터 제공받았다. 상술한 균주들은 디스크 강화 방법(W. Song, I.K Bae, Y.N Lee, C.H Lee, S.H Lee and S.H Jeong, J ClinMicrobiol,2007, 45, 1180)을 이용하여 기존에 ESBL 생산을 위해 스크리닝되었으며 blaCTX-M을 위한 멀티플렉스 PCR 및 시퀀싱을 통해 분자 수준에서 β-락타마제 함량에 대해 특징지어졌다.
균주를 뮬러-힌톤 아가(아산, 대한민국)에서 분리하였고 형광 테스트를 실시하기 전에 16-24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 박테리아 단백질의 추출은 이전에 기재된 대로 실시하였다(P. Nordmann, L. Poirel and L. Dortet, Emerg. Infect. Dis.,2012, 18, 1503.). 간략하게는, 하나의 계산된 접종 루프(10μL)의 상기 테스트 균주들을 150 μL의 200 mM Tris-HCl 용해 완충액(B-PERII, 박테리아 단백질 추출 시약; Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA)에 재현탁하였으며, 1분 동안 볼텍싱하였고 상온에서 30분 동안 추가적으로 반응시켰다. 이러한 박테리아 현탁액을 상온에서 5분 동안 10,000 x g로 원심분리시켰다. 30 μL의 상층액을 상기 실시예 1에서 제조한 100 μL의 형광성 프로브(100 nM, 100 mM Tris-HCl, pH = 8)와 96-웰 트레이에서 혼합하였다.
형광 시그널은 동력 모드로 Infinite F200pro(Tecan Croup Ltd.,Mannedorf, Switzerland) 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 485 nm(대역폭 20 nm) 및 535 nm(대역폭 25 nm)로 셋팅되었다. 각 웰에 130 μL의 최대 용량을 가지는 폴리스티렌 블랙 96 바닥이 평평한 웰 마이크로플레이트(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)를 이용하였다. 각 테스트 시료의 형광 시그널을 5분 마다 90분 동안 측정하였고, 그 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다. 양성 대조군으로서는 페놀 레드 어세이를 수행하였다. 구체적으로, 페놀 레드 어세이를 위해, 이전( P. Nordmann, L. Poirel and L. Dortet, Emerg. Infect. Dis.,2012, 18, 1503)에 보고된 대로 30 μL의 상층액을 페놀 레드 용액(pH 7.8)을 포함하는 6 mg/mL 세프타지딤 나트륨 염으로 이루어진 100 μL의 용액과 혼합하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
도 5a 및 6a에 나타낸 바와 같이, 상기 CAZ 및/또는 CTX 내성 박테리아는 0.5 mg/mL 또는 1 ug/ml보다 더 낮은 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 가지는 약물-민감성 박테리아와 명확하게 구별되었다.
또한, 도 5b 및 6b에 나타낸 바와 같이 증가된 시그널은 박테리아에 대한 CAZ 및/또는 CTX의 최소 억제 농도에 다소 의존적임을 알 수 있는데, 이는 CAZ 및/또는 CTX 가수분해 활성에 대한 상기 프로브의 특이성을 나타낸다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 형광 강도가 CAZ 내성이면서, CTX 민감성인 균주, CAZ 민감성이면서, CTX 내성인 균주, 및 CAZ 및 CTX 둘 모두에 내성이 균주에서는 형광 강도가 증가하였으나, CAZ 및 CTX 둘 모두에 민감성인 균주에서는 형광강도가 증가하지 않았음을 알 수 있다. 상기의 결과로 일 구체예에 따른 프로브가 세팔로스포린계 항생제 내성인 균주를 검출할 수 있음을 나타낸다.
박테리아 페놀 레드 실시예 1의 프로브
CTX-M-14 (4) 음성 양성
CTX-M-15 + SHV-12 (128) 음성 양성
SHV-28 + TEM-1 (64) 음성 양성
CTX-M-9 (0.25) 음성 음성
BL1560 (8) 음성 양성
BL1679 (8) 음성 양성
BL2161 (4) 음성 양성
BL2514 (8) 음성 양성
BL2750 (0.125) 음성 음성
BL2780 (0.125) 음성 음성
BL2784 (0.5) 음성 음성
BL2788 (0.06) 음성 음성
참고: (a) 괄호 안의 숫자, CAZ의 MIC; (b) BL1560 같은 BL 시리즈, BL은 혈액(blood)으로 혈액에서 온 균주; 및 (c) 양성, 해당 프로브(페놀 레드 또는 실시예 1의 프로브)에 의해 신호가 검출된 경우(즉, 프로브의 신호 생성이 안 된 경우는 음성임).
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 기존에 기술인 페놀 레드법은 효과적으로 항생제 내성 박테리아를 검출할 수 없는데 반해, 일 구체예에 따른 프로브는 항생제 내성 박테리아를 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 3. 임상 시료에서의 항생제 내성 박테리아 검출
3.1. 혈액 시료 내 항생제 내성 박테리아 감별 능력 평가
혈액 시료는 강남성모병원으로부터 총 185개를 제공받았다. 그 중 환자수는 119명이었고, 그 중 63명의 환자의 시료를 호기성 또는 혐기성 배양 조건에서 배양하여 얻어진 세균이 126개이었고, 1명의 환자의 시료는 호기성 및 혐기성 배양 조건에서 세균이 각각 2개씩 4개가 배양되어 얻어졌고, 55명의 환자 시료로부터는 혐기성 또는 호기성 배양 조건 중 하나의 조건에서만 세균이(호기성 -21개/혐기성-28개) 배양 되어 얻어졌다. 결과로, 혐기성 배양 조건에서 얻어진 균의 시료는 총 96개이고, 호기성 배양 조건에서 얻어진 균 시료는 총 93개 이었으며, 총 185개의 시료 중 44개가 ESBL 양성이었고, 141개가 ESBL 음성이었다. 이들의 균종 분류는 하기 표 2 내지 5와 같다.
ESBL 양성 균주 No.
Escherichia coli 27
Klebsiella pneumoniae 16
Citrobacter freundii, Kluyvera cryocrescens 1
Total 44
ESBL 음성 균주 No.
Achromobacter denitrificans 1
Acinetobacter baumannii 3
Citrobacter braakii, Escherichia coli 2
Citrobacter freundii 1
Enterobacter aerogenes 6
Enterobacter cloacae 5
Escherichia coli 78
Klebsiella oxytoca 3
Klebsiella pneumoniae 34
Proteus mirabilis 1
Pseudomonas aeruginosa 1
Salmonella, non-typhi 1
Serratia marcescens 1
Escherichia coli, Klebsiella oxytoca 2
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,Enterobacter cloacae, 2
total 141
실험에 사용된 185개의 시료
프로브 시험 185개 시료의 균종 No.
Achromobacter denitrificans 1
Acinetobacter baumannii 3
Citrobacter freundii 1
Enterobacter aerogenes 6
Enterobacter cloacae 5
Escherichia coli 105
Klebsiella oxytoca 3
Klebsiella pneumoniae 50
Proteus mirabilis 1
Pseudomonas aeruginosa 1
Salmonella, non-typhi 1
Serratia marcescens 1
Citrobacter freundii, Kluyvera cryocrescens 1
Escherichia coli, Klebsiella oxytoca 2
Citrobacter braakii, Escherichia coli 2
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter cloacae 2
Total 185
혈액샘플 종류 185
호기성혈액배양 63
혐기성혈액배양 126
ESBL 　
양성 44
음성 141
　 　
환자수 119
호기성,혐기성 샘플 동시 62*
호기성 샘플만 32**
혐기성 샘플만 25
　 　
* - 1인의 환자는 호기성, 혐기성 2set 4개의 sample 있음　
** - 2인의 환자는 혐기성 샘플만 2개　
균종에 있어서, 4명이 두 개 이상의 균이 있었으며, 각각 Citrobacter freundii와 Kluyvera cryocrescens, Escherichia coli와 Klebsiella oxytoca, Citrobacter braakii와 Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli와 Enterobacter cloacae가 함께 자랐다.
혐기성 시료의 처리는 다음과 같이 수행하였다. 10 mL 혈액 배양액을 원심분리 한 후, 침사를 제외한 상층액을 제거하였다. 10 ml 염수로 3회 세척한 후, 침사에 0.5 ml 염수를 첨가하여 침사를 부유시킨 뒤 100 ul, 400 ul 씩 두 개의 1.5 ml 튜브에 옮겼다. 이후에 다시 원심분리 후 400 ul을 분주한 튜브의 상층액을 버린 뒤에 B-PER 300 ul을 넣고, 4 ℃에서 볼텍싱을 30분 동안 수행하였다. 이후에 라이시스(lysis)가 끝난 시료를 원심 분리후 상층액을 형광 강도 측정에 사용하였다. 100 ul을 분주한 튜브는 원심분리 후 상층액을 제거하고 DW 100 ul을 넣은 후 10 ℃에서 10분간 가열하고 원심분리하여 상층액을 PCR 실험에 사용하였다.
호기성 시료의 처리는 다음과 같이 수행하였다. 10 mL 혈액 배양액을 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고 암모늄 클로라이드 1ml, 5 % 사포닌 용액 5 ml를 침사와 섞은 후 10분간 방치하였다. 이후 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 10 ml 염수로 3회 세척한 후, 상기 혐기성 시료와 같은 과정으로 처리하였다.
형광의 측정은 실험군으로서 상기 실시예 1에서 제조된 프로브를 사용하였고, 양성 대조군으로서 페놀 레드를 사용하였다. 상기 일 구체예에 따른 프로브가 10 nM으로 들어가 있는 10 ul의 형광 용액에 전처리가 완료된 상기 시료 30 ul을 96-웰 트레이에서 혼합하였다. 페놀 레드 어세이는 상기 실험예 1에 기재된 것과 같이 수행하였다. 형광 시그널을 동력 모드로 Infinite F200pro(Tecan Croup Ltd.,Mannedorf, Switzerland) 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 485 nm(대역폭 20 nm) 및 535 nm(대역폭 25 nm)로 셋팅되었다. 형광 강도는 시료가 들어간 웰의 형광값을 시료가 들어가지 않은 대조군 웰(B-PER만 들어간 웰)의 형광값의 평균을 빼어 측정하였다.
상기의 결과에 대해 ROC 곡선을 확인하였다. 그 결과, 일 구체예에 따른 프로브는 10 분의 AUC가 0.967로 가장 좋은 결과를 보였으므로 이 시간대의 수치로 민감도와 특이도를 계산하였다.
각 시험법의 박테리아 검출의 특이도와 민감도는 진실 양성을 통해 산출하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 진실 양성은 Vitek2(제조사: bioMerieux)의 ESBL 검사에서 양성이 나온 균주를 PCR로 확인하고, PCR이 음성인 균주를 대상으로 표현형 테스트를 시행하여 양성을 나타내는 균주를 양성으로 판별함으로써 수행하였다.
ESBL 검출 CTX 또는 CAZ 내성 검출
검사법 민감도 특이도 민감도 특이도
실시예 1의 프로브 90.9%(40/44) 87.9%(123/141) 84.2%(48/57) 92.2%(118/128)
페놀 레드 88.6%(39/44) 99.3%(140/141) 68.4%(39/57) 99.2%(127/128)
또한, 추가적으로 ESBL의 유전자형 별로 일 구체예에 따른 프로브의 민감도 및 특이도를 분석하였고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
또한, ESBL이 아닌 균에서도 CTX/CAZ 내성이 일정 정도 이상이면 감별 가능한지 확인하기 위해, ESBL을 발현하면서 특정 MIC를 갖는 균주에 대한 형광 강도를 분석하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
실시예 1의 프로브 페놀 레드
β-락타마제 종류 sensitivity (%) specificity (%) sensitivity (%) specificity (%)
only CTX-M 96.30 97.83 96.30 100.00
including CTX-M 96.67 97.83 96.67 100.00
only TEM 42.86 97.83 0.00 100.00
including TEM 55.56 97.83 22.22 100.00
only SHV 100.00 97.83 0.00 100.00
including SHV 100.00 97.83 11.11 100.00
cAmpC 100.00 97.83 64.71 100.00
DHA 100.00 97.83 0.00 100.00
CIT 100.00 97.83 0.00 100.00
CMY 100.00 97.83 0.00 100.00
Total 93.51 97.83 45.45 100.00
β-락타마제 종류 종 No. of isolates Positivity of assays Resistant rate of MIC by EUCAST
실시예 1의 프로브 CTX [2<] CAZ [4<]
ESBL
CTX-M Escherichia coli 14 13 92.9% 13 92.9% 8 57.1%
Serratia marcescens 5 5 100.0% 5 100.0% 4 80.0%
Klebsiella pneumoniae 3 3 100.0% 3 100.0% 2 66.7%
Citrobacter freundii 3 3 100.0% 3 100.0% 2 66.7%
Enterobacter cloacae 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
Samonella typhimurium 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
CTX-M total 27 26 96.3% 26 96.3% 18 66.7%
TEM Escherichia coli 5 2 40.0% 2 40.0% 3 60.0%
Proteus mirabilis 1 1 100.0% 1 100.0% 0 0.0%
Providencia stuartii 1 0 0.0% 0 0.0% 1 100.0%
TEM total 7 3 42.9% 3 42.9% 4 57.1%
SHV Escherichia coli 3 3 100.0% 3 100.0% 3 100.0%
Klebsiella pneumoniae 2 2 100.0% 2 100.0% 1 50.0%
Serratia marcescens 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
SHV total 6 6 100.0% 6 100.0% 5 83.3%
CTX-M+TEM Citrobacter freundii 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
CTX-M+SHV Escherichia coli 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
Enterobacter cloacae 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
SHV+TEM Klebsiella pneumoniae 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
AmpC
cAmpC Escherichia coli 6 6 100.0% 6 100.0% 6 100.0%
Citrobacter freundii 6 6 100.0% 6 100.0% 6 100.0%
Serratia marcescens 5 5 100.0% 5 100.0% 2 40.0%
cAmpC total 17 17 100.0% 17 100.0% 14 82.4%
DHA Klebsiella pneumoniae 7 7 100.0% 2 28.6% 6 85.7%
CIT Escherichia coli 4 4 100.0% 1 25.0% 3 75.0%
CMY Escherichia coli 2 2 100.0% 2 100.0% 1 50.0%
Proteus mirabilis 2 2 100.0% 2 100.0% 2 100.0%
MOX Klebsiella pneumoniae 1 1 100.0% 1 100.0% 1 100.0%
β-락타마제총 77 72 93.5% 64 83.1% 58 75.3%
Negative Escherichia coli 44 1 2.3% 0 0.0% 0 0.0%
Klebsiella pneumoniae 2 0 0.0% 0 0.0% 0 0.0%
총 123 73 59.3% 64 52.0% 58 47.2%
3.2. 소변 시료 내 항생제 내성 박테리아 감별 능력 평가
소변 시료는 강남성모병원으로부터 제공받아 사용하였다. 대상 균주로는, ESBL 양성 균주가 총 53개로 그 중 Escherichia coli가 43개였고, Klebsiella pneumoniae가 10개였으며, ESBL 음성 균주는 총 51개로 Escherichia coli가 43개, Klebsiella pneumoniae가 5개, 그리고 Klebsiella oxytoca가 3개였다.
소변 시료의 전처리는 다음과 같이 수행하였다. 소변 7 ml를 4000 g로 원심분리하여 상층액을 버리고 펠렛은 PBS 7 ml로 2번 세척하여 사용하였다. 마지막 세척 과정에서 펠렛을 350 ul의 PBS로 녹인 후에 70 ul를 DNA 분리에 사용하였고, 180 ul는 다시 원심 분리 후 200 ul의 B-PER 용액에 넣고 30분간 볼텍싱하였다.
이후에는 상기 실험예 3.1의 방법과 동일한 방법으로 형광 측정 및 페놀 레드 실험을 수행하였다. 그 결과, 일 구체예에 따른 프로브는 ESBL 검출, 및 CTX 또는 CAZ 내성에 따른 ROC 커브의 90분의 AUC가 각각 0.725 및 0.739로 가장 결과가 좋아 이 시간대의 수치로 민감도와 특이도를 계산하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
ESBL 검출 CTX 또는 CAZ 내성 검출
검사법 민감도 특이도 민감도 특이도
실시예 1의 프로브 63.0%(34/54) 80%(40/50) 64.8%(35/54) 82%(41/50)
페놀 레드 31.5%(17/54) 100%(50/50) 31.5%(17/54) 100%(50/50)
상기 표 6 내지 표 9에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 프로브는 실제 임상 시료에서도 ESBL 발현 박테리아 및 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 프로브는 β-락타마제 또는 ESBL을 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 pH 지시인자-기반된 방법에서 가능하지 않은 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물;
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000030
    (코어 구조(core-structure)-L-Z)
    식 중, R1은 세팔로스포린계 항생제의 코어 구조의 7번 위치의 치환기로부터 선택되고,
    A는 S, O, SO, SO2, 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    L은
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000031
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000032
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000033
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000034
    또는
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000035
    이고, RL은 단일결합이거나, C1-6 알킬렌기, C2-6 알케닐렌기, 또는 C2-6 알키닐렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, 또는 C2-6 알키닐기이고, R5는 단일결합이거나, C1-6 알케닐기이고, R6 및 R7는 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, 또는 C2-6 알키닐기이고, n은 1 내지 4의 정수이고, m은 1 내지 9의 정수이고, *는 코어 구조와의 결합 부위이고, *'는 Z와의 결합 부위이고, 및
    Z는 형광 모이어티이다.
  2. 청구항 1에 있어서, R1은 H, -NH2, 및 -NHCO-R'로 이루어진 군으로부터 선택되고, R'는 -CH2-CN, -CH2S-CF3,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000036
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000037
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000038
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000039
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000040
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000041
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000042
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000043
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000044
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000045
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000046
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000047
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000048
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000049
    ,
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000050
    , 및
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000051
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 L은
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000052
    이고, 상기 식 중 RL은 단일결합이거나, 메틸 또는 에틸이고, *는 코어 구조와의 결합 부위이고, *'는 Z와의 결합 부위인 것인 화합물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 형광 모이어티는 BODIPY(boron-dipyrromethene)인 것인 화합물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 BODIPY는 피리딜 BODIPY, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인 화합물;
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016007476-appb-I000053
    .
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 1의 Z은 L과 함께 β-락타마제 또는 확장된 스텍트럼 β-락타마제(extended spectrum β-lactamase: ESBL)에 의해 상기 화학식 1로부터 분리되어 형광을 나타내는 것인 화합물.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 항생제 내성 박테리아는 β-락타마제 또는 확장된-스펙트럼 β-락타마제(ESBL)를 발현하는 박테리아인 것인 프로브.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 ESBL을 발현하는 박테리아는 엔테로박터 종(Enterobacter spp .), 에스체리시아 종(Escherichia spp .), 살모넬라 종(Samonella spp .), 프로테우스 종(Proteus spp .), 시트로벡터 종(Citrobacter spp.), 모르가넬라 종(Morganella spp .), 박테로이데스 종(Bacteroides spp .), 프로비덴시아 종(Providencia spp .), 세라티아 종(Serratia spp), 클렙시엘라 종(Klebsiellaspp.), 쉬겔라 종(Shigella spp .), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 아시네토박터 종(Acinetobacter spp .) 및 클루이베라 종(Kluyvera spp .)으로부터 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아인 것인 프로브.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 항생제는 세팔로스포린(cephalosporin)계 항생제인 것인 프로브.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세포탁심 또는 세프타지딤인 것인 프로브.
  13. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물.
  14. 청구항 1 내지 7 중 어느 한항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단용 키트.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 박테리아 감염은 ESBL을 발현하는 박테리아 감염인 것인 키트.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 ESBL을 발현하는 박테리아 감염에 의한 질환은 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 기도관 감염, 상기도관 감염, 세기관지염, 폐렴(병원성), 폐혈증, 뇌수막염, 수술 중 감염, 이질, 전염성 부비동염, 복막염, 탄저병, 라임병, 골수염, 레지오넬라증, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진 및는 뇌사성 근막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 키트.
  17. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 화합물을 목적 시료와 접촉시키는 단계; 및
    상기 목적 시료에서 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항의 화합물로부터 발생된 형광을 검출하는 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 시료는 세포 배양액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변 대변 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
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