WO2016190585A1 - 표적핵산 검출방법 및 키트 - Google Patents

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    • G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid and a kit for detecting and analyzing a target nucleic acid, and specifically, (i) a nucleic acid comprising a complementary binding site with a target nucleic acid, and (ii) a target nucleic acid and a non-complementary base.
  • a method for detecting and analyzing target nucleic acids using a membrane immobilized with an oligomer and (iii) a labeled primer comprising a marker and a probe complementarily binding to the nucleic acid oligomer, and a kit for detecting and analyzing target nucleic acids. will be.
  • Molecular diagnostics is used to diagnose the root of diseases such as DNA or RNA, and is used in various fields such as infectious diseases, cancer diagnosis, genetic diseases, and customized diagnosis.
  • Representative molecular diagnostic techniques include PCR techniques that amplify DNA in a short time (Saiki, R., et. Al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science 239, 487-91. 1998).
  • general PCR techniques should use electrophoresis to identify amplified DNA. In order to perform such electrophoresis, agarose gel (Agarose gel) is made, and DNA has to be confirmed by staining with EtBr and the like. For this reason it is not suitable for use in a laboratory.
  • nucleic Acid Lateral Flow Assay there is a Nucleic Acid Lateral Flow Assay that is identified using membranes instead of gel electrophoresis after PCR (Aveyard, J., et. Al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device.Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007).
  • NALF nucleic acid lateral flow
  • the inventors of the present application regardless of the type of amplified product, by reacting a probe corresponding to the nucleic acid oligomer of the artificially synthesized PCR primers and the nucleic acid oligomer of the membrane, a variety of PCR products with one kind of membrane It was confirmed that it can be universally confirmed, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to recognize the above-mentioned problems of the prior art, and to perform amplified nucleic acid analysis that is a result of target nucleic acid amplification more accurately and simply compared to the conventional electrophoresis method, and simultaneously distinguishes a plurality of target nucleic acids.
  • the present invention provides a general method for detecting and analyzing target nucleic acids and a kit therefor.
  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, comprising the following steps:
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising the following steps:
  • a labeled primer comprising (i) a complementary binding site with a target nucleic acid, (ii) a nucleic acid oligomer containing a target nucleic acid and a non-complementary base, and (iii) a label with a target nucleic acid to react with the target nucleic acid.
  • step (b) reacting the product amplified in step (a) with the membrane to which the probe complementary to the nucleic acid oligomer is immobilized;
  • the invention also provides a labeled primer comprising (a) a complementary binding site with a target nucleic acid, (ii) a nucleic acid oligomer containing a target nucleic acid and a non-complementary base, and (iii) a marker; And (b) relates to a target nucleic acid detection kit comprising a membrane fixed to the probe complementary to the nucleic acid oligomer.
  • FIG. 1 illustrates a method for detecting a nucleic acid amplification product according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 illustrates a general purpose target nucleic acid detection and analysis technique using a side flow assay according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of the analysis of the amplification products of HPV 16 and HPV 18 target nucleic acid using a method for detecting a target nucleic acid amplification product according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid, comprising the following steps:
  • a method for detecting a target nucleic acid comprising the following steps:
  • a labeled primer comprising (i) a complementary binding site with a target nucleic acid, (ii) a nucleic acid oligomer containing a target nucleic acid and a non-complementary base, and (iii) a label with a target nucleic acid to react with the target nucleic acid.
  • step (b) reacting the product amplified in step (a) with the membrane to which the probe complementary to the nucleic acid oligomer is immobilized;
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention is to provide a technology that can be confirmed accurately and simply compared to the conventional electrophoresis method when performing the amplified gene analysis that is the result of the target nucleic acid amplification, including PCR.
  • the present invention comprises the steps of (a) synthesizing a labeled primer comprising (i) a complementary binding site with a target nucleic acid, (ii) a nucleic acid oligomer comprising a target nucleic acid and a non-complementary base, and (iii) a marker Reacting with the nucleic acid to amplify the target nucleic acid.
  • a nucleic acid oligomer comprising a target nucleic acid and a non-complementary base, ie, a gene unrelated to the target gene, is about 10-40 bp, preferably about 20-30 bp, to the primer.
  • a nucleic acid oligomer of about 10-40 bp, preferably about 20-30 bp is added to the ends of the primers used to perform general multiplex-PCR.
  • nucleic acid oligomer is at least one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3 Sequences.
  • the present invention includes the step of (b) reacting the product amplified in step (a) with the membrane to which the probe complementary binding to the nucleic acid oligomer is fixed.
  • step (b) the product amplified in step (a) may be injected to the side of the membrane so that the nucleic acid oligomer in the amplified product and the probe immobilized on the membrane may move to a complementary hybridization reaction.
  • the probe of step (b) may further include a nucleic acid oligomer for immobilization on the membrane, and may further include a 10-40 bp oligomer having a repeating nucleotide sequence.
  • Example 1 an embodiment of a method for analyzing nucleic acid amplification products so that HPV 16 and 18 can be diagnosed simultaneously is described in Example 1, wherein the additional nucleic acid oligomer may comprise the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the present invention includes the step of detecting the amplification of the target nucleic acid by confirming whether or not the color of the marker.
  • the marker is biotin, Cy5, Cy3, FITC, EDANS (5- (2'-aminoethyl) amino-1-naphthalene sulfate), tetramethyltamine (TMR), tetramethyltamine isocyanate ( TMRITC), x-rhodamine, DIG or antibodies, but is not limited thereto.
  • the binder may be streptavidin, but is not limited thereto.
  • biotin By attaching and amplifying biotin to one primer, it is combined with streptavidin at the membrane, and depending on the propensity of beads attached to streptavidin, gold particles can be identified by color development. In the case of fluorescence, it can be identified by fluorescence in various wavelength bands, and according to the type of probe attached to the membrane, several to tens can be distinguished simultaneously.
  • the invention provides a labeled primer comprising (a) a complementary binding site with a target nucleic acid, (ii) a nucleic acid oligomer containing a target nucleic acid and a non-complementary base, and (iii) a marker; And (b) relates to a target nucleic acid detection kit comprising a membrane fixed to the probe complementary to the nucleic acid oligomer.
  • kits of the present invention may be variously configured according to a use, and may be used for detecting or identifying amplified target nucleic acids.
  • Kits of the present invention may optionally include reagents necessary for conducting nucleic acid amplification PCR reactions such as polymerases, buffers, deoxyribonucleotide-5-triphosphates.
  • the kits of the present invention may also further comprise various polynucleotide molecules, various buffers and reagents.
  • the optimal amount of reagents, buffers or reactants used for a particular reaction in the kit can be determined by one skilled in the art and includes a separate package or compartment comprising membranes to which (a) primers and (b) probes are immobilized, as mentioned above. It can be manufactured as a compartment.
  • HPV Human papillomavirus
  • HPV 16 and HPV 18 are among high risk groups and are known to be closely related to cervical cancer (Walboomers, J.). ., et.al., Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. The Journal of Pathology 189, 12-19, 1999).
  • Primer sequences used for PCR are shown in Table 1 below. It is composed of a site for amplification and a site to which a probe can bind by specifically reacting to each gene.
  • probe sequence that is bound to the side flow membrane and must react with the PCR amplification product is shown in Table 2. It consists of 10-30 oligo thymines attached for easy binding to the sites and membranes that react with each primer sequence.
  • the method for detecting a target nucleic acid and a kit for detecting a target nucleic acid according to the present invention are detected irrespective of the sequence of a target nucleic acid amplification product by immobilizing a probe having complementarity with an artificially added synthetic primer to a membrane, so that one membrane The results of various amplification products can be confirmed.
  • the present invention has a general purpose that can be used for various amplification products. This generally increases productivity by using a universal membrane instead of a membrane that must be used separately for each target nucleic acid item of interest.

Abstract

본 발명은 핵산 증폭 산물의 분석방법 및 핵산 증폭 산물을 분석하기 위한 키트에 관한 것으로, 구체적으로 (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 포함하는 핵산 올리고머 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머와 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브를 고정화한 멤브레인을 이용하여 핵산 증폭 산물을 분석하는 방법 및 핵산 증폭 산물을 분석하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

표적핵산 검출방법 및 키트
본 발명은 표적핵산의 검출방법 및 표적핵산을 검출 및 분석하기 위한 키트에 관한 것으로, 구체적으로 (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 포함하는 핵산 올리고머 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머와 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브를 고정화한 멤브레인을 이용하여 표적핵산을 검출하고 분석하는 방법 및 표적핵산을 검출하고 분석하기 위한 키트에 관한 것이다.
분자진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암진단, 유전질환 및 맞춤진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91. 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확인하기 위해서 전기영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있다. 이러한 이유 때문에 검사실에서 사용하기에는 적합하지 않다.
최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광 시약을 사용해야 한다 (Higuchi, R., et. al., Kinetic PCR Analysis: Real-time Monitoring of DNA Amplification Reactions. Nature Biotechnology 11, 1026 - 1030, 1993)는 문제점이 있다. 또한, 사용해야 하는 형광 파장수가 제한되어 있기 때문에 현실적으로 5개 이상의 다중 PCR (multiplex PCR)을 실시하기에는 어려운 한계점을 지니고 있다. 이러한 이유로, 검사실에서는 PCR 기술을 이용한 저가의 검사를 하기에 어려움이 많아 일반적으로 대학병원과 같은 대형병원에서만 주로 사용하고 있는 실정이다.
최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid 사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다 (Helb, D., et. al., Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand, Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237, 2010).
다른 방법으로, PCR 후에 젤 전기영동 대신에 멤브레인을 사용하여 확인하는 핵산 측면 흐름 어세이 (Nucleic Acid Lateral Flow Assay)가 있다 (Aveyard, J., et. al., One step visual detection of PCR products with gold nanoparticles and a nucleic acid lateral flow (NALF) device. Chem. Commun., 41, 4251-4253, 2007). 그러나, 젤 전기영동 기술에 비해 복잡하여 실험실에서 제조하여 사용하기는 불가능하며, 멤브레인에 부착된 프로브의 시퀀스는 PCR 증폭 산물에 따라서 특이적으로 결합할 수 있도록 사용하여야 하는 기술의 한계 때문에 범용으로 사용하는 데는 한계점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 증폭된 산물의 종류와 상관없이 인위적으로 합성된 PCR 프라이머의 핵산 올리고머와 멤브레인의 핵산 올리고머에 상응하는 프로브가 반응하도록 함으로써, 한 종류의 멤브레인으로 다양한 PCR 산물을 범용적으로 확인할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술에 대한 정보는 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 종래의 전기영동방법에 비해 정확하면서도 간단하게 표적 핵산 증폭의 결과물인 증폭된 핵산 분석을 실시할 수 있고, 복수의 표적 핵산을 동시에 구분할 수 있는 범용적인 표적핵산의 검출 및 분석방법 및 이를 위한 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다:
다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법:
(a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머를 표적 핵산과 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;
(b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인과 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 표지자의 반응 여부를 확인하여 표적 핵산의 증폭 여부를 검출하는 단계.
본 발명은 또한, (a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머; 및 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 표적핵산 검출 키트에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 핵산 증폭 산물의 검출방법을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 측면 흐름 어세이를 이용한 범용적 표적핵산 검출 및 분석 기술을 도시한 것이다.
도 3은 HPV 16과 HPV 18 표적 핵산의 증폭 산물을 본 발명의 일실시예에 따른 표적핵산 증폭 산물의 검출방법을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다:
다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법:
(a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머를 표적 핵산과 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;
(b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인과 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 표지자의 반응 여부를 확인하여 표적 핵산의 증폭 여부를 검출하는 단계.
분자진단에서 가장 대표적으로 사용되고 있는 방법은 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)을 이용하는 것이다. 이 방법은 미량의 특정 DNA를 수 시간 내에 많은 양으로 증폭시키는 기술이며, 면역진단에 비해 민감도를 획기적으로 높일 수 있는 방법이나, 일반적인 PCR의 경우에는 젤 (Gel)상에서 전기영동에 의해 증폭된 산물을 확인해야 하는 번거로움이 있다. 최근에는 형광을 사용하는 실시간 피씨알 (real-tim PCR) 기법이 있으나 사용하는 장비가 복잡하며 고가이고, 이에 대한 피씨알 시약 또한 고가의 가격에 의해 일반적인 실험실에서는 사용하기에 어려움이 있다.
이에, 본 발명에서는 PCR을 비롯한 표적 핵산 증폭의 결과물인 증폭된 유전자 분석을 실시할 때에 기존의 전기영동 방법에 비해 정확하고 간단하게 확인할 수 있는 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 단계 (a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 포함하는 핵산 올리고머 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머를 합성하고, 표적 핵산과 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.
PCR을 이용하여 표적 유전자를 증폭할 때에 표적 핵산과 비상보적인 염기를 포함하는 핵산 올리고머 즉, 표적 유전자와 관련이 없는 유전자를 프라이머에 약 10-40 bp, 바람직하게 약 20-30 bp의 핵산 올리고머를 추가하여 합성하여 증폭시킨 후, 이것과 상보성이 있는 약 10-40 bp, 바람직하게 약 20-30 bp의 프로브를 멤브레인에 고정화시키고, 서로 혼성화/교잡반응을 시키는 것이다.
일반적인 다중 피씨알 (multiplex-PCR)을 수행하는 데 있어서 사용하는 프라이머의 말단에 약 10-40 bp, 바람직하게 약 20-30 bp의 핵산 올리고머를 추가하여 합성하여, 이를 멤브레인에 상보적으로 합성되어 있는 프로브 올리고머와 반응을 시킴으로써 쉽게 결과물 즉, 핵산 증폭 여부를 확인할 수가 있다.
이는 여러 종의 질병을 동시에 진단하는 것이 가능하도록 한다. 즉, 수 개에서 수 십개의 추가된 각기 다른 올리고머 시퀀스를 지닌 프로브로 다중 피씨알을 수행한 후, 이와 상보적으로 반응이 가능한 프로브가 결합된 올리고머 프로브와 반응이 가능하도록 사용하게 되면, 하나의 측면 흐름 멤브레인으로 수개에서 수십개의 증폭된 결과물을 확인할 수가 있다.
따라서, 다양한 다중 피씨알에 공동으로 사용할 수가 있어 측면 흐름 멤브레인의 생산시에 대량 생산이 가능하다. 이는 하나의 측면흐름 멤프레인을 사용하여 다양한 아이템의 결과물을 확인하는 것으로, PCR의 증폭 산물의 종류에 상관없이 동일한 멤브레인을 사용하여 증폭산물을 확인할 수 있기 때문에, 제품생산의 원가절감과 품질관리를 용이하게 하여 제품의 생산성을 높일 수 있게 한다.
일 실시예에 따르면, HPV 16과 18이 동시 진단 가능하도록 핵산 증폭 산물의 분석방법의 구체예를 실시예 1에 기재하였으며, 이 때 상기 핵산 올리고머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인과 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (b)에서, 멤브레인 측면에 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 주입하여 증폭된 산물이 이동하면서 멤브레인에 고정된 프로브와 증폭된 산물 중 핵산 올리고머가 상보적 혼성화 반응하도록 할 수 있다.
일 실시예에 따르면, HPV 16과 18이 동시 진단 가능하도록 핵산 증폭 산물의 분석방법의 구체예를 실시예 1에 기재하였으며, 이 때 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브는 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 단계 (b)의 프로브는 멤브레인에 고정화하기 위해 핵산 올리고머를 추가로 포함할 수 있으며, 반복되는 염기 서열을 가지는 10-40bp의 올리고머를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, HPV 16과 18이 동시 진단 가능하도록 핵산 증폭 산물의 분석방법의 구체예를 실시예 1에 기재하였으며, 이 때 상기 추가 핵산 올리고머는 서열번호 13의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 (c) 상기 표지자의 발색 여부를 확인하여 표적 핵산의 증폭을 검출하는 단계를 포함한다.
하나의 실시예에서, 상기 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에, 표지자의 발색을 유도하는 결합제와 반응시켜 발색 또는 형광 발현 여부를 확인하고 표적 핵산의 증폭을 검출할 수 있다. 이 때, 상기 결합제는 스트렙타비딘일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 쪽의 프라이머에 바이오틴 (Biotine)을 부착시켜 증폭함으로써 멤브레인에서 스트렙타비딘 (Streptavidine)과 결합하게 되고, 스트렙타비딘에 부착된 비드의 성향에 따라서 골드 파티클인 경우에는 발색으로 확인이 가능하고, 형광일 경우는 다양한 파장대의 형광으로 확인할 수 있어서 멤브레인에 부착된 프로브의 종류에 따라서 수개에서 수십개까지 동시에 구분이 가능하다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머; 및 (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 표적핵산 검출 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 용도에 따라 다양하게 구성될 수 있으며, 증폭된 타겟 핵산의 검출 또는 확인 용도로 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 목적에 따라, 중합효소, 버퍼, 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 핵산 증폭 PCR 반응을 실시하는데 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 본 발명의 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 다양한 버퍼 및 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트에서 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 앞서 언급된 (a) 프라이머 및 (b) 프로브가 고정화된 멤브레인들을 포함하는 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. HPV 16과 18의 동시진단 설계
HPV (Human papillomavirus)는 자궁경부암을 일으키는 원인 바이러스로 약 100여 종의 HPV type이 보고되어 있는데, 이들 중 HPV 16과 HPV 18은 고위험군에 속하여, 자궁경부암과 관련이 깊은 것으로 알려져 있다 (Walboomers, J., et. al., Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. The Journal of Pathology 189, 12-19, 1999).
이를 동시에 진단하려고 한다면, HPV 16과 HPV 18의 특이 유전자를 사용하고 대조군으로서는 모든 사람의 세포에 존재하는 베타-글로빈 유전자를 사용하여 3종의 유전자를 동시에 증폭시키게 된다.
PCR을 위해서 사용한 프라이머 시퀀스를 다음 표 1에 나타내었다. 각각의 유전자에 특이적으로 반응하여 증폭을 하기 위한 부위와 프로브가 결합할 수 있는 부위로 구성되어 있다.
Figure PCTKR2016005194-appb-T000001
또한, 측면 흐름 멤브레인에 결합되어 있어서 PCR 증폭산물과 반응해야 하는 프로브 시퀀스를 표 2에 나타내었다. 각각의 프라이머 시퀀스와 반응하는 부위와 멤브레인에 쉽게 결합할 수 있게 하기 위하여 10-30개의 올리고 티민을 부착한 것으로 구성되어 있다.
Figure PCTKR2016005194-appb-T000002
2. 전기영동 결과와 측면 흐름 멤프레인 결과의 비교
다중 PCR (mutiplex PCR)을 실시한 후에 반응 산물의 10 ul는 1.5% 아가로즈젤 상에서 30분 동안 전기영동을 시켜서 확인하였고, 10ul는 측면 흐름 멤브레인 상에서 15분 동안 반응시켜 결과를 확인하였다. 이를 분석하여 비교한 결과를 도 3에 도시하였으며, 도 3을 참조하면 양자의 방법에서 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명에 따른 표적핵산의 검출방법 및 표적핵산을 검출하기 위한 키트는 인위적으로 첨가된 합성 프라이머와 상보성이 있는 프로브를 멤브레인에 고정화함으로써, 표적 핵산 증폭 산물의 서열과 상관없이 검출됨으로써, 하나의 멤브레인으로 다양한 증폭 산물의 결과를 확인할 수 있다. 종래 일대일 반응으로 프라이머와 프로브를 반응시키는 것에 비해 여러 증폭 산물에 사용할 수 있는 범용성을 지닌다. 이는 일반적으로 목적하는 표적 핵산 아이템마다 별도로 사용해야 하는 멤브레인 대신에 범용적 멤브레인을 사용하게 됨으로써 생산성 향상을 높일 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법:
    (a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머를 표적 핵산과 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인과 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 표지자의 반응 여부를 확인하여 표적 핵산의 증폭 여부를 검출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 핵산 올리고머는 10-40bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 핵산 올리고머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 증폭된 산물을 멤브레인 측면에 주입하면 증폭된 산물이 이동하면서 멤브레인에 고정된 프로브와 증폭된 산물에 포함된 핵산 올리고머가 상보적 혼성화 반응하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브는 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 프로브는 멤브레인에 고정화하기 위해 핵산 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 추가 핵산 올리고머는 서열번호 13의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 표지자는 비오틴, Cy5, Cy3, FITC, EDANS(5-(2'-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민, DIG 또는 항체인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 표지자의 발색을 유도하는 결합제와 반응시키는 것을 추가로 포함하는 검출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 결합제는 스트렙타비딘인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. (a) (i) 표적 핵산과의 상보적 결합 부위, (ii) 표적 핵산과 비상보적인 염기를 함유하는 핵산 올리고머, 및 (iii) 표지자를 포함하는 표지된 프라이머; 및
    (b) 상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브가 고정된 멤브레인을 포함하는 표적핵산 검출 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 올리고머는 10-40bp의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 올리고머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 올리고머와 상보적으로 결합하는 프로브는 서열번호 10 내지 12로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 프로브는 멤브레인에 고정화하기 위해 핵산 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 추가 핵산 올리고머는 서열번호 13의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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