WO2016171383A1 - 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법 - Google Patents

적외선 차단 물질의 효능 평가 방법 Download PDF

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WO2016171383A1
WO2016171383A1 PCT/KR2016/001647 KR2016001647W WO2016171383A1 WO 2016171383 A1 WO2016171383 A1 WO 2016171383A1 KR 2016001647 W KR2016001647 W KR 2016001647W WO 2016171383 A1 WO2016171383 A1 WO 2016171383A1
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blocking material
infrared ray
infrared
ray blocking
plate
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PCT/KR2016/001647
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남진주
강승현
이준배
김연준
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코스맥스 주식회사
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention is made by the task number HN14C0083 in support of the Ministry of Health and Welfare, the research management professional organization of the above task is a global cosmetic research and development project group,
  • the present invention relates to a method for evaluating the efficacy of an infrared ray blocking material, and more particularly, in order to evaluate the efficacy of an infrared ray blocking material, culturing a cell including a medium on an infrared transmission plate, and applying an infrared ray blocking material on the top of a plate lid in which the cell is cultured. After coating, the method relates to a method of evaluating the efficacy of the infrared ray blocking material by measuring the temperature of the medium of the plate by irradiating infrared rays.
  • Infrared radiation has a wavelength of 1mm at 750nm from sunlight and accounts for 54% of the light emitted from the sun. Infrared rays are composed of near IR, middle IR and far IR and exist in the wavelength range of 750-3000 nm, 3000-30000nm and 30000nm-lmm, respectively.
  • near-infrared rays account for one third of the total sunlight, and penetrate deep into the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue of the skin, which has a detrimental effect on the skin.
  • These adverse effects are the main culprit of photoaging, such as skin damage caused by UV light, and matr ix Increasing metal loproteinase (MMP) and decreasing collagen causes dermal layer damage.
  • MMP metal loproteinase
  • MMPs Matr ix metal loproteinases
  • the skin aging generates heat, which is one of the characteristics of infrared rays, thereby raising the skin temperature to the skin irradiated with infrared rays, causing wrinkles as well as solar elastic fibrosis. Sudden heat rise promotes the formation of new blood vessels, thereby causing oxidative DNA damage, causing various dermatitis and skin cancers.
  • the skin aging phenomenon may be intensified.
  • sunscreens were considered a major concern in cosmetics, according to various reports that the ultraviolet rays mainly affect the skin.
  • the heat generated by infrared rays has also been found to damage the skin and cause photoaging.
  • the method for evaluating the efficacy of the infrared blocking material is not described, and the temperature of the medium is measured by measuring the temperature of the medium as in the present invention. There is no known method for evaluating efficacy.
  • the present inventors have intensively researched to overcome the problems of the prior arts, and in order to evaluate the efficacy of the infrared blocking material, the cells are cultured with the medium containing the infrared transmission plate and the infrared blocking on the upper part of the plate lid cultured cells After applying the material, when measuring the temperature of the medium of the plate by irradiating infrared rays, it was confirmed that it can be usefully applied to evaluate the efficacy of the infrared ray blocking material and to develop the infrared ray blocking material and cosmetics for infrared ray blocking. And the present invention has been completed.
  • a main object of the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy of an infrared ray blocking material, which is useful for evaluating the efficacy of an infrared ray blocking material and for developing an infrared ray blocking material and a cosmetic product for infrared ray blocking.
  • the present invention provides a method for evaluating the efficacy of an infrared ray blocking material comprising the following steps.
  • step b) applying an infrared ray blocking material to the upper part of the plate lid in which the cells of step a) are cultured;
  • infrared rays are also known as methods for evaluating sunscreens and sunscreens as factors causing skin damage such as skin aging, dermatitis or skin cancer. There is little research on this. Accordingly, the present inventors have completed the present invention as a result of studying the method for evaluating the efficacy of the infrared ray blocking substance. According to the experimental example of the present invention, as a result of determining the temperature of the medium through the method for evaluating the efficacy of the infrared blocking material of the present invention, the medium temperature of the plate wel l coated with the infrared blocking material was higher than the control group (Vehicle, PMMA, Talc). It was found to be lower.
  • the cell of step a) is characterized in that the human fibroblasts (Human dermal f ibroblasts) or keratinocytes (Kerat inocytes).
  • the step c) recovering the cells and the medium of the plate is characterized in that it further comprises the step of accumulating gene and protein expression.
  • the efficacy of the infrared blocking material may be evaluated by measuring the specific gene and protein expression as well as measuring the medium temperature.
  • the gene and protein expression is characterized in that MM Matrix metal loproteinase) -l, 3 or 9, and / or type 1 or 4 procol lagen.
  • gene and protein expression were measured by a method for evaluating the efficacy of the infrared blocking material of the present invention.
  • Expression of MMP-1,3,9 gene and MMP-1 protein was suppressed in cells coated with infrared blocking material, and type 1 ⁇ 4 procol lagen gene and type 1 procol lagen protein were applied with infrared blocking material. It was confirmed that the expression is increased in the cells. It is judged that this influenced gene expression and protein expression by infrared heat blocking effect by infrared ray blocking material, and these results are applied to evaluate the efficacy of infrared ray blocking material and to develop infrared ray blocking material and cosmetics for infrared ray blocking material. It means that it can be done (see Experimental Example 1 and Figures 1-4).
  • the infrared transmission plate is characterized in that the polystyrene (Polystrene) or quartz plate.
  • the infrared rays may be near infrared (near IR), middle infrared (middle IR) or far infrared (far IR), but is characterized in that the near infrared of the wavelength of 750 to 3000nm.
  • the infrared blocking material is characterized in that the inorganic powder coated with a metal oxide.
  • the infrared ray blocking material is coated by mixing a metal oxide: inorganic powder in a ratio of 6-8: 2-4% by weight.
  • the metal oxide may be titanium oxide, antimony oxide or vanadium oxide, preferably cerium oxide or aluminum oxide, and the inorganic powder is polymethylmethacrylate (PMMA) or talc (Talc). .
  • the evaluation method of the infrared ray blocking material of the present invention is useful for evaluating the efficacy of the infrared ray blocking material and developing the infrared ray blocking material and the cosmetic for the infrared ray blocking material.
  • 1 is a view showing the results of measuring the gene expression of MMP-1, 3, 9 through the efficacy evaluation method of the infrared blocking material of the present invention.
  • Figure 2 is a view showing the results of measuring the gene expression of type 1, 4 procol lagen through the efficacy evaluation method of the infrared blocking material of the present invention.
  • Figure 3 is a view showing the results of measuring the protein expression of MMP-1 through the method for evaluating the efficacy of the infrared blocking material of the present invention.
  • Figure 4 is a view showing the results of measuring the protein expression of type 1 procol lagen through the efficacy evaluation method of the infrared blocking material of the present invention.
  • the inventors prepared the infrared ray blocking composition in the following manner under the assumption that the inorganic powder coated with the metal oxide would be effective for infrared ray blocking.
  • PMMAQVM coated 50 wt% of PMMA with cerium oxide / aluminum oxide), Talc coated cerium oxide / aluminum oxide TalcCT / M) 25 wt 3 ⁇ 4> ethanol : 1,3-butylene glycol 1 : It was prepared by dispersing in a dispersant in a ratio of 1. This was used in the experiment of the evaluation method of the efficacy of the infrared blocking material.
  • Experimental Example 1 Evaluation of the efficacy of the infrared blocking material
  • human dermal f ibroblasts are cultured using a cell medium (DMEM) to reach about 803 ⁇ 4 of the cell plate. Incubate the cells for 24 hours by seeding 4x l 0 5 cel ls / wel l on the center wel l of the 6wel l plate.
  • a negative IR (+) IR and an experimental group were applied with an infrared blocker (Example 1) on top of the plate Hd. Investigate for 15 minutes. At this time, the medium temperature after irradiation is measured, respectively.
  • RT-PCR was performed using a PCR machine (Step One Plus, Applied Biosys terns, USA) and assayed by adding Cyberlin (SYBRGreen supermix, Applied Biosys terns, USA) with the corresponding messenger RNA primers and cDNA to MMP-1, 3 , 9 and type 1, 4 procollagen messenger RNA expression was confirmed.
  • test sample was applied to the stopper of the cell culture dish, and then irradiated with infrared rays to further incubate for 24 hours to recover the medium.
  • the recovered medium was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to remove impurities and assayed using MMP-1 EL ISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kit (Calbiochem, Canada).
  • MMP-1 EL ISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Patent Document 0001 KR 10-2012-0059672 A
  • Patent Document 0002 KR 10-2012-0049634 A

Abstract

본 발명은 적외선 차단 물질의 효능을 평가하기 위하여 적외선 투과 플레이트에 배지를 포함한 세포를 배양하고 세포가 배양된 플레이트 뚜껑의 상부에 적외선 차단물질을 도포한 후, 적외선을 조사하여 플레이트의 배지의 온도를 측정을 통해 적외선 차단 물질의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 적외선 차단 물질의 평가방법은 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 유용하다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 액정 클렌징 조성물은 직교로 배열된 두 장의 편광판 사이에서 액정상 구조와 빛과의 간섭현상에 의해 홀로그램과 같은 외관을 확인할 수 있으며, 이러한 현상은 45°c에서 4주 경과 후에도 유지될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
적외선 차단 물질의 효능 평가 방법
【기술분야】
본 발명은 대한민국 보건복지부 지원하에 과제번호 HN14C0083에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 글로벌코스메틱연구개발사업단， 연구사업명은
"글로벌화장품신소재.신기술연구개발지원" ， 연구과제명은 "입자의 플라즈몬 성질을 기반으로 한 신규 적외선 차단용화장품 소재 개발" ， 주관기관은 ^마크로케어， 연구기간은 2014. 11.01 ~ 2018. 10.31이다.
본 발명은 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법에 관한 것으로， 더욱 구체적으로 적외선 차단 물질의 효능을 평가하기 위하여 적외선 투과 플레이트에 배지를 포함한 세포를 배양하고 세포가 배양된 플레이트 뚜껑의 상부에 적외선 차단물질을 도포한 후， 적외선을 조사하여 플레이트의 배지의 온도를 측정을 통해 적외선 차단 물질의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
태양광에 의한 피부 노화는 자외선에 의해 일어나는 것이 일반적이나 최근 적외선으로부터 발생하는 열에 기인한 여러 가지 피부 질병들에 대한 연구가 진행되고 있다.
적외선 ( infrared)은 태양광에서 나오는 750nm에서 1mm 파장을 가지고 있으며 태양으로부터 조사되는 광선의 54%를 차지한다. 적외선의 종류에는 근적외선 (near IR) , 중적외선 (middle IR) , 원적외선 ( far IR)로 구성되며 각각 750-3000 nm, 3000-30000nm , 30000nm-lmm의 파장의 영역에 존재한다.
특히， 근적외선의 경우 전체 태양광의 1/3을 차지하며， 피부의 표피, 진피， 피하조직까지 깊숙이 침투하여 피부에 해로운 영향을 미친다. 이러한 악영향은 자외선이 야기하는 피부 손상과 같이 광노화의 주범이 되어 matr ix metal loproteinase (MMP)를 증가시키고 콜라겐을 감소하여 진피층 손상을 일으킨다.
노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에 노화가 진행될 때 이 부분에 형태적인 변화가 일어나게 되면 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질단백질을 분해하는 효소로 Matr ix metal loproteinases (MMPs)가 대표적이며 한 번의 자외선 조사에도 피부 내의 MMPs 활성이 증가되고， 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를 촉진하는데 주요한요인으로 작용한다.
상기 피부노화는 적외선의 특징 중 하나인 열을 발생시켜 적외선에 조사된 피부에 피부 온도를 상승시켜 주름뿐만 아니라 일광탄력섬유증을 야기시킨다. 갑작스러운 열 상승은 새로운 혈관의 형성을 촉진시키고, 이에 의해 산화적 DNA 손상을 유발하여 각종 피부염과 피부암을 일으킨다. 또한 자외선과 함께 조사될 경우 상기 피부노화 현상은 심화될 수 있다.
기존의 선스크린의 경우 태양광선 중에서 주로 자외선이 피부에 악영향을 미친다는 여러 연구 보고에 따라 화장품에도 자외선 차단제가 주된 관심사로 여겨졌다. 하지만， 적외선에 의해 발생하는 열 또한 피부에 손상을 일으켜 광노화를 일으키는 인자인 것으로 밝혀졌다.
자외선 차단을 위한 자외선 차단제의 효능 평가로는 "SPF(sun protect ion factor) "라 명명되는 UVB 영역 (290~320 nm)이 유도하는 흥반 (erythema) 및 ACProtect ion of UVA) "로 명명되는 画 영역 (320~400 nm)이 유도하는 혹화 (Per si stent Pigment Darkening) 현상을 실험자가 육안으로 관찰하는 방법을 통해서만 이루어지고 있다. 또한 한국 공개특허 10-2012-0059672호는 자외선 선스크린 효능을 특정 유전자 발현을 통해 확인하고 있으며， 한국 공개특허 10- 2012-0049634호는 자외선 차단제의 효능을 세포 사멸율을 측정하여 확인하고 있다.
그러나， 적외선 차단 물질의 효능을 평가하는 방법에 대해서는 기재되어 있지 않을뿐더러 본원발명과 같이 배지의 온도를 측정하여 적외선 차단 물질의 효능을 평가하는 방법에 대해서는 알려진바 없다.
이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과， 적외선 차단 물질의 효능을 평가하기 위하여 적외선 투과 플레이트에 배지를 포함한 세포를 배양하고 세포가 배양된 플레이트 뚜껑의 상부에 적외선 차단물질을 도포한 후, 적외선을 조사하여 플레이트의 배지의 온도를 측정할 경우， 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 유용하게 적용할 수 있음을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
따라서， 본 발명의 주된 목적은 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 유용한 적외선 차단제 물질의 효능 평가 방법을 제공하는 데 있다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 하기 단계를 포함하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 제공한다.
a) 적외선 투과 플레이트에 배지를 포함한 세포를 배양하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 세포가 배양된 플레이트 뚜껑의 상부에 적외선 차단물질을 도포하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 플레이트에 적외선을 조사하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계 플레이트의 배지의 온도를 측정하는 단계.
자외선뿐만 아니라 적외선 또한 피부노화， 피부염 또는 피부암과 같은 피부 손상을 일으키는 요인으로서 자외선 차단물질 및 자외선 차단제의 평가 방법에 대해서는 많이 알려져 있으나， 적외선 차단 물질의 탐색 및 이를 위한 적외선 차단 물질의 효능 평가방법에 대한 연구는 미미한 실정이다. 이에， 본 발명자들은 적외선 차단 물질 효능 평가방법에 대하여 연구한 결과， 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 실험예에 따르면， 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 배지의 온도를 축정한 결과， 적외선 차단 물질이 도포된 Plate wel l의 배지 온도가 대조군 (Vehicle , PMMA, Talc) 보다 더 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이는 적외선 차단 물질에 의한 적외선 열 차단 효과에 의해 배지 온도가 대조군에 비해 본래 온도를 유지되는 것으로 판단되며， 이러한 결과는 배지의 온도 측정이 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 적용할 수 있음을 의미한다 (실험예 1 및 표 1 참조) .
본 발명에 있어서， 상기 a) 단계의 세포는 사람섬유아세포 (Human dermal f ibroblasts) 또는 각질분화형성세포 (Kerat inocytes)인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서， 상기 c) 단계 플레이트의 세포 및 배지를 회수하여 유전자 및 단백질 발현을 축정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법은 배지 온도 측정뿐만 아니라 특정 유전자 및 단백질 발현 측정을 통하여 적외선 차단 물질의 효능을 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서， 상기 유전자 및 단백질 발현은 MM Matrix metal loproteinase)-l , 3 또는 9， 및 /또는 type 1 또는 4 procol lagen인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면， 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 유전자 및 단백질 발현을 측정하였다. MMP-1 ,3 ,9 유전자 및 MMP-1의 단백질의 경우에는 적외선 차단 물질이 도포된 세포에서 발현이 억제되었고 type 1ᅳ 4 procol lagen유전자 및 type 1 procol lagen 단백질의 경우에는 적외선 차단 물질이 도포된 세포에서 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 적외선 차단 물질에 의한 적외선 열 차단 효과에 의해 유전자 발현 및 단백질 발현에 영향을 미친 것으로 판단되며， 이러한 결과는 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 적용할 수 있음을 의미한다 (실험예 1 및 도 1-4 참조) .
본 발명에 있어서， 상기 적외선 투과 플레이트는 폴리스티렌 (Polystrene) 또는 석영 플레이트인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서， 상기 적외선은 근적외선 (near IR) , 중적외선 (middle IR) 또는 원적외선 ( far IR)일 수 있으나， 바람직하게는 750 내지 3000nm 파장의 근적외선인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서， 상기 적외선 차단물질은 금속산화물로 코팅된 무기분체인 것을 특징으로 한다.
상기 적외선 차단물질은 금속산화물 ： 무기분체를 6~8 ： 2-4 중량 % 비율로 흔합하여 코팅된 것을 특징으로 한다. 상기 금속산화물은 티타늄 옥사이드， 안티몬 옥사이드 또는 바나듐 옥사이드일 수 있으며, 바람직하게는 세륨 옥사이드 또는 알루미늄 옥사이드이며， 상기 무기분체는 폴리메틸메타크릴레이트 (Polymethylmethacrylate , PMMA) 또는 탈크 (Talc)인 것을 특징으로 한다.
【유리한 효과】
이상 설명한 바와 같이， 본 발명의 적외선 차단 물질의 평가방법은 적외선 차단제 물질의 효능을 평가하고 적외선 차단 물질의 개발 및 적외선 차단용 화장품을 개발하는데 유용하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 MMP-1 , 3， 9의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 type 1， 4 procol lagen의 유전자 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 MMP-1의 단백질 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본원발명의 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법을 통해 type 1 procol lagen의 단백질 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 실시예 1 : 적외선 차단제의 제조
본 발명자들은 금속 산화물로 코팅된 무기분체가 적외선 차단에 효과적일 것이라는 가정 하에 하기와 같은 방법으로 적외선 차단제 조성물을 제조하였다. 구체적으로， PMMA을 세륨 옥사이드 /알루미늄 옥사이드로 코팅한 PMMAQVM) 50중량 ¾>， Talc를 세륨 옥사이드 /알루미늄 옥사이드 코팅 TalcCT/M) 25중량 ¾>를 에탄올 ： 1 ,3-부틸렌글라이콜 =1 ： 1의 비율의 분산제에 분산시켜 제조하였다. 이를 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법의 실험에 사용하였다. 실험예 1 : 적외선 차단물질의 효능 평가
( 1)배지 온도 측정을 통한 적외선 차단 물질의 효능 평가
먼저， 사람 섬유아세포 (human dermal f ibroblasts)를 세포 plate의 80¾정도가 되도록 세포용 배지 (DMEM)을 이용하여 배양한다. 배양한 세포를 6wel l plate의 가운데 wel l에 4x l05 cel l s/wel l seeding하여 24시간 동안 배양한다. 대조군으로는 (-) IR, (+)IR, 실험군으로는 plate Hd의 상부에 적외선 차단제 (실시예 1)를 도포하여 37°C로 유지된 plate안 세포에 l id를 덮어 근적외선 조사기를 이용하여 15분간 조사한다. 이때， 조사한 후의 배지 온도를 각각 측정한다.
(2)유전자 발현 실험
상기 ( 1)에서 배지 온도를 측정하기 위하여 적외선 처리를 마친 plate의 배지를 교체한 후, 24시간 동안 추가 배양한다. 이 후， 피부 노화 반응을 유전자 레벨로 확인하기 위하여 세포를 회수하여 실험하였다. 구체적으로, 사람 섬유아세포를 6 wel l 세포 배양 접시에 4χ 105의 밀도로 접종한 후 37°C , 5% C02 배양기에서 24시간 배양하였다. 실험용 시료 (실시예 1)를 세포 배양 접시의 마개에 도포한 후 근적외선을 15분간 조사하여 24시간 추가 배양하였다. 그 후 세포에 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) lmC을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 RNA를 정량한 후， cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosys terns, 미국)을 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Applied Biosys terns, 미국)을 해당 메신저 RNA 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 에세이하여 MMP-1, 3, 9와 type 1, 4 procollagen의 메신저 RNA 발현양을 확인하였다.
(3) 단백질 발현 실험
상기 (1)에서 배지 온도를 측정하기 위하여 적외선 처리를 마친 plate의 배지를 교체한 후， 24시간 동안 추가 배양한다. 구체적으로ᅳ 사람 섬유아세포를
6 well 세포 배양 접시에 4χ105의 밀도로 접종한 후 37°C, 5% C02 배양기에서
24시간 배양하였다. 그 후 실험용 시료를 세포 배양 접시의 마개에 도포한 후 적외선을 조사하여 24시간 추가 배양하여 배지를 회수하였다. 회수한 배지는 12,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 불순물을 제거하고 MMP-1 EL ISA (Enzyme- linked immunosorbent assay) kit (Calbiochem, 캐나다)를 이용하여 에세이 하였다. 또한， type 1 procollagen EIA(Enzyme immuno assay) kit를 이용하여 type 1 procollagen의 단백질 발현양을 확인하였다. 배지 온도 측정 결과를 하기 표 1에 나타내었으며， 유전자 및 단백질 발현양에 대한 결과는 도 1 내지 4에 나타내었다.
【표 11
Figure imgf000009_0001
그 결과 상기 표 1에서 나타나는 바와 같이, 본원발명 실시예 1에서 제조한 적외선 차단 조성물을 도포한 경우 (P/M (50%) , T/M (25%))， 대조군 보다 배지의 온도가 낮은 것을 확인할 수 있었으며， 이러한 배지의 온도를 확인함으로써 적외선 차단 물질의 열 차단 효과， 즉 적외선 차단 물질의 효능을 평가할 수 있는 방법이라는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1 내지 4에서 나타나는 바와 같이， P/M과 T/M에서 적외선에 의해 증가한 MMP-1 , 3， 9을 현저히 억제함과 동시에 적외선에 의해 감소한 type 1 , 4 procol lagen의 생성을 보호하는 결과를 보였고， 적외선에 의해 증가한 MMP-1 단백질과 감소한 type 1 procol lagen 단백질도 메신저 RNA의 발현과 동일한 양상을 보였다. 이러한 유전자 및 단백질 발현을 확인함으로써 적외선 차단 물질의 열 차단 효과， 즉 적외선 차단 물질의 효능을 평가할 수 있는 방법이라는 것을 확인할 수 있었다. 참조문헌
(특허문헌 0001) KR 10-2012-0059672 A
(특허문헌 0002) KR 10-2012-0049634 A

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
하기 단계를 포함하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법:
a) 적외선 투과 플레이트에 배지를 포함한 세포를 배양하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 세포가 배양된 플레이트 뚜껑의 상부에 적외선 차단물질을 도포하는 단계 ;
c) 상기 b) 단계의 플레이트에 적외선을 조사하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계 플레이트의 배지의 온도를 측정하는 단계.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 세포는 사람섬유아세포 (Human dermal f ibroblasts) 또는 각질분화형성세포 (Kerat inocytes)인 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가방법.
【청구항 3】
재 1항에 있어서， 상기 c) 단계 플레이트의 세포 및 배지를 회수하여 유전자 및 단백질 발현을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법 .
[청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 유전자 및 단백질 발현은 MMKMatr ix metal loproteinase)-l , 3 또는 9， 및 /또는 type 1 또는 4 procol l agen인 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법.
【청구항 5]
제 1항에 있어서， 상기 적외선 투과 플레이트는， 폴리스티렌 (Polystrene) 또는 석영 플레이트인 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 적외선은 750 내지 3000nm 파장의 근적외선인 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가 방법 .
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 적외선 차단물질은 금속산화물로 코팅된 무기분체인 것을 특징으로 하는 적외선 차단 물질의 효능 평가방법.
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