KR20120059672A - 특정 유전자의 발현 변화를 통해 선스크린 효능을 평가하는 방법 - Google Patents

특정 유전자의 발현 변화를 통해 선스크린 효능을 평가하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선스크린 효능을 평가하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 세포에서 특정 유전자 발현을 통해 자외선뿐만 아니라 피부 손상을 가장 많이 유도하는 400∼500 nm 영역의 블루/바이올렛 라이트 차단 효능을 함께 평가함으로써 보다 정확하고 높은 신뢰도로 선스크린 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

특정 유전자의 발현 변화를 통해 선스크린 효능을 평가하는 방법{Method for evaluating the sunscreen effect by measuring the specific gene expression}
본 발명은 선스크린 효능을 평가하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피부 세포에서 특정 유전자 발현을 통해 자외선뿐만 아니라 피부 손상을 가장 많이 유도하는 400∼500 nm 영역의 블루/바이올렛 라이트 차단 효능을 함께 평가함으로써 보다 정확하고 높은 신뢰도로 선스크린 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.
태양광, 즉 태양에너지는 주로 전자기파(電磁氣波)가 되어서 지구로 오는데, 이 전자기파는 파장이 긴 쪽에서 차례로 라디오파, 초단파, 적외선(赤外線), 가시광선, 자외선, X선 및 γ선 등, 모든 파장의 방사선을 포함한다.
이러한 태양광으로부터 피부를 보호하기 위하여 많은 선스크린 제품이 개발되었다. 그러나, 현재 모든 선스크린 제품의 효능 평가는 "SPF(sun protection factor)"라 명명되는 UVB 영역(290∼320 nm)이 유도하는 홍반(erythema) 및 "PA(Protection of UVA)"로 명명되는 UVA 영역(320∼400 nm)이 유도하는 흑화(Persistent Pigment Darkening) 현상을 실험자가 육안으로 관찰하는 방법을 통해서만 이루어지고 있다.
상술한 바와 같이 태양광(태양에너지)에서 자외선이 차지하는 비중은 매우 적으며, 실제로 태양광은 다른 파장영역의 전자기파들이 더 많은 비중을 차지하고 있다. 즉, 상기 SPF와 PA는 태양광의 일부인 자외선을 얼마나 잘 차단하는지를 나타내는 지표일 뿐이며, 이를 통해 자외선과 다른 파장을 갖는 대부분의 태양광을 차단하는 효능을 확인할 수는 없는 실정이다.
시판되는 거의 모든 선스크린 제품들이 자외선은 효율적으로 차단할수 있을지 몰라도 태양광에 포함된 가시광선은 그대로 투과시키고 있으며, 이 가시광선 중 가장 피부 손상을 가장 많이 유도하는 것이 400∼500 nm 파장의 블루/바이올렛 라이트 영역이다. 그러나, 현재 상기 블루/바이올렛 라이트의 차단 효능을 평가할 수 있는 어떠한 차단 지표도 설정되어 있지 않아 자외산 차단과 함께 블루/바이올렛 라이트의 차단 효능을 평가할 수 있는 방법에 대한 필요성이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 기존의 인체를 포함한 인공피부 및 실험동물 등에서 단순히 태양광 내에 존재하는 자외선의 투과량이나 투과방지효능을 보거나 홍반이나 흑화의 육안평가를 통해 SPF나 PA를 측정하는 방법이 피부에 미치는 영향을 정확히 대변하기에 부족한 점을 보완하기 위한 선스크린 효능 평가방법을 모색하던 중, SPF나 PA의 차단력을 나타내는 수치가 동일 혹은 유사한 것에 대해서도 파장이 다른 블루/바이올렛 라이트를 차단하는 정도가 다르게 나타나는 것을 확인하고, 세포의 분화, 재생 및 결합에 관여하는 유전자 변화율을 측정함으로써 선스크린의 효능을 정확하고 세부적으로 측정할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 SPF나 PA의 차단력을 나타내는 수치가 동일한 선스크린 제품에서도 블루/바이올렛 라이트 영역에 의한 피부 변화율을 측정함으로써 그 효능의 차이를 정확하게 식별할 수 있는 선스크린 효능 평가방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 평가 대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계; 피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 태양광을 조사하는 단계; 및 상기 피부 세포를 수득하여 세포 내 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 선스크린 효능 평가 방법을 제공한다.
본 발명에서는 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 측정함으로써 피부에 대한 선스크린 효과를 더욱 세분화하여 정확하고 신뢰도 높은 선스크린 효능 평가방법을 제공할 수 있었다. 또한 선스크린 제품을 투과한 광원이 홍반, 흑화와 같은 현상은 일으키지 않으나 피부에 영향을 주는 정도는 다르므로 자외선 영역 이외에 이를 평가할 수 있는 새로운 평가방법을 제공할 수 있었다.
도 1 은 블루/바이올렛 라이트의 유사 혹은 동일 SPF, PF 임상지수 및 투과율(Transmittance)의 차이를 보여주는 그래프이다.
도 2a 내지 2f는 블루/바이올렛 라이트가 선스크린을 투과한 후 유도하는 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가한 결과를 보여주는 그래프이다(INV: Involucrin, Lor: Loricrin, CDSN: Corneodesmosin, DSC 1: Desmocollin-1, DSG 1: Desmoglein-1, 및 TGM 1: Transglutaminase-1).
본 발명에서는 유사 혹은 동일한 자외선차단 임상평가지수(SPF 및 PA)를 갖는 선스크린 제품들일지라도 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부 세포 내의 유전자 발현에는 상당히 차이가 있음을 확인하고 이를 이용하여 기존의 선스크린 효능 평가 방법보다 더욱 정확하고 높은 신뢰도를 갖는 선스크린 효능 평가방법을 제공한다.
즉, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는 선스크린 효능 평가방법을 제공한다:
평가 대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계;
피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 태양광을 조사하는 단계; 및
상기 피부 세포를 수득하여 세포 내 유전자 발현량을 측정하는 단계.
상기에서, 태양광은 290∼400 nm 파장의 자외선 및/또는 400∼500 nm 파장의 블루/바이올렛 라이트인 것이 바람직하고, 태양광 투과성 물질은 태양광, 즉, 상기 자외선 또는 블루/바이올렛 라이트를 투과시키면서 선스크린 제품의 도포가 가능한 물성을 지닌 것이면 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 석영판(Quartz Plate) 또는 목표로 하는 광선영역만 투과시키는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter) 등을 사용할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
상기 피부세포는 인간 또는 동물 유래 피부 세포를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들면, 각질분화형성세포(Keratinocytes), 섬유아세포(fibroblast), 또는 머켈세포(Merkel cell)와 같은 멜라닌형성세포(Melanocytes) 등을 사용할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 유전자는 피부 세포의 분화, 재생 및 결합에 관여하는 것으로서, 예를 들면, 인보루크린(INV: Involucrin), 로리크린(LOR: Loricrin), 코네오데스모신(CDSN: Corneodesmosin), 데스모콜린-1(DSC-1: desmocollin-1), 데스모글레인-1(DSG-1: desmoglein-1) 또는 트랜스글루타미나아제-1(TGM-1: Transglutaminase-1) 유전자를 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 특히 상기 유전자 중 코네오데스모신과 데스모콜린-1 유전자는 블루/바이올렛 라이트 조사에 의한 발현량의 변화가 UV 조사에 의한 것과 상반되어 블루/바이올렛 라이트 차단 지표로서 적절하였다.
또한 본 발명에서 사용하는 평가 대상 물질은 선스크린 제품 이외에 화장품과 같이 사람의 피부에 적용하는 제품이나 제형 등에 구성성분으로 적용하고자 하는 모든 물질을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1∼5] 선스크린 제형
하기 표 1에 기재된 성분을 갖는 선스크린 제형을 통상적인 방법으로 제조하였다(단위: 중량%).
성분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
TiO2 1.4 1.1 2 8.8 3.4
ZnO - 2.8 12 8 -
OMC(octyl methoxy cinnamate) 5 7 7.5 - 3
이소아밀 p-메톡시신나메이트
(Isoamyl p-Methoxycinnamate)		 2 2 - - -
에틸헥실 살리실레이트
(Ethylhexyl Salicylate)		 - 4.5 - - -
티노소브 S(Tinosorb S) 3 3 3 - 6
옥토크릴렌(Octocrylene) 　- - 2 - -
폴리실리콘-15(Polysilicone-15) - - 2 - -
[시험예 1]
실시예 1∼5에서 제조한 선스크린 제형의 SPF 및 PA 임상지수, 및 투과율을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 각각 나타내었다. 이때, 선스크린의 투과율은 실시예 1∼5의 선스크린 제형을 각각 석영 혹은 대역통과필터 위에 2 mg/㎠의 양으로 도포한 후 블루라이트/바이올렛 영역을 포함한 광원을 조사하고 투과되는 블루/바이올렛 라이트 파장영역(400∼500 nm)을 SPR-4001 분광방사계(Spectroradiometer, Luzchem, Canada)로 측정하였다.
유사 혹은 동일 SPF 및 PA 임상지수
시험물질 SPF PA 투과율(%)
실시예 1 35 ++ 14%
실시예 2 50 +++ 3%
실시예 3 50 +++ 12%
실시예 4 50 +++ 60%
실시예 5 50 +++ 32%
상기 표 2 및 도 1의 결과에서, 실시예 1∼5의 선스크린 제형들이 모두 유사 혹은 동일한 범주의 SPF 및 PA 임상지수를 나타낸 반면, 상기 블루/바이올렛 라이트의 투과율에 있어서는 제품 마다 상당한 차이가 있었다.
[시험예 2]
본 발명에서 사용하는 사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌(Walkersville) 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500 ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2 ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5 ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.
실시예 1∼5의 선스크린 제형을 석영판(Quartz Plate) 또는 대역(帶域)통과필터 위에 2 mg/㎠ 도포한 후 그 하부에 사람정상각질피부세포를 위치시킨 다음, 선스크린이 도포된 부위의 위쪽에서 400∼500 nm의 블루/바이올렛 라이트(1시간 35 J/㎠, 2시간 70 J/㎠) 및 UV(1시간 25MED, 2시간 50MED, 1MED= 21 mJ/㎠)를 각각 조사한 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 이후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다.
인보루크린(INV), 로리크린(LOR), 코네오데스모신(CDSN), 데스모콜린-1(DSC-1), 데스모글레인-1(DSG-1) 및 트랜스글루타미나아제-1(TGM-1) 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 UV 및 블루/바이올렛 라이트가 선스크린을 투과한 후 유도하는 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 2a 및 2f에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 3과 같다.
유전자 명칭 프라이머
인보루크린 Hs00846307_s1
로리크린 Hs01894962_s1
CDSN Hs00381831_m1
DSC-1 Hs00245189_m1
DSG-1 Hs00170047_m1
트랜스글루타미나아제-1 Hs00165929_m1
본 실험에서 사용한 인보루크린, 로리크린 및 트랜스글루타미나아제-1은 각질형성세포에서 대표적으로 사용되는 표피 분화의 특이적 표지 단백질이고, CDSN, DSC-1 및 DSG-1는 각질형성세포간 결합에 중요한 역할을 하는 세포간 결합 단백질로서 이들은 피부보습, 노화, 재생, 아토피 피부염 및 건선 환자 등 주요 피부질환과 밀접한 연관이 있다.
도 2a 내지 2f의 결과에서, 인보루크린, 로리크린, DSG-1 및 트랜스글루타미나아제-1는 UV 조사군과 블루/바이올렛 라이트 조사군에 있어서 큰 상이점이 없었으나, DSC-1과 CDSN의 경우는 UV 조사군과 블루/바이올렛 라이트의 결과가 상반되는 결과를 보였다. 이러한 증감은 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다. 상기 결과를 통해 DSC-1과 CDSN이 블루/바이올렛 라이트 차단 효능 평가를 위한 지표로 적절한 것임을 확인할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 평가 대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계;
    피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 태양광을 조사하는 단계; 및
    상기 피부 세포를 수득하여 세포 내 유전자 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 선스크린 효능 평가 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 태양광은 290∼400 nm 파장의 자외선 및 400∼500 nm 파장의 블루/바이올렛 라이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 태양광 투과성 물질은 석영판(Quartz Plate) 또는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter)인 것을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 피부 세포는 각질분화형성세포(Keratinocytes), 섬유아세포(fibroblast) 또는 멜라닌형성세포(Melanocytes)인 것을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자는 인보루크린(Involucrin), 로리크린(Loricrin), 코네오데스모신(Corneodesmosin), 데스모콜린-1(desmocollin-1), 데스모글레인-1(desmoglein-1) 및 트랜스글루타미나아제-1(Transglutaminase-1)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가방법.
  6. 평가 대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계;
    피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 400∼500 nm 영역의 블루/바이올렛 라이트를 조사하는 단계; 및
    상기 피부 세포를 수득하여 세포 내 코네오데스모신(Corneodesmosin) 또는 데스모콜린-1(desmocollin-1) 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 선스크린 효능 평가 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 태양광 투과성 물질은 석영판(Quartz Plate) 또는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter)인 것을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 피부 세포는 각질분화형성세포(Keratinocytes), 섬유아세포(fibroblast) 또는 멜라닌형성세포(Melanocytes)인 것을 특징으로 하는 선스크린 효능 평가방법.
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