CN103207276A

CN103207276A - 一种测定CoQ10抑制紫外光B辐射损伤的方法

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Publication number: CN103207276A
Application number: CN2012105930099A
Authority: CN
Inventors: 张文娟; 党磊; 赵仁滨
Original assignee: Beijing Tianchen Space Biomedical R & D Co Ltd
Current assignee: Beijing Tianchen Space Biomedical R & D Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-07-17

Abstract

一种测定CoQ10抑制紫外光B辐射损伤的方法，属于紫外线辐射的防护技术领域。测定步骤包括：CoQ10用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解；HaCat细胞用完全培养基调整细胞浓度为4-10×10⁴/孔，接种于细胞板中，贴壁后换用1％、2％、3％、5％的低血清培养基，分别以照射后4h－24h不同时间点为观察时间点，HaCat细胞培养4h--24h后，用ELISA试剂盒检测各组细胞内CPDs的含量。优点在于，CoQ10可以作为抗光辐射损伤的成分添加到化妆品中，也可作为美白成分应用于化妆品中或作为药品用于治疗光辐射损伤症状。

Description

一种测定CoQ10抑制紫外光B辐射损伤的方法

技术领域

本发明属于紫外线辐射的防护技术领域，特别是提供了一种测定CoQ10（辅酶Q10）抑制紫外光B辐射损伤的方法。

技术背景

太阳光中的紫外线辐射是一种非常显著的环境因子，它主要作用于人的皮肤。根据波长大小，太阳光中的紫外线可以分为三类：1)长波紫外线(UVA)，波长为320～400nm，是长波紫外线，几乎全部到达地面，能穿透真皮；2)中波紫外线(UVB)，波长为280～320nm，可以穿透皮肤，大部分可到达地面；3)短波紫外线(UVC)，波长为200～280nm，均被臭氧层所吸收，不能到达地面。日光中的紫外线，主要为长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)，是导致皮肤日晒伤、光老化及皮肤癌的重要因素。在相同剂量下，UVB的光损伤作用比UVA约大800-1000倍。另外紫外辐射对生物体危害作用表现在生态环境的破坏、引起皮肤灼伤或癌变、抑制免疫系统、损伤眼底或引起白内障、加速材料的老化等。入射到地球表面的紫外辐射强度受多种因素的影响，如气候条件、地理因素、人类活动等。人类活动引起的地球两极臭氧空洞的形成已导致入射到地球表面的紫外辐射(尤其是UVB)的增强。据WHO估计，地球上的动物、植物以及浮游生物等，在未来的40～100年将会受到越来越强的UV(特别是UVB)的辐射作用，UV辐射甚至会对人类的生存环境造成不可估量的影响，所以深入研究紫外辐射生物学效应的机制，避免紫外辐射损伤并加强对其防护等具有重要意义。其中近几十年来，由于臭氧层的破坏、过度日光浴等原因使人体暴露部位的皮肤衰老约80%以上属于光老化。大量非保护的日光暴露，不仅有损于人的美容、使受损伤人群增多，而且可以引起皮肤松弛、粗糙、萎缩、皱纹、色素沉着、毛细血管扩张、紫癜等，其中最危险的是发展成皮肤癌。防护UV，延缓光老化日益受到人们的关注，已经成为人们日常生活的重要方面。

辅酶Q10，又名泛醌(ubiquinone)，是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，其在生物体内发挥关键的生理药理调节作用。外源性补充的辅酶Q10在治疗心血管疾病、神经系统疾病、以及皮肤抗皱等方面具有广泛的临床应用。研究表明，辅酶Q10可以促进皮肤细胞增殖，促进胶原蛋白、弹性蛋白的生成，并可以抑制皮肤黑色素生成，具有光保护作用。辅酶Q10已经被广泛用于化妆品中以达到抗氧化和抗衰老的目的。然而其中的一些机制并未阐明。CoQ10对细胞的功能和分子功能具有重要的意义。CoQ10是线粒体呼吸链上的电子载体，可以通过巯基损耗，激活特定的磷酸化激酶和阻止DNA的氧化损伤而有效降低人角质形成细胞中UV介导的的氧化水平上调。细胞内源的CoQ10的水平随年龄增加而降低，而通过饮食或外服的方式补充CoQ10有可能可以延缓老年性的皮肤老化过程。有文献也证实CoQ10可以抵抗老年性的皮肤老化过程。CoQ10可以通过抑制成纤维组织内MMPs的表达而减小面部皱纹面积；在经过六个月的连续局部使用后，发现辅酶Q10也可以通过促进人类新生成纤维细胞的增殖，增强IV型和第七型胶原的基因表达来减少眼睛周围的皱纹面积。另外，有一项研究也发现，CoQ10可以通过抑制前炎性因子PGE-2和IL-6的产生而阻止人皮肤成纤维细胞内由于UV介导的炎性反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定CoQ10抑制紫外光B辐射损伤的方法，对辅酶Q10在保护皮肤和抑制紫外光损伤的功能上有了进一步的认识。

本发明通过一系列实验证明CoQ10具有抑制辐射光损伤的功能，显示出对防治紫外线损伤有着优异的效果。CoQ10添加入化妆品中可使化妆品具有抑制光辐射功效，也能够作为降低光辐射损伤症状的药品添加剂。将CoQ10添加入化妆品中可使化妆品具有抗紫外辐射的功效，也能够作为降低皮肤炎症因子产生的药品添加剂。

紫外光B辐射可直接损伤表皮细胞DNA，DNA直接吸收UVB产生光产物，主要为6-4光产物((6-4)PPs)和环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)，约80％CPD如没有修复或修复不完善，这种空间结构的变化将阻碍DNA复制、转录，进而影响蛋白质的生物学功能。UVB同时可诱导产生活性氧（ROS），从而引起下游信号转导通路的激活，造成生物大分子的损伤，其中包括对多种细胞因子分泌的调节。最近许多研究证实核转录因子NF-kappa B在皮肤光损伤和皮肤恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。通过干预核转录因子NF-kappa B途径可以有效地降低光损伤。

核转录因子-κB(Nuclear Factor Kappa B，NF-KAPPA B)属于REL家族广泛存在的转录子，可以调节炎症、免疫、细胞进程、凋亡和致癌的相关基因。通常以同源或异源二聚体的形式存在，最常见的形式为p50/p65组成的二聚体。细胞在非刺激状态下，NF-κB与核因子κB抑制蛋白(Inhibitor kappa B，I κB)结合，以一种未被激活的形式存在于细胞浆。NF-κB可被多种刺激所激活，包括紫外线、炎症细胞因子、各种丝裂原等。NF-κB是一种广泛表达的核转录因子，其参与激活多种人类肿瘤，引起肿瘤细胞凋亡的抑制。已经证实有三种途径可以激活NF-κB，使其从胞质迁移入胞核，并同目标基因E的特定序列结合。在“经典途径”中，例如炎症刺激因子激活I κB激酶复合物中的I KK，活化的I KK磷酸化I ΚBa上的丝氨酸32和36残基或I ΚBB上的丝氨酸19和23残基而使蛋白酶体降解。I KBa的降解使NF-K B蛋白核定位序列暴露出来，从而导致二聚体结构从胞质迁移入胞核，并同DNA结合，影响基因的表达，从而引起下游细胞因子的表达增加。另外两种激活途径在紫外线激活NF-κB作用机制还未阐明。

从国外文献来看，评价紫外光对皮肤细胞的损伤主要是通过检测细胞内CPD含量和炎症细胞因子水平来实现。CPD含量检测通常采用酶联免疫法（ELISA），炎症细胞因子采用的是Luminex检测方法。而其中蛋白水平的分子相互机制则是通过蛋白质印迹法（western-blot）来探索的。

在本发明中，通过如下步骤测定表明CoQ10是否具抑制紫外光B辐射损伤的作用：

1.CoQ10用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解。

2.HaCat细胞用完全培养基调整细胞浓度为4-10×10⁴/孔，接种于细胞板中，贴壁后换用1％、2％、3％、5％的低血清培养基，同时加入1所述的CoQ10溶液，CoQ10终浓度为1uM、5uM、10uM。并使用UVB（5mJ/cm²或20mJ/cm²）照射，分别以照射后不同时间点（4h--24h）为观察时间点。

3.所述HaCat细胞培养4h--24h后，用ELISA试剂盒检测各组细胞内CPDs的含量。CoQ10剂量相关性的检测：六孔板培养HaCat细胞，选取照射后继续培养4h和24h作为观测时间点，每个时间点都设六组：UVB未照射组（-UVB）、单纯UVB照射组（UVB）、微载体组（NLC）、辅酶Q10剂量1μM组（UVB+1μM）、辅酶Q10剂量5μM组（UVB+5μM）、辅酶Q10剂量10μM组（UVB+10μM），每个组重复两个孔，每个孔接2×10⁵的细胞量，共需4块六孔板，4.8×10⁶的细胞量。照射剂量为5mJ/cm²，4h—24h之后分别收集细胞，用试剂盒提取DNA，采用硫酸鱼精蛋白ELISA法检测CPDs。

4.所述HaCat细胞UVB辐射6h--24h，提取RNA，QPCR检测细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α基因表达水平。

所述HaCat细胞UVB辐射6h--24h，采用Luminex检测试剂盒检测细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α分泌情况。

5.所述HaCat细胞UVB辐射6h后，采用western-blot方法检测各组NF-κ B表达情况。

本实验室前期研究结果表明，辅酶Q10可明显抑制UVB照射之后人角质形成细胞（HaCat细胞）和人成纤维细胞（ESF细胞）中活性氧水平和基质金属蛋白酶-1的产生和白细胞介素-1α的分泌。本发明在此基础上，进一步研究了辅酶Q10对UVB照射后的角质形成细胞和成纤维细胞的DNA损伤、细胞因子表达水平的影响，并进一步研究了辅酶Q10的光保护作用机制与核转录因子B（NF-B）信号通路的相关性，藉此可为辅酶Q10作为防晒剂的防护开发提供理论证明，并以此为研究平台，深入研究紫外线照射皮肤后引起皮肤一系列细胞水平、基因水平的变化及这些生物学效应的具体分子机制。

CoQ10具有抑制光辐射损伤的作用；CoQ10可以作为抗光辐射损伤的成分添加到化妆品中，CoQ10的应用是将CoQ10添加入化妆品中，可使化妆品（包括美白爽肤水、面霜、面膜等）具有抑制光辐射的功效。也可以作为药品用于治疗光辐射损伤症状。

附图说明

图1显示CoQ₁₀对Hacat细胞辐射后CPDs含量的影响。

图2显示CoQ₁₀对Hacat细胞辐射细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α基因表达水平的影响。

图3显示CoQ₁₀对Hacat细胞辐射细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α分泌的影响。

图4显示CoQ₁₀对Hacat细胞辐射后NF-κB、IκBα和IKKα表达的影响。

具体实施方式

1、CPDs含量检测

辅酶Q10剂量相关性的研究：六孔板培养HaCat细胞，选取照射后继续培养24h作为观测时间点，此时间点都设六组：UVB未照射组（-UVB）、单纯UVB照射组（UVB）、微载体组（NLC）、辅酶Q10剂量1μM组（UVB+1μM）、辅酶Q10剂量5μM组（UVB+5μM）、辅酶Q10剂量10μM组（UVB+10μM），每个组重复两个孔，每个孔接2×10⁵的细胞量，共需4块六孔板，4.8×10⁶的细胞量。照射剂量为5mJ/cm²，24h之后分别收集细胞，用试剂盒提取DNA，采用硫酸鱼精蛋白ELISA法检测CPDs。

2、QPCR检测

（1）RNA的提取实验

1）用加入β-ME的Buffer RLT Plus 600ul，吹散细胞。

2）涡旋30s，破碎细胞。

3）将细胞裂解溶液转移至gDNA过滤柱上，将柱置于2mL离心管中10,000rpm离心30s。弃柱，保留溶液。

4）细胞裂解溶液中加入一个体积600μl70%乙醇，吹打混匀。

5）转移700μl样品至RNeasy过滤柱，柱子置于2ml离心管，≥10,000rpm离心30s，弃溶液。

6）向RNeasy过滤柱中加入700μl的Buffer RW1小心的盖上盖子，10,000rpm离心30s，弃溶液。

7）向RNeasy过滤柱中加入500μl的Buffer REP10,000rpm离心30s，弃溶液。

8）向RNeasy过滤柱中加入500μl的Buffer REP 10,000rpm离心2min，，弃溶液，将RNeasy过滤柱放入一个新的2ml离心管全速空甩离心1min。。

9）将RNeasy柱放入新的1.5ml离心管中，在膜上加入30的RNase-free water，≥10,000rpm离心1min，将RNA溶解于水中。

10）测定RNA浓度。

（2）反转录实验

1）变性：RNA+Primer+dNTPs(共10μl，不足部分用DEPC-treated water补足)65℃,5min，接着放置于冰上至少1min。

2）退火：cDNA合成混合物体系如下所示

random hexamers：添加10μl cDNA合成混合物，25℃10min。

Oligo（dT）或GSPs：添加10μl cDNA合成混合物。

3）cDNA合成：50℃50min。

4）结束反应：85℃5min，之后放置于冰上。

5）RNA的降解：添加1μl RNase H，37℃20min。

6）cDNA合成产物可以储存于-20℃。

（3）RealTime-PCR

以GAPDH作为内参，实验方法为：

95℃，2min

95℃，10sec

58℃，10sec

72℃,15sec

共40个循环

3、细胞因子表达检测

HaCat细胞UVB辐射24h，采用Luminex，检测辅酶Q10作用之后细胞上清里面不同细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的表达。

4、NF-κB表达检测

HaCat细胞UVB辐射6h，，采用western-blot方法，辅酶Q10在不同浓度（1μM、5μM、10μM）下，照射6h后，检测NF-κB在辅酶Q10对UVB照射中的干预作用及其机制。

Claims

1.一种测定CoQ10抑制紫外光B辐射损伤的方法，其特征在于，测定步骤如下：

（1）CoQ10用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解；

（2）HaCat细胞用完全培养基调整细胞浓度为4-10×10⁴/孔，接种于细胞板中，贴壁后换用1％、2％、3％、5％的低血清培养基，同时加入（1）所述的CoQ10溶液，CoQ10终浓度为1uM、5uM、10uM；并使用浓度为5mJ/cm²或20mJ/cm²的UVB照射，分别以照射后4h－24h不同时间点为观察时间点；

（3）HaCat细胞培养4h--24h后，用ELISA试剂盒检测各组细胞内CPDs的含量；CoQ10剂量相关性的检测；

（4）所述HaCat细胞UVB辐射6h--24h，提取RNA，QPCR检测细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α基因表达水平；

所述HaCat细胞UVB辐射6h--24h，采用Luminex检测试剂盒检测细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α分泌情况；

（5）所述HaCat细胞UVB辐射6h后，采用western-blot方法检测各组NF-κB表达情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQ10剂量相关性的检测包括：六孔板培养HaCat细胞，选取照射后继续培养4h和24h作为观测时间点，每个时间点都设六组：UVB未照射组（-UVB）、单纯UVB照射组（UVB）、微载体组（NLC）、CoQ10剂量1μM组（UVB+1μM）、CoQ10剂量5μM组（UVB+5μM）、CoQ10剂量10μM组（UVB+10μM），每个组重复两个孔，每个孔接2×10⁵的细胞量，共需4块六孔板，4.8×10⁶的细胞量；

照射剂量为5mJ/cm²，4h-24h之后分别收集细胞，用试剂盒提取DNA，采用硫酸鱼精蛋白ELISA法检测CPDs。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQ10具有生物活性物质特点CoQ10。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生物活性物质特点是一种脂溶性醌,其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链——聚异戊烯基的聚合度为10而得名，是一种醌环类化合物；分子式C59H90O4，分子量863.36。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQ10具有抑制光辐射损伤的作用；CoQ10的应用是将CoQ10添加入化妆品中，使化妆品具有抑制光辐射的功效；所述的化妆品包括美白爽肤水、面霜、面膜。