KR102102321B1

KR102102321B1 - 태양광 차단 기능성 물질 스크리닝 방법 및 태양광 차단 효능 평가 방법

Info

Publication number: KR102102321B1
Application number: KR1020130149432A
Authority: KR
Inventors: 김형준; 최민식; 정지용; 박주열; 이태룡; 신동욱
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2020-04-21
Also published as: KR20150064579A

Abstract

본 발명의 태양광 차단 기능 측정방법은 태양광 조사에 의해 변화하는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량 및 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 중 하나 이상의, 대상 물질에 의한 변화를 측정함으로써, 기존에 육안평가를 통해 자외선 차단정도를 평가하던 방법과 달리 정확하고 객관적으로 태양광 차단 정도를 측정 및 판단할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 측정방법은 자외선 차단 지수만을 제공하던 기존의 태양광 차단 효능 평가 방법과 달리 가시광선 중 가장 피부 손상을 가장 많이 유도하는 400∼500 nm 파장의 블루/바이올렛 라이트의 차단여부까지 판별할 수 있으며, 보다 세분화된 태양광 차단 효능 평가 결과를 제공할 수 있다. 나아가 이를 이용해 태양광 차단 정도를 지수화하는 것이 가능하다.

Description

태양광 차단 기능성 물질 스크리닝 방법 및 태양광 차단 효능 평가 방법{Method for screening of sunlight protection functional material and method for evaluating sunlight protection effect}

본 명세서에 기재된 내용은 피부 세포에서 특정 유전자의 발현변화를 통해 태양광 차단 기능을 측정하는 방법, 구체적으로 태양광 차단 기능성 물질을 스크리닝 방법 또는 태양광 차단 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다.

태양광(태양에너지)은 빛의 파장이 긴 쪽에서부터 차례로 라디오파, 초단파, 적외선, 가시광선, 자외선, X선 및 γ선 등으로 이루어진다. 그리고 태양광의 피부에 대한 부정적인 영향이 알려지면서, 이러한 태양광으로부터 피부를 보호하기 위한 많은 제품이 개발되었다.

그러나, 상술한 바와 같이 태양광에는 여러 다양한 파장의 전자기파들이 존재함에도, 현재 대부분의 태양광 차단 효능은 자외선을 얼마나 효과적으로 차단할 수 있는지로만 판단되고 있다. 이에 따라 태양광 차단 제품의 효능 평가도 자외선 차단정도를 평가하는 지표인, "SPF(sun protection factor)"라 명명되는 UVB 영역(290∼320 nm)이 유도하는 홍반(erythema) 및 "PA(Protection of UVA)"로 명명되는 UVA 영역(320∼400 nm)이 유도하는 흑화(Persistent Pigment Darkening) 현상을 실험자가 육안으로 관찰하는 방법을 통해서만 이루어지고 있다. 즉, 실제로 태양광에서 자외선이 차지하는 비중은 매우 적으며 태양광은 다른 파장영역의 전자기파들이 더 많은 비중을 차지하고 있음에도, 상기 SPF와 PA를 통한 자외선 차단효능 외에 다른 파장을 갖는 대부분의 태양광의 차단 효능을 확인할 수 없다는 문제가 있다.

실제로 시판되는 대부분의 태양광 차단 제품들의 경우 상기와 같은 SPF와 PA로 표시되는 자외선 차단지수에만 초점을 맞추어 개발되어 왔고, 그 결과 가시광선에 대한 태양광 차단, 또는 이를 이용하는 기술의 개발은 미흡한 실정이다.

또한, 상기와 같은 태양광 차단 제품들은 가시광선 중 가장 피부 손상을 가장 많이 유도하는 400∼500 nm 파장의 블루/바이올렛 라이트 영역을 포함하는 가시광선에 대한 태양광 차단 기능이 매우 미흡함에도, 현재 상기 블루/바이올렛 라이트의 차단 효능을 평가할 수 있는 어떠한 차단 지표도 설정되어 있지 않아 이를 확인할 수 없다는 문제가 있다.

국내 등록특허공보 제10-0151635호

본 발명의 일측면은 태양광, 구체적으로 블루/바이올렛 라이트의 차단 기능을 측정하여 태양광 차단 기능 물질을 스크리닝할 수 있는 방법, 또는 태양광 차단 효능을 평가할 수 있는 태양광 차단 효능 평가 방법을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는,

태양광 조사에 의해 변화하는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량 및 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 중 하나 이상의, 대상 물질에 의한 변화를 측정하는 단계를 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 구현예는 상기 변화를 측정한 결과, 대상물질에 의해 피부 세포 내 항균성 펩티드의 발현량 및 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량 중 하나 이상의 감소가 억제되면 태양광 차단 기능이 있는 것으로 판정하는 태양광 차단 기능성 물질 스크리닝 단계를 더 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 변화를 측정한 결과, 대상물질에 의해 상기 항균성 펩티드의 발현량 및 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량 중 하나 이상의 감소 억제 정도가 클수록 태양광 차단 기능이 높은 것으로 판정하는 태양광 차단 효능 평가 단계를 더 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 구현예로서 사용되는 항균성 펩티드인 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, Psoriasin, Dermcidin, RNase7의 각 유전자 발현량(Relative mRNA Level)의 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예로서 사용되는 항균성 펩티드인 HBD-1, HBD-2, HBD-3, Psoriasin, Dermcidin, RNase7의 각 유전자 발현량(Relative mRNA Level)의 UV(자외선) 조사전(cont.)과 조사후(UV), 그리고 조사강도에 따른 변화를 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린(Flagellin)을 처리한 경우의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C를 처리하고, 이와 더불어 산화 질소 스캐빈저(Nitric Oxide scavenger)인 PTIO과 활성산소종 스캐빈저(ROS scavenger)인 NAC를 각각 처리하였을 때의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(-)과 조사후(Blue)로 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 사람정상각질피부세포에 블루/바이올렛 라이트 조사한 경우 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-protiens)의 생성량 변화를 비교한 결과(SDS-PAGE 겔의 모습)를 나타낸 것이다.
도 6은 사람정상각질피부세포에 자외선을 조사한 경우 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-protiens)의 생성량 변화를 비교한 결과(SDS-PAGE 겔의 모습)를 나타낸 것이다.
도 7은 블루/바이올렛 라이트를 조사한 경우(Blue) 실시예 1 내지 3의 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신(Psoriasin), 더미시딘(Dermcidin), RNase7의 각 발현량을 비교한 그래프를 나타낸 것이다.
도 8은 블루/바이올렛 라이트(Blue light)를 조사한 경우 실시예 1 및 3의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-protiens)의 생성량 변화를 비교한 결과(SDS-PAGE 겔의 모습)을 나타낸 것이다.

본 명세서에서 “태양광(sunlight)”이라 함은 자외선뿐만 아니라 라디오파, 초단파, 적외선, 가시광선, X선 및 γ선 등 태양광의 모든 파장을 포함하는 최광의의 개념이다. 또한, 본 명세서에서 "피부세포"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직의 세포를 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 몸 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발에 존재하는 세포를 포함하는 최광의의 개념이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 구현예는 태양광 조사에 의해 변화하는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량 및 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 중 하나 이상의, 대상 물질에 의한 변화를 측정하는 단계를 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 변화를 측정한 결과, 대상물질에 의해 상기 항균성 펩티드의 발현량 및 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량 중 하나 이상의 감소 억제정도가 클수록 태양광 차단 기능이 높은 것으로 판정하는 태양광 차단 효능 평가 단계를 더 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법을 제공한다.

일 구현예에 따른 본 발명의 태양광 차단 기능 측정 방법에서 조사되는 상기 태양광은 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 포함한다. 또한, 상기 태양광은 290~400nm 파장의 자외선을 더 포함할 수 있다.

일 구현예 따르면, 상기 태양광, 구체적으로 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 상기 항균성 펩티드(AMPs)의 발현량을 감소시킨다. 또한, 상기 블루/바이올렛 라이트는 각종 사이토카인(cytokine) 및 이와 관련된 유전자, 단백질로서 RANTES(Human CCL5), CCL 2(Chemokine ligand 2), IL-6(Interleukin-6), IL-8(Interleukin-8), TNF-α(Tumor necrosis factor-α), COX-2(Cyclooxygenase-2) 등의 발현량을 감소시킬 수 있다.

구체적으로 상기 항균성 펩티드는 작은 분자량을 가진 단백질로, 박테리아, 바이러스 및 곰팡이와 같은 병원균에 의한 감염을 예방하는 항균 활성을 갖는다. 상기 항균성 펩티드는 혈관신생, 창상치유 및 화학주성을 유도하는 것으로 보고되고 있으며, 양전하를 띠면서 친수성 및 소수성 부위를 동시에 가지고 있는 구조적인 특징이 있다. 일 구현예로서 상기 항균성 펩티드(AMPs)는 HBD-1(Human beta-defensin-1, ACCESSION NP_005209, VERSION NP_005029.1 GI: 4885181), HBD-2(Human beta-defensin-2, ACCESSION NP_004933, VERSION NP_004933.1 GI: 4826692), HBD-3(Human beta-defensin-3, ACCESSION AAG02237, VERSION AAG02237.1 GI: 49931627), LL-37(Cathelicidin-37, ACCESSION NP_004336, VERSION NP_004336.3 GI: 348041314) 서라이아신(Psoriasin, ACCESSION AAA60210, VERSION AAA60210.1 GI: 190668), 더미시딘(Dermcidin, ACCESSION NP_444513, VERSION NP_444513.1 GI: 16751921) 및 리보핵산가수분해효소 7(RNase 7, ACCESSION CAC84458, VERSION CAC84458.1 GI: 40643235) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구현예에 따른 본 발명의 태양광 차단 기능 측정 방법에 사용되는 상기 HBD(Human beta-defensin)-1, HBD-2, HBD-3, LL(Cathelicidin)-37, 서라이아신(Psoriasin), 더미시딘(Dermcidin), 리보핵산가수분해효소(RNase) 7은 선천 면역 인자로서 피부 소화기 호흡기 안구 결막에 존재, 그람 양/음성세균과 진균 바이러스를 죽이거나 성장을 억제. 이들은 각질형성세포 이외에 피부의 땀샘과 피지 선의 분비물에 존재하며 땀과 피지를 통하여 피부 표면으로 분비되고 침착되어 항균 장벽 형성에 기여한다. 또한, 상기 항균성 펩티드들은 자외선 조사시에는 블루/바이올렛 조사시와 반대로 발현량이 증가하는 특성을 가지고 있다. 상기 자외선에 대한 항균성 펩티드의 발현특성은 Glaser R. et al. UV-B radiation induces the expression of antimicrobial peptides in human keratinocytes in vitro and in vivo, J Allergy Clin Immunol. 2009 May;123(5):1117-23. 에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질은 자외선 조사시 발현량이 증가하지만, 본 발명의 다른 일 구현예 따르면, 상기 태양광, 구체적으로 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트는 상기 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량을 감소시킨다. 구체적으로, 생체내의 많은 기능과 연관된 질소 (nitric oxide)는 활성 시스테인 잔기와 반응하여 단백질 S-나이트로실레이션을 생성할 수 있고, 단백질 인산화 과정처럼 단백질 S-나이트로실레이션은 단백질 활성 등의 세포 신호전달을 조절할 수 있다. 그리고 상기 블루/바이올렛 라이트는 생체내 정상적으로 나이트로실레이션, 즉 상기와 같이 S-나이트로실레이션되어 있는 단백질에서 산화질소(Nitric Oxide)를 떼어내는 디-나이트로실레이션(De-Nitrosylation)을 유도할 수 있다. 그리고, 블루/바이올렛 라이트에 의해 상기와 같이 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량이 감소되면, 항균성 펩티드(AMPs)도 감소될 수 있다.

상기 항균성 펩티드의 유전자 또는 S-나이트로실레이션의 단백질의 발현 수준은 예를 들어 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 노던 블롯(northern blot) 분석, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역 블롯(immuneblot), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 비오틴-스위치 어세이(Biotin-switch assay) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 측정될 수 있다.

또한, 일 구현예로서 본 발명에 따른 방법은 상기 변화를 측정하는 단계 이전에, 대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계, 및 피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 태양광을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 태양광 투과성 물질은 태양광, 즉, 상기 자외선 또는 블루/바이올렛 라이트를 투과시키면서 측정 대상 물질의 도포가 가능한 물성을 지닌 것이면 모두 사용이 가능하며, 예를 들면 석영판(Quartz Plate) 또는 목표로 하는 광선영역만 투과시키는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이때 상기 대상 물질은 태양광 차단 효능을 평가하고자 하는 물질로서, 사람의 피부에 적용하는 물질이면 화장품, 약품, 섬유 등과 같이 이를 포함하는 제품이나 제형에 제한되지 않고 모두 포함한다.

일 구현예에 따른 본 발명의 태양광 차단 기능 측정 방법에서 사용되는 상기 피부 세포는 인간 또는 동물 유래 피부 세포를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들면, 각질분화형성세포(Keratinocytes), 섬유아세포(fibroblast) 및 머켈세포(Merkel cell)와 같은 멜라닌형성세포(Melanocytes) 중 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기와 같이 피부 세포 내 항균성 펩티드의 발현량 및/또는 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량이 감소할 경우, 피부 면역력이 저하되어 각종 피부 트러블, 질병 등이 발생할 뿐만 아니라, 이로 인해 피부 보습능이 저하되고 노화가 촉진되어 피부 미용에도 좋지 않다. 그러나 본 발명의 태양광 차단 기능 측정 방법에 따르면 블루/바이올렛 라이트를 차단할 수 있는 태양광 차단 기능성 물질을 스크리닝하고, 이를 개발함으로써, 상기와 같은 블루/바이올렛 라이트에 의해 유도되는 피부의 부정적인 효과들을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 블루/바이올렛 라이트를 차단 효능정도를 객관적으로 평가할 수 있으므로, 이를 지수화하는 것이 가능하다. 나아가, 상기와 같은 본 발명에 따른 스크리닝 및 효능 평가 방법을 사용하여 블루/바이올렛 라이트를 차단하는데 유용한 물질들을 발굴하고 이를 피부에 적용할 경우, 항균성 펩티드의 감소가 차단되므로 자연면역감소도 차단되어 면역력을 증가시킬 수 있을 것이다.

이하, 시험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 시험예, 실시예 및 비교예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[시험예 1]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 항균성 펩티드의 발현량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

먼저, 본 발명에서 사용하는 사람정상각질피부세포(Human epidermal neonatal keratinocyte cells)는 상용적으로 확보되어 권장하는 방법으로, 론자사(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌(Walkersville) 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO₂ 배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 세포 배양액은 론자사의 지침서에 따라 배양하였다. 500 ml의 KBM-2(Clonetics CC-3103) 배지에 KGM-2 불렛 키트(Bullet kit: BPE(Bovine pituitary extract) 2 ml, hEGF(human epidermal growth factor) 0.5 ml, 인슐린(Insulin) 0.5 ml, 하이드로코티손(Hydrocortisone) 0.5 ml, 트랜스페린(Transferrin) 0.5 ml, 에피네프린(Epinephrine) 0.5 ml, 및 젠타마이신 설페이트+암포페리신-B(Gentamycin Suflate + Amphofericin-B: GA-1000) 0.5 ml을 첨가하여 사용하였다.

그 다음, 상기 사람정상각질피부세포가 배양된 배지에 400~500 nm의 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²)를 조사한 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 이후 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.

분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다.

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.

유전자 명칭	프라이머
HBD-1	Hs00608345_m1
HBD-2	Hs00175474_m1
HBD-3	Hs00218678_m1
LL-37	Hs00189038_m1
서라이아신(Psoriasin)	Hs00161488_m1
더미시딘(Dermcidin)	Hs00364976_m1
RNase7	Hs00922963_s1

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 선천면역 유전자, 즉 항균성 펩티드인 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, Psoriasin, Dermcidin, RNase7 모두 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)보다 조사후(Blue)에서 각 유전자 발현량(Relative mRNA Level)이 감소함을 알 수 있다. 이는, 블루/바이올렛 라이트 대신에 자외선(10, 30mJ)을 조사한 것을 제외하고는 상기 실험과 동일한 조건 및 방법으로 실시한 실험결과, 자외선 조사시에는 생체내의 HBD-1, HBD-2, HBD-3, Psoriasin, Dermcidin 및 RNase7의 발현량이 조사강도의 증가에 따라 증가한 것과 대비되는 결과이다(도 2 참조). 이는 같은 태양광이어도 그 파장에 따라 피부에 대하여 다르게 작용하며, 상기와 같은 항균성 펩티드들을 블루/바이올렛 라이트 차단 기능을 측정하고 그 효능을 평가하기 위한 지표로 사용할 수 있음을 의미한다.

[시험예 2]

이때, 상기 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²) 조사 전과 후로 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린(Flagellin, invivogen, San Diego, California, USA)를 처리하였다.

그 다음, 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다.

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1과 같다.

도 3은 사람정상각질피부세포에 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C와 플라젤린을 처리한 경우의 각 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7 유전자 발현량 변화를 블루/바이올렛 라이트 조사전(cont.)과 조사후(Blue)로 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이 Poly I:C와 플라젤린에 의해 항균성 펩티드인 상기 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7이 증가되었을 때, 블루/바이올렛 라이트의 조사로 상기 각 유전자의 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 증감은 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다. 이는 상기와 같은 항균성 펩티드들을 블루/바이올렛 라이트 차단 기능을 측정하고 그 효능을 평가하기 위한 지표로 사용할 수 있음을 의미한다.

[시험예 3]

이때, 상기 블루/바이올렛 라이트(10 J/cm²) 조사 전과 후로 바이러스, 박테리아의 감염상황을 유도하기 위해 Poly I:C를 처리하였다. 이와 더불어, 산화 질소 스캐빈저(Nitric oxide scavenger)인 PTIO(2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt)과 활성산소종 스캐빈저인 NAC(N-Acetyl-L-cysteine)를 각각 처리하였다(Sigma, St. Louis, MO, USA).

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1과 같다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 상기 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 발현량이 Poly I:C에 의해 증가되었을 때 블루/바이올렛 라이트 조사에 의해 감소되는 것을, 처리한 두 스캐빈저 중 산화 질소 스캐빈저인 PTIO을 처리한 군에서는 블루/바이올렛 라이트 조사에도 항균성 펩티드(AMPs)들의 발현량이 감소되지 않았다. 이는 블루/바이올렛 라이트가 S-나이트로실레이션 생성 및 항균성 펩티드(AMPs)의 발현 조절에 관여함을 의미한다.

[시험예 4]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

상기 배양세포에 400~500 nm의 블루/바이올렛 라이트를 각각 10, 30, 60 J/cm²로 조사한 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 단백질 S-나이트로실레이션 검출을 위한 비오틴-스위치 어세이(Biotin-switch assay)를 수행하였다. 구체적으로, 상기 세척된 세포를 HENTS용액(HEPES, Triton X100, SDS, protease inhibitor, EDTA)으로 10분간 용해시켜 상등액만 취하였다. 단백질 정량 후 HEN(HEPES, protease inhibitor, EDTA) 용액을 이용하여 600ug/200ul 로 맞추었다. S-나이트로실레이션 되지 않은 시스테인(cystein)의 반응을 막기위해 MMTS(Sigma)를 10mM이 되도록 추가한 후 50℃에서 15분간 반응시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, 1mM HPDP-비오틴(Pierce)이 포함된 50mM 아스코르빈산(Sigma) HENS용액(HEPES, SDS, protease inhibitor, EDTA)에 녹여 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 S-나이트로실레이션된 시스테인에 비오틴을 결합시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, HENS용액으로 녹이고, 보정을 위한 투입(input)을 5% 덜어둔 뒤, 아비딘-아가로스 비드(avidin-agarose bead, Pierce)를 각각 20μl씩 가해 4℃에서 12시간 반응시켰다. 비드를 neutralization 용액(HEPES, EDTA, NaCl, Triton X 100)으로 5회 씻은 후 샘플 버퍼(sample buffer)를 넣고 끓인 뒤 투입(input)과 함께 SDS-PAGE를 수행한다. 그 후 은 염색(Silver staining)을 통해 나이트로실레이션 (S-Nitrosylation) 된 단백질을 SDS-PAGE 겔로 확인하였고, 이를 도 5에 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 블루/바이올렛 라이트를 조사하지 않은 대조군(cont)와 비교할 때, 블루/바이올렛 라이트 조사 강도가 증가할수록 생체내의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-proteins)가 감소함을 확인할 수 있다.

이는, 블루/바이올렛 라이트 대신에 자외선(20mJ)을 조사한 것을 제외하고는 상기 실험과 동일한 조건 및 방법으로 실시한 실험결과, 자외선 조사시에는 생체내의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-proteins)가 증가한 것과 대비되는 결과이다(도 6 참조). 이는 같은 태양광이어도 그 파장에 따라 피부에 대하여 다르게 작용하며, 상기와 같은 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량을 블루/바이올렛 라이트 차단 기능을 측정하고 그 효능을 평가하기 위한 지표로 사용할 수 있음을 의미한다.

[시험예 5]

본 발명의 일 구현예에 따라 측정 대상 물질의 피부세포에 대한 태양광 차단 기능을 측정하기에 앞서, 대상 물질의 자외선 및 블루/바이올렛 라이트 투과정도를 하기와 같이 측정하였다.

본 실험에 앞서, 대상 물질로서 실시예 1 내지 3의 태양광 차단 제형을 하기의 조성으로 통상적인 방법에 따라 제조하였다(단위: 중량%).

성분	실시예1	실시예2	실시예3
TiO₂	2	2	2
ZnO	2	2	2
OMC(octyl methoxy cinnamate)	7	7	7
에틸헥실 살리실레이트 (Ethylhexyl Salicylate)	-	3	3
티노소브 S(Tinosorb S)	3	-	3
세티올 CC(Cetiol CC)	5.00	5.00	5.00
놈콧-HK-G(Nomcort-HK-G)	1.50	1.50	1.50
지랍(Ozokerite)	1.00	1.00	1.00
아빌 EM90(Abil EM90)	1.50	1.50	1.50
크릴-6(Crill-6)	0.50	0.50	0.50
벤톤 27VCG(Bentone 27VCG)	1.40	1.40	1.40
DC 2-9040	3.00	3.00	3.00
DC 345	3.00	3.00	3.00
핀솔브 TN(Finsolv TN)	20.00	20.00	20.00
증류수	42.73	42.73	39.73
EDTA.2Na	0.02	0.02	0.02
NaCl	1.00	1.00	1.00
글리세린	5.00	5.00	5.00
폴리에틸렌(PE)	0.30	0.30	0.30
센시바 SC50(Sensiva SC50)	0.05	0.05	0.05
총 합계	100.00	100.00	100.00

그 다음, 상기 실시예 1∼3의 각 SPF 및 PA 임상지수, 및 블루/바이올렛 라이트의 투과율을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 각각 나타내었다. 이때, 블루/바이올렛 라이트의 투과율은 실시예 1∼3의 태양광 차단 제형을 각각 대역통과필터 위에 2 mg/㎠의 양으로 도포한 후 블루/바이올렛 라이트 영역을 포함한 광원을 조사하고 투과되는 블루/바이올렛 라이트 파장영역(400∼500 nm)을 분광광도계(Spectrophotometer)인 SPF-290S 자외선차단제 분석 시스템(Sunscreen Analyzer System)으로 측정하였다. 자외선에 의한 SPF (피부홍반) 및 PA (피부흑화) 확인 실험은 자외선 차단제 실험법 식품의약품안전처(KFDA)의 방법대로 실시하였다

시험물질	SPF	PA	Blue/Violet 차단률 (%)
실시예1	30	+++	51.3 %
실시예2	30	++	15.4 %
실시예3	30	+++	56.4 %

상기 표 3의 결과로부터, 실시예 1-3의 태양광 차단 제형들은 자외선에 대하여 거의 동일한 SPF 및 PA를 나타낸 반면, 블루/바이올렛 라이트의 투과율에 있어서는 큰 차이를 가짐을 알 수 있다. 이는 동일한 자외선 차단 효능을 갖는 태양광 차단 제품들간에도 가시광선 중 400~500nm의 파장영역을 갖는 블루/바이올렛 라이트의 차단 효능은 각각 다를 수 있으므로, 자외선 차단 지수가 곧 태양광의 전반적인 차단 기능 보유 또는 차단 효능 정도를 포괄적으로 의미할 수는 없음을 의미한다.

[시험예 5]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 태양광 차단 기능을 갖는 물질에 따른 항균성 펩티드의 발현량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

그 다음, 상기 시험예 4에서 사용한 실시예 1-3의 태양광 차단 제형을 대역통과필터 위에 2 mg/㎠ 도포한 후 그 하부에 사람정상각질피부세포를 위치시킨 다음, 태양광 차단이 도포된 부위의 위쪽에서 400∼500 nm의 블루/바이올렛 라이트를 0, 30 J/㎠의 세기로 각각 조사하였다. 그 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 이후 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.

HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan® gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 블루/바이올렛 라이트가 유도하는 피부의 유전자 변화를 실시간 PCR 로 평가하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 이때, 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1과 같다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 블루/바이올렛 라이트를 조사한 경우(Blue) 실시예 1 내지 3의 HBD-1, HBD-2, HBD-3, LL-37, 서라이아신, 더미시딘, RNase7의 각 발현량이 감소하였으나, 실시예 1-3의 블루/바이올렛 라이트 차단 효능에 따라 그 감소정도가 각각 차이가 있었다. 이는 상기와 같은 항균성 펩티드 발현량을 블루/바이올렛 라이트 차단 효능을 평가하기 위한 지표로 사용할 수 있음을 의미한다.

[시험예 6]

본 발명의 일 구현예로서, 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)를 피부세포에 조사시 조사시 태양광 차단 기능을 갖는 물질에 따른 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 변화를 측정하는 실험을 하기와 같이 실시하였다.

그 다음, 상기 시험예 4에서 사용한 실시예 1 및 3의 태양광 차단 제형을 대역통과필터 위에 2 mg/㎠ 도포한 후 그 하부에 사람정상각질피부세포를 위치시킨 다음, 태양광 차단이 도포된 부위의 위쪽에서 400∼500 nm의 블루/바이올렛 라이트를 30 J/㎠의 세기로 각각 조사하였다.

그 다음 사람정상각질피부세포의 배양액을 제거하고, 2 ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 단백질 S-나이트로실레이션 검출을 위한 비오틴-스위치 어세이(Biotin-switch assay)를 수행하였다. 구체적으로, 상기 세척된 세포를 HENTS용액(HEPES, Triton X100, SDS, protease inhibitor, EDTA)으로 10분간 용해시켜 상등액만 취하였다. 단백질 정량 후 HEN(HEPES, protease inhibitor, EDTA) 용액을 이용하여 600ug/200ul 로 맞추었다. S-나이트로실레이션 되지 않은 시스테인(cystein)의 반응을 막기위해 MMTS(Sigma)를 10mM이 되도록 추가한 후 50℃에서 15분간 반응시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, 1mM HPDP-비오틴(Pierce)이 포함된 50mM 아스코르빈산(Sigma) HENS용액(HEPES, SDS, protease inhibitor, EDTA)에 녹여 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 S-나이트로실레이션된 시스테인에 비오틴을 결합시켰다. 아세톤으로 단백질 침전 후, HENS용액으로 녹이고, 보정을 위한 투입(input)을 5% 덜어둔 뒤, 아비딘-아가로스 비드(avidin-agarose bead, Pierce)를 각각 20μl씩 가해 4℃에서 12시간 반응시켰다. 비드를 neutralization 용액(HEPES, EDTA, NaCl, Triton X 100)으로 5회 씻은 후 샘플 버퍼(sample buffer)를 넣고 끓인 뒤 투입(input)과 함께 SDS-PAGE를 수행한다. 그 후 은 염색(Silver staining)을 통해 나이트로실레이션 (S-Nitrosylation) 된 단백질을 SDS-PAGE 겔로 확인하였고, 이를 도 8에 나타내었다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 블루/바이올렛 라이트를 조사하지 않은 대조군(cont)와 비교할 때, 실시예 1 및 3의 태양광 차단 효능의 차이에 의해 생체내의 S-나이트로실레이션된 단백질(SNO-proteins) 생성량도 차이가 나타남을 알 수 있다. 이는 상기와 같은 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량을 블루/바이올렛 라이트 차단 효능을 평가하기 위한 지표로 사용할 수 있음을 의미한다.

Claims

태양광 조사에 의해 변화하는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량 및 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 중 하나 이상의, 대상 물질에 의한 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 변화를 측정한 결과, 대상물질에 의해 피부 세포 내 항균성 펩티드의 발현량 및 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량 중 하나 이상의 감소가 억제되면 태양광 차단 기능이 있는 것으로 판정하는 태양광 차단 기능성 물질 스크리닝 단계를 더 포함하며,
상기 태양광은 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)이고,
상기 항균성 펩티드는 HBD(Human beta-defensin)-1, HBD-2, HBD-3, LL(Cathelicidin)-37, 서라이아신(Psoriasin), 더미시딘(Dermcidin) 및 리보핵산가수분해효소(RNase) 7 중 하나 이상이며,
상기 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질은 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 시스테인인, 태양광 차단 기능 측정 방법.
삭제
태양광 조사에 의해 변화하는 피부 세포 내 항균성 펩티드(antimicrobial peptides, AMPs)의 발현량 및 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질의 생성량 중 하나 이상의, 대상 물질에 의한 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 변화를 측정한 결과, 대상물질에 의해 상기 항균성 펩티드의 발현량 및 S-나이트로실레이션된 단백질의 생성량 중 하나 이상의 감소 억제 정도가 클수록 태양광 차단 기능이 높은 것으로 판정하는 태양광 차단 효능 평가 단계를 더 포함하며,
상기 태양광은 400~500nm 파장의 블루/바이올렛 라이트(Blue/Violet light)이고,
상기 항균성 펩티드는 HBD(Human beta-defensin)-1, HBD-2, HBD-3, LL(Cathelicidin)-37, 서라이아신(Psoriasin), 더미시딘(Dermcidin) 및 리보핵산가수분해효소(RNase) 7 중 하나 이상이며,
상기 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 단백질은 S-나이트로실레이션(S-Nitrosylation)된 시스테인인, 태양광 차단 기능 측정 방법.
삭제
삭제
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 항균성 펩티드는 태양광을 조사하면 발현량이 감소하는 유전자인 태양광 차단 기능 측정 방법.
삭제
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 변화를 측정하는 단계 이전에,
대상 물질을 태양광 투과성 물질에 도포하는 단계; 및
피부 세포를 상기 태양광 투과성 물질 하부에 위치시킨 후 태양광 투과성 물질 상부에 태양광을 조사하는 단계를 더 포함하는 태양광 차단 기능 측정 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 태양광 투과성 물질은 석영판(Quartz Plate) 또는 대역(帶域)통과필터(Band pass filter)인 태양광 차단 기능 측정 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 피부 세포는 각질분화형성세포(Keratinocytes), 섬유아세포(fibroblast) 및 멜라닌형성세포(Melanocytes) 중 하나 이상인 태양광 차단 기능 측정 방법.