WO2016159050A1 - 血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法 - Google Patents

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壮太 岩谷
一朗 森岡
中村　肇
宮脇　敦史
安希子 熊谷
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国立大学法人神戸大学
国立研究開発法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring unbound bilirubin in a blood sample.
  • the present invention relates to a method for accurately measuring unbound bilirubin in a neonatal blood sample in order to appropriately manage jaundice in a newborn.
  • the present invention relates to a method for accurately measuring unbound bilirubin in a blood sample derived from a premature infant in order to reliably predict nuclear jaundice in a premature infant.
  • nuclear jaundice was one of the causes of neonatal brain damage, but early detection and early treatment were made with the advance of perinatal medical care, and it became almost preventable for full-term infants (mature infants).
  • early detection and early treatment were made with the advance of perinatal medical care, and it became almost preventable for full-term infants (mature infants).
  • full-term infants mature infants.
  • nuclear jaundice occurring in premature infants, which is a major issue that should be urgently solved in the field of pediatric neonatal medicine. .
  • Serum bilirubin so-called total bilirubin (TB)
  • TB total bilirubin
  • iDB unconjugated bilirubin
  • DB conjugated bilirubin
  • the neurotoxic component is unconjugated bilirubin.
  • unbound bilirubin which is not bound to albumin, has a low molecular weight, so it easily passes through the blood-brain barrier and deposits in the brain. It becomes a serious factor that exerts neurotoxicity.
  • Non-patent Document 1 Clin Chim Acta. 1977 Sep 1). ; 79 (2): See 411-7.
  • an automatic measuring device U-Analyzer manufactured by Arrows Co., Ltd.
  • This automatic measuring device is the only device that is clinically applied as an unbound bilirubin measuring device, and is approved by the US Food and Drug Administration (FDA) and the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare.
  • peroxidase is allowed to act on hydrogen peroxide generated by glucose and glucose oxidase to cause oxidative degradation of bilirubin.
  • albumin-unbound unbound bilirubin is easily oxidatively decomposed into colorless components
  • albumin-bound bilirubin is difficult to be oxidatively degraded
  • the concentration of unbound bilirubin is measured from the initial rate of oxidative degradation. Specifically, it is measured by monitoring the decrease rate of bilirubin pigment by a colorimetric method.
  • Non-Patent Document 4 Yasuhiro Kawase. Neonatal hyperbilirubinemia. Toru Yamaguchi, Mitsuo Kitahara, Tsuguya Fukui, edited by today's treatment guidelines, 2006 edition, School of Medicine, Tokyo, 2006 (pp. 941-942).
  • the amount of unbound bilirubin in the blood correlates with the total amount of bilirubin, but such a correlation may not be exhibited particularly in premature infants among newborns.
  • 39% of premature infants less than 30 weeks showed 39% of cases where unbound bilirubin showed a high value of 0.8 or more even though the total bilirubin was a low value of less than 15. It has been found that 7 out of 8 cases of TB nuclear jaundice were occupied. This result, which shows that there are not a few cases in which unbound bilirubin is relatively high compared to total bilirubin, suggests that managing jaundice only with total bilirubin can overlook the risk of developing nuclear jaundice. Warning.
  • Patent Document 1 Since the polypeptide UnaG described in International Publication No. 2014/133158 (Patent Document 1) specifically binds to unconjugated bilirubin, the present inventors applied this polypeptide to a GOD-POD measurement system. Inspired to do. However, since this polypeptide releases albumin binding and binds to bilirubin at the moment of contact with albumin-bound bilirubin, there is no distinction between unbound bilirubin and albumin-bound bilirubin. Therefore, it cannot be simply applied to a GOD-POD measurement system that derives the concentration from the initial rate of oxidative degradation of unbound bilirubin.
  • an object of the present invention is to provide a measurement method capable of accurately reflecting unbound bilirubin regardless of whether the amount of conjugated bilirubin is high.
  • the present inventors dared to discard the method of measuring the initial rate of unbound bilirubin oxidative degradation, which was essential for measuring the concentration of unbound bilirubin, and instead, stopped the oxidative degradation. Adopted. Then, by deriving the difference in the amount of UnaG binding before and after the oxidative degradation reaction as the amount of unbound bilirubin, UnaG is not used in the form of labeling only the detection target component as in the prior art, but only the detection target component. It was made possible to apply to the GOD-POD measurement system by changing the value of and using it in an unlabeled form.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the method for measuring unbound bilirubin of the present invention includes a decomposition step (i), a decomposition stop step (ii), a contact step (iii), and a detection step (iv).
  • a blood sample containing unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin is subjected to an oxidative degradation reaction of unbound bilirubin in the unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin.
  • the oxidative decomposition reaction is stopped to obtain a sample decomposition product.
  • the sample degradation product is contacted with a polypeptide that exhibits fluorescence characteristics by specific binding to unconjugated bilirubin.
  • a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics by specific binding to unconjugated bilirubin is also brought into contact with a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics by specific binding to unconjugated bilirubin.
  • fluorescence caused by the polypeptide is detected for each of the sample degradation product and the unreacted sample. Furthermore, the amount of unbound bilirubin is derived from the difference between the fluorescence in the sample degradation product and the fluorescence in the unreacted sample.
  • the blood sample is divided into a strain that has undergone the degradation step (i) and a strain that has not undergone the degradation step (i), and only in the former case, unbound bilirubin has a specific binding ability to the polypeptide. It is decomposed into components that do not have As a result, among the unconjugated bilirubin (unbound bilirubin and albumin-bound bilirubin) and conjugated bilirubin contained in the blood sample, only the albumin-bound bilirubin has specific binding and fluorescence in the line that has undergone the degradation step (i). In a strain that does not undergo degradation step (i), unbound bilirubin and albumin-bound bilirubin are prepared to produce specific binding and fluorescence.
  • unconjugated bilirubin is distinguished from conjugated bilirubin, and unbound bilirubin and albumin-bound bilirubin are also distinguished, so unbound regardless of whether the conjugated bilirubin is high or not. It becomes possible to accurately measure bilirubin. Thus, if a blood sample collected from a newborn is measured as a blood sample, jaundice can be managed accurately.
  • the blood sample may be a blood sample derived from a premature infant.
  • the blood sample may be derived from blood having a serum total bilirubin concentration of 8 mg / dL or more.
  • conjugated bilirubin is not detected in the present invention, it is particularly useful when there are particularly many cases where the amount of conjugated bilirubin is high. Specifically, it is possible to effectively manage newborn jaundice.
  • the conjugated bilirubin concentration of the blood sample may be 1 mg / dL or more.
  • conjugated bilirubin is not detected in the present invention, it is particularly useful in the case of a sample having such a high conjugated bilirubin concentration.
  • the oxidative degradation reaction may be stopped with an antioxidant.
  • the oxidative decomposition reaction can be stopped simply and effectively.
  • the antioxidant may be ascorbic acid.
  • the oxidative decomposition reaction can be stopped more easily and effectively.
  • the oxidative decomposition reaction can be stopped at a time of 10 seconds to 60 seconds after the start of the reaction in the decomposition step (i).
  • the unbound bilirubin in the blood sample can be sufficiently decomposed and the unbound bilirubin can be measured quickly.
  • the antioxidant may be added so as to be 0.1% by weight or more in the reaction system of the decomposition stopping step (ii).
  • the ascorbic acid when the antioxidant is ascorbic acid, the ascorbic acid may be added so as to be 32% by weight or less in the reaction system of the decomposition stopping step (ii).
  • ascorbic acid may be diluted to 0.8% by weight or less in the reaction system of the contacting step (iii).
  • reaction system in the contacting step (iii) can be set to a pH at which a polypeptide binding reaction easily occurs.
  • the dilution rate of the blood sample in the reaction system of the decomposition step (i) may be 5 to 120 times in terms of serum. .
  • the oxidative degradation reaction in the degradation step (i) proceeds with hydrogen peroxide and peroxidase generated from glucose in the presence of glucose oxidase, and oxidative degradation
  • the amounts of glucose oxidase and peroxidase may be 0.0128 U or more and 0.256 U or less in terms of converted value per 1 ⁇ L of serum.
  • the unit U representing the amount of enzyme is an international unit.
  • the reaction rate of the decomposition step (i) can be controlled appropriately.
  • the blood sample may be a whole blood sample.
  • the measurement efficiency is good because it is not necessary to prepare serum. Therefore, it is possible to quickly test for newborn jaundice, which is an urgent disease. Furthermore, since the amount of blood collected is small, the burden at the time of blood collection for newborns, particularly premature infants, can be reduced.
  • the amount of unbound bilirubin may be derived by performing a correction with a hematocrit value in the detection step (iv).
  • the sample preparation apparatus for unbound bilirubin measurement of the present invention includes an incubator, a reagent solution addition unit, a reagent blank solution addition unit, a timer, a stop agent addition unit, and a mixing unit.
  • the incubator includes a reaction container container and a control container container.
  • the reagent solution addition unit adds the unbound bilirubin oxidative degradation reagent solution to the reaction container in the reaction container storage unit.
  • the reagent blank solution addition unit adds the reagent blank solution to the control container in the control container storage unit.
  • the timer is started based on the operation of the reagent solution addition unit and the reagent blank solution addition unit.
  • the terminator addition unit is controlled based on the time measured by the timer and adds an oxidative decomposition terminator to each of the reaction container and the control container.
  • the mixing unit mixes the contents of the reaction container and the contents of the control container.
  • the decomposition step (i) and the decomposition stop step (ii) of the method for measuring unbound bilirubin according to (1) to (14) are routinely performed, and unbound bilirubin measurement for use in the contact step (iii) is performed. Sample can be prepared easily and accurately.
  • the unbound bilirubin measurement device of the present invention includes the sample preparation device for unbound bilirubin measurement according to (15), a fluorescence measurement unit, an arithmetic processing unit, and an output unit.
  • the fluorescence measurement unit performs fluorescence measurement on a sample for fluorescence measurement in which a polypeptide showing fluorescence characteristics is added to the contents of the reaction container to which the oxidative decomposition terminator is added and the contents of the control container.
  • the arithmetic processing unit derives an unbound bilirubin value from at least the difference between the fluorescence value of the contents of the reaction container and the fluorescence value of the contents of the control container.
  • the output unit displays the derived unbound bilirubin value.
  • the unbound bilirubin measuring device may further include a sorting unit and an adding unit.
  • the fractionation unit dispenses the contents from the reaction container and the control container into the measurement container after the addition of the oxidative decomposition terminator.
  • the addition unit adds a polypeptide solution exhibiting fluorescence characteristics to the measurement container.
  • the unbound bilirubin measurement kit of the present invention exhibits fluorescence characteristics by specific binding to an oxidoreductase for oxidative degradation of unbound bilirubin, an oxidative degradation terminator for stopping oxidative degradation, and unconjugated bilirubin. And at least a polypeptide.
  • the unbound bilirubin measurement kit according to (18) may further include glucose and glucose oxidase.
  • the oxidoreductase may be peroxidase. Thereby, the oxidative degradation of unbound bilirubin can be performed effectively.
  • the oxidative degradation terminator may be an antioxidant. As a result, the oxidative decomposition reaction can be stopped simply and effectively.
  • the antioxidant may be ascorbic acid. As a result, the oxidative decomposition reaction can be stopped simply and effectively.
  • the present invention enables measurement that accurately reflects the amount of unbound bilirubin regardless of whether the conjugated bilirubin is a high sample or not. For this reason, for example, jaundice management of a newborn can be performed accurately.
  • the measurement principle in one embodiment of the present invention is typically shown.
  • An example of the protocol of the measuring method of this invention is shown.
  • the block diagram of an example of the sample preparation apparatus for unbound bilirubin measurement of this invention and the unbound bilirubin measurement apparatus of this invention is shown.
  • the protocol of the UnaG method performed in Reference Example 1 is schematically shown.
  • the calibration curve obtained in Reference Example 1 is shown.
  • the correlation between the unconjugated bilirubin concentration by UnaG method (UnaG use and UnaG-HisFLAG use) obtained in Reference Example 3 and the unconjugated bilirubin concentration by enzymatic method is shown.
  • the correlation of the unconjugated bilirubin concentration in the whole blood by UnaG method obtained in Reference Example 10 and the unconjugated bilirubin concentration in the serum by UnaG method is shown.
  • concentration obtained by the reference example 11 by a UB analyzer is shown.
  • a correlation between the UB value (UB analyzer UB) of the UB analyzer by the conventional measurement method and the UB value (UB analyzer-0-20s) based on the TB value is shown.
  • the correlation between the UB value (UB analyzer UB) of the UB analyzer by the conventional measurement method and the UB value (UB analyzer-0-20s) based on the converted value after mixing with ascorbic acid is shown. It is a figure explaining the calculation method (a) of the UB value by the conventional measuring method, and the calculation method (b) of the UB value by this invention.
  • the correlation between the UB value (UBUanalyzer UB) of the UB analyzer by the conventional measurement method and the UB value (GOD-POD-UnaG-UB) based on the iDB value of the GOD-POD-UnaG method is shown.
  • the correlation with POD-UnaG-UB) is shown again in FIG.
  • the relationship between the iDB / Alb molar ratio and the UB value of the UB analyzer according to the conventional measurement method for the low DB value sample in Example 3 and the high DB value sample in Example 4 is shown.
  • the relationship between the iDB / Alb molar ratio and the UB value according to the GOD-POD-UnaG method of the present invention for the low DB value sample in Example 3 and the high DB value sample in Example 4 is shown.
  • FIG. 1 schematically shows the measurement principle with an example of an embodiment of the present invention.
  • D-Bil represents conjugated bilirubin
  • iD-Bil represents unconjugated bilirubin.
  • Alb represents albumin
  • iD-Bil released from albumin Alb represents unbound bilirubin UB.
  • D-BX represents a degradation product of conjugated bilirubin
  • iD-BX represents a degradation product of unbound bilirubin.
  • UnaG represents an example of a fluorescent polypeptide that specifically binds to conjugated bilirubin iD-Bil.
  • FIG. 1 (a1) shows a blood sample (unreacted sample).
  • the blood sample may be a blood collected sample derived from a human or non-human organism as long as it includes unbound bilirubin UB of conjugated bilirubin D-Bil and unconjugated bilirubin iD-Bil, or conjugated bilirubin. It may be an artificial blood sample prepared by known concentrations of D-Bil and / or unbound bilirubin UB.
  • the blood sample (a1) is preferably a blood sample derived from a human infant, particularly a newborn, from the viewpoint of great clinical significance.
  • the blood sample (a1) includes total bilirubin, namely conjugated bilirubin D-Bil and unconjugated bilirubin iD-Bil. Most of the unconjugated bilirubin iD-Bil exists as albumin Alb-bound bilirubin, while some is released from albumin Alb and exists as the neurotoxin unbound bilirubin UB.
  • the blood sample (a1) may be whole blood, plasma, or serum, and a blood sample is appropriately obtained and prepared by a person skilled in the art. In the preparation, plasma treatment, seradication treatment, dilution treatment and the like are performed.
  • a newborn is usually an infant who is 0 days or more and less than 28 days old, when the date of birth is counted as 0 days. Newborns often deviate from the correlation normally seen between total bilirubin and unbound bilirubin UB, and unbound bilirubin UB is often relatively high, and there is a high demand for accurate measurement of unbound bilirubin UB. . Therefore, when the newborn has a factor that increases the unbound bilirubin UB concentration, it is preferable that the newborn falls under hypoalbuminemia, pharmacological treatment, infection, etc. Among them, it is preferable that the newborn is a premature baby who is very likely to fall under the above factors.
  • a premature infant refers to a newborn born less than 37 weeks of gestation, but is more preferably a newborn less than 30 weeks of gestation.
  • the present invention can be applied to an infant who is 28 days or older.
  • the present invention is a measurement method that is not affected by the concentration of conjugated bilirubin D-Bil in a blood sample. Therefore, the present invention provides that when the blood sample may contain a high concentration of conjugated bilirubin D-Bil, for example, the total bilirubin is 5 mg / dL or more, preferably 8 mg / dL or more, particularly 20 mg / dL or more. More useful when included in concentration.
  • the upper limit of the total bilirubin concentration in the case where it can be measured in the present invention is not particularly limited. For example, 40 mg / dL, preferably up to 30 mg / dL can be measured.
  • the present invention is more useful when the conjugated bilirubin D-Bil concentration is 0.5 mg / mL or more, preferably 1 mg / mL or more, more preferably 2.5 mg / mL or more.
  • the conjugated bilirubin D-Bil concentration is 0.5 mg / mL or more, preferably 1 mg / mL or more, more preferably 2.5 mg / mL or more.
  • conjugated bilirubin D-Bil concentration conjugated bilirubin / total bilirubin ratio
  • it is more useful when it is preferably 10% or more, more preferably 20% or more.
  • the present inventors In the conventional method for measuring unbound bilirubin UB by the GOD-POD method, the present inventors normally assume that the unbound bilirubin UB is based on the total bilirubin value when the conjugated bilirubin / total bilirubin ratio of the specimen is in the above range. It is confirmed that it is easy to get out at a higher value than the value to be.
  • bilirubin in a blood sample may be fat-soluble, or may be changed to a water-soluble structural isomer (cyclobilirubin) by light.
  • the blood sample (a1) is subjected to a decomposition step (i).
  • conjugated bilirubin D-Bil and unbound bilirubin UB in the blood sample (a1) are oxidatively decomposed.
  • the decomposition reaction that occurs in the step involves converting at least unbound bilirubin UB into a substance that does not have a binding property to the fluorescent polypeptide used in step (iii) described below, and the albumin Alb-bound bilirubin in the fluorescent poly There is no particular limitation as long as the binding property with the peptide is not changed.
  • Oxidative decomposition may proceed by transferring hydrogen of bilirubin to peroxide, which is a hydrogen acceptor, using an oxidoreductase.
  • peroxidase is used as the oxidoreductase
  • hydrogen peroxide is used as the peroxide.
  • Hydrogen peroxide can be generated in the reaction system of the decomposition step (i). More preferably, as shown in FIG. 1, hydrogen peroxide is generated with gluconate from glucose, water and oxygen in the presence of GOD (glucose oxidase). By causing peroxidase to act on the generated hydrogen peroxide, bilirubin is oxidatively decomposed. In this case, since the degradation rate depends on peroxidase, it is preferable in that the initiation timing and degradation rate of unbound bilirubin UB can be easily controlled by the addition timing and concentration of peroxidase. In this embodiment, hydrogen peroxide is generated in the reaction system of the decomposition step (i). However, in the present invention, hydrogen peroxide is used as a reagent without using glucose and glucose oxidase. Addition from outside the system is also allowed.
  • the conjugated bilirubin D-Bil is oxidatively decomposed together with the unbound bilirubin UB in the blood sample (a1) by the decomposition step (i). Unbound bilirubin UB and conjugated bilirubin D-Bil are converted into colorless unbound bilirubin degradation product iD-BX and colorless conjugated bilirubin degradation product D-BX, respectively, by oxidative degradation.
  • a method capable of stopping the reaction in the decomposition step (i) can be used without any particular limitation.
  • an oxidative decomposition terminator may be added to the reaction system constructing the decomposition step (i).
  • an antioxidant can be used as an oxidative decomposition stopper.
  • the antioxidant include glutathione, N-acetylcysteine, ascorbic acid (vitamin C), ⁇ -tocopherol (vitamin E), butylhydroxyanisole, catechin, quercetin, uric acid, flavonoids and the like.
  • ascorbic acid as shown in FIG. 1 the decomposition reaction can be stopped more easily and effectively due to cost, availability, operability (high water solubility), high decomposition stopping effect, and the like.
  • oxidative degradation terminators include ferrocyanide ion; EDTA iron complex; ferrocyanide and albumin; cationic surfactant and / or amphoteric surfactant; amphoteric surfactant and ferrocyanide; Polyoxyethylene alkyl ethers and ferrocyanide ions; iron complexes and steroid compounds; polyoxyethylene alkyl phenyl ether condensates may be used, and saturated or unsaturated fatty acids having 8 to 24 carbon atoms (specifically, , Octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, eicosatrienoic acid, arachidonic acid, icosanoic acid, eicosatetraenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosane Acid, docosahexaeno
  • the decomposition step (i) when the subject from whom the blood sample is derived has received vitamin C treatment by infusion or the like, it is originally included by treating the blood sample with ascorbate oxidase prior to the decomposition step (i). In addition, an adverse effect on the decomposition process of ascorbic acid is eliminated, and accurate measurement is possible. In this case, the decomposition can be effectively stopped by using an oxidative decomposition stopper other than ascorbic acid.
  • each of the unreacted sample (a1) that has not undergone the degradation step (i) and the sample degradation product (b1) that has undergone the degradation step (i) are specific to unconjugated bilirubin iD-Bil.
  • a polypeptide (fluorescent polypeptide) that exhibits fluorescence properties by binding to is brought into contact.
  • the fluorescent polypeptide UnaG is used.
  • a fluorescent unreacted sample (a2) is obtained from the unreacted sample (a1)
  • a fluorescent sample decomposed product (b2) is obtained from the sample decomposed product (b1).
  • the fluorescent polypeptide used in the contact step (iii) exhibits at least the following two characteristics.
  • the first property is specific binding to unconjugated bilirubin iD-Bil, and binding to conjugated bilirubin D-Bil and its degradation product D-BX, and unbound bilirubin UB degradation product iD-BX. Does not have sex.
  • the second characteristic is that when it specifically binds to a holo body, that is, unconjugated bilirubin iD-Bil, it emits fluorescence of a predetermined wavelength upon irradiation with excitation light, while an apo body, that is, unconjugated bilirubin iD-Bil exists. If not, it does not emit fluorescence even when irradiated with the same excitation light. The intensity of the fluorescence depends on the unconjugated bilirubin iD-Bil concentration.
  • the fluorescent polypeptide UnaG exemplified in the embodiment shown in FIG. 1 has all the above three characteristics. Therefore, in the fluorescence unreacted sample (a2), it binds to unconjugated bilirubin iD-Bil regardless of whether it binds to albumin Alb. That is, it binds to unbound bilirubin UB and albumin Alb-bound bilirubin, and emits fluorescence corresponding to the binding amount. On the other hand, in the fluorescent sample decomposition product (b2), it binds only to albumin Alb-bound bilirubin.
  • the fluorescent polypeptide used in the contacting step (iii) is not particularly limited as long as it satisfies the above three characteristics.
  • Specific examples of the fluorescent polypeptide may be a polypeptide having UnaG as a basic structure, and examples thereof include (A) to (D) below.
  • B A fluorescent polypeptide having an amino acid sequence in which 1 to 21 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the number of amino acids substituted, deleted, inserted, and / or added is preferably 1 or more and 21 or less, and preferably 1 or more and 14 or less in that the above characteristics are preferably satisfied. Is more preferably 1 or more and 7 or less, and particularly preferably 1 or more and 5 or less, or 1 or more and 6 or less.
  • C A fluorescent polypeptide having 85% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and preferably 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% in that the above characteristics are preferably satisfied.
  • the above is particularly preferable.
  • a fluorescent polypeptide having Examples of the stringent conditions include conditions described in a reference [Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989)].
  • 6 ⁇ SSC composition of 1 ⁇ SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhart and 100 mg / mL herring
  • a solution containing sperm DNA at a temperature of 65 ° C. for 8 hours to 16 hours and hybridizing with the probe, and in a solution containing about 0.1 M or lower salt at 65 ° C. after hybridization under the conditions.
  • said polynucleotide has 85% or more sequence identity with respect to the base sequence of the polynucleotide which codes the fluorescent polypeptide as described in said (A), 90% or more of sequence identity More preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the fluorescent polypeptide may be any polypeptide composed of peptide-bonded amino acid residues, but is not limited thereto, and may include a structure other than the polypeptide.
  • structures other than polypeptides include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited. Since it is premised on satisfying the above characteristics, it goes without saying that it has a structure that serves as a binding site for unconjugated bilirubin iD-Bil.
  • Fluorescent polypeptides may be isolated from natural sources or may be obtained artificially. More specifically, the fluorescent polypeptides include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, And translation products produced by recombinant techniques (including mammalian cells).
  • the artificially obtained fluorescent polypeptide may include, for example, those in which an affinity tag is added to the protein structure listed in (A) to (D) above for the purpose of purification or the like.
  • An example of the fluorescent polypeptide is one derived from eel, and more specifically one derived from Japanese eel.
  • the fluorescence property of the fluorescent polypeptide may be that the maximum excitation wavelength is 480 nm to 520 nm, or 490 nm to 510 nm, or 494 nm to 504 nm, and the maximum fluorescence wavelength is 507 nm to 547 nm or 517 nm to 537 nm for green light. Or 522 nm or more and 532 nm or less.
  • the main fluorescence characteristics of UnaG are that the maximum excitation wavelength is 498 nm to 499 nm, the maximum fluorescence wavelength is 525 nm to 530 nm, the molar extinction coefficient is 50,000 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 to 78,000 M ⁇ 1 cm ⁇ 1 , The quantum yield is 50% to 54%, and the fluorescence lifetime is 2.2 nanoseconds.
  • the fluorescent polypeptides specifically mentioned above, in particular UnaG bind immediately upon contact with unconjugated bilirubin iD-Bil and ensure strong fluorescence activity even with small amounts of unconjugated bilirubin iD-Bil. Therefore, even if the amount of the fluorescent unreacted sample (a2) and the fluorescent sample decomposition product (b2) is very small, highly sensitive and accurate measurement is possible. That is, there is no problem even if the amount of the blood sample (a1) prepared at first is very small, and two systems of the fluorescence unreacted sample (a2) and the fluorescent sample decomposition product (b2) are obtained in one measurement. There is no hindrance to the necessity to prepare them in parallel. Such advantages greatly contribute to the usefulness of the newborn jaundice as a routine test.
  • excitation light is irradiated to each of the fluorescent unreacted sample (a2) and the fluorescent sample decomposition product (b2), and the emitted fluorescence having a predetermined wavelength is detected.
  • fluorescence unreacted sample (a2) fluorescence due to the binding of unbound bilirubin UB and fluorescent polypeptide (UnaG) is emitted, and in the fluorescent sample degradation product (b2), the unbound bilirubin degradation product iD-BX is Since it does not bind to the fluorescent polypeptide (UnaG), no fluorescence is emitted from it.
  • Fluorescence intensity emitted from the holobody of the fluorescent polypeptide correlates with the binding amount of the fluorescent polypeptide. Therefore, the amount of unbound bilirubin UB is derived by measuring the fluorescence intensity emitted from the fluorescence unreacted sample (a2) and the fluorescence sample decomposition product (b2) and calculating the difference.
  • the cut-off value serving as a reference for diagnosis can be determined based on the accumulation of cases. In this case, as the cut-off value, different values can be set between the gestational age of less than 30 weeks and 30 weeks or more, and between the birth weight of less than 1500 g and 1500 g or more.
  • the amount of unbound bilirubin is measured based on the above-described measurement principle.
  • the method for measuring the total amount of bilirubin, the method for measuring the conjugated bilirubin, and the other methods for measuring the unbound bilirubin (GOD-POD method) That is, you may combine with the measurement result by at least any one of the method of calculating
  • FIG. 2 shows an example of the protocol of the measurement method of the present invention.
  • various conditions in each step will be described in more detail.
  • serum is prepared as a blood sample (a1).
  • the amount of blood sample prepared first may be 0.5 ⁇ l or more and 25 ⁇ l or less, for example, in the case of serum as in the example of FIG. 2 (in the case of a blood sample that is not serum such as whole blood, in terms of serum). Since the method of the present invention can be measured even when the dilution rate in the contact step (iii) is high, it is possible to measure a trace amount of a blood sample. Therefore, the amount of blood sample (serum converted value) may be as small as less than 1 ⁇ m, for example. On the other hand, in consideration of dilution operability in each step, it is preferable to secure a necessary blood sample amount (serum equivalent value) of, for example, 0.8 ⁇ l or more and 2 ⁇ l or less, particularly 1 ⁇ l.
  • the blood sample (a1) first undergoes initial dilution by being mixed with a buffer solution (Buffer).
  • a buffer solution buffer solution
  • glucose Glucose
  • Buffer buffer solution
  • PBS buffer solution phosphate buffered saline
  • acetate buffer solution Tris buffer solution and the like can be used.
  • the blood sample (a1) is diluted to a serum conversion value (dilution ratio based on the serum amount in the blood sample), for example, 1.5 times or more, or 1.8 times or more (volume basis).
  • a serum conversion value for example, 1.5 times or more, or 1.8 times or more (volume basis).
  • the dilution rate is not less than the above lower limit.
  • the upper limit within the range of the dilution rate is not particularly limited, but the viewpoint of taking into account the change in the equilibrium relationship between bilirubin and albumin as the dilution factor increases, and the degradation by light exposure and / or unknown metabolites in serum From the viewpoint of avoiding the natural consumption of bilirubin by the blood sample, it is preferable that the blood sample (a1) is not too thin.
  • the dilution rate of the blood sample (a1) may be, for example, 55 times or less in terms of serum, 2.5 times or less, or 2.2 times or less (both based on volume). Good.
  • the concentration of glucose in the buffer (Buffer) is appropriately determined in consideration of the above-described dilution rate and an appropriate amount as a glucose oxidase (GOD) substrate in the reaction system of the decomposition step (i).
  • the amount per glucose oxidase 1U is 0.3 mg or more and 1 mg or less, preferably 0.3 mg or more and 0.5 mg or less, for example, 0.312 mg as an example. Can be determined.
  • the concentration of glucose in the buffer solution may be 1 mg / mL or more and 100 mg / mL or less, preferably 1 mg / mL or more and 10 mg / mL or less, for example, 1 mg / mL.
  • a part of the diluted blood sample (blood sample dilution) is used for the A system, and another part is used for the B system.
  • a buffer solution (GOD / POD buffer solution) containing glucose oxidase (GOD) and peroxidase (POD) is added to the blood sample dilution of system B of this embodiment, and the decomposition process is performed by satisfying an appropriate temperature condition.
  • the reaction system (i) is established.
  • the buffer used for the GOD / POD buffer may be appropriately selected from the buffers listed as usable at the first dilution.
  • the blood sample (a1) is further diluted with the GOD / POD buffer.
  • the dilution rate of the blood sample (a1) in the reaction system of the decomposition step (i) may be 120 times or less, preferably 70 times or less, and 52.5 times as an example, in terms of serum. It is preferable that the dilution rate is less than or equal to the above upper limit from the viewpoint of avoiding natural consumption of bilirubin.
  • the lower limit within the range of the dilution rate is not particularly limited, but may be, for example, 5 times in consideration of dilution operability.
  • the amount of GOD and POD in the GOD / POD buffer is appropriately determined in consideration of the above-described dilution rate and an appropriate amount as an enzyme in the reaction system of the decomposition step (i).
  • the amount of GOD is adjusted to be, for example, 0.0128 U or more and 0.256 U or less, preferably 0.05 U or more and 0.2 U or less, and 0.16 U as an example with respect to 1 ⁇ l (serum converted value) of blood sample (a1). Is done.
  • the amount of POD is also adjusted to be, for example, 0.0128 U or more and 0.256 U or less, preferably 0.05 U or more and 0.2 U or less, and 0.16 U as an example with respect to 1 ⁇ l of blood sample (a1) (serum equivalent value).
  • unbound bilirubin can be decomposed at an appropriate rate, that is, a rate that is neither too slow nor too early.
  • the amount of GOD and the amount of POD may be the same amount.
  • the reaction temperature in the decomposition step (i) is, for example, not less than 28 ° C. and not more than 38 ° C., for example, 37 ° C. Since the reaction in the decomposition step (i) is completed quickly, both the blood sample dilution and the GOD / POD buffer solution are adjusted to the above temperature by heating or the like immediately before constructing the reaction system. It is preferable.
  • the reaction in the decomposition step (i) is stopped by adding a buffer containing ascorbic acid.
  • the buffer solution containing ascorbic acid may be appropriately selected from the buffer solutions listed as usable at the time of the first dilution.
  • a buffer solution containing ascorbic acid is similarly added to both the A line and the B line. The Since the A system does not receive the above degradation reaction (i), the configuration of bilirubin in the sample is not different from the original blood sample (a1) (see FIG. 1).
  • the timing at which the decomposition stop step (ii) is performed is desirably the timing at which the decomposition of the unbound bilirubin UB that has already been released in the blood sample (a1) before the start of the reaction in the decomposition step (i) is completed.
  • the time to be secured from the start of the reaction in the decomposition step (i) to the decomposition stop step (ii) may be selected in consideration of the dilution rate of the blood sample in the reaction system in the decomposition step (i).
  • the time is assumed to be a system in which the degree of decrease in the total amount of bilirubin and the degree of decrease in the amount of unconjugated bilirubin can be equated with a normal amount of conjugated bilirubin D-Bil
  • This may correspond to the time taken for the total bilirubin amount to decrease by about 20% (specifically, 18% or more and 25% or less) from its initial concentration.
  • the total bilirubin concentration decreases by about 5% before the reaction system in the decomposition step (i) becomes uniform due to complete mixing, specifically, when the initial concentration of total bilirubin is 100%, It may be equivalent to the time taken to decrease from% to 76%.
  • the range of the timing to stop the decomposition is not less than the above lower limit value in terms of reliably decomposing unbound bilirubin to be decomposed, and that it is not more than the above upper limit value has good reproducibility of measured values. This is preferable.
  • the reaction temperature in the decomposition stopping step (ii) may be 20 ° C. or more and 38 ° C. or less, for example, 37 ° C.
  • Ascorbic acid can be stopped if the amount is 0.0015 mg or more per 1 POD of POD used in the decomposition step (i). It may be used in a larger amount for the purpose of quickly and reliably stopping the decomposition. For example, it is used in an amount of 0.015 mg to 120 mg, preferably 1.5 mg to 50 mg, preferably 1.73 mg per POD 1U. Also good.
  • the ascorbic acid concentration and the addition amount of the buffer containing ascorbic acid are such that the final concentration of ascorbic acid after being added to the reaction solution in the decomposition step (i) is, for example, 0.1 wt% or more 32 It can be determined to be not more than wt%, preferably not less than 0.2 wt% and not more than 10 wt%, for example 0.35 wt%.
  • the dilution rate of the blood sample may be 5 to 120 times, preferably 10 to 100 times, preferably 80 times as a serum conversion value.
  • the final concentration of ascorbic acid is not less than the above lower limit value in terms of reliably stopping the decomposition of unbound bilirubin UB, and that the ascorbic acid concentration is not more than the above upper limit value means that the pH is too acidic.
  • the subsequent contact step (iii) it is preferable in the subsequent contact step (iii) that it is easy to restore the neutrality without adversely affecting the binding properties with the fluorescent polypeptide.
  • the dilution rate of a blood sample is below the said upper limit.
  • a buffer solution containing the fluorescent polypeptide UnaG is added to both the unreacted sample of line A (a1) and the decomposed product of line B (b1).
  • the buffer containing the fluorescent polypeptide UnaG may be appropriately selected from the buffers listed as usable at the first dilution.
  • the contacting step (iii) is performed under conditions that do not substantially adversely affect the specific binding property of the fluorescent polypeptide UnaG.
  • the temperature condition may be 4 ° C. or more and 65 ° C. or less, preferably 20 ° C. or more and 37 ° C. or less
  • the pH is approximately neutral, for example, 6.5 or more and 8.0 or less, preferably 7 It may be from 0.0 to 7.5, especially 7.4.
  • the final concentration of ascorbic acid in the contacting step (iii) may be, for example, 0.01% by weight or more and 0.8% by weight or less.
  • the final concentration of ascorbic acid may be 0.5 wt% or less, more preferably 0.25 wt% or less, more preferably 0.2 wt% or less, and even more preferably 0.05 wt% or less.
  • the final concentration of ascorbic acid is not more than the above upper limit value in that no substantial adverse effect is caused on the specific binding property of the fluorescent polypeptide UnaG.
  • the reaction time may be 20 seconds or more and 35 seconds or less, preferably 25 or more and 30 seconds or less.
  • the blood sample is diluted to such an extent that the internal blocking effect in the fluorescence detection step (iv) can be ignored.
  • the dilution rate of the blood sample may be 200 times or more and 3200 times or less, preferably 400 times or more and 1600 times or less, and 800 times as an example, in terms of serum.
  • the concentration and addition amount of the buffer containing the fluorescent polypeptide UnaG can be determined in consideration of the dilution rate of the blood sample and the pH described above.
  • the concentration of the buffer containing the fluorescent polypeptide UnaG is such that the final concentration of UnaG after addition is 0.5 ⁇ M or more and 4 ⁇ M or less, preferably 1.0 ⁇ M or more and 3 ⁇ M or less. It can be prepared to be 2 ⁇ M.
  • excitation light corresponding to the fluorescence characteristics of the fluorescent polypeptide is irradiated to each of the fluorescence non-reacted sample (a2) of system A and the fluorescent sample decomposition product (b2) of system B. Then, the fluorescence intensity at a predetermined wavelength is measured.
  • the excitation wavelength may be 480 nm to 520 nm, or 490 nm to 510 nm, or 494 nm to 504 nm.
  • the detection wavelength may be 507 nm to 547 nm of green light, 517 nm to 537 nm, or 522 nm to 532 nm.
  • the excitation wavelength may be from 498 nm to 499 nm and the detection wavelength may be from 525 nm to 530 nm.
  • Fluorescence detection means is not particularly limited, and for example, a UV transilluminator, an LED transilluminator, a fluorescence microscope, a fluorescence detector, and a flow cytometry can be used.
  • the difference in fluorescence intensity detected from each of the fluorescence unreacted sample of line A (a2) and the fluorescent sample decomposition product (b2) of line B is calculated, and the concentration of unbound bilirubin UB is calculated. calculate.
  • the difference in fluorescence intensity can be derived as an absolute amount of unbound bilirubin UB, for example, by collating with a calibration curve created in advance based on a known concentration sample.
  • the difference in fluorescence intensity may be appropriately calibrated.
  • whole blood can be used for measurement as a blood sample (a1) without serologic treatment.
  • the difference in fluorescence intensity is calibrated by taking into account the hematocrit value, and the correct amplification is performed.
  • Bound bilirubin UB can be derived.
  • FIG. 3 the block diagram of an example of the sample preparation apparatus for unbound bilirubin measurement of this invention and the unbound bilirubin measurement apparatus of this invention is shown.
  • the sample preparation device for unbound bilirubin measurement includes an incubator, a reagent solution addition unit, a reagent blank solution addition unit, a timer, a stop agent addition unit, and a mixing unit.
  • disassembly stop process (ii) of said measuring method of unbound bilirubin can be automated.
  • the incubator includes a reaction container container and a control container container.
  • a reaction container is housed in the reaction container housing section, a control container is housed in the control container housing section, and their contents are maintained at a predetermined temperature by an incubator.
  • the contents initially added to the reaction container and the control container are dilutions of the blood sample and have the same composition.
  • the blood sample dilution added to the reaction container is the A line shown in FIG. 2, and the blood sample dilution added to the control container is the B line shown in FIG.
  • the dilution of the blood sample added to the reaction container and the control container may be, for example, a blood sample mixed with a glucose-containing buffer. Specifically, after the blood sample and the glucose-containing buffer are mixed, a part of the obtained mixture can be dividedly added to the reaction container and the other part to the control container. This mixing and divided addition step can be performed manually.
  • the sample preparation apparatus for measuring unbound bilirubin according to the present invention does not exclude that it is configured to automate the mixing and divided addition steps.
  • the reaction container storage section and the control container storage section are shielded from light.
  • the reagent solution addition unit adds a predetermined amount of the unbound bilirubin oxidative decomposition reagent solution to the reaction vessel in the reaction vessel storage unit. Thereby, the decomposition
  • the unbound bilirubin oxidative degradation reagent solution is a buffer solution containing, for example, GOD and POD.
  • the unbound bilirubin oxidative degradation reagent solution may be prepared in a state maintained at a predetermined temperature in the incubator.
  • the reagent blank solution addition unit adds a predetermined amount of the reagent blank solution to the control container in the control container storage unit. Therefore, the unbound bilirubin decomposition step (i) is not performed in the control container. Then, the contents of the control container are mixed by the mixing unit.
  • the reagent blank solution is, for example, a buffer solution having a composition in which GOD and POD are excluded from the above-described buffer solution containing GOD and POD.
  • the reagent blank solution may be prepared in a state maintained at a predetermined temperature in the incubator.
  • the timer is controlled to start based on the operation of the reagent solution addition unit and the reagent blank solution addition unit. Thereby, the time of decomposition
  • the stop agent addition unit is controlled based on the measurement time of the timer. Specifically, the timer takes a predetermined time (preferably 30 minutes) from the start of the reaction in the decomposition step (i) until the decomposition of the unbound bilirubin already released in the blood sample is completed. Second), the reaction vessel and the control vessel are controlled to perform an operation of adding a predetermined amount of the oxidative decomposition terminator. Even after the addition of the oxidative decomposition terminator, the contents of the reaction container and the control container are mixed by the mixing section. Thereby, the oxidative degradation reaction of unbound bilirubin is stopped at an accurate timing.
  • the oxidative degradation terminator may be used in a state dissolved in a buffer solution, and may be prepared in a state maintained at a predetermined temperature in an incubator.
  • the unbound bilirubin measuring device of the present invention includes the above-described sample preparation device for measuring unbound bilirubin, and further includes a fluorescence measuring unit, an arithmetic processing unit, and an output unit. . In the case of this embodiment, a fractionation part and an addition part are also included.
  • the fluorescence measurement unit includes a measurement container housing unit, and is composed of a known spectroscopic optical system. It is preferable that the measurement container accommodated in the measurement container accommodating portion is capable of efficiently performing fluorescence observation on a plurality of samples like a multi-well. In the present embodiment, a multi-well is exemplified as a measurement container.
  • sample decomposition product (b1) see FIGS. 1 and 2)
  • control container contents unreacted sample (a1), see FIGS. 1 and 2)
  • This operation may be performed manually, but may be automatically performed by the sorting unit as in the present embodiment.
  • movement of this fractionation part may be automatically controlled based on operation
  • the fluorescence measurement unit performs blank measurement at the time when a part of the contents of the reaction container and the control container is added to each well (and before addition of a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics described later). You can go.
  • the blank measurement may be performed by a manual command, or in the present embodiment including the sorting unit, may be automatically performed by automatic control of the fluorescence measuring unit based on the end of operation of the sorting unit.
  • a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics is added to the contents of each well.
  • the contact step (iii) is performed, and the fluorescent unreacted sample (a2) is obtained from the well containing the unreacted sample (a1) and the fluorescent sample is decomposed from the well containing the sample decomposition product (b1).
  • the product (b2) is obtained as a measurement sample for fluorescence (see FIGS. 1 and 2).
  • the operation of adding a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics may be performed manually, or may be performed by an adding unit as in this embodiment. Further, the operation of the adding unit may be automatically controlled based on, for example, the end of the blank measurement described above, or may be operated by a manual command.
  • the polypeptide which shows a fluorescence characteristic is used in the aspect of the buffer solution containing the polypeptide which has UnaG as a basic structure, for example.
  • the buffer containing the polypeptide may be prepared in a state maintained at a predetermined temperature in an incubator.
  • the fluorescence measurement unit performs fluorescence detection on each of the fluorescence measurement samples, that is, the fluorescence unreacted sample (a2) and the fluorescent sample decomposition product (b2). Thereby, the detection step (iv) is performed.
  • This operation may be performed by a manual command or may be performed by automatic control of the fluorescence measurement unit based on the operation of the addition unit in the present embodiment including the addition unit.
  • the timer is controlled so that the timer is started from the time when the polypeptide exhibiting fluorescence characteristics is added by the addition unit, and based on the measurement time of the timer.
  • the fluorescence measurement unit may be controlled to operate. For example, when a timer counts a predetermined time (preferably not less than 10 minutes and not more than 15 minutes) when a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics shows maximum fluorescence intensity, control is performed so that the fluorescence measurement unit operates and measures fluorescence. May be.
  • the fluorescence measurement unit is continuously operated to measure the fluorescence. You may continue.
  • the arithmetic processing unit derives an unbound bilirubin value from at least the difference between the fluorescence value of the contents of the reaction container and the fluorescence value of the contents of the control container.
  • the fluorescence measurement unit continues to measure the fluorescence while counting a predetermined time (preferably 10 minutes or more and 15 minutes or less) in which the polypeptide exhibiting the fluorescence characteristic exhibits the maximum fluorescence intensity, the calculation is performed.
  • the processing unit can derive an unbound bilirubin value after performing a process of determining the maximum fluorescence intensity from each acquired fluorescence intensity.
  • the arithmetic processing unit obtains each of the obtained samples.
  • the unbound bilirubin value can be derived after performing a process of calculating a representative value (for example, an average value, a median value, etc.) from the fluorescence intensity of the.
  • the arithmetic processing unit may perform correction using the hematocrit value.
  • the output unit displays the derived unbound bilirubin value.
  • the unbound bilirubin measurement kit of the present invention is a kit for carrying out the above-described method for measuring unbound bilirubin.
  • the kit for measuring unbound bilirubin of the present invention includes, as items, an oxidoreductase for oxidative degradation of unbound bilirubin, an oxidative degradation terminator for stopping oxidative degradation, and fluorescence by specific binding to unconjugated bilirubin. At least a polypeptide exhibiting properties.
  • the oxidoreductase is preferably peroxidase.
  • the form of the oxidoreductase is preferably a lyophilized product from the viewpoint of storage stability and the like, but may be a liquid form in which a buffer solution described below is dissolved as a solvent.
  • the oxidative degradation terminator can be appropriately selected from the substances exemplified in the above-mentioned unbound bilirubin measurement and included.
  • the oxidative degradation terminator may be in the form of a powder agent or may be in the form of a solution in which the aforementioned buffer solution is dissolved as a solvent.
  • the oxidative degradation terminator is preferably an antioxidant, and more preferably ascorbic acid. In particular, when it is ascorbic acid, it is preferably in the form of a powder from the viewpoint of storage stability.
  • Polypeptides exhibiting fluorescence characteristics can be appropriately selected from the substances exemplified in the above-mentioned unbound bilirubin measurement and included.
  • the polypeptide exhibiting fluorescence characteristics is preferably a lyophilized product from the viewpoint of storage stability.
  • the unbound bilirubin measurement kit can further contain glucose and glucose oxidase.
  • Glucose may be in the form of a powder, or may be in the form of a solution dissolved in the aforementioned buffer solution from the viewpoint of convenience and / or accuracy during measurement.
  • Glucose oxidase is preferably a freeze-dried product from the viewpoint of storage stability and the like, but it may be in the form of a solution prepared by dissolving the above buffer solution as a solvent.
  • the unbound bilirubin measurement kit can contain unbound bilirubin as a standard substance as a further item.
  • the standard substance may be in the form of a powder or in the form of a solution dissolved in the above-mentioned buffer.
  • Each item may be appropriately light-shielded and packaged, and an amount suitable for one use may be packaged, and a plurality of item sets may be included.
  • the unbound bilirubin measurement kit includes a buffer solution (PBS) as a solvent or diluent for at least one of an oxidoreductase, an oxidative degradation terminator, a polypeptide exhibiting fluorescence characteristics, glucose, glucose oxidase and a standard substance.
  • PBS buffer solution
  • Buffers phosphate buffered saline
  • acetate buffers Tris buffers, etc.
  • the unbound bilirubin measurement kit may further include information on a protocol indicating the above-described unbound bilirubin measurement method.
  • the information may be a printed matter on which a protocol is posted, or a printed matter on which information on a browsing or obtaining location on the web is posted so that the protocol can be browsed or obtained on the Internet or the like.
  • the unbound bilirubin measurement kit is a dedicated kit for the above-mentioned unbound bilirubin measurement device
  • a dedicated measurement container for example, a multi-well
  • Neonatal serum is a surplus sample that occurred in blood tests conducted for the purpose of jaundice evaluation in newborns admitted to the neonatal specific intensive care unit of Kobe University Hospital.
  • the use of surplus specimens for basic research was obtained with the consent of the child's surrogate.
  • UnaG and UnaG-HisFLAG a fluorescent polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 provided by the RIKEN Brain Science Institute was used.
  • the GOD-POD enzyme solution contains 3.2 units of glucose oxidase as a dry frozen product and 3.2 units of peroxidase as a lyophilized product, 0.0068 mg of potassium dihydrogen phosphate and disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 0 .720 mg and a solution dissolved in purified water to 25 ⁇ L were used.
  • a phosphate buffer pH 7.4 was used as the buffer used for the solvent, the diluent, and the enzyme diluent.
  • a UB analyzer (a dedicated measuring instrument Ubi analyzer manufactured by Arrows Co., Ltd.) was used.
  • Total bilirubin T-bil and conjugated bilirubin D-bil were measured by Iatro Q T-BILII and Iatro Q D-BBIL (A) (both manufactured by LSI Rulece Co., Ltd.) using an enzymatic method, respectively.
  • the type bilirubin iD-bil was derived by calculating the difference between them.
  • the fluorescence intensity of the mixed solution reached its maximum when 10 minutes had elapsed after mixing. Therefore, at the elapse of 10 minutes after mixing, the fluorescence intensity at a fluorescence wavelength of 527 nm relative to the excitation wavelength of 498 nm was measured using a microplate reader.
  • a calibration curve was prepared by plotting fluorescence intensity against unconjugated bilirubin (iD-Bil) concentration. The obtained calibration curve is shown in FIG.
  • specimens using UnaG 72 specimens
  • specimens using UnaG-HisFLAG 68 specimens
  • R 0.956, p ⁇ 0.001).
  • UnaG method using UnaG or UnaG-HisFLAG was verified for another 5 types of serum samples collected during the same day.
  • the results are shown in Table 7 below. As shown in Table 7, it was confirmed that almost the same unconjugated bilirubin concentration was derived when either UnaG or UnaG-HisFLAG was used.
  • Table 8 shows the mean value and standard for the total bilirubin concentration, the conjugated bilirubin concentration obtained by the enzyme method (BOD (bilirubin oxidase) method), and the difference (Difference). The deviation (SD) is also shown.
  • the specimen can be applied to the present invention regardless of the level of conjugated bilirubin, the variation of fluorescent protein, the presence or absence of the subject's phototherapy history, and the elapsed time after serum preparation.
  • the Hb concentration was measured using XN-series 9000 (manufactured by Sysmex Corporation) by the SLS-hemoglobin method (Hb 13.4). 6). Using Buffer, dilution series of Hb 5 g / dL, Hb 2.5 g / dL, Hb 1 g / dL, and Hb 0.5 g / dL were prepared.
  • a bilirubin standard solution (unbound bilirubin reference material, Arrows) was prepared. The measured value of this bilirubin standard solution with a UB analyzer was TB17.1 mg / dL. 2. The bilirubin standard solution was serially diluted with Buffer to prepare dilution series having bilirubin concentrations of 1.71 ng / ⁇ L, 0.855 ng / ⁇ L, and 0.4275 ng / ⁇ L. Further, only the buffer was prepared as a control. 3. A 400 pmol / 150 ⁇ L solution of UnaG-His FLAG was prepared using Buffer. 4).
  • a bilirubin standard solution (unbound bilirubin reference material, Arrows) was prepared. The measured value of this bilirubin standard solution with a UB analyzer was TB17.1 mg / dL. 2. The bilirubin standard solution was serially diluted with Buffer to prepare dilution series having bilirubin concentrations of 1.71 ng / ⁇ L, 0.855 ng / ⁇ L, and 0.4275 ng / ⁇ L. Further, only the buffer was prepared as a control. 3. A 400 pmol / 150 ⁇ L solution of UnaG was prepared using Buffer. 4).
  • Ascorbic acid 1000 mg was dissolved in 10 mL of Buffer to prepare a 100 mg / mL ascorbic acid solution.
  • 10 mg / mL, 1 mg / mL, and 0.1 mg / mL ascorbic acid solutions were also prepared using Buffer. This created ascorbic acid dilution series of 100 mg / mL (10%), 10 mg / mL (1%), 1 mg / mL (0.1%) and 0.1 mg / mL (0.01%).
  • the present invention is applicable even if the specimen is whole blood.
  • the unbound bilirubin concentration was measured using a UB analyzer, and the correlation with the total bilirubin concentration was examined.
  • the result is shown in FIG.
  • the conjugated bilirubin concentration / total bilirubin concentration ratio is less than 5% and 5% or more and less than 10%
  • the relationship between TB and UB is roughly correlated.
  • the ratio is 10% or more and less than 20%
  • the correlation is greatly collapsed.
  • the ratio is 20% or more, the correlation is further deteriorated.
  • Example 1 Measurement of unbound bilirubin by GOD-POD-UnaG method
  • unbound bilirubin was measured by the method of the present invention using neonatal serum.
  • a bilirubin standard solution (unbound bilirubin reference material, Arrows) was prepared. The measured value of this bilirubin standard solution with a UB analyzer was TB 17.8 mg / dL. 2. The bilirubin standard solution was serially diluted with Buffer to prepare dilution series having bilirubin concentrations of 17.8 ng / ⁇ L, 8.9 ng / ⁇ L, and 4.45 ng / ⁇ L. Moreover, only Buffer was prepared as a control. 3. A 400 pmol / 195 ⁇ L solution of UnaG-His FLAG was prepared using Buffer.
  • the fluorescence intensity was measured three times for each specimen up to 15 minutes after the start of injection, and the median value of the maximum fluorescence intensity was adopted (see Table 19). 6). Using the calibration curve, iD-bil of the 0 second time point sample and the 30 second time point sample was calculated from the maximum fluorescence intensity (see Table 19).
  • the unbound bilirubin value ([U-bil]) by the GOD-POD-UnaG method was determined from the above formula (I).
  • the unbound bilirubin value of each serum was 0.51 in the case of serum 172, 0.75 in the case of serum 211, and 0.32 in the case of serum 215.
  • Example 2 Measurement of unbound bilirubin by GOD-POD-UnaG method
  • unbound bilirubin was measured by the method of the present invention using neonatal serum.
  • a bilirubin standard solution (unbound bilirubin reference material, Arrows) was prepared. The measured value of this bilirubin standard solution with a UB analyzer was TB17.7 mg / dL. 2. The bilirubin standard solution was serially diluted with Buffer to prepare dilution series having bilirubin concentrations of 4.435 ng / ⁇ L, 2.2175 ng / ⁇ L, and 1.10875 ng / ⁇ L. Moreover, only Buffer was prepared as a control. 3. A 132.4 pmol / ⁇ L solution of UnaG-His FLAG was prepared using Buffer. 4).
  • a standard solution-Glucose mixed solution was prepared by adding 20 ⁇ L of bilirubin standard solution (iD-bil 17.7 mg / dL) to 1000 ⁇ L of Buffer containing 1.1 mg / mL Glucose. 2. 25 ⁇ L of Buffer was added to the standard solution-Glucose mixed solution, and 555 ⁇ L of Buffer containing 1% ascorbic acid was further added. As a result, a total of 1600 ⁇ L of 80-fold diluted sample was obtained. 3.
  • the TB values of the serum, the buffer, the sample before mixing with ascorbic acid, and the sample after mixing with ascorbic acid were measured with a UB analyzer and recorded.
  • the stock solution GOD-POD was 12.5 ⁇ l per 10 ⁇ l of serum, and GOD-POD 3.2 U was obtained per 1600 ⁇ L of the 20-second sample, and the final concentration of ascorbic acid after adding ascorbic acid-containing buffer was 0.35%.
  • Table 25 The measured values recorded are shown in Table 25 below.
  • the conversion value is a value calculated by multiplying 1600/1045 based on the change in capacity (the same applies to the following tables).
  • K ⁇ TB / 0.71 was calculated as 1. In the GOD-POD-UnaG method, iDB value and TB value were used.
  • Serum 179 The TB value and UB value of serum 179 are shown in Table 28 below.
  • Serum 181 The TB value and UB value of serum 181 are shown in Table 31 below.
  • Serum 185 The TB value and UB value of serum 185 are shown in Table 34 below.
  • Serum 180 The TB value and UB value of serum 180 are shown in Table 37 below.
  • FIG. 15 shows the correlation between the UB analyzer UB value (UB ⁇ ⁇ ⁇ analyzer ⁇ UB) and the UB value based on the TB value (UB analyzer-0-20s) according to the conventional measurement method. As shown in FIG. 15, both showed a good correlation. Therefore, it was shown that the UB value can be calculated based on the transition of the TB value ( ⁇ TB between the 0 second value and the 20 second value) measured using the UB analyzer after mixing the GOD-POD solution.
  • Table 41 shows the UB analyzer UB value according to the conventional measurement method (GOD-POD method) and the UB value ( ⁇ TB / 4.51) based on the converted value after ascorbic acid mixing.
  • FIG. 16 shows the correlation between the UB value (UB ⁇ analyzer UB) of the UB analyzer by the conventional measurement method and the UB value (UB analyzer-0-20s) based on the converted value after ascorbic acid mixing.
  • both showed a good correlation. Therefore, after stopping the reaction with ascorbic acid, it was shown that the UB value can be calculated from ⁇ TB of the 0 second value and the 20 second value using a UB analyzer.
  • Table 42 shows the UB value of the UB analyzer according to the conventional measurement method (GOD-POD method) and the UB value ( ⁇ TB / 5.49) based on the iDB value of the GOD-POD-UnaG method.
  • FIG. 18 shows the correlation between the UB value (UBUanalyzer UB) of the UB analyzer by the conventional measurement method and the UB value (GOD-POD-UnaG-UB) based on the iDB value of the GOD-POD-UnaG method.
  • UBUanalyzer UB UBUanalyzer UB
  • GOD-POD-UnaG-UB UB value
  • Example 3 Measurement of unbound bilirubin by GOD-POD-UnaG method (DB low value example)] (Sample) Forty-five sera collected from 33 newborns with low DB values (DB ⁇ 1.0 mg / dL) were verified. Table 43 shows the case background of 33 cases, and Table 44 shows the values of unconjugated bilirubin based on the serum sampling age and the enzymatic method of 45 samples.
  • Example 4 Measurement of unbound bilirubin by GOD-POD-UnaG method (DB high value example)] (Sample) Eleven sera samples with high DB values (DB ⁇ 1.0 mg / dL) collected from 4 newborns were verified.
  • FIG. 21 shows the relationship between the iDB / Alb molar ratio and the UB value of the UB analyzer according to the conventional measurement method
  • FIG. 22 shows the iDB / Alb molar ratio and the UB value according to the GOD-POD-UnaG method of the present invention. Shows the relationship.
  • samples having an iDB / Alb molar ratio of 0.6 or less, specifically, 40 samples with low DB values ( ⁇ plotted with dots) and 11 samples with high DB values ( ⁇ dots). Plots)) are shown.

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Abstract

抱合型ビリルビン量が高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビンを正確に反映することができる測定方法を提供する。本発明のアンバウンドビリルビンUBの測定方法は、分解工程(i)、分解停止工程(ii)、接触工程(iii)及び検出工程(iv)を含む。分解工程(i)では、非抱合型ビリルビンiD-Bil及び抱合型ビリルビンD-Bilを含む血液試料を、iD-BilのうちのUB及びD-Bilの酸化分解反応に供する。分解停止工程(ii)では、酸化分解反応を停止して試料分解物を得る。接触工程(iii)では、試料分解物を、iD-Bilに特異的結合するUnaGに接触させる。別途、血液試料が分解工程(i)に供されなかった未反応試料も、UnaGに接触させる。検出工程(iv)では、試料分解物及び未反応試料各々から、UnaGの蛍光を検出し、その差分からUBの量を導出する。

Description

血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法
　本発明は、血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法に関する。特に本発明は、新生児の黄疸管理を適切に行うため、新生児由来血液試料中のアンバウンドビリルビンを正確に測定する方法に関する。中でも本発明は、早産児の核黄疸を確実に予見するため、早産児由来血液試料中のアンバウンドビリルビンを正確に測定する方法に関する。
　従来、核黄疸は新生児脳障害の原因の１つであったが、周産期医療の進歩によって早期発見早期治療がなされ、正期産児（成熟児）ではほぼ予防可能となった。しかし、近年、超早産児の生存例の増加等に伴って早産児に核黄疸症例が発生している現状が明らかになり、小児新生児医療領域において、緊急に解決すべき大きな課題となっている。
　核黄疸の原因が、新生児期の黄疸、すなわち血清ビリルビンにあることは良く知られている。血清ビリルビン、いわゆる総ビリルビン（TB）は、それ自体が黄色色素であり、非抱合型ビリルビン（間接ビリルビン；iDB）および抱合型ビリルビン（直接ビリルビン；DB）を含む。神経毒性を有する成分は非抱合型ビリルビンであるが、その中でも、アルブミン非結合型のアンバウンドビリルビン（UB）は、低分子量であることから容易に血液脳関門を通過し脳に沈着するため、神経毒性を発揮する重大要因となる。
　アンバウンドビリルビンの測定技術の開発は１９６０年代から試みられてきた中で、本発明者は、グルコースオキシダーゼ－ペルオキシダーゼ（ＧＯＤ－ＰＯＤ）法を報告した（非特許文献１：Clin Chim Acta. 1977 Sep 1; 79(2): 411-7参照）。さらに、ＧＯＤ－ＰＯＤ法を適用した自動測定装置（（株）アローズ製UB-Analyzer）を開発した（非特許文献２：Kobe J Med Sci. 1982 Apr; 28(2): 91-104参照）。この自動測定装置は、アンバウンドビリルビン測定装置として臨床応用されている唯一の装置であり、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）および日本国厚生労働省に認可されている。
　ＧＯＤ－ＰＯＤ法では、グルコースとグルコースオキシダーゼとにより発生させた過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させ、ビリルビン酸化分解を起こさせる。アルブミン非結合型のアンバウンドビリルビンが無色成分へ容易に酸化分解される一方、アルブミン結合型ビリルビンが酸化分解されにくいため、アンバウンドビリルビンの濃度はその酸化分解の初速度から計測される。具体的には、比色法によりビリルビン色素の減少速度をモニタリングすることで計測される。
　神戸大学医学部小児科から発表された黄疸治療基準では、血清総ビリルビン濃度とアンバウンドビリルビン濃度との両方について、光線療法および交換輸血の適応基準が示されている（非特許文献３：神戸大学医学部小児科，編，未熟児新生児の管理．東京、日本小児医事出版社，1991参照）。この基準の普及により、成熟児の核黄疸は大きく減少した。しかし、この基準を早産児にあてはめることについて過剰治療の指摘もあり、現状として、遵守率は下がっている。
　また、黄疸治療基準の他の例として、血清総ビリルビン濃度のみに基づいて光線療法および交換輸血の適応基準が示されているものもある（非特許文献４：川瀬康浩.新生児高ビリルビン血症.山口徹、北原光夫、福井次矢　総編集、今日の治療指針2006年版、医学書院、東京、2006 pp 941-942）。
　一方、ニホンウナギの筋肉において緑色蛍光を示すタンパク質をコードする遺伝子が単離された。その遺伝子産物ＵｎａＧは非抱合型ビリルビンと特異的に結合することで強い緑色蛍光を発し、結合したビリルビン自体が蛍光性発色団として働くことが発見された（非特許文献５：Cell. 2013 Jun 20; 153(7): 1602-11および特許文献１：国際公開第２０１４／１３３１５８号参照）。
国際公開第２０１４／１３３１５８号
Clinica Chimica Acta, 1977 Sep 1; 79(2): 411-7. Kobe Journal of Medical Sciences, 1982 Apr; 28(2): 91-104. 神戸大学医学部小児科，編，未熟児新生児の管理．東京、日本小児医事出版社，1991 川瀬康浩.新生児高ビリルビン血症.山口徹、北原光夫、福井次矢　総編集、今日の治療指針2006年版、医学書院、東京、2006 pp 941-942 Cell. 2013 Jun 20; 153(7): 1602-11.
　本発明者らによって行われた早産児の核黄疸の発生頻度に関する全国調査によると、核黄疸の年間発生数は、在胎３０週未満の早産児で８～９人/年と推察されるところ、実際には在胎３０週以上３７週未満の早産児にも発症しうることを考慮すると、さらに多い可能性が十分ある。
　また、通常では血中のアンバウンドビリルビン量は総ビリルビン量に相関するが、新生児のうち特に早産児においては、そのような相関を示さない場合がある。本発明者らによる調査では、３０週未満の早産児では、総ビリルビンが１５未満の低値であるにも関わらずアンバウンドビリルビンが０．８以上の高値を示す例が３９％もみられ、低ＴＢ核黄疸児８例中７例も占めていたことが判っている。総ビリルビンに比してアンバウンドビリルビンが相対的に高い症例が少なからず存在することを示したこの結果は、黄疸管理を総ビリルビンのみで管理することが、核黄疸発生の危険状態を見逃すことを警告している。
　アンバウンドビリルビンによる黄疸管理の重要性の再認識により、アンバウンドビリルビンの正確な測定系が必要となる。しかしながら、唯一の自動測定装置UB-Analyzerでさえも、検体中の抱合型ビリルビンが高い場合には正確な測定ができない問題がある。ＧＯＤ－ＰＯＤ法では、抱合型ビリルビンが高い場合に、アンバウンドビリルビンとともに抱合型ビリルビンも酸化分解されることで、アンバウンドビリルビン測定値が真のアンバウンドビリルビン量からかけ離れた、見かけ上パニック値を示すことがある。このような測定値に直面した場合の臨床的判断の困難性は非常に大きい。新生児、特に早産児では、この抱合型ビリルビンが高い症例が多いため問題は大きい。
　国際公開第２０１４／１３３１５８号（特許文献１）に記載されたポリペプチドＵｎａＧが非抱合型ビリルビンに特異的に結合することから、本発明者らは、このポリペプチドをＧＯＤ－ＰＯＤ測定系に適用することを着想した。しかしながら、このポリペプチドはアルブミン結合ビリルビンと接触した瞬間にアルブミンの結合を解いてビリルビンに結合するため、アンバウンドビリルビンとアルブミン結合ビリルビンとの区別が無くなる。そのため、アンバウンドビリルビンの酸化分解の初速度からその濃度を導出するＧＯＤ－ＰＯＤ測定系へ単純に適用することができない。
　以上に鑑み、本発明の目的は、抱合型ビリルビン量が高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビンを正確に反映することができる測定方法を提供することにある。
　本発明者らは、ＧＯＤ－ＰＯＤ測定系において、アンバウンドビリルビンの濃度測定に必須であったアンバウンドビリルビン酸化分解の初速度測定の手法を敢えて捨象し、代わりに当該酸化分解を停止させる手法を採用した。そして、酸化分解反応前後におけるＵｎａＧ結合量の差分をアンバウンドビリルビンの量として導出することで、ＵｎａＧを、従来のように検出対象成分のみを標識する形態で使用するのではなく、検出対象成分のみを変化させ標識されない形態で使用することで、ＧＯＤ－ＰＯＤ測定系への適用を可能にした。本発明は、以下の発明を包含する。
（１）
　本発明のアンバウンドビリルビンの測定方法は、分解工程（i）と、分解停止工程（ii）と、接触工程（iii）と、検出工程（iv）とを含む。
　分解工程（i）では、非抱合型ビリルビンおよび抱合型ビリルビンを含む血液試料を、非抱合型ビリルビンのうちのアンバウンドビリルビン、および抱合型ビリルビンの酸化分解反応に供する。
　分解停止工程（ii）では、酸化分解反応を停止して試料分解物を得る。
　接触工程（iii）では、試料分解物を、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる。別途、血液試料が分解工程（i）に供されなかった未反応試料も、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる。
　検出工程（iv）では、試料分解物と未反応試料とのそれぞれについて、ポリペプチドに起因する蛍光を検出する。さらに、試料分解物における蛍光と未反応試料における蛍光との差から、アンバウンドビリルビンの量を導出する。
　上記の構成では、血液試料が、分解工程（i）を経た系統と、分解工程（i）を経ない系統とに分けられ、前者のみで、アンバウンドビリルビンが、ポリペプチドへの特異的結合能を持たない成分へ分解される。これにより、血液試料中に含まれていた非抱合型ビリルビン（アンバウンドビリルビンおよびアルブミン結合ビリルビン）および抱合型ビリルビンのうち、分解工程（i）を経た系統ではアルブミン結合ビリルビンのみが特異的結合および蛍光を生じ、分解工程（i）を経ない系統ではアンバウンドビリルビンおよびアルブミン結合ビリルビンが特異的結合および蛍光を生じるように調製される。
　したがって、非抱合型ビリルビンと抱合型ビリルビンとが区別されるとともに、非抱合型ビリルビンのアンバウンドビリルビンとアルブミン結合ビリルビンとも区別されるため、抱合型ビリルビンが高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビンを正確に測定することが可能になる。これにより、新生児からの採血試料を血液試料として測定すれば、新生児の黄疸管理を的確に行うことができる。
　さらに、蛍光法であることから高い測定感度が達成されるため、微量血液試料での測定が可能になる。したがって、血液試料が、新生児、特に早産児に由来するものである場合に、採血時の負荷を軽減することができる。
（２）
　上記（１）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は、早産児由来の血液試料であってよい。
　早産児では、総ビリルビンに対しアンバウンドビリルビンが高い症例が特に多いため、より有効性の高い黄疸管理が可能となる。
（３）
　上記（１）または（２）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は、血清総ビリルビン濃度が８ｍｇ／ｄＬ以上である血液に由来するものであってよい。
　このように血清総ビリルビン濃度が高い場合、抱合型ビリルビン量が高い症例が特に多い。本発明では抱合型ビリルビンを検出しないため、このように抱合型ビリルビン量が高い症例が特に多い場合に特に有用である。具体的には、新生児黄疸の管理を効果的に行うことができる。
（４）
　上記（１）から（３）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料の抱合型ビリルビン濃度は１ｍｇ／ｄＬ以上であってよい。
　本発明では抱合型ビリルビンを検出しないため、このように抱合型ビリルビン濃度が高い試料の場合に特に有用である。
（５）
　上記（１）から（４）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、酸化分解反応の停止は抗酸化物質によって行ってよい。
　この場合、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。
（６）
　上記（５）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質はアスコルビン酸であってよい。
　この場合、酸化分解反応の停止をより簡易かつ効果的に行うことができる。
（７）
　上記（１）から（６）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、酸化分解反応の停止は、分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下の時点で行うことができる。
　この場合、血液試料中のアンバウンドビリルビンを十分に分解することができるとともに、アンバウンドビリルビンの迅速な測定を行うことができる。
（８）
　上記（５）から（７）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質は、分解停止工程（ii）の反応系において０．１重量％以上となるように添加されてよい。
　この場合、酸化分解反応の停止をより確実に行うための抗酸化作用を発揮することができる。
　（９）
　上記（８）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質がアスコルビン酸である場合、アルコルビン酸は、分解停止工程（ii）の反応系において３２重量％以下となるように添加されてよい。
　この場合、接触工程（iii）において、ポリペプチドの結合反応が起こりやすいｐＨへの調整が容易である。
（１０）
　上記（６）から（９）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、アスコルビン酸は、接触工程（iii）の反応系において０．８重量％以下となるように希釈されてよい。
　この場合、接触工程（iii）の反応系を、ポリペプチドの結合反応が起こりやすいｐＨとすることができる。
（１１）
　上記（１）から（１０）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、分解工程（i）の反応系における血液試料の希釈率は、血清換算値で５倍以上１２０倍以下であってよい。
　この場合、血液試料が比較的濃い濃度で反応に供されるため、ビリルビンの自然消費（たとえば、光曝露および／または血清中の未知の代謝物質による分解）を好ましく抑制するとともに、アンバウンドビリルビンの分解反応の進行への悪影響も回避しやすい。したがって、より正確にアンバウンドビリルビンを測定することができる。
（１２）
　上記（１１）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、分解工程（i）の酸化分解反応が、グルコースオキシダーゼの存在下でグルコースから生じさせた過酸化水素とペルオキシダーゼとにより進行させるものであり、酸化分解反応の反応系において、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼそれぞれの量が、血清１μＬ当たりの換算値で０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下であってよい。
　なお、本明細書において、酵素の量を表す単位Ｕは、国際単位（International Unit）である。
　この場合、血液試料の濃度に対する酵素量が適切であるため、分解工程（i）の反応速度を適切にコントロールすることができる。
（１３）
　上記（１）から（１２）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は全血試料であってよい。
　この場合、さらに、血清の調製を行う必要が無いため測定効率が良好である。したがって、緊急疾患である新生児黄疸の迅速な検査が可能となる。さらに、採血量が少なくて済むため、新生児、特に早産児の採血時の負荷を軽減することができる。
（１４）
　上記（１３）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、検出工程（iv）で、ヘマトクリット値による補正を行ってアンバウンドビリルビンの量を導出してよい。
　通常ビリルビンは血球成分中に存在せず血漿成分中に存在するために、全血でのアンバウンドビリルビン測定値は、血清または血漿で測定した場合に比べて低く検出される。これをヘマトクリット値で補正することで、全血であっても正確な測定が可能となる。
（１５）
　本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、インキュベータと、試薬液添加部と、試薬ブランク液添加部と、タイマーと、停止剤添加部と、混和部と、を含む。
　インキュベータは、反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含む。
　試薬液添加部は、反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液を添加する。
　試薬ブランク液添加部は、対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液を添加する。
　タイマーは、試薬液添加部および試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動する。
　停止剤添加部は、タイマーの計測時間に基づいて制御されかつ、反応用容器および対照用容器それぞれに酸化分解停止剤を添加する。
　混和部は、反応用容器の内容物および対照用容器の内容物それぞれを混和する。
　この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法の分解工程（i）および分解停止工程（ii）をルーチン化し、接触工程（iii）に供するためのアンバウンドビリルビン測定用試料を容易にかつ正確に調製することができる。
（１６）
　本発明のアンバウンドビリルビン測定装置は、（１５）に記載のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置と、蛍光測定部と、演算処理部と、出力部とを含む。
　蛍光測定部は、酸化分解停止剤が添加された反応用容器の内容物および対照用容器の内容物それぞれに蛍光特性を示すポリペプチドが添加された蛍光測定用試料について蛍光測定を行う。
　演算処理部は、少なくとも反応用容器の内容物の蛍光値と対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する。
　出力部は、導出された前記アンバウンドビリルビン値を表示する。
　この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法を容易にかつ正確に行うことができる。
（１７）
　上記（１６）に記載のアンバウンドビリルビン測定装置は、分取部と添加部とをさらに含んでよい。
　分取部は、酸化分解停止剤の添加後に反応用容器および対照用容器それぞれから内容物を測定用容器に分取する。
　添加部は、測定用容器に蛍光特性を示すポリペプチド液を添加する。
　この構成によって、蛍光測定用試料の調製もルーチン化されるため、（１）から（１４）に記載アンバウンドビリルビンの測定方法をより容易にかつ正確に行うことができる。
（１８）
　本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、を少なくとも含む。
　この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法を実施することができる。
（１９）
　上記（１８）のアンバウンドビリルビン測定キットは、グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含んでよい。
　これによって、アンバウンドビリルビンの分解開始のタイミングおよび分解速度のコントロールが容易となる。
（２０）
　上記（１８）または（１９）のアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、酸化還元酵素はペルオキシダーゼであってよい。
　これによって、アンバウンドビリルビンの酸化分解を効果的に行うことができる。
（２１）
　上記（１８）から（２０）のいずれかのアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、酸化分解停止剤は抗酸化物質であってよい。
　これによって、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。
（２２）
　上記（２１）のアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、抗酸化物質はアスコルビン酸であってよい。
　これによって、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。
　本発明によって、抱合型ビリルビンが高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビン量を正確に反映した測定を行うことができる。このため、たとえば新生児の黄疸管理を的確に行うことが可能となる。
本発明の一実施形態における測定原理を模式的に示す。 本発明の測定方法のプロトコルの一例を示す。 本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置および本発明のアンバウンドビリルビン測定装置の一例のブロック図を示す。 参考例１で行ったＵｎａＧ法のプロトコルを模式的に示す。 参考例１で得られた検量線を示す。 参考例３で得られた、ＵｎａＧ法（ＵｎａＧ使用およびＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ使用）による非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法による非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 図６の相関図について、ＵｎａＧを使用したＵｎａＧ法の場合（７２検体、×ドット）とＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを使用したＵｎａＧ法の場合（６８検体、○ドット）とで区別して示す。 図６の相関図について、光線治療中の新生児の検体（３５検体、三角ドット）と、光線治療を行っていない新生児の検体（１０５検体、丸ドット）とを区別可能にプロットしたものである。 参考例６で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中のヘモグロビン濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例７で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中の乳び濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例８で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中のアスコルビン酸濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例１０で得られた、ＵｎａＧ法による全血中の非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法による血清中の非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 参考例１０で得られた、ＵｎａＧ法による全血中の非抱合型ビリルビン濃度と、ＵｎａＧ法による血清中の非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 参考例１１で得られた、ＵＢアナライザによるアンバウンドビリルビン濃度と総ビリルビン濃度との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＴＢ値を基にしたＵＢ値（UB analyzer－0-20s）との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（UB analyzer－0-20s）との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢ値の算出方法（ａ）と、本発明によるＵＢ値の算出方法（ｂ）とを説明する図である。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。 実施例３で得られた、ＤＢ低値血清検体についての、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。 実施例４で得られた、ＤＢ高値血清検体についての、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を、図１９に重ねて示す。 実施例３での低ＤＢ値の検体と実施例４での高ＤＢ値の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値との関係を示す。 実施例３での低ＤＢ値の検体と実施例４での高ＤＢ値の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるＵＢ値との関係を示す。
［１．測定原理］
　図１に、本発明の実施形態の一例を挙げて測定原理を模式的に示す。
図１において、Ｄ－Ｂｉｌは抱合型ビリルビンを、ｉＤ－Ｂｉｌは非抱合型ビリルビンを示す。Ａｌｂはアルブミンを示し、アルブミンＡｌｂから遊離しているｉＤ－ＢｉｌはアンバウンドビリルビンＵＢを示す。Ｄ－ＢＸは抱合型ビリルビンの分解物を示し、ｉＤ－ＢＸはアンバウンドビリルビンの分解物を示す。ＵｎａＧは抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌに特異的に結合する蛍光性ポリペプチドの一例を示す。
［１－１．測定対象］
　図１の（ａ１）は、血液試料（未反応試料）を示す。血液試料としては、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌおよび非抱合型ビリルビンｉＤ－ＢｉｌのアンバウンドビリルビンＵＢが含まれていれば、ヒトまたは非ヒト生物由来の採血試料であってもよいし、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌおよび／またはアンバウンドビリルビンＵＢを既知濃度で調製した人工血液試料であってもよい。
　血液試料（ａ１）は、臨床上の意義が大きい点から、ヒト乳児、特に新生児に由来する血液試料であることが好ましい。血液試料（ａ１）には、総ビリルビン、つまり抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌおよび非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌが含まれる。非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌの多くはアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとして存在する一方、一部はアルブミンＡｌｂから遊離して神経毒のアンバウンドビリルビンＵＢとして存在する。血液試料（ａ１）は、具体的には、全血、血漿および血清のいずれであってもよく、当業者によって適宜血液試料が入手および調製される。調製においては、血漿化処理、血清化処理、希釈処理などが行われる。
　新生児は、通常、生日を０日と数えた場合に、生後０日以上２８日未満の乳児である。新生児は、総ビリルビンとアンバウンドビリルビンＵＢとの間に通常みられる相関から乖離してアンバウンドビリルビンＵＢが相対的に高いことが多く、アンバウンドビリルビンＵＢ測定を正確に行わなければならない要請が高い。したがって、新生児がアンバウンドビリルビンＵＢ濃度を上昇させる要因を持っている場合、たとえば低アルブミン血症、薬剤治療中、感染症罹患などに該当していることが好ましい。中でも、新生児が、当該要因に該当する可能性が極めて高い早産児であることが好ましい。早産児は、在胎３７週未満で生まれた新生児をいうが、在胎３０週未満の新生児であることがより好ましい。
　一方、生後２８日以上の乳児でも当該要因に該当する可能性があるため、本発明は、生後２８日以上の乳児にも適用され得る。
　本発明は、血液試料中の抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌの濃度に影響を受けない測定方法である。したがって本発明は、血液試料が、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌを高濃度で含んでいる可能性がある場合、たとえば総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬ以上、好ましくは８ｍｇ／ｄＬ以上、特に２０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度で含む場合に一層有用である。本発明で測定可能な場合の総ビリルビン濃度の上限は特に限定されないが、たとえば４０ｍｇ／ｄＬ、好ましくは３０ｍｇ／ｄＬまでを測定対象とすることができる。
　具体的には、本発明は、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬ以上である場合に一層有用である。あるいは、総ビリルビン濃度に対する抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌ濃度（抱合型ビリルビン／総ビリルビン比）で表した場合、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上である場合に一層有用である。本発明者らは、従来のＧＯＤ－ＰＯＤ法によるアンバウンドビリルビンＵＢ測定法において、検体の抱合型ビリルビン／総ビリルビン比が上記の範囲である場合に、アンバウンドビリルビンＵＢが総ビリルビン値から通常想定される値よりも高値で出やすいことを確認している。
　また、本発明は、血液試料の由来元となる被験者が光線療法を受けたか否かに影響を受けない測定方法である。従って、本発明では、血液試料中のビリルビンが脂溶性であってもよいし、光線により水溶性の構造異性体（シクロビリルビン）に変化させられていてもよい。
［１－２．分解工程］
　図１に示すように、血液試料（ａ１）は分解工程（i）に供される。分解工程（i）では、血液試料（ａ１）中の抱合型ビリルビンＤ－ＢｉｌとアンバウンドビリルビンＵＢとが酸化分解される。当該工程で生じる分解反応は、少なくともアンバウンドビリルビンＵＢが後述工程（iii）で用いられる蛍光性ポリペプチドとの結合特性を有しない物質に変換し、かつ、アルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンの当該蛍光性ポリペプチドとの結合特性を変化させない限り、特に限定されるものではない。
　酸化分解は、酸化還元酵素を用いてビリルビンの水素を水素受容体である過酸化物に転移させることにより進行させればよい。好ましくは、図１に示すように酸化還元酵素としてペルオキシダーゼ、過酸化物として過酸化水素を用いる。
　過酸化水素は、分解工程（i）の反応系中で発生させることができる。より好ましくは、図１に示すように、過酸化水素を、ＧＯＤ（グルコースオキシダーゼ）の存在下、グルコース（Glucose）、水および酸素からグルコネート（Gluconate）とともに生じさせる。生じさせた過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させることで、ビリルビンを酸化分解する。この場合、分解速度がペルオキシダーゼに依存するため、ペルオキシダーゼの添加タイミングおよび濃度によってアンバウンドビリルビンＵＢの分解開始のタイミングおよび分解速度をコントロールしやすい点で好ましい。なお、本実施形態では過酸化水素を分解工程（i）の反応系中で発生させている例を示しているが、本発明では、グルコースおよびグルコースオキシダーゼを用いることなく、過酸化水素を試薬として系外から添加することも許容する。
　図１においては、分解工程（i）によって、血液試料（ａ１）中のアンバウンドビリルビンＵＢとともに、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌも酸化分解される。アンバウンドビリルビンＵＢおよび抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌは、酸化分解によって、それぞれ無色のアンバウンドビリルビン分解物ｉＤ－ＢＸおよび無色の抱合型ビリルビン分解物Ｄ－ＢＸに変換される。
［１－３．分解停止工程］
　血液試料（ａ１）では、アンバウンドビリルビンＵＢとアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとが平衡状態の関係にあるため、アンバウンドビリルビンＵＢが遊離し続けることによるアンバウンドビリルビンＵＢの分解反応が後述の接触工程（iii）にまで冗長しないよう、分解停止工程（ii）を行う。これによって、試料分解物（ｂ１）を得る。
　分解停止工程（ii）では、分解工程（i）の反応の停止が可能な方法を特に限定されることなく用いることができる。具体的には、分解工程（i）を構築している反応系に、酸化分解停止剤を添加すればよい。
　たとえば、分解反応の停止を簡易かつ効果的に行う観点から、酸化分解停止剤として抗酸化物質を用いることができる。抗酸化物質としては、グルタチオン、Ｎ－アセチルシステイン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ブチルヒドロキシアニソール、カテキン、クエルセチン、尿酸、フラボノイドなどが挙げられる。図１に示すようなアスコルビン酸を用いる場合、コスト性、入手容易性、操作性（高い水溶性）、高い分解停止効果などにより、分解反応の停止をより簡易かつ効果的に行うことができる。
　上記の他にも、酸化分解停止剤としては、フェロシアン化物イオン；ＥＤＴＡ鉄錯体；フェロシアン化物およびアルブミン；カチオン性界面活性剤および／または両性界面活性剤；両性界面活性剤およびフェロシアン化物；ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびフェロシアン化イオン；鉄錯体およびステロイド化合物；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物などを用いてもよいし、炭素数８以上２４以下の飽和又は不飽和脂肪酸（具体的には、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、イコサン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラドコサン酸、およびテトラコサペンタエン酸）を用いてもよい。
　なお、血液試料の由来元となる被験者が点滴などによるビタミンＣ処置を受けている場合は、上記の分解工程（i）に先立って、血液試料をアスコルビン酸オキシダーゼ処理することで、もともと含まれていたアスコルビン酸の分解工程への悪影響を排除し、正確な測定が可能となる。この場合、アスコルビン酸以外の酸化分解停止剤を用いることによって、効果的に分解停止を行うことができる。
［１－４．接触工程］
　接触工程（iii）では、分解工程（i）を経ていない未反応試料（ａ１）、および分解工程（i）を経た試料分解物（ｂ１）それぞれに対し、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌに特異的に結合することで蛍光特性を示すポリペプチド（蛍光性ポリペプチド）を接触させる。図１においては、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを用いている。これによって、未反応試料（ａ１）からは蛍光化未反応試料（ａ２）が、試料分解物（ｂ１）からは蛍光化試料分解物（ｂ２）が得られる。
　接触工程（iii）で用いる蛍光性ポリペプチドは、少なくとも以下の２つの特性を示す。１つめの特性として、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌに対する特異的結合性を有し、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌおよびその分解物Ｄ－ＢＸと、アンバウンドビリルビンＵＢの分解物ｉＤ－ＢＸとに対する結合性は有しない。２つめの特性として、ホロ体つまり非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌと特異的結合した場合に励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発する一方、アポ体つまり非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌが存在しない場合には同じ励起光の照射を受けても蛍光を発しない。当該蛍光の強度は、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌ濃度に依存する。
　さらに、蛍光性ポリペプチドの３つめの特性として、アルブミンＡｌｂ結合性ビリルビンと接触した場合、アルブミンＡｌｂと非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌとの結合を切断して非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌと結合してよい。
　図１に示す実施形態で例示されている蛍光性ポリペプチドＵｎａＧは、上記の３つの特性を全て有する。したがって、蛍光化未反応試料（ａ２）中では、アルブミンＡｌｂに結合しているか否かを問わず、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌに結合する。つまり、アンバウンドビリルビンＵＢとアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとに結合し、結合量相当の蛍光を発する。一方、蛍光化試料分解物（ｂ２）中では、アルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンのみに結合する。
　接触工程（iii）で用いられる蛍光性ポリペプチドは、上記の３つの特性を満たす限り特に限定されない。蛍光性ポリペプチドの具体例は、ＵｎａＧを基本構造とするポリペプチドであってよく、たとえば、以下の（Ａ）から（Ｄ）に挙げられる。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個以上２１個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、上記の特性を好ましく満たす点で、１個以上２１個以下であることが好ましく、１個以上１４個以下であることがより好ましく、１個以上７個以下であることがさらに好ましく、１個以上５個以下または１個以上６個以下であることが特に好ましい。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有する蛍光性ポリペプチド。なお、配列同一性は、上記の特性を好ましく満たす点で、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（Ｄ）上述の（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド。なお、ストリンジェントな条件下としては、例えば、参考文献[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件などが挙げられる。より具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハートおよび１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃、８時間以上１６時間以下で恒温しハイブリダイズさせる条件、および当該条件におけるハイブリダイズ後に６５℃で約０．１Ｍまたはそれより低い塩を含む溶液中、好ましくは０．２×ＳＳＣまたは同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液において洗浄する条件が挙げられる。なお、上記のポリヌクレオチドは、上記（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対して８５％以上の配列同一性を有することが好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上の配列同一性を有することがさらに好ましい。
　上記蛍光ポリペプチドは、ペプチド結合されたアミノ酸残基で構成されるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ポリペプチド以外の構造としては、糖鎖、イソプレノイド基などが挙げられるが、特に限定されるものではない。上記の特性を満たすことが前提であるため、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌとの結合部位となる構造を有していることは言うまでもない。
　蛍光性ポリペプチドは、天然供給源より単離してもよいし、人為的に得てもよい。より具体的には、当該蛍光性ポリペプチドには、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された翻訳産物が含まれる。人為的に得られる蛍光性ポリペプチドには、たとえば上記の（Ａ）から（Ｄ）に挙げられるタンパク質構造に、その精製などの目的でアフィニティタグが付加された態様のものが含まれてよい。蛍光性ポリペプチドの一例として、ウナギ由来のものが挙げられ、より具体的にはニホンウナギ由来のものが挙げられる。
　蛍光性ポリペプチドの蛍光特性は、最大励起波長が４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下、または４９０ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、または４９４ｎｍ以上５０４ｎｍ以下であってよく、最大蛍光波長が緑色光の５０７ｎｍ以上５４７ｎｍ以下、または５１７ｎｍ以上５３７ｎｍ以下、または５２２ｎｍ以上５３２ｎｍ以下であってよい。特にＵｎａＧの主な蛍光特性は、最大励起波長が４９８ｎｍ以上４９９ｎｍ以下、最大蛍光波長が５２５ｎｍ以上５３０ｎｍ以下、モル吸光係数が５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1以上７８，０００Ｍ-1ｃｍ-1以下、量子収率が５０％以上５４％以下、蛍光寿命が２．２ナノ秒である。
　上述に具体的に挙げた蛍光性ポリペプチド、特にＵｎａＧは、非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌと接触すると即座に結合するとともに、少量の非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌであっても強い蛍光活性を確保することができるため、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）の量が微量であっても高感度且つ正確な測定が可能となる。すなわち、最初に用意する血液試料（ａ１）の量が微量であっても支障なく、また、１回の測定で蛍光化未反応試料（ａ２）と蛍光化試料分解物（ｂ２）との二系統を並列して調製する必要性に対しても支障がない。このような利点は、新生児黄疸のルーチン検査としての有用性に大きく寄与する。
［１－５．検出工程］
　検出工程（iv）においては、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対して励起光を照射し、発せられた所定波長の蛍光を検出する。蛍光化未反応試料（ａ２）中ではアンバウンドビリルビンＵＢと蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）との結合による蛍光が発せられ、蛍光化試料分解物（ｂ２）中ではアンバウンドビリルビン分解物ｉＤ－ＢＸが蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）に結合していないためそこからは蛍光が発せられない。
　当該蛍光性ポリペプチドのホロ体から発せられる蛍光強度は、蛍光性ポリペプチドの結合量に相関する。したがって、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）から発せられる蛍光強度を計測し、その差を算出することによってアンバウンドビリルビンＵＢの量が導出される。
［１－６．診断］
　測定されたアンバウンドビリルビンＵＢの測定値に基づいて、血液試料の由来元（被験者）の黄疸管理を行うことができる。この場合、たとえば、核黄疸発症の予知を行い、光線療法、交換輸血、血漿交換、γ－グロブリン点滴療法などの治療法の適応を決定することができる。さらに、治療後のフォローアップ時に、治療効果を確認することもできる。診断の基準となるカットオフ値は、症例の蓄積に基づいて決定することができる。この場合、カットオフ値としては、在胎週数３０週未満と３０週以上との間、出生体重１５００ｇ未満と１５００ｇ以上との間で異なる値を設定することができる。
　本発明は上記の測定原理でアンバウンドビリルビン量を測定するものであるが、適宜、総ビリルビン量の測定法、抱合型ビリルビンの測定法、および他のアンバウンドビリルビンの測定法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法、つまりアンバウンドビリルビン分解による総ビリルビン量の減少速度からアンバウンドビリルビン量を求める方法）の少なくともいずれかによる測定結果と組み合わせてもよい。
［２．プロトコルおよび諸条件］
　図２に、本発明の測定方法のプロトコルの一例を示す。以下において、このプロトコルに準じ、それぞれの工程における諸条件等についてさらに詳細に説明する。
　図２の例では、血清（Serum）を血液試料（ａ１）として用意する。最初に用意する血液試料量は、図２の例のような血清の場合で（血液試料が全血など血清でない場合は血清換算値で）たとえば０．５μｌ以上２５μｌ以下であってよい。本発明の方法は、接触工程（iii）での希釈率が高くても測定可能であるため、血液試料の微量測定が可能である。したがって、血液試料量（血清換算値）は、たとえば１μｍ未満の微量であってもよい。一方、各工程での希釈操作性を考慮すると、必要な血液試料量（血清換算値）は、たとえば０．８μｌ以上２μｌ以下、特に１μｌを確保することが好ましい。
［２－１．分解工程（i）諸条件］
　血液試料（ａ１）は、まず、緩衝液（Buffer）と混和されることで最初の希釈を受ける。本実施形態では、反応系中で過酸化水素を発生させるため、この緩衝液（Buffer）の中にグルコース（Glucose）を含ませる。緩衝液としては、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などを使用することができる。
　緩衝液による希釈により、血液試料（ａ１）は血清換算値（血液試料中の血清量を基準とした希釈率）でたとえば１．５倍以上、または１．８倍以上（体積基準）に希釈される。希釈率が上記下限値以上であることは、調製容易性の点で好ましい。希釈率の範囲内の上限値は特に限定されないが、希釈倍率の上昇に伴うビリルビンとアルブミンとの平衡関係の変化を考慮する観点、ならびに、光曝露および／または血清中の未知の代謝物質による分解によるビリルビンの自然消費を回避する観点から、血液試料（ａ１）は薄め過ぎないことが好ましい。この観点から、血液試料（ａ１）の希釈率は、血清換算値でたとえば５５倍以下であってもよいし、２．５倍以下または２．２倍以下（いずれも体積基準）であってもよい。
　当該緩衝液（Buffer）中のグルコースの濃度は、上述の希釈率と、分解工程（i）の反応系におけるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）基質としての適切量と、を勘案して適宜決定される。たとえば、分解工程（i）の反応系を構築した場合にグルコースオキシダーゼ１Ｕあたりの量が０．３ｍｇ以上１ｍｇ以下、好ましくは０．３ｍｇ以上０．５ｍｇ以下、一例として０．３１２ｍｇとなるように勘案して決定することができる。したがって、緩衝液中のグルコースの濃度は１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下、一例として１ｍｇ／ｍＬであってよい。
　希釈された血液試料（血液試料希釈物）の一部はＡ系統用に使用され、別の一部はＢ系統用に使用される。
　本実施形態のＢ系統の血液試料希釈物には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む緩衝液（ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液）が加えられ、適切な温度条件を満たすことで、分解工程（i）の反応系が構築される。ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液に用いられる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。
　分解工程（i）の反応系では、ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液により血液試料（ａ１）はさらなる希釈を受ける。分解工程（i）の反応系中における血液試料（ａ１）の希釈率は、血清換算値でたとえば１２０倍以下、好ましくは７０倍以下、一例として５２．５倍であってよい。希釈率が上記上限値以下であることは、ビリルビンの自然消費回避の点で好ましい。当該希釈率の範囲内の下限は特に限定されないが、希釈操作性などを考慮すると、たとえば５倍であってよい。
　ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液中のＧＯＤおよびＰＯＤの量は、上述の希釈率と、分解工程（i）の反応系における酵素としての適切量と、を勘案して適宜決定される。ＧＯＤの量は、血液試料（ａ１）１μｌ（血清換算値）に対してたとえば０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下、好ましくは０．０５Ｕ以上０．２Ｕ以下、一例として０．１６Ｕとなるように調製される。ＰＯＤの量も、血液試料（ａ１）１μｌ（血清換算値）に対してたとえば０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下、好ましくは０．０５Ｕ以上０．２Ｕ以下、一例として０．１６Ｕとなるように調製される。ＧＯＤおよびＰＯＤの量を上記範囲内で設定することにより、適切な速度、つまり遅すぎず早すぎない速度でアンバウンドビリルビンを分解させることができる。ＧＯＤの量とＰＯＤの量とは、同量であってよい。
　分解工程（i）における反応温度は、例えば２８℃以上３８℃以下、一例として３７℃である。分解工程（i）の反応は速やかに終了させられるため、当該反応系を構築する直前の段階で、血液試料希釈物とＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液との両方が加温等により上記の温度に調整されていることが好ましい。
　なお、Ａ系統の血液試料希釈物には、ＧＯＤおよびＰＯＤを加えないことを除いて同じ操作を行う。すなわち、ＧＯＤおよびＰＯＤのいずれも含まない緩衝液が加えられ、かつ、同じ温度条件下に置かれる。
［２－２．分解停止工程（ii）諸条件］
　分解工程（i）の反応は、アスコルビン酸を含む緩衝液の添加により停止される。アスコルビン酸を含ませる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。Ａ系統とＢ系統とでは、分解反応（i）を経たか否かという点を除いて互いに同じ条件とするため、アスコルビン酸を含む緩衝液は、Ａ系統およびＢ系統の両方に同様に添加される。Ａ系統では上記の分解反応（i）を受けていないため、試料中のビリルビンの構成としては当初の血液試料（ａ１）と変わらない（図１参照）。すなわちこの試料は未反応のままであるので、未反応試料（ａ１）と記載する。一方、Ｂ系統では上記の分解反応（i）を受けたため、試料中のビリルビンの構成が変化しており試料分解物（ｂ１）となっている（図１参照）。
　分解停止工程（ii）を行うタイミングは、分解工程（i）の反応開始前から既に血液試料（ａ１）中で遊離していた分のアンバウンドビリルビンＵＢの分解が完了したタイミングであることが望ましい。分解工程（i）の反応開始後から分解停止工程（ii）までに確保する時間は、分解工程（i）の反応系における血液試料の希釈率などを考慮して選択してよい。
　たとえば、当該時間は、抱合型ビリルビンＤ－Ｂｉｌが通常量であることで総ビリルビン量の減少度合いと非抱合型ビリルビン量の減少度合いとが同視可能な系を想定した場合に、当該系において、総ビリルビン量がその初期濃度から約２０％減少（具体的には１８％以上２５％以下減少）するのにかかる時間相当であってよい。完全混和により分解工程（i）の反応系が均一となるまでに総ビリルビン濃度が５％程度減少することを考慮すると、具体的には、総ビリルビンの初期濃度を１００％とした場合に、９５％から７６％まで低下するのにかかる時間相当であってよい。さらに具体的には、たとえば分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下、好ましくは１５秒以上３５秒以下、より好ましくは１５秒以上２５秒以下、一例として２０秒であってよい。分解停止を行うタイミングの範囲が上記下限値以上であることは、分解すべきアンバウンドビリルビンを確実に分解する点で好ましく、上記上限値以下であることは、測定値の再現性が良好である点で好ましい。
　分解停止工程（ii）における反応温度は、たとえば２０℃以上３８℃以下、一例として３７℃であってよい。アスコルビン酸は、分解工程（i）で使用したＰＯＤ１Ｕあたり０．００１５ｍｇ以上となる量であれば分解停止可能である。分解停止を迅速かつ確実に行うことを目的としてより多量に用いてもよく、たとえばＰＯＤ１Ｕあたり０．０１５ｍｇ以上１２０ｍｇ以下、好ましくは１．５ｍｇ以上５０ｍｇ以下、一例として１．７３ｍｇとなる量で用いてもよい。より具体的には、アスコルビン酸を含む緩衝液のアスコルビン酸濃度および添加量は、分解工程（i）の反応液中に添加された後のアスコルビン酸の終濃度がたとえば０．１重量％以上３２重量％以下、好ましくは０．２重量％以上１０重量％以下、一例として０．３５重量％となるように決定することができる。さらに、アスコルビン酸を含む緩衝液添加後は、血液試料の希釈率は血清換算値で５倍以上１２０倍以下、好ましくは１０倍以上１００倍以下、一例として８０倍であってよい。
　アスコルビン酸の終濃度が上記下限値以上であることは、アンバウンドビリルビンＵＢの分解を確実に停止する点で好ましく、アスコルビン酸濃度が上記上限値以下であることは、ｐＨが酸性に傾き過ぎることを防止することで、引き続く接触工程（iii）において蛍光性ポリペプチドとの結合特性に悪影響を与えない中性に回復させることが容易となる点で好ましい。また、血液試料の希釈率が上記上限値以下であることは、ビリルビンの自然消費回避の点で好ましい。
［２－３．接触工程（iii）諸条件］
　接触工程（iii）では、Ａ系統の未反応試料（ａ１）およびＢ系統の試料分解物（ｂ１）両方に、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液を添加する。蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含ませる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。蛍光性ポリペプチドＵｎａＧと非抱合型ビリルビンｉＤ－Ｂｉｌとが特異的に結合した複合体を形成することにより、それぞれ、Ａ系統では蛍光化未反応試料（ａ２）へ、Ｂ系統では蛍光化試料分解物（ｂ２）へ変換される。
　接触工程（iii）は、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧの特異的結合性に実質的な悪影響が生じない条件下で行われる。このような条件としては、たとえば温度条件が４℃以上６５℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下であってよく、ｐＨがおおよそ中性、たとえば６．５以上８．０以下、好ましくは７．０以上７．５以下、特に７．４であってよい。図示したようにアスコルビン酸を使用する場合は、ｐＨは低めとなる傾向がある。接触工程（iii）におけるアスコルビン酸の終濃度は、たとえば０．０１重量％以上０．８重量％以下であってよい。好ましくは、アスコルビン酸の終濃度は０．５重量％以下、さらに好ましくは０．２５重量％以下、一層好ましくは０．２重量％以下、より一層好ましくは０．０５重量％以下であってよい。アスコルビン酸の終濃度が上記上限値以下であることは、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧの特異的結合性に実質的な悪影響が生じない点で好ましい。また、反応時間は２０秒以上３５秒以下、好ましくは２５以上３０秒以下であってよい。
　接触工程（iii）における蛍光性ポリペプチドＵｎａＧ添加後の反応液において、血液試料は、蛍光検出工程（iv）における内部遮断効果が無視できる程度まで希釈されることが極めて好ましい。たとえば、血液試料の希釈率は、血清換算値で２００倍以上３２００倍以下、好ましくは４００倍以上１６００倍以下、一例として８００倍であってよい。
　蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液の濃度および添加量は、上記の血液試料の希釈率および上記のｐＨを考慮して決定することができる。たとえば、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液の濃度は、測定の正確性の点などから、添加後のＵｎａＧの終濃度が０．５μＭ以上４μＭ以下、好ましくは１．０μＭ以上３μＭ以下、一例として２μＭとなるように調製することができる。
［２－４．検出工程（iv）諸条件］
　検出工程（iv）では、Ａ系統の蛍光化未反応試料（ａ２）およびＢ系統の蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対して、蛍光性ポリペプチドの蛍光特性に応じた励起光を照射し、所定の波長の蛍光強度を測定する。励起波長は、４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下、または４９０ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、または４９４ｎｍ以上５０４ｎｍ以下であってよい。検出波長は、緑色光の５０７ｎｍ以上５４７ｎｍ以下、または５１７ｎｍ以上５３７ｎｍ以下、または５２２ｎｍ以上５３２ｎｍ以下であってよい。特に蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを用いる場合は、励起波長が４９８ｎｍ以上４９９ｎｍ以下、検出波長が５２５ｎｍ以上５３０ｎｍ以下であってよい。
　蛍光の検出手段は特に限定されないが、たとえば、ＵＶトランスイルミネータ、ＬＥＤトランスイルミネータ、蛍光顕微鏡、蛍光検出器、およびフローサイトメトリなどを用いることができる。
　検出工程（iv）では、Ａ系統の蛍光化未反応試料（ａ２）およびＢ系統の蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれから検出された蛍光強度の差を計算し、アンバウンドビリルビンＵＢの濃度として算出する。この場合、蛍光強度の差分は、たとえば既知濃度試料に基づいて予め作成された検量線と照合されることで、アンバウンドビリルビンＵＢの絶対量として導出することができる。
　さらに、蛍光強度の差分は、適宜較正が行われてよい。たとえば本発明では全血を血清化処理することなく血液試料（ａ１）として測定に供することができるため、この場合、本工程でヘマクリット値を考慮することで蛍光強度の差分を較正し、正しいアンバウンドビリルビンＵＢを導出することができる。
［５．アンバウンドビリルビン測定装置］
　図３に、本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置および本発明のアンバウンドビリルビン測定装置の一例のブロック図を示す。
　図３に示すように、アンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、インキュベータと、試薬液添加部と、試薬ブランク液添加部と、タイマーと、停止剤添加部と、混和部と、を含む。これにより、上記のアンバウンドビリルビンの測定方法の分解工程（i）および分解停止工程（ii）を自動化することができる。
　インキュベータは、反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含む。反応用容器収容部には反応用容器が収容され、対照用容器収容部には対照用容器が収容され、インキュベータにより、それらの内容物が所定の温度に維持される。
　反応用容器および対照用容器に最初に添加される内容物は、血液試料の希釈物であって組成が同じものである。反応用容器に添加された血液試料希釈物は図２に示すうちのＡ系統であり、対照用容器に添加された血液試料希釈物は図２に示すうちのＢ系統である。
　反応用容器および対照用容器に添加される血液試料の希釈物は、たとえば、グルコース含有緩衝液と混和された血液試料であってよい。具体的には、血液試料とグルコース含有緩衝液とを混和した後、得られた混和物の一部を反応用容器に、他の一部を対照用容器に、分割添加することができる。この混和および分割添加の工程は、手動で行うことができる。しかしながら、本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、この混和および分割添加の工程を自動化するように構成されることを除外するものではない。
　インキュベータにおいては、反応用容器および対照用容器中のビリルビン自然消費を回避する観点から、反応用容器収容部と対照用容器収容部が遮光されるように構成されることが好ましい。
　試薬液添加部は、反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液を所定量添加する。これによって、反応用容器中のアンバウンドビリルビンの分解工程（i）が行われる。そして、混和部によって、反応用容器の内容物が混和される。なお、アンバウンドビリルビン酸化分解試薬液は、たとえばＧＯＤおよびＰＯＤを含む緩衝液である。アンバウンドビリルビン酸化分解試薬液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。
　試薬ブランク液添加部は、対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液を所定量添加する。したがって、対照用容器内では、アンバウンドビリルビンの分解工程（i）は行われない。そして、混和部によって、対照用容器の内容物が混和される。なお、試薬ブランク液は、たとえば、上記のＧＯＤおよびＰＯＤを含む緩衝液からＧＯＤおよびＰＯＤが除外された組成の緩衝液である。試薬ブランク液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。
　タイマーは、試薬液添加部および試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動するように制御される。これにより、分解工程（i）の時間を正確に測定することができる。
　停止剤添加部は、タイマーの計測時間に基づいて制御される。具体的には、タイマーが、分解工程（i）の反応開始前から既に血液試料中で遊離していた分のアンバウンドビリルビンの分解が完了するまでにかかるとされる所定の時間（好ましくは３０秒）をカウントした時に、反応用容器および対照用容器それぞれに酸化分解停止剤を所定量添加する動作を行うように制御される。酸化分解停止剤を添加した後も、反応用容器および対照用容器それぞれの内容物は混和部によって混和される。これによって、アンバウンドビリルビンの酸化分解反応の停止が正確なタイミングで行われる。なお、酸化分解停止剤は、緩衝液中で溶解された状態で使用されてよく、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。
　図３に示すように、本発明のアンバウンドビリルビン測定装置は、上記のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置を含んで構成され、さらに、蛍光測定部と、演算処理部と、出力部とを含む。本実施形態の場合は、分取部と添加部も含む。
　蛍光測定部には、測定用容器収容部が含まれ、公知の分光光学系で構成されている。測定用容器収容部に収容される測定用容器は、多穴ウェルのように複数の試料について効率的に蛍光観察できるものであることが好ましい。本実施形態では、測定用容器として多穴ウェルを挙げて説明する。
　酸化分解停止剤の添加後、反応用容器の内容物（試料分解物（ｂ１）、図１および図２参照）および対照用容器の内容物（未反応試料（ａ１）、図１および図２参照）はそれぞれ一部がそれぞれのウェルに添加される。この操作は手動で行ってもよいが、本実施形態のように、分取部によって自動に行われてもよい。また、この分取部は、停止剤添加部の動作またはタイマーの計測時間に基づいて、その稼動が自動制御されていてもよいし、手動命令（たとえば手動スイッチ）により稼動させてもよい。
　また、蛍光測定部は、反応用容器および対照用容器の内容物のそれぞれ一部がそれぞれのウェルに添加された時点（かつ、後述の蛍光特性を示すポリペプチドの添加前）で、ブランク測定を行ってよい。ブランク測定は、手動命令によって行われてもよいし、分取部を含む本実施形態では、分取部の稼動終了に基づいた蛍光測定部の自動制御により自動的に行われてもよい。
　それぞれのウェルの内容物に対しては、蛍光特性を示すポリペプチドが添加される。これによって、接触工程（iii）が行われ、未反応試料（ａ１）が入ったウェルからは蛍光化未反応試料（ａ２）が、試料分解物（ｂ１）が入ったウェルからは蛍光化試料分解物（ｂ２）が、それぞれ蛍光用測定試料として得られる（図１、図２参照）。
　蛍光特性を示すポリペプチドを添加する操作は手動で行ってもよいが、本実施形態のように、添加部によって行われてもよい。また、この添加部は、たとえば上述のブランク測定の終了に基づいて、その稼動が自動制御されていてもよいし、手動命令により稼動させてもよい。なお、蛍光特性を示すポリペプチドは、たとえばＵｎａＧを基本構造とするポリペプチドを含む緩衝液の態様で使用される。このポリペプチドを含む緩衝液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてもよい。
　蛍光測定部は、蛍光用測定試料、つまり、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対し、蛍光検出を行う。これによって、検出工程（iv）が行われる。この操作は、手動命令によって行われてもよいし、添加部を含む本実施形態では、添加部の稼動に基づいた蛍光測定部の自動制御により行われてもよい。
　蛍光測定部による検出工程（iv）が自動制御により行われる場合、添加部によって蛍光特性を示すポリペプチドが添加された時点からタイマーが始動するようにタイマーが制御され、当該タイマーの計測時間に基づいて蛍光測定部が稼動するように制御されてよい。たとえば、タイマーが、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントした時に、蛍光測定部が稼動し蛍光測定するように制御されてよい。あるいは、タイマーが、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントする間、蛍光測定部を稼動し続けることで蛍光測定し続けてもよい。
　演算処理部は、少なくとも反応用容器の内容物の蛍光値と対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する。上記のように、蛍光測定部が、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントする間蛍光測定し続ける場合は、演算処理部は、取得したそれぞれの蛍光強度から最大蛍光強度を割り出す処理を行った後に、アンバウンドビリルビン値を導出することができる。また、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれについて、同じ条件の試料を複数作成することで複数の蛍光強度を取得した場合は、演算処理部は、取得したそれぞれの蛍光強度から代表値（たとえば平均値、中央値など）を割り出す処理を行った後に、アンバウンドビリルビン値を導出することができる。さらに、血液試料が血清でなく全血である場合には、演算処理部は、ヘマクリット値による補正を行ってもよい。
　出力部は、導出されたアンバウンドビリルビン値を表示する。
［６．アンバウンドビリルビン測定キット］
　本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、上記のアンバウンドビリルビンの測定方法を実施するためのキットである。本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、アイテムとして、アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、を少なくとも含む。
　酸化還元酵素としてはペルオキシダーゼであることが好ましい。酸化還元酵素の態様は、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましいが、後述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。
　酸化分解停止剤は、上述のアンバウンドビリルビン測定において例示した物質から適宜選択して含ませることができる。酸化分解停止剤は、粉末剤の態様であってもよいし、前述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。酸化分解停止剤としては抗酸化剤であることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましいが、特にアスコルビン酸である場合は、保存安定性などの観点から粉末剤の態様であることが好ましい。
　蛍光特性を示すポリペプチドは、上述のアンバウンドビリルビン測定において例示した物質から適宜選択して含ませることができる。蛍光特性を示すポリペプチドは、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましい。
　アンバウンドビリルビン測定キットには、グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含むことができる。グルコースは、粉末剤の態様であってもよいし、測定時の簡便性および／または正確性などの観点から、前述の緩衝液中に溶解された液剤の態様であってもよい。グルコースオキシダーゼは、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましいが、前述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。
　アンバウンドビリルビン測定キットには、標準物質としてのアンバウンドビリルビンをさらなるアイテムとして含むことができる。標準物質は、粉末剤の態様であってもよいし、前述の緩衝液中に溶解された液剤の態様であってもよい。
　それぞれのアイテムは、適宜遮光包装されてよく、１回分の使用に適した量が分包され、複数回分のアイテムセットが含まれてもよい。
　また、アンバウンドビリルビン測定キットには、酸化還元酵素、酸化分解停止剤、蛍光特性を示すポリペプチド、グルコース、グルコースオキシダーゼおよび標準物質の少なくともいずれかのための溶媒または希釈剤としての緩衝液（ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、酢酸緩衝液、トリス緩衝液など）をさらなるアイテムとして含んでもよい。
　アンバウンドビリルビン測定キットには、上記のアンバウンドビリルビン測定方法を示すプロトコルに関する情報をさらに含んでよい。当該情報は、プロトコルを掲載した印刷物であってもよいし、プロトコルがインターネット等で閲覧または取得可能となるように、ウェブ上の閲覧または取得場所についての情報を掲載した印刷物であってもよい。
　さらに、アンバウンドビリルビン測定キットが、上述のアンバウンドビリルビン測定装置の専用キットである場合などは、専用の測定用容器（たとえば多穴ウェル）がアイテムとして含んでいてもよい。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
　以下の参考例および実施例において、人工ビリルビン標準液（単にビリルビン標準液と記載する場合もある）には、株式会社アローズ製のビリルビン標準液を用いた。新生児血清には、神戸大学病院の新生児特定集中治療室に入院した新生児において、黄疸評価目的に行った血液検査の中で発生した余剰検体であり、神戸大学病院の倫理委員会の承認を受け、かつ、余剰検体の基礎研究への使用について患児の代諾者の了承を得たものを用いた。
　ＵｎａＧおよびＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧには、独立行政法人理化学研究所脳科学総合研究センターより提供された、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチドを用いた。
　ＧＯＤ－ＰＯＤ酵素液には、乾燥凍結品のグルコースオキシダーゼ３．２単位と凍結乾燥品のペルオキシダーゼ３．２単位とを、リン酸二水素カリウム０．００６８ｍｇとリン酸水素二ナトリウム１２水和物０．７２０ｍｇと精製水に溶解させて２５μＬとした液剤中に溶解させたものを用いた。溶媒、希釈液、および酵素希釈液に用いたBufferとしては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
　マイクロプレートリーダには、コロナ電気株式会社製ＳＨ－９０００を用いた。総ビリルビンＴＢおよびアンバウンドビリルビンＵＢは、ＵＢアナライザ（株式会社アローズ製の専用測定器ユービーアナライザ）を用いた。総ビリルビンＴ－ｂｉｌおよび抱合型ビリルビンＤ－ｂｉｌは、それぞれ、酵素法を用いたイアトロＱ　Ｔ－ＢＩＬIIおよびイアトロＱ　Ｄ－ＢＢＩＬ（Ａ）（いずれも株式会社ＬＳＩメディエンス製）によって測定し、非抱合型ビリルビンｉＤ－ｂｉｌはそれらの差分を求めることにより導出した。
［参考例１：ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（１）］
　図４に、本参考例１で行ったＵｎａＧ法のプロトコルを模式的に示す。
（検量線の作成）
　まず、人工ビリルビン標準液を段階希釈し、コントロールとともに、ビリルビン濃度が０．０ｍｇ／ｄＬから３３．６ｍｇ／ｄＬまでの段階希釈系列を調製した。
　人工ビリルビン標準液の段階希釈系列それぞれ５０μＬと、ＵｎａＧ溶液１５０μＬとを混和し、総量２００μＬの混合溶液を作成した。混合溶液中のＵｎａＧの最終濃度は２μＭであった。
　混合溶液の蛍光強度は、混和後１０分経過時に最大となった。したがって、混和後１０分経過時に、マイクロプレートリーダを用い、励起波長498nmに対する蛍光波長527nmの蛍光強度を測定した。非抱合型ビリルビン（ｉＤ－Ｂｉｌ）濃度に対する蛍光強度をプロットし、検量線を作成した。得られた検量線を図５に示す。
（検体）
　新生児２８例より採取した４８検体を入手した。２８例の症例背景を表１に、４８検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（非抱合型ビリルビン濃度の測定）
　図４に示すように、上述の新生児血清をそれぞれＰＢＳで２００倍希釈した。希釈した各新生児血清５０μＬとＵｎａＧ溶液１５０μＬ（４００ｍｏｌ）とを混和し、１０反応分後、同様に蛍光強度を測定した。上記の検量線に基づいて、測定値から非抱合型ビリルビン濃度（ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度）を求めた。
　４８検体について、ＵｎａＧ法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度（総ビリルビン測定値と抱合型ビリルビン値との差分として導出）との相関を調べた。その結果、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０４ｘ＋０．１８、Ｒ＝０．９５４、Ｐ＜０．００１）。
（光線療法の影響の検証）
　さらに、上述の相関について、光線治療中の新生児の検体（１１検体）と、光線治療を行っていない新生児の検体（３７検体）との間で相違はなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。
　なお、さらに症例数および検体数を増やした例を後述の参考例３に示す。
［参考例２：ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（１）］
（検体）
　新生児２９例より採取した５３検体を入手した。２９例の症例背景を表３に、５３検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（非抱合型ビリルビンの測定）
　上記の検体を用い、ＵｎａＧ法に用いる蛍光性タンパク質としてＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたことを除いて、参考例１と同じように、検量線を作成し、ＵｎａＧ法と酵素法とで測定された非抱合型ビリルビン測定値の相関を調べた。その結果、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０２ｘ－０．０８、Ｒ＝０．９５４、Ｐ＜０．００１）。
　なお、ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧは、参考例１で用いたＵｎａＧにヒスチジンタグを介してＦＬＡＧタグが付された、ＵｎａＧの変形例である。
（光線療法の影響の検証）
　さらに、上述の相関について、光線治療中の新生児の検体（１９検体）と、光線治療を行っていない新生児の検体（３４検体）との間で相違はなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。
　なお、さらに症例数および検体数を増やした例を後述の参考例３に示す。
［参考例３：ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（２）、およびＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（２）］
（検体）
　上述の参考例１および参考例２に、新生児の症例および血清検体をさらに増やし、参考例１および参考例２における症例および血清検体数を含めた合計９３例より採取した血清１４０検体（抱合型ビリルビン＜１．０ｍｇ／ｄＬ）について、症例背景をまとめて表５に、１４０検体の血清採取日齢および酵素法に基づく抱合型ビリルビンの値をまとめて表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（非抱合型ビリルビンの測定）
　上記の１４０検体を用い、７２検体についてはＵｎａＧを使用して参考例１と同様の操作を行い、６８検体についてはＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを使用して参考例２と同様の操作を行うことで検量線を作成し、ＵｎａＧ法（UnaG method）と酵素法（BOD method）とで測定された非抱合型ビリルビン測定値の相関を調べた。１４０検体の結果をまとめて図６に示す。図６に示すように両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０１ｘ＋０．１７、ｒ＝０．９４３、Ｐ＜０．００１）。　
（非抱合型ビリルビンの測定－ＵｎａＧ使用とＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ使用との比較）
　図６に示された１４０検体のうち、ＵｎａＧを使用した７２検体と、ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いた６８検体とを区別して図７に示す。
　図７では、ＵｎａＧを用いた検体（７２検体）を×ドットで、ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いた検体（６８検体）を○ドットで、区別可能にプロットしている。図７に示すように、ＵｎａＧを用いた検体群（７２検体、×ドット）では、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０３ｘ＋０．１８、ｒ＝０．９５６、ｐ＜０．００１）。同様に、ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いた検体群（６８検体、○ドット）でも、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．９９６ｘ＋０．１１、ｒ＝０．９３５、ｐ＜０．００１）。さらに、両検体群で相関の相違はみられなかった。
　さらに、同日同時間に採取した別の５種類の血清検体について、ＵｎａＧまたはＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法の検証を行った。その結果を以下の表７に示す。表７に示すように、ＵｎａＧおよびＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧのいずれを用いた場合も、ほぼ同じ非抱合型ビリルビン濃度が導出されることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（光線療法の影響の検証）
　上述の１４０検体について、光線療法を受けていない時間帯に採取した検体群（１０５検体、丸ドット）と、光線療法を受けている時間帯に採取した検体群（３５検体、三角ドット）とを区別可能にプロットした。その結果を図８に示す。図８に示すように、両検体群で有意な差は見られなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。
［参考例４：高濃度抱合型ビリルビン血清を用いた場合のＵｎａＧ法と酵素法とによる非抱合型ビリルビン濃度の比較］
　抱合型ビリルビン濃度が高い１４検体（抱合型ビリルビン≧１．０ｍｇ／ｄＬ）について、ＵｎａＧ法（UnaG method）によって得られた非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法（BOD method）によって得られた総ビリルビン（Total bilirubin）濃度、抱合型ビリルビン（Conjugated bilirubin）濃度、それらから導出された非抱合型ビリルビン（Unconjugated bilirubin）濃度と、の比較、ならびに、ＵｎａＧ法（ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ使用）および酵素法によって得られたそれぞれの非抱合型ビリルビン濃度の差（Difference）を表８に示す。表８では、酵素法（BOD(bilirubin oxidase) method）によって得られた総ビリルビン（Total bilirubin）濃度、抱合型ビリルビン（Conjugated bilirubin）濃度、およびその差（Difference）について、平均値（Mean）および標準偏差（SD）も併せて示す。なお、酵素法による非抱合型ビリルビンの導出方法は、以下の式に従った。
　　　[非抱合型ビリルビン]＝[総ビリルビン]－[抱合型ビリルビン]
　　　１ｍｇ／ｄＬ＝１７．１μＭ
　表８より、酵素法とＵｎａＧ法による抱合型ビリルビン濃度は同等であり有意差はなかった（p=0.31）。したがって、ＵｎａＧ法は、抱合型ビリルビン濃度の高低に関わらず非抱合型ビリルビンを直接的に測定することができることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［参考例５：ビリルビン測定値の安定性評価］
　新生児血清５検体を用い、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値について、日中変動および日間変動を検証した。その結果を表９に示す。表９では、日中変動についての検証（A. Intra-day assay）と日間変動についての検証（B. Inter-day assay）を表し、それぞれ、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値（A:時刻を変えて測定、B:日を変えて測定）、その中央値（Median）、平均値（Mean）、標準偏差（SD）および変動係数（CV）を、酵素法（BOD method）による非抱合型ビリルビン測定値とともに示す。
　なお、日中変動の検証では、調製された同一の血清から時間を異にして測定用試料を調製して得られるiDBの測定値が変化するかどうかを検証した。具体的には、血清を調製後、約２０分毎に毎回測定用試料を調製し、合計６回測定した。
　また、日間変動の検証では、調製された同一の血清から日を異にして測定用試料を調製して得られるiDBの測定値が変化するかどうかを検証した。具体的には、血清を調製後、毎日測定用試料を調製し、合計６日間に亘って測定を行った。
　表９に示すように、日中および日間のいずれにおいても、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値が安定的に得られることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［参考例１－参考例５まとめ］
　以上の参考例１から参考例３より、新生児合計９３例からの血清合計１４０検体について、酵素法による非抱合型ビリルビン測定値とＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値とはきわめて良好な相関関係を示した。
　参考例１から参考例３より、蛍光タンパク質のバリエーションに関し、蛍光タンパク質ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法および蛍光タンパク質ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法いずれにおいても、ほぼ同等の非抱合型ビリルビン測定値を示した。
　参考例１から参考例３より、光線療法の影響に関し、蛍光タンパク質ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法および蛍光タンパク質ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法いずれにおいても、光線療法の有無による明らかな影響は確認できなかった。
　参考例４より、抱合ビリルビン濃度の影響に関し、抱合ビリルビン濃度が高い１４検体においても酵素法による非抱合型ビリルビン測定値とＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値とはほぼ同値であった。
　さらに、参考例５より、血清調製後の２４時間未満のいずれの時点であっても、かつ、１日以上（１日以上６日以下）経過後のいずれの時点であっても、安定した非抱合型ビリルビン測定値が得られた。
　したがって、検体は、抱合ビリルビンの高低、蛍光タンパク質のバリエーション、被験者の光線療法歴の有無、血清調製後の経過時間にかかわらず本発明へ適用可能であることが容易に推認される。
［参考例６：ＵｎａＧ法による溶血検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
　本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、検体中のヘモグロビン（溶血）の影響を検証した。
（ヘモグロビン含有溶液の作成）
１．健常成人から全血５ｍＬを採取した（血液ガス測定：Ｈｂ１６ｇ／ｄＬ）
２．遠心して上清成分を吸引破棄し、赤血球成分のみを残した。
３．血球成分２ｍＬとｄＨ２Ｏ３ｍＬとを加えて溶血させ、全量５ｍＬとした。
４．十分混和したうえで、遠心して上済み液のみを新しいチューブに移した。
　　これにより、赤血球膜成分を除いた。結果、全量は約４ｍＬ程度となった。
５．ＳＬＳ－ヘモグロビン法によるＸＮ－ｓｅｒｉｅｓ　９０００（シスメックス株式会社製）を用いてＨｂ濃度を測定した（Ｈｂ１３．４）。
６．Ｂｕｆｆｅｒを用いて、Ｈｂ５ｇ／ｄＬ、Ｈｂ２．５ｇ／ｄＬ、Ｈｂ１ｇ／ｄＬ、Ｈｂ０．５ｇ／ｄＬの希釈系列を作成した。
（検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．１ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒを用いて段階希釈し、ビリルビン濃度が１．７１ｎｇ／μＬ、０．８５５ｎｇ／μＬ、０．４２７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとして、当該Ｂｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ－Ｈｉｓ　ＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１５０μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ－Ｈｉｓ　ＦＬＡＧ溶液１５０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５０μＬとを混合し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。
（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．２種類の新生児血清（血清２２５、血清２２７）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ－ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ－ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ－ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
２．新生児血清１０μｌと、上記で段階希釈により調製した各ヘモグロビン含有溶液１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９８０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）におけるヘモグロビンの最終濃度は、２５ｍｇ／ｄｌ、１２．５ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌおよび２．５ｍｇ／ｄｌであった。
　また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（ヘモグロビン不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）４種および２００倍希釈液（ヘモグロビン不含）を作成した。
４．検量線作成で用いたＵｎａＧ－Ｈｉｓ　ＦＬＡＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．上述の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ－ｂｉｌ値を算出した。
（結果）
　ビリルビン標準液では、いずれのヘモグロビン濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
　新生児血清でも、いずれのヘモグロビン濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１１および図９（四角ドット：血清２２５、丸ドット：血清２２７）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［参考例７：ＵｎａＧ法による乳び含有検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
　本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、乳びの影響を検証した。
（乳び溶液の作成）
１．２０％（２０ｇ／１００ｍＬつまり２００ｍｇ／ｍＬ）イントラリポス輸液を用意した。
２．Ｂｕｆｆｅｒを用いて、２０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬのイントラリポス溶液を作成した。これによって、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％）、２０ｍｇ／ｍＬ（２％）、２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）および０．２ｍｇ／ｍＬ（０．０２％）のイントラリポス希釈系列を作成した。
（検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．１ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒを用いて段階希釈し、ビリルビン濃度が１．７１ｎｇ／μＬ、０．８５５ｎｇ／μＬ、０．４２７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとして、当該Ｂｕｆｆｅｒのみを用意した。３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧの４００ｐｍｏｌ／１５０μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ　１５０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５０μＬとを混合し、マイクロプレートリーダ測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。
（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．２種類の新生児血清（血清１７３、血清２００）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ－ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ－ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ－ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
２．新生児血清１０μｌと、上記で調製した各乳び溶液１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９８０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（乳び含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（乳び含有）におけるイントラリポス最終濃度は、０．１％、０．０１％、０．００１％および０．０００１％であった。
　また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（乳び不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（乳び含有）４種および２００倍希釈液（乳び不含）を作成した。
４．検量線作成で用いたＵｎａＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．上述の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ－ｂｉｌ値を算出した。
（結果）
　ビリルビン標準液では、いずれのイントラリポス濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
　新生児血清でも、いずれのイントラリポス濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１３および図１０（四角ドット：血清１７３、丸ドット：血清２００）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［参考例８：ＵｎａＧ法によるアスコルビン酸含有検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
　本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、アルコルビン酸の影響を検証した。
（アスコルビン酸溶液の作成）
１．アスコルビン酸 1000mgをBuffer 10mLに溶解し、100mg/mLのアスコルビン酸溶液を調製した。
２．Bufferを用いて、10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mLのアスコルビン酸溶液も調製した。これによって、１００ｍｇ／ｍＬ（１０％）、１０ｍｇ／ｍＬ（１％）、１ｍｇ／ｍＬ（０．１％）および０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１％）のアスコルビン酸希釈系列を作成した。
（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．参考例７と同じ新生児血清（血清１７３、血清２００）を用意した。
２．新生児血清１０μｌと、上記で調製した各アスコルビン酸溶液２００μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１７９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）におけるアスコルビン酸最終濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬであった。
　また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（アスコルビン酸不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）４種および２００倍希釈液（アスコルビン酸不含）を作成した。
４．参考例７の検量線作成で用いたＵｎａＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．参考例７の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ－ｂｉｌ値を算出した。
（結果）
　ビリルビン標準液では、いずれのアスコルビン酸濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
　新生児血清でも、いずれのアスコルビン酸濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１４および図１１（四角ドット：血清１７３、丸ドット：血清２００）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［参考例６－参考例８まとめ］
　以上より、検体中にヘモグロビン、乳び、およびアルコルビン酸のいずれが含まれていても、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定に悪影響がないことを確認した。したがって、検体中にヘモグロビン、乳び、およびアルコルビン酸のいずれが含まれていても、本発明へ適用可能であることが容易に推認される。
［参考例９：全血を用いたＵｎａＧ法（１）］
　本参考例から、新生児血液の一部から調製した血清試料と、他の一部である全血試料とを用いて、血球成分の影響を調べた。
　血清試料と全血試料とのそれぞれについて、参考例１と同様にしてマイクロプレートリーダでＵｎａＧの蛍光を検出し、非抱合ビリルビン値を３回測定した。下記表１５に示すように、ヘマトクリット値Ｈｔで補正することによって、全血でも非抱合ビリルビン値を測定することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　したがって、検体が全血であっても本発明へ適用可能であることが推認される。
［参考例１０：全血を用いたＵｎａＧ法（２）］
　新生児１８例から採取した全血２６検体について、参考例１と同様に検量線を作成し、ＵｎａＧ法によって非抱合型ビリルビン濃度を得た。また、当該全血２６検体それぞれから血清検体を調製し、血清検体について、参考例１と同様にＵｎａＧ法および酵素法によって非抱合型ビリルビン濃度を得た。
　得られた非抱合型ビリルビン濃度について、ＵｎａＧ法による全血中の濃度（Concentration in whole blood by the UnaG method）の、酵素法による血清中の濃度（Concentration in serum by BOD method）との相関を調べた。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、両検体／両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．７６ｘ＋０．３０、ｒ＝０．９６２、ｐ＜０．００１）。
　また、得られた非抱合型ビリルビン濃度について、ＵｎａＧ法による全血中の濃度（Concentration in whole blood by the UnaG method）の、ＵｎａＧ法による血清中の濃度（Concentration in serum by UnaG method）との相関を調べた。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、両検体によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．７３ｘ＋０．７７、ｒ＝０．９６２、ｐ＜０．００１）。
［参考例１１：ＵＢアナライザで測定した新生児血清のＵＢ／ＴＢ比の統計］
　抱合型ビリルビン濃度が高い６５検体（高ＤＢ）の新生児血清と、通常の抱合型ビリルビン濃度である２４５検体（通常ＤＢ）の新生児血清とを入手した。それぞれの検体を酵素法によって総ビリルビン濃度および抱合型ビリルビン濃度を測定した。それらの比（抱合型ビリルビン濃度／総ビリルビン濃度）の分布を以下の表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　それぞれの検体について、ＵＢアナライザを用いてアンバウンドビリルビン濃度を測定し、総ビリルビン濃度との相関を調べた。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、抱合型ビリルビン濃度／総ビリルビン濃度比が５％未満および５％以上１０％未満であればおおよそＴＢとＵＢとの関係は相関が取れている。しかしながら、当該比が１０％以上２０％未満となると相関は大きく崩れ、当該比が２０％以上となると相関の崩れはさらに顕著になる。
［実施例１：ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定］
　本実施例では、新生児血清を用いて、本発明の方法によってアンバウンドビリルビンの測定を行った。
（ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，　アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．８ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒで段階希釈し、ビリルビン濃度が１７．８ｎｇ／μＬ、８．９ｎｇ／μＬおよび４．４５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとしてＢｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ－Ｈｉｓ　ＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１９５μＬ溶液を作成した。（Ｈｉｓ　ＦＬＡＧは、量産用に付されたアフィニティ精製タグ）
４．ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１９５μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定した。測定値（最大蛍光強度）は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。
（標準液および新生児検体）
１．ビリルビン標準液および３種類の新生児血清（血清１７２、血清２１１、血清２１５）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ－ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ－ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ－ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（各試薬の作成）
１．アスコルビン酸１６００ｍｇをＢｕｆｆｅｒ１０ｍＬに溶解し、１６％（１６０ｍｇ／ｍＬ）アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
２．ＧＯＤ－ＰＯＤ酵素液５０μＬを酵素液希釈液９５０μＬに溶解し、２０倍希釈ＧＯＤ－ＰＯＤ溶液を作成した。
３．Ｂｕｆｆｅｒ１０ｍＬにＧｌｕｃｏｓｅ５００ｍｇを加え、５０ｍｇ／ｍｌＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
４．上述のＵｎａＧ法の検量線の作成に用いたＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１９５μＬ溶液（ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ溶液）を用意した。
（ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．５０ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬにビリルビン標準液２５μＬ（ＴＢ１７．８ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち２０μＬを別のチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ８０μＬを加え、さらに１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた。これによって、合計２００μＬの２０倍希釈０秒時点サンプルが得られた。
３．標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち別の２０μＬに２０倍希釈ＧＯＤ－ＰＯＤ溶液８０μＬを加え、３０秒後に１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた。これによって、合計２００μＬの２０倍希釈３０秒時点サンプルが得られた。
４．０秒時点サンプルと３０秒時点サンプルとから５μＬずつ採取し、ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１９５μＬを入れたウェル内に注入し、蛍光強度を測定した。この場合、各サンプルにつき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定し、最大蛍光強度の中央値を採用した（表１８参照）。
５．０秒時点サンプルの最大蛍光強度から検量線を作成した。
６．検量線を用いて、０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプルのｉＤ－ｂｉｌを算出した（表１８参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　上記の情報を下記式（Ｉ）にあてはめることによりＫ値を求めた。
　　　　　ΔiD-bil / ΔTime = K × [POD] × [U-bil] 　　　　　（Ｉ）
　その結果、Ｋ値は４．７７と算出された。
（ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法による血清のアンバウンドビリルビンの測定）
１．５０ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬに血清２５μＬを加え、血清－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。このとき、血清は２倍希釈相当であった。
２．血清－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち２０μＬに、Ｂｕｆｆｅｒ　８０μＬを加え（この時点で、血清は１０倍希釈相当）、さらに１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ　１００μＬを加えた（この時点で、血清は２０倍希釈相当、アスコルビン酸は８％）。これによって、合計２００μＬの０秒時点サンプルが得られた。
３．血清－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち他の２０μＬに２０倍希釈ＧＯＤ－ＰＯＤ溶液８０μＬを加え（この時点で、血清は１０倍希釈相当）、３０秒後に１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた（この時点で、血清は２０倍希釈相当、アスコルビン酸は８％）。これによって、合計２００μＬの３０秒時点サンプルが得られた。
　なお、分解反応時（つまりＧＯＤ－ＰＯＤ溶液８０μＬを加えた時）において、血清１０μＬに対し原液（ＧＯＤ－ＰＯＤ酵素液）ＧＯＤ－ＰＯＤ４μＬの量関係となった。また、分解反応液２００μＬあたりのＧＯＤ－ＰＯＤの量は０．５２Ｕとなった。
４．上記項目２および項目３で作成された０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプル２００μＬのうち５μＬずつ採取し、ＵｎａＧ溶液１９５μＬを入れたウェルに注入し（この時点で、血清は８００倍相当、アスコルビン酸は０．２％、ｐＨは７．１から７．２）、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。
５．各検体につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定し、最大蛍光強度の中央値を採用した（表１９参照）。
６．検量線を用いて、最大蛍光強度から、０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプルのｉＤ－ｂｉｌを算出した（表１９参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　ビリルビン標準液を用いて算出されたＫ値（４．７７）を用い、上記式（Ｉ）から、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビン値（[U-bil]）を求めた。その結果、それぞれの血清のアンバウンドビリルビン値は、血清１７２の場合で０．５１、血清２１１の場合で０．７５、血清２１５の場合で０．３２であった。
［実施例２：ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定］
　本実施例では、新生児血清を用いて、本発明の方法によってアンバウンドビリルビンの測定を行った。
（ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，　アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．７ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒで段階希釈し、ビリルビン濃度が４．４３５ｎｇ／μＬ、２．２１７５ｎｇ／μＬおよび１．１０８７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとしてＢｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ－Ｈｉｓ　ＦＬＡＧの１３２．４ｐｍｏｌ／μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１８０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列２０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定した。測定値（最大蛍光強度）は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。
（標準液および新生児検体）
１．ビリルビン標準液および４種類の新生児血清（血清１７９、血清１８０、血清１８１、血清１８５）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ－ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ－ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ－ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）およびアンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（各試薬の用意）
１．アスコルビン酸４００ｍｇをＢｕｆｆｅｒ４０ｍＬに溶解し、１％（１０ｍｇ／ｍＬ）アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
２．アローズ社ＵＢアナライザ用試薬であるＧＯＤ－ＰＯＤ溶液を用意した（下記表２１参照）。
３．アローズ社ＵＢアナライザ用試薬である１ｍｇ／ｍｌＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ（下記表２１参照）を用意した。
４．上述のＵｎａＧ法の検量線の作成に用いたＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧの１３２．４ｐｍｏｌ／μＬ溶液（ＵｎａＧ－ＨｉｓＦＬＡＧ溶液）を用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．１ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液２０μＬ（ｉＤ－ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液に、Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬを加え、さらに１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬを加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈サンプルが得られた。
３．８０倍希釈サンプルを２０μＬ採取し、ＵｎａＧ溶液１８０μｌをセットしたＵＢアナライザ内のウェルに加え、蛍光強度を測定した。
４．上記項目３の操作を３回行い、ＵｎａＧ溶液注入開始後１０分までの蛍光強度を測定した。
５．最大蛍光強度とｉＤ－ｂｉｌ濃度とから検量線を作成した。この場合、最大蛍光強度としては注入開始後１０分までの蛍光強度のうちの最大値であって、かつ中央値を採用した。
　結果、非抱合型ビリルビン濃度ｉＤＢ＝最大蛍光強度／２５５．９　という関係が導出された。つまり、図５の検量線と同等であることを確認した。
（０秒時点のｉＤ－ｂｉｌ測定）
１．　１ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液または血清２０μＬ（ｉＤ－ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液に、Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬと１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬとを同時に加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈０秒時点サンプルが得られた。
３．血清、Ｂｕｆｆｅｒ、アスコルビン酸混和前のサンプルおよびアスコルビン酸混和後のサンプルのＴＢ値をＵＢアナライザで測定し記録した。
（２０秒時点のｉＤ－ｂｉｌ測定）
１．　１ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液または血清２０μＬ（ｉＤ－ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液－Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液にＧＯＤ－ＰＯＤ溶液２５μＬを加え、２０秒後に１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬを加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈２０秒時点サンプルが得られた。
３．血清、Ｂｕｆｆｅｒ、アスコルビン酸混和前のサンプルおよびアスコルビン酸混和後のサンプルのＴＢ値をＵＢアナライザで測定し記録した。
　なお、血清１０μｌあたり原液ＧＯＤ－ＰＯＤ１２．５μｌとなり、１６００μＬの２０秒時点サンプルあたりＧＯＤ－ＰＯＤ３．２Ｕとなり、アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを加えた後のアスコルビン酸の終濃度は０．３５％となった。
（検討方法）
１．上記の０秒時点サンプル（以下、単に０秒サンプルと記載）および２０秒時点サンプル（以下、単に２０秒サンプルと記載）それぞれ１６００μｌのうち２０μｌずつを採取し、ＵｎａＧ溶液１８０μｌを入れたウェルに注入し、蛍光強度を測定した。この場合、８０倍希釈血清２０μｌを採取したこととなり、アスコルビン酸の終濃度は０．０３５重量％となり、ｐＨは７．３０以上７．３５以下の範囲となった。
２．各サンプルについて３回ずつ、注入開始後１０分までの蛍光強度を測定した。
３．最大蛍光強度から、０秒時点のｉＤ－ｂｉｌ（０秒値）および２０秒時点のｉＤ－ｂｉｌ（２０秒値）を算出した。
４．標準液の０秒値および２０秒値と、下記式（Ｉ）とから、Ｋ値を求めた。
　　　　　ΔiD-bil / ΔTime = K × [POD] × [U-bil] 　　　　　（Ｉ）
５．新生児血清の０秒値および２０秒値と、上記項目４で得られたＫ値と、上記式（I）とを用いて、U-bil値を求めた。
６．上記項目５で得られたU-bil値と、UBアナライザで測定したU-bil値の相関関係を調べた。
（参考）
　まず、上記と同様に３０秒時点サンプル（つまり２０秒後に１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを加えた場合のサンプル）を作成し、分解反応時間が２０秒（表２２参照）である場合と３０秒（表２３参照）である場合とでどちらがよりΔＴＢ％が安定するか検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　上記表２２および表２３より、分解反応時間が２０秒である２０秒サンプルを採用した。
（結果）
１．標準液
　標準液のＴＢ値とＵＢ値とを下記表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　記録した測定値を下記表２５に示す。なお、表２５において換算値とは、容量変化をもとに1600/1045を乗じて算出した値である（以下の表において同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表２６に示す。表２６が示すように、ＵＢアナライザによるＴＢ値およびＵｎａＧによるｉＤＢ値について、いずれもΔ％が２０％前後で安定していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　以下のようにＫ値を算出した。
　　　ΔTB/Δt=Kx[POD]x[UB]
　　　K=ΔTB/Δt/[POD]/[UB]
　　　Δtおよび[POD]はこの実験系では一定であることから1とすると
　　　K=ΔTB/0.71と算出された。
　なお、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法では、ｉＤＢ値とＴＢ値として使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
２．血清１７９
　血清１７９のＴＢ値とＵＢ値とを下記表２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　記録した測定値を下記表２９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
３．血清１８１
　血清１８１のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
　記録した測定値を下記表３２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
４．血清１８５
　血清１８５のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　記録した測定値を下記表３５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
５．血清１８０
　血清１８０のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　記録した測定値を下記表３８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
（ＵＢ値の導出）
１．下記表４０に、従来の測定方法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、２０秒時点のＴＢ値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／４．６５）とを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　さらに、図１５に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＴＢ値を基にしたＵＢ値（UB analyzer－0-20s）との相関を示す。図１５に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、ＧＯＤ－ＰＯＤ液を混和した後の、ＵＢアナライザを用いて測定されたＴＢ値の推移（０秒値と２０秒値とのΔＴＢ）に基づいてＵＢ値を算出できることが示された。
２．下記表４１に、従来の測定方法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／４．５１）とを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　さらに、図１６に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（UB analyzer－0-20s）との相関を示す。図１６に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、アスコルビン酸で反応停止後、ＵＢアナライザを用いて０秒値と２０秒値とのΔＴＢからＵＢ値を算出できることが示された。
　上記項目１および項目２より、ＵＢアナライザを用いた従来の測定方法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）では、ＧＯＤ－ＰＯＤ液を混和した後においてＴＢ値が９５％から７６％まで低下するまでにかかる時間からＵＢ値を算出していた（図１７（ａ）参照）が、本発明では、ＧＯＤ－ＰＯＤ液の混和時点から２０秒時点のΔＴＢ（比色法で測定）からでも、ＧＯＤ－ＰＯＤ液の混和時点から２０秒時点のΔｉＤＢ（ＵｎａＧ法で測定）からでも、ＵＢ値を算出できる（図１７（ｂ）参照）ことが示された。
３．下記表４２に、従来の測定方法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／５．４９）とを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　さらに、図１８に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。図１８に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、アスコルビン酸で反応停止させた後、ＵＢアナライザを用いてＵｎａＧ法でのｉＤＢ値に基づいてＵＢ値を算出できることが示された。
［実施例３：ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定（ＤＢ低値例）］
（検体）
　新生児３３例より採取した、ＤＢ低値（ＤＢ＜１．０ｍｇ／ｄＬ）の血清４５検体を検証した。３３例の症例背景を表４３に、４５検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表４４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
（非抱合型ビリルビンの測定－ＧＯＤ－ＰＯＤ法との比較）
　上記の４５検体を用い、実施例２と同様に、本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によりアンバウンドビリルビン（ＵＢ）の測定を行った。参考用に、上記の４５検体を用い、ＵＢアナライザ（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）によりＵＢの測定を行った。ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法とＧＯＤ－ＰＯＤ法とで測定されたＵＢ測定値の相関を調べた。その結果を図１９に示す。図１９に示すように両方法によって得られたＵＢ濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．８７６ｘ＋０．０７、ｒ＝０．９４７、Ｐ＜０．００１）。　
［実施例４：ＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定（ＤＢ高値例）］
（検体）
　新生児４例より採取した、ＤＢ高値（ＤＢ≧１．０ｍｇ／ｄＬ）の血清１１検体を検証した。１１検体の検体番号；症例番号（症例番号１はトリソミー１８、症例番号２および３は先天性サイトメガロウイルス感染症、症例番号３はメチルマロン酸血症）；在胎週数；出生体重（BW）；血清採取日齢；酵素法で測定された総ビリルビン値（T-bil(mg/dL)）、抱合型ビリルビン値（D-bil(mg/dL)）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン値（iD-bil(mg/dL)）と総ビリルビンに対する抱合型ビリルビンの比率（DB/TB(%)）；ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（TB(mg/dL)）およびアンバウンドビリルビン（非抱合型ビリルビン）値（UB(μg/dL)）；ならびにアルブミン値（Alb(g/dL)）を、表４５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
（非抱合型ビリルビンの測定－ＧＯＤ－ＰＯＤ法との比較）
　上記の１１検体を用い、実施例２と同様に、本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によりアンバウンドビリルビン（ＵＢ）の測定を行った。従来の測定方法（ＧＯＤ－ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を調べた。その結果を図２０に示す。図２０においては、１１検体の結果（Ｘドットでプロット）を実施例３の図１９に重ねて示している。
　図２０に示すように、ＤＢ高値例の本実施例では、ＤＢ低値例の実施例３とはプロットの分布が異なり、従来のＧＯＤ－ＰＯＤ法では比較的高値を示す傾向が明らかとなった。
［ｉＤＢ／Ａｌｂ比とＵＢとの関係］
　実施例３での低ＤＢ値（ＤＢ＜１．０ｍｇ／ｄＬ）の検体と、実施例４での高ＤＢ値（ＤＢ≧１．０ｍｇ／ｄＬ）の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比とＵＢ値との関係を調べた。その結果を図２１および図２２に示す。図２１は、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値との関係を示し、図２２は、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と、本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によるＵＢ値との関係を示す。なお、図２１および図２２では、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比が０．６以下である検体、具体的には低ＤＢ値の４０検体（●ドットでプロット）および高ＤＢ値の１１検体（×ドットでプロット））について示している。
　図２１に示すように、従来のＧＯＤ－ＰＯＤ法によると、低ＤＢ値の４０検体では良好な相関関係（ｒ＝０．８４９、Ｐ＜０．００１）が認められたが、高ＤＢ値の１１検体では相関関係は不良（ｒ＝０．３７５、ｐ＝０．２５５）であった。
　一方、図２２に示すように、本発明のＧＯＤ－ＰＯＤ－ＵｎａＧ法によると、低ＤＢ値の４０検体で良好な相関関係（ｒ＝０．８７４、Ｐ＜０．００１）が認められた上に、高ＤＢ値の１１検体でも良好な相関関係（ｒ＝０．８９５、ｐ＜０．００１）が認められた。
　本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。

 

Claims (22)

  1. 　非抱合型ビリルビンおよび抱合型ビリルビンを含む血液試料を、前記非抱合型ビリルビンのうちのアンバウンドビリルビン、および前記抱合型ビリルビンの酸化分解反応に供する分解工程（i）と、
    　前記酸化分解反応を停止して試料分解物を得る分解停止工程（ii）と、
    　前記試料分解物と、前記血液試料が前記酸化分解反応に供されなかった未反応試料とを、それぞれ別個に、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる接触工程（iii）と、
    　前記試料分解物と前記未反応試料とのそれぞれについて、前記ポリペプチドに起因する蛍光を検出し、前記蛍光の差から前記アンバウンドビリルビンの量を導出する検出工程（iv）と、を含む、血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  2. 　前記血液試料が早産児由来の血液試料である、請求項１に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  3. 　前記血液試料の血清総ビリルビン濃度が８ｍｇ／ｄＬ以上である、請求項１または２に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  4. 　前記血液試料の前記抱合型ビリルビン濃度が１ｍｇ／ｄＬ以上である、請求項１から３のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  5. 　前記酸化分解反応の停止を抗酸化物質の添加によって行う、請求項１から４のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  6. 　前記抗酸化物質がアスコルビン酸である、請求項５に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  7. 　前記酸化分解反応の停止を、分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下の時点で行う、請求項１から６のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  8. 　前記抗酸化物質は、前記分解停止工程（ii）の反応系において０．１重量％以上となるように添加される、請求項５から７のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  9. 　前記抗酸化物質がアスコルビン酸である場合、前記アルコルビン酸は前記分解停止工程（ii）の反応系において３２重量％以下となるように添加される、請求項８に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  10. 　前記アスコルビン酸は、前記接触工程（iii）の反応系において０．８重量％以下となるように希釈される、請求項６から９のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  11. 　前記分解工程（i）の反応系における前記血液試料の希釈率が、血清換算値で５倍以上１２０倍以下である、請求項１から１０のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  12. 　前記分解工程（i）において、前記酸化分解反応が、グルコースオキシダーゼの存在下でグルコースから生じさせた過酸化水素とペルオキシダーゼとにより進行させるものであり、前記酸化分解反応の反応系において、前記グルコースオキシダーゼおよび前記ペルオキシダーゼ量が、それぞれ、血清１μＬに対して０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下である、請求項１１に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  13. 　前記血液試料が全血試料である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  14. 　前記検出工程（iv）において、ヘマトクリット値による補正を行って前記アンバウンドビリルビンの量を導出する、請求項１３に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
  15. 　反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含むインキュベータと、
    　前記反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液の添加を行う試薬液添加部と、
    　前記対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液の添加を行う試薬ブランク液添加部と、
    　前記試薬液添加部および前記試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動するタイマーと、
    　前記タイマーの計測時間に基づいて制御されかつ前記反応用容器および前記対照用容器それぞれに酸化分解停止剤の添加を行う停止剤添加部と、
    　前記反応用容器の内容物および前記対照用容器の内容物それぞれを混和する混和部と、
    を含む、アンバウンドビリルビン測定用試料調製装置。
  16. 　請求項１５に記載のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置と、
    　前記酸化分解停止剤が添加された前記反応用容器の内容物および前記対照用容器の内容物それぞれに蛍光特性を示すポリペプチドが添加された蛍光測定用試料について蛍光測定を行う蛍光測定部と、
    　少なくとも前記反応用容器の内容物の蛍光値と前記対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する演算処理部と、
    　導出された前記アンバウンドビリルビン値を表示する出力部と、
    を含む、アンバウンドビリルビン測定装置。
  17. 　前記酸化分解停止剤の添加後に前記反応用容器および前記対照用容器それぞれから内容物を測定用容器に分取する分取部と、
    　前記測定用容器に蛍光特性を示すポリペプチド液を添加する添加部と、
    をさらに含む、請求項１６に記載のアンバウンドビリルビン測定装置。
  18. 　アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、
    　前記酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、
    　非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、
    を少なくとも含む、アンバウンドビリルビン測定キット。
  19. 　グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含む、請求項１８に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
  20. 　前記酸化還元酵素がペルオキシダーゼである、請求項１８または１９に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
  21. 　前記酸化分解停止剤が抗酸化物質である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
  22. 　前記抗酸化物質がアスコルビン酸である、請求項２１に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
     
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