JP2021124484A - 測定用尿試料の作製方法と尿試料中のビリルビン濃度の測定方法 - Google Patents
測定用尿試料の作製方法と尿試料中のビリルビン濃度の測定方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】尿試料中に含まれるビリルビンの濃度を測定するための測定用尿試料の作製方法であって、(1) 動物から得られた尿試料に、非抱合型ビリルビンに対し特異的に結合して蛍光を発する種の蛍光タンパク質に接触させて、反応済尿試料を得る工程(接触工程 (i))、と、(2) 得られた反応済尿試料に対し可視光を照射して、測定試料を得る工程(照射工程 (ii)) と、を有する。
【選択図】図1
Description
(1)動物から得られた尿試料に、非抱合型ビリルビンに対し特異的に結合して蛍光を発する種の蛍光タンパク質に接触させて、反応済尿試料を得る工程(=接触工程(i))と、
(2)得られた反応済尿試料に対し可視光を照射して、測定試料を得る工程(=照射工程(ii))と、を有することを特徴とする。
励起波長(nm):450〜525
最大励起波長 (nm):498〜499
蛍光波長(nm):500〜600
最大蛍光波長 (nm):525〜530(緑色)
モル吸光係数 (M-1cm-1):50000〜78000
量子収率 (%):50〜54
蛍光寿命 (ナノ秒):2.2
新生児高ビリルビン血症の症例に対して黄疸治療のための光療法を行った。黄疸の治療の目的は、血液中のビリルビンを低下させることである。
2017年10月1日から2019年11月30日までに在胎34週未満で出生した76の早産児を、奈良県立医科大学病院の新生児集中治療部門の研究に登録した。47例を青色LEDの光療法器で、18例をそれ以外の光療法器で治療した。また、11例が光療法を要さなかった。青色 LEDの光療法器で治療した47例と光療法を要さなかった11例、計58例を対象とした。そのうち、光療法の前に尿を採取できなかった8例、光療法の開始から12±6時間以内に尿を採取できなかった7例、及び光療法の開始20時間以内に光強度と波長を変更した19例、生後7日までに死亡した1例、重篤な頭蓋内出血を生じた3例も研究対象から除外した。その結果、20人の早産児がこの研究の対象となった。児は全例、閉鎖式保育器に収容し、保育器は光療法を受けている間を除き、キルテイングカバーで遮光した。溶血性疾患、感染症、抱合型ビリルビン値の上昇、消化器疾患又は先天異常の症例はなかった。この研究は、当機関の倫理委員会(承認番号1033) によって承認され、児が研究に参加する前にすべての家族からインフォームドコンセントを取得した。
光療法は、井村の基準 (Imura S. Phototherapy of neonataljaundice: its indication and prevention of adverse effects. 1985 43(8):1741-8. Nihon Rinsho. (Japanese)) に従って開始した。即ち、出生体重と出生後時間に規定された血清総ビリルビン値を超えたときに光療法を開始した。そして、溶血、呼吸窮迫、アシドーシス (pH <7.25)、低体温(直腸温で1時間以上35℃未満)、血清総タンパク質が5.0g/dL未満の低タンパク血症、低血糖又は感染症といったビリルビン脳症の危険因子が存在する場合はワンランク下の出生体重の基準に下げて光療法した。
出生当日から尿を採取するため、ポリエチレンパック (Atom Urine Collector for premature baby (登録商標): Atom Medical International, Inc., Tokyo, Japan) を外性器に貼付、又は小綿球(染みた尿を抽出する)数個をおむつの中の外性器の近くに置き、尿を1日に2回採取し、直ちにマイクロチューブ (ST-0150R; INA・OPTICA Co., LTD, Osaka, Japan) に移し、測定まで-70℃で冷凍保存した。
本実施例では、ウナギ筋肉由来の非抱合型ビリルビン (ZZ-B) 誘導性蛍光タンパク質UnaGを使用した。
黒色マイクロプレート (Microtest TM 96ウェルアッセイプレート、黒色、平底、BD Biosciences、ニュージャージー、米国)を準備した。そして1ウェルあたり50μLのUnaG溶液(最終UnaG濃度2μM) 、50μLの尿試料液又は標準検量線を描くために使用する希釈ビリルビン溶液、50μLの最終濃度0.1%ヒト血清アルブミン(アルブミン20%IV 4g/20ml“JB”;日本血液製剤機構、東京、日本)、50μLの最終濃度0.1% アスコルビン酸水溶液(L(+)-Ascorbic Acid; FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., 大阪、日本)を含む200μL反応混合液とした。蛍光分光光度計 (SpectraMax L&M2(Molecular Devices、LLC., California, USA))とそれぞれ498及び527 nmの励起および蛍光波長用の蛍光フィルターとを用いて、37℃の温度条件下で各ウェルにおける蛍光測定をした。
特注の青色光LEDユニット (波長範囲は420-520 nmで、ピーク放射は450 nm、15.8 mW/ cm2; P4630 LEDユニット:Ushio Inc.、Tokyo、Japan) から放出される光を、1ウェルあたり50μLのUnaG溶液(最終UnaG濃度が2μM)、50 μLの0.1%最終濃度アルブミン、50μLの最終濃度0.1% アスコルビン酸水溶液、尿サンプル50μLの計200μL反応混合液をマイクロプレートに照射して、蛍光測定をした。また、間歇的に尿中ビリルビン濃度(UnaGで捕捉)を蛍光測定した (240分まで15〜30分ごと) 。尿中ビリルビン濃度(UnaGで捕捉)は、このような断続的な測定値のうち最も高い蛍光強度を示した値を標準曲線により導出されたビリルビン濃度に換算して算出した。また、計算の基礎となる標準曲線の信頼性は、R2> 0.9であった。
測定された数値はすべて、中央値(範囲)で表した。両群の平均間の差の有意性はMann-Whitney U検定を用いて検定し、有意性はp <0.05と定義した。データは、日本語Windows用のStatFlex ver.6 (Artec Inc.、大阪、日本) を使用して分析した。
図2は、接触工程で得られた尿試料に光照射(光刺激)を加えず、尿試料中のビリルビン濃度(UnaGで捕捉)からの検出光を検出した図である。図2に示されるように、光療法を行った新生児の尿試料から得られた検出光は、光療法を行っていない新生児の尿試料から得られる検出光と比較しても微増を示すのみであった。これは光療法を行った新生児から排泄された尿試料中のビリルビンの一部は、室温でUnaGと結合するZZ-Bに光学異性化を起こすものの、残り大半を占める尿中のビリルビン光学異性体は温度刺激だけではUnaGと結合できる光学異性化を起こさないからであると考えられた。また、生後時間による尿中ビリルビン濃度(UnaGで捕捉)の変化を図2に示した。両群で、尿中ビリルビン濃度(UnaGで捕捉)は生後時間が経過するにつれて高くなった。これはヒトの尿においてEZ-Cよりも量は少ないが同様に排泄されるZE-Bについては、室温でUnaGと結合するZZ-Bに回帰した(非特許文献3)ものを捉えたと推察した。また、尿中ビリルビン濃度(UnaGで捕捉)は光療法の有無にかかわらず生後時間の経過とともに上昇していた。それは、赤血球の自然破壊に伴うビリルビン産生量の増加と胎盤の離脱に伴い児自身でビリルビンを処理する必要性が生じたが、その処理能の低さのため循環するビリルビンが増加したことに起因したと考えた。
光療法を行った新生児の尿試料に、非抱合型ビリルビンZZ-Bに対し特異的に結合して蛍光を発する蛍光タンパク質であるUnaGを加え、その後、この尿試料に450nm(青色領域波長)の励起光を照射し、蛍光の検出光を検出することによりビリルビン濃度の検出を試みた。
本願発明では、尿試料に可視光を照射する前に、尿試料に蛍光タンパク質を接触させている。実施例3では尿試料に蛍光タンパク質UnaGを接触させるタイミングを検討した。
Claims (14)
- 尿試料中に含まれるビリルビンの濃度を測定するための測定用尿試料の作製方法であって、動物から得られた尿試料に、非抱合型ビリルビンに対し特異的に結合して蛍光を発する種の蛍光タンパク質に接触させて、反応済尿試料を得る工程(接触工程 (i)) と、得られた反応済尿試料に対し可視光を照射して、測定試料を得る工程(照射工程(ii))と、を有することを特徴とする測定用尿試料の作製方法。
- 前記接触工程 (i) は、前記照射工程 (ii) の前に行われる、ことを特徴とする請求項1記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記尿試料はヒト新生児から採取したものであることを特徴とする請求項1又は2に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記ヒト新生児は、前記尿試料を採取する前に黄疸治療のための光療法を受けていることを特徴とする請求項3記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記ヒト新生児から採取した尿試料は希釈尿試料として調整されていて、希釈率は、遠心後上清換算値で1倍以上25倍以下であることを特徴とする請求項3又は4記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記接触工程 (i) において、ビリルビンの照射工程(ii)での光酸化分解反応を抑制するために抗酸化物質を添加し、且つ、ビリルビンの光学異性化反応を安定させるためにアルブミン製剤を添加することを特徴とする請求項1乃至5の何れか1項に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記抗酸化物質がアスコルビン酸であることを特徴とする請求項6記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記接触工程 (i) において用いる蛍光タンパク質がUnaGであることを特徴とする請求項1乃至7の何れか1項に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記照射工程 (ii) で照射する可視光のスペクトルの主成分は青色波長400〜500nmの少なくとも一部の光を含むことを特徴とする請求項1乃至8の何れか1項に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記照射工程 (ii) での照射に供する機器はLEDであることを特徴とする請求項1乃至9の何れか1項に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 前記照射工程 (ii) で行う照射時間は、前記尿試料に前記蛍光タンパク質が接触後は60分間以内とすることを特徴とする請求項1乃至10の何れか1項に記載の測定用尿試料の作製方法。
- 請求項1乃至11の何れか1項の方法で得られた測定用尿試料に対して、所定の波長光を励起光として照射し、光照射の結果得られる検出光を検出することによりビリルビン濃度を導出する工程(検出工程 (iii)) を有することを特徴とする尿試料中のビリルビン濃度の測定方法。
- 前記検出工程(iii)で使う励起光は、波長450nm以上525 nm以下の波長範囲の中にある光を少なくとも含んでおり、
前記検出光は、少なくとも波長510 nm以上560 nm以下の光を含んでいる
ことを特徴とする請求項12に記載の尿試料中のビリルビン濃度の測定方法。 - 上記励起光は、波長470nm以上507 nm以下の波長範囲の中にある光を少なくとも含んでおり、
上記検出光は、波長520 nm以上545 nm以下の波長範囲の中にある光を少なくとも含んでいることを特徴とする請求項13に記載の尿試料中のビリルビン濃度の測定方法。
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内田優美子、外7名: "蛍光タンパク質「UnaG」を用いた新生児の尿中ビ リルビン測定", 日本新生児成育医学会雑誌, vol. 29, no. 3, JPN6023040180, 2017, JP, pages 617, ISSN: 0005221179 * |
内田優美子、外7名: "蛍光タンパク質「UnaG」を用いた早産児の尿中ビリルビン", 日本新生児成育医学会雑誌 , vol. 30, no. 3, JPN6023040181, 2018, JP, pages 695, ISSN: 0005221180 * |
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