JP2001507790A - ビリルビンアルブミン結合の測定 - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方 法: (a)前記試料の第1アリコート中の抱合および未抱合ビリルビン濃度を測定 し; (b)前記試料の第2アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量 の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触 媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約50% 未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な 条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記第2ア リコート試料の前記希釈は容量で約3:1未満であり; (c)前記所定時間で酸化反応を停止させ、酸化後の前記第2アリコートに残 存する抱合および未抱合ビリルビンを測定し;次いで (d)以下の式: bss=−Bo・Log(Bt/Bo)/(希釈率・Kp・P・t) [式中、bssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり; Boは、前記血清試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は工程(a )で測定されたものであり; Btは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン 酸化後に残存する、前記試料中の 未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前記工程(c)で測定されたものであり ; 希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であ り; tは酸化反応に対する所定の反応時間であり; Pは標準化触媒試薬の濃度であり;そして Kpは、アルブミン、あるいはビリルビンに結合できる他の分子の不存在下で の前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する1次速度定数である。] の計算から、bssで示される定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度を測定する。 2.以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方 法: (a)前記試料中の未抱合ビリルビン(Bo)の濃度を測定し; (b)前記試料の第2アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量 の標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触 媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約50% 未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な 条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記アリコ ート試料の前記希釈は容量で約3:1未満であり; (c)前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第2 アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度(Bt)を測定 し; (d)前記工程(b)のものと同容量の前記試料の第3アリコートを、添加触 媒試薬の不存在下、工程(b)と同一時間で酸化試薬および緩衝液と混合し、次 いで前記第3アリコート中の未酸化未抱合ビリルビンの濃度を測定し、それによ り添加された緩衝液の量は工程(b)で添加された触媒試薬の量と等容量で、か つ添加された酸化試薬の容量および濃度は工程(b)で用いられたものと等しく し;次いで (e)以下の式: bss=−[Bo・Log((Bo−Bb+Bt)/Bo)]/(希釈率・Kp・P・t) [式中、bssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり; Boは、前記血清試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は工程(a )で測定されたものであり; Btは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン 酸化後に残存する、前記血清試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前 記工程(c)で測定されたものであり; Bbは標準化触媒試薬の不存在下におけるバックグラウンド酸化であり; 希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であ り; tは酸化反応に対する所定の反応時間であり; Pは標準化触媒試薬の濃度であり;そして Kpは、前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する1次速度定数であ る。] の計算からbssで示される定常状態未抱合非アルブミン結合ビリルビン濃度を測 定する。 3.以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方 法: (a)前記試料の第1アリコート中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測 定し; (b)前記試料の第2アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量 の第1標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化 を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約5 0%未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有 効な条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記ア リコート試料の前記希釈は容量で約3:1未満であり; (c)前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第2アリコート試料中の未酸 化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し; (d)第3アリコートにおいて第2の量の同一触媒試薬を用いて工程(b)お よび(c)を反復し、前記触媒試薬の第2の量は触媒試薬の第1の量とは異なる もので あり; (e)前記工程(b)のものと同容量の前記試料の第4アリコートを、添加触 媒試薬の不存在下、工程(b)と同一時間で酸化試薬および緩衝液と混合し、次 いで前記第4アリコート中の未酸化未抱合ビリルビンの濃度を測定し、それによ り添加された緩衝液の量は工程(b)で添加された触媒試薬の量と等容量で、か つ添加された酸化試薬の容量および濃度は工程(b)で用いられたものと等しく し;次いで (f)以下の方程式: bss1=−[Bo・Log((Bo−Bb+Bt1/Bo)]/(希釈率・Kp・P1 ・t1) bss2=−[Bo・Log((Bo−Bb+Bt2/Bo)]/(希釈率・Kp・P2 ・t2) を用いて、2つの触媒試薬濃度における定常状態未抱合未結合濃度を決定し、次 いで、方程式: からk-1、Boおよびk1・aを決定し、次いで、方程式 から平衡未結合未抱合ビリルビンbeqを決定する。 [式中、bss1は触媒試薬の第1濃度における第1定常状態未抱合未結合アルブ ミン濃度であり; bss2は触媒試薬の第2濃度における第2定常状態未抱合未結合アルブミン濃 度であり; P1は第1触媒試薬濃度であり; P2は第2触媒試薬濃度であり; Boは前記血清試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は前記工程( a)で測定され; Bbは標準化触媒試薬不存在下でのバックグラウンド酸化であり; Bt1およびBt2は、各々、触媒試薬存在下での酸化試薬による所定時間のビリ ルビン酸化後の前記工程(c)および工程(d)からの未抱合ビリルビン濃度で あり; 希釈率は酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり; t1およびt2は、独立して、酸化反応の所定の反応時間であって、t1および t2は同一であっても異なっていてもよく; Kpは前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化についての一次速度定数であ り; k-1はアルブミンからのビリルビンの解離速度定数であり; k1はアルブミンとビリルビンの会合速度定数であり; aは未結合アルブミンの濃度であり;そして beqは未結合未抱合ビリルビンの平衡濃度である。] 4.以下の工程を含む、試料中の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方 法: (a)前記試料の第1アリコート中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測 定し; (b)前記試料の第2アリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量 の第1標準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化 を触媒する一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約5 0%未満となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有 効な条件下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記ア リコート試料の前記希釈は容量で約3:1未満であり; (c)前記所定時間で酸化反応を停止させ、前記第2アリコート試料中の未酸 化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し; (d)第3アリコートにおいて第2の量の同一触媒試薬を用いて工程(b)お よび(c)を反復し、前記触媒試薬の第2の量は触媒試薬の第1の量とは異なる ものであり; (e)以下の方程式: bss1=−[Bo・Log(Bt1/Bo)]/(希釈率・Kp・p1・t1) bss2=−[Bo・Log(Bt2/Bo)]/(希釈率・ Kp・P2・t2) を用い、2つの触媒試薬濃度における定常状態未抱合未結合アルブミン濃度を決 定し、次いで、方程式: からk-1、Boおよびk1・aを決定し、次いで、方程式 から平衡未結合未抱合ビリルビンbeqを決定する。 [式中、bss1は触媒試薬の第1濃度における第1定常状態未抱合未結合アルブ ミン濃度であり; bss2は触媒試薬の第2濃度における第2定常状態未抱合未結合アルブミン濃 度であり; P1は第1触媒試薬濃度であり; P2は第2触媒試薬濃度であり; Boは前記血清試料中の未抱合ビリルビン濃度であって、その値は前記工程( a)で測定され; Bbは標準化触媒試薬不存在下でのバックグラウンド酸化であり; Bt1およびBt2は、各々、触媒試薬存在下での酸化試薬による所定時間のビリ ルビン酸化後のる前記工程(c) および工程(d)からの未抱合ビリルビン濃度であり; 希釈率は酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であり; t1およびt2は、独立して、酸化反応の所定の反応時間であって、t1および t2は同一であっても異なっていてもよく; Kpは前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化についての一次速度定数であ り; k-1はアルブミンからのビリルビンの解離速度定数であり; k1はアルブミンとビリルビンの会合速度定数であり; aは未結合アルブミンの濃度であり;そして beqは未結合未抱合ビリルビンの平衡濃度である。] 5.以下の工程を含む、全ビリルビン濃度が既知の新生児から得られた試料中 の未結合未抱合ビリルビンの濃度を測定する方法: (a)前記試料のアリコートをビリルビン酸化試薬および触媒的に有効量の標 準化触媒試薬と混合し、ここで、前記酸化試薬によるビリルビンの酸化を触媒す る一次速度定数は、酸化されたビリルビン量が全ビリルビン濃度の約50%未満 となるように充分に短い所定時間で未抱合ビリルビンを酸化するのに有効な条件 下で予め測定されており、酸化試薬および触媒試薬の添加による前記アリコート 試料の前記希釈は容量で約3:1未満であり; (b)前記所定時間で酸化反応を停止させ、酸化後の 前記アリコート試料中の未酸化の抱合および未抱合ビリルビンの濃度を測定し; (c)以下の式: bss=−Bo・Log(Bt/Bo)/(希釈率・Kp・P・t) [式中、bssは定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度であり; Boは、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり; Btは、標準化触媒試薬存在下における酸化試薬による所定時間のビリルビン 酸化後に残存する、前記試料中の未抱合ビリルビン濃度であり、その値は前記工 程(b)で測定されたものであり; 希釈率は、試料への酸化試薬および触媒試薬の添加から得られた試料希釈であ り; tは酸化反応に対する所定の反応時間であり; Pは標準化触媒試薬の濃度であり;そして Kpは、アルブミン、あるいはビリルビンに結合できる他の分子の不存在下で の前記酸化試薬によるビリルビンの触媒酸化に対する1次速度定数である。] の計算から、bssで示される定常状態未抱合未結合ビリルビン濃度を測定する。 6.Bo−Bbが有意にBt未満であって、Btに対するBo−Bbの値がほぼ0で ある請求項2または3に記載の方法。 7.前記触媒試薬がペルオキシダーゼであって、かつ、前記酸化試薬がペルオ キシドである請求項1〜5のいず れか1に記載の方法。 8.前記ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼである請求 項7に記載の方法。 9.前記試料中の抱合および未抱合ビリルビンの濃度が以下のようにして測定 される請求項1〜4のいずれか1に記載の方法: (a)第1容器中で、前記試料中の抱合ビリルビンの全量との着色複合体を形 成するのに十分な時間、前記血清試料のアリコートと有効量のジアゾ試薬を混合 し、その濃度を測定し; (b)前記第1容器に反応促進に有効量のアクセレレータを添加し、未抱合ビ リルビンと反応して第2の着色複合体を形成するのに十分な時間、前記アクセレ レータを(a)の生成物と混合し、次いで抱合および未抱合ビリルビンの濃度を 決定する。 10.以下の工程を含む、緩衝化血清試料中の抱合および未抱合ビリルビンの 濃度を測定する請求項2または3に記載の方法: (a)第1容器中で、前記試料中の抱合ビリルビンの全量との着色複合体を形 成するのに十分な時間、前記血清試料のアリコートと有効量のジアゾ試薬を混合 し、その濃度を測定し; (b)前記第1容器に反応促進に有効量のアクセレレータを添加し、未抱合ビ リルビンと反応して第2の着色複合体を形成するのに十分な時間、前記アクセレ レータ を(a)の生成物と混合し、次いでBoで示すその濃度を決定し; (c)第2の容器に第2アリコート試料、ペルオキシド、および、ベルオキシ ドによるビリルビンのペルオキシダーゼ触媒酸化に対する所定の一次速度定数を 有する触媒的に有効量の標準化ペルオキシダーゼ溶液を添加し、これを未抱合ビ リルビンを酸化するのに有効な条件下で所定の時間混合し、前記酸化された未抱 合ビリルビンは全ビリルビン濃度の約50%未満であって、ペルオキシドおよび ペルオキシダーゼの添加による前記第2アリコート試料の希釈率は容量で約3: 1未満であり; (d)前記試料中の未抱合ビリルビンの全量と着色複合体を形成するのに十分 な時間、工程(c)の生成物にジアゾ試薬を添加し、その濃度を測定し; (e)反応促進に有効量のアクセレレータを第2容器に添加し、残存する未抱 合ビリルビンと反応するのに十分な時間、工程(d)の生成物と混合し、次いで 、Btで示す酸化未抱合ビリルビンの量をそれから測定し; (f)第3の容器において、添加ペルオキシダーゼ不存在下で、工程(c)で 添加されたペルオキシダーゼの量と等容量のさらなる緩衝液溶液、および前記血 清血漿のアリコート試料とペルオキシドを混合し、前記血清試料およびペルオキ シドの容量は工程(c)で用いたものと同一であり、工程(c)の混合と同一時 間、前記溶液を混合し; (g)工程(d)および(e)で用いたと同一量のジアゾ試薬および同一量の アクセレレータを前記第3の容器に各々添加し、それから、前記試料中に存在す るBbで示す未酸化未抱合ビリルビンの量を測定し;次いで、 (h)定常状態未抱合非アルブミン結合ビリルビン濃度を決定する。 11.前記ジアゾ試薬が酸存在下での芳香族アミンと亜硝酸塩との反応によっ て形成されるものである請求項9に記載の方法。 12.前記芳香族アミンがスルファニル酸である請求項11に記載の方法。 13.前記アクセレレータがメタノールである請求項9に記載の方法。 14.前記試料中の未抱合ビリルビンの濃度が以下のようにして測定される請 求項5に記載の方法: 未酸化未抱合ビリルビンと反応して着色複合体を形成させるのに十分な時間、 有効量のアクセレレータおよびジアゾ試薬を前記試料に添加し、それにより前記 試料中の未抱合ビリルビンの濃度を測定する。 15.前記ジアゾ試薬が酸存在下での芳香族アミンと亜硝酸塩との反応によっ て形成されるものである請求項14に記載の方法。 16.芳香族アミンがスルファニル酸である請求項15に記載の方法。 17.前記アクセレレータがメタノールである請求項 14に記載の方法。 18.ペルオキシダーゼの濃度が約1〜150μg/mLの範囲である請求項 1〜5のいずれか1に記載の方法。 19.前記アリコート中に存在する試料の容量が約10μL以上であって約1 00μL未満である請求項1〜5のいずれか1に記載の方法。 20.前記試料が哺乳動物からの血清または血漿である請求項1〜5のいずれ か1に記載の方法。 21.前記哺乳動物がヒトである請求項20に記載の方法。
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