JP2009139315A - 血圧調節剤のスクリーニング方法及び評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトを除くモデル動物に候補物質を投与する工程と、当該モデル動物の血中におけるジヒドロビオプテリン濃度を測定する工程とを含み、上記候補物質によりジヒドロビオプテリン濃度が増加した場合には当該候補物質に血圧上昇作用があると判定し、上記候補物質によりジヒドロビオプテリン濃度が減少した場合には当該候補物質に血圧降下作用があると判定する。
【選択図】なし
Description
本実施例では、血中の血中BP類量及び窒素酸化物量と血圧値との関係を検討した。
本試験には降圧薬等を服薬していない健常男性16名を検査対象者とした。本試験における採血時間は、日内変動による本試験測定項目への影響を考え、午前9時から9時半の間に行った。また、食事摂取内容変動による測定結果への影響を避ける為に、全対象者は3日前より禁酒を、さらに、前日は同じ夕食を摂取した。さらに採血当日、全対象者は水以外の摂取を控え、採血1時間前より全ての飲食を控えた。なお、全対象者は、採血12時間前に食事は済ませた。
検査対象者は、測定前10分間の安静を経て、全自動血圧計(TM-2655VP:A&D CO.,LTD製)を用いて血圧を2回測定した。得られた血圧の平均値を測定結果として用いた。
検査対象者から採血した血液試料からNOx測定用血漿試料を調製した。NOx測定用血漿試料は、100%メタノールと1:1と混合し4℃、10,000 xgで、20分間遠心し、除タンパクした。その後、Griess試薬反応を利用したHPLCシステム(ENO-20; Eicom社製)を用いて上清に含まれる総窒素酸化物量を測定し、血漿中酸化窒素量を算出した。
検査対象者から採血した血液試料を用いて、血中に含まれるBP類を測定した。本測定は、全対象例において血中BP類量の測定は、BP類の測定方法を開示する文献(T. Fukushimaら Anal Biochem(1980)102;176-188)に記載された方法に準拠して行った。当該文献によれば、還元型BP類(即ちBH4)量は、酸性条件下におけるヨウ素酸化反応から求められる総BP類量(還元型BP類量と酸化型BP類量との和)とアルカリ性条件下におけるヨウ素酸化反応から求められる酸化型BP類量から算出した。BP類の存在比率は、還元型BP類量(BH4)/酸化型BP類量(BH2)として表記した。
BP類測定用血漿試料200μLに、40μL 1N HCl、及び、100μLヨウ素酸化液(1% I2、2% KI)を添加し、混合した。室温、暗所にて1時間静置後、20μL 5%アスコルビン酸、及び、40μL 蒸留水を加え、反応を停止した。反応後、サンプルは限外ろ過(Microcon 10NMWL:Millipore Corp., Bedford, MA, USA)し、ヨウ素酸化物を含むろ液をHPLC試料とした。
検査対象者から採血した血液試料からBP類測定用血漿試料を調製した。そしてBP類測定用血漿試料200μLに、40μLの1N NaOH及び100μLヨウ素酸化液(1% I2、2% KI)を添加し、混合した。室温、暗所にて1時間静置後、20μL 5%アスコルビン酸及び40μLの 2N HClを加え、反応を停止した。反応後、サンプルは限外ろ過し、ヨウ素酸化物を含むろ液をHPLC試料とした。
得られたHPLC試料50μLをHPLCシステム(Shimadzu社製)を用いて解析し、血漿中に含まれるBP類量及びBH4/BH2を算出した。HPLCシステム概要は下に記す。サンプルは50μLをinertsil ODS-3カラム(4.6 x 250 mm, GL Science社製)に注入し、カラム温度35℃下で、2種類の溶離液50mmol/L 酢酸/蒸留水(pH 3.0)と50mmol/L 酢酸/メタノールを用い、リニアグラジュエント下、流速0.5 mL/minで溶離した。検出は励起波長350nm、蛍光波長450nmで行った。
(HPLCシステム概要)
システムコントロラー:SCL-10Avp
カラムオーブン:CTO-10ACvp
ポンプ:LC10ADvp
オートサンプラー:SIL-10ADvp
ディテクター:RF-10AxL
検査対象者の年齢、血圧値、心拍数、BP類量及びNOx量について測定した結果を表1に示した。表1に示す結果は平均値±標準偏差(Average(Ave)±standard deviation(SD))で表した。また、表1において、Ageは年齢を示し、SBPは収縮期血圧を示し、DBPは拡張期血圧を示し、MBPは平均血圧を示し、HRは心拍数を示し、BP'sは総BP類量を示し、BH4はBH4量を示し、BH2はBH2量を示し、BH4/BH2はBP類の存在比を示し、NOxは総酸化窒素量を示している。
本実施例では、BH2をモデル動物に投与したときの血圧の変動を検証した。
本実施例では、血中のBH2濃度の変動に基づいて候補物質のなかから血圧調整剤をスクリーニングできることを実証するため、既知の血圧降下剤を高血圧モデルラットに投与したときのBH2濃度の変動を検証した。
(HPLCシステム概要)
システムコントロラー:SCL-10Avp
カラムオーブン:CTO-10ACvp
ポンプ:LC10ADvp
オートサンプラー:SIL-10ADvp
ディテクター:RF-10AxL
本実験例では、実施例3で使用したCQAによる血圧降下作用を検討した。本実験例では、Wister系ラット(SHR :10週齢、♂;日本SLCより購入)を用いた。ラットは、室温23±2℃、湿度55±10%、12時間の明暗サイクル(明期;AM7:00〜PM7:00)下で13週齢まで予備飼育した。尚、飼育期間中ラットには、全て、CE-2固形食を自由摂食、水道水を自由飲水させた。予備飼育期間中に収縮期血圧(tail-cuff法)を測定し、高血圧であることを確認した後、実施例3で使用したCQA(Cayman社)(200mg/kg)含有生理食塩水を経口ゾンデにより強制投与した。投与後一定時間後に、収縮期血圧(tail-cuff法)を測定し、血圧の変動率(%)を下式に従い算出した。
Claims (7)
- ヒトを除くモデル動物に候補物質を投与する工程と、
当該モデル動物の血中におけるジヒドロビオプテリン濃度を測定する工程とを含み、
上記候補物質によりジヒドロビオプテリン濃度が増加した場合には当該候補物質に血圧上昇作用があると判定し、上記候補物質によりジヒドロビオプテリン濃度が減少した場合には当該候補物質に血圧降下作用があると判定することを特徴とする、血圧調節剤の評価又はスクリーニング方法。 - 上記モデル動物は高血圧モデル動物であり、当該モデル動物の血中におけるジヒドロビオプテリン濃度の減少を測定することで血圧降下剤を同定することを特徴とする請求項1記載の血圧調節剤の評価又はスクリーニング方法。
- 上記ジヒドロビオプテリン濃度は、血中のジヒドロビオプテリン濃度及びビオプテリン濃度の合算値として測定されることを特徴とする請求項1又は2記載の血圧調節剤の評価又はスクリーニング方法。
- ヒトを除くモデル動物に評価対象物質を投与する工程と、
当該モデル動物の血中におけるジヒドロビオプテリン濃度を測定する工程とを含む、血圧調節剤の評価方法。 - 上記ジヒドロビオプテリン濃度を測定する工程では、ジヒドロビオプテリン濃度の変動程度、変動タイミングを評価することを特徴とする請求項4記載の血圧調整剤の評価方法。
- 上記ジヒドロビオプテリン濃度を測定する工程では、他の因子によるジヒドロビオプテリン濃度の変動を評価することを特徴とする請求項4記載の血圧調整剤の評価方法。
- 上記ジヒドロビオプテリン濃度は、血中のジヒドロビオプテリン濃度及びビオプテリン濃度の合算値として測定されることを特徴とする請求項4乃至6いずれか一項記載の血圧調節剤の評価方法。
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RU2614521C2 (ru) * | 2014-12-23 | 2017-03-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" (ФГБНУ "НИИНФ им. П.К. Анохина") | Способ моделирования сосудистой дистонии у крыс по гипотензивному типу |
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WO2002018587A1 (fr) * | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Suntory Limited | Procede de production de biopterines |
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