KR20040039176A

KR20040039176A - 뇌졸중의 조기 진단법

Info

Publication number: KR20040039176A
Application number: KR10-2003-7006577A
Authority: KR
Inventors: 알랜 클레인펠드
Original assignee: 알랜 클레인펠드
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-16
Publication date: 2004-05-10
Also published as: WO2003024306A3; EP1424931B1; WO2003024306A2; EP1424931A2; US7202089B2; EP1424931A4; CA2425781A1; US20030054412A1; CN100334447C; JP2005513417A; CN1524182A

Abstract

본 발명은 뇌졸중의 조기진단방법에 관한 것으로서, 형광물질로 표지된 지방산결합단백질을 포함하는 제제를 포함한다. 전기 방법은 지방산결합단백질이 결합상태 또는 비결합상태에 있는지를 형광의 차이로 분석한다. 혈액에 비결합상태의 유리 지방산이 증가하면, 이는 뇌중중의 표시자로서 이용된다.

Description

뇌졸중의 조기 진단법{Early Diagnosis of Stroke}

뇌졸중은 뇌조직으로 통하는 혈류의 장애로 정의된다. 이것은 뇌의 특정부위의 장애이거나, 예를 들어, 심장에 의한 펌프질이 완전히 손상되었을 때의 모든 흐름의 실질적인 감소일 수도 있다. 좀 더 빈번하게, 뇌로 통하는 혈관의 막힘이나 파열에 의해 뇌의 특정부위로의 흐름이 방해되었을 때, 뇌졸중은 일어난다. 혈관의 막힘은, 예를 들어, 색전증(embolism)이나 혈전(thrombus)의 형성을 통해, 일반적으로 뇌로 혈액을 공급하는 동맥에서 생기고, 이는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)으로 알려져 있다.

허혈성 뇌졸중의 경우에, 혈류의 장애는 일시적일 수도 있다; 이것은 일시적 국소빈혈 발생(TIA)이라 알려져 있다. 이러한 경우에, 환자는 종종 임상적으로 측정되지 않는 해로운 결과들로 고생하지만 뒤따를 수 있는 뇌졸중의 높은 위험수위에 있다. 반면에, 막힘이 수시간내에 해결되지 않는 환자들은 계속되는 상해로 고생하고, 종종 죽음에까지 이를 수 있다. 이것은 막히기 전 혈관에 의해 정상적으로 영양과 산소가 공급되었던 뇌세포(뇌조직)의 죽음에 의한 결과이다. 이러한 조직의 죽음이나 경색은, 뇌졸중 시작한지 몇시간 이후에만, 컴퓨터 에이디드 토모그래피(computer aided tomography; CT scan) 또는 자기공명영상법(MRI)에 의해서 감지될 수 있다. 출혈의 경우, 뇌는 혈액을 채우기 시작하여, 조직의 파괴를 가져온다.

뇌졸중은 선진국에서 사망의 세번째 원인이다. 새로운 경우의 뇌졸중은 미국에서만 매년 대략 750,000명에 영향을 준다. 미국에서, 뇌졸중 사망의 결과로 인한 치료비용과 생산성 손실은 약 $40조 달러에 이른다고 추산되고 있다. 유일하게 효과적인 뇌졸중 치료는, 혈전을 생성하게 하는 단백질을 효소학적으로 절단하여 혈전을 없애는 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator; t-PA)와 같은 혈전용해제의 투여이다. 너무 늦으면 부작용(출혈)을 일으키므로 T-PA는 첫번째 증상이후 오직 3시간 이내에 주어질 수 있다. 더욱이, t-PA는 허혈성 뇌졸중에만 사용될 수 있다; 출혈성 뇌졸중에의 사용은 일반적으로 사망에 이르게 된다.

그러므로, 혈전용해 치료는, 신속하게 진단되었고 출혈성 뇌졸중이 배제되었을 때에만 사용될 수 있다. 현행 진단 방법은 일반적으로 응급 수술의의 임상 발표에 거의 실질적으로 의존한다. 의사가 뇌졸중을 의심하고 환자가 혈전용해 치료에 적격이라고 생각되면, 출혈을 배제시키기 위해, 환자는 신속하게 CT 스캔이 수행되어야 한다(CT 스캔은 초기 단계에 감지할 수 있다). 일반적으로, 이러한 결정에 필요한 시간과 절차 때문에, 극소수의 잠재적으로 적합한 환자들만 혈전용해 치료를 받는다.

결론적으로, 개체에서 허혈성 뇌졸중의 유무를 결정할 수 있고 허혈성과 출혈성 뇌졸중을 구분지울 수 있는 간단하고 신속한 혈액 검사의 필요성이 끊임없이 제기되었다. 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 체액에서 비결합 유리 지방산의 측정을 통한 본 발명에 기술된 진단 방법은, 국소빈혈 발생의 높은 감지 능력을 가진, 간단하고, 저렴하며, 사실상 순간적이고 쉽게 접근 할 수 있는 측정방법에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명자는 비결합 유리 지방산의 수준이 뇌졸중 당시 올라간다는 것을 발견했다. 이러한 관찰은 뇌졸중을 감지 및 진단하고, 가능하면 출혈성 뇌졸중, 편두통(migraine) 및 발작(seizure)등과 같이 유사한 증상을 보이는 다른 상태에서 허혈성 뇌졸중을 구분하는 편리한 방법을 제공한다.

일 실시태양에서, 포유동물의 뇌졸중을 감지하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 일치한 증상을 보이는 포유동물로부터 체액 표본을 제공하는 단계;

표본을 수용액 및, 수용액에서 첫번째 형광을 보이고 지방산 결합 단백질이 지방산에 결합하면 다르게 측정되는 두번째 형광을 내는, 형광부분을가진 지방산 결합 단백질을 포함하는 제제와 혼합하는 단계; 및,

전기 체액 표본의 비결합 지방산의 농도를 결정하기 위해, 전기 체액표본을 전기 수용액 및 전기 제제와 혼합한 후, 전기 두번째 형광을 측정하는 단계. 바람직한 실시태양에서, 체액은 전체 혈액, 혈청 및 혈장 등을 포함하는 집합에서 나온다.

다른 실시태양에서, 체액의 비결합 유리 지방산의 수준을 이용하여 환자의 뇌졸중 치료의 경과를 모니터링하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

뇌졸중 치료동안 다른 시점에서, 환자로부터의 체액 표본에서 비결합 유리 지방산 수준을 측정하는 단계;

비결합 유리 지방산의 측정된 수준과, 뇌졸중 증상이 없는 정상 군집 체액의 비결합 유리 지방산의 측정으로부터 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및,

뇌졸중 치료동안 어느 주어진 시점에서 환자의 체액 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이, 성공적인 뇌졸중 치료를 나타내는, 정상 군집으로부터의 비결합 유리 지방산의 역치 수준으로 가는 경향을 보이는지 결정하는 단계

다른 실시태양에서, 뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부를 결정하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

환자로부터의 체액에서 비결합 유리 지방산 수준을 측정하는 단계;

비결합 유리 지방산의 측정된 수준과, 뇌졸중이 없는 정상 군집 체액의 비결합 유리 지방산의 측정으로부터 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및,

환자 체액 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집으로부터의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 상대적으로, 증가된 뇌졸중 위험을 나타내는 증가 유무를 결정하는 단계. 일 실시태양에서, 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.

일 실시태양에서, 측정하는 단계는 하기를 추가로 포함할 수 있다:

전기 체엑 표본을 수용액 및, 수용액에서 첫번째 형광을 보이고 지방산 결합 단백질이 지방산에 결합하면 다르게 측정되는 두번째 형광을 내는, 형광부분으로 표지된 지방산 결합 단백질을 포함하는 제제와 혼합하는 단계; 및,

전기 체엑 표본의 비결합 지방산의 농도를 결정하기 위해, 전기 체엑 표본을 전기 수용액 및 전기 제제와 혼합한 후, 전기 두번째 형광을 측정하는 단계. 바람직한 실시태양에서, 전기 두번째 형광을 측정하기 위한 전기 파장은 약 420nm에서 460nm이고 전기 제제가 전기 첫번째 형광을 나타내는 전기 파장은 약 495nm에서 560nm이다.

바람직한 실시태양에서, 지방산 결합 단백질은 랫(rat) 소장 지방산 결합 단백질, 인간 지방세포 지방산 결합 단백질 또는 랫 심장 지방산 결합 단백질 등이다. 형광부분은 아크릴로단(acrylodan), 댄질 아지리딘(danzyl aziridine), 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸에스터(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole ester: IANBDE) 및 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole: IANBDA) 등이다.

바람직한 실시태양에서, 혼합 및 측정하는 단계의 제제는 아크릴로단으로 표지된 지방산 결합 단백질이고, 전기 지방산 결합 단백질은, 27, 81, 82 또는 84번 위치에 시스테인(cysteine), 또는 72번 위치에 알라닌(alanine)인 랫 소장 지방산 결합 단백질 또는 27번 위치에 리신(lysine)을 가지는 랫 심장 지방산 결합 단백질을 포함하는 돌연변이된 단백질이다. 가장 바람직한 실시태양에서, 혼합 및 측정 단계의 제제는 아크릴로단으로 표지된 랫 소장 지방산 결합 단백질이다. 대체할 수 있는 바람직한 실시태양에서, 제제는 아크릴로단으로 표지되고 72번 위치에 알라닌을 가지는 랫 소장 지방산 결합 단백질이다.

일 실시태양에서, 뇌졸중을 나타내는 비결합 유리 지방산의 농도는 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 유리 지방산 농도의 평균값보다 표준편차 2 단위이상 크다. 다른 실시태양에서, 뇌졸중을 나타내는 비결합 유리 지방산의 농도는 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 유리 지방산 농도의 평균값보다 약 두 배 이상 크다.

일 실시태양에서, 방법은 하기의 단계를 추가로 포함할 수 있다:

혈액표본의 총 유리 지방산 및 알부민을 측정하는 단계; 및,

총 유리 지방산 및 전기 알부민의 비율을 결정하는 단계.

지방산에 결합하는 다른 단백질을 이용할 수도 있다. 일 실시태양에서, 뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부를 결정하는 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

체엑 표본을 수용액 및, 7-하이드록시코메린(7-hydroxycoumarin) 및 앤트라닐로일(anthraniloyl)을 포함하는 집합에 선택된 형광 부분으로 표지된 알부민을 포함하여, 수용액에서는 첫번째 형광을 나타내고 알부빈이 지방산에 결합하면 수용액에서 측정할 수 있을 정도로 다른 두번째 형광을 나타내는 제제와, 혼합하는 단계; 및,

체엑 표본의 비결합 지방산의 농도를 결정하기 위해, 체액 표본을 전기 수용액 및 제제와 혼합한 후, 두번째 형광을 측정하는 단계.

일 실시태양에서, 출혈의 높은 위험수위에 있는 환자를 확인하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

환자의 체액내 비결합 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계;

측정된 비결합 유리 지방산이 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 비결합 유리 지방산을 측정하여 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및

환자 체액 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 상대적으로, 증가된 출혈 위험을 나타내는, 증가 유무를 결정하는 단계.

다른 실시태양에서, 뇌졸중 이후 3년이내 높은 사망 위험수위에 있는 환자를 확인하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:

환자로부터 측정된 비결합 유리 지방산의 수준과, 뇌졸중을 가지지 않는 정상 군집내 체액의 결합하지 않거나 수용성의 유리 지방산을 측정하여 결정된 비결합 유리 지방산의 역치 수준을 비교하는 단계; 및

환자 체엑 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 상대적으로, 뇌졸중 이후 증가된 3년내 사망 위험을 나타내는, 증가 유무를 결정하는 단계.

다른 실시태양에서, 허혈성 뇌졸중을 진단하는 방법은 하기의단계를 포함한다:

허혈성 뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자를 확인하는 단계;

환자로부터 체엑 표본을 수득하는 단계;

표본내 비결합 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계; 및,

비결합 유리 지방산의 측정된 수준이, 허혈성 뇌졸중을 나타내도록 충분히 올라갔는지 확인하는 단계. 바람직한 실시태양에서, 비결합 유리 지방산의 측정된 수준이 허혈성 뇌졸중을 나타낼 때, 환자에 혈전용해 치료를 수행한다.

본 발명은 혈액, 혈장 및 혈청 등의 체액에 있는 비결합 유리 지방산의 측정을 통한 뇌졸중(stroke)의 진단법에 관한 것이다.

설명된 실시태양이 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 반면, 발명의 범주를 벗어나지 않고 당업계에 숙련된 기술을 가진자에게 변용이 있을 것이라고 이해되어야 한다. 그러므로, 발명의 범주는 부가된 청구항에 의해 독립적으로 결정될 것이다.

본 발명은 뇌졸중의 진단과 모니터링을 기술한다. 일 실시태양에서, 지방산과 같은 지질성분들을 측정함으로써 뇌졸능이 진단되거나 뇌졸중 치료의 경과가 모니터링된다. 전체 지방산은 본 발명에 인용문헌으로 통합된 미국 특허 제 4,071,413, 제 5,512,429, 제 5,449,607 및 제 4,369,250 등에 개시된 당 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 방법들에 의해 수득한 전체 지방산의 수준은, 개체의 국소빈혈 상태를 감지하기 위해, 정상적인 개체로부터 수득한 수준과 비교될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 알부민에 대한 전체 지방산의 비율이 결정되고 정상적 군집과 비교된다.

다른 실시태양에서, 비결합 유리 지방산의 수준은 하기 기술된 바와 같이 체액에서 측정된다. 바람직하게, 비결합 지방산은 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 임파액, 위액, 세포간액 또는 담즙 등의 체액에서 측정된다. 바람직한 실시태양에서, 검사 표본에 사용된 체액은 뇌척수액, 혈액 또는 혈청이다. 대부분의 체액에서, 유리 지방산(FFA)은 거의 알부민과 같은 단백질에 결합하지만 중요한 소수는 비결합성이며, 수용액상에 용해 가능하다. FFA_u는 수용성 유리 지방산으로 간주된다.

본 방법은 선택된 환자 군집에 적용될 때 특별히 유리할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, (FFA)가 존재할 수 있는 체액 표본은 허혈성 뇌졸중과 일치하는 증상을 보이는 환자들 또는 신경계 기능장애를 가리키는 증상을 가진 환자들로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들어 허혈성 뇌졸중 및 발작, 출혈성 뇌졸중, 편두통 같은 다른 상태에 기인한 증상을 구분하기 위해 사용될 수 있다. 뇌졸중의 증상은 의료계에서 잘 알려져 있고, 부분 또는 전체 마비, 언어장애, 정신이상, 사지 또는 신체 반쪽의 감각마비 또는 약해짐, 시력의 갑작스런 상실이나 저하, 심한 두통, 근육이나 평형 감각 상실, 및 무기력함을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 여기서 논의된 진단 단계의 조합인데, 환자가 허혈성 뇌졸중을 가졌는지, 뇌졸중에 관련된 치료와 함께 지시한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 그러한 치료의 한 형태는 (t-PA 또는 스트렙토키나아제같은) 혈전용해 치료이다. 바람직하게, 그러한 치료는 허혈성 뇌졸중 발생의 짧은 기간내에 수행되고, 허혈성 뇌졸중을 알려주는 FFA_u의 수준을 밝히는 동정단계의 2, 3 시간내에 유리하게, 1 시간내에 가장 유리하게 수행된다.

증상이 없는 군집에 상대적인 체액내 FFA_u의 수준을 제공하는 어느 동정법이라도 기술된 진단방법에 사용될 수 있다. 바람직하게, 역치값은 뇌졸중을 가지지 않는 정상적인 군집에서 결정된다. 일 실시태양에서, 역치값은 뇌졸중을 가지지 않는 대조구 군집의 FFA_u농도에 비해 상당히 높은 체액내 FFA_u의 농도이다. 일 실시태양에서, 역치값은 뇌졸중을 가지지 않는 대조구 군집의 평균 FFA_u농도에 비해 적어도 표준편차 2단위가 큰 체액내 FFA_u의 농도이다. 다른 실시태양에서, 뇌졸중을 가지지 않는 대조구 군집의 평균 FFA_u농도에 비해 적어도 약 두 배 큰 체액내 FFA_u의 농도이다.

일 실시태양에서, 본 발명은, 형광 표지된 FABP에의 FFA_u결합에 의한 형광의 변화를 양적으로 감지하여, 뇌졸중에 연관된 혈액, 혈청 및 혈장 표본의 비결합 유리 지방산(FFA_u)의 증가된 양을 측정하기 위해 형광 표지된 지방산 결합 단백질(FABP)을 사용한다. 본 발명은, 인용문헌으로 통합된 미국 특허 제 5,470,714호에 구체적으로 기술된 방법을 이용한다. 또는, FABP에의 FFA_u결합을 표시할 수 있는 다른 적합한 라벨도 사용될 수 있다. 다양한 동정방식과 표지 기술이 알려져 있고, 적어도, 본 발명에서는, 특정 표지나 동정방식은 중요하지 않아서, 당업계에 알려진 어느 적합한 동정방식과 표지가 사용될 수 있다.

다양한 FABP와 형광표지가 뇌졸중을 표시하는 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 체액의 FFA_u의 수준을 감지하는 데 사용될 수 있다. 이것들은 예를 들어, 랫 소장 FABP(I-FABP), 인간 지방세포 FABP(A-FABP) 및 랫 심장 FABP(H-FABP) 등을 포함한다. 하나 또는 그이상의 아미노산이 변형된(삽입, 결실 및/또는 치환), 이러한 FABP의 위치특이적 돌연변이도 방법에 유용하고, 예를 들어, I-FABP의 위치 27, 81, 82, 84의 Cys 치환, I-FABP의 위치 72의 Ala의 치환 및 H-FABP 27 위치의 Lys 치환 등을 포함한다.

반드시 국한되진 않지만 아크릴로단(acrylodan), 댄질 아지리딘(danzyl aziridine), 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 에스터(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxy-1,3-diazole ester; IANBDE) 및 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxy-1,3-diazole;IANBDA) 등을 포함한 다양한 기존의 표지를 이용하여, FABP 분자들은 형광 표지될 수 있다. 알부민과 같이 FFA에 결합하고 그것에 의해 형광을 변화시키는 다른 단백질도 사용될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 알부민은 7-하이드록시쿠마린이나 안트라닐로일과 같은 형광라벨을 가진다. 유리 지방산의 결합에 따라 측정 가능한 차이가 있는 이상, 어떤 표지도 발명의 실용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 파장, 신호세기, 또는 분극화, 또는 수명이 모니터링 될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 표지의 예시는, 반드시 국한되지는 않지만, 흡수 또는 광학적 활성 및 전자 스핀 공명에 의해 감지되는 스핀 표지의 변화를 내는 발색단을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 형광 표지된 FABP는 아크릴로단에서 유래된 재조합 랫 소장 지방산 결합 단백질이다(ADIFAB라 일컬음). 아클리로단에 의한 유도체 형성은 종래의 구체적으로 기술된 방법에 의해 수행되고(참조: 미국 특허 제 5,470,714 & Richieri, G.V, et al., J. Biol. Chem., 1992, 276:23495-23501), ADIFAB는 상업적으로 유용하다(FFA 사이언스 LLC, 샌디에이고,캘리포니아주). FFA_u의 농도는 형광 표지된 FABP에 FFA_u가 결합함으로서 결정될 수 있다. 아무런 FFA도 형광 표지된 FABP에 결합하지 않을 때, 다른 형광이 나타난다. FFA_u의 농도는 형광 차이에서 결정될 수 있다. 형광 표지된 FABP에 의해 방출된 파장은 표지와 사용된 단백질에 따라 다르다. 일 실시태양에서, 표지는 아크릴로단이고 단백질은 I-FABP이거나 위치 72에서 Ala가 Leu로 치환된 I-FABP 이다. 이러한 종류들은 각각 ADIFAB 및 ADIFAB2으로 블리운다. ADIFAB2의 결합 친화력은 ADIFAB보다 약 10배정도 큰것으로 알려져 왔다. 이러한 형광 표지된 FABP로부터 방출된 파장은 약 420에서 470nm이다. 형광 표지된 FABP에 결합한 FFA를 위한 방출 파장은 약 495에서 580nm이다. 당업계의 숙련된 기술자라면 개시된 동정법에서 다른 형광 표지된 FABP로 쉽게 대체할 수 있을 것이라 이해될 것이다.

수용액 표본에서의 FFA_u결정을 위한 동정법은, 결합한 FFA가 없을 때의 첫번째 파장으로부터, 결합이 있을 때의 두번째 파장까지 FABP 형광 이동(shift)의 강도를 측정하고, FFA_u의 농도는 그후 두 형광 파장 강도의 비율(R 값)로부터 결정된다(참조: 미국 특허 제 5,470,714; Richieri, et al., J. Lipid Research, 1995, 36:229-240). 요약하면, 비율은 다음의 식을 이용해 계신된다:

ㅣ(1) 및 ㅣ(1)blank는 ADIFAB, AIFAB2 및 이 두개를 제외한 모든 제제를 포함한 블랭크(blank) 표본을 위해 각각 파장 "1"에서 측정된 형광강도이고 ㅣ(2) 및 ㅣ(2)blank 는 해당되는 파장 "2"의 형광강도이다. ADIFAB에서, 파장 "1"은 바람직하게(절대적은 아님) 495와 515nm 범위이고 파장 "2"는 422와 442nm범위이다. 형광강도의 측정은 표준 기술을 이용해 얻을 수 있다. 당업계의 숙련된 기술자들에게 인지되었듯이, 적합한 환경에서, 상기 식의 ㅣblank 강도는 무시될 수 있다.

정상적 개체의 양보다 높이 올라간 체액 FFA_u의 양적인 수준측정은 뇌졸중을 진단하는데 이용될 수 있다. 일 실시태양에서, 뇌졸중은 뇌졸중을 가지지 않는 대조구 군집의 비결합 유리 지방산의 농도보다 매우 높은 체액 표본의 비결합 유리 지방산에 의해 지시된다. 일 실시태양에서, 뇌졸중은 표준편차 2정도로 체액 표본의 정상적인 수준의 비결합 유리 지방산의 평균을 초과하는 비결합 유리 지방산의 수준에 의해 감지된다. 다른 실시태양에서, 대조구 군집의 체액에서 결정된 비결합 유리 지방산의 평균보다 약 두배 큰 체액의 비결합 유리 지방산 수준이 뇌졸중을 지시한다. 의미있게 높은 혈액, 혈청 또는 혈장의 비결합 유리 지방산의 증가된 수준도 감지될 수 있다.

본 발명의 진단 방법은 뇌졸중을 경험한 환자가, 건강한 개체와 비교하여, 혈액, 혈청 및 혈장과 같은 체액의 증가된 FFA_u수준을 가졌었다는 발견에 근거한다. 진단 방법이 언제라도 수행될 수 있는 반면, 바람직하게, 검사는 국소빈혈 발생의 24시간내에 수행된다. 좀 더 바람직하게, 검사는 국소빈혈 발생 10시간내에 수행된다. 가장 바람직하게, 검사는 치료가 시작될 수 있도록 국소빈혈 발생 3시간내에 수행된다. 심장 빈혈과 같은 국소빈혈 상태를 위한 많은 치료는 효과적이기 위해 빠르게(시간내로) 시행되어야 한다. 한편, 올바른 진단없는 치료는 환자를 가장 악화시킬 수 있다. 예를 들어, 출혈성 뇌졸중의 경우 혈전용해 치료의 개시는 사망에 이르게 할 수 있다.

검사는 허혈성 뇌졸중과 편두통, 발작 및 출혈성 뇌졸중 등의 다른 상태를 구분하기 위해 사용될 수 있다. 최소한으로, 이 검사는 환자가 뇌졸중을 앓는다고 의료인에게 경보를 제공할 것이다. 그러므로, CT나 MRI 스캔이 더 신속하게 개시될 수 있어, 혈전용해 치료까지의 시간을 단축시킨다. 검사는 이엠티(EMT) 사람들에 의해 쉽게 수행될 수 있기 때문에, 이러한 경보는 구급차에서도 일어날 수 있다. 더욱이, 구급차에서 검사를 수행하는 것이, 그 검사에 근거하여 적합한 치료가 개시될 수 있는 적합한 시설로 운반할 수 있으므로, 뇌졸중을 치료할 필수인력과 장비가 있는 의료시설에서 멀리 있는 환자들에게 특별히 더 이로울 것이다. 허혈성 뇌졸중의 경우, 이러한 치료는 t-PA와 같은 혈전용해제의 투여를 포함할 수 있다. t-PA의 사용은 출혈성 뇌졸중에서는 반대로 작용하여 일반적으로 환자를 사망에 이르게 한다.

실시예 1: 혈액 표본에서의 FFA _u 동정

요약하여, FFA_u의 동정과 결정은 하기와 같이 수행된다. 혈액 표본은 완충액(20mM N-2-hydroxyethyl-piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid(HEPES), 150mM NaCl, 5mM KCl alc 1mM Na₂HPO₄, pH 7.4)에서 100배 희석되어, 약 6 μM 의 혈청 알부민 농도를 생성한다. 유리 지방산이 없는 알부민에 ADIFAB 또는 ADIFAB2를 첨가한 용액은 음성 대조구이다. 각 수용체에, 두개의 혈청 분배주(aliquot)가 준비되었다: 하나는 1% 혈청의 "배경(background)"이거나 "블랭크(blank)"이고 하나는 1% 혈청에 ADIFAB 또는 ADIFAB2"의 실험적(experimental)"표본이다. 음성 대조구, 블랭크와 실험적 표본은 22℃ 또는 37℃에서 측정된다.

각 표본에서, 강도 쌍(pair)의 다중 측정은 ADIFAB를 위해 약 432nm 및 505nm, ADIFAB2를 위해 450 및 550, 그리고 R 값은 블랭크 표본 강도의 공제(subtraction)이후에 결정된다. 적어도 두개의 분리된 측정이 각 혈청 표본에 각각 다른 날에 수행되고, FFA_u농도의 표준편차가 결정된다. 측정 값사이의 차이 가능성을 결정하기 위해, 수단의 차이는 p값이 0.05보다 작으면 유효하다고 여겨지는 스튜던트 t 겸사를 통해 평가된다.

실시예 2. 응급실 세팅(setting)에서 뇌졸중 증상을 나타내는 환자의 [FFA _u ]는 증가한다.

혈액 표본은 병원의 응급센터에 입원한 39명의 환자로부터, 입원시와 이후 몇 일 동안 몇 몇 시간때에 수득된다. 비결합 유리 지방산의 수준은 미국 특허 제 5,470,714에 기술한 대로, 형광을 내는 지방산 결합 단백질을 이용하여 측정된다. FFA_u수준과 크레이틴 키나아제(creatine kinase; CK-MB) 수준 모두 각 표본에서 측정된다. 한 환자가 결국에 뇌졸중으로 진단되었다. CK-MB 값이 정상범위에 있는 동안, FFA_u값은 정상 수준의 두 배 이상 큰 것으로 밝혀졌다.

실시예 3. 초점성(focal) 뇌빈혈의 랫 모델에서, [FFA _u ]는 증가한다.

랫 모델은 혈장 초점성 뇌빈혈에 관련한 FFA_u수준을 모니터링하는데 사용된다. 좌측 중간대뇌동맥(Middle Cerebral Artery; MCA)의 가역적인 초점성 뇌빈혈은 관내 폐색(occlusion)에 의해 유도된다(참조: Jackson-Friedman, et al., Neurology vol., 1997, 147:346-352). 혈장은 체순환에서 채집된다. 성체 랫이 마취된다. 4-0 나일론 봉합사가 공동(common) 경동맥에 삽입되고 내부 경동맥을 통해 들어가고, 그 끝이 전측 대뇌동맥에 도달하여, 루멘(lumen)에 들어가지 않고 MCA의 기원을 폐색시킨다. 봉합사의 유리된 기부(proximal) 근단은 동맥 절개를 닫은 후에 외부로 노출된다. 특정한 시간에, 봉합사는 회수되고, MCA로의 혈류가 복구된다. 대략 0.1ml의 혈액이 폐색 전후 다양한 시점에서 채혈된다. 혈액 표본은 완충성 식염수를 함유하는 헤파린 처리된(heparinized) 주사기로 뽑힌 직후, 용혈을 최소화하기 위해 얼음으로 옮겨진다. 희석된 혈액은 원심분리되어, 1%로 희석된 혈장이, 22℃에서 ADIFAB2를 이용한 FFA_u를 결정하는데 사용된다(참조: Richieri et al., Mol. Cell. Biochem. vol., 1999, 192:87-94).

요약하면, ADIFAB2는 하기와 같이 수득된다. 첫째, Ala⁷²돌연변이와 적합한 상보적 말단을 포함하는 제한절편은, 위치특이적 톨연변이에 의해 도입된 I-FABP cDNA 서열의 211 위치에 있는SalI와 291위치의PmeI를 포함하는 야생형 제한절편에 치환된다(참조: Alpers, et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 1994, 81:313-317). 돌연변이된 제한 절편은 원하는 서열, 을 포함한, 부분적으로 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드의 가열냉각, DNA 중합효소인 클레나우(klenow) 절편에 의한단일가닥 부분의 "채워넣기(filling in)" 및,SalI 및PmeI에 의해서 절단되어 적당한 말단을 만드는 과정에 의해 제작된다. I-FABP cDNA를 치환한 Ala⁷²는 pET11 벡터에 삽입되어 BL21(DE3) 세포주에서 발현된다. 돌연변이 I-FABP는 필수적으로 Lowe, et al.에 의한 방법으로 정제되고(참조: Lowe, et al., J. Biol. Chem., 1997, 262:5931-5937) 대장균 배양후, 리터당 약 100mg의 정제된 단백질을 생산한다. 아크릴로단 유도과정은 ADIFAB를 위해 종래에 기술된 식으로 수행된다(참조: 미국 특허 제 5,470,714). 리피덱스-5000 크로마토그래피가 유리 아크릴로단을 제거하기 위해 사용되었다.

류신72->알라닌인 아크릴로단 유도체 I-FABP(ADIFAB2)는 ADFAB와 상당히 다르다. 최대 방출 위치는, ADIFAB 의 432, 505nm와 비교하여, 아포(apo)-ADIFAB2의 경우 약 440nm 및 홀로(holo)-ADIFAB2인 경우 약 550nm인, 긴 파장에서 생기고, 최적 흥분 파장은 ADIFAB의 386nm에 비교하여 ADIFAB2는 약 375nm이다. 더욱이, 결합 특징의 평형값 R₀, R_max및 Q(참조: 미국 특허 제 5,470,714)를 결정하는 매개변수도 ADIFAB2에는 상당히 다르고, ADIFAB와는 반대로, 이러한 매개변수의 값은 지방산과 온도에 따라 다르다. 그러므로, 440nm, 550nm 및 올레산(oleate)에서 R_max및 Q는 각각 1.6과 2.5 및 7.5와 12이고, 온도는 10에서 37℃이며, 이러한 값들은 팔미트산(palmitate)과 스테아르산(stearate)인 경우보다 10% 정도 높다.

가역적인 MCA 폐색에 노출된 동물을 이용하여, 15분에서 2시간 사이에 여러번 측정은 이루어진다. 혈액 표본은 외과적 절개 직전, 봉합 및 이후 다양한 시점에서 채혈된다(1, 2, 3, 4 및 24 시간). 다른 폐색에 대한 [FFA_u]의 시간 경과의 평균값이 계산된다. [FFA_u] 수준은 증가하고 1-2시간 정도에 최대가 된 후, 24시간 동안 점진적으로 감소한다. 폐색이후에 [FFA_u]의 수준은 신속히 증가하고, 4시간 이상 증가된 상태를 유지한다. 허혈성 뇌졸중의 유일한 치료법은, 초기 증상의 3시간 이내에 주어져야 하는 조직 플라스미노겐 활성인자(t-PA)같은 혈전용해제의 투여이기 때문에, 이러한 작용은 중요하다. 더욱이, t-PA 투여가 빠르면 빠를 수록 약효가 좋다. 국소빈혈 발생을 뒤따르는 FFA_u수준의 신속한 증가는 이상적인 진단창을 제공한다.

실시예 4: 출혈성 뇌졸중의 랫 모델에서, FFA _u 를의 수준은 증가된 채로 유지되지 않는다.

허혈성 뇌졸중의 진단에 있어 가장 주요한 문제는 비-뇌빈혈 증후군을 앓는 환자들이 종종 뇌졸중 유사 증세를 나타낸다는 것이다. 이러한 "뇌졸중 유사" 중 대표적인 것은 출혈성 뇌졸중과 발작이다. 출혈 발생의 경우, t-PA는 그러한 환자들에게 치명적이기 때문에, 잘못된 진단은 심각하다.

출혈성 뇌졸중의 가능한 모델은 100-200ml의 랫 혈액을 꼬리핵(caudate nucleus)으로 주입함으로써 얻어진다. 출혈(혈종(hematoma)) 모델에서, 주입(injection) 시점의 [FFA_u]내 매우 신속한 스파이크(spike)후 1-2시간 후에 기저상태로 돌아간다는 것을 알수 있다. 경과시간에 따른 [FFA_u]는 0시간부터 감소하고 2시간 동안 기저상태의 30%이내가 된다.

실시예 5:[FFA _u ]의 수준은 발작동안 증가하지 않는다.

발작의 랫 모델은 꼬리핵으로, 발작을 유도하는 비큐큘린(bicuculline)을 융합시킴으로써 얻어진다. 발작 모델에서의 시간에 따른 [FFA_u]에서, 24시간 동안 기저상태에서 실질적으로 변화가 없다는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 뇌졸중에 의해 매개된 혈장 FFA의 증가는 지방조직의 가수분해에서 초래된다.

동물에 유도된 뇌빈혈은 뇌조직내에 FFA의 축적을 초래한다고 오랫동안 알려져 왔다. 그러한 결정은, 뇌조직의 수확과 조직으로부터의 지질 성분을 분리하기 위한 유기물 추출을 필요로한다. 빈혈상태 뇌의 FFA 조성은, 국소빈혈 유도의 수분내에 증가하고 결국엔, 대조구 조직에 비해 8배 이상 증가하는 것으로 알려졌다. 그러므로, 혈장 FFA의 증가는, 빈혈 상태 뇌의 FFA증가의 자명한 결과로서 뒤따르는 것 같이 보였을 것이다. 하지만, 심지어 완전한 국소빈혈내에서 생성된 FFA의 절대량은, FFA의 혈장 수준과 비교하여 너무 적어서, [FFA_u]를 의미있게 증가시킬 수 없다. 예를 들어, 완전한 국소빈혈에서, 약 0.8㎛ole의 FFA가 랫 뇌에 축적된다. 가역적 뇌빈혈을 뒤따르는, 덜 중요한 혈장에서의 FFA의 양은 약 100배정도크다.

뇌빈혈에서 관찰된 대량의 FFA를 생성하기 위한 충분한 능력을 가진 유일한 조직은 지방조직이다. 우리의 결과에서, 뇌빈혈 수분내에, 뇌는 지방 가수분해의 하나 또는 그이상의 활성인자를 방출한다라는 것을 알 수 있다. 노르에피네프린과 TNF_α적어도 2개의 그러한 활성인자는 뇌빈혈에서 방출된다. 랫 뇌졸중 모델(실시예 2)에서, 동일한 혈액표본에서의 [FFA_u]과 TNF_α는 가역적인 2시간 폐색에서 추출된다. 두개의 양 모두 증가하고 동일한 시간 경과를 따른다.

실시예 7: 뇌빈혈을 나타내는 인간 환자에서 [FFA _u ]는 조기에 증가한다.

뇌졸중 환자들의 [FFA_u] 측정은, 허혈성 뇌졸중의 신속하고 민감한 지시를 가능하게 할 수 있고, 그러한 환자들이 뇌졸중 유사 증상으로부터 구분될 수 있게 한다.

정상적인 건강한 사람이 군집에서의 [FFA_u] 측정 결과는 이전에 보고되었다(참조: Richieri et al., J. Lipid Res., 1995, 36:229-240). 이러한 측정들은, FFA_u의 첫번째 형광 탐침인 ADIFAB를 이용하여 37℃에서 수행되었다. 이러한 측정의 결과에서, 평균과 표준편차는 각각 2.8nM 과 0.7nM인 것을 알 수 있다. 두 탐침을 위해 얻어진 값의 차이는 부분적으로, 감소하는 온도와 함께 [FFA_u]의 감소 때문이고, 바람직하게, ADIFAB2 탐침과 비교하여, ADIFAB의 더 짧은 파장의 형광을흡수하는 헤모글로빈과 같은 혈장 요소에의 ADIFAB 탐침의 늘어난 민감도 때문이다.

광범위한 질병을 가진 환자의 [FFA_u] 측정에서, 뇌 또는 심장 빈혈 및 가능한 패혈증(sepsis)을 가진 환자들은 예외로, 질병을 가진 군집에서 [FFA_u]의 분포는 정상적인 비증상 개체의 분포와 상당히 유사하다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과들에 반하여, 뇌빈혈을 가지는 환자들에서는 상당히 증가된 [FFA_u]이 관찰된다.

혈액 표본은 뇌졸중뇌졸중로 여러개의 다른 병원에 입원한 환자들에게서 얻어진다. 혈액 표본은 각 환자들에게서 그들의 병원생활동안 한번 또는 그이상 횟수로 얻어진다. 입원시(처음 증상의 2와 5시간 사이)에 얻어진 표본에 대한 [FFA_u] 측정의 결과들에서, 비증상의 개체와 비교하여 상당히 높은 수준으로 이동된 분포를 알 수 있다. 이러한 결과들에서, [FFA_u]의 측정이, 인간 허혈성 뇌졸중에 대한 조기에 정확하게 수행할 수 있는 진단법을 제공하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 정신에서 벗어나지 않게 다양한 변용이 만들어질 수 있다는 것이 당업계 숙련된 자에게 이해될 것이다. 그러므로, 본 발명의 형태는 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않았다는 것이 확실히 이해되어야 한다.

Claims

허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 일치한 증상을 보이는 포유동물로부터 체액 표본을 제공하는 단계;

전기 체액 표본을 수용액 및, 수용액에서 첫번째 형광을 보이고 지방산 결합 단백질이 지방산에 결합하면 다르게 측정되는 두번째 형광을 내는, 형광물질로 표지된 지방산 결합 단백질을 포함하는 제제와 혼합하는 단계; 및,

전기 체액 표본의 비결합 지방산의 농도를 결정하기 위해, 전기 체액 표본을 전기 수용액 및 전기 제제와 혼합한 후, 전기 두번째 형광을 측정하는 단계를 포함하는, 포유동물의 뇌졸중(stroke) 감지방법.
제 1항에 있어서,

체액 표본은 전체 혈액, 혈청 및 혈장을 포함하는 집합에서 선택된 것을 특징으로 하는

포유동물의 뇌졸중(stroke) 감지방법.
뇌졸중 치료동안 다른 시점에서, 환자로부터의 체엑 표본에서 비결합 유리지방산 수준을 측정하는 단계;

비결합 유리 지방산의 측정된 수준과, 뇌졸중 증상이 없는 정상 군집 체액의 비결합 유리 지방산의 측정으로부터 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및,

뇌졸중 치료동안 어느 주어진 시점에서 환자의 체엑 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이, 성공적인 뇌졸중 치료를 나타내는, 정상 군집에서 비결합 유리 지방산의 역치 수준으로 가는 경향을 보이는지 결정하는 단계를 포함하는, 환자의 뇌졸중 치료의 경과를 모니터링하기 위한 비결합 유리 지방산의 체액 수준 이용방법.
환자로부터의 체액에서 비결합 유리 지방산 수준을 측정하는 단계;

비결합 유리 지방산의 측정된 수준과, 뇌졸중이 없는 정상 군집 체액에서 비결합 유리 지방산의 측정으로부터 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및,

환자 체엑 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집으로부터의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 상대적으로, 증가된 뇌졸중 위험을 나타내는 증가 유무를 결정하는 단계를 포함하는, 뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 4항에 있어서,

체액은 전체 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택된 것을특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 4항에 있어서,

전기 체엑 표본을 수용액 및, 수용액에서 첫번째 형광을 보이고 지방산 결합 단백질이 지방산에 결합하면 다르게 측정되는 두번째 형광을 내는, 형광부분으로 표지된 지방산 결합 단백질을 포함하는 제제와 혼합하는 단계; 및,

전기 체엑 표본의 비결합 유리 지방산의 농도를 결정하기 위해, 전기 체액 표본을 전기 수용액 및 전기 제제와 혼합한 후, 전기 두번째 형광을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 4항에 있어서,

전기 두번째 형광을 측정하는 전기 단계는 전기 제제가 전기 첫번째 형광을 나타내는 파장과 다른 파장에서 수행되는 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 7항에 있어서,

전기 두번째 형광을 측정하기 위한 전기 파장은 약 420nm에서 460nm이고, 전기 제제가 전기 첫번째 형광을 나타내는 전기 파장은 약 495nm에서 560nm인 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

전기 혈액표본의 총 유리 지방산 및 알부민을 측정하는 단계; 및,

전기 총 지방산 및 전기 알부민의 비율을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

전기 지방산 결합 단백질은 랫(rat) 소장 지방산 결합 단백질, 인간 지방세포 지방산 결합 단백질 또는 랫 심장 지방산 결합 단백질 등이고, 전기 형광부분은 아크릴로단(acrylodan), 댄질 아지리딘(danzyl aziridine), 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 에스터(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole ester: IANBDE) 또는 4-[N-[(2-이오도아세톡시)에틸]-N-메틸아미노]-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(4-[N-[(2-iodoacetoxy)ethyl]-N-methylamino]-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole: IANBDA) 등인 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

전기 혼합 및 측정 단계의 전기 제제는 아크릴로단으로 표지된 지방산 결합 단백질이고, 전기 지방산 결합 단백질은, 27, 81, 82 또는 84번 위치에 시스테인(cysteine), 또는 72번 위치에 알라닌(alanine)인 랫 소장 지방산 결합 단백질 또는 27번 위치에 리신(lysine)을 가지는 랫 심장 지방산 결합 단백질을 포함하는 돌연변이된 단백질인 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

전기 혼합 및 측정 단계의 전기 제제는 아크릴로단으로 표지된 랫 소장 지방산 결합 단백질인 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 12항에 있어서,

전기 제제는 아크릴로단으로 표지되고 72번 위치에 알라닌을 가지는 랫 소장 지방산 결합 단백질인 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

비결합 유리 지방산의 농도가 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 유리 지방산 농도의 평균값보다 표준편차 2 단위 이상 크면 뇌졸중을 나타내는 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 6항에 있어서,

비결합 유리 지방산의 농도가 비 국소빈혈 군집으로부터 결정된 비결합 유리 지방산 농도의 평균값보다 약 두 배 이상 크면 뇌졸중을 나타내는 것을 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
제 4항에 있어서,

전기 체엑 표본을 수용액 및, 7-하이드록시코메린(7-hydroxycoumarin) 및 앤트라닐로일(anthraniloyl)로 구성된 군으로부터 선택된 형광 부분으로 표지된 알부민을 포함하고 수용액에서는 첫번째 형광을 나타내고 알부민이 지방산에 결합하면 수용액에서 측정할 수 있을 정도로 다른 두번째 형광을 나타내는 제제와, 혼합하는 단계; 및,

전기 체엑 표본의 비결합 지방산의 농도를 결정하기 위해, 전기 체액 표본을 전기 수용액 및 전기 제제와 혼합한 후, 전기 두번째 형광을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 전기 측정 단계를 특징으로 하는

뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자의 뇌졸중 여부 결정방법.
환자의 체액내 비결합 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계;

측정된 비결합 유리 지방산이 수준과, 국소빈혈을 가지지 않는 정상 군집내 체액에서 비결합 유리 지방산을 측정하여 결정된 역치 수준을 비교하는 단계; 및

환자 체엑 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 비하여, 증가된 출혈 위험을 나타내는, 증가 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 출혈 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
환자의 체액내 비결합 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계;

환자로부터 측정된 비결합 유리 지방산의 수준과, 뇌졸중을 나타내지 않는 정상 군집내 체액에서 결합하지 않거나 수용성의 유리 지방산을 측정하여 결정된 비결합 유리 지방산의 역치 수준을 비교하는 단계; 및

환자 체엑 표본에서의 비결합 유리 지방산 수준이 정상 군집의 비결합 유리 지방산의 역치 수준에 비하여, 뇌졸중 이후 증가된 3년내 사망 위험을 나타내는, 증가 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 이후 3년이내 사망할 위험수위가 높은 환자의 확인방법.
허혈성 뇌졸중과 일치하는 증상을 나타내는 환자를 확인하는 단계;

환자로부터 체엑 표본을 수득하는 단계;

표본내 비결합 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계; 및,

비결합 유리 지방산의 측정된 수준이, 허혈성 뇌졸중을 나타내도록 충분히 증가했는지 확인하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌졸중 진단방법.
제 19항에 있어서,

비결합 유리 지방산의 측정된 수준이 허혈성 뇌졸중을 나타낼 때, 환자에 혈전용해 치료를 수행하는 단계를 추가로 포함하는

허혈성 뇌졸중 진단방법.