WO2016148073A1 - アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法 - Google Patents

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昌泰 松本
由宇 二瀬
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for assisting detection of Alzheimer's disease or mild dementia.
  • Alzheimer's disease is a typical dementia that accounts for the majority of dementia, and the number of patients is expected to increase in an aging society in the future. Alzheimer's disease is progressive, and current medicine cannot cure it or stop it completely, but there are drugs and therapies that slow the progression. Therefore, it is desirable to detect Alzheimer's disease as early as possible. In particular, as a pre-stage of developing Alzheimer's disease, there are many cases of mild dementia (referred to as MCI), but if mild dementia can be detected, the transition to Alzheimer's disease can be stopped or delayed as much as possible. it can. Currently, Alzheimer's disease is diagnosed by interviews and brain MRI images, but it is not easy to detect early Alzheimer's disease or mild dementia.
  • MCI mild dementia
  • Non-Patent Documents 1 to 3 In order to detect Alzheimer's disease at an early stage, methods using the abundance of microRNA (hereinafter referred to as “miRNA”) in blood as an index have been proposed (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • miRNA microRNA
  • an object of the present invention is to provide a method for assisting detection of Alzheimer's disease or mild dementia that assists in detecting Alzheimer's disease or mild dementia with high accuracy.
  • Alzheimer's disease or mild dementia can be detected with high accuracy by using a specific miRNA as an indicator, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following. (1) Presence of at least one miRNA selected from the group consisting of miR-122, miR-144, let-7f, miR-128-3p, and miR-107 contained in a test sample isolated from a living body A method for assisting in the detection of Alzheimer's disease or mild dementia using the amount as an index, wherein miR-122 is present in a larger amount than that in a healthy person, and / or miR-144, let-7f, miR-128- A method (provided that the presence of at least one miRNA selected from the group consisting of 3p and miR-107 is less than that of a healthy subject indicates that it is more likely to develop Alzheimer's disease or mild dementia (however, , MiR-144, let-7f or miR-107 as a single indicator).
  • test sample is serum or plasma.
  • microRNA selected from the group consisting of let-7g-5p, miR425-3p and miR425-5p is used as an internal standard.
  • Alzheimer's disease or mild dementia can be detected with high accuracy and still easily, so that it greatly contributes to detection of Alzheimer's disease or mild dementia.
  • microRNAs that were significantly different between Alzheimer and healthy people groups by next-generation sequencer analysis are shown.
  • the vertical axis represents the number of reads for each miRNA per 1,000,000 reads. Since Let-7f-1, let-7f-2 has the same sequence of mature, we proceeded with the analysis as let-7f. Same as above In the following Example, the result of having analyzed the data by qRT-PCR (s) by the (DELTA) (DELTA) Ct (s) method is shown.
  • DELTA DELTA Ct
  • ROC curve created based on the results of qRT-PCR and a scatter diagram of ⁇ Ct values of each sample are shown.
  • the difference between the ⁇ Ct values of let-7f and miR-122 and the difference of ⁇ Ct values of miR-144 and miR-122 are calculated, and a scatter diagram and an ROC curve are created.
  • ⁇ Ct values of miR-122, let-7f, and miR-144 are expressed as box plot in the Alzheimer group, the MCI group, and the healthy subject group. There was a significant difference between MCI group and healthy group at P ⁇ 0.05.
  • Example it is a figure which compares and shows the measurement result of (DELTA) Ct (let-7f) *-(miR-122) measured about the Alzheimer's disease group, the MCI group, and the healthy subject group.
  • Example it is a figure which compares and shows the measurement result of (DELTA) Ct (miR-107) *-(miR-122-5p) measured about the Alzheimer's disease group, the MCI group, and the healthy subject group.
  • it is a figure which shows the measurement result about miR-128-3p identified as miRNA which reduces by Alzheimer's disease.
  • it is a figure which shows the measurement result about miR-107 identified as miRNA which decreases by Alzheimer's disease.
  • ⁇ Ct was corrected using let-7g obtained as an internal standard in the following Examples. It is a figure which shows the measurement result about miR-122 and let-7f. ⁇ Ct was corrected using let-7g obtained as an internal standard in the following Examples. It is a figure which shows the measurement result about miR-144. It is a figure which shows AUC of ( DELTA ) Ct (miR- 128)-( DELTA ) Ct (miR-122) obtained in the following Example.
  • miR-122, miR-144, let-7f, miR-128-3p and miR-107 contained in a test sample separated from a living body.
  • the abundance of one kind of miRNA is used as an index (except for a method using miR-144, let-7f, or miR-107 alone as an index).
  • miRNAs themselves are well known, and their base sequences are also well known. As a precaution, the base sequences of these miRNAs are described as follows.
  • miR-122 uggagugugacaaugguguuug (SEQ ID NO: 1)
  • miR-144 ggauaucaucauauacuguaag
  • let-7f ugagguaguagauuguauaguu
  • miR-128-3p ucacagugaaccggucucuuu
  • miR-107 agcagcauuguacagggcuauca (SEQ ID NO: 5)
  • miR-122 is more abundant in Alzheimer's disease or mild dementia patients than in healthy individuals, and miR-144, let-7f, miR-128-3p, and miR-107 are Alzheimer's disease. Or in patients with mild dementia, the abundance is lower than in healthy individuals.
  • miRNA can be used alone or in combination, but when combined, the accuracy is further increased.
  • miR-144 and let-7f whose abundance is reduced in patients with Alzheimer's disease or mild dementia, at least one of them is preferably used as an indicator together with miR-122, and any one of them may be used as an indicator. .
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a body fluid containing miRNA, but usually a blood sample (including plasma, serum and whole blood) is preferably used.
  • RNA quantification method of miRNA itself is well known, and all reagents and devices necessary for quantification are commercially available. Therefore, those skilled in the art can easily carry out, and one example is specifically described in the following examples. Has been.
  • a poly A tail region is added to the 3 ′ end of miRNA using a commercially available reagent, and an oligonucleotide (ie, poly T) that hybridizes to the added region is reverse primer.
  • Each miRNA is quantified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) using oligonucleotides that hybridize to each miRNA (complementary strand of each miRNA) as a forward primer, and each miRNA can be easily quantified by this method
  • qRT-PCR quantitative real-time PCR
  • the quantification method is not limited to this, and for example, it can be quantified by a commercially available method using a so-called “next-generation sequencer”.
  • a blood sample can be preferably used as described above, and serum and plasma can be particularly preferably used.
  • serum and plasma can be particularly preferably used.
  • the miRNA in serum or plasma at least one selected from the group consisting of let-7g-5p, miR425-3p, and miR425-5p, which are miRNAs whose abundance is small in serum and plasma
  • the microRNA is preferably used as an internal standard.
  • the abundance of miR-122 is greater than that in healthy subjects and / or at least one miRNA selected from the group consisting of miR-144, let-7f, miR-128-3p and miR-107.
  • miR-144, let-7f, miR-128-3p and miR-107 When the abundance of is less than that of healthy individuals, it is determined that the possibility of Alzheimer's disease or mild dementia is high.
  • Each miRNA used here alone has a statistically significant difference between Alzheimer's disease or mild dementia patients and healthy individuals (in the examples, p ⁇ 0.001 or p ⁇ 0.01 by t-test)
  • the presence or absence of a statistically significant difference with respect to a healthy person is preferably used as a reference.
  • ⁇ Ct values cut-off values
  • ⁇ Ct (let-7f)-(miR-122) ⁇ Ct (let-7f)-(miR-122)
  • miR-122 that increases in Alzheimer's disease or mild dementia
  • miR-144 let-7f, miR-128-3p or miR-107 that decreases
  • ⁇ Ct (miR-107)-(miR-122) Is preferably used as an index.
  • Item 2 Collection and storage of plasma from whole blood 1) 5 mL of whole blood collected in a Venoject II vacuum blood collection tube supplemented with EDTA-2K was transferred to a 15 mL tube and centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes at room temperature. 2) Centrifugation separates the plasma layer, leukocyte layer, and red blood cell layer from the top. Of these, only the plasma layer was transferred to a new 2 mL tube. 3) Centrifuged 2) at 10000 rpm for 10 minutes at room temperature to precipitate blood cell components mixed in the collected plasma. 4) Only 250 ⁇ L of the plasma layer was dispensed into a new 1.5 mL tube and stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • RNA in plasma RNA was extracted using miRNeasy Mini kit (QIAGEN). 1) Frozen plasma samples were thawed and centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at room temperature to precipitate aggregated proteins and blood cell components. 2) 200 ⁇ L of the supernatant was transferred to a new 1.5 mL tube. 3) Add 1000 ⁇ L of QIAzol Lysis Reagent and mix well to denature the protein components. 4) Add 10 ⁇ L of 0.05 nM cel-miR-39 as control RNA for RNA extraction, mix by pipetting, and let stand at room temperature for 5 minutes.
  • the column was transferred to a new 2 mL collection tube and centrifuged at 10000 xg for 1 min at room temperature. 14) Move the column to a 1.5 mL tube, add 50 ⁇ L of RNase-free water, and let stand at room temperature for 1 minute. 15) Centrifuged at 8000 xg for 1 minute at room temperature to elute the RNA adsorbed on the filter. The eluted RNA was used as it was in the next experiment, and the rest was stored at -80 ° C.
  • Next-generation sequencer analysis was performed using Ion Total RNA-seq Kit v2, Ion PGM (lifetechnologies), Bioanalyzer (Agilent). Concentrate 50 ⁇ L of plasma-derived microRNA extracted in Section 2 to 10 ⁇ L under reduced pressure. For adapter hybridization, add 1 ⁇ L of Ion Adoptor Mix v2 and 3 ⁇ L of Hybridization buffer to 4 ⁇ L of the RNA solution concentrated in 1). After slowly pipetting 10 times, spin down. Incubate with a thermal cycler at 65 ° C for 10 minutes and at 16 ° C for 5 minutes. For adapter ligation, add 10 ⁇ L of 2x Ligation buffer and 2 ⁇ L of Ligation Enzyme Mix to the solution reacted in 4).
  • Nucleic acids with the same length as the target cDNA are extracted by bead purification. Gently vortex Nucleic Acid Binding Beads. Add 5 ⁇ L of Nucleic Acid Binding Beads to the Plocessing Plate. Add 250 ⁇ L of Binding Solution Concentrate to 15) and pipette 10 times. Add 60 ⁇ L of Nuclease-Free water to the cDNA solution of 13). Add the solution of 17) to 16). Match P-1000 Pipetman to 275 ⁇ L and rinse the tip 3 times with 100% ethanol. With the tip of 19), add 275 ⁇ L of 100% ethanol to 17) and pipette 10 times. Leave at room temperature for 5 minutes. Place the Processing Plate on a magnetic stand for 5 minutes.
  • the buffer used was 1x TBE. Place 20 mL of 1x TBE and 30) 10% TBE acrylamide gel in the tapper. Add 2 ⁇ L of SYBR gold and shake for 5 minutes. Perform UV irradiation and cut out a band around 100-106 bp. Place the cut gel in a 1.5mL tube and crush it moderately with the tip of the tip. Add 500 ⁇ L of TE buffer. Overnight at 37 ° C. Centrifuge for 3 minutes at 3000 rpm. Transfer the supernatant to a new 1.5 mL tube and add 1 ⁇ L of 20 mg / mL glycogen as a coprecipitate. Add 50 ⁇ L of 3M sodium acetate. Add 400 ⁇ L isopropanol and vortex.
  • Section 2 Analysis of results Analysis was performed using CLC bio Genomics Workbench.
  • the number of reads for each microRNA is corrected to the number when the number of reads for each sample is 1,000,000.
  • t-tests were performed on each microRNA, and microRNAs with P ⁇ 0.05 and at least one group with an average number of reads of 50 or more were picked up and further analyzed by the following qRT-PCR .
  • Section 4 Measurement of Plasma MicroRNA Amount by qRT-PCR Section 1
  • Comprehensive analysis of plasma miRNA is performed using miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR, Universal cDNA synthesis kit II, LightCycler480 multi-well plate (Exiqon) It was.
  • Universal cDNA synthesis kit II is added to the 3 'end of mature miRNA, and reverse transcription is performed using a primer containing poly-T primer, so that all miRNA contained in the sample can be obtained in 1 tube.
  • This is a cDNA synthesis kit for miRNA designed for reverse transcription.
  • PCR ⁇ reaction proceeds, and the amount of miRNA in the sample can be measured as the difference in fluorescence intensity It becomes like this.
  • the Ct value is calculated using a second derivative method where the point of maximum change in the fluorescence amplification curve is the Ct value. For the analysis, comparatively the miRNA amount is compared without creating a calibration curve. The ⁇ Ct method was used. *
  • Reverse transcription of microRNA Reverse transcription of miRNA in plasma was performed using Universal cDNA Synthesis Kit II (EXIQON). 1) Dispense 2 ⁇ L of 5x Reaction buffer, 5 ⁇ L of Nuclease-Free water, 1 ⁇ L of Enzyme mix, and 2 ⁇ L of plasma-derived RNA solution into a 0.2 mL tube. 2) Mix by tapping and spin down. 3) Reaction was performed at 42 ° C for 60 minutes and 95 ° C for 5 minutes with a thermal cycler. 4) The synthesized cDNA was transferred to a 1.5 mL tube and stored at -80 ° C.
  • ROC receiveriver operation characteristics
  • AUC area under the curve
  • Item 3.Comparison of Marker Candidate MicroRNA Levels in Healthy and Alzheimer Patients by qRT-PCR The difference in the plasma levels of miRNA in healthy subjects and Alzheimer's disease patients shown in the first screening is considered to be influenced by individual differences in the samples used in the experiments. Therefore, in order to eliminate the influence of individual differences from the plasma level of marker candidate miRNA, each group of healthy subjects and Alzheimer patients was increased to 62 samples each, and as a second screening, the plasma levels of individual candidate miRNAs in each sample were increased. The amount was measured by qRT-PCR. The amount of marker candidate miRNA in the second screening was measured by qRT-PCR using SYBR Green.
  • the ⁇ Ct value of each specimen was calculated and t-test was performed at a 5% significance level.
  • those that showed a significant difference between the healthy group and the Alzheimer group were 7 types of miR-122, miR-185, let-7f, miR-15b, miR-484, and miR-144. Met. There was no significant difference in the other three types.
  • ROC curves were created using the ⁇ Ct values of these seven types of miRNA, Alzheimer patients could be diagnosed with high accuracy AUC ⁇ 0.8 ⁇ in miR-122, let-7f, miR-144 (Fig. 3-A). And FIG. 3-B).
  • qRT-PCR was performed.
  • the ⁇ Ct value in 42 MCI patients was calculated and compared with the healthy group by t-test. A significant difference was found at P ⁇ 0.05.
  • miR-122 was on an uptrend
  • let-7f and miR-144 were on a downtrend, similar to Alzheimer's ( Figure 5-A, Figure 5-B, and Figure 5-C). .
  • Item 7 Superiority of let-7g as internal standard Let-7g was measured in healthy individuals and Alzheimer's disease patients. The results are shown in FIG. Let-7g has little variation and can be used as an internal standard.
  • the base sequence of let-7g is ugagguaguaguuuguacaguu (SEQ ID NO: 6).
  • ⁇ Ct was corrected using let-7g as an internal standard.
  • the measurement results for miR-122, let-7f, and miR-144 are shown in FIGS. 11-A and 11-B.
  • Item 8 Combination of miR-122 and miR-128-3p In the same manner as in Item 5, ⁇ Ct (miR-128) ⁇ (miR-122) in 42 MCI patients was calculated. The results are shown in FIG.

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Abstract

要約　アルツハイマー病又は軽度認知症を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法が開示されている。アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法は、生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107の少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とする。miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107の少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す。

Description

アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法
　本発明は、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法に関する。
　アルツハイマー病は、認知症の過半数を占める代表的な認知症であり、今後の高齢化社会において患者数は益々増えると考えられている。アルツハイマー病は、進行性であり、現在の医学では、完治させたり進行を完全に食い止めることはできないが、進行を遅らせる医薬や療法は存在する。したがって、アルツハイマー病をできるだけ早期に検出することが望まれる。特に、アルツハイマー病を発症する前段階として、軽度認知症（ＭＣＩという）を患う場合が少なくないが、軽度認知症を検出することができれば、アルツハイマー病への移行を食い止め又は可能な限り遅らせることができる。現在、アルツハイマー病の診断は、問診や脳のMRI画像等により行われているが、早期のアルツハイマー病や軽度認知症を検出することは容易ではない。
　早期にアルツハイマー病を検出すべく、血液中のマイクロRNA（以下、「miRNA」）の存在量を指標とする方法が提案されている（特許文献１～３、非特許文献１～３）。
特開2014-132863号公報 特表2014-520529号公報 EP 2733219 A1
Pavan Kumar et al., PLOS ONE, July 2013, Volume 8, Issue 7, e69807, pp.1-10 Petra Leindinger et al., Genome Biology 2013, 14:R78 Wang-Xia Wang et al., The Journal of Neuroscience, January 30, 2008, 28(5) 1213-1223
　上記の通り、種々のmiRNAが、アルツハイマー病の検出のための指標として提案されているが、より正確にアルツハイマー病を検出することができれば有利であることは言うまでもない。
　したがって、本発明の目的は、アルツハイマー病又は軽度認知症を高精度に検出することを補助する、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、アルツハイマー病又は軽度認知症において存在量が増大する特定のmiRNAと、アルツハイマー病又は軽度認知症において存在量が減少する特定のmiRNAを種々見出し、これらのうちで、特定のmiRNAを指標とすることで高精度にアルツハイマー病又は軽度認知症の検出が可能になることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。
(2)生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144及びlet-7fから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する(1)記載の方法。
(3)
(I)miR-122とmiR-144、
(II) miR-122とlet-7f、
(III) miR-122とmiR-128-3p、及び
(IV) miR-122とmiR-107
から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とする(1)記載の方法。
(4)(III) miR-122とmiR-128-3pの組合せの存在量を指標とする(3)記載の方法。
(5)前記被検試料が血清又は血漿である(1)～(4)のいずれかに記載の方法。
(6)let-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いる(5)記載の方法。
　本発明の方法によれば、高精度に、かつ、それでいて簡便にアルツハイマー病又は軽度認知症を検出することが可能であるので、アルツハイマー病又は軽度認知症の検出に大いに寄与する。
下記実施例において、次世代シーケンサー解析によりアルツハイマー、健常人群間で有意に差がみられたマイクロRNAを示す。縦軸は total 1,000,000 リード数あたりの 各miRNA のリード数をあらわす。Let-7f-1,let-7f-2 は mature の配列は同じであるため、let-7f として解析を進めた。 同上 下記実施例において、qRT-PCR によるデータをΔΔCt 法で解析した結果を示す。次世代シーケンサー解析で候補にあげた10種類の miRNA のうち、7 種類で有意差が見いだせた。 同上 下記実施例において、qRT-PCR の結果に基づきROC曲線を作成したものと、各サンプルのΔCt値の散布図を示す。 同上 下記実施例において、let-7f と miR-122 のΔCt値の差、 miR-144 と miR-122 のΔCt値の差を算出し、散布図とROC曲線を作成したものを示す。 同上 下記実施例において、アルツハイマー群、MCI群、健常人群において miR-122, let-7f, miR-144 のΔCt値を box plot であらわしたものを示す。MCI群と健常人群の間で P<0.05 で有意に差がみられた。 同上 同上 下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(let-7f) - (miR-122)の測定結果を比較して示す図である。 下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-144) - (miR-122) の測定結果を比較して示す図である。 下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122-5p)の測定結果を比較して示す図である。 下記実施例において、アルツハイマー病群、MCI群及び健常人群について測定した、ΔCt(miR-107) - (miR-122-5p)の測定結果を比較して示す図である。 下記実施例において、アルツハイマー病で減少するmiRNAとして同定されたmiR-128-3pについての測定結果を示す図である。 下記実施例において、アルツハイマー病で減少するmiRNAとして同定されたmiR-107についての測定結果を示す図である。 下記実施例における検体情報を示す図である。 下記実施例において得られた、健常人とアルツハイマー病患者におけるlet-7gの相対発現値を比較して示す図である。 下記実施例において得られた、let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-122及びlet-7fについての測定結果を示す図である。 下記実施例において得られた、let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-144についての測定結果を示す図である。 下記実施例において得られた、ΔCt(miR-128)-ΔCt(miR-122)のAUCを示す図である。
　上記の通り、本発明の方法では、生体から分離された被検試料中に含まれるmiR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とする（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。これらのmiRNA自体は周知であり、その塩基配列も周知である。念のためにこれらのmiRNAの塩基配列を記載すると次のとおりである。
miR-122：uggagugugacaaugguguuug（配列番号１）
miR-144：ggauaucaucauauacuguaag（配列番号２）
let-7f：ugagguaguagauuguauaguu（配列番号３）
miR-128-3p：ucacagugaaccggucucuuu（配列番号４）
miR-107：agcagcauuguacagggcuauca（配列番号５）
　これらのmiRNAのうち、miR-122は、アルツハイマー病又は軽度認知症患者では、健常人よりも存在量が多く、miR-144、let-7f 、miR-128-3p及びmiR-107は、アルツハイマー病又は軽度認知症患者では、健常人よりも存在量が少なくなる。
　これらの５種類のmiRNAは、単独でも組み合わせても用いることができるが、組み合わせるとさらに精度が高くなる。アルツハイマー病又は軽度認知症患者において存在量が低下するmiR-144及びlet-7fは、これらのうちの少なくとも１つがmiR-122と共に指標として用いることが好ましく、いずれか１つを指標として用いればよい。(I)miR-122とmiR-144、(II) miR-122とlet-7f、(III) miR-122とmiR-128-3p、及び (IV) miR-122とmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とすることにより、下記実施例に具体的に記載するように、ROC（受信者操作特性）曲線におけるAUC（Area Under Curve、曲線下面積）が、0.9という非常に高い精度が得られる。特に、(III) miR-122とmiR-128-3pの組合せにより、AUCが1.00という完璧な結果が得られる。AUCが1.00ということは、偽陽性率０％、偽陰性率０％ということであり、最高の精度が達成される。
　被検試料としては、miRNAを含む体液であれば特に限定されないが、通常、血液試料（血漿、血清及び全血を包含する）が好ましく用いられる。
　miRNAの定量方法自体は周知であり、定量のために必要な試薬類や装置は全て市販されているので、当業者が容易に行うことができ、下記実施例にも１例が具体的に記載されている。下記実施例に記載されている方法では、市販の試薬を用いて、miRNAの3'末端にポリＡテール領域を付加し、この付加領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（すなわち、ポリＴ）をリバースプライマーとし、各miRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（各miRNAの相補鎖）をフォワードプライマーとして用いる定量的リアルタイムＰＣＲ(qRT-PCR)により各miRNAを定量しており、この方法により容易に各miRNAを定量できるが、定量方法はこれに限定されるものではなく、例えば、市販されている、いわゆる「次世代シーケンサー」を用いる方法等によっても定量可能である。
　被検試料としては、上記の通り血液試料を好ましく用いることができ、特に血清及び血漿を好ましく用いることができる。血清又は血漿中の上記miRNAを測定する場合には、血清及び血漿中で存在量の変動が少ないmiRNAであるlet-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いることが好ましい。
　本発明の方法では、miR-122の存在量が健常者よりも多く、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ない場合に、アルツハイマー病又は軽度認知症の可能性が高いと判定する。ここで用いられる各miRNAは、それぞれ単独でもアルツハイマー病又は軽度認知症患者と健常者の間に統計学的有意差（実施例では、t-検定でp<0.001又はp<0.01）があるので、健常者に対する統計学的有意差(t検定で、p<0.05、好ましくはp<0.01、さらに好ましくはp<0.001)の有無を基準とすることが好ましい。具体的には、下記実施例に示されるように、好ましくは、例えば、偽陽性率が最良の値（最も低くなる値）なるプロット点におけるΔCt値（カットオフ値）が、miR-122とlet-7fの組み合わせ（ΔCt(let-7f)-(miR-122))で1.49以上である場合に、アルツハイマー病又は軽度認知症の可能性が高いと判定することができる（図４－Ｂ参照）。また、上記の通り、アルツハイマー病又は軽度認知症で増大するmiR-122と、減少するmiR-144、let-7f、miR-128-3p又はmiR-107を組み合わせて、
ΔCt(miR-144) - (miR-122)、
ΔCt(let-7f) - (miR-122)、
ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122)、
ΔCt(miR-107) - (miR-122)
を指標とすることが好ましい。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実験材料と実験方法
第 1 節　臨床検体
第 1 項　使用した臨床検体
　末梢血の採取は、広島大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会から承認されたヒトゲノム遺伝子解析研究計画書に基づいて行われた。本実施例で解析に用いた末梢血の内訳を以下の表に示す。
第 2 項　全血からの血漿の回収と保存
1) EDTA-2K が添加されたベノジェクトII真空採血管に採血された 5 mL の全血を 15 mL チューブに移し、3500rpmで10分間、室温で遠心した。
2) 遠心により、上から血漿層、白血球層、赤血球層の 3 層に分離される。そのうち、血漿層のみを新しい 2 mL チューブ に移した。
3) 2)を 10000 rpm で 10 分間、室温で遠心し、採取した血漿に混入している血球成分を沈殿させた。
4) 血漿層のみを新しい1.5mLチューブに250μＬずつ分注し、-80℃で凍結保存した。
第 2 節　血漿中 RNA の抽出
　血漿中 RNA の抽出は、miRNeasy Mini kit (QIAGEN) を用いて行った。
1) 凍結した血漿サンプルを融解し、10000 rpm で 5 分間、室温で遠心し、凝集タンパク質や血球成分を沈殿させた。
2) 上清 200 μＬ を新しい 1.5 mL チューブ に移した。
3) 1000 μＬ の QIAzol Lysis Reagent を加えて十分に混和し、タンパク質成分を変性した。
4) RNA 抽出のコントロール RNA として 0.05 nM cel-miR-39 を 10 μＬ 加え、ピペッティングで混和した後、室温で 5 分間静置した。
5) 水層と有機溶媒層の分離促進のため、200μＬのクロロホルムを加え、十分に混和し、室温で 3 分間静置した。
6) 12000 xg、15分間、4℃で遠心し、上層の水層650μＬを新しい2mLチューブ に移した。
7) RNA を析出させるため、975μＬの 100% エタノールを加え、ピペッティングで混和した。
8) 650 μＬ の 7) を miRNeasy Mini spin column (以下、カラム) に移し、室温で 1 分間静置後、8000 xg、15 秒間、室温で遠心し、RNA をカラムのフィルターに吸着させた。カラムから通過した溶液は廃棄した。
9) 7) の溶液を全てカラムに通すまで 8) を繰り返し、全ての RNA をフィルターに吸着させた。
10) フィルターに付着した夾雑物の除去のため、650 μＬ の Buffer RWT をカラムに加え、 8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
11) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、15 秒間、室温で遠心した。カラムから通過した溶液は廃棄した。
12) フィルターに吸着した RNA の洗浄のため、500 μＬ のBuffer RPE をカラムに加え、8000 xg、2 分間、室温で遠心した。 カラムから通過した溶液は廃棄した。
13) フィルターに付着している溶液を完全に除去するため、カラムを新しい 2 mL collection チューブ に移し、10000 xg、1 分間、室温で遠心した。
14) カラムを 1.5 mL チューブ に移し、50 μＬ の RNase-free water を加え、室温で 1 分間静置した。
15) 8000 xg、1 分間、室温で遠心し、フィルターに吸着した RNA を溶出した。溶出した RNAは、そのまま次の実験に用い、残りは -80 ℃ で保存した。
第 3 節　血漿中 microRNA の解析
第 1 項　次世代シーケンサーにおける網羅的解析
　本実施例では、血漿中より抽出できる RNA 量が微量であり、濃度測定が困難であったため、 RNA 溶液の濃度調節は行わなかった。したがって、「同じ質量の RNA 中にどれだけの目的 miRNA が含まれていたか」ではなく、「同容量の血漿から抽出した RNA 溶液中にどれだけの目的 miRNA が含まれていたか」を比較したことになる。これは、この後の qRT-PCR 解析でも同様である。
　次世代シーケンサーによる解析は Ion Total RNA-seq Kit v2, Ion PGM (lifetechnologies), Bioanalyzer(Agilent) を用いて行った。
第２節で抽出した 50μＬの血漿由来 microRNA を 10μＬに減圧濃縮する。
アダプターのハイブリダイゼーションのため、1)で濃縮したRNA溶液 4μＬ に 1μＬの Ion Adoptor Mix v2 と 3μＬのHybridization buffer を加える。 
10回ゆっくりピペッチィングをした後、スピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 65℃ 10分、16℃ 5分　反応させる。
アダプターライゲーションのため、4)で反応させた溶液に 10μＬ の 2x Ligation buffer と 2μＬ のLigation Enzyme Mix を加える。
穏やかにピペッティングし、スピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 16℃ 16時間反応させる。
アダプターをライゲーションした microRNA を逆転写するため、7)の溶液に 2μＬの Nuclease-Free water, 4μＬの10x RT buffer, 2μＬ の 2.5mM dNTP Mix, 8μＬのIon RT Primer v2 を加える。
穏やかにピペッティングしスピンダウンをする。
サーマルサイクラーで 70℃ 10分 反応させる。
直ちに反応溶液を氷上に置き、4μＬの10x SuperScript III Enzyme Mix を加える。
穏やかにピペッティングし、スピンダウンする。
サーマルサイクラーで42℃ 30分反応させる。
ビーズ精製により目的の cDNA と同じ長さを持つ核酸を抽出する。Nucleic Acid Binding Beads を穏やかにvortexする。
Plocessing Plate に 5μＬの Nucleic Acid Binding Beads を加える。
15)に 250μＬのBinding Solution Concentrate を加え、10回ピペッティングをする。
60μＬの Nuclease-Free water を13)のcDNA溶液に加える。
17)の溶液を16)に加える。
P-1000のピペットマンを275μＬに合わせ、100%エタノールでチップを３回リンスする。
19)のチップのまま、275μＬの100%エタノールを17)に加え、10回ピペッティングをする。
5分間室温に置く。
Processing Plate を磁気スタンドに5分間置く。
上清は廃棄し、磁気スタンドに置いたまま2分間 Nucleic Acid Binding Beads を風乾させる。
磁気スタンドからProcessing Plate を外し、13μＬの Nuclease-Free water を加え、10回ピペッティングをする。
1分間室温に置く。
磁気スタンドにProcessing Plate を1分間置き、溶液 13μＬを回収する。
精製した cDNA を増幅させるため、0.2mLチューブに26)のcDNA溶液 を6μＬ分注する。
27)に 45μＬの Platinum PCR SuperMix High Fidelity, 1μＬの Ion Xpress RNA-Seq Barcode, 1μＬの Ion Xpress RNA 3’ Barcode Primer を加える。
サーマルサイクラーで以下の条件で反応を行った。
94℃ 2分
（2 Cycles）94℃ 30秒、50℃ 30秒、68℃ 30秒
（19 Cycles）94℃ 30秒、62℃ 30秒、68℃ 30秒
68℃ 5分
アダプターダイマーを取り除くため、増幅したcDNAを電気泳動し、ゲル切り出しを行う。10% TBE アクリルアミドゲルを作成し、120V で泳動を行う。バッファーは 1x TBE を用いた。
タッパーに 20 mL の1x TBE と、30)の10% TBE アクリルアミドゲル を入れる。
2μＬのSYBR gold を加え、5分間振とうさせる。
UV照射を行い、100-106 bp 付近のバンドを切り出す。
切り出したゲルを 1.5mLチューブに入れ、チップの先で適度に砕く。
500μＬ の TE buffer を加える。
37℃でオーバーナイトする。
3000 rpm で3分間遠心をする。
上清を新しい 1.5 mL チューブに移し、1μＬの20 mg/mLグリコーゲンを共沈剤として加える。
50μＬの 3M 酢酸ナトリウムを加える。
400μＬのイソプロパノールを加え、vortex を行う。
-80℃ 30分静置する。
15,000 xg 30分間 4℃ で遠心をする。
上清を廃棄し、1 mL の70%エタノールを加える。
15,000 xg 5分間 4℃ で遠心をする。
上清を廃棄し、風乾させる。
15μＬの Nuclease-Free water を加える。
Bioanalyzer で DNA High Sensitivity Kit を用いて濃度測定を行う。
cDNA を 20 pM に希釈し、エマルジョンPCR を行う。エマルジョンPCR はIon OneTouch 2(lifetechnologies) を用いた。
Ion OneTouch 2 に Recovery tube, Amplification Plate を装着する。
Reagent tube に Oil を 2分の1、別のReagent tube に Recovery Solution を 4分の1 入れ、Ion OneTouch 2 に装着する。
1.5 mL low-binding チューブに、48)で希釈した 25μＬの cDNA, 25μＬの Nuclease-Free water, 500μＬの Reagent Mix, 300μＬの PCR Reagent B, 50μＬの Enzyme mix を混合する。
Ion Sphere Particles を vortex し、スピンダウンした後 100μＬを51)に加える。
Vortex し、スピンダウンする。
Reaction Filter Assembly に反応液を充填し、Ion OneTouch 2 に装着し、エマルジョンPCR を開始する。
エマルジョンPCR サンプルを回収し、Ion One Touch ES(lifetechnologies) を用いてビーズ精製を行う。
サンプルを回収し、全量を 0.2 mL に移す。
5μＬの Control Ion Sphere を加える。
15,500 xg で2分間遠心する。
チューブに 15μＬ 残して上清を廃棄する。
12μＬ の Sequencing Primer を加える。
サーマルサイクラーで 95℃ 2分、37℃ 2分 反応させる。反応後は室温に戻す。
サンプルを 318 Chip にローディングする。
Ion PGM に装着し、解析を行う。
第 2 項　結果の解析
　解析は CLC bio Genomics Workbench を用いて行った。各 microRNA のリード数は、各サンプルのリード数を 1,000,000 とした時の数に補正する。アルツハイマー群と健常人群で各 micro RNA で t検定を行い、P<0.05 となり、且つ少なくとも片方の群の平均リード数が50以上となる microRNAをピックアップし、次の qRT-PCR でさらに解析を行った。
　第 4 節　qRT-PCR による血漿中 microRNA 量の測定
第 1 項　血漿中 miRNA の網羅的解析は、miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR, Universal cDNA synthesis kit II, LightCycler480 multi-well plate (Exiqon) を用いて行った。
　Universal cDNA synthesis kit II は、mature miRNA の 3’ 末端に poly-A tail を付加し、poly-T primer を含む primer を用いて逆転写を行うことで、サンプル中に含まれる miRNA を 1 チューブ で全て逆転写できるように設計された miRNA 用の cDNA 合成キットである。
　LightCycler480 multi-well plate に合成したcDNA と酵素や蛍光物質の混ざった反応試薬 SYBR Green master mix、primer を加えることで、PCR 反応が進行し、蛍光強度の差としてサンプル中の miRNA 量の測定ができるようになる。Ct 値の算出には、蛍光の増幅曲線の変化幅が最大となる点を Ct 値とする二次導関数法を用い、解析には、検量線を作成せず、相対的に miRNA 量を比較する ΔΔCt 法を用いた。　
第 2 項　microRNA の逆転写
　血漿中 miRNA の逆転写は Universal cDNA Synthesis Kit II (EXIQON) を用いて行った。
1) 0.2 mL チューブ に、2μＬ の 5x Reaction buffer,5μＬ の Nuclease-Free water,1μＬ の Enzyme mix, 2μＬの血漿由来 RNA 溶液 を分注する。
2) タッピングで混和後、スピンダウンする。
3) サーマルサイクラーで 42℃ 60分、95℃ 5分反応を行った。
4) 合成した cDNA は 1.5 mL チューブ に移し、-80 ℃ で保存した。
第 3 項　SYBR Green での qRT-PCR
　real-time PCR 反応は LightCycler（商品名） 480 (Roche)、miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR (EXIQON)、384-well plate は LightCycler（商品名）480 Multiwell Plate 384, white (Roche) を用いて行った。PCR reaction mix、希釈済み cDNA の384-well plate への分注は、Bravo Automated Liquid Handling Platform (Agilent Technologies) を用いた。
1) 0.65 mL チューブ に、合成した cDNA を DNase-free water を用いて 40 倍に希釈した。
2) 0.65 mL チューブ に、次のように PCR reaction mix を調製した (表示はレプリケート数 1 のときの 1 サンプルあたりの量)。
PCR Master mix 5μＬ, PCR primer mix 1μＬ
3) PCR reaction mix を 384-well plate に 6μＬずつ分注した。
4) 1) で調製した希釈 cDNA を 384-well plate に 4μＬずつ分注し、ピペッティングで十分に混和した。
5) サンプルの蒸発防止のため、384-well plate にシールを貼り、1500 xg、1 分間、室温で遠心した。
6) LightCycler（商品名） 480 (Roche) を用い、以下の条件で real-time PCR を行った。
95℃ 10分
(45 Cycles) 95℃ 10秒、60℃ 1分
第 4 項　結果の解析
　Ct 値の算出には、蛍光の増幅曲線の変化幅が最大となる点を Ct 値とする二次導関数法を用い、解析には、検量線を作成せず、相対的に miRNA 量を比較する ΔΔCt 法を用いた。また、サンプル同士を比較するために、miRNA 量の補正を行う必要があるが、この補正には、第 2 節の 4) で添加した外部コントロール cel-miR-39 を用いた。補正値 (ΔCt 値) の算出方法を下記に示す。
ΔCt = Ct - Ctcel-miR-39
　qRT-PCR 解析においては、上記の式に従い、測定したサンプルの Ct値から、そのサンプル中に含まれる cel-miR-39 の Ct 値を引いたものをΔCt 値として解析に用いた。
ROC 曲線による マーカー microRNA の精度評価
　ROC (受信者操作特性) 曲線を描き AUC を算出して比較する方法は、診断マーカーの精度評価の方法である。ROC は横軸に「1-特異度」(偽陽性率) を、縦軸に「感度」をプロットし、陽性/陰性を判断するカットオフ値を媒介変数として変化させたときに得られる曲線である。AUC (曲線下面積) はこの ROC 曲線下の面積のことであり、0.5～1 の値をとる。ある診断マーカーを用いてROC 曲線を作成し、AUC を算出した際、その値が 1 に近づけば近づく程精度の良いマーカーと評価される。一般にAUC ≧ 0.7 であれば診断マーカーとして精度がよいとされる。
結果
第 1 節　アルツハイマー患者特異的な変動を示す血漿中 microRNA の同定
第 1 項　
　本節では、健常人とアルツハイマー患者の血漿中 miRNA プロファイルを網羅的に解析し、比較することで、アルツハイマー患者で変動する miRNA の同定を行った。
第 2 項　健常人とアルツハイマー患者の血漿中 microRNA の網羅的解析と比較
(第１のスクリーニング)
　健常人群、アルツハイマー患者群、各 62 名の血漿中における miRNA 量を次世代シーケンサー Ion PGM (lifetechnologies)を用いて網羅的に解析し、各群における miRNA 量を比較した。各群毎に miRNA 量の平均値を算出し、各群間での比較を行った（図１－Ａ及び図１－Ｂ）。
　健常人群に比べ、アルツハイマー患者群で 有意に量が増加した miRNA を3種類、アルツハイマー患者群で有意に量が減少した miRNAを7種類同定した(図２－Ａ及び図２－Ｂ）。
　これら 10 種類の miRNA をアルツハイマー マーカー 候補 miRNA として、qRT-PCR による解析を行った。以下にその miRNA を記す。
　健常人に比べ、アルツハイマー病患者で血漿中 miRNA 量増加：miR-122-5p, miR-185-5p
　健常人に比べ、アルツハイマー病患者で血漿中 miRNA 量減少：let-7f-5p, let-7g-5p, miR-15b-5p,miR-30b-5p,miR-484-5p,miR-660-5p, miR-144-5p 
　第 3 項　qRT-PCR による健常人とアルツハイマー患者の マーカー 候補 microRNA 量の比較
(第２のスクリーニング)
　第１のスクリーニング で示された健常人とアルツハイマー病患者における miRNA の血漿中量の違いは、実験に用いた検体の個人差の影響を少なからず受けていると考えられる。そこで、マーカー 候補 miRNAの血漿中量から個人差の影響を排除するため、健常人群とアルツハイマー患者群の各群をそれぞれ 62 検体に増やし、第２のスクリーニング として各検体における個々の候補 miRNA の血漿中量を qRT-PCR で測定した。第２のスクリーニング での マーカー 候補 miRNA 量の測定は、SYBR Green を用いた qRT-PCR 法で行った。
　各検体のΔCt値を算出し、5%有意水準でt検定を行った。10種類の マーカー 候補 miRNA のうち、健常人群とアルツハイマー群で有意差がみられたものは、miR-122,miR-185,let-7f,miR-15b,miR-484,miR-144の 7 種類であった。他3種類では、有意差はみられなかった。また、この7種類の miRNA のΔCt値を用いて ROC曲線を作成したところ、miR-122,let-7f,miR-144 において AUC≧0.8 と精度よくアルツハイマー患者の診断ができた（図３－Ａ及び図３－Ｂ）。また、miR-122 と let-7f、miR-122 と miR-144 のΔCt値の差を算出し、再び ROC 曲線を作成したところ、AUC>0.9 とさらに精度よく診断が可能となった(図４－Ａ及び図４－Ｂ）。
　以上の結果より、アルツハイマー患者において上昇している miR-122, 減少しているlet-7f,miR-144 をマーカー 候補 miRNA として同定することができた。
第 4 項　qRT-PCR による健常人と軽度認知症(MCI)患者の マーカー 候補 microRNA 量の比較
　第 3 項でアルツハイマー診断 miRNA 候補として同定した miR-122, let-7f, mir-144 について、同様に qRT-PCR を行った。MCI 患者 42名におけるΔCt値を算出し、健常人群とt検定にて比較したところ、P<0.05 で有意に差がみられた。MCI 患者においても、miR-122 は上昇傾向、let-7f と miR-144 は減少傾向と、アルツハイマー患者と同様の傾向がみられた（図５－Ａ、図５－Ｂ及び図５－Ｃ）。
第５項　miRNAの組み合わせ
　２種類のmiRNAを組合せた場合の精度を検討した。具体的には以下の試験を行った。第３項及び第６項で使用した検体においてqRT-PCRを行い、ΔCt値を算出した。そして、2種類のmiRNAのΔCt値の差、ΔCt(let-7f) - (miR-122)、ΔCt(miR-144) - (miR-122)、ΔCt(miR-128-3p) - (miR-122-5p)及びΔCt(miR-107) - (miR-122-5p)を算出した。結果をそれぞれ図６－Ａから図６－Ｄに示す。
第６項　網羅的なqRT-PCRによりアルツハイマー病で減少するマイクロRNAの同定
　上記した網羅的なqRT-PCRにより、アルツハイマー病で減少するマイクロRNAとして、miR-128-3p及びmiR-107が同定された。結果をそれぞれ図７及び図８に示す。また、検体情報を図９に示す。
第７項　let-7gの内部標準としての優位性
　健常人とアルツハイマー病患者におけるlet-7gを測定した。結果を図１０に示す。let-7gは変動が少なく内部標準として用いることができ、診断の精度を上げることができる優位性があることがわかった。なお、let-7gの塩基配列は、ugagguaguaguuuguacaguu（配列番号６）である。
　let-7gを内部標準として用いてΔCtを補正した。miR-122、let-7f及びmiR-144についての測定結果を図１１－Ａ及び図１１－Ｂに示す。
第８項　miR-122とmiR-128-3pの組合せ
　第５項と同様にして、MCI患者４２名におけるΔCt(miR-128) - (miR-122)を算出した。結果を図１２に示す。
　図１２に示されるように、miR-122とmiR-128-3pの組合せにより、AUC1.00（すなわち、偽陽性率０％、偽陰性率０％）という驚くべき結果が得られた。

Claims (6)

  1. 　生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法であって、miR-122の存在量が健常者よりも多いこと、並びに／又はmiR-144、let-7f、miR-128-3p及びmiR-107から成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量が健常者よりも少ないことが、アルツハイマー病又は軽度認知症を発症している可能性が大きいことを示す、方法（ただし、miR-144、let-7f又はmiR-107を単独で指標とする方法を除く）。
  2. 　生体から分離された被検試料中に含まれる、miR-122、miR-144及びlet-7fから成る群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの存在量を指標とするアルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する請求項１記載の方法。
  3. (1)miR-122とmiR-144、
    (2) miR-122とlet-7f、
    (3) miR-122とmiR-128-3p、及び
    (4) miR-122とmiR-107
    から成る群より選ばれる少なくとも１種の組合せの存在量を指標とする請求項１記載の方法。
  4. 　(3) miR-122とmiR-128-3pの組合せの存在量を指標とする請求項３記載の方法。
  5. 　前記被検試料が血清又は血漿である請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　let-7g-5p、miR425-3p及びmiR425-5pから成る群より選ばれる少なくとも１種のマイクロRNAを内部標準として用いる請求項５記載の方法。
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