JP2019513352A - 親水性ポリマー材料を使用するrna画分の精製 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(前記全血を再構成させるために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収して、長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するステップと、を含む、方法に関する。
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(全血を再構成させるために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収し、それにより長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するステップと、を含む、方法に関する。
(i)第2の態様の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
(i)全血サンプルが個体由来である、第2の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、
(iii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iv)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法に関する。
(i)全血サンプルが個体由来である、第3の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
(i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキットに関する。
(i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体を含むキットに関する。
定義
本発明を以下において詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されるものではなく、変更することができることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。特段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本発明をここでさらに説明する。以下の節において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、明らかに反対の指示のない限り、他の任意の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい、または有利であると示した任意の特徴は、明らかに反対の指示のない限り、好ましい、または有利であると示した任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせることができる。
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(全血を再構成させるために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収し、それにより長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するステップと、を含む、方法に関する。
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(前記全血を再構成させるために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収し、それにより長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するステップと、を含む、方法に関する。
(i)多糖類が、セルロースであり、
(ii)ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。
(iv)1つまたは複数の分離技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を単離するステップをさらに含む。
(i)第2の態様の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
(i)前記全血サンプルが個体から由来した(採取された、得られた、単離された)、第2の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子の前記レベルを決定するステップと、
(iii)レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iv)個体が前記比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法に関する。
(i)前記全血サンプルが個体から由来した(採取された、得られた、単離された)、第3の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
(i)前記全血サンプルが個体から由来した(採取された、得られた、単離された)、第3の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを、1名または複数の健康な対象由来の1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんである。
(i)前記全血サンプルが個体から由来した(採取された、得られた、単離された)、第3の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを、1名または複数の疾患に罹患している対象由来の1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんである。
(i)前記全血サンプルが個体から由来した(採取された、得られた、単離された)、第3の態様に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを、1名または複数の疾患に罹患している対象由来の1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベル、および1名または複数の別の疾患に罹患している対象由来の1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断するステップと、を含む。好ましくは、疾患は肺がんであり、他の疾患は肺がん以外の疾患である。また本方法は、異なる治療された疾患を互いに区別することも可能にする。例えば、疾患は、アジュバント処置された疾患、例えば、アジュバント処置肺がんであり、他の疾患は、緩和処置された疾患、例えば、例えば緩和処置された肺がんであってもよく、または、疾患は緩和処置された疾患、例えば緩和処置された肺がんであり、他の疾患はアジュバント処置疾患、例えばアジュバント処置肺がんであってもよい。
(i)多糖類は、セルロースであり、
(ii)ポリオレフィンは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)ポリエステルは、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。
(i)親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブ、を含むキットに関する。
(ii)個体から血液を取り出す手段、
(iii)容器、および/または
(iv)吸収された全血サンプルからの全血を有する吸収性プローブが、本発明の第1〜第4の態様の方法において使用可能であるという情報を含むデータ媒体をさらに含む。
(ii)個体から血液を取り出す手段、
(iii)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するための手段、
(iv)容器、および/または
(v)吸収された全血サンプルからの全血を有する吸収性プローブが、本発明の第1〜第4の態様の方法において使用可能であるという情報を含むデータ媒体、をさらに含む。
(i)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子を検出するためのポリヌクレオチド、および/または
(ii)バイオチップ、RT−PCTシステム、PCRシステム、フローサイトメーターまたは次世代シークエンシングシステム、を含んでいてもよい。
(i)親水性ポリマー材料を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる吸収性プローブに吸収される(全血サンプル由来の)全血を再構成するための流体、を含むキットに関する。
(ii)容器、および/または
(iii)本発明の第1〜第4の態様の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されたデータ媒体をさらに含む。
(ii)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するための手段、
(iii)容器、ならびに/あるいは
(iv)本発明の第1〜第4の態様の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されたデータ媒体、をさらに含む。
(i)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子を検出するためのポリヌクレオチド、ならびに/あるいは
(ii)バイオチップ、RT−PCTシステム、PCRシステム、フローサイトメーターまたは次世代シークエンシングシステム、を含み得る。
(i)多糖類が、セルロースであり、
(ii)ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される。より好ましくは、親水性ポリマー材料は、綿、セルロースまたはポリエチレンである。
1. 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去する方法であって、
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(全血を再構成させるために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収して、長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するステップと、を含む、方法。
2. 長さが200ヌクレオチド以上の前記RNA画分がリボソーム18S RNAおよびリボソーム28S RNAからなる群から選択される1つまたは複数のRNA分子を含む、第1項の方法。
3. 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製する方法であって、
(i)全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)(全血を再構成するために)吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの流体を回収して、長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するステップと、を含む、方法。
4. 長さが200ヌクレオチド未満の前記RNA画分が、miRNA、tRNA、siRNA、piRNAおよびsnorRNAからなる群から選択される1つまたは複数のRNA分子を含む、第3項の方法。
5. 前記親水性ポリマー材料が6g/cm3以下、好ましくは4g/cm3以下の密度を有する、第1項から第4項のいずれか一項の方法。
6. 前記親水性ポリマー材料が0.5〜6g/cm3、好ましくは1〜4g/cm3の密度を有する、第5項の方法。
7. 前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第1項から第6項のいずれか一項の方法。
8. 前記親水性ポリマー材料が、前記材料の全体積の20〜70%、好ましくは30〜50%の細孔容積を有する、第1項から第7項のいずれか一項の方法。
9. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で100μm以下、好ましくは50μm以下の細孔を含む、第7項または第8項の方法。
10. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で10〜100μm、好ましくは20〜50μmの細孔を含む、第9項の方法。
11. 前記水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択される、第1項から第10項のいずれか一項の方法。
12. (i)前記多糖類が、セルロースであり、
(ii)前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第11項の方法。
13. 前記吸収性プローブが1〜50μlの全血の所定の最大容量を吸収した、第1項から第12項のいずれか一項の方法。
14. 前記吸収性プローブが10mm以下、好ましくは5mm以下の長さを有し、また40mm2以下、好ましくは20mm2以下の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが250mm3以下、好ましくは200mm3以下の体積を有する、第1項から第13項のいずれか一項の方法。
15. 前記吸収性プローブが2〜10mm、好ましくは2〜5mmの長さを有し、また5〜40mm2、好ましくは5〜20mm2の断面積を有するか、前記吸収性プローブが、1mm3〜250mm3、好ましくは2.5mm3〜200mm3の体積を有する、第14項の方法。
16. 前記親水性ポリマー材料に吸収された全血が乾燥されている、第1項から第15項のいずれか一項の方法。
17. 前記方法が、
(iv)1つまたは複数の分離技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を単離するステップをさらに含む、第3項から第16項のいずれか一項の方法。
18. 1つまたは複数の分離技術が、遠心分離、蒸発/再構成、濃縮、沈殿、液体/液体抽出、および固相抽出からなる群から選択される、第17項の方法。
19. 長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定する方法であって、
(i)第3項から第18項のいずれか一項の方法を実施するステップ、および
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップを含む、方法。
20. 長さが200ヌクレオチド未満の前記RNA分子が、miRNA、tRNA、siRNA、piRNAおよびsnorRNAからなる群から選択される、第19項の方法。
21. ステップ(ii)で決定された前記レベルが発現レベルである、第19項または第20項の方法。
22. 前記適切な技術が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、第19項から第21項のいずれか一項の方法。
23. (i)前記核酸ハイブリダイゼーションがマイクロアレイ/バイオチップ、ビーズ、またはin situハイブリダイゼーションを使用して実施され、および/または
(ii)前記核酸増幅がリアルタイムPCRを使用して行われる、第22項の方法。
24. 個体における疾患の診断方法であって、
(i)第3項または第18項の方法を実施するステップであって、前記全血サンプルが個体由来である、ステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、
(iii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iv)該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
25. 前記適切な技術が核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、第24項の方法。
26. 個体における疾患を診断する方法であって、
(i)第19項または第23項の方法を実施するステップであって、前記全血サンプルが個体由来である、ステップと、
(ii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iii)個体が比較に基づいて疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。
27. 前記1つまたは複数の参照レベルが、
1もしくは複数の健康な被験者、
疾患に罹患している1もしくは複数の被験者、および/または
他の疾患に罹患している1もしくは複数の被験者、の1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される、第24項から第26項のいずれか一項の方法。
28. 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用。
29. 長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分が、リボソーム18S RNAおよびリボソーム28S RNAからなる群から選択される1つまたは複数のRNA分子を含む、第28項の使用。
30. 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用。
31. 前記長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分がmiRNA、tRNA、siRNA、piRNAおよびsnorRNAからなる群から選択される1つまたは複数のRNA分子を含む、第30項の使用。
32. 前記親水性ポリマー材料が6g/cm3以下、好ましくは4g/cm3以下の密度を有する、第28項から第31項のいずれか一項の使用。
33. 前記親水性ポリマー材料が0.5〜6g/cm3、好ましくは1〜4g/cm3の密度を有する、第32項の使用。
34. 前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第28項から第33項のいずれか一項の使用。
35. 前記親水性ポリマー材料が材料の全体積の20〜70%、好ましくは30〜50%の細孔体積を有する、第28項から第34項のいずれか一項の使用。
36. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で100μm以下、好ましくは50μm以下の細孔を含む、第34項または第35項の使用。
37. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で10〜100μm、好ましくは20〜50μmの細孔を含む、第36項の使用。
38. 前記水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィン、ポリエステルからなる群から選択される、第28項から第37項のいずれか一項の使用。
39. (i)前記多糖類が、セルロースであり、
(ii)前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第38項の使用。
40. 疾患を診断または鑑別診断するための、第19項から第23項のいずれか一項の方法の使用。
41. (i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキット。
42. 前記キットが全血サンプルを採取するのに有用である、第41項のキット。
43. 前記キットが、
(ii)個体から血液を取り出す手段、
(iii)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子の前記レベルを決定するための手段、
(iv)容器、および/または
(v)吸収された全血サンプルの全血サンプルを有する吸収性プローブが、第1項から第27項のいずれか一項の方法において使用できるという情報を含むデータ媒体をさらに含む、第41項または第42項のキット。
44. (i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体
を含むキット。
45. 前記キットが第1項〜第27項のいずれか一項の方法の実施に有用である、第44項のキット。
46. 前記キットが、
(ii)長さが200ヌクレオチド以上のRNA分子および/または長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子の前記レベルを決定するための手段、
(iii)容器、および/または
(iv)第1項〜第23項のいずれか一項の方法をどのように実施するかに関する指示が入力されデータ媒体
をさらに含む、第44項または第45項のキット。
47. 前記親水性ポリマー材料が6g/cm3以下、好ましくは4g/cm3以下の密度を有する、第41項〜第46項のいずれか一項のキット。
48. 前記親水性ポリマー材料が0.5〜6g/cm3、好ましくは1〜4g/cm3の密度を有する、第47項のキット。
49. 前記親水性ポリマー材料が多孔質である、第41項〜第48項のいずれか一項のキット。
50. 前記親水性ポリマー材料が、材料の全体積の20〜70%、好ましくは30〜50%の細孔容積を有する、第41項〜第49項のいずれか一項のキット。
51. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で100μm以下、好ましくは50μm以下の細孔を含む、第49項または第50項のキット。
52. 前記親水性ポリマー材料が、直径または最大断面寸法で10〜100μm、好ましくは20〜50μmの細孔を含む、第51項のキット。
53. 前記水性ポリマー材料が綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択される、第41項〜第52項のいずれか一項のキット。
54. (i)前記多糖類が、セルロースであり、
(ii)前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、およびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)前記ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、第53項のキット。
55. 前記吸収性プローブが1〜50μlの全血の所定の最大容量を吸収するように構成された、第41項〜第54項のいずれか一項のキット。
56. 前記吸収性プローブが10mm以下、好ましくは5mm以下の長さを有し、また、40mm2以下、好ましくは20mm2以下の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが250mm3以下、好ましくは200mm3以下の体積を有する、第41項〜第55項のいずれか一項のキット。
57. 前記吸収性プローブが2〜10mm、好ましくは2〜5mmの長さを有し、また、5〜40mm2、好ましくは5〜20mm2の断面積を有するか、または前記吸収性プローブが1mm3〜250mm3、好ましくは2.5mm3〜200mm3の体積を有する、第56項のキット。
実施例1:親水性ポリマー吸収デバイス(Mitra Microsampling Device)を使用する血液サンプル回収
血液は、無菌の安全性ランセット(Safety−Lancet Extra 18G、Sarstedt、Numbrecht、ドイツ)と各個体当たり4つのMitra Microsampling Device(neoteryx、Torrance、CA、米国、Ordering No.10005)を使用して、左手中指を穿刺することにより、異なる個体(n=3)から回収した。Mitra Microsampling Device(図6)の血液を周囲温度で2時間乾燥させた。Mitra Microsampling Deviceのサンプラー本体から各個体あたり4個の血液充填サンプラーチップを取り出し、2mlチューブ(Eppendorf、Hamburg、ドイツ)に移した。
長さが200nt未満の短鎖RNA抽出(マイクロRNA画分を含む)は、フェノール−クロロホルム抽出技術を使用して行った。短鎖RNAの精製は、miRNeasy Serum Plasma Kit(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ)を使用して行った。ここでは、1mLのQiazol試薬(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ、カオトロピック試薬としてのチオシアン酸グアニジンおよびフェノールを含む)を、4つのMitra Sampler Tip(実施例1、血液サンプル回収を参照)を含む2mLチューブにピペッティングした。次いで、チューブを4℃、振盪機上で1000rpmにて16時間インキュベートした。その後、全上澄みを、新しい2mLエッペンドルフチューブに移した。200μlのクロロホルムを添加した後、混合物を15秒間十分にボルテックスし、室温で2分間インキュベートした後、12,000×gにて15分間4℃で遠心分離した。その後、上部の水性相を他の2つの相に触れることなく新しい1mLのチューブに移した。1.5容量の100%エタノールを水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合し、室温で10分間インキュベートした。次いで、700μlのサンプルをQiagen MinEluteカラムに移し、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。最後の2つのステップを、全サンプル体積がカラムに適用されるまで繰り返した。その後、700μlの緩衝液RWTを各カラムに添加し、13,000rpmにて15秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、500μlの緩衝液RPEをカラムに加え、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、500μLの80%エタノールをカラムに添加し、13,000rpmにて2分間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、カラムを新しい2ml採取管に入れ、開放蓋を用いて13,000rpmにて5分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい1.5ml収集チューブに移した。総RNA含有量の溶出については、マイクロRNA14μlのRNaseフリー水をカラムにピペッティングし、1分間インキュベートし、室温で13,000rpmで1分間遠心分離した。別のRNaseフリー水14μlをカラムにピペッティングし、室温で1分間インキュベートし、室温で13,000rpmにて1分間、遠心分離した。長さが200nt未満の溶出された短鎖RNA画分(マイクロRNA画分を含む)を、品質管理および定量化まで氷上で保存した。
血液は、無菌の安全性ランセット(Safety−Lancet Extra 18G、Sarstedt、Numbrecht、ドイツ)を使用し、左手薬指を穿刺することにより異なる個体(n=3)から回収した。約0.5〜4.0平方センチメートルの面積をカバーしている親水性セルロース含有吸収性デバイス(Non−Indicating FTA Classic Card(GE Healthcare Life Science社製、Buckinghamshire、英国)、Non−Indicating FTA Elute Micro Card(GE Healthcare Life Science社製、Buckinghamshire、英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences社製、Austin、TX、米国)、HemaSpot SE(Spot On Sciences社製、Austin、TX、米国)、TNF(Munktell社製、Barenstein、ドイツ)、TNF−Di(Munktell社製、Barenstein、ドイツ)を含めた様々な製造業者製のセルロース含有濾紙)に、各個体当たり血液2滴を加えた。様々な親水性セルロース含有吸収性プローブを2時間乾燥し、次いで周囲温度で1週間保存した。親水性セルロース含有吸収性プローブの血液吸収領域を切り出し、2mLチューブ(Eppendorf、Hamburg、ドイツ)に移した。
長さが200nt未満の短鎖RNA(マイクロRNA画分を含む)の抽出は、フェノール−クロロホルム抽出技術を使用して行った。短鎖RNAの精製は、miRNeasy Serum Plasma Kit(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ)を用いて行った。1mLのQiazol試薬(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ)を、乾燥により全血サンプルが吸収された親水性セルロース含有吸収性デバイスを含む2mLチューブにピペッティングした(血液サンプル回収、実施例3を参照されたい)。次いで、チューブを4℃、振盪機上で1000rpmにて16時間インキュベートした。その後、全上澄みを新しい2mLエッペンドルフチューブに移した。200μlのクロロホルムを添加した後、混合物を15秒間十分にボルテックスし、室温で2分間インキュベートし、次いで12,000×gにて4℃で15分間、遠心分離した。その後、上部の水性相を他の2つの相に触れることなく新しい2mLチューブに移した。1.5容量の100%エタノールを水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合し、室温で10分間インキュベートした。次いで、700μlのサンプルをQiagen MinEluteカラムに移し、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。最後の2つのステップを、全サンプル体積がカラムに適用されるまで繰り返した。その後、700μlの緩衝液RWTを各カラムに添加し、13,000rpmにて15秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、500μlの緩衝液RPEをカラムに加え、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、500μLの80%エタノールをカラムに添加し、3,000rpmにて2分間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、カラムを新しい2ml採取管に入れ、開放蓋を用いて13,000rpmにて5分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい1.5ml収集チューブに移した。短鎖RNA含有物の溶出については、マイクロRNA14μlのRNaseフリー水をカラムにピペッティングし、1分間インキュベートし、室温で13,000rpmにて1分間、遠心分離した。別のRNaseフリー水14μlをカラムにピペッティングし、室温で1分間インキュベートし、室温で13,000rpmにて1分間、遠心分離した。長さが200nt未満の溶出された短鎖RNA(マイクロRNAを含む)を、品質管理および定量化まで氷上で保存した。
血液は、異なる個体から採取した(n=3)。ここでは、各献血者について、2.5mlの全血をPAXgene Blood RNAチューブ(PreAnalytix、Hombrechticon、スイス)への静脈穿刺により回収した。血液細胞は、遠心分離によって全血サンプルを処理することから得られた/取得した。ここで、前記採血管に回収した全血からの血球は、5000×g、10分間の遠心分離により遠心分離した。上澄み(細胞外血液画分を含む)は廃棄したが、血球ペレット(赤血球、白血球および血小板を含む細胞血液画分)はさらなる処理のために回収した。短鎖RNA(miRNA画分を含み、200nt未満)を含むが、200ntを超えるRNA画分も含む全RNAは、miRNeasy Mini Kit(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ)を使用し、回収した血液細胞から抽出した。詳細については、実施例6を参照されたい。
短鎖RNA(miRNA画分を含み、200nt未満)および200ntを超えるRNA画分を含めた全RNAの単離は、miRNeasy Mini Kit(Qiagen GmbH、Hilden、ドイツ)を使用して行った。ここでは、血球ペレット(実施例5で概説したようにして得られた)を、上下にピペッティングすることで700μlのQIAzol溶解試薬に十分に再懸濁し、直ちに懸濁液を新しい1.5mlエッペンドルフチューブに移した。次に140μlのクロロホルムを添加し、十分にボルテックスし、室温で2〜3分間インキュベートした後、12,000gにて15分間、4℃で遠心分離した。その後、上部の水性相を、他の2つの相に触れることなく、細心の注意を払い新しい2mlチューブに移した。次いで、1.5容量の100%エタノールを移した水性相に添加し、ピペッティングにより十分に混合した。次いで、700μlのサンプルをカラムに移し、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、700μlの緩衝液RWTを各カラムに添加し、13,000rpmにて15秒間、室温で再度遠心分離し、流出液を捨てた。次いで、500μlの緩衝液RPEをカラムに加え、13,000rpmにて15秒間、室温で遠心分離し、流出液を捨てた。その後、別の500μlの緩衝液RPEをカラムに添加し、13,000rpmにて2分間、室温で遠心分離し、流出液を廃棄した。次いで、カラムを新しい2ml採取管に入れ、13,000rpmにて1分間、室温で遠心分離して乾燥させた。カラムを新しい1.5ml回収チューブに移した。総RNA含有量の溶出については、マイクロRNA40μlのRNaseフリー水をカラムにピペッティングし、1分間インキュベートし、室温で13,000rpmにて1分間、遠心分離した。次いで、溶出液を同じカラムに戻し、室温で1分間インキュベートし、再び1分間遠心分離した。低分子RNA(200nt未満、miRNA画分を含む)および200ntを超えるRNA画分を含む溶出全RNAはNanoDrop 1000を用いて定量し、発現プロファイリング実験に使用するまで−20℃で保存した。
抽出したRNAの品質管理および定量は、AgilentのBioanalyzer(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、米国)を、製造業者のプロトコールおよびBioanalyzer SmallおよびNano Assayに従って使用して行った。RNAを70℃で2分間変性させた後、Small and Nano Assayの両方のBioanalyzerチップに1μLを適用した。チップを2,400rpmでボルテックスし、Bioanalyzer Instrumentで5分以内に泳動させた。
マイクロRNA画分を含む全RNAサンプルを、AgilentのヒトmiRNA 8x60kマイクロアレイ(リリースv21)で、製造業者のプロトコールに従って分析した。マイクロRNAのCy3酵素標識および回転ハイブリダイゼーションオーブン中での55℃、20時間のアレイハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイスライドを2回洗浄し(非ストリンジェントおよびストリンジェント)、その後、AgilentのSureScan Microarray Scannerでスキャンした。得られた画像データをAgilent Feature Extractionソフトウェア(バージョン11)を用いて評価した。Feature Extractionソフトウェアによって生成された生データファイル(Gene View)は、本コール解析のためにExcelにインポートした。
乾燥血液スポット(DBS)が安定したmiRNA測定を容易にするか否か、また生物学的変動に対する技術的安定性の比較をさらに系統的に調査した。第1に、異なる環境条件(例えば、温度および湿度)に暴露された同一個体由来のサンプルの全ゲノムワイドmiRNAプロファイルを生成することによりDBSサンプルの安定性を試験した。第2に、同一個体から採取したサンプルを7回繰り返すことによる技術的再現性を調べた。第3に、異なる治療を受けている53名の肺がん患者からのサンプルを調査した。3段階の間に、108のゲノムワイドmiRNAプロファイルが生成され、生物統計学的手段によって評価した。
サンプル回収:試験のため、乾燥血液スポット上に合計78サンプルを回収した。TNF紙(Munktell、Barenstein、ドイツ)(Ahlstrom)を使用した。到着後、RNA抽出まで、乾燥血液スポットは−80℃で保存した。安定分析については、1つの個体が含まれており、異なる環境条件に暴露された。温度は摂氏26〜35℃、湿度は38.5〜60%の間で変化させた。ワークフロー全体、すなわち異なる抽出と異なるマイクロアレイとの間で再現性を獲得するため、本発明者らは別の個体の技術的な7回の複製を実施した。それぞれのサンプルは、肺がん試験と共にプロセスコントロールとして測定した。また同一個体も、乾燥血液スポット上のmiRNAレパートリーを比較するためのPAXGene Blood Tubes(BD)を使用し、血液チューブを用いて調べた。臨床事例として、異なる治療法に曝露された53名の肺がんサンプルを調査した。詳細には、治癒(アジュバント)治療を受けている患者に属する17サンプルと、緩和ケアを受けている患者の36サンプルであった。アジュバント治療は、治癒の機会を改善するための一次外科的治療に追加的に適用され、一方、緩和ケアは進行がんの症例である生活の質の改善のために使用された。試験は、地元倫理委員会により承認されており、参加者から書面による同意を得た。血液サンプルは乾燥血液スポット上に回収した。すべてのサンプルを、miRBase V21マイクロアレイ(Agilent)で測定した。異なるマイクロアレイを比較するため、26サンプルのサブセットもmiRBase V19マイクロアレイ(Agilent)上で測定した。合計で、30種の全miRNomeがV19でプロファイリングされ、78種の全miRNomeがV21マイクロアレイでプロファイリングされた。
この試験の目的は、乾燥血液スポットからのゲノムワイドmiRNAプロファイルを確実に測定し、疾患診断における適用を促進するか否かを検討することであった。3段階のアプローチを実施した。第1に、異なる環境条件下での複製をプロファイリングした。第2に、プロセスコントロールとしての技術的複製が確立され、一連のマイクロアレイ上で測定された。第3に、臨床的実現可能性を、肺がん患者サンプルを使用して試験した。3段階において測定されたmiRNomeの数値の概要を以下の表1に示す。
異なる環境条件に暴露された一連の乾燥血液スポットサンプルからmiRNAを抽出した。3つの温度と3つの湿度レベルの組合せを調べ、各組合せを3回測定した。したがって、3つの形態の6つの組合せを有することにより、合計18のmiRNomeがマイクロアレイ上にプロファイリングされた。クラスターヒートマップを確立した(データは示さず)。異なる条件を相互に比較した。結果を図8Aに示す。0.997の最低相関が温度に関して計算された。最も低い影響に対応する最も高い相関−湿度(相関0.999)について計算した。これらの結果は、主要な様々な構成要素分析によっても確認されている(図8B参照)。これらの結果は、乾燥血液スポットから測定されたmiRNAが固有の安定性を有し、例えば、サンプルの中央実験室への輸送によって引き起こされる、様々な条件にそれらが暴露されたとしても、診断情報のキャリアとして技術的に適していることを示している。
次に、乾燥血液スポットから再現性のあるmiRNomeがマイクロアレイ上でどのようにプロファイリングされるかについて調べた。1名の個体から、7つの異なるAgilentスライドでの7つの技術的複製(Agilent技術では、1つのスライド上で物理的に8つに分離されたアレイ上での8つのサンプルの並列処理が可能)で実行した。これに関して、処理しようとするサンプルはまた、プロセスコントロール(=健常コントロール)と考えることもできる。これらのプロセスコントロールの平均相関は0.993と高かった。同じ測定を、バージョン21の代わりにmiRBAseバージョン19のAgilentマイクロアレイの旧バージョンで繰り返した。ここでは、4つのプロセスコントロールが含まれており、同等の相関が得られた(データは示さず)。以前の分析における結果として、ある個体から複製されたプロセスコントロールは乾燥血液スポットからのmiRNAsが技術的観点から診断ツールとして適していることが強調されている。
最後に、肺がん患者サンプルとプロセスコントロールのサンプルとの間の生物学的差異を調べた。これは2つのステップで実現した。第1に、V19およびV21の両バージョンのAgilentマイクロアレイ上の30個のサンプル(26個の肺がん、4個のプロセスコントロール)をプロファイリングした。階層的クラスタリングを適用することにより、各バージョンについて、類似のサンプル分布を有する2つのクラスターを得た(データは示さず)。治療形態が同じのサンプルは一緒にクラスター化される傾向があっただけでなく、プロセスコントロールもまた1つのクラスターに分類された。第2のステップでは、60個のサンプル(53個の肺がんおよび上述の7個のプロセスコントロール)をmiRBase V21のAgilentマイクロアレイ上にプロファイリングした。この分析ステップの平均相関は0.974であった。プロセスコントロールサンプル(0.993)と肺がんサンプル(0.976)に関する平均相関はこの値を超えていたが、プロセスコントロールサンプルと肺がんサンプルの間で最も低い平均相関(0.967)が計算された。興味深いことに、2つの異なる肺がん治療コホート間に差異があった。したがって、次に「アジュバント」処置患者グループと「緩和」処置患者グループとの間の統計的対比較を、両側t検定を使用して実施した。研究の探索的性質により、生のp値が0.05未満のmiRNAは、有意に制御解除されたと考えられた。前述の比較(アジュバント対緩和)については、51の有意に制御解除されたmiRNA(全591発現miRNAの8.6%)が両側t検定および選択したアルファレベル0.05に基づいて確認された。これらの51のmiRNAのうち、11はアジュバント群(20%)において高い発現を示した。p値が0.019の最もアップレギュレートされたmiRNAはhsa−miR−150−5pであり、p値が0.014の最もダウンレギュレートされたマーカーはhsa−miR−642a−3pであった。すべてのmiRNAは図9のボルケーノプロットに示されており、ここでは、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされたmiRNAをそれぞれダークグレー(上方右側)で、またライトグレー(下方左側)で強調している。発現強度、倍率変化、p値および受信者動作特性曲線下の面積(AUC値)に関する詳細情報を図10に示す。
様々なヒト疾患に対し、非侵襲性バイオマーカーとしてmiRNAsを用いる研究の数が増えている。多くの場合、これらのmiRNAは、血清、血漿または全血由来であった。PAXgeneおよびEDTAなどの保存チューブが一般に使用されているが、DBSからのmiRNAの研究はまだ新しい領域である。
Claims (20)
- 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去する方法であって、
(i)該全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)該吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの該流体を回収して、長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するステップと、を含む、方法。 - 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製する方法であって、
(i)該全血サンプルの全血が吸収されている親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを提供するステップと、
(ii)該吸収性プローブを流体と接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)からの該流体を回収し、それにより長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するステップと、を含む、方法。 - 前記親水性ポリマー材料が、6g/cm3以下、好ましくは4g/cm3以下の密度を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記親水性ポリマー材料が綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択され、好ましくは、
(i)該多糖類が、セルロースであり、
(ii)該ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または、
(iii)該ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - (iv)1つまたは複数の分離技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を単離するステップをさらに含み、
好ましくは、該1つまたは複数の分離技術が、遠心分離、蒸発/再構成、濃縮、沈殿、液体/液体抽出、および固相抽出からなる群から選択される、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。 - 長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定する方法であって、
(i)請求項2から5のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、を含む、方法。 - 前記適切な技術が、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 個体における疾患の診断方法であって、
(i)前記全血サンプルが個体由来である、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法を実施するステップと、
(ii)適切な技術によって、長さが200ヌクレオチド未満のRNA分子のレベルを決定するステップと、
(iii)該レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iv)該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。 - 前記適切な技術が、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ伸長、配列決定、および質量分析、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 個体における疾患の診断方法であって、
(i)前記全血サンプルが個体由来である、請求項6または7に記載の方法を実施するステップと、
(ii)前記レベルを1つまたは複数の参照レベルと比較するステップと、
(iii)該個体が該比較に基づいて該疾患に罹患しているか否かを診断または鑑別診断するステップと、を含む、方法。 - 前記1つまたは複数の参照レベルが、
1または複数の健康な被験者、
疾患に罹患している1または複数の被験者、および/または、
別の疾患に罹患している1または複数の被験者のうちの1つまたは複数の参照全血サンプルを測定することによって決定される、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。 - 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド以上のRNA画分を除去するための親水性ポリマー材料の使用。
- 全血サンプルから長さが200ヌクレオチド未満のRNA画分を精製するための親水性ポリマー材料の使用。
- 前記親水性ポリマー材料が6g/cm3以下、好ましくは4g/cm3以下の密度を有する、請求項12または13に記載の使用。
- 前記親水性ポリマー材料が、綿、多糖類、ポリオレフィンおよびポリエステルからなる群から選択され、好ましくは、
(i)前記多糖類が、セルロースであり、
(ii)前記ポリオレフィンが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリイソブチレンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択され、または
(iii)ポリエステルが、ポリカーボネートおよびポリエチレンテレフタレートからなる群から選択される、請求項12から14のいずれか一項に記載の使用。 - 疾患を診断または鑑別診断するための、請求項6または7に記載の方法の使用。
- (i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブを含むキット。
- 全血サンプルを採取するのに有用である、請求項17に記載のキット。
- (i)親水性ポリマー材料を含む吸収性プローブに吸収された全血を再構成するための流体を含むキット。
- 請求項1から11のいずれか一項に記載の方法の実施に有用である、請求項19に記載のキット。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2009518020A (ja) * | 2005-12-09 | 2009-05-07 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 短鎖核酸の濃縮方法 |
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