CN109154544A - 使用亲水性聚合材料的rna级分的纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法。本发明还涉及从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法。本发明进一步涉及对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定的方法。此外，本发明涉及用于对个体的疾病进行诊断的方法。另外，本发明涉及用于实施本发明的方法的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法。本发明还涉及从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法。本发明进一步涉及对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定的方法。此外，本发明涉及用于对个体的疾病进行诊断的方法。另外，本发明涉及用于实施本发明的方法的试剂盒。
背景技术
全血样品被用于分子生物学分析，例如以确定患者是否患有特定疾病。这些样品通常通过采集全血、冷冻然后处理经冷冻的血液来收集。冷冻的血液需要至少200μL的样品量。冷冻运输和全血的处理涉及高成本。
因此，优选使用血斑技术(bloodspot technique)收集全血样品。该技术需要较小的样品体积(对人而言，通常为45μL-60μL)，但是不断发展的分析技术采用使用10μL-15μL的人血和更小的样品。一旦取样完成，将血斑在空气中干燥，然后转移或邮寄至实验室以进行处理。因为血液是干燥的，所以不认为其是危险的。因此，在操作或运送时不需要采取特殊的预防措施。一旦到达分析地点，将期望的组分(例如蛋白质或代谢物)从干血斑提取至上清液，随后例如通过液相色谱和/或质谱对该上清液进一步分析。
现今，全血中包含的生物标志物在疾病的早期诊断、风险分级和治疗管理中起关键作用。特别地，微小RNA(miRNA)是在全血中发现的生物标志物。其代表一组调控元件，所述调控元件使细胞能够在众多的生物过程(例如增殖、分化、凋亡、应激反应和肿瘤形成)中对复杂的基因表达级联进行微调。miRNA存在于血细胞中以及作为游离循环核酸存在于血液中。这是由于以下事实：miRNA在血细胞或多种组织中表达，所述血细胞或多种组织将miRNA释放到循环血液中。
目前，使用PaxGene blood RNA管收集血液，以便测定其中包含的RNA生物标志物(例如miRNA)的水平。需要大量的基于仪器和分析的工作来纯化和分离其中包含的RNA生物标志物(例如miRNA)。此外，这种技术非常耗时并且昂贵。
因此，需要一种改进的血液制备方法，从而减少或消除一个或多个上述误差和困难。
本发明的发明人首次评定：为了降低来源于全血样品的RNA级分的复杂性，血斑技术是有用的。具体而言，本发明的发明人发现对于以下方面而言，血斑技术是有价值的：从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分，或者从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分(包括miRNA)。纯化和/或分离的RNA级分包含RNA分子。本发明的发明人进一步发现：可确定这样纯化和/或分离的RNA分子(例如miRNA分子)的表达谱，并且所述表达谱具有高质量。此外，本发明的发明人发现：血斑技术提供在不同的环境条件(例如温度和/或湿度)下的样品稳定性，提供技术稳定性，并且允许对患有疾病的个体进行诊断或鉴别诊断。
发明内容
在第一方面，本发明涉及从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自所述全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而移除长度≥200个核苷酸的RNA级分。
在第二方面，本发明涉及从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自所述全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。
在第三方面，本发明涉及测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施根据第二方面所述的方法；以及
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定。
在第四方面，本发明涉及用于对个体的疾病进行诊断的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施根据第二方面所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定；
(iii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iv)基于所述比较，对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
或者，可以如下阐述第四方面：用于对个体的疾病进行诊断的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施根据第三方面所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iii)基于所述比较，对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
在第五方面，本发明涉及亲水性聚合材料用于从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的用途。
在第六方面，本发明涉及亲水性聚合材料用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的用途。
在第七方面，本发明涉及根据第三方面所述的方法用于诊断或鉴别诊断疾病的用途。
在第八方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料。
在第九方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)流体，所述流体用于重构吸附探针中/上所吸附的全血，所述吸附探针包含亲水性聚合材料。
发明内容没有必要描述本发明的所有特征。通过阅读随后的具体描述，其它实施方式将变得显而易见。
具体实施方式
定义
在下面对本发明进行详细描述之前，应理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案和试剂，因为它们可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求所限制。除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。
优选地，本文使用的术语按如下文献中所述来定义：“A multilingual glossaryof biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel,B.和H.著(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland。
在本说明书全文中引用了若干文献。不论在上文或下文中，本文引用的各文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、使用说明、GenBank提交序列的登录号等)均通过引用的方式以其整体并入于此。不应将本文的任何内容解释为承认本发明无权借助在先发明而先于这些公开。如果这些并入的参考文献的定义或教导与本说明书中所述的定义或教导之间冲突，本说明书的文本优先。
根据本发明，术语“包含/包括(comprise)”或其变化形式(例如，包含/包括(“comprises”和“comprising”))是指包含所述的整体或整体的组，但不排除任何其它整体或整体的组。根据本发明，术语“基本上由···组成(consisting essentially of)”是指包含所述的整体或整体的组，同时排除实质上影响或改变了所述的整体的其它整体或变型。根据本发明，术语“由···组成(consisting of)”或变化形式(例如，由···组成(“consists of”))是指包含所述的整体或整体的组，并排除任何其它整体或整体的组。
除非本文另有指出或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(尤其是权利要求的上下文中)所使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似的指代应理解为涵盖单数和复数。
如本文所使用的，术语“核苷酸”是指作为核酸(如DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸))的单体或亚单元的有机分子。核苷酸(核酸的结构单元)由含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及至少一个磷酸基团组成。因此，核苷加磷酸基团产生核苷酸。
如本文所使用的，术语“长度≥200个核苷酸的RNA级分”是指包含大的RNA分子(即长度≥200个核苷酸的一种或多种RNA分子)的RNA部分。所述一种或多种RNA分子包括核糖体RNA(rRNA)分子。它们可选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组。
在本发明的上下文中，术语“核糖体核糖核酸(缩写为rRNA)”是指核糖体的RNA组分，并且对所有活的有机体的蛋白质合成而言都是必需的。其构成核糖体(大约60wt％rRNA和40wt％蛋白质)内的主要物质。核糖体含有两种主要的rRNA和50种以上的蛋白质。核糖体rRNA形成两个亚基：大亚基(LSU)和小亚基(SSU)。大亚基包含核糖体28S RNA，小亚基包含核糖体18S RNA。
如本文所使用的，术语“长度＜200个核苷酸的RNA级分”是指包含小的RNA分子(即长度＜200个核苷酸的一种或多种RNA分子)的RNA部分。所述一种或多种RNA分子可选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
术语“微小RNA(microRNA，缩写为miRNA)”是指长度为至少10个核苷酸且不超过40个核苷酸的单链RNA分子。所述核苷酸共价连接在一起。例如，所述单链RNA分子具有10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸、25个核苷酸、26个核苷酸、27个核苷酸、28个核苷酸、29个核苷酸、30个核苷酸、31个核苷酸、32个核苷酸、33个核苷酸、34个核苷酸、35个核苷酸、36个核苷酸、37个核苷酸、38个核苷酸、39个核苷酸或40个核苷酸的长度。miRNA调控基因表达并且由基因编码，miRNA从所述基因的DNA转录但不翻译成蛋白质(即miRNA是非编码RNA)。编码miRNA的基因比加工的成熟miRNA分子长。在细胞核内，miRNA首先被转录成初级转录本或具有帽和多聚(A)尾的pri-miRNA，然后被加工成短的、70个核苷酸的茎环结构(称为pre-miRNA)。在动物中，该加工由被称为微处理器复合体(Microprocessor complex)的蛋白复合体来进行，所述微处理器复合体由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha组成。这些pre-miRNA然后在细胞质中通过与核酸内切酶Dicer的相互作用被加工成成熟miRNA，其还起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成。当Dicer切割pre-miRNA茎环时，形成两条互补的短RNA分子，但仅一条整合进RISC。这一条链被称为前导链(guide strand)，并且基于5’端的稳定性，由argonaute蛋白(RISC中的催化活性RNA酶)选择。剩下的链(称为miRNA*、反义前导链(反义链)或过客链(passenger strand))作为RISC底物被降解。因此，miRNA*来源于与“正常”miRNA相同的发卡结构。所以，如果之后将“正常”miRNA称为“成熟miRNA”或“前导链”，则将miRNA*称为“反义前导链”或“过客链”。
如本文所使用的，术语“转运RNA(缩写为tRNA)”是指由RNA(通常长度为76-90个核苷酸)组成的接头分子(adaptor molecule)，所述接头分子用作mRNA与蛋白质的氨基酸序列之间的物理连接。tRNA通过按照信使RNA(mRNA)中的三核苷酸序列(密码子)指导将氨基酸携带至细胞的蛋白质合成机器(核糖体)中来实现这一点。由此，tRNA是翻译(根据遗传密码子生物合成新蛋白质)的必需组分。
如本文所使用的，术语“小干扰RNA(缩写为siRNA)”是指一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对。siRNA起多种作用，但在RNA干扰(RNAi)通路中最为显著，在RNAi通路中，siRNA与互补核苷酸序列干扰特定基因的表达。siRNA通过在转录后使mRNA分解而发挥功能，从而导致没有翻译。
如本文所使用的，术语“piwi-相互作用RNA(piwi-interacting RNA，缩写为piRNA)”是指在动物细胞中表达的最大一类的非编码小RNA分子。piRNA通过与piwi蛋白相互作用形成RNA-蛋白复合体。这些piRNA复合体与在生殖系细胞中的逆转录转座子和其它遗传元件的表观遗传和转录后基因沉默(尤其是精子发生中的那些)相关。piRNA在以下方面区别于微小RNA(miRNA)：大小(26nt-31nt，而非21nt-24nt)、缺乏序列保守性、以及复杂性增加。
如本文所使用的，术语“核仁小RNA(缩写为snoRNA)”是指主要引导其它RNA(主要是核糖体RNA、转运RNA和核小RNA(small nuclear RNA))的化学修饰的一类小RNA分子。存在两类主要的snoRNA：C/D box snoRNA，其与甲基化相关；以及H/ACA box snoRNA，其与假尿嘧啶化(pseudouridylation)相关。snoRNA通常作为向导RNA(guide RNA)，但不应与在锥虫中指导RNA编辑的向导RNA相混淆。
如本文所使用的，术语“全血(whole blood)”是指未分级分离的血液。因此，其包含所有血液组分。全血由无细胞液体(血浆或血清)和多种血细胞类型的混合物组成。三种主要的血细胞类型为红血细胞(红血球)、白血细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)。每个类型向血液中的总RNA贡献不同量的RNA。
如本文所使用的，术语“红血细胞(RBC)”和“红血球(erythrocytes)”是指在全血中最丰富的细胞，占血容量的44％。成熟的RBC在成熟过程中失去它们的核和细胞器，因此未向血液总RNA池中贡献任何RNA。然而，未成熟的RBS(也称为网织红细胞)可能保留一些残留的核酸。因为网织红细胞在RBC群体中占约1％，来自网织红细胞的残留RNA贡献了血液总RNA池中多至70％的RNA。
如本文所使用的，术语“白血细胞(WBC)”和“白血球(leukocytes)”是指执行机体免疫功能的有核血细胞。白血球是血液中最具转录活性的细胞。白血球由粒细胞、淋巴细胞和单核细胞组成。粒细胞可进一步分为中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。淋巴细胞可分为B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞。各种淋巴细胞亚型中的细胞数目在疾病状态(例如炎症和白血病)期间可能显著变化。
如本文所使用的，术语“血小板(platelets)”和“凝血细胞(thrombocytes)”是指在血液凝结中起主要作用的血细胞。血小板由称为巨核细胞的大骨髓细胞的破碎而进入血液循环。同红血细胞一样，血小板缺乏核和细胞器。未成熟的血小板(称为网织血小板)含有来自巨核细胞的残留RNA。多至4.5％的血小板计数可为网织血小板。因此，血小板RNA也对血液总RNA池有贡献。
如本文所使用的，术语“血浆”是指淡黄色的血液液体组分，其通常以悬浮状态容纳全血中的血细胞。这使得血浆成为血细胞的细胞外基质。血浆为流体，其由以下组成：约92％的水；7％的重要的蛋白质，例如白蛋白、γ-球蛋白、抗血友病因子和其它凝血因子；以及1％的矿物盐、糖、脂肪、激素和维生素。
如本文所使用的，术语“血清”是指既不是血细胞(血清不含有白血细胞或红血细胞)也不是凝血因子的血液组分。其为不包含纤维蛋白原的血浆。血清包含不用于血液凝结(凝固)的所有蛋白质以及所有的电解质、抗体、抗原、激素和任何外源物质(如药物和微生物)。
如本文所使用的，术语“全血样品”是指不再是个体机体的一部分的血液材料。全血样品可通过从个体中取出血液来提供，但也可通过使用先前分离的血液材料来提供。全血样品可使用常规的血液收集技术从个体中取出。例如，可使用针头从个体的手臂静脉中或通过手指扎刺提取全血。因此，全血样品可具有血滴的形式。所述血滴可位于个体上(例如个体的指尖上)。全血样品也可包含在血液收集管(例如毛细管)或者移液管尖端。
术语“血斑(blood spot)”是指包含一个或多个血滴的滤纸。通常地，在取样之后将所述包含一个或多个血滴的滤纸干燥。本发明的发明人使用亲水性聚合材料来吸附血滴。
术语“血斑技术”是指将血样样品印迹在滤纸上的一种生物取样形式。在生物取样之后，优选地将包含血液的滤纸干燥。干燥的样品可容易地运送至分析实验室并且使用各种方法(例如RNA表达分析)进行分析。特别地，血斑样本通过将由刺血针从手指、足跟或脚趾抽出的数滴血液涂抹在吸附性滤纸上来收集。使血液彻底浸透纸，并且优选风干。可将样本储存在添加有干燥剂的低透气性塑料袋中以减少湿度，并且即使在热带性气候，可将其存放在环境温度下。一旦在实验室中，技术人员可使用自动打孔机或手动打孔机将饱和纸的一小片从纸张上分开，以进行进一步的分析。作为将纸片打孔出来的替代方案，最近的自动化解决方案可在不将其打孔出来的情况下，通过使洗脱液冲洗通过滤纸来提取样品。本发明的发明人使用亲水性聚合材料，血液被印迹/涂抹在所述亲水性聚合材料上。
如本文所使用的，术语“个体(individual)”是指可从中获取、获得或分离全血样品的任何受试者。
如本文所使用的，术语“个体”进一步是指希望了解她或他是否患病的任何受试者。具体而言，如本文所使用的，术语“个体”是指怀疑受疾病影响的受试者。个体可被诊断为受到疾病影响(即患病的)，或者可被诊断为未受到疾病影响(即健康的)。如本文所使用的，术语“个体”还指受到疾病影响(即患病的)的受试者。患者可针对疾病再次测试，并且可被诊断为仍然受到该疾病影响(即患病的)，或者不再受到该疾病影响(即健康的)(例如在治疗干预后)。应当指出的是，被诊断为健康(即没有患该疾病)的患者可能患有未测试或未知的其它疾病。所述疾病可为肺癌。也可将希望知道她或他是否患有疾病的个体指定为患者。
所述个体可为哺乳动物，包括人和其它哺乳动物(例如动物，如啮齿动物、兔或猴)。所述啮齿动物可为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或灰鼠(chinchilla)。
如本文所使用的，术语“(对照)受试者”是指已知受到疾病影响(即患病的)的受试者(阳性对照)。如本文所使用的，术语“(对照)受试者”还指已知未受到疾病影响(即健康的)的受试者(阴性对照)。因此，如本文所使用的，术语“健康受试者”意味着已知未受到疾病影响的受试者。应当指出的是，已知是健康(即未患有所测试/所知的疾病)的(对照)受试者可能患有未测试/未知的其它疾病。所述疾病可为肺癌。
所述(对照)受试者可为哺乳动物，包括人和其它哺乳动物(例如动物，如啮齿动物、兔或猴)。所述啮齿动物可为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或灰鼠。
如本文所使用的，术语“诊断疾病/对疾病进行诊断”是指确定个体是否表现出疾病的迹象或患有该疾病。优选地，所述疾病为肺癌。
如本文所使用的，术语“鉴别诊断疾病/对疾病进行鉴别诊断”是指确定个体是表现出一种疾病的迹象或患有该疾病，还是表现出其它疾病的迹象或患有其它疾病。优选地，所述疾病为肺癌。所述其它疾病为肺癌以外的任何其它疾病。如在本发明的上文中使用的，“鉴别诊断疾病/对疾病进行鉴别诊断”还可允许对经不同治疗的疾病彼此进行区别。例如，所述疾病可为辅助治疗的疾病(例如辅助治疗的肺癌)，而所述其它疾病可为姑息治疗的疾病(例如姑息治疗的肺癌)；或者所述疾病可为姑息治疗的疾病(例如姑息治疗的肺癌)，而所述其它疾病可为辅助治疗的疾病(例如辅助治疗的肺癌)。
如本文所使用的，术语“处理(treatment)”(特别是“治疗性处理”)是指改善健康状况和/或延长(增加)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体的疾病、阻止或减缓个体疾病的发展、抑制或减缓个体疾病的发展、降低个体症状的频率或严重程度、和/或降低目前具有疾病或曾经具有疾病的个体的复发。所述治疗性处理可为对肺癌的处理。所述对肺癌的治疗性处理选自于由化学疗法、外科手术、放射疗法、辅助疗法和姑息疗法所组成的组。
如本文所使用的，术语“吸附探针”是指能够吸附包含在全血样品中的全血的任何探针。本文使用的吸附探针包含亲水性聚合材料、基本上由亲水性聚合材料组成或由亲水性聚合材料组成。
如本文所使用的，术语“亲水性聚合材料”是指能够吸附包含在全血样品中的全血的任何材料。如本文所使用的，术语“亲水性聚合材料”进一步是指含有极性或带电的官能团的聚合材料，所述官能团使该材料溶于水。亲水性聚合材料包括亲水性聚合物。亲水性聚合物由两个以上亲水性单体生产。如本文所使用的，术语“亲水性聚合材料”还包括本质上不是亲水性的但被赋予亲水性的聚合材料(例如，聚乙烯)。如果所述聚合材料最初不是亲水性的，则存在许多方法将该材料转化为亲水状态。用于创造亲水性表面的方法包括用表面活性剂(如Tween-40或Tween-80)进行吸附处理以创造亲水性表面。也可用同时含有亲水元件和疏水元件的其它分子进行处理。所述疏水元件将与疏水性聚合材料强烈相互作用并暴露创造亲水性表面的亲水元件。另外，另一众所周知的向此类材料的表面添加极性基团的方法是用等离子体处理(电晕、空气、火焰或化学)，包括氧等离子体处理。同样地，可使用将亲水性聚合物接枝到表面和用极性或亲水性分子(如糖)对表面上的活性基团进行化学官能化来在聚合材料上获得亲水性表面。共价修饰也可用于将极性或亲水性官能团添加到聚合材料的表面。
所述亲水性聚合材料可选自于由以下所组成的组：含纤维素的材料(例如棉)、多糖、聚烯烃和聚酯，或其修饰物。所述多糖可为纤维素；所述聚烯烃可选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；以及所述聚酯可选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。特别优选棉、纤维素和聚乙烯作为亲水性聚合材料。
包含亲水性聚合材料的装置/探针的实例包括，但不限于：Mitra微量取样装置(Mitra Microsampling Device，neoteryx，Torrance，CA，USA)、非指示型FTA标准卡(Non-Indicating FTA Classic Card，GEHealthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、非指示型FTA洗脱微型卡(Non-Indicating FTA Elute Micro Card，GE Healthcare LifeScience，Buckinghamshire，英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、HemaSpot SE(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、TNF(Munktell，德国)以及TNF-Di(Munktell，德国)。
如本文所使用的，术语“水平”是指长度＜200个核苷酸的RNA分子的量(例如以克、摩尔或离子计数所测量的)或浓度(例如绝对浓度或相对浓度)。如本文所使用的，术语“水平”还包括缩放的的量或值、归一化的的量或值或缩放并归一化的量或值。在一个实施方式中，所述水平为长度＜200个核苷酸的RNA分子的表达水平。所述表达水平可表示为(相对)RNA(例如miRNA)浓度、(相对)RNA(例如miRNA)量或(相对)RNA(例如miRNA)消光单位(例如相对荧光单位)。
在本发明的上下文中，术语“成套试剂盒(kit of parts，缩写为试剂盒)”应理解为本文鉴定的组分中的至少部分的任意组合，所述组合以空间上共存的方式组合至功能单元，并且所述组合可含有其它组分。
本发明的实施方式
现在将对本发明进行进一步描述。在以下段落中，更详细地对本发明的不同方面进行了定义。除非明确地指出相反，如此限定的每个方面可与任何其它方面组合。特别地，除非明确地指出相反，被指明为优选的或有利的任何特征可与被指明为优选的或有利的任何其它特征组合。
本发明的发明人首次评定：为了降低全血样品的复杂性，血斑技术是有用的。具体而言，本发明的发明人发现对于以下方面，血斑技术是有价值的：从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分，或者从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分(包含miRNA)。纯化和/或分离的RNA级分包含RNA分子。本发明的发明人进一步发现可确定如此纯化和/或分离的RNA分子(例如miRNA分子)的表达谱，并且所述表达谱具有高质量。此外，本发明的发明人发现：血斑技术提供了在不同的环境条件(例如温度和/或湿度)下的样品稳定性、提供了技术稳定性、并且允许对患有疾病的个体进行诊断或鉴别诊断。
因此，在第一方面，本发明涉及从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本上由亲水性聚合材料组成或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成，所述亲水性聚合材料中/上吸附了来自全血样品的全血；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而移除长度≥200个核苷酸的RNA级分。
在步骤(i)中，提供了吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本上由亲水性聚合材料组成，或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成；所述亲水性聚合材料中/上吸附了来自全血样品的全血。由此，包含在全血中的长度≥200个核苷酸的RNA分子以及长度＜200个核苷酸的RNA分子被吸附进/至所述亲水性聚合材料中。
步骤(i)中提供的吸附探针可通过将包含亲水性聚合材料的吸附探针、基本上由亲水性聚合材料组成的吸附探针、或由亲水性聚合材料组成的吸附探针与全血样品(物理)接触而获得，由此将全血吸附进/至所述亲水性聚合材料。
吸附探针与全血样品之间的(物理)接触可通过将所述吸附探针浸渍或浸没至所述全血样品而实现。全血样品可具有血滴的形式。全血也可包含在血液收集管中。或者，可将全血样品的一滴或多滴涂抹至吸附探针(例如通过移液器)。由于(物理)接触，全血以及包含在全血中的长度≥200个核苷酸的RNA分子和长度＜200个核苷酸的RNA分子浸进/入亲水性聚合材料中。
通常而言，使探针与全血样品维持(物理)接触以下时间就足够了：1s至20s之间，优选1s至10s之间，更优选1s至5s之间，例如1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s或20s。希望接触时间尽可能地短。在此期间，探针吸附预定体积的血液，并且一旦饱和，就不再吸附更多的血液。可改变探针的大小和形状来调节吸附的血液的体积和吸附速率。以下的血液体积被认为是合适的：1μl至50μl之间的血液体积，优选5μl至25μl之间的血液体积，甚至更优选10μl至20μl之间的血液体积，例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl或50μl的血液体积。
在步骤(ii)中，使吸附探针与流体接触。所述流体可为液体或气体。优选地，所述流体为离液(chaotropic)流体(例如，离液液体或气体)。更优选地，所述离液流体选自于由以下所组成的组：硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。甚至更优选地，所述离液流体为硫氰酸胍。或者，所述离液流体(例如，离液液体或气体)可包含硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。优选地，所述离液流体包含硫氰酸胍。
吸附探针与流体之间的接触可通过将所述吸附探针浸渍或浸没至所述流体而实现。这可通过手动或流体处理机械手来完成。步骤(ii)允许对全血进行重构。对流体和/或吸附探针的物理搅拌技术(例如超声、混合或涡旋)可加快重构过程。具体而言，步骤(ii)使得包含在全血中的分子彼此分离。一些分子可从所述亲水性聚合材料中移除，另一些则不能。这些分子仍然被吸附在/于亲水性聚合材料中。本发明的发明人惊奇地发现：长度≥200个核苷酸的RNA分子仍然被吸附在/于所述亲水性聚合材料中而不进入流体，但长度＜200个核苷酸的RNA分子可在步骤(ii)中被流体从所述亲水性聚合材料中提取出。
在步骤(iii)中，从步骤(ii)回收流体。由于该过程，移除了长度≥200个核苷酸的RNA级分。就此而言，应当指出的是，移除长度≥200个核苷酸的RNA级分并不必然意味着将长度≥200个核苷酸的RNA级分完全移除。本发明也涵盖了其中移除长度≥200个核苷酸的RNA分子的至少部分的实施方式。例如，在一些实施方式中，将至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的长度≥200个核苷酸的RNA分子移除。优选的是，将至少90％的长度≥200个核苷酸的RNA分子移除。更优选的是，将至少95％的长度≥200个核苷酸的RNA分子移除。甚至更优选的是，将至少98％或至少99％的长度≥200个核苷酸的RNA分子移除。最优选的是，将100％的长度≥200个核苷酸的RNA分子(即全部长度≥200个核苷酸的RNA分子)移除。
从步骤(ii)回收流体可通过将吸附探针从流体中移除来实现。
优选地，长度≥200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组。
在第二方面，本发明涉及从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本上由亲水性聚合材料组成或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成；所述亲水性聚合材料中/上吸附了来自全血样品的全血；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。
在步骤(i)中，提供了吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本上由亲水性聚合材料组成，或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成，所述亲水性聚合材料中/上吸附了来自全血样品的全血。由此，包含在全血中的长度≥200个核苷酸的RNA分子以及长度＜200个核苷酸的RNA分子被吸附进/至所述亲水性聚合材料。
步骤(i)中提供的吸附探针可通过将包含亲水性聚合材料的吸附探针、基本上由亲水性聚合材料组成的吸附探针、或由亲水性聚合材料组成的吸附探针与全血样品(物理)接触而获得，由此将全血吸附进/至所述亲水性聚合材料。
吸附探针与全血样品之间的(物理)接触可通过将所述吸附探针浸渍或浸没至所述全血样品而实现。全血样品可具有血滴的形式。全血也可包含在血液收集管中。或者，可将全血样品中的一滴或多滴涂抹至吸附探针(例如通过移液器)。由于(物理)接触，全血以及包含在全血中的长度≥200个核苷酸的RNA分子和长度＜200个核苷酸的RNA分子浸进/入所述亲水性聚合材料中。
通常而言，使探针与全血样品维持(物理)接触以下时间就足够了：1s至20s之间，优选1s至10s之间，更优选1s至5s之间，例如1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s或20s。希望接触时间尽可能地短。在此期间，探针吸附预定体积的血液，并且一旦饱和，就不再吸附更多的血液。可改变探针的大小和形状来调节吸附的血液的体积和吸附速率。以下的血液体积被认为是合适的：1μl至50μl之间的血液体积，优选5μl至25μl之间的血液体积，甚至更优选10μl至20μl之间的血液体积，例如1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39μl、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl或50μl的血液体积。
在步骤(ii)中，将吸附探针与流体接触。所述流体可为液体或气体。优选地，所述流体为离液流体(例如，离液液体或气体)。更优选地，所述离液流体选自于由以下所组成的组：硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。甚至更优选地，所述离液流体为硫氰酸胍。或者，所述离液流体(例如，离液液体或气体)可包含硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。优选地，所述离液流体包含硫氰酸胍。
吸附探针与流体之间的接触可通过将所述吸附探针浸渍或浸没至所述流体中而实现。这可通过手动或流体处理机械手来完成。步骤(ii)允许对全血进行重构。对流体和/或吸附探针的物理搅拌技术(例如超声或涡旋)可加快重构过程。具体而言，步骤(ii)允许包含在全血中的分子彼此分离。一些分子可从所述亲水性聚合材料中移除，另一些分子则不能。这些分子仍然被吸附在/于亲水性聚合材料中。本发明的发明人惊奇地发现：长度≥200个核苷酸的RNA分子仍然被吸附在/于所述亲水性聚合材料中而不进入所述流体，而长度＜200个核苷酸的RNA分子可在步骤(ii)中通过流体从所述亲水性聚合材料中移除。
在步骤(iii)中，从步骤(ii)回收流体。由于该过程，纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。特别地，从重构的血液样品的水相中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。优选地，纯化的长度＜200个核苷酸的RNA级分具有至少50％或至少60％的纯度，更优选至少70％的纯度，甚至更优选至少80％的纯度，最优选至少90％的纯度，例如，至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％的纯度，或者100％的纯度。
从步骤(ii)回收流体可通过将吸附探针从流体中移除而实现。
优选地，所述长度＜200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，吸附探针与流体接触≤20小时，优选≤5小时，例如≤1分钟、≤2分钟、≤3分钟、≤4分钟、≤5分钟、≤6分钟、≤7分钟、≤8分钟、≤9分钟、≤10分钟、≤11分钟、≤12分钟、≤13分钟、≤14分钟、≤15分钟、≤16分钟、≤17分钟、≤18分钟、≤19分钟、≤20分钟、≤21分钟、≤22分钟、≤23分钟、≤24分钟、≤25分钟、≤26分钟、≤27分钟、≤28分钟、≤29分钟、≤0.5小时、≤1小时、≤1.5小时、≤2小时、≤2.5小时、≤3小时、≤3.5小时、≤4小时、≤4.5小时、≤5小时、≤6小时、≤7小时、≤8小时、≤9小时、≤10小时、≤11小时、≤12小时、≤13小时、≤14小时、≤15小时、≤16小时、≤17小时、≤18小时、≤19小时或≤20小时。更优选地，吸附探针与流体接触1分钟到20小时之间，甚至更优选1分钟到5小时之间，例如1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3，例如为0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。更优选地，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，甚至更优选在1g/cm3到4g/cm3之间，例如为0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的孔体积在材料总体积的20％到70％之间，优选在30％到50％之间，例如为材料总体积的20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：≤100μm，优选≤50μm，例如，≤10μm、≤15μm、≤20μm、≤25μm、≤30μm、≤35μm、≤40μm、≤45μm、≤50μm、≤55μm、≤60μm、≤65μm、≤70μm、≤75μm、≤80μm、≤85μm、≤90μm、≤95μm或100μm。更优选地，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：10μm到100μm之间，甚至更优选20μm到50μm之间，例如，10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、或100μm。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料选自于由以下所组成的组：包含纤维素的材料(例如棉)、多糖、聚烯烃和聚酯。优选地，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
更优选地，所述亲水性聚合材料为棉、纤维素或聚乙烯。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述吸附探针吸附预定最大体积在1μl到50μl之间的全血，例如，1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39μl、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl或50μl。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述吸附探针的长度为≤10mm，优选≤5mm，例如，≤2mm、≤2.5mm、≤3mm、≤3.5mm、≤4mm、≤4.5mm、≤5mm、≤5.5mm、≤6mm、≤6.5mm、≤7mm、≤7.5mm、≤8mm、≤8.5mm、≤9mm、≤9.5mm或≤10mm；横截面积为≤40mm2，优选≤20mm2，例如，≤5mm2、≤6mm2、≤7mm2、≤8mm2、≤9mm2、≤10mm2、≤11mm2、≤12mm2、≤13mm2、≤14mm2、≤15mm2、≤16mm2、≤17mm2、≤18mm2、≤19mm2、≤20mm2、≤21mm2、≤22mm2、≤23mm2、≤24mm2、≤25mm2、≤26mm2、≤27mm2、≤28mm2、≤29mm2、≤30mm2、≤31mm2、≤32mm2、≤33mm2、≤34mm2、≤35mm2、≤36mm2、≤37mm2、≤38mm2、≤39mm2或≤40mm2。
当全血样品为血滴(例如来自手指扎刺)时，这样的尺寸被认为是合适的。
在本发明的第一方面和第二方面的可选实施方式中，所述吸附探针的体积为≤250mm3，优选≤200mm3，例如，≤1mm3、≤1.5mm3、≤2mm3、≤2.5mm3、≤3mm3、≤3.5mm3、≤4mm3、≤4.5mm3、≤5mm3、≤5.5mm3、≤6mm3、≤6.5mm3、≤7mm3、≤7.5mm3、≤8mm3、≤8.5mm3、≤9mm3、≤9.5mm3、≤10mm3、≤11mm3、≤12mm3、≤13mm3、≤14mm3、≤15mm3、≤16mm3、≤17mm3、≤18mm3、≤19mm3、≤20mm3、≤21mm3、≤22mm3、≤23mm3、≤24mm3、≤25mm3、≤26mm3、≤27mm3、≤28mm3、≤29mm3、≤30mm3、≤31mm3、≤32mm3、≤33mm3、≤34mm3、≤35mm3、≤36mm3、≤37mm3、≤38mm3、≤39mm3、≤40mm3、≤41mm3、≤42mm3、≤43mm3、≤44mm3、≤45mm3、≤46mm3、≤47mm3、≤48mm3、≤49mm3、≤50mm3、≤60mm3、≤70mm3、≤80mm3、≤90mm3、≤100mm3、≤110mm3、≤120mm3、≤130mm3、≤140mm3、≤150mm3、≤160mm3、≤170mm3、≤180mm3、≤190mm3、≤200mm3、≤210mm3、≤220mm3、≤230mm3、≤240mm3或≤250mm3。
当全血样品为血滴(例如来自手指扎刺)时，这样的体积被认为是合适的。
更优选地，所述吸附探针的长度在2mm到10mm之间、优选在2mm到5mm之间，例如，2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm；横截面积在5mm2到40mm2之间，优选在5mm2到20mm2之间，例如，5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2、13mm2、14mm2、15mm2、16mm2、17mm2、18mm2、19mm2、20mm2、21mm2、22mm2、23mm2、24mm2、25mm2、26mm2、27mm2、28mm2、29mm2、30mm2、31mm2、32mm2、33mm2、34mm2、35mm2、36mm2、37mm2、38mm2、39mm2或40mm2。
在本发明的第一方面和第二方面的可选实施方式中，所述吸附探针的体积在1mm3到250mm3之间，优选在2.5mm3到200mm3之间，例如，1mm3、1.5mm3、2mm3、2.5mm3、3mm3、3.5mm3、4mm3、4.5mm3、5mm3、5.5mm3、6mm3、6.5mm3、7mm3、7.5mm3、8mm3、8.5mm3、9mm3、9.5mm3、10mm3、11mm3、12mm3、13mm3、14mm3、15mm3、16mm3、17mm3、18mm3、19mm3、20mm3、21mm3、22mm3、23mm3、24mm3、25mm3、26mm3、27mm3、28mm3、29mm3、30mm3、31mm3、32mm3、33mm3、34mm3、35mm3、36mm3、37mm3、38mm3、39mm3、40mm3、41mm3、42mm3、43mm3、44mm3、45mm3、46mm3、47mm3、48mm3、49mm3、50mm3、60mm3、70mm3、80mm3、90mm3、100mm3、110mm3、120mm3、130mm3、140mm3、150mm3、160mm3、170mm3、180mm3、190mm3、200mm3、210mm3、220mm3、230mm3、240mm3、或250mm3。
虽然圆柱形探针上的半圆形端部或平端圆柱被认为是期望的，但可使用多种配置。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，对吸附进/至亲水性聚合材料的全血进行干燥。干燥可例如在室温(20℃)或高温(例如30℃)下在露天进行。或者，可将吸附探针转移至专用的干燥容器，所述干燥容器被配置成有助于进行干燥，同时使吸附探针与干燥容器的壁或其它潜在的污染物表面之间的接触最小化。所述干燥容器可包含干燥剂以促进干燥。干燥可进行0.5小时到5小时之间，或者0.5小时到3小时之间，例如，0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、或5小时。就此而言，应当指出的是，由于其取决于湿度、温度、待干燥的体积以及吸附探针的形状和配置，干燥时间可变化。此外，快速干燥血液有助于减缓血液样品的降解。小样品干燥比大样品干燥快。为了减少干燥时间，优选选择亲水性材料为空气可透过的或气体可透过的，从而使空气能够进入吸附探针并将其较快干燥。
可将流体与吸附探针分开，来进行进一步加工(例如，浓缩)或分析(例如，微阵列分析)，同时可弃掉吸附探针。因此，在本发明的第二方面的一个实施方式中，所述方法进一步包括以下步骤：
(iv)通过一种或多种分离技术对长度＜200个核苷酸的RNA级分进行分离。
优选的是，所述一种或多种分离技术选自于由以下所组成的组：离心、蒸发/重构、浓缩、沉淀、液/液提取、以及固相提取。
由于这一分离步骤，可进一步改善长度＜200个核苷酸的RNA级分的纯度。特别优选的是，分离的长度＜200个核苷酸的RNA级分的纯度为至少70％或至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，例如，至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.9％，或者100％。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述吸附探针进一步包含选自于由参比标准、抗凝剂和稳定剂所组成的组的物质。
使用抗凝剂在维持血液的均一性以及阻止不期望的降解方面可能有用。可将抗凝血剂干燥地施用至吸附探针，但是优选湿润地或以液体的形式施用并在使用之前将其干燥。最常见的抗凝剂分为两类：聚阴离子(例如，肝素)或金属螯合物(例如，EDTA，柠檬酸盐)。合适的抗凝剂被认为包括酸性柠檬酸盐葡萄糖(acid citrate dextrose)、柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖、柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖腺嘌呤、柠檬酸钠、K2EDTA、K3EDTA、EDTA钠、肝素锂、肝素钠、以及草酸钾。施用至吸附探针的任何抗凝剂应当与所使用的流体和下游的分析适当地相匹配，以免不利地影响分析的精度。
在分析过程中使用参比标准(例如内标和外标)是常见操作。因此，可在流体制造或取样过程中，将参比标准(湿润的或干燥的)施用至吸附探针；或者当从吸附探针提取(干燥的)血液时，可将其添加至重构的流体中。不影响血液分析的许多非挥发性物质可用作参比标准。可使用放射性标记、荧光标记和氘化标记。
使用稳定剂也是常见操作。稳定剂可用于稳定血液。可将稳定剂干燥地施用至吸附探针，但是优选湿润地或以液体的形式进行施用并在使用前将其干燥。稳定剂的实例包括(但不限于)RNA-later、RNAstable、PAXgene-试剂、RNAsin以及catrimox-14。
在本发明的第一方面和第二方面的一个实施方式中，所述吸附探针为如WO 2013/067520 A1或US 2013116597 A1中所描述的探针。具体而言，所述吸附探针为如WO 2013/067520 A1或US 2013116597 A1中所描述的生物流体取样装置的部分。就此而言，参见WO2013/067520 A1的第10页第28行至第34页第27行、图2-图3和图8、以及权利要求1-19；以及参见US 2013116597 A1的第[0068]-[0129]段、图2-图3和图8、以及权利要求1-19。
在第三方面，本发明涉及测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施第二方面的方法；以及
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定。
本发明的发明人惊奇地发现可测定根据本发明第二方面纯化/分离的RNA分子(例如miRNA)的水平。如此，可缩短样品处理时间，可简化样品分析(例如由于表达谱)，以及可节省成本。
优选地，所述长度＜200个核苷酸的RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
在本发明的第三方面的一个实施方式中，在步骤(ii)中测定的所述水平为表达水平。
步骤(ii)中的测定可通过用于测定RNA分子(例如miRNA)的水平、特别是RNA分子(例如miRNA)的表达水平的任何常规手段来进行。例如，可使用定性、半定量和/或定量检测方法。本领域普通技术人员熟知各种技术。
优选的是，通过以下方法测定RNA分子(例如miRNA)的水平、特别是RNA分子(例如miRNA)的表达水平：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
核酸扩增可使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR))来进行。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)优选用于分析单个RNA分子(例如miRNA)或少量的RNA分子(例如miRNA)。其特别适合用于检测低丰度RNA分子(例如miRNA)。然而，实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR)允许分析单个RNA分子(例如miRNA)和大量的RNA分子(例如miRNA)。
通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR))来测定miRNA的表达水平的各种试剂盒和方案是可用的。例如，可根据制造商的建议使用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)进行miRNA的逆转录。简单说，可将miRNA与dNTP、MultiScribe逆转录酶和特异于靶miRNA的引物组合。所得的cDNA可进行稀释，并且可用于PCR反应。可根据制造商的建议(Applied Biosystems)进行PCR。简单说，可将cDNA与特异于靶miRNA的TaqMan分析组合，并且可使用ABI7300进行PCR反应。
核酸杂交可使用微阵列/生物芯片或原位杂交来进行。原位杂交优选用于分析单个RNA分子(例如miRNA)或少量的RNA分子(miRNA)。然而，微阵列/生物芯片允许分析单个RNA分子(例如miRNA)和大量的RNA分子(例如miRNA)。
更优选的是，(i)使用微阵列/生物芯片或珠子，或者使用原位杂交进行核酸杂交；和/或(ii)使用实时PCR进行核酸扩增。
优选的是，步骤(ii)中合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。更优选的是，(i)使用微阵列/生物芯片、珠子、或原位杂交进行核酸杂交；和/或(ii)使用实时PCR进行核酸扩增。
在第四方面，本发明涉及用于对个体的疾病进行诊断的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施根据第二方面所述的方法，其中所述全血样品来自(获取自、获得自、分离自)个体；
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定；
(iii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iv)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
步骤(ii)中的测定可通过用于测定RNA分子(例如miRNA)的水平、特别是RNA分子(例如miRNA)的表达水平的任何常规手段来进行。例如，可使用定性、半定量和/或定量检测方法。本领域技术人员熟知各种技术。
优选的是，通过以下方法测定RNA分子(例如miRNA)的水平、特别是RNA分子(例如miRNA)的表达水平：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
核酸扩增可使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量聚合酶链式反应(RT qPCR))来进行。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)优选用于分析单个RNA分子(例如miRNA)或少量的RNA分子(例如miRNA)。其特别适合用于检测低丰度的RNA分子(例如miRNA)。然而，实时定量聚合酶链式反应(RT qPCR)允许分析单个RNA分子(例如miRNA)和大量的RNA分子(例如miRNA)。
通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)(例如实时定量聚合酶链式反应(RT qPCR))来测定miRNA的表达水平的各种试剂盒和方案是可用的。例如，可根据制造商的建议使用TaqMan微小RNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)进行miRNA的逆转录。简而言之，可将miRNA与dNTP、MultiScribe逆转录酶和特异于靶miRNA的引物组合。所得的cDNA可进行稀释，并可用于PCR反应。可根据制造商的建议(Applied Biosystems)进行PCR。简而言之，cDNA可与特异于靶miRNA的TaqMan分析组合，并且可使用ABI7300进行PCR反应。
核酸杂交可使用微阵列/生物芯片或原位杂交进行。原位杂交优选用于分析单个RNA分子(例如miRNA)或少量的RNA分子(miRNA)。然而，微阵列/生物芯片允许分析单个RNA分子(例如miRNA)和大量的RNA分子(例如miRNA)。
更优选的是，(i)使用微阵列/生物芯片或珠子，或者使用原位杂交进行核酸杂交；和/或(ii)使用实时PCR进行核酸扩增。
优选的是，步骤(ii)中合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。更优选的是，(i)使用微阵列/生物芯片、珠子、或原位杂交进行核酸杂交；和/或(ii)使用实时PCR进行核酸扩增。
或者，可以如下阐述所述第四方面：用于对个体的疾病进行诊断的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施根据第三方面所述的方法，其中所述全血样品来自(获取自、获得自、分离自)个体；
(ii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
所述参比水平可为允许确定个体是否患有疾病的任何水平。优选地，所述一个或多个参比水平通过对一个或多个参比全血样品(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个或500个参比全血样品)进行测量而确定，所述一个或多个参比全血样品来自：一个或多个健康受试者(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个或500个健康受试者)；一个或多个患有疾病的受试者(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个或500个患有疾病的受试者)；和/或一个或多个患有其它疾病的受试者(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个或500个患有其它疾病的受试者)。
特别是，所述一个或多个参比水平通过对一个或多个参比全血样品进行测量而确定，所述一个或多个参比全血样品来自：一个或多个肺癌受试者，优选经受肺癌疗法的肺癌受试者，更优选经受姑息肺癌疗法或辅助肺癌疗法的肺癌受试者；和/或一个或多个健康的受试者，优选未经受过肺癌疗法的受试者，更优选未经受过姑息肺癌疗法或辅助肺癌疗法的受试者。
对分析的每个受试者采取一个参比全血样品是切实可行的。如果需要额外的参比全血样品，可(重新)测试同一个受试者。
所述参比水平可为平均参比水平。其可通过测量参比水平并计算其“平均”值(例如，平均值、中位值或模态值)来确定。优选的是，所述参比水平来自与待测试或待诊断的患者具有相同的性别(例如女性或男性)和/或相似年龄/生命阶段(例如成人或老年人)的受试者。
所述疾病可为任何疾病(例如肺癌)。所述其它疾病可为除了肺癌外的任何其它疾病。
在一个实施方式中，用于对个体的疾病进行诊断的方法包括以下步骤：
(i)实施根据第三方面所述的方法，其中所述全血样品来自(获取自、获得自、分离自)个体；
(ii)将所述水平与参比水平进行比较，所述参比水平通过测量来自一个或多个健康受试者的一个或多个参比全血样品而确定；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断。
优选地，所述疾病为肺癌。
在另一实施方式中，用于对个体的疾病进行诊断的方法包括以下步骤：
(i)实施根据第三方面所述的方法，其中所述全血样品来自(获取自、获得自、分离自)个体；
(ii)将所述水平与参比水平进行比较，所述参比水平通过测量来自一个或多个患病受试者的一个或多个参比全血样品而确定；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断。
优选地，所述疾病为肺癌。
在另一实施方式中，用于对个体的疾病进行诊断的方法包括以下步骤：
(i)实施根据第三方面所述的方法，其中所述全血样品来自(获取自、获得自、分离自)个体；
(ii)将所述水平与以下参比水平进行比较：通过测量来自一个或多个患病受试者的一个或多个参比全血样品而确定的参比水平；以及，通过测量来自一个或多个患有其它疾病的受试者的一个或多个参比全血样品而确定的参比水平；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有所述疾病进行诊断。
优选地，所述疾病为肺癌，并且其它疾病为除了肺癌外的任何其它疾病。
所述方法还可允许对经不同治疗的疾病彼此进行区别。例如，所述疾病可为辅助治疗的疾病(例如辅助治疗的肺癌)，而所述其它疾病可为姑息治疗的疾病(例如姑息治疗的肺癌)；或者所述疾病可为姑息治疗的疾病(例如姑息治疗的肺癌)，而所述其它疾病可为辅助治疗的疾病(例如辅助治疗的肺癌)。
在第五方面，本发明涉及亲水性聚合材料用于从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的用途。优选地，所述长度≥200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组。
在第六方面，本发明涉及亲水性聚合材料用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的用途。优选地，所述长度＜200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料包含在吸附探针中(参见本发明第一方面和第二方面)。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3，例如，0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。更优选地，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，甚至更优选1g/cm3到4g/cm3之间，例如，0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的孔体积为材料总体积的20％到70％之间，优选30％到50％之间，例如，材料总体积的20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：≤100μm，优选≤50μm，例如，≤10μm、≤15μm、≤20μm、≤25μm、≤30μm、≤35μm、≤40μm、≤45μm、≤50μm、≤55μm、≤60μm、≤65μm、≤70μm、≤75μm、≤80μm、≤85μm、≤90μm、≤95μm或≤100μm。更优选地，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：10μm到100μm之间，甚至更优选20μm到50μm之间，例如，10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料选自于由以下所组成的组：含纤维素的材料(例如棉)、多糖、聚烯烃和聚酯。优选地，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
更优选地，所述亲水性聚合材料为棉、纤维素或聚乙烯。
在本发明第五方面和第六方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料为如WO2013/067520 A1或US 2013116597 A1中所描述的材料。特别是，所述亲水性聚合材料为如WO 2013/067520 A1或US 2013116597 A1中所描述的生物流体取样装置中包含的吸附探针的部分。就此而言，参见WO 2013/067520 A1的第10页第28行至第34页第27行、图2-图3和图8、以及权利要求1-19；以及参见US 2013116597 A1的第[0068]段-第[0129]段、图2-图3和图8、以及权利要求1-19。
关于吸附探针和/或亲水性聚合材料的其它实施方式，参见本发明的第一方面或第二方面。
在第七方面，本发明涉及根据第三方面所述的方法用于诊断或鉴别诊断疾病的用途。所述疾病可为肺癌。关于对疾病的诊断或鉴别诊断，参见本发明的第四方面。
在第八方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本上由亲水性聚合材料组成，或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成。
所述试剂盒用于获取全血样品。
在本发明的第八方面的一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含：
(ii)将血液从个体中移出的工具；
(iii)容器；和/或
(iii)数据载体，所述数据载体包含具有吸附进/至其中的来自全血样品的全血的吸附探针可用于本发明的第一方面至第四方面的方法的信息。
在本发明的第八方面的一个可选实施方式中，所述试剂盒进一步包括：
(ii)将血液从个体中移出的工具；
(iii)用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具；
(iv)容器；和/或
(iii)数据载体，所述数据载体包含具有吸附进/至其中的来自全血样品的全血的吸附探针可用于本发明的第一方面至第四方面的方法的吸附探针的信息。
将血液从个体中移出的工具可选自于由注射器(带针头)、针和刺血针组成的组。可将注射器(带针头)用于从个体手臂的静脉中提取血液。可将针或刺血针用于破坏皮肤上层并从个体中移出血滴(例如通过手指扎刺)。然后，将包含亲水性聚合材料的吸附探针、基本由亲水性聚合材料组成的吸附探针或由亲水性聚合材料组成的吸附探针设置为与全血样品(物理)接触，从而将全血吸附进/至所述亲水性聚合材料。之后，可将吸附探针干燥(例如，风干)。这可在室温(20℃)或高温(例如30℃)下完成。
然后，将包含其中/上吸附了来自全血样品的全血的亲水性聚合材料的吸附探针运送至实验室，以用于进一步分析。
用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具可包括：
(i)多核苷酸，所述多核苷酸用于检测长度≥200个核苷酸的RNA分子和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子；和/或
(ii)生物芯片、RT-PCR系统、PCR系统、流式细胞仪或下一代测序系统。
优选地，所述长度＜200个核苷酸的RNA分子为miRNA分子。
所述多核苷酸可附着至生物芯片。所述多核苷酸也可用作RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的引物。
所述数据载体可为：非电子数据载体，例如图形数据载体，如信息单(例如，包含根据本发明第一方面至第四方面如何使用所述试剂盒的详细信息)、信息表、条形码或访问码；或电子数据载体，例如软盘、光盘(CD)、数字通用盘(DVD)、微芯片或其它基于半导体的电子数据载体。访问码可允许访问数据库(例如，互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库)。访问码还可允许访问应用软件或移动app，所述应用软件使得计算机为计算机用户执行任务，所述移动app是被设计成在智能手机和其它移动装置上运行的软件。
所述数据载体可进一步包含本文确定的RNA分子(例如miRNA)的水平的一个或多个参比水平。在数据载体包含允许访问数据库的访问码的情况下，可将所述一个或多个参比水平存储在该数据库中。
所述试剂盒可任选地包含从商业和用户角度所需要的材料，所述材料包括在获取全血样品过程中可能有用的缓冲剂、试剂和/或稀释剂。
在第九方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)流体，所述流体用于重构被吸附进/至吸附探针的全血(从全血样品)，所述吸附探针包含亲水性聚合材料，所述吸附探针基本由亲水性聚合材料组成，或者所述吸附探针由亲水性聚合材料组成。
所述流体可为液体或气体。优选地，所述流体为离液流体(例如，离液液体或气体)。更优选地，所述离液流体选自于由以下所组成的组：硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。甚至更优选地，所述离液流体为硫氰酸胍。或者，所述离液流体(例如，离液液体或气体)可包含硫氰酸胍、异硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍、碱金属硫氰酸盐、碱金属异硫氰酸盐、碱金属碘化物以及碱金属高氯酸盐。优选地，所述离液流体包括硫氰酸胍。
将所述试剂盒用于实施本发明的第一方面至第四方面的方法，即用于从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分，用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分，以及用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分并(然后)测定所述RNA分子的水平。
上述提及的RNA级分包含一种或多种RNA分子(例如miRNA分子)。所述长度≥200个核苷酸的RNA级分优选包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组；所述长度＜200个核苷酸的RNA级分优选包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
如果将试剂盒用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分并(然后)测定所述RNA分子的水平，所述试剂盒进一步包含用于测定RNA分子(例如miRNA分子)的水平、特别是表达水平的工具。优选地，所述工具包括：一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸用于测定一种或多种RNA分子(例如miRNA分子)的(表达)水平；和/或生物芯片、RT-PCR系统、PCR系统、流式细胞仪、基于珠的复用系统(bead-based multiplex system)或下一代测序系统。
在本发明的第九方面的一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含：
(ii)容器；和/或
(iii)数据载体，所述数据载体载有关于如何实施本发明第一方面至第四方面的方法的使用说明。
在本发明的第九方面的可选实施方式中，所述试剂盒进一步包含：
(ii)用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具；
(iii)容器；和/或
(iv)数据载体，所述数据载体载有关于如何实施本发明第一方面至第四方面的方法的使用说明。
用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具可包括：
(i)多核苷酸，所述多核苷酸用于检测长度≥200个核苷酸的RNA分子和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子；和/或
(ii)生物芯片、RT-PCR系统、PCR系统、流式细胞仪或下一代测序系统。
优选地，所述长度＜200个核苷酸的RNA分子为miRNA分子。
所述多核苷酸可附着至生物芯片。所述多核苷酸也可用作RT-PCR系统、PCR系统或下一代测序系统的引物。
所述试剂盒包含一个或多个容器。例如，可将所述流体装在容器(例如瓶，特别是喷雾瓶)中。此外，可将用于测定所述RNA分子的水平的工具装在容器中。
所述数据载体可为：非电子数据载体，例如图形数据载体，如信息单、信息表、条形码或访问码；或电子数据载体，例如软盘、光盘(CD)、数字通用盘(DVD)、微芯片或其它基于半导体的电子数据载体。访问码可允许访问数据库(例如，互联网数据库、集中式数据库或分散式数据库)。访问码还可允许访问应用软件或移动app，所述应用软件使得计算机为计算机用户执行任务，所述移动app是被设计成在智能手机和其它移动装置上运行的软件。
所述数据载体可进一步包含本文测定的RNA分子(例如miRNA)的水平的一个或多个参比水平。在所述数据载体包含允许访问数据库的访问码的情况下，可将所述一个或多个参比水平存储在该数据库中。
所述试剂盒可任选地包含从商业和用户角度所需要的材料，所述材料包括用以实施本发明第一方面至第四方面所述的方法的缓冲剂、试剂和/或稀释剂。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3，例如0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。更优选地，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，甚至更优选在1g/cm3到4g/cm3之间，例如，0.5g/cm3、1.5g/cm3、2g/cm3、2.5g/cm3、3g/cm3、3.5g/cm3、4g/cm3、4.5g/cm3、5g/cm3、5.5g/cm3或6g/cm3。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料的孔体积为材料总体积的20％到70％之间，优选30％到50％之间，例如，为材料总体积的20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％或70％。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：≤100μm，优选≤50μm，例如，≤10μm、≤15μm、≤20μm、≤25μm、≤30μm、≤35μm、≤40μm、≤45μm、≤50μm、≤55μm、≤60μm、≤65μm、≤70μm、≤75μm、≤80μm、≤85μm、≤90μm、≤95μm或≤100μm。更优选地，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为以下的孔：10μm到100μm之间，甚至更优选20μm到50μm之间，例如，10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述亲水性聚合材料选自于由以下所组成的组：含纤维素的材料(例如棉)、多糖、聚烯烃和聚酯。优选地，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
更优选地，所述亲水性聚合材料为棉、纤维素或聚乙烯。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述吸附探针吸附预定最大体积在1μl到50μl之间的全血，例如，1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39μl、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl或50μl。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，所述吸附探针的长度为≤10mm，优选≤5mm，例如，≤2mm、≤2.5mm、≤3mm、≤3.5mm、≤4mm、≤4.5mm、≤5mm、≤5.5mm、≤6mm、≤6.5mm、≤7mm、≤7.5mm、≤8mm、≤8.5mm、≤9mm、≤9.5mm或≤10mm；以及横截面积为≤40mm2，优选为≤20mm2，例如，≤5mm2、≤6mm2、≤7mm2、≤8mm2、≤9mm2、≤10mm2、≤11mm2、≤12mm2、≤13mm2、≤14mm2、≤15mm2、≤16mm2、≤17mm2、≤18mm2、≤19mm2、≤20mm2、≤21mm2、≤22mm2、≤23mm2、≤24mm2、≤25mm2、≤26mm2、≤27mm2、≤28mm2、≤29mm2、≤30mm2、≤31mm2、≤32mm2、≤33mm2、≤34mm2、≤35mm2、≤36mm2、≤37mm2、≤38mm2、≤39mm2或≤40mm2。
当全血样品是血滴(例如来自手指扎刺)时，这样的大小被认为是合适的。
在本发明第八方面或第九方面的可选实施方式中，所述吸附探针的体积为≤250mm3，优选≤200mm3，例如，≤1mm3、≤1.5mm3、≤2mm3、≤2.5mm3、≤3mm3、≤3.5mm3、≤4mm3、≤4.5mm3、≤5mm3、≤5.5mm3、≤6mm3、≤6.5mm3、≤7mm3、≤7.5mm3、≤8mm3、≤8.5mm3、≤9mm3、≤9.5mm3、≤10mm3、≤11mm3、≤12mm3、≤13mm3、≤14mm3、≤15mm3、≤16mm3、≤17mm3、≤18mm3、≤19mm3、≤20mm3、≤21mm3、≤22mm3、≤23mm3、≤24mm3、≤25mm3、≤26mm3、≤27mm3、≤28mm3、≤29mm3、≤30mm3、≤31mm3、≤32mm3、≤33mm3、≤34mm3、≤35mm3、≤36mm3、≤37mm3、≤38mm3、≤39mm3、≤40mm3、≤41mm3、≤42mm3、≤43mm3、≤44mm3、≤45mm3、≤46mm3、≤47mm3、≤48mm3、≤49mm3、≤50mm3、≤60mm3、≤70mm3、≤80mm3、≤90mm3、≤100mm3、≤110mm3、≤120mm3、≤130mm3、≤140mm3、≤150mm3、≤160mm3、≤170mm3、≤180mm3、≤190mm3、≤200mm3、≤210mm3、≤220mm3、≤230mm3、≤240mm3或≤250mm3。
当全血样品是血滴(例如来自手指扎刺)时，这样的体积被认为是合适的。
更优选地，所述吸附探针的长度在2mm到10mm之间，优选在2mm到5mm之间，例如，2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm；以及横截面积在5mm2到40mm2之间，优选在5mm2到20mm2之间，例如，5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2、13mm2、14mm2、15mm2、16mm2、17mm2、18mm2、19mm2、20mm2、21mm2、22mm2、23mm2、24mm2、25mm2、26mm2、27mm2、28mm2、29mm2、30mm2、31mm2、32mm2、33mm2、34mm2、35mm2、36mm2、37mm2、38mm2、39mm2或40mm2。
在本发明第八方面或第九方面的可选实施方式中，所述吸附探针的体积在1mm3到250mm3之间，优选在2.5mm3到200mm3之间，例如，1mm3、1.5mm3、2mm3、2.5mm3、3mm3、3.5mm3、4mm3、4.5mm3、5mm3、5.5mm3、6mm3、6.5mm3、7mm3、7.5mm3、8mm3、8.5mm3、9mm3、9.5mm3、10mm3、11mm3、12mm3、13mm3、14mm3、15mm3、16mm3、17mm3、18mm3、19mm3、20mm3、21mm3、22mm3、23mm3、24mm3、25mm3、26mm3、27mm3、28mm3、29mm3、30mm3、31mm3、32mm3、33mm3、34mm3、35mm3、36mm3、37mm3、38mm3、39mm3、40mm3、41mm3、42mm3、43mm3、44mm3、45mm3、46mm3、47mm3、48mm3、49mm3、50mm3、60mm3、70mm3、80mm3、90mm3、100mm3、110mm3、120mm3、130mm3、140mm3、150mm3、160mm3、170mm3、180mm3、190mm3、200mm3、210mm3、220mm3、230mm3、240mm3或250mm3。
在本发明第八方面或第九方面的一个实施方式中，将所述吸附探针配置成吸附预定最大体积在1μl到50μl之间、优选在5μl到25μl之间、甚至更优选在10μl到20μl之间的全血，例如，1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl、26μl、27μl、28μl、29μl、30μl、31μl、32μl、33μl、34μl、35μl、36μl、37μl、38μl、39μl、40μl、41μl、42μl、43μl、44μl、45μl、46μl、47μl、48μl、49μl或50μl。
关于所述吸附探针和/或亲水性聚合材料的其它实施方式，参见本发明的第一方面或第二方面。
本发明总结如下：
1.一种从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而移除长度≥200个核苷酸的RNA级分。
2.如项1所述的方法，其中，所述长度≥200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组。
3.一种从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触(以重构所述全血)；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。
4.如项3所述的方法，其中，所述长度＜200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
5.如项1-4中任一项所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3。
6.如项5所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，优选在1g/cm3到4g/cm3之间。
7.如项1-6中任一项所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
8.如项1-7中任一项所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料的孔体积为材料总体积的20％到70％之间，优选30％到50％之间。
9.如项7或8所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为≤100μm、优选≤50μm的孔。
10.如项9所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸在10μm到100μm之间、优选在20μm到50μm之间的孔。
11.如项1-10中任一项所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料选自于由棉、多糖、聚烯烃和聚酯所组成的组。
12.如项11所述的方法，其中：
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
13.如项1-12中任一项所述的方法，其中，所述吸附探针吸附预定最大体积在1μl到50μl之间的全血。
14.如项1-13中任一项所述的方法，其中，所述吸附探针的长度为≤10mm、优选≤5mm，横截面积为≤40mm2，优选≤20mm2；或者
所述吸附探针的体积为≤250mm3、优选≤200mm3。
15.如项14所述的方法，其中，所述吸附探针的长度在2mm到10mm之间、优选在2mm到5mm之间，横截面积在5mm2到40mm2之间、优选在5mm2到20mm2之间；或者
所述吸附探针的体积在1mm3到250mm3之间、优选在2.5mm3到200mm3之间。
16.如项1-15中任一项所述的方法，其中，将所述亲水性聚合材料中/上吸附的全血干燥。
17.如项3-16中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
(iv)通过一种或多种分离技术对长度＜200个核苷酸的RNA级分进行分离。
18.如项17所述的方法，其中，所述一种或多种分离技术选自于由以下所组成的组：离心、蒸发/重构、浓缩、沉淀、液/液提取和固相提取。
19.一种测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施项3-18中任一项所述的方法；以及
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定。
20.如项19所述的方法，其中，所述长度＜200个核苷酸的RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
21.如项19或20所述的方法，其中，步骤(ii)中测定的水平为表达水平。
22.如项19-21中任一项所述的方法，其中，所述合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
23.如项22所述的方法，其中：
(i)所述核酸杂交使用微阵列/生物芯片、珠子或原位杂交进行；和/或
(ii)所述核酸扩增使用实时PCR进行。
24.一种用于诊断个体的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施项3-18中任一项所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)通过合适的技术对长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平进行测定；
(iii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iv)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
25.如项24所述的方法，其中，所述合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
26.一种用于诊断个体的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施项19-23中任一项所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
27.如项24-26中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个参比水平通过测量一个或多个参比全血样品来确定，所述一个或多个参比全血样品来自：
一个或多个健康受试者；
一个或多个患病受试者；和/或
一个或多个患有其它疾病的受试者。
28.亲水性聚合材料用于从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的用途。
29.如项28所述的用途，其中，所述长度≥200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由核糖体18S RNA和核糖体28S RNA所组成的组。
30.亲水性聚合材料用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的用途。
31.如项30所述的用途，其中，所述长度＜200个核苷酸的RNA级分包含一种或多种RNA分子，所述一种或多种RNA分子选自于由miRNA、tRNA、siRNA、piRNA和snorRNA所组成的组。
32.如项28-31中任一项所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3。
33.如项32所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，优选在1g/cm3到4g/cm3之间。
34.如项28-33中任一项所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
35.如项28-34中任一项所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料的孔体积在材料总体积的20％到70％之间，优选30％到50％之间。
36.如项34或35所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为≤100μm、优选≤50μm的孔。
37.如项36所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸在10μm到100μm之间、优选在20μm到50μm之间的孔。
38.如项28-37中任一项所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料选自于由棉、多糖、聚烯烃和聚酯所组成的组。
39.如项38所述的用途，其中，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
40.项19-23中任一项所述的方法用于诊断或鉴别诊断疾病的用途。
41.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料。
42.如项41所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于获取全血样品。
43.如项41或42所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含：
(ii)将血液从个体中移出的工具；
(iii)用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具；
(iv)容器；和/或
(v)数据载体，所述数据载体包括以下的信息：具有吸附进/至其中的来自全血样品的全血的吸附探针可用于项1-27中任一项所述方法。
44.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)流体，所述流体用于重构包含亲水性聚合材料的吸附探针中/上吸附的全血。
45.如项44所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于实施项1-27中任一项所述的方法。
46.如项44或45所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含：
(ii)用于测定长度≥200个核苷酸的RNA分子的水平和/或长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的工具；
(iii)容器；和/或
(iv)数据载体，所述数据载体载有关于如何实施项1-23中任一项所述的方法的使用说明。
47.如项41-46中任一项所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3。
48.如项47所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料的密度在0.5g/cm3到6g/cm3之间，优选在1g/cm3到4g/cm3之间。
49.如项41-48中任一项所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料是多孔的。
50.如项41-49中任一项所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料的孔体积在材料总体积的20％到70％之间，优选30％到50％之间。
51.如项49或50所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸为≤100μm、优选≤50μm的孔。
52.如项51所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料包含直径或最大的横截面尺寸在10μm到100μm之间、优选在20μm到50μm之间的孔。
53.如项41-52中任一项所述的试剂盒，其中，所述亲水性聚合材料选自于由棉、多糖、聚烯烃和聚酯所组成的组。
54.如项53所述的试剂盒，其中，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
55.如项41-54中任一项所述的试剂盒，其中，将所述吸附探针配置成吸附预定最大体积在1μl到50μl之间的全血。
56.如项41-55中任一项所述的试剂盒，其中，所述吸附探针的长度为≤10mm、优选≤5mm，横截面积为≤40mm2、优选≤20mm2；或者
所述吸附探针的体积为≤250mm3、优选≤200mm3。
57.如项56所述的试剂盒，其中，所述吸附探针的长度在2mm到10mm之间、优选在2mm到5mm之间，横截面积在5mm2到40mm2之间、优选在5mm2到20mm2之间；或者
所述吸附探针的体积在1mm3到250mm3之间、优选在2.5mm3到200mm3之间。
本发明的各种修改和变型对本领域技术人员而言将是显而易见的，其并未脱离本发明的范围。尽管已结合具体的优选实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解的是，请求保护的发明不应当被不恰当地限于这样的具体实施方式。实际上，用于实施本发明而进行的对于相关领域的技术人员而言显而易见的所述方式的各种修改和变型都意在被本发明涵盖。
附图说明
以下附图仅用于说明本发明，而不应被解释为以任何方式限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求限定。
图1：描绘了从来自人个体的全血样品中分离的RNA的Agilent Bioanalyzer Nano结果的比较，i)使用吸附探针移除长度＞200nt的RNA级分(Mitra微量取样装置，下曲线)，ii)没有移除长度＞200nt的RNA级分(收集在PAXgene Blood RNA管中的全血，上曲线)。上曲线清楚地示出了主要的RNA峰(18S核糖体RNA、28S核糖体RNA)仍然存在；而在下曲线中，通过将全血样品吸附至吸附探针的亲水性聚合材料，有效地移除了所述18S RNA和28S RNA以及其它长度＞200nt的RNA种类。
图2：示出了从全血样品中分离的且使用亲水性聚合材料的吸附探针(Mitra微量取样装置)移除了长度＞200nt的RNA级分的RNA的Agilent Bioanalyzer(Nano RNA试剂盒)结果，所述全血样品从人个体中收集：通过使用亲水性聚合材料的吸附探针(Mitra微量取样装置)将从由全血样品获得的RNA中将＞200nt的RNA级分(包括但不限于最显著的核糖体RNA峰(处于～2000nt的18S片段和处于～4000nt的28S片段))移除。
图3：源自全血样品的长度＜200nt的小RNA级分的特写，其中通过使用亲水性聚合物吸附探针将长度＞200nt的RNA级分移除。此处，所述小RNA级分包含各种小RNA种类，例如miRNA(～15nt-35nt)、tRNA(～60nt-80nt)、siRNA(～20nt-25nt)、piRNA(～26nt-31nt)或snorRNA。
图4：亲水性聚合物吸附探针的扫描电子显微镜(SEM)图像：(A)包含亲水性纤维素的聚合物吸附探针材料，例如非指示型FTA标准卡(GE Healthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、非指示型FTA洗脱微型卡(GE Healthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、HemaSpot SE(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、TNF(Munktell，德国)、TNF-Di(Munktell，德国)；(B)亲水性有机聚合物吸附探针材料，例如Mitra微量取样装置。
图5：miRNA表达数据：描绘了在小RNA级分中发现的表达(在Agilent dna-微阵列上，详细信息参见实施例8)的miRNA，所述小RNA级分在通过使用亲水性聚合物吸附探针进行处理而从全血样品移除＞200nt的级分后获得。此处，作为实例，将聚合物吸附探针如Mitra微量取样装置或包含亲水性纤维素的吸附探针(例如，非指示型FTA标准卡(GEHealthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、非指示型FTA洗脱微型卡(GEHealthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、HemaSpot SE(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、TNF(Munktell，德国)、TNF-Di(Munktell，德国))用作包含所述亲水性聚合物吸附探针的装置，以从全血样品中移除＞200nt的RNA级分。其中：SEQ ID NO＝序列识别号；miRNA＝根据miRBase的微小RNA的标识符；gTotalGeneSignal(A)＝当采用包含亲水性纤维素的吸附材料来移除＞200nt的RNA时检测到的相应miRNA的相对表达水平；gTotalGeneSignal(B)＝当采用亲水性聚合物吸附材料(Mitra微量取样装置)来移除＞200nt的RNA时检测到的相应miRNA的相对表达水平。
图6：Mitra微量取样装置：亲水性吸附探针包含在所述装置的顶部尖端。
图7：描绘了从来自人个体的全血样品中分离的RNA的Agilent Bioanalyzer Nano结果的比较，(i)使用吸附探针(包含亲水性纤维素的吸附装置，例如非指示型FTA标准卡(GE Healthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、非指示型FTA洗脱微型卡(GEHealthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、HemaSpot SE(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、TNF(Munktell，德国)、TNF-Di(Munktell，德国))移除长度＞200nt的RNA级分(下曲线)；(ii)没有移除长度＞200nt的RNA级分(收集在PAXgene Blood RNA管中的全血，上曲线)。上曲线清楚地示出了主要的RNA峰(18S核糖体RNA、28S核糖体RNA)仍然存在；而在下曲线中，通过将全血样品吸附至亲水性聚合材料的吸附探针，有效地移除了所述18S RNA和28S RNA及其它长度＞200nt的RNA种类。
图8：来自干血斑的miRNome的稳定性。A：对于各种环境因素，不同条件的散点图和相关性。B：环境影响因素的PVCA图。
图9：失调的miRNA的火山图，其涉及辅助治疗的患者和姑息治疗的患者之间的比较。
图10：取决于肺癌疗法的生物学变异。表达强度、倍数变化、p-值以及失调的miRNA的接受者工作特征曲线下面积(AUC值)。
实施例
下面给出的实施例仅用于说明目的，并不以任何方式限制如上所述的发明。
第I部分：
实施例1：使用亲水性聚合物吸附装置(Mitra微量取样装置)收集血液样品
通过使用无菌安全的刺血针(Safety-Lancet Extra 18G，Sarstedt，Nümbrecht，德国)和Mitra微量取样装置(neoteryx，Torrance，CA，USA，货号10005)穿刺左手的中指从不同的个体(n＝3)收集血液，每个个体4个Mitra微量取样装置。在环境温度下将Mitra微量取样装置(图6)上的血液干燥2小时。将每个个体的4个充满血液的取样器尖端从Mitra微量取样装置的取样器主体移除，并转移至2mL管(Eppendorf，Hamburg，德国)。
实施例2：从Mitra微量取样装置提取小RNA
使用苯酚-氯仿提取技术实施长度＜200nt的小RNA(包括微小RNA级分)的提取。通过使用miRNeasy血清血浆试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)进行小RNA的纯化。此处，移取1mL Qiazol试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国；所述试剂包含硫氰酸胍和苯酚，硫氰酸胍作为离液剂)至含有4个Mitra取样器尖端的2mL管(参见实施例1，血液样品收集)。然后，在4℃下，以1,000rpm将管在振荡器上孵育16小时。之后，将全部上清液转移至新的2mLEppendorf管。添加200μL氯仿后，将混合物彻底涡旋15sec，并在室温下孵育2min，然后在4℃下以12,000×g离心15min。之后，在不触及其它两相的情况下将上层水相转移至新的1mL管。向该水相中添加1.5体积的100％乙醇，通过移取彻底混合，并且在室温下孵育10min。然后，将700μL样品转移至Qiagen MinElute柱，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。重复最后两步直至将全部样品体积施加到柱上。之后，将700μL缓冲剂RWT添加至各柱中，在RT下以13,000rpm再次离心15sec，弃掉穿过流。然后，将500μl缓冲剂RPE添加至柱中，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。之后，将500μL的80％乙醇添加至柱中，并在RT下以13,000rpm离心2min，弃掉穿过流。然后，将柱放置于新的2mL收集管中，并在开盖的情况下，在RT下以13,000rpm离心5min，以干燥柱。将柱转移进新的1.5mL收集管中。为了洗脱总RNA(包括微小RNA)，将14μL不含RNase的水移取至该柱上，孵育1min，并在RT下以13,000rpm离心1min。再向柱中移取14μL不含RNase的水，孵育1min，并在RT下以13,000rpm离心1min。将洗脱的长度＜200nt的小RNA级分(包含微小RNA级分)在冰上保存直到质量控制和量化。
实施例3：使用包含亲水性纤维素的吸附装置收集血液样品
通过使用无菌安全的刺血针(Safety-Lancet Extra 18G，Sarstedt，Nümbrecht，德国)穿刺左手的无名指，从不同的个体(n＝3)收集血液。将每个个体的两滴血液添加至包含亲水性纤维素的吸附装置(来自不同制造商的含纤维素的滤纸，包括非指示型FTA标准卡(GE Healthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、非指示型FTA洗脱微型卡(GEHealthcare Life Science，Buckinghamshire，英国)、HemaSpot HF(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、HemaSpot SE(Spot On Sciences，Austin，TX，USA)、TNF(Munktell，德国)、TNF-Di(Munktell、德国))，所述吸附装置覆盖大约0.5cm2-4.0cm2的面积。将各种包含亲水性纤维素的吸附探针干燥2小时，然后在环境温度下保存1周。将包含亲水性纤维素的吸附探针的吸附血液的区域切下并转移至2mL管(Eppendorf，Hamburg，德国)。
实施例4：从包含亲水性纤维素的吸附装置提取小RNA
使用苯酚-氯仿提取技术实施长度＜200nt的小RNA(包括微小RNA级分)的提取。使用miRNeasy血清血浆试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)进行小RNA的纯化。将1mL Qiazol试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)移取至装有其中吸附有全血样品且干燥的包含亲水性纤维素的吸附装置的2mL管(参见血液样品收集，实施例3)。然后，在4℃下，以1,000rpm将管在振荡器上孵育16小时。之后，将全部上清液转移至新的2mL Eppendorf管。添加200μL氯仿后，将混合物彻底涡旋15sec，室温下孵育2min，然后在4℃下以12,000×g离心15min。之后，在不触及其它两相的情况下将上层水相转移至新的2mL管。向水相中添加1.5体积的100％乙醇，通过移取彻底混合，并在室温下孵育10min。然后，将700μL样品转移至QiagenMinElute柱上，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。重复最后两步直至将全部样品体积施加到柱上。之后，将700μL缓冲剂RWT添加至各柱中，在RT下以13,000rpm再次离心15sec，弃掉穿过流。然后，将500μL缓冲剂RPE添加至柱中，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。之后，将500μL的80％乙醇添加至柱中，并在RT下以13,000rpm离心2min，弃掉穿过流。然后，将柱放置进新的2mL收集管中，并在开盖的情况下，在RT下以13,000rpm离心5min，以干燥柱。将柱转移进新的1.5mL收集管中。为了洗脱小RNA(包括微小RNA)，将14μL不含RNase的水移取至该柱上，孵育1min，并在RT下以13,000rpm离心1min。再移取14μL不含RNase的水至柱上，室温下孵育1min，并在RT下以13,000rpm离心1min。将洗脱的长度＜200nt的小RNA(包括微小RNA)在冰上保存直到质量控制和量化。
实施例5：使用PaxGene Blood RNA管收集血液样品
从不同的个体(n＝3)收集血液。此处，对每位血液供体而言，通过静脉穿刺将2.5mL全血收集到PAXgene Blood RNA管(PreAnalytix，Hombrechticon，瑞士)中。从通过离心对全血样品进行处理来得到/获得血细胞。此处，通过10min的5000×g离心使来自收集在所述血液收集管中的全血的血细胞沉降下来。收获血细胞沉淀(血液细胞级分，包含红血细胞、白血细胞和血小板)以进行进一步处理，同时弃掉上清液(包含细胞外血液级分)。使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，从收获的血细胞中提取总RNA(包括小RNA(＜200nt；包括miRNA级分)，以及＞200nt的RNA级分)；详细信息参见实施例6。
实施例6：从PAXgene Blood RNA管中提取总RNA(包括＞200nt的RNA级分)
使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)进行总RNA(包括小RNA(＜200nt；包括miRNA级分)和＞200nt的RNA级分)的分离。此处，通过上下移取使血细胞沉淀(如实施例5中所述而获得)彻底重悬于700μL QIAzol裂解试剂中，并立即将悬浮液转移至新的1.5mL Eppendorf管。然后，添加140μL氯仿，彻底涡旋，在室温下孵育2-3min，然后在4℃下以12,000g离心15min。之后，在不触及其它两相的情况下，小心地将上层水相转移至新的2mL管中。然后，向转移的水相中添加1.5体积的100％乙醇，通过移取彻底混合。然后，将700μL样品转移至柱中，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。之后，向各柱中添加700μL缓冲剂RWT，在RT下以13,000rpm再次离心15sec，弃掉穿过流。然后，向柱中添加500μL缓冲剂RPE，并在RT下以13,000rpm离心15sec，弃掉穿过流。之后，向柱中再添加500μL缓冲剂RPE，并在RT下以13,000rpm离心2min，弃掉穿过流。然后，将柱放置于新的2mL收集管中，并在RT下以13,000rpm离心1min，以干燥柱。将柱转移进新的1.5mL收集管。为了洗脱总RNA(包括微小RNA)，将40μL不含RNase的水移取至柱上，孵育1min，在RT下以13,000rpm离心1min。然后，将洗脱物放回相同柱中，RT下孵育1min，并再次离心1min。使用NanoDrop 1000对洗脱的总RNA(包括小RNA(＜200nt；包括miRNA级分)和＞200nt的RNA级分)进行定量，并且在用于表达谱实验之前将其保存在-20℃。
实施例7：小RNA级分的质量控制
根据制造商的方案以及Bioanalyzer Small and Nano分析，使用Agilent生物分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)进行提取的RNA的质量控制和量化。将RNA在70℃变性2min，之后将1μL施加至生物分析仪的芯片上以进行Small分析和Nano分析。将芯片在2,400rpm下涡旋，并在5min内在生物分析仪器上进行运行。
实施例8：基于微阵列的微小RNA表达谱测定
根据制造商的方案在Agilent human miRNA 8x60k微阵列(release v21)上对总RNA样品(包括微小RNA级分)进行分析。在酶促Cy3标记微小RNA以及在旋转杂交炉中于55℃下阵列杂交20小时之后，将微阵列载片洗涤两次(非严格和严格)，之后用Agilent的SureScan微阵列扫描仪进行扫描。使用Agilent Feature Extraction软件(v11)对所得的图像数据进行评价。将由Feature Extraction软件生成的原始数据文件(GeneView)导入Excel，以用于present call分析。
第II部分：
进一步系统地探讨了干血斑(DBS)是否促进稳定的miRNA测量，并比较了技术稳定性与生物变异性。首先，通过生成暴露于不同环境条件(例如，温度和湿度)的样品(来自相同个体)的全基因组范围的miRNA谱，对DBS样品的稳定性进行测试。其次，通过对取自相同个体的样品进行七次重复，对技术可重复性进行了研究。第三，研究了来自53名经受不同疗法的肺癌患者的样品。经过这三个阶段，生成了108个基因组范围的miRNA谱，并通过生物统计学手段进行评价。
材料和方法
样品收集：对为了本研究而言，收集了共78个在干血斑上的样品。使用来自(Munktell，德国)(Ahlstrom)的TNF纸。抵达后，将干血斑保存在-80℃直至进行RNA提取。对于稳定性分析而言，一个个体被列入并且暴露于至不同的环境条件。温度在26℃和到35℃之间变化；湿度在38.5％和到60％之间。为了捕获取整个工作流程的可重复性(即，在不同的提取之间以及不同的微阵列之间上)，我们对另一个个体实施了7次技术重复。随着肺癌研究，测量相应的样品作为过程对照(process control)。还使用PAXGeneBlood管(BD)对同一个个体进行研究以比较干血斑上的miRNA库(miRNA repertoire)和使用血液管的miRNA库。作为临床案例，对暴露于不同治疗方案的53个肺癌样品进行了研究。具体地，17个样品属于用治愈性(辅助)治疗的患者，36个样品属于用姑息护理的患者。辅助疗法额外施用于原发性手术治疗以改善治愈机会，而姑息治疗用于在晚期癌症的情况下改善生活质量。本研究获得了当地伦理委员会的批准，并且参与者签署了书面知情同意书。
将血液样品收集在干血斑上。所有样品在miRBase V21微阵列(Agilent)上进行测量。为了对比不同的微阵列，还在miRBase V19微阵列(Agilent)上测量了26个样品的子集。总体上，在V19微阵列上对30个完整的miRNA基因组进行了属性描述，在V21微阵列上对78个全miRNA基因组进行了属性描述。
miRNA提取：在RNA提取之前，将DBS样品在RT解冻1小时。将全部血滴切下并转移至2mL Eppendorf管中。在4℃下并在振荡器上以1,000rpm，将DBS纸于1mL Qiazol裂解试剂(Qiagen GmbH，Hilden，德国)中孵育16小时。将上清液转移至新的2mL管，以用于进一步处理。使用Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒(Qiagen GmbH，Hilden，德国)进行RNA提取和纯化。根据制造商的使用说明，使用小RNA试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)用Agilent 2100生物分析仪检查RNA含量和miRNA质量(进行RNA洗脱物的质量控制和量化)。
miRNA测量：对于微小RNA表达谱，在具有最新miRBase v21内容的AgilentSureprint G3Human miRNA(8x60k)微阵列载片上对样品进行分析。每个阵列靶向2,549个微小RNA，每个探针20次重复。此外，部分样品在先前的v19版本的Agilent SureprintmiRNA载片上进行测量，以用于技术评价。根据制造商的方案，使用来自Agilent的miRNA完全标记与杂交试剂盒对提取的微小RNA进行标记和杂交。在55℃下旋转杂交20小时后，将载片洗涤两次，并在Agilent的SureScan微阵列扫描仪上进行扫描。使用Feature Extraction软件(Agilent Technologies)将来自扫描仪的图像文件转换为文本原始数据。
数据预处理：对于属性描述的样品的预处理，应用Bioconductor文库AgiMicroRna(其被设计为预处理和分析微小RNA的Agilent微阵列数据)。通过稳健的多阵列平均(robust multiarray average，RMA)算法，在以下三个步骤中产生处理后的表达值。首先对探针的测量信号(miRNA的20个探针重复中的一个)进行背景校正，然后通过分位数对阵列进行归一化，最后通过总结相应的探针信号对miRNA的最终信号进行评价。通过应用附加过滤，将未在任何实验组中检测到的对照特征和miRNA从数据集移除，以获得仅用于生物信息学分析的表达特征。
生物信息学分析：为了评价技术可重复性，针对过程对照计算皮尔逊相关性(Pearson’s correlation)。因此，进行属于一个miRBase版本的芯片之间的比较，以及属于不同miRBase版本(v19和v21)的芯片之间的比较。同时，对技术重复的相对miRNA表达值的变异系数(CV)进行评价。同时，就其GC含量以及它们首次引入miRBase来对这些miRNA进行分析。
此外，应用层次聚类法(hierarchical clustering approach)，就不同环境条件(如湿度和温度)来评价实验组和类别。成对观测值之间的距离的测量基于欧几里得距离。
对于寻找区分三组(辅助、姑息和过程对照)的候选物的生物统计学评价，使用t检验进行成对比较。为了控制假发现率，通过使用Benjamin-Hochberg调整来调节所有的p值。除了显著性值之外，还计算了接受者工作特征曲线下面积(AUC)值。
结果
本研究旨在了解是否能够可靠地测量来自干血斑的基因组范围的miRNA谱，从而促进在疾病诊断中的应用。实施了三阶段法。首先，对不同环境条件下的重复进行属性描述。其次，在一系列微阵列上建立并测量技术重复(作为过程对照)。第三，使用肺癌患者样品测试临床可行性。下表1中列出了三个阶段中测量的miRNome的数量的概述。
表1：各阶段测量的全miRNome的数量
来自干血斑的miRNome的稳定性
从暴露于不同环境条件的一系列干血斑样品中提取miRNA。探讨了三个温度和三个湿度水平的组合，同时各组合重复测量三次。因此，通过以三重复的形式具有六种组合，在微阵列上对总共18种miRNome进行属性描述。建立了聚类热图(cluster heatmap)(数据未显示)。将不同的条件彼此进行比较。结果示于图8A中。关于温度，计算出最低相关性为0.997。关于湿度，计算出最高相关性-对应于最低影响(相关性为0.999)。这些结果也通过主变量成分分析得以证实(参见图8B)。这些结果表明，即使将它们暴露于例如通过将样品运送到中心实验室诱发的各种的条件，从干血斑测量的miRNA具有固有稳定性，并且在技术上适合作为诊断信息的载体。
随着时间的miRNA的可重复性
接下来，探讨了来自干血斑的可重复的miRNome如何能够在微阵列上进行属性分析。来自一个个体，在7个不同的Agilent载片上进行7次技术重复(Agilent技术允许在一个载片的8个物理分离阵列上平行处理8个样品)。就此而言，也可将待处理的样品认为是过程对照(＝健康对照)。这些过程对照的平均相关性高达0.993。用来自miRBAse的19版本而不是21版本的先前版本的Agilent微阵列重复相同的测量。此处，列入了4个过程对照，产生可相当的相关性(数据未显示)。根据之前分析的结果，来自一个个体的重复的过程对照强调了：从技术角度，来自干血斑的miRNA适合作为诊断工具。
取决于肺癌疗法的生物学变异
最后，研究了肺癌患者样品与过程对照之间的生物学变异。这通过两个步骤实现。首先，在来自两个版本V19和V21的Agilent微阵列上对30个样品(26个肺癌以及4个过程对照)进行属性描述。通过应用层次聚类，对于每个版本获得了具有相似样品分布的两个聚类(数据未显示)。不仅具有相同治疗形式的样品具有聚类在一起的趋势，而且过程对照也落在一个聚类中。在第二步中，在来自miRBase V21的Agilent微阵列上对60个样品(53个肺癌和上述7个过程对照)进行属性描述。该分析步骤的平均相关性为0.974。虽然过程对照(0.993)和肺癌样品(0.976)的平均相关性超过该值，计算出了过程对照和肺癌样品之间的最低平均相关性(0.967)。
进一步感兴趣的是两种不同肺癌治疗组群之间的差异。因此，接下来通过使用双尾t检验进行“辅助”治疗的患者组和“姑息”治疗的患者组之间的统计学成对比较。由于该研究的探索性质，原始p-值<0.05的miRNA被认为显著失调。关于上述比较(辅助vs.姑息)，基于双尾t检验和所选择的α水平0.05，发现51种显著失调的miRNA(全部591种表达miRNA中的8.6％)。在这51种miRNA中，11种在辅助组中具有较高表达(20％)。具有p-值为0.019的最上调的miRNA为hsa-miR-150-5p，具有p-值为0.014的最下调的标志物为hsa-miR-642a-3p。所有miRNA均示于图9中的火山图中，其中上调和下调的miRNA分别以深灰色(右上角)和浅灰色(左上角)突出显示。图10中提供了关于表达强度、倍数变化、p-值和接受者工作特征曲线下面积(AUC值)的详细信息。
讨论
越来越多的研究将miRNA作为各种人疾病的非侵入性生物标志物。在许多情况下，这些miRNA源自血清、血浆或全血。虽然通常使用保存管(如PAXgene)和EDTA，但对来自DBS的miRNA的研究仍然是一个新领域。
在本研究中，通过追求以下三个方面分析了来自DBS的miRNA的测量可靠性：(1)在不同环境条件下的样品稳定性；(2)芯片版本之间的技术稳定性和可重复性；以及(3)以肺癌患者为例的临床样品比较。
关于第一方面，通过考虑在一个类别内对不同环境条件(湿度和温度)的比较，已证明所测量的来自DBS的miRNA具有高稳定性。
在本研究的第二部分中，一方面，用过程对照已证明，相等且高的相关性为不同芯片版本(V19和V21)间的技术稳定性提供了证据。另一方面，也可以来自v19的相似结构读取来自V21的临床样品和过程对照的聚类图案。这些相似的结果表明，尽管关于芯片存在不同的miRBase版本，在DBS中测量的miRNA具有高可重复性。
本研究的第三部分是关于三个不同组之间的临床比较：过程对照、接受辅助疗法的患者以及接受姑息疗法的患者。在失调miRNA的统计学显著性的情况下，肺癌患者和过程对照之间存在非常大量的显著miRNA(调整p-值<0.05)。这一高数目可能是由肺癌疾病本身和应用的疗法引起的。
序列表
<110> Hummingbird Diagnostics GmbH
<120> 使用亲水性聚合材料的RNA级分的纯化
<130> 505-54 PCT
<150> EP 16 161 077.9
<151> 2016-03-18
<160> 475
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
aaaccguuac cauuacugag uu 22
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ugagguagua gguugugugg uu 22
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<400> 26
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 28
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
uacaguacug ugauaacuga a 21
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
uggagagaaa ggcaguuccu ga 22
<210> 31
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
uucccagcca acgcacca 18
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
ugagguagua gguuguaugg uu 22
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 33
ucguaccgug aguaauaaug cg 22
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 35
aagcugccag uugaagaacu gu 22
<210> 36
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 36
aauugcacgg uauccaucug ua 22
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 37
uuauaauaca accugauaag ug 22
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 38
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 39
uagcaccauu ugaaaucggu ua 22
<210> 40
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 40
uucagauccc agcggugccu cu 22
<210> 41
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 41
uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210> 42
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 42
aaugacacga ucacucccgu uga 23
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 43
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 44
uaccacaggg uagaaccacg g 21
<210> 45
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 45
cagugcaaug uuaaaagggc au 22
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 46
uguaaacauc cuugacugga ag 22
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 47
aaaagcuggg uugagagga 19
<210> 48
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 48
aaaagcuggg uugagagggc aa 22
<210> 49
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 49
uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23
<210> 50
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 50
ggaugguugg gggcggucgg cgu 23
<210> 51
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 51
aaagcugggu ugagaagg 18
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 52
ucgaggagcu cacagucuag u 21
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 53
aaaagcuggg uugagagggu 20
<210> 54
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 54
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
uaaggugcau cuagugcaga uag 23
<210> 56
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
uagugcaaua uugcuuauag ggu 23
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
auauaauaca accugcuaag ug 22
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
uugaucucgg aagcuaagc 19
<210> 59
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
uguaacagca acuccaugug ga 22
<210> 60
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
cagugcaaua guauugucaa agc 23
<210> 61
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 61
aaaagcuggg uugagagggc ga 22
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 62
cugaccuaug aauugacagc c 21
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<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 63
gggagaaggg ucggggc 17
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 64
gccccugggc cuauccuaga a 21
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 65
uacccauugc auaucggagu ug 22
<210> 66
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 66
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 67
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 68
aucacauugc cagggauuuc c 21
<210> 69
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
uaaggugcau cuagugcagu uag 23
<210> 70
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 70
uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
<210> 71
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 71
uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 72
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 72
uauggcacug guagaauuca cu 22
<210> 73
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 73
ggcggcggcg gaggcggggg 20
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 74
gagcuuauuc auaaaagugc ag 22
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 75
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 76
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 76
acugccccag gugcugcugg 20
<210> 77
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 77
uguaaacauc cccgacugga ag 22
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<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 78
ggaggccggg guggggcggg gcgg 24
<210> 79
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 79
caaagaauuc uccuuuuggg cu 22
<210> 80
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 80
uggaagacua gugauuuugu ugu 23
<210> 81
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 81
ucgaggagcu cacagucu 18
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 82
aauggcgcca cuaggguugu g 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 83
augaccuaug aauugacaga c 21
<210> 84
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 84
aacauucaac gcugucggug agu 23
<210> 85
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 85
cagcagcaau ucauguuuug aa 22
<210> 86
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 86
aggcugggcu gggacgga 18
<210> 87
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 87
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 88
accacugcac uccagccuga g 21
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 89
ggggagcgag gggcggggc 19
<210> 90
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 90
acugcaguga aggcacuugu ag 22
<210> 91
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 91
aucccaccuc ugccacca 18
<210> 92
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 92
ugagguagua aguuguauug uu 22
<210> 93
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
cagugcaaug augaaagggc au 22
<210> 94
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
accccacucc ugguacc 17
<210> 95
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 95
cugggggugg ggggcugggc gu 22
<210> 96
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 96
cagugguuuu acccuauggu ag 22
<210> 97
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 97
ucagugcauc acagaacuuu gu 22
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 98
uagcagcaca gaaauauugg c 21
<210> 99
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 99
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 100
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 100
ugaggggcag agagcgagac uuu 23
<210> 101
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 101
cuggguuggg cugggcuggg 20
<210> 102
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 102
uauugcacau uacuaaguug ca 22
<210> 103
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 103
caugccuuga guguaggacc gu 22
<210> 104
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 104
acaguagucu gcacauuggu ua 22
<210> 105
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 105
gcggaaggcg gagcggcgga 20
<210> 106
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 106
ucaggcucag uccccucccg au 22
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 107
ucucacacag aaaucgcacc cgu 23
<210> 108
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 108
aauccuugga accuaggugu gagu 24
<210> 109
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 109
ugucuuacuc ccucaggcac au 22
<210> 110
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 110
gugaguagug gcgcgcggcg gc 22
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 111
ugagggaccc aggacaggag a 21
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 112
uucacagugg cuaaguucug c 21
<210> 113
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 113
uugggcuggg cuggguuggg 20
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 114
cauuauuacu uuugguacgc g 21
<210> 115
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 115
uuggaggcgu ggguuuu 17
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 116
cuagacugaa gcuccuugag g 21
<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 117
ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 118
cgcauccccu agggcauugg ugu 23
<210> 119
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 119
gugcguggug gcucgaggcg ggg 23
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 120
ucacagugaa ccggucucuu u 21
<210> 121
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 121
augcaccugg gcaaggauuc ug 22
<210> 122
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 122
gggucccggg gagggggg 18
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 123
ugagggagug ggugggagg 19
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 124
aacacaccua uucaaggauu ca 22
<210> 125
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 125
uuauaaagca augagacuga uu 22
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 126
acuggacuag gagucagaag g 21
<210> 127
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 127
agugccugag ggaguaagag 20
<210> 128
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 128
ugagaacuga auuccauggg uu 22
<210> 129
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 129
agcaggugcg gggcggcg 18
<210> 130
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 130
ccucccacac ccaaggcuug ca 22
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 131
uggcuguugg agggggcagg c 21
<210> 132
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 132
ugaggcgggg gggcgagc 18
<210> 133
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 133
aaugcaccug ggcaaggauu ca 22
<210> 134
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 134
ggcgggugcg ggggugg 17
<210> 135
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 135
uuuggcaaug guagaacuca cacu 24
<210> 136
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 136
ccaauauuac ugugcugcuu ua 22
<210> 137
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 137
acugcauuau gagcacuuaa ag 22
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 138
cugggcccgc ggcgggcgug ggg 23
<210> 139
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 139
aucccaccac ugccaccau 19
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 140
aucacauugc cagggauuac c 21
<210> 141
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 141
agagaugaag cgggggggcg 20
<210> 142
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 142
gggugcgggc cggcgggg 18
<210> 143
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 143
gggcucacau caccccau 18
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 144
guaggugaca gucaggggcg g 21
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 145
cggggucggc ggcgacgug 19
<210> 146
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 146
cucggggcag gcggcuggga gcg 23
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 147
ggggccuggc ggugggcgg 19
<210> 148
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 148
acuggacuug gagucagaag gc 22
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 149
agcuacaucu ggcuacuggg u 21
<210> 150
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 150
uaguaccagu accuuguguu ca 22
<210> 151
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 151
uuaugguuug ccugggacug ag 22
<210> 152
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 152
ugaccgauuu cuccuggugu uc 22
<210> 153
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 153
ccaggaggcg gaggaggugg ag 22
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 154
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 155
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 155
uccagcauca gugauuuugu ug 22
<210> 156
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 156
ccccagggcg acgcggcggg 20
<210> 157
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 157
cacugugggu acaugcu 17
<210> 158
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 158
ucgggccugg gguuggggga gc 22
<210> 159
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 159
uggguuuacg uugggagaac u 21
<210> 160
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 160
cccaguguuc agacuaccug uuc 23
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 161
auccuugcua ucugggugcu a 21
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 162
aaggggcugg gggagcaca 19
<210> 163
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 163
ugauauguuu gauauauuag gu 22
<210> 164
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 164
cagggggacu gggggugagc 20
<210> 165
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 165
ucccccaggu gugauucuga uuu 23
<210> 166
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 166
agggggaaag uucuauaguc c 21
<210> 167
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 167
cgaaucauua uuugcugcuc ua 22
<210> 168
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 168
auaauacaac cugcuaagug cu 22
<210> 169
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 169
aggcaggggc uggugcuggg cggg 24
<210> 170
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 170
uuaucagaau cuccaggggu ac 22
<210> 171
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 171
cccagcagga cgggagcg 18
<210> 172
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 172
ugagguagga gguuguauag uu 22
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 173
cugggagggg cuggguuugg c 21
<210> 174
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 174
agggaucgcg ggcggguggc ggccu 25
<210> 175
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 175
uagguaguuu ccuguuguug gg 22
<210> 176
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 176
agggcuggac ucagcggcgg agcu 24
<210> 177
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 177
gcggagagag aauggggagc 20
<210> 178
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 178
gggagccagg aaguauugau gu 22
<210> 179
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 179
gugccagcug caguggggga g 21
<210> 180
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 180
cuuucagucg gauguuuaca gc 22
<210> 181
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 181
uggcagggag gcugggaggg g 21
<210> 182
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 182
cagggcaggg aaggugggag ag 22
<210> 183
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 183
aaggagcuca cagucuauug ag 22
<210> 184
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 184
caacaaauca cagucugcca ua 22
<210> 185
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 185
uucaccaccu ucuccaccca gc 22
<210> 186
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 186
aggguggggc uggagguggg gcu 23
<210> 187
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 187
ugauugucca aacgcaauuc u 21
<210> 188
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 188
uuagggagua gaaggguggg gag 23
<210> 189
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 189
aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 190
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 190
gugagucucu aagaaaagag ga 22
<210> 191
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 191
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23
<210> 192
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 192
aggaagcccu ggaggggcug gag 23
<210> 193
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 193
uuacggacca gcuaagggag gc 22
<210> 194
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 194
gagacugggg uggggcc 17
<210> 195
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 195
aauccuuugu cccuggguga ga 22
<210> 196
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 196
gcgggggugg cggcggcauc cc 22
<210> 197
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 197
uggggaaggc uuggcaggga aga 23
<210> 198
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 198
acuggacuug gagucagaaa 20
<210> 199
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 199
cacgcucaug cacacaccca ca 22
<210> 200
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 200
ucagcaaaca uuuauugugu gc 22
<210> 201
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 201
uaauccuugc uaccugggug aga 23
<210> 202
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 202
uaacagucua cagccauggu cg 22
<210> 203
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 203
ugggauccag acagugggag aa 22
<210> 204
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 204
uacgucaucg uugucaucgu ca 22
<210> 205
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 205
ugcggggcua gggcuaacag ca 22
<210> 206
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 206
ucuguggagu ggggugccug u 21
<210> 207
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 207
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 208
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 208
aguuugggau ggagagagga ga 22
<210> 209
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 209
caguuaucac agugcugaug cu 22
<210> 210
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 210
aagggaggag gagcggaggg gcccu 25
<210> 211
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 211
cagcaggagg ugaggggag 19
<210> 212
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 212
acucaaaaga uggcggcacu uu 22
<210> 213
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 213
gugaaggccc ggcggaga 18
<210> 214
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 214
gggaaaagga agggggagga 20
<210> 215
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 215
aaucugagaa ggcgcacaag gu 22
<210> 216
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 216
guggguacgg cccagugggg gg 22
<210> 217
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 217
aauggauuuu uggagcagg 19
<210> 218
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 218
uguagagcag ggagcaggaa gcu 23
<210> 219
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 219
ccugcgaguc uccggcggug g 21
<210> 220
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 220
caggccauau ugugcugccu ca 22
<210> 221
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 221
ucggccuggg gaggaggaag gg 22
<210> 222
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 222
cggguagaga gggcaguggg agg 23
<210> 223
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 223
aacauucauu gcugucggug ggu 23
<210> 224
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 224
guggguaggg uuugggggag agcg 24
<210> 225
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 225
ucaauaggaa agagguggga ccu 23
<210> 226
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 226
uggggagcug aggcucuggg ggug 24
<210> 227
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 227
guggguuggg gcgggcucug 20
<210> 228
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 228
gugagucagg guggggcugg 20
<210> 229
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 229
aacauucaac cugucgguga gu 22
<210> 230
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 230
aacauagagg aaauuccacg u 21
<210> 231
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 231
aggcgaugug gggauguaga ga 22
<210> 232
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 232
cgucaacacu ugcugguuuc cu 22
<210> 233
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 233
cccagggcuu ggaguggggc aagguu 26
<210> 234
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 234
ugaaacauac acgggaaacc uc 22
<210> 235
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 235
aguucuucag uggcaagcuu ua 22
<210> 236
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 236
augugccuga gggaguaaga ca 22
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 237
uuacaguugu ucaaccaguu acu 23
<210> 238
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 238
uguaaacauc cucgacugga ag 22
<210> 239
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 239
ggcuggucag augggagug 19
<210> 240
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 240
uucauuugcc ucccagccua ca 22
<210> 241
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 241
caccuugcgc uacucagguc ug 22
<210> 242
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 242
aacuggccua caaaguccca gu 22
<210> 243
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 243
uaaggagggg gaugagggg 19
<210> 244
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 244
cccaguguuu agacuaucug uuc 23
<210> 245
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 245
caggaguggg gggugggacg u 21
<210> 246
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 246
gguagugagu uaucagcuac 20
<210> 247
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 247
ucagugcaug acagaacuug g 21
<210> 248
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 248
uugaggggag aaugaggugg aga 23
<210> 249
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 249
aucauagagg aaaauccacg u 21
<210> 250
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 250
acugcugagc uagcacuucc cg 22
<210> 251
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 251
cggggcggca ggggccuc 18
<210> 252
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 252
aaugcacccg ggcaaggauu cu 22
<210> 253
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 253
guggaguccu ggggaaugga ga 22
<210> 254
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 254
gcccugaccu guccuguucu g 21
<210> 255
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 255
auaguccgag uaacgucggg gc 22
<210> 256
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 256
uaaugccccu aaaaauccuu au 22
<210> 257
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 257
uucagcagga acagcu 16
<210> 258
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 258
gugcggaacg cuggccgggg cg 22
<210> 259
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 259
ucccugagac ccuuuaaccu guga 24
<210> 260
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 260
cgggcguggu gguggggg 18
<210> 261
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 261
cguggaggac gaggaggagg c 21
<210> 262
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 262
ccccuggggc ugggcaggcg ga 22
<210> 263
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 263
cugggacagg aggaggaggc ag 22
<210> 264
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 264
uauucauuua uccccagccu aca 23
<210> 265
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 265
cgcgccgggc ccggguu 17
<210> 266
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 266
cgggcguggu ggugggggug 20
<210> 267
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 267
uuuucaacuc uaaugggaga ga 22
<210> 268
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 268
gccggacaag agggagg 17
<210> 269
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 269
ucugggcaac aaagugagac cu 22
<210> 270
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 270
uccgucucag uuacuuuaua gc 22
<210> 271
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 271
gugggcuggg cugggcuggg cc 22
<210> 272
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 272
agacacauuu ggagagggaa cc 22
<210> 273
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 273
ggcuggagcg agugcagugg ug 22
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 274
guguggccgg caggcgggug g 21
<210> 275
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 275
gagggcgggu ggaggagga 19
<210> 276
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 276
cguguauuug acaagcugag uu 22
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<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 277
acugggcuug gagucagaag 20
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 278
guccaguuuu cccaggaauc ccu 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 279
ucaaaaucag gagucggggc uu 22
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<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 280
gggcuggggc gcggggaggu 20
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 281
gcuggugaca ugagaggc 18
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<211> 23
<212> RNA
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<400> 282
ugaggauaug gcagggaagg gga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 283
ucggggauca ucaugucacg aga 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 284
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<212> RNA
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<211> 22
<212> RNA
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<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 287
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<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 288
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 289
ugugacagau ugauaacuga aa 22
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<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 290
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 291
cggaugagca aagaaagugg uu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 292
cuccugacuc cagguccugu gu 22
<210> 293
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 293
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<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 294
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<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 295
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<210> 296
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 296
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 297
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 298
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 299
caucccuugc augguggagg g 21
<210> 300
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 300
aauccuugcu accugggu 18
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 301
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<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 302
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 303
aucacacaaa ggcaacuuuu gu 22
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<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 304
cggcuggagg ugugagga 18
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 305
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 306
ucgaccggac cucgaccggc u 21
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 307
agccuuccag gagaaaugga ga 22
<210> 308
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 308
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 309
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<211> 21
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 313
uguguccggg aaguggagga gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 314
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 315
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
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<211> 21
<212> RNA
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 317
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 318
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 319
ucuucucugu uuuggccaug ug 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 320
ugagggguuu ggaaugggau gg 22
<210> 321
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 321
uuuugcgaug uguuccuaau au 22
<210> 322
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 322
guggggccag gcggugg 17
<210> 323
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 323
gggggaagaa aaggugggg 19
<210> 324
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 324
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 325
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 325
cugcccuggc ccgagggacc ga 22
<210> 326
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 326
uggaguuaag gguugcuugg aga 23
<210> 327
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 327
ugagaccucu ggguucugag cu 22
<210> 328
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 328
cuggcccucu cugcccuucc gu 22
<210> 329
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 329
gugaauuacc gaagggccau aa 22
<210> 330
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 330
cugccaauuc cauaggucac ag 22
<210> 331
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 331
ucggggcaug ggggagggag gcugg 25
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 332
aaucguacag ggucauccac uu 22
<210> 333
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 333
acuccauuug uuuugaugau gga 23
<210> 334
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 334
ccucugggcc cuuccuccag 20
<210> 335
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 335
cgggcugucc ggaggggucg gcu 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 336
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 337
accuggcaua caauguagau uu 22
<210> 338
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 338
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<210> 339
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 339
gagccaguug gacaggagc 19
<210> 340
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 340
gugagccagu ggaauggaga gg 22
<210> 341
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 341
aaagacccau ugaggagaag gu 22
<210> 342
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 342
ugggagggcg uggaugaugg ug 22
<210> 343
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 343
ucuaguaaga guggcagucg a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 344
ugagugugug ugugugagug ugu 23
<210> 345
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 345
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 346
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<210> 347
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 347
uacccuguag auccgaauuu gug 23
<210> 348
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 348
acuggacuug gagccagaag 20
<210> 349
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 349
agcucggucu gaggccccuc agu 23
<210> 350
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 350
uggacugccc ugaucuggag a 21
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<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 351
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<210> 352
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 352
aggugcucca ggcuggcuca ca 22
<210> 353
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 353
cugcgcaagc uacugccuug cu 22
<210> 354
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 354
ucugguccug gacaggaggc 20
<210> 355
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 355
uuacacagcu ggacagaggc a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 356
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 357
gcagggacag caaaggggug c 21
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<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 358
guccgcucgg cgguggccca 20
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 359
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<210> 360
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 360
uaccauuaga agagcuggaa ga 22
<210> 361
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 361
cuggcagggg gagaggua 18
<210> 362
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 362
caacggaauc ccaaaagcag cug 23
<210> 363
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 363
gugggggaga ggcuguc 17
<210> 364
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 364
ucccuguccu ccaggagcuc acg 23
<210> 365
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 365
ugggaggagg ggaucuuggg 20
<210> 366
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 366
ucagcuacua ccucuauuag g 21
<210> 367
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 367
aauauaacac agauggccug u 21
<210> 368
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 368
acccuaucaa uauugucucu gc 22
<210> 369
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 369
augcgaggau gcugacagug 20
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<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 370
ugggggugug gggagagaga g 21
<210> 371
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 371
aggaugagca aagaaaguag auu 23
<210> 372
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 372
ugggucuuug cgggcgagau ga 22
<210> 373
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 373
cagggcucag ggauuggaug gagg 24
<210> 374
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 374
cggggugggu gaggucgggc 20
<210> 375
<211> 25
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 375
auggggugag auggggagga gcagc 25
<210> 376
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 376
acuggcuagg gaaaaugauu ggau 24
<210> 377
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 377
cacccguaga accgaccuug cg 22
<210> 378
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 378
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 379
aaaaacugag acuacuuuug ca 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 380
agggggaugg cagagcaaaa uu 22
<210> 381
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 381
acucggcgug gcgucggucg ug 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 382
aaaaguaauu gcgguuuuug cc 22
<210> 383
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 383
caggcaggug uaggguggag c 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 384
aucagggcuu guggaauggg aag 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 385
ggggcugggg ccggggccga gc 22
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<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 386
cuccgggacg gcugggc 17
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<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 387
gaauguugcu cggugaaccc cu 22
<210> 388
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 388
agaggcuuug ugcggauacg ggg 23
<210> 389
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 389
uuucuucuua gacauggcaa cg 22
<210> 390
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 390
ugaguggggc ucccgggacg gcg 23
<210> 391
<211> 26
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 391
cucggccgcg gcgcguagcc cccgcc 26
<210> 392
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 392
cagcagcaca cugugguuug u 21
<210> 393
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 393
aaagaucugg aagugggaga ca 22
<210> 394
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 394
aucaacagac auuaauuggg cgc 23
<210> 395
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 395
uaugucugcu gaccaucacc uu 22
<210> 396
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 396
agcuucuuua cagugcugcc uug 23
<210> 397
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 397
cuuggcaccu agcaagcacu ca 22
<210> 398
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 398
acauugccag ggaguuu 17
<210> 399
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 399
cugacugaau agguaggguc auu 23
<210> 400
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 400
gcccaggacu uugugcgggg ug 22
<210> 401
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 401
uucauuuggu auaaaccgcg auu 23
<210> 402
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 402
aguuuugcag guuugcaucc agc 23
<210> 403
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 403
aaaaccgucu aguuacaguu gu 22
<210> 404
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 404
agggugugug uguuuuu 17
<210> 405
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 405
uuaagacuug cagugauguu u 21
<210> 406
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 406
gcuggugcaa aaguaauggc gg 22
<210> 407
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 407
aaacaaacau ggugcacuuc uu 22
<210> 408
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 408
agugggaggc cagggcacgg ca 22
<210> 409
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 409
ggauggagga ggggucu 17
<210> 410
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 410
acuggacuug gagucagga 19
<210> 411
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 411
agcccccugg ccccaaaccc 20
<210> 412
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 412
aaguucuguu auacacucag gc 22
<210> 413
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 413
cagccccaca gccucaga 18
<210> 414
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 414
ugagcuaaau gugugcuggg a 21
<210> 415
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 415
cggcgcgacc ggcccgggg 19
<210> 416
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 416
gggggggcag gaggggcuca ggg 23
<210> 417
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 417
uauacaaggg caagcucucu gu 22
<210> 418
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 418
ugagggcucc aggugacggu gg 22
<210> 419
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 419
uuugcaguaa caggugugag ca 22
<210> 420
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 420
aggcaagaug cuggcauagc u 21
<210> 421
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 421
aagggacagg gagggucgug g 21
<210> 422
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 422
cacuggcucc uuucugggua ga 22
<210> 423
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 423
gcgguggggc cggaggggcg u 21
<210> 424
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 424
uauaaaauga gggcaguaag ac 22
<210> 425
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 425
cuggagauau ggaagagcug ugu 23
<210> 426
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 426
agacacauuu ggagagggac cc 22
<210> 427
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 427
cugcaaugua agcacuucuu ac 22
<210> 428
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 428
uugggauggu aggaccagag ggg 23
<210> 429
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 429
ugagaugaag cacuguagcu c 21
<210> 430
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 430
aagacugaga ggaggga 17
<210> 431
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 431
gagggcagcg uggguguggc gga 23
<210> 432
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 432
aaaaguaauu gugguuuuug cc 22
<210> 433
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 433
uguguggauc cuggaggagg ca 22
<210> 434
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 434
acggcccagg cggcauuggu g 21
<210> 435
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 435
ucacaccugc cucgcccccc 20
<210> 436
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 436
ugugacuggu ugaccagagg gg 22
<210> 437
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 437
ucucuucauc uaccccccag 20
<210> 438
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 438
ucggccugac cacccacccc ac 22
<210> 439
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 439
guguggaaga ugggaggaga aa 22
<210> 440
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 440
caagucacua gugguuccgu u 21
<210> 441
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 441
ugggcugcug agaaggggca 20
<210> 442
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 442
ucaggcaaag ggauauuuac aga 23
<210> 443
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 443
uuggggaaac ggccgcugag ug 22
<210> 444
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 444
aacccguaga uccgaacuug ug 22
<210> 445
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 445
accgugcaaa gguagcaua 19
<210> 446
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 446
uugccagggc aggaggugga a 21
<210> 447
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 447
cccaugccuc cugccgcggu c 21
<210> 448
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 448
cucaaguagu cugaccaggg ga 22
<210> 449
<211> 17
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 449
ucgccuccuc cucuccc 17
<210> 450
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 450
ggcggcgggg agguaggcag 20
<210> 451
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 451
ggggggugug gagccagggg gc 22
<210> 452
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 452
aguauucugu accagggaag gu 22
<210> 453
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 453
uaacagucuc cagucacggc c 21
<210> 454
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 454
cagcagggga gagagaggag uc 22
<210> 455
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 455
uaggaugggg gugagaggug 20
<210> 456
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 456
aacauucauu guugucggug ggu 23
<210> 457
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 457
gaguggauag gggagugugu gga 23
<210> 458
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 458
cugguacagg ccugggggac ag 22
<210> 459
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 459
cugguuucac augguggcuu ag 22
<210> 460
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 460
aguggaccga ggaaggaagg a 21
<210> 461
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 461
ucuuggagua ggucauuggg ugg 23
<210> 462
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 462
ucggauccgu cugagcuugg cu 22
<210> 463
<211> 16
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 463
aggaaacagg gaccca 16
<210> 464
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 464
ggcuugcaug ggggacugg 19
<210> 465
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 465
uggugggugg ggaggagaag ugc 23
<210> 466
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 466
aagacgggag gaaagaaggg ag 22
<210> 467
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 467
aucccuugca ggggcuguug ggu 23
<210> 468
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 468
acauuuucca gcccauuca 19
<210> 469
<211> 24
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 469
uguggacagu gagguagagg gagu 24
<210> 470
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 470
cgcgggcgcu ccuggccgcc gcc 23
<210> 471
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 471
gcgacccaua cuugguuuca g 21
<210> 472
<211> 18
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 472
aggagaaguc gggaaggu 18
<210> 473
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 473
uccgaacucu ccauuccucu gc 22
<210> 474
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 474
cuuccgcccc gccgggcguc g 21
<210> 475
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 475
cgguggacug gagugggugg 20
Claims (20)
1.一种从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自所述全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而将长度≥200个核苷酸的RNA级分移除。
2.一种从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供吸附探针，所述吸附探针包含其中/上吸附有来自所述全血样品的全血的亲水性聚合材料；
(ii)使所述吸附探针与流体接触；以及
(iii)从步骤(ii)回收所述流体，从而纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述亲水性聚合材料选自于由棉、多糖、聚烯烃和聚酯所组成的组，并且其中优选地，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：
(iv)通过一种或多种分离技术，对长度＜200个核苷酸的RNA级分进行分离；
其中优选地，所述一种或多种分离技术选自于由离心、蒸发/重构、浓缩、沉淀、液/液提取和固相提取所组成的组。
6.一种测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施权利要求2-5中任一项所述的方法；以及
(ii)通过合适的技术测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
8.一种用于诊断个体的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)通过合适的技术测定长度＜200个核苷酸的RNA分子的水平；
(iii)将所述水平与一个或多个参比水平进行比较；以及
(iv)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述合适的技术选自于由以下所组成的组：核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、测序和质谱，或它们的任意组合。
10.一种用于诊断个体的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施权利要求6或7所述的方法，其中所述全血样品来自个体；
(ii)将所述水平与一种或多种参比水平进行比较；以及
(iii)基于所述比较对所述个体是否患有疾病进行诊断或鉴别诊断。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种参比水平通过测量一种或多种参比全血样品来确定，所述一种或多种参比全血样品来自：
一个或多个健康受试者；
一个或多个患病受试者；和/或
一个或多个患有其它疾病的受试者。
12.亲水性聚合材料用于从全血样品中移除长度≥200个核苷酸的RNA级分的用途。
13.亲水性聚合材料用于从全血样品中纯化长度＜200个核苷酸的RNA级分的用途。
14.如权利要求12或13所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料的密度为≤6g/cm3，优选≤4g/cm3。
15.如权利要求12-14中任一项所述的用途，其中，所述亲水性聚合材料选自于由棉、多糖、聚烯烃和聚酯所组成的组；并且其中优选地，
(i)所述多糖为纤维素；
(ii)所述聚烯烃选自于由聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚异丁烯和聚甲基戊烯所组成的组；或者
(iii)所述聚酯选自于由聚碳酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯所组成的组。
16.根据权利要求6或7所述的方法用于诊断或鉴别诊断疾病的用途。
17.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)吸附探针，所述吸附探针包含亲水性聚合材料。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于获取全血样品。
19.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)流体，所述流体用于重构吸附探针中/上吸附的全血，所述吸附探针包含亲水性聚合材料。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于实施权利要求1-11中任一项所述的方法。
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