ES2952950T3 - Purificación de fracciones de ARN utilizando un material polimérico hidrofílico - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para eliminar una fracción de ARN con >= 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre completa. La presente invención también se refiere a un método para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre completa. La presente invención se refiere además a un método para determinar el nivel de moléculas de ARN con <200 nucleótidos de longitud. Además, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo. Además, la presente invención se refiere a un kit que es útil para llevar a cabo los métodos de la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Purificación de fracciones de ARN utilizando un material polimérico hidrofílico
La presente invención se refiere a un método para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total. La presente invención se refiere además a un método para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud. Además, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo. Por otra parte, la presente invención se refiere al uso de un kit para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total.
Antecedentes de la invención
Las muestras de sangre total se utilizan para análisis biológicos moleculares, por ejemplo, para determinar si un paciente sufre o no una enfermedad específica. Estas muestras a menudo se recolectan tomando muestras de sangre total congelada y luego procesando la sangre congelada después. La sangre congelada requiere un tamaño de muestra de al menos 200 μl. Hay altos costes asociados con el transporte en congelación y el procesamiento de sangre total.
Por lo tanto, se prefiere la recolección de muestras de sangre total utilizando una técnica de la mancha de sangre. Esta requiere volúmenes de muestra más pequeños, típicamente 45-60 μl para humanos, aunque las técnicas analíticas en evolución están utilizando muestras que utilizan 10-15 μl de sangre humana y más pequeñas. Una vez que se completa el muestreo, las gotas de sangre se secan al aire antes de transferirlas o enviarlas a los laboratorios para procesamiento. Debido a que la sangre está seca, no se considera peligrosa. Por lo tanto, no es necesario tomar precauciones especiales en el manejo o envío. Una vez en el sitio de análisis, los componentes deseados, por ejemplo, proteínas o metabolitos, se extraen de las gotas de sangre seca en un sobrenadante que luego se analiza más a fondo, por ejemplo, por cromatografía líquida y/o espectrometría de masas.
Hoy, los biomarcadores que se encuentran en la sangre total juegan un papel clave en el diagnóstico temprano, estratificación del riesgo y manejo terapéutico de enfermedades. En particular, los microARNs (miARNs) son biomarcadores que se encuentran en la sangre total. Representan un grupo de elementos regulatorios que permiten a las células afinar cascadas complejas de expresión génica en una amplia gama de procesos biológicos, como proliferación, diferenciación, apoptosis, respuesta al estrés y oncogénesis. Estos existen en la sangre y en las células sanguíneas como ácidos nucleicos circulantes libres. Esto se debe al hecho de que los miARNs se expresan en las células sanguíneas o en diversos tejidos que liberan los miARNs a la sangre circulante.
En la actualidad, la sangre se recolecta utilizando tubos de ARN en sangre PaxGene para determinar el nivel de biomarcadores de ARN, como los miARNs, comprendidos en ellos. Es necesario un gran esfuerzo analítico y basado en instrumentos para purificar y aislar biomarcadores de ARN como los miARNs, comprendidos en ellos. Además, estas técnicas consumen mucho tiempo y son caras.
WO 2013/165870 A1 divulga composiciones sólidas para la extracción, estabilización y conservación ambiental de ácidos nucleicos de una muestra biológica en un formato seco.
Hay, por lo tanto, una necesidad de un método mejorado de preparación de sangre que reduzca o elimine uno o más de los errores y dificultades anteriores.
Los inventores de la presente invención evaluaron por primera vez que la técnica de la mancha de sangre es útil para poder reducir la complejidad de una fracción de ARN derivada de una muestra de sangre total. En particular, los inventores de la presente invención encontraron que la técnica de la mancha de sangre es valiosa para eliminar fracciones de ARN con > 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre total o para purificar fracciones de ARN con < 200 nucleótidos de longitud (incluido miARN) de una muestra de sangre total. Las fracciones de ARN purificadas y/o aisladas comprenden moléculas de ARN. Los inventores de la presente invención descubrieron además que los perfiles de expresión de dichas moléculas de ARN purificadas y/o aisladas, por ejemplo, moléculas de miARN, se pueden determinar y que dichos perfiles de expresión son de gran calidad. Además, los inventores de la presente invención encontraron que la técnica de la mancha de sangre brinda estabilidad a la muestra en diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura y/o humedad), brinda estabilidad técnica y permite el diagnóstico o diagnóstico diferencial de un individuo que padece una enfermedad.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de purificación de una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total que comprende los pasos de:
(i) proporcionar una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico en/hacia el cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total,
(ii) poner en contacto la sonda absorbente con un fluido que comprende un agente caotrópico (para reconstituir la sangre total), y
(iii) recuperar el fluido que comprende un agente caotrópico del paso (ii), eliminando así la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, y
(iv) purificar la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud del fluido recuperado mediante una o más técnicas de separación seleccionadas del grupo que consiste en centrifugación, evaporación/reconstitución, concentración, precipitación, extracción líquido/líquido y extracción en fase sólida,
en el que la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud no entra al fluido y permanece absorbida en el material polimérico hidrofílico,
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto, y
(ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada. En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto, en el que la muestra de sangre total es de un individuo, (ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada, (iii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iv) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación. Dicho tercer aspecto puede alternativamente formularse de la siguiente manera: Un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la muestra de sangre total es de un individuo, (ii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iii) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación. En un cuarto aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un material polimérico hidrofílico para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un método de acuerdo con el segundo aspecto para diagnosticar o diagnosticar diferencialmente una enfermedad.
En un sexto aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un kit para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en el que dicho kit comprende
(i) una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico, y
(ii) un fluido que comprende un agente caotrópico para reconstituir la sangre total absorbida en/hacia una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico,
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la presente invención. Otras realizaciones resultarán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por
las reivindicaciones adjuntas. Amenos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la materia.
Preferiblemente, los términos utilizados en la presente se definen como se describen en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, Ch-4010 Basilea, Suiza).
El término "comprende" o variaciones tales como "comprendiendo" o "que comprende" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un entero declarado o grupo de enteros, pero no la exclusión de ningún otro entero o grupo de enteros. El término "que consiste esencialmente en" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un entero declarado o grupo de enteros, mientras se excluyen modificaciones u otros enteros que afectarían o alterarían materialmente el entero declarado. El término "que consta de" o variaciones tales como "consiste en" de acuerdo con la presente invención significa la inclusión de un entero declarado o grupo de enteros y la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.
Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente, o claramente contradicho por el contexto.
El término "nucleótidos", como se utiliza en la presente, se refiere a moléculas orgánicas que sirven como monómeros, o subunidades, de ácidos nucleicos como ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico). Los bloques de construcción de los ácidos nucleicos, los nucleótidos, están compuestos por una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y al menos un grupo fosfato. Así, un nucleósido más un grupo fosfato produce un nucleótido.
El término "fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud", como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de ARN que comprende moléculas de ARN grandes, concretamente una o más moléculas de ARN que tienen una longitud de > 200 nucleótidos. Una o más moléculas de ARN abarcan moléculas de ARN ribosomal (ARNr). Pueden seleccionarse del grupo que consiste en ARN 18S y ARN ribosomal 28S.
En el contexto de la presente invención, el término "ácido ribonucleico ribosomal (ARNr abreviado)" se refiere al componente de ARN del ribosoma y es esencial para la síntesis de proteínas en todos los organismos vivos. Constituye el material predominante dentro del ribosoma, que es aproximadamente un 60% de ARNr y un 40% de proteína en peso. Los ribosomas contienen dos ARNr principales y 50 o más proteínas. Los ARNs ribosomales forman dos subunidades, la subunidad grande (SUG) y la subunidad pequeña (SUP). La subunidad grande abarca el ARN ribosomal 28S y la subunidad pequeña abarca el ARN ribosomal 18S.
El término "fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud", como se utiliza en la presente, se refiere a una porción de ARN que comprende moléculas pequeñas de ARN, concretamente una o más moléculas de ARN que tienen una longitud de < 200 nucleótidos. Una o más moléculas de ARN pueden seleccionarse del grupo que consiste en miARN, ARNt, ARNip, ARNpi y ARNpno.
El término "microARN (abreviado miARN)" se refiere a moléculas de ARN de hebra sencilla que tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos y de no más de 40 nucleótidos. Los nucleótidos están unidos entre sí covalentemente. Por ejemplo, las moléculas de ARN de hebra sencilla tienen una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. Los miARNs regulan la expresión génica y están codificados por genes a partir de cuyo ADN se transcriben, pero los miARNs no se traducen en proteínas (es decir, los miARNs son ARNs no codificantes). Los genes que codifican para los miARNs son más largos que las moléculas de miARN maduras procesadas. Los miARNs se transcriben primero como transcritos primarios o primiARNs con una tapa y una cola poli-A y se procesan en estructuras cortas de tallo-bucle de 70 nucleótidos conocidas como pre-miARNs en el núcleo celular. Este procesamiento se realiza en animales mediante un complejo de proteínas conocido como complejo de Microprocesador que consiste en la nucleasa Drosha y la proteína de unión a ARN de doble hebra Pasha. Estos pre-miARNs se procesan luego para madurar miARNs en el citoplasma mediante la interacción con la endonucleasa Dicer, la cual también inicia la formación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (CSIA). Cuando Dicer escinde el tallo-bucle pre-miARN, se forman dos moléculas de ARN cortas complementarias, pero solo una se integra en el CSIA. Esta hebra se conoce como la hebra guía y es seleccionada por la proteína argonauta, la ARNasa catalíticamente activa en el CSIA, sobre la base de la estabilidad del extremo 5'. La hebra restante, conocida como miARN*, anti-guía (anti-hebra) o hebra pasajera, se degrada como sustrato CSIA. Por lo tanto, los miARN*s se derivan de la misma estructura de horquilla que los miARNs "normales". Entonces, si el miARN "normal" se denomina "miARN maduro" o “hebra guía", el miARN* es la "hebra anti-guía" o "hebra pasajera".
El término "ARN de transferencia (abreviado ARNt)", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula adaptadora compuesta de ARN, típicamente de 76 a 90 nucleótidos de longitud que sirve como enlace físico entre el ARNm y la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Hace esto llevando un aminoácido a la maquinaria de síntesis de proteínas de la célula (ribosoma) según lo indique una secuencia de tres nucleótidos (codón) en un ARN mensajero (ARNm). Como tales, los ARNt son un componente necesario de la traducción, la síntesis biológica de nuevas proteínas según el código genético.
El término "ARN de interferencia pequeño (abreviado ARNip)", como se utiliza en la presente, se refiere a una clase de moléculas de ARN de doble hebra, de 20 a 25 pares de bases de longitud. El ARNip desempeña muchas funciones, pero es más notable en la vía de interferencia de ARN (ARNi), donde interfiere con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias. El ARNip funciona haciendo que el ARNm se descomponga después de la transcripción, lo que resulta en que no haya traducción.
El término "ARN que interactúa con piwi (abreviado ARNpi)", como se utiliza en la presente se refiere a la clase más grande de moléculas pequeñas de a Rn no codificantes expresadas en células animales. Los ARNpi forman complejos de ARN-proteína a través de interacciones con proteínas piwi. Estos complejos ARNpi se han relacionado con el silenciamiento génico tanto epigenético como postranscripcional de retrotransposones y otros elementos genéticos en las células de la línea germinal, en particular las de la espermatogénesis. Son distintos del microARN (miARN) en tamaño (26-31 nt en lugar de 21-24 nt), falta de conservación de secuencia y complejidad aumentada.
El término "ARN pequeño nucleolar (abreviado ARNpno)", como se utiliza en la presente, se refiere a una clase de moléculas de ARN pequeñas que guían principalmente las modificaciones químicas de otros ARNs, principalmente ARNs ribosomales, ARNs de transferencia y ARNs pequeños nucleares. Hay dos clases principales de ARNpno, los ARNspno de caja C/D, que están asociados con la metilación, y los ARNspno de caja H/ACA, que están asociados con la pseudouridilación. Los ARNspno se denominan comúnmente ARN guía, pero no deben confundirse con los ARNs guía que dirigen la edición de ARN en los tripanosomas.
El término "sangre total", como se utiliza en la presente, se refiere a sangre no fraccionada. Por lo tanto, comprende todos los componentes de la sangre. La sangre total se compone de un fluido acelular (plasma o suero) y una mezcla de múltiples tipos de células sanguíneas. Los tres tipos principales de células sanguíneas son los glóbulos rojos (eritrocitos), los glóbulos blancos (leucocitos) y las plaquetas (trombocitos). Cada tipo contribuye con una cantidad diferente de ARN al ARN total en sangre.
Los términos "glóbulos rojos (GR)" y "eritrocitos", tal como se utilizan en la presente, se refieren a las células más abundantes en la sangre total, constituyendo el 44% del volumen sanguíneo. GR maduros pierden su núcleo y organelos durante la maduración y, por lo tanto, no contribuyen con ningún ARN al conjunto total de ARN sanguíneo. Sin embargo, los GR inmaduros, también conocidos como reticulocitos, pueden retener algunos ácidos nucleicos residuales. Debido a que los reticulocitos constituyen aproximadamente el 1% de la población de GR, el ARN residual de los reticulocitos contribuye hasta con el 70% del ARN en la reserva total de ARN sanguíneo.
Los términos "glóbulos blancos (GB)" y "leucocitos", como se utilizan en la presente, se refieren a células sanguíneas nucleadas que llevan a cabo las funciones inmunitarias del cuerpo. Los leucocitos son las células más activas transcripcionalmente en la sangre. Los leucocitos están formados por granulocitos, linfocitos y monocitos. Los granulocitos se pueden dividir en neutrófilos, basófilos y eosinófilos. Los linfocitos se pueden dividir en células B, células T y células asesinas naturales (AN). El número de células en cada subtipo de leucocito puede cambiar significativamente durante estados de enfermedad tales como inflamación y leucemia.
Los términos "plaquetas" y "trombocitos", como se utilizan en la presente, se refieren a las células sanguíneas que desempeñan un papel importante en la coagulación de la sangre. Las plaquetas ingresan a la circulación sanguínea mediante la fragmentación de células grandes de médula ósea llamadas megacariocitos. Al igual que los glóbulos rojos, las plaquetas carecen de núcleo y organelos. Las plaquetas inmaduras, llamadas plaquetas reticuladas, contienen ARN residual de los megacariocitos. Hasta el 4.5% de los recuentos de plaquetas pueden ser plaquetas reticuladas. El ARN de plaquetas, por lo tanto, también contribuye a la reserva sanguínea total de ARN.
El término "plasma", como se utiliza en la presente, se refiere al componente líquido amarillo pálido de la sangre que normalmente mantiene las células sanguíneas en suspensión en la sangre total. Esto convierte al plasma en la matriz extracelular de las células sanguíneas. Es un fluido que se compone de aproximadamente 92% de agua, 7% de proteínas vitales como albúmina, gammaglobulina, factor antihemofílico y otros factores de coagulación, y 1% de sales minerales, azúcares, grasas, hormonas y vitaminas.
El término "suero", como se utiliza en la presente, se refiere al componente sanguíneo que no es ni una célula sanguínea (el suero no contiene glóbulos blancos ni rojos) ni un factor de coagulación. Es el plasma sanguíneo sin incluir los fibrinógenos. El suero incluye todas las proteínas que no se utilizan en la coagulación de la sangre y todos los electrolitos, anticuerpos, antígenos, hormonas y cualquier sustancia exógena (por ejemplo, fármacos y microorganismos).
El término "muestra de sangre total", como se utiliza en la presente, se refiere a material sanguíneo que ya no forma parte del cuerpo de un individuo. Se puede proporcionar una muestra de sangre total extrayendo sangre de un individuo, pero también se puede obtener utilizando material sanguíneo previamente aislado. La muestra de sangre total puede extraerse de un individuo utilizando técnicas convencionales de recolección de sangre. Por ejemplo, la sangre total se puede extraer de una vena en el brazo de un individuo utilizando una aguja o mediante un pinchazo en el dedo. Así, la muestra de sangre total puede tener la forma de una gota de sangre. Dicha gota de sangre puede ser de un individuo, por ejemplo, en la punta del dedo del individuo. La muestra de sangre total también puede estar comprendida en un tubo de recolección de sangre, por ejemplo, tubo capilar, o en una punta de pipeta.
El término "mancha de sangre" se refiere a un papel de filtro que comprende una o más gotas de sangre. Normalmente, el papel filtro que comprende una o más gotas de sangre se seca después del muestreo. Los inventores de la presente invención utilizaron un material polimérico hidrofílico para absorber las gotas de sangre.
El término "técnica de la mancha de sangre" se refiere a una forma de biomuestreo donde las muestras de sangre se secan en papel filtro. Después del biomuestreo, el papel filtro que contiene la sangre se seca preferentemente. Las muestras secas pueden enviarse fácilmente a un laboratorio analítico y analizarse mediante varios métodos, como el análisis de expresión de ARN. En particular, las muestras de gotas de sangre se recolectan aplicando unas pocas gotas de sangre, extraídas con una lanceta del dedo de la mano, talón o dedo del pie, sobre un papel filtro absorbente. Se deja que la sangre sature completamente el papel y preferiblemente se seca al aire. Las muestras se pueden almacenar en bolsas de plástico de baja permeabilidad a gases con desecante agregado para reducir la humedad y se pueden mantener a temperatura ambiente, incluso en climas tropicales. Una vez en el laboratorio, los técnicos pueden separar un pequeño disco de papel saturado de la hoja utilizando un perforador automático o manual para su posterior análisis. Como alternativa a perforar un disco de papel, las soluciones de automatización recientes pueden extraer la muestra haciendo pasar un eluyente a través del filtro sin perforarlo. Los inventores de la presente invención utilizaron un material polimérico hidrofílico sobre el que se seca/aplica la sangre.
El término "individuo", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sujeto del cual se puede tomar, obtener o aislar una muestra de sangre total.
El término "individuo", como se utiliza en la presente, se refiere además a cualquier sujeto del que se desea saber si él o ella padece una enfermedad. En particular, el término "individuo", como se utiliza en la presente, se refiere a un sujeto del que se sospecha está afectado por una enfermedad. El individuo puede ser diagnosticado de estar afectado por la enfermedad, es decir, enfermo, o puede diagnosticarse que no está afectado por la enfermedad, es decir, sano. El término "individuo", como se utiliza en la presente, también se refiere a un sujeto que está afectado por la enfermedad, es decir, enfermo. El paciente puede volver a someterse a la prueba de la enfermedad y puede diagnosticarse que todavía está afectado por la enfermedad, es decir, enfermo, o que ya no está afectado por la enfermedad, es decir, sano, por ejemplo, después de una intervención terapéutica. Debe tomarse en cuenta que un paciente que es diagnosticado como sano, es decir, que no padece la enfermedad, posiblemente padezca otra enfermedad no probada/conocida. La enfermedad puede ser cáncer de pulmón. También se puede designar como paciente al individuo del que se desea saber si padece una enfermedad.
El individuo puede ser un mamífero, incluidos tanto un ser humano como otro mamífero, por ejemplo, un animal como un roedor, un conejo o un mono. El roedor puede ser un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de Indias o una chinchilla.
El término "sujeto (control)", como se utiliza en la presente, se refiere a un sujeto que se sabe que está afectado por una enfermedad (control positivo), es decir, enfermo. El término "sujeto (control)", como se utiliza en la presente, también se refiere a un sujeto que se sabe que no está afectado por una enfermedad (control negativo), es decir, sano. Por lo tanto, el término "sujeto sano", como se utiliza en la presente, significa un sujeto que se sabe no está afectado por una enfermedad. Debe tomarse en cuenta que un sujeto (control) que se sabe que está sano, es decir, que no padece la enfermedad probada/conocida, posiblemente padezca otra enfermedad no probada/conocida. La enfermedad puede ser cáncer de pulmón.
El sujeto (control) puede ser un mamífero, incluidos tanto un ser humano como otro mamífero, por ejemplo, un animal como un roedor, un conejo o un mono. El roedor puede ser un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de Indias o una chinchilla.
El término "diagnosticar una enfermedad", como se utiliza en la presente, significa determinar si un individuo muestra signos o sufre la enfermedad. Preferiblemente, la enfermedad es cáncer de pulmón.
El término "diagnosticar diferencialmente una enfermedad", como se utiliza en la presente, significa determinar si un individuo muestra signos de o sufre una enfermedad o muestra signos de o sufre otra enfermedad. Preferiblemente, la enfermedad es cáncer de pulmón. La otra enfermedad es cualquier otra enfermedad además del cáncer de pulmón. "Diagnosticar diferencialmente una enfermedad", como se utiliza en el contexto de la presente invención, también puede permitir distinguir entre sí enfermedades tratadas de manera diferente. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad tratada con adyuvante, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado con adyuvante, y la otra enfermedad puede ser una enfermedad tratada paliativamente, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado de forma paliativa, o la enfermedad puede ser una enfermedad tratada de forma paliativa, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado paliativamente, y la otra enfermedad puede ser una enfermedad tratada con adyuvante, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado con adyuvante.
El término "tratamiento", en particular "tratamiento terapéutico", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier terapia que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la esperanza de vida de un individuo. Dicha terapia puede eliminar la enfermedad en un individuo, arrestar o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retrasar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que ha tenido previamente una
enfermedad. El tratamiento terapéutico puede ser un tratamiento de cáncer de pulmón. El tratamiento terapéutico del cáncer de pulmón se selecciona del grupo que consiste en quimioterapia, cirugía, radioterapia, terapia adyuvante y terapia paliativa.
El término "sonda absorbente", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sonda que pueda absorber sangre total comprendida en la muestra de sangre total. La sonda absorbente utilizada en la presente comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico.
El término "material polimérico hidrofílico", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier material que pueda absorber la sangre total comprendida en la muestra de sangre total. El término "material polimérico hidrofílico", como se utiliza en la presente, se refiere además a un material polimérico que contiene grupos funcionales polares o cargados, que hacen que el material sea soluble en agua. Un material polimérico hidrofílico comprende polímeros hidrofílicos. Un polímero hidrofílico se produce a partir de dos o más monómeros hidrofílicos. El término "material polimérico hidrofílico", como se utiliza en la presente, también abarca un material polimérico que no es hidrofílico por naturaleza, por ejemplo, polietileno, pero que se ha vuelto hidrofílico. Si el material polimérico no es inicialmente hidrofílico, existen numerosos métodos para convertir el material en un estado hidrofílico. Los métodos para crear superficies hidrofílicas incluyen el tratamiento de adsorción con tensioactivos como Tween-40 o Tween-80 para crear superficies hidrofílicas. El tratamiento también puede ocurrir con otras moléculas que contienen elementos tanto hidrofílicos como hidrofóbicos. Los elementos hidrofóbicos van a interactuar fuertemente con el material polimérico hidrofóbico y expondrán los elementos hidrofílicos creando superficies hidrofílicas. Además, el tratamiento con plasma (Corona, Aire, Llama o Químico) es otro método bien conocido para agregar grupos polares a las superficies de dichos materiales, incluyendo tratamientos con plasma de oxígeno. Asimismo, el injerto de polímeros hidrofílicos en la superficie y la funcionalización química de grupos activos en la superficie con moléculas polares o hidrófilas como los azúcares pueden utilizarse para conseguir una superficie hidrofílica sobre un material polimérico. La modificación covalente también podría utilizarse para agregar grupos funcionales polares o hidrofílicos a la superficie de un material polimérico.
El material polimérico hidrofílico se puede seleccionar del grupo que consiste en un material que comprende celulosa, por ejemplo, algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster, o modificaciones de los mismos. El polisacárido puede ser celulosa, la poliolefina puede seleccionarse del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, y el poliéster puede seleccionarse del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato. Se prefieren particularmente el algodón, la celulosa y el polietileno como materiales poliméricos hidrofílicos.
Los ejemplos de dispositivos/sondas que comprenden un material polimérico hidrofílico incluyen, pero se limitan a, dispositivo de Micromuestreo Mitra (neoteryx, Torrance, CA, EUA.), Tarjeta Clásica FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), Micro Tarjeta de Elución FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), HemaSpot HF (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), HemaSpot SE (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), TNF (Munktell, Barenstein, Alemania) y TNF-Di (Munktell, Barenstein, Alemania).
El término "nivel", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad (medida, por ejemplo, en gramos, mol o recuentos de iones) o concentración (por ejemplo, concentración absoluta o relativa) de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud. El término "nivel", como se utiliza en la presente, también comprende cantidades o valores escalados, normalizados o escalados y normalizados. En una realización, el nivel es el nivel de expresión de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud. Dicho nivel de expresión puede indicarse como concentración (relativa) de ARN (por ejemplo, miARN), cantidad (relativa) de ARN (por ejemplo, miARN), o unidades de extinción (relativas) de ARN (por ejemplo, miARN) tales como unidades relativas de fluorescencia.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "partes del kit (abreviado kit)" cualquier combinación de al menos algunos de los componentes identificados en la presente, que se combinan, coexistiendo espacialmente, en una unidad funcional, y que pueden contienen otros componentes.
Realizaciones de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas, a menos que se indique claramente lo contrario.
Los inventores de la presente invención evaluaron por primera vez que la técnica de la mancha de sangre es útil para reducir la complejidad de una muestra de sangre total. En particular, los inventores de la presente invención encontraron que la técnica de la mancha de sangre es valiosa para eliminar fracciones de ARN con > 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre total o para purificar fracciones de ARN con < 200 nucleótidos de longitud (incluyendo miARN) de una muestra de sangre total. Las fracciones de ARN purificadas y/o aisladas comprenden moléculas de ARN. Los inventores de la presente invención descubrieron además que los perfiles de expresión de dichas moléculas de ARN purificadas y/o aisladas, por ejemplo, moléculas de miARN, se pueden determinar y que
dichos perfiles de expresión son de gran calidad. Además, los inventores de la presente invención encontraron que la técnica de la mancha de sangre brinda estabilidad a la muestra bajo diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura y/o humedad), brinda estabilidad técnica y permite el diagnóstico o diagnóstico diferencial de un individuo que padece una enfermedad.
Descrito en la presente, pero no incluido por la presente invención, un método para eliminar una fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre total que comprende los pasos de
(i) proporcionar una sonda absorbente que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico en/hacia cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total,
(ii) poner en contacto la sonda absorbente con un fluido (para reconstituir la sangre total), y
(iii) recuperar el fluido del paso (ii), eliminando así la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud.
En el paso (i), se proporciona una sonda absorbente, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico en/hacia el que se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total. Con ello, las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, así como las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud que están comprendidas en la sangre total han sido absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico.
La sonda absorbente proporcionada en el paso (i) puede obtenerse colocando una sonda absorbente que comprenda, consista esencialmente en, o consista en un material polimérico hidrofílico en contacto (físico) con la muestra de sangre total, absorbiendo así la sangre total en/hacia el material polimérico hidrofílico.
Se puede lograr un contacto (físico) entre la sonda absorbente y la muestra de sangre total mojando o sumergiendo la sonda absorbente en la muestra de sangre total. La muestra de sangre total puede tener la forma de una gota de sangre. La sangre total también puede estar contenida en un tubo de recolecta de sangre. Alternativamente, se pueden aplicar una o más gotas de la muestra de sangre total a la sonda absorbente, por ejemplo, a través de una pipeta. Debido al contacto (físico), la sangre total se sumerge en/hacia el material polimérico hidrofílico y, con ello, las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, así como las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud, que están contenidas en la sangre total.
Normalmente, es suficiente mantener la sonda en contacto (físico) con la muestra de sangre total entre 1 y 20 segundos, preferentemente entre 1 y 10 segundos, más preferentemente entre 1 y 5 segundos, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos. El tiempo de contacto es deseablemente lo más corto posible. La sonda absorbe un volumen predeterminado de sangre durante ese tiempo y, una vez saturada, no absorbe más sangre. El tamaño y la forma de la sonda se pueden variar para ajustar el volumen de sangre absorbida y la tasa de absorción. Volúmenes de sangre de entre 1 y 50 μl, preferiblemente entre 5 y 25 μl, e incluso más preferiblemente entre 10 y 20 μl, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2526, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 μl, se creen apropiados.
En el paso (ii), la sonda absorbente se pone en contacto con un fluido. El fluido puede ser un líquido o un gas. Preferiblemente, el fluido es un fluido caotrópico, por ejemplo, un líquido caotrópico o gas. Más preferiblemente, el fluido caotrópico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino. Aún más preferiblemente, el fluido caotrópico es tiocianato de guanidinio. Alternativamente, el fluido caotrópico, por ejemplo, el líquido caotrópico o gas puede comprender tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino. Preferiblemente, el fluido caotrópico comprende tiocianato de guanidinio.
Se puede lograr un contacto entre la sonda absorbente y el fluido al mojar o sumergir la sonda absorbente en el fluido. Esto se puede hacer a mano o con un robot de manejo de fluidos. El paso (ii) permite reconstituir la sangre total. Las técnicas de agitación física como sonicación, mezcla o agitación en vórtice del fluido y/o la sonda absorbente puede acelerar el proceso de reconstitución. En particular, el paso (ii) permite la separación de moléculas comprendidas en la sangre total entre sí. Algunas moléculas se pueden eliminar del material polimérico hidrofílico, otras moléculas no. Estas moléculas permanecen absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico. Los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud permanecen absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico y no entran al fluido, mientras que las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud pueden extraerse del material polimérico hidrofílico mediante el fluido en el paso (ii).
En el paso (iii) se recupera el fluido del paso (ii). Debido a este proceso, se elimina la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. A este respecto, cabe señalar que la eliminación de la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud no significa necesariamente que la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud se elimine por completo. También se describen realizaciones en las que se elimina al menos una parte de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, en algunas realizaciones, al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% o el 100% de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud se eliminan. Se prefiere que se eliminen al menos el 90% de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. Se prefiere más que se
eliminen al menos el 95% de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. Es incluso más preferible que se eliminen al menos el 98% o el 99% de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. Lo más preferible es que se eliminen el 100% de las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, es decir, todas las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud.
La recuperación del fluido del paso (ii) puede lograrse retirando la sonda absorbente del fluido.
Preferiblemente, la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud comprende una o más moléculas de ARN seleccionadas del grupo que consiste en ARN ribosomal 18S y ARN ribosomal 28S.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método de purificación de una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total que comprende los pasos de:
(i) proporcionar una sonda absorbente que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico en/hacia el cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total,
(ii) poner en contacto la sonda absorbente con un fluido que comprende un agente caotrópico (para reconstituir la sangre total), y
(iii) recuperar el fluido que comprende un agente caotrópico del paso (ii), eliminando así la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, y
(iv) purificar la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud del fluido recuperado mediante una o más técnicas de separación seleccionadas del grupo que consiste en centrifugación, evaporación/reconstitución, concentración, precipitación, extracción líquido/líquido y extracción en fase sólida,
en el que la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud no ingresa al fluido y permanece absorbida en el material polimérico hidrofílico
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
En el paso (i), se proporciona una sonda absorbente, que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico en/hacia el cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total. Con ello, las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, así como las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud que están comprendidas en la sangre total han sido absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico.
La sonda absorbente provista en el paso (i) puede obtenerse al colocar una sonda absorbente que comprenda, consista esencialmente en, o consista en un material polimérico hidrofílico en contacto (físico) con la muestra de sangre total, absorbiendo así la sangre total en/hacia el material polimérico hidrofílico.
Se puede lograr un contacto (físico) entre la sonda absorbente y la muestra de sangre total al mojar o sumergir la sonda absorbente en la muestra de sangre total. La muestra de sangre total puede tener la forma de una gota de sangre. La sangre total también puede estar contenida en un tubo de recolecta de sangre. Alternativamente, se pueden aplicar una o más gotas de la muestra de sangre total a la sonda absorbente, por ejemplo, a través de una pipeta. Debido al contacto (físico), la sangre total se sumerge en/hacia el material polimérico hidrofílico y, con ello, las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, así como las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud, que están contenidas en la sangre total.
Normalmente, es suficiente mantener la sonda en contacto (físico) con la muestra de sangre total entre 1 y 20 segundos, preferiblemente entre 1 y 10 segundos, más preferiblemente entre 1 y 5 segundos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segundos. El tiempo de contacto es deseablemente lo más corto posible. La sonda absorbe un volumen predeterminado de sangre durante ese tiempo y, una vez saturada, no absorbe más sangre. El tamaño y forma de la sonda se pueden variar para ajustar el volumen de sangre absorbida y la tasa de absorción. Volúmenes de sangre de entre 1 y 50 μl, preferiblemente entre 5 y 25 μl, incluso más preferiblemente entre 10 y 20 μl, por ejemplo, de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 2526, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 μl, se creen apropiados.
En el paso (ii), la sonda absorbente se pone en contacto con un fluido que comprende un agente caotrópico. El fluido puede ser un líquido o gas. Preferiblemente, el fluido es un líquido o gas que comprende un agente caotrópico. Más preferiblemente, el agente caotrópico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino. Aún más preferiblemente, el agente caotrópico es tiocianato de guanidinio.
Se puede lograr un contacto entre la sonda absorbente y el fluido que comprende un agente caotrópico al mojar o sumergir la sonda absorbente en el fluido que comprende un agente caotrópico. Esto se puede hacer a mano o con un robot de manejo de fluidos. El paso (ii) permite reconstituir la sangre total. Las técnicas de agitación física como la sonicación o agitación en vórtice del fluido y/o la sonda absorbente pueden acelerar el proceso de reconstitución. En particular, el paso (ii) permite la separación de moléculas comprendidas en la sangre total entre sí. Algunas moléculas
se pueden eliminar del material polimérico hidrofílico, otras moléculas no. Estas moléculas permanecen absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico. Los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que las moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud permanecen absorbidas en/hacia el material polimérico hidrofílico y no entran al fluido que comprende un agente caotrópico, mientras que las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud pueden eliminarse del material polimérico hidrofílico por el fluido que comprende un agente caotrópico en el paso (ii).
En el paso (iii), el fluido que comprende un agente caotrópico se recupera del paso (ii). De este modo, se elimina la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud. La fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud se recupera del fluido que comprende un agente caotrópico. Se recupera particularmente de la fase acuosa de la muestra de sangre reconstituida.
En el paso (iv), la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud se purifica del líquido recuperado mediante una o más técnicas de separación seleccionadas del grupo que consiste en centrifugación, evaporación/reconstitución, concentración, precipitación, extracción líquido/líquido y extracción de fase sólida.
La recuperación del fluido que comprende un agente caotrópico del paso (ii) se puede lograr retirando la sonda absorbente del fluido que comprende un agente caotrópico.
Preferiblemente, la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud comprende una o más moléculas de ARN seleccionadas del grupo que consiste en miARN, ARNt, ARNip, ARNpi y ARNpno.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente se pone en contacto con el fluido que comprende un agente caotrópico durante ≤ 20 horas, preferiblemente durante ≤ 5 horas, por ejemplo, durante ≤ 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 minuto(s), 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 hora(s). Más preferiblemente, la sonda absorbente se pone en contacto con el fluido que comprende un agente caotrópico durante entre 1 minuto y 20 horas, incluso más preferiblemente entre 1 minuto y 5 horas, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 ,26 , 27, 28, 29 minuto(s), 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 o 20 hora(s).
Preferiblemente, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 4 g/cm3, por ejemplo, de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 g/cm3. Más preferentemente, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de entre 1 y 4 g/cm3, por ejemplo, de 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 g/cm3.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico es poroso.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico tiene un volumen de poro de entre 20 y 70%, preferiblemente de entre 30 y 50%, por ejemplo, de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ,64, 65, 66, 67, 68, 69, o el 70 % del volumen total del material.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico comprende poros que son ≤ 100 |jm, preferiblemente ≤ 50 jm , por ejemplo, ≤ 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jm , de diámetro o de la dimensión transversal más grande. Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico comprende poros que tienen entre 10 y 100 jm , incluso más preferiblemente entre 20 y 50 jm , por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jm , de diámetro o de la dimensión transversal más grande.
En el primer aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster. Preferiblemente,
(i) el polisacárido es celulosa,
(ii) la poliolefina se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, o
(iii) el poliéster se selecciona del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato.
Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico es algodón, celulosa o polietileno.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente ha absorbido un volumen máximo predeterminado de sangre total de entre 1 y 50 jl, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 jl.
En una realización del primer aspecto de la presente invención,
la sonda absorbente tiene una longitud de ≤ 10 mm, preferiblemente de ≤ 5 mm, por ejemplo, de ≤ 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mm y un área transversal de ≤ 40 mm2, preferentemente de ≤ 20 mm2, por ejemplo, de ≤ 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 mm2.
Tales tamaños se consideran adecuados cuando la muestra de sangre total es una gota de sangre, por ejemplo, de un pinchazo en el dedo.
En una realización alternativa del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente tiene un volumen de ≤ 250 mm3, preferentemente de ≤ 200 mm3, por ejemplo, de ≤ 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 mm3.
Tales volúmenes se consideran adecuados cuando la muestra de sangre total es una gota de sangre, por ejemplo, de un pinchazo en el dedo.
Más preferentemente, la sonda absorbente tiene una longitud de entre 2 y 10 mm, preferentemente de entre 2 y 5 mm, por ejemplo de 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mm, y un área transversal de entre 5 y 40 mm2, preferentemente de entre 5 y 20 mm2, por ejemplo, de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ,29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 mm2.
En una realización alternativa del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente tiene un volumen de entre 1 mm3 hasta 250 mm3, preferentemente de entre 2.5 mm3 a 200mm3, por ejemplo, de 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ,41,42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230, 240 o 250 mm3.
Se cree que son deseables cilindros con extremos planos o extremos semicirculares en sondas cilindricas, pero se pueden utilizar varias configuraciones.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, la sangre total absorbida en/hacia el material polimérico hidrofílico se ha secado. El secado puede llevarse a cabo al aire libre, por ejemplo, a temperatura ambiente (20 °C) o a temperaturas elevadas (por ejemplo, 30 °C). Alternativamente, la sonda absorbente puede transferirse a un contenedor de secado especial configurado para ayudar al secado mientras se minimiza el contacto entre la sonda absorbente y las paredes del contenedor de secado u otras superficies contaminantes potenciales. El recipiente de secado puede comprender un desecante para facilitar el secado. El secado puede llevarse a cabo entre 0.5 y 5 hora(s) o entre 0.5 y 3 hora(s), por ejemplo, durante 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 o 5 hora(s). En este sentido, se debe notar que el tiempo de secado puede variar ya que depende de humedad, temperatura, volumen a secar y la forma y configuración de la sonda absorbente. Además, el secado rápido de la sangre ayuda a ralentizar la degradación de la muestra de sangre. Secar una muestra pequeña es más rápido que secar una muestra grande. Para reducir el tiempo de secado, el material hidrofílico se selecciona preferiblemente para que sea permeable al aire o gas, de modo que el aire pueda entrar en la sonda absorbente y secarla más rápido.
Se prefiere particularmente que la fracción de ARN purificado con < 200 nucleótidos de longitud tenga una pureza de al menos el 70% o al menos el 75%, más preferiblemente de al menos el 80%, aún más preferiblemente de al menos el 90%, y lo más preferiblemente de al menos 95%, por ejemplo, al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9 % o 100%.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente comprende además una sustancia seleccionada del grupo que consiste en un estándar de referencia, un anticoagulante y un estabilizador.
El uso de anticoagulantes puede ser útil para mantener la homogeneidad de la sangre, así como para prevenir degradación no deseada. Puede aplicarse un anticoagulante seco a la sonda absorbente, pero preferiblemente se aplica húmedo o en forma líquida y se deja secar antes de usarse. Los anticoagulantes más comunes se dividen en dos categorías: polianiones (por ejemplo, heparina) o quelantes de metales (por ejemplo, EDTA, citrato). Se cree que los anticoagulantes adecuados incluyen ácido citrato dextrosa, citrato fosfato dextrosa, citrato fosfato dextrosa adenina, citrato de sodio, K2 EDTA, k 3 EDTA, EDTA de sodio, heparina de litio, heparina de sodio, potasio y oxalato. Cualquier anticoagulante aplicado a la sonda absorbente debe combinarse adecuadamente con el fluido utilizado y el análisis río abajo para no afectar negativamente la precisión del análisis.
El uso de un estándar de referencia, por ejemplo, estándar interno y externo, durante el análisis es una práctica común. Por lo tanto, se puede aplicar un estándar de referencia (húmedo o seco) a la sonda absorbente durante la fabricación o el muestreo del fluido, o se puede agregar al fluido de reconstitución cuando se extrae la sangre (seca) de la sonda absorbente. Muchos materiales no volátiles que no afectan el análisis de la sangre pueden utilizarse como estándares de referencia. Pueden utilizarse radiomarcadores, marcadores fluorescentes y marcadores deuterados.
El uso de estabilizadores también es una práctica común. Los estabilizadores pueden ser útiles para estabilizar la sangre. Se puede aplicar un estabilizador seco a la sonda absorbente, pero preferiblemente se aplica húmedo o en forma líquida y se deja secar antes de usarse Los ejemplos de estabilizadores incluyen, pero no se limitan a, ARN-later, ARNstable, PAXgene-reactivo, ARNsin y catrimox-14.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, la sonda absorbente es una sonda como se describe en WO 2013/067520 A1 o US 2013116597 A1. En particular, la sonda absorbente es parte de un dispositivo de muestreo de fluidos biológicos como se describe en WO 2013/067520 A1 o US 2013116597 A1. Al respecto, se refiere a la página 10, línea 28 a la página 34, línea 27, Figuras 2, 3 y 8, y reivindicaciones 1 a 19 de WO 2013/067520 A1 y a los párrafos [0068] a [0129], Figuras 2, 3 y 8, y reivindicaciones 1 a 19 de US 2013116597 A1.
En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto, y
(ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada.
Los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que se puede determinar el nivel de moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, purificadas de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. De esta manera, los tiempos de procesamiento de muestras pueden acortarse, el análisis de muestras (por ejemplo, debido a la creación de perfiles de expresión) puede simplificarse y los costes pueden ahorrarse.
Preferiblemente, las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud se seleccionan del grupo que consiste en miARN, ARNt, ARNip, ARNpi y ARNpno.
En una realización del segundo aspecto de la presente invención, el nivel que se determina en el paso (ii) es el nivel de expresión.
La determinación en el paso (ii) puede llevarse a cabo por cualquier medio conveniente para determinar el nivel de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, particularmente el nivel de expresión de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Por ejemplo, pueden utilizarse métodos de detección cualitativos, semicuantitativos y/o cuantitativos. Una variedad de técnicas son bien conocidas por el experto en la materia.
Se prefiere que el nivel de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, particularmente el nivel de expresión de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, se determina mediante hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos, extensión de polimerasa, secuenciación, espectroscopia de masas o cualquier combinación de los mismos. La amplificación de ácidos nucleicos se puede realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR). Se prefiere la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para el análisis de una sola molécula de aRn, por ejemplo, un miARN, o un bajo número de moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Es particularmente adecuado para detectar moléculas de ARN de baja abundancia, por ejemplo, miARNs. Sin embargo, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR) permite el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN, y un número elevado de moléculas de ARN, miARNs.
Hay disponible una variedad de kits y protocolos para determinar el nivel de expresión de los miARNs mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Rt qPCR). Por ejemplo, la transcripción reversa de miARNs se puede realizar utilizando el Kit de Transcripción Reversa TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, el miARN se puede combinar con dNTPs, la transcriptasa reversa MultiScribe y el cebador específico para el miARN objetivo. El ADNc resultante se puede diluir y se puede utilizar para la reacción de PCR. La PCR puede realizarse según la recomendación del fabricante (Applied Biosystems). Brevemente, el ADNc se puede combinar con el ensayo TaqMan específico para el miARN objetivo y la reacción de PCR se puede realizar utilizando ABI7300.
La hibridación de ácidos nucleicos se puede realizar utilizando un microarreglo/biochip o hibridación in situ. Se prefiere la hibridación in situ para el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN, o un bajo número de moléculas de ARN, miARNs. El microarreglo/biochip, sin embargo, permite el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN y un gran número de moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Se prefiere más que (i) la hibridación de ácidos nucleicos se realice utilizando un microarreglo/biochip o perlas, o utilizando hibridación in situ, y/o (ii) la amplificación de ácidos nucleicos se realiza mediante PCR en tiempo real.
Se prefiere que la técnica adecuada en el paso (ii) se seleccione del grupo que consiste en hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos, extensión de polimerasa, secuenciación y espectroscopia de masas, o cualquier combinación de los mismos. Se prefiere más que (i) la hibridación de ácidos nucleicos se realice utilizando un microarreglo/biochip, perlas o hibridación in situ, y/o (ii) la amplificación de ácidos nucleicos se realiza mediante PCR en tiempo real.
En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto, en el que la muestra de sangre total es (tomada, obtenida, aislada) de un individuo,
(ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada,
(iii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iv) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
La determinación en el paso (ii) puede llevarse a cabo por cualquier medio conveniente para determinar el nivel de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, particularmente el nivel de expresión de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Por ejemplo, pueden utilizarse métodos de detección cualitativos, semicuantitativos y/o cuantitativos. Una variedad de técnicas son bien conocidas por el experto en la materia.
Se prefiere que el nivel de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, particularmente el nivel de expresión de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, se determine mediante hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos, extensión de polimerasa, secuenciación, espectroscopia de masas o cualquier combinación de los mismos.
La amplificación de ácidos nucleicos se puede realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR). Se prefiere la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN, o un bajo número de moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Es particularmente adecuado para detectar moléculas de ARN de baja abundancia, por ejemplo, miARNs. Sin embargo, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR) permite el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN, y un elevado número de moléculas de ARN, miARNs.
Hay disponible una variedad de kits y protocolos para determinar el nivel de expresión de los miARNs mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Rt qPCR). Por ejemplo, la transcripción reversa de miARN se puede realizar utilizando el Kit de Transcripción Reversa TaqMan MicroRNA (Applied Biosystems) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, el miARN se puede combinar con dNTPs, la transcriptasa reversa MultiScribe y el cebador específico para el miARN objetivo. El ADNc resultante se puede diluir y se puede utilizar para la reacción de PCR. La PCR puede realizarse según recomendación del fabricante (Applied Biosystems). Brevemente, el ADNc se puede combinar con el ensayo TaqMan específico para el miARN objetivo y la reacción de PCR se puede realizar utilizando ABI7300.
La hibridación de ácidos nucleicos se puede realizar utilizando un microarreglo/biochip o hibridación in situ. Se prefiere la hibridación in situ para el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN, o un bajo número de moléculas de ARN, miARNs. El microarreglo/biochip, sin embargo, permite el análisis de una sola molécula de ARN, por ejemplo, un miARN y un gran número de moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs. Se prefiere más que (i) la hibridación de ácidos nucleicos se realice utilizando un microarreglo/biochip o perlas, o utilizando hibridación in situ, y/o (ii) la amplificación de ácidos nucleicos se realiza mediante PCR en tiempo real.
Se prefiere que la técnica adecuada en el paso (ii) se seleccione del grupo que consiste en hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos, extensión de polimerasa, secuenciación y espectroscopia de masas, o cualquier combinación de los mismos. Se prefiere más que (i) la hibridación de ácidos nucleicos se realice utilizando un microarreglo/biochip, perlas o hibridación in situ, y/o (ii) la amplificación de ácidos nucleicos se realiza mediante PCR en tiempo real.
Dicho tercer aspecto puede alternativamente formularse de la siguiente manera: Un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la muestra de sangre total es (tomada, obtenida, aislada) de un individuo,
(ii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iii) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
El nivel de referencia puede ser cualquier nivel que permita determinar si un individuo padece o no la enfermedad. Preferiblemente, uno o más niveles de referencia se determinan al medir una o más muestras de sangre total de referencia, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o 500 muestra(s) de sangre total de referencia, de uno o más sujetos sanos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o 500 sujetos sanos,
uno o más sujetos que padecen una enfermedad, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o 500 sujetos que padecen una enfermedad, y/o
uno o más sujetos que padecen otra enfermedad, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o 500 sujeto(s) que sufre(n) de otra enfermedad. En particular, uno o más niveles de referencia se determinan midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de
uno o más sujetos con cáncer de pulmón, preferiblemente sujetos con cáncer de pulmón sometidos a terapia contra el cáncer de pulmón, más preferiblemente sujetos con cáncer de pulmón sometidos a terapia paliativa o adyuvante contra el cáncer de pulmón, y/o
uno o más sujetos sanos, preferentemente sujetos que no estén sujetos a terapia de cáncer de pulmón, más preferentemente sujetos que no se someten a terapia paliativa o adyuvante de cáncer de pulmón. Es factible tomar una muestra de sangre total de referencia por sujeto para el análisis. Si se requieren muestras de sangre total de referencia adicionales, se puede (re)analizar al mismo sujeto.
Dicho nivel de referencia puede ser un nivel de referencia promedio. Puede determinarse midiendo los niveles de referencia y calculando el valor "promedio" (por ejemplo, valor medio, mediano o modal) de los mismos. Se prefiere que el nivel de referencia sea de un sujeto del mismo sexo (por ejemplo, mujer u hombre) y/o de una edad/etapa de vida similar (por ejemplo, adultos o ancianos) que el paciente que se someterá a la prueba o al diagnóstico.
La enfermedad puede ser cualquier enfermedad, por ejemplo, cáncer de pulmón. La otra enfermedad puede ser cualquier otra enfermedad además del cáncer de pulmón.
En una realización, el método para diagnosticar una enfermedad en un individuo comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la muestra de sangre total es (tomada, obtenida, aislada) de un individuo,
(ii) comparar dicho nivel con un nivel de referencia que se determina midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de uno o más sujetos sanos, y
(iii) diagnosticar si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
Preferiblemente, la enfermedad es cáncer de pulmón.
En otra realización, el método para diagnosticar una enfermedad en un individuo comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la muestra de sangre total es (tomada, obtenida, aislada) de un individuo,
(ii) comparar dicho nivel con un nivel de referencia que se determina midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de uno o más sujetos que padecen la enfermedad, y
(iii) diagnosticar si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
Preferiblemente, la enfermedad es cáncer de pulmón.
En otra realización, el método para diagnosticar una enfermedad en un individuo comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de acuerdo con el segundo aspecto, en el que la muestra de sangre total es (tomada, obtenida, aislada) de un individuo,
(ii) comparar dicho nivel con un nivel de referencia que se determina midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de uno o más sujetos que padecen la enfermedad y con un nivel de referencia que se determina midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de uno o más sujetos que padezcan otra enfermedad, y
(iii) diagnosticar si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
Preferiblemente, la enfermedad es cáncer de pulmón y la otra enfermedad es cualquier otra enfermedad que no sea cáncer de pulmón. El método también puede permitir distinguir entre sí enfermedades tratadas de forma diferente. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad tratada con adyuvante, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado con adyuvante, y la otra enfermedad puede ser una enfermedad tratada paliativamente, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado de forma paliativa, o la enfermedad puede ser una enfermedad tratada de forma paliativa, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado paliativamente, y la otra enfermedad puede ser una enfermedad tratada con adyuvante, por ejemplo, cáncer de pulmón tratado con adyuvante.
En la presente se describe, pero no se abarca por la presente invención, el uso de un material polimérico hidrofílico para eliminar una fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre total. Preferiblemente,
la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud comprende una o más moléculas de ARN seleccionadas del grupo que consiste en ARN ribosomal 18S y ARN ribosomal 28S.
En un cuarto aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un material polimérico hidrofílico para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster. Preferiblemente, la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud comprende una o más moléculas de ARN seleccionadas del grupo que consiste en miARN, ARNt, ARNip, ARNpi y ARNpno.
En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico está comprendido en una sonda adsorbente (véase el primer aspecto de la presente invención).
Preferiblemente, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 4 g/cm3, por ejemplo, de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, g/cm3. Más preferentemente, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de entre 1 y 4 g/cm3, por ejemplo, de 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 g/cm3.
En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico es poroso.
En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico tiene un volumen de poro de entre 20 y 70%, preferiblemente de entre 30 y 50%, por ejemplo, de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ,64, 65, 66, 67, 68, 69, o el 70 % del volumen total del material.
En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico comprende poros que son ≤ 100 |jm, preferiblemente ≤ 50 jm , por ejemplo, ≤ 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jm , de diámetro o de mayor dimensión de la sección transversal. Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico comprende poros que son de entre 10 y 100 jm , incluso más preferiblemente entre 20 y 50 jm , por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jm , de diámetro o de dimensión transversal más grande.
Como se mencionó anteriormente, el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster. Preferiblemente,
(i) el polisacárido es celulosa,
(ii) la poliolefina se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, o
(iii) el poliéster se selecciona del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato.
Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico es algodón, celulosa o polietileno.
En una realización del cuarto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico es un material como se describe en WO 2013/067520 A1 o US 2013116597 A1. En particular, el material polimérico hidrofílico es parte de una sonda absorbente que está comprendida en un dispositivo de muestreo de fluidos biológicos como se describe en WO 2013/067520 A1 o US. 2013116597 A1. Al respecto, se refiere a la página 10, línea 28 a la página 34, línea 27, Figuras 2, 3 y 8, y reivindicaciones 1 a 19 de WO 2013/067520 A1 y a los párrafos [0068] a [0129], Figuras 2, 3 y 8, y reivindicaciones 1 a 19 de US 2013116597 A1.
Con respecto a otras realizaciones de la sonda absorbente y/o material polimérico hidrofílico, se hace referencia al primer aspecto de la presente invención.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un método de acuerdo con el segundo aspecto para diagnosticar o diagnosticar diferencialmente una enfermedad. La enfermedad puede ser cáncer de pulmón. En cuanto al diagnóstico o diagnóstico diferencial de una enfermedad, se hace referencia al tercer aspecto de la presente invención.
En un sexto aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un kit para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en donde dicho kit comprende
(i) una sonda absorbente que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un material polimérico hidrofílico, y
(ii) un fluido que comprende un agente caotrópico para reconstituir la sangre total absorbida en/hacia una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico,
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el kit comprende, además
(ii) medios para extraer sangre de un individuo,
(iii) un contenedor, y/o
(iv) un soporte de datos que comprende la información de que la sonda absorbente con la sangre total de la muestra de sangre total absorbida en/hacia ella es utilizable en los métodos del primer al tercer aspecto de la presente invención.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el kit comprende además medios para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud.
Los medios para extraer sangre de un individuo pueden seleccionarse del grupo que consiste en una jeringa (con una aguja), una aguja y una lanceta. La jeringa (con una aguja) puede utilizarse para extraer sangre de una vena en el brazo de una persona. La aguja o lanceta se puede utilizar para destruir la capa superior de la piel y extraer una gota de sangre (por ejemplo, mediante un pinchazo en el dedo) de un individuo. La sonda absorbente que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en un material polimérico hidrofílico, se pone luego en contacto (físico) con la muestra de sangre total, absorbiendo así la sangre total en/hacia el material polimérico hidrofílico. Posteriormente, la sonda absorbente se puede secar, por ejemplo, secar al aire. Esto se puede hacer a temperatura ambiente (20 °C) o a temperaturas elevadas (por ejemplo, 30 °C).
La sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico en/hacia el cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total puede enviarse luego a un laboratorio para análisis adicional.
Los medios para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud pueden comprender:
(i) polinucleótidos para detectar moléculas de ARN con > 200 nucleótidos de longitud y/o moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud, y/o
(ii) un biochip, un sistema RT-PCT, un sistema PCR, un citómetro de flujo o un sistema de secuenciación de siguiente generación.
Preferiblemente, las moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud son moléculas de miARN.
Dichos polinucleótidos pueden unirse a un biochip. Dichos polinucleótidos también se pueden utilizar como cebadores en un sistema RT-PCT, un sistema PCR o un sistema de secuenciación de siguiente generación.
El soporte de datos puede ser un soporte de datos no electrónico, por ejemplo, un soporte de datos gráficos como un folleto informativo (por ejemplo, que incluye detalles sobre cómo utilizar dicho kit según el primer al tercer aspecto de la presente invención), una hoja de información, un código de barras o un código de acceso, o un soporte de datos electrónico como un disquete, un disco compacto (CD), un disco versátil digital (DVD), un microchip u otro soporte de datos electrónico basado en semiconductores. El código de acceso puede permitir el acceso a una base de datos, por ejemplo, una base de datos de Internet, una base de datos centralizada o descentralizada. El código de acceso también puede permitir el acceso a un software de aplicación que hace que una computadora realice tareas para usuarios de computadoras o una aplicación móvil que es un software diseñado para ejecutarse en teléfonos inteligentes y otros dispositivos móviles.
Dicho soporte de datos puede comprender además uno o más niveles de referencia del nivel de las moléculas de ARN, por ejemplo, miARNs, determinado en el la presente. En caso de que el soporte de datos comprenda un código de acceso que permita el acceso a una base de datos, dichos uno o más niveles de referencia pueden depositarse en esta base de datos.
El kit puede comprender opcionalmente materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos tampones, reactivos y/o diluyentes que pueden ser útiles para tomar una muestra de sangre total.
El fluido que comprende un agente caotrópico puede ser un líquido o gas. Preferiblemente, el fluido que comprende un agente caotrópico es un líquido o gas que comprende un agente caotrópico. Más preferiblemente, el agente caotrópico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino. Aún más preferiblemente, el agente caotrópico es tiocianato de guanidinio.
El kit es útil para llevar a cabo los métodos del primer al tercer aspecto de la presente invención, es decir, para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, y para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total y (posteriormente) determinar el nivel de dichas moléculas de ARN.
Las fracciones de ARN mencionadas anteriormente comprenden una o más moléculas de ARN, por ejemplo, moléculas de miARN. La fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud comprende preferentemente una o más moléculas
de ARN seleccionadas del grupo que consiste en ARN ribosomal 18S y ARN ribosomal 28S y la fracción de ARN con
< 200 nucleótidos de longitud comprende preferentemente una o más moléculas de ARN seleccionadas del grupo compuesto por miARN, ARNt, ARNip, ARNpi y ARNpno.
Si el kit es para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total y (posteriormente) determinar el nivel de dichas moléculas de ARN, comprende además medios para determinar el nivel, particularmente el nivel de expresión, de las moléculas de ARN (por ejemplo, moléculas de miARN).
Preferiblemente, dichos medios comprenden uno o más polinucleótidos para determinar el nivel (de expresión) de una o más moléculas de ARN (por ejemplo, moléculas de miARN), y/o un microarreglo, un sistema RT-PCT, un sistema
PCR, un citómetro de flujo, un sistema multiplex basado en perlas o un sistema de secuenciación de próxima generación.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de
≤ 4 g/cm3, por ejemplo, de 0.5, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 g/cm3 Más preferentemente, el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de entre 1 a 4 g/cm3, por ejemplo, de 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 g/cm3.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico es poroso.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico tiene un volumen de poro de entre 20 y 70%, preferiblemente de entre 30 y 50%, por ejemplo, de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,
62, 63 ,64, 65, 66, 67, 68, 69, o el 70 % del volumen total del material.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, el material polimérico hidrofílico comprende poros que son ≤ 100 |jm, preferiblemente ≤ 50 jm , por ejemplo, ≤ 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
90, 95 o 100 jm , de diámetro o de la mayor dimensión de la sección transversal. Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico comprende poros que son de entre 10 a 100 jm , incluso más preferiblemente entre 20 y 50 jm , por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 jm , de diámetro o de la dimensión transversal más grande.
Como se mencionó anteriormente, el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster. Preferiblemente,
(i) el polisacárido es celulosa,
(ii) la poliolefina se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, o
(iii) el poliéster se selecciona del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato.
Más preferiblemente, el material polimérico hidrofílico es algodón, celulosa o polietileno.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, la sonda absorbente ha absorbido un volumen máximo predeterminado de sangre total de entre 1 y 50 jl, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 48, 49 o 50 jl.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención,
la sonda absorbente tiene una longitud de ≤ 10 mm, preferiblemente de ≤ 5 mm, por ejemplo, de ≤ 2, 2.5, 3, 3.5, 4,
4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mm y un área transversal de < 40 mm2, preferentemente de < 20 mm2, por ejemplo, de ≤ 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 3 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 mm2.
Tales tamaños se consideran adecuados cuando la muestra de sangre total es una gota de sangre, por ejemplo, de un pinchazo en el dedo.
En una realización alternativa del sexto aspecto de la presente invención, la sonda absorbente tiene un volumen de ≤
250 mm3, preferentemente de ≤ 200 mm3, por ejemplo, de ≤ 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9,
9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,
40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210,
220, 230, 240 o 250 mm3.
Dichos volúmenes se consideran adecuados cuando la muestra de sangre total es una gota de sangre, por ejemplo, de un pinchazo en el dedo.
Más preferentemente, la sonda absorbente tiene una longitud de entre 2 y 10 mm, preferentemente de entre 2 y 5 mm, por ejemplo de 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mm, y un área transversal de entre 5 y 40
mm2, preferentemente de entre 5 y 20 mm2, por ejemplo, de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ,29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 mm2.
En una realización alternativa del sexto aspecto de la presente invención, la sonda absorbente tiene un volumen de entre 1 mm3 hasta 250 mm3, preferentemente de entre 2.5 mm3 a 200mm3, por ejemplo, de 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ,41,42 , 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230, 240 o 250 mm3.
En una realización del sexto aspecto de la presente invención, la sonda absorbente está configurada para absorber un volumen máximo predeterminado de sangre total de entre 1 y 50 μl, preferiblemente entre 5 y 25 μl, e incluso más preferiblemente entre 10 y 20 μl, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 μl.
Con respecto a otras realizaciones de la sonda absorbente y/o material polimérico hidrofílico, se hace referencia al primer aspecto de la presente invención.
Descripción breve de las figuras
Las siguientes figuras son meramente ilustrativas de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención como se indica en las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera.
Figura 1: Se muestra la comparación de los resultados del Agilent Bioanalyzer Nano de ARN aislado de muestras de sangre total i) con la eliminación de la fracción de ARN con > 200 nt de longitud utilizando una sonda absorbente (Dispositivo de Micromuestreo Mitra, curva inferior) y ii) sin la eliminación de la fracción de ARN con >200 nt de longitud (sangre total recolectada en tubos de ARN en sangre PaxGene, curva superior) de un individuo humano. La curva superior muestra claramente que los picos principales de ARN (ARN ribosomal 18S, 28S) todavía están presentes, mientras que en la curva inferior dichos ARNs 18S y 28S y otras especies de ARN con> 200 nt de longitud se han eliminado de manera efectiva al absorber la muestra de sangre total a una sonda absorbente de material polimérico hidrofílico.
Figura 2: Se muestran los resultados de Agilent Bioanalyzer (kit Nano ARN) de ARN aislado de muestras de sangre total recolectadas de un individuo humano con eliminación de la fracción de ARN con > 200 nt de longitud utilizando una sonda absorbente de material polimérico hidrofílico (Dispositivo de Micromuestreo Mitra): las fracciones de ARN de >200 nt, incluidos, pero no limitados a, los picos de ARN ribosomal más destacados (fragmento 18S a -2000 nt y fragmento 28S a -4000 nt) se eliminan del ARN obtenido de una muestra de sangre total mediante uso de una sonda absorbente de material polimérico hidrofílico (Dispositivo de Micromuestreo Mitra).
Figura 3: Primer plano de fracción de ARN pequeño con <200 nt de longitud derivada de una muestra de sangre total de la cual se ha eliminado la fracción de ARN de >200 nt de longitud mediante el uso de una sonda absorbente polimérica hidrofílica. En la presente, dicha fracción de ARN pequeño comprende varias especies de ARN pequeño, como miARN (~ 15-35 nt), ARNt (-60-80 nt), ARNip (-20-25 nt), ARNpi (-26-31 nt) o ARNpno.
Figura 4: Imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) de sondas absorbentes poliméricas hidrofílicas: (A) celulosa hidrofílica que comprende material de sonda absorbente polimérica; como Tarjeta Clásica FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), Micro Tarjeta de Elución FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), HemaSpot HF (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA), HemaSpot SE (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA), TNF (Munktell, Barenstein, Alemania), TNF-Di (Munktell, Barenstein, Alemania); (B) material de sonda absorbente polimérica orgánica hidrofílica; como el dispositivo de micromuestreo Mitra.
Figura 5: Datos de expresión de miARN: se muestran los miARNs que se encontraron expresados (en una micromatriz de ADN de Agilent; para obtener detalles, véase el Ejemplo 8) en la fracción de ARN pequeño que se obtuvo después de eliminar la fracción de >200 nt de una muestra de sangre total que ha sido procesado mediante el uso de una sonda absorbente polimérica hidrofílica. En la presente, como ejemplos, sondas absorbentes poliméricas como el dispositivo de micromuestreo Mitra o una sonda absorbente que comprende celulosa hidrofílica (como Tarjeta Clásica FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), Micro Tarjeta de Elución FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), HemaSpot HF (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), HemaSpot SE (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), TNF (Munktell, Barenstein, Alemania), TNF-Di (Munktell, Barenstein, Alemania)) se utilizaron como dispositivo que comprende dicha sonda absorbente polimérica hidrofílica para eliminar la fracción de ARN >200 nt de la muestra de sangre total. Con: SEQ ID No = número de identificación de secuencia; miARN = identificador de microARN de acuerdo con miRBase; gTotalGenSeñal (A) = nivel de expresión relativo de los miARNs correspondientes detectados cuando se emplea un material absorbente que comprende celulosa hidrofílica para la eliminación de >200 nt de ARN; gTotalGenSeñal (B) = nivel de expresión relativo de los miARNs correspondientes detectados cuando se emplea un material absorbente polimérico hidrofílico (dispositivo de micromuestreo Mitra) para la eliminación de >200 nt de ARN.
Figura 6: Dispositivo de Micromuestreo Mitra: la sonda absorbente hidrofílica está comprendida en la punta superior de dicho dispositivo.
Figura 7: Se muestra la comparación de los resultados de Agilent Bioanalyzer Nano de ARN aislado de muestras de sangre total (i) con la eliminación de la fracción de ARN con > 200 nt de longitud utilizando una sonda absorbente (celulosa hidrofílica que comprende un dispositivo absorbente como la Tarjeta Clásica FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), Micro Tarjeta de Elución FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), HemaSpot HF (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), HemaSpot SE (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), TNF (Munktell, Barenstein, Alemania), TNF-Di (Munktell, Barenstein, Alemania)), curva inferior) y (ii) sin eliminación de la fracción de ARN con >200 nt de longitud (sangre total recolectada en tubos de ARN en sangre PaxGene, curva superior) de un individuo humano. La curva superior muestra claramente que los picos principales de ARN (ARN ribosomal 18S, 28S aún están presentes, mientras que en la curva inferior dichos ARN 18S y 28S y otras especies de ARN con una longitud de >200 nt se han eliminado de forma eficaz mediante la absorción de la muestra de sangre total hacia una sonda absorbente de material polimérico hidrofílico.
Figura 8: Estabilidad de miRNomas a partir de manchas de sangre seca. A. Diagramas de dispersión y correlaciones de diferentes condiciones para cada factor ambiental. B. Gráfica ACVP de factores ambientales influyentes.
Figura 9: Gráfico de dispersión de miARN desregulados con respecto a la comparación entre pacientes tratados con adyuvante y paliativos.
Figura 10: Variación biológica en función del tratamiento del cáncer de pulmón. Intensidades de expresión, cambio múltiple, valores p y el área bajo la curva de características del operador del receptor (valor ABC) de los miARNs desregulados.
Ejemplos
Los ejemplos dados a continuación tienen únicamente fines ilustrativos y no limitan la invención descrita anteriormente de ningún modo.
Parte 1:
Ejemplo 1: Recolección de muestras de sangre utilizando un dispositivo absorbente polimérico hidrofílico (Dispositivo de Micromuestreo Mitra)
Se recolectó sangre de diferentes individuos (n=3) mediante punción en el dedo medio de la mano izquierda utilizando lancetas de seguridad estériles (Safety-Lancet Extra 18G, Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) y cuatro dispositivos de micromuestreo Mitra (neoteryx, Torrance, CA, USA, número de pedido 10005) por individuo. La sangre en el dispositivo de micromuestreo Mitra (Figura 6) se secó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se extrajeron cuatro Puntas de Muestra llenas de sangre por individuo del Cuerpo de Muestra del dispositivo de micromuestreo Mitra y se transfirieron a un tubo de 2 ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania)
Ejemplo 2: Extracción de ARN pequeño del dispositivo de Micromuestreo Mitra
La extracción de ARN pequeño con una longitud <200 nt (incluida la fracción de microARN) se llevó a cabo utilizando la técnica de extracción con fenol-cloroformo. La purificación del ARN pequeño se realizó mediante el uso del kit de plasma de suero miRNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). En la presente, se pipeteó 1 ml de reactivo Qiazol (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania, que comprende tiocianato de guanidinio como reactivo caotrópico y fenol) al tubo de 2 ml que contenía cuatro Puntas de Muestra Mitra (véase el ejemplo 1, recolección de muestras de sangre). A continuación, el tubo se incubó a 4 °C en un agitador a 1,000 rpm durante 16 horas. Posteriormente, el sobrenadante completo se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo de 2 mL. Después de agregar 200 μl de Cloroformo, la mezcla se agitó en vórtice minuciosamente durante 15 segundos y se incubó durante 2 min a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 12,000 x g durante 15 min a 4 °C. Posteriormente, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo nuevo de 1 mL sin tocar las otras dos fases. Se añadieron 1.5 volúmenes de etanol al 100 % a la fase acuosa, se mezcló minuciosamente mediante pipeteo y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, se transfirieron 700 μl de la muestra a una columna MinElute de Qiagen y se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 segundos a TA, descartando el flujo de paso. Los dos últimos pasos se repitieron hasta que se aplicó el volumen completo de la muestra a la columna. Posteriormente, se añadieron a cada columna 700 μl de tampón RWT, se centrifugó nuevamente a 13,000 rpm durante 15 seg a TA, descartando el flujo de paso. A continuación, se añadieron 500 μl de tampón RPE a la columna y se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 segundos a TA, descartando el flujo de paso. Posteriormente se añadió a la columna 500 μl de etanol al 80% y se centrifugó a 13,000 rpm durante 2 min a TA, descartando el flujo de paso. Luego, la columna se colocó en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y se centrifugó con la tapa abierta a 13,000 rpm durante 5 min a TA para secarla. La columna se transfirió a un nuevo tubo de recolección de 1.5 ml. Para la elución del ARN total incl. microARN, se pipetearon 14 μl de agua libre de ARNasas en la columna, se incubó durante 1 min y se centrifugó a 13,000 rpm a temperatura ambiente durante 1 min. Se pipetearon otros 14 μl de agua libre de ARNasas a la columna, se incubó durante 1 min a TA y se centrifugó a 13.000 rpm a TA durante 1 min. La fracción eluída de ARN pequeño con una longitud <200 nt (incluida la fracción de microARN) se almacenó en hielo hasta el control de calidad y la cuantificación.
Ejemplo 3: Recolección de muestras de sangre utilizando un dispositivo absorbente que comprende celulosa hidrofílica
Se recolectó sangre de diferentes individuos (n=3) mediante punción en el dedo anular de la mano izquierda utilizando lancetas de seguridad estériles (Safety-Lancet Extra 18G, Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Se agregaron dos gotas de sangre por individuo al dispositivo absorbente que comprende celulosa hidrofílica (celulosa que comprende papel filtro de varios fabricantes, incluyendo Tarjeta Clásica FTA No-Indicadora (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), Micro Tarjeta de Elución FTA No-Indicadora ( GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Gran Bretaña), HemaSpot HF (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), HemaSpot SE (Spot On Sciences, Austin, TX, EUA.), TNF (Munktell, Barenstein, Alemania), TNF-Di (Munktell, Barenstein, Alemania)) cubriendo un área de aproximadamente 0.5-4.0 cm cuadrados. Las diversas sondas absorbentes que comprenden celulosa hidrofílica se secaron durante 2 horas y luego se almacenaron durante 1 semana a temperatura ambiente. El área de sangre absorbida de la celulosa hidrofílica que comprende las sondas absorbentes se cortó y se transfirió a un tubo de 2 ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania).
Ejemplo 4: Extracción de ARN pequeño de un dispositivo absorbente que comprende celulosa hidrofílica
La extracción de ARN pequeño con una longitud < 200 nt (incluida la fracción de microARN) se llevó a cabo utilizando la técnica de extracción con fenol-cloroformo. La purificación del ARN pequeño se realizó mediante el uso del kit de plasma de suero miRNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se pipeteó 1 ml de reactivo Qiazol (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) en el tubo de 2 ml que contenía la celulosa hidrofílica que comprende el dispositivo absorbente en el que se absorbió la muestra de sangre total mediante secado (véase recolección de muestra de sangre, ejemplo 3). A continuación, el tubo se incubó a 4 °C en un agitador a 1,000 rpm durante 16 horas. Posteriormente, el sobrenadante completo se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo de 2 mL. Después de agregar 200 μl de cloroformo, la mezcla se agitó en vórtice minuciosamente durante 15 segundos y se incubó durante 2 min a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 12,000 x g durante 15 min a 4 °C. Posteriormente, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo nuevo de 2 mL sin tocar las otras dos fases. Se añadieron 1.5 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa, se mezcló completamente mediante pipeteo y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, se transfirieron 700 μl de la muestra a una columna MinElute de Qiagen y se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 segundos a TA, descartando el flujo de paso. Los dos últimos pasos se repitieron hasta que se aplicó el volumen completo de la muestra a la columna. Posteriormente, se añadió a cada columna 700 μl de tampón RWT, se centrifugó nuevamente a 13,000 rpm durante 15 seg a TA, descartando el flujo de paso. A continuación, se añadieron 500 μl de tampón RPE a la columna y se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 segundos a TA, descartando el flujo de paso. Posteriormente se añadió a la columna 500 μl de etanol al 80% y se centrifugó a 13,000 rpm durante 2 min a TA, descartando el flujo de paso. Luego, la columna se colocó en un tubo nuevo de recolección de 2 ml y se centrifugó con la tapa abierta a 13,000 rpm durante 5 min a TA para secarla. La columna se transfirió a un tubo nuevo de recolección de 1.5 ml. Para la elución del ARN pequeño incl. MicroARN, se pipetearon 14 μl de agua libre de ARNasas en la columna, se incubó durante 1 min y se centrifugó a 13.000 rpm a TA durante 1 min. Se pipetearon otros 14 μl de agua libre de ARNasas a la columna, se incubó durante 1 min a Ta y se centrifugó a 13.000 rpm a TA durante 1 min. El ARN pequeño eluido con <200 nt de longitud (incl. el microARN) se almacenó en hielo hasta el control de calidad y la cuantificación.
Ejemplo 5: Recolección de muestras de sangre utilizando tubos de ARN en sangre PaxGene
Se recolectó sangre de diferentes individuos (n=3). En la presente, para cada donante de sangre, se recolectaron 2.5 ml de sangre total mediante punción venosa en un tubo de ARN en sangre PAXgene (PreAnalytix, Hombrechticon, Suiza). Las células sanguíneas se derivaron/obtuvieron del procesamiento de las muestras de sangre total por centrifugación. En la presente, las células sanguíneas de la sangre total recolectada en dichos tubos de recolección de sangre se centrifugaron durante 10 min, 5000xg. El sedimento de células sanguíneas (la fracción de sangre celular que comprende glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) se cosechó para su posterior procesamiento, mientras que el sobrenadante (incluida la fracción de sangre extracelular) se descartó. El aRn total, incluido el ARN pequeño (<200 nt, incluida la fracción de miARN), pero también la fracción de ARN > 200 nt, se extrajo de las células sanguíneas cosechadas utilizando el Mini Kit miRNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania); para más detalles véase el Ejemplo 6.
Ejemplo 6: Extracción de ARN total (incluida la fracción de ARN con >200 nt) tubos de ARN en sangre PaxGene
El aislamiento del ARN total, incluido el ARN pequeño (<200 nt, incluida la fracción de miARN) y la fracción de ARN de >200 nt, se realizó mediante el uso del Mini Kit miRNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). En la presente, el sedimento de células sanguíneas (obtenido como se describe en el Ejemplo 5) se resuspendió completamente en 700 μl de reactivo de lisis QIAzol pipeteando hacia arriba y hacia abajo e inmediatamente la suspensión se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf de 1.5 ml. Luego se añadieron 140 μl de cloroformo, se agitó en vórtice minuciosamente y se incubó durante 2-3 min a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 12,000 g durante 15 min a 4°C. Posteriormente, la fase acuosa superior se transfirió a un tubo nuevo de 2 ml con mucho cuidado, sin tocar las otras dos fases. Luego se añadieron 1.5 volúmenes de etanol al 100 % a la fase acuosa transferida y se mezcló minuciosamente mediante pipeteo. A continuación, se transfirieron 700 μl de muestra a una columna y se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 segundos a TA, descartando el flujo de paso. Posteriormente se agregaron 700 μl de Buffer RWT a cada columna y se centrifugaron nuevamente a 13,000 rpm durante 15 seg a TA, descartando el flujo de paso. A continuación, se añadieron 500 μl de tampón RPE a la columna y se centrifugaron a 13,000 rpm durante 15 segundos
a TA, descartando el flujo de paso. Posteriormente se añadieron a la columna otros 500 |jl de Buffer RPE y se centrifugó a 13,000 rpm durante 2 min a TA, descartando el flujo de paso. Luego, la columna se colocó en un nuevo tubo de recolección de 2 ml y se centrifugó a 13,000 rpm durante 1 min a TA para secarla. La columna se transfirió a un nuevo tubo de recolección de 1.5 ml. Para la elución del ARN total incl. microARN Se pipetearon 40 j l de agua libre de ARNasas en la columna, se incubó durante 1 min y se centrifugó a 13.000 rpm a TA durante 1 min. Luego, el eluato se volvió a colocar en la misma columna, se incubó durante 1 min a TA y se centrifugó nuevamente durante 1 min. El ARN total eluido, incluido el ARN pequeño (<200 nt, incluida la fracción de miARN) y la fracción de ARN >200 nt, se cuantificó utilizando el NanoDrop 1000 y se almacenó a -20 °C antes de su uso en experimentos de perfiles de expresión.
Ejemplo 7: Control de calidad de la fracción de ARN pequeño
El control de calidad y la cuantificación del ARN extraído se realizó utilizando el Bioanalyzer de Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y el Bioanalyzer para ensayos pequeños y nano. El ARN se desnaturalizó durante 2 minutos a 70 °C, luego se aplicó 1 j l al chip Bioanalyzer para ensayos pequeños y nanométricos. Los chips se agitaron en vórtice a 2,400 rpm y se corrieron en el instrumento Bioanalyzer dentro de los 5 min siguientes.
Ejemplo 8: Determinación basada en microarreglos de perfiles de expresión de microARN
La muestra de ARN total, incluida la fracción de microARN, se analizó en un microarreglo de miARN humano 8x60k Agilent (versión v21) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del marcaje enzimático con Cy3 del microARN y 20 horas de hibridación de arreglos a 55 °C en un horno de hibridación giratorio, el portaobjetos del microarreglo se lavó dos veces (no riguroso y riguroso) y luego se escaneó con el escáner de microarreglos SureScan de Agilent. Los datos de imagen resultantes se evaluaron con el software Agilent Feature Extraction (v11). Los archivos de datos brutos (GeneView) generados por el software Feature Extraction se importaron en Excel para el análisis de las presentes.
Parte II:
Además, se ha explorado sistemáticamente si las gotas de sangre seca (GSS) facilitan las mediciones estables de miARN y se ha comparado la estabilidad técnica con la variabilidad biológica. Primero, se probó la estabilidad de las muestras de GSS mediante la generación de perfiles de miARN de todo el genoma de muestras de los mismos individuos expuestos a diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, temperatura y humedad). Segundo, se investigó la reproducibilidad técnica mediante la realización de siete réplicas de muestras tomadas del mismo individuo. Tercero, se investigaron muestras de 53 pacientes con cáncer de pulmón sometidos a diferentes tratamientos. A través de las tres etapas, se generaron y evaluaron por medios bioestadísticos 108 perfiles de miARN de todo el genoma.
Materiales y Métodos
Recolección de muestra: Para el estudio, se recolectaron un total de 78 muestras en gotas de sangre seca. Se utilizó papel TNF de (Munktell, Barenstein, Alemania) (Ahlstrom). Después de la llegada, las gotas de sangre seca se almacenaron a -80 grados Celsius hasta la extracción del ARN. Para el análisis de estabilidad se incluyó un individuo y se expuso a diferentes condiciones ambientales. La temperatura varió entre 26 y 35 grados Celsius, la humedad entre 38.5 y 60%. Para capturar la reproducibilidad en todo el flujo de trabajo, es decir, entre diferentes extracciones y también en diferentes microarreglos, realizamos 7 réplicas técnicas de otro individuo. La muestra respectiva se ha medido como control de proceso junto con el estudio de cáncer de pulmón. El mismo individuo también ha sido investigado utilizando Tubos de Sangre (TS) PAXGene para comparar el repertorio de miARN en gotas de sangre seca y utilizando los tubos de sangre. Como caso clínico, se investigaron 53 muestras de cáncer de pulmón expuestas a diferentes regímenes de terapia. En detalle, 17 muestras pertenecían a pacientes con terapia curativa (adyuvante) y 36 muestras a pacientes con cuidados paliativos. La terapia adyuvante se aplicó adicionalmente a la terapia quirúrgica primaria para mejorar las posibilidades de curación, mientras que los cuidados paliativos se utilizaron para mejorar la calidad de vida en caso de cáncer avanzado. El estudio ha sido aprobado por el comité de ética local y los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. Se han recolectado muestras de sangre en gotas de sangre seca. Todas las muestras se midieron en microarreglos miRBase V21 (Agilent). También se midió un subconjunto de 26 muestras en microarreglos miRBase V19 (Agilent) para comparar los diferentes microarreglos. En total, se perfilaron 30 miRNomas completos en V19 y 78 miRNomas completos en microareglos V21.
Extracción de miARN: Antes de la extracción de ARN, las muestras de GSS se descongelaron a TA durante una hora. Se cortó la gota de sangre total y se transfirió a un tubo Eppendorf de 2 mL. Los papeles GSS se incubaron durante 16 horas en 1 ml de reactivo de lisis Qiazol (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) en un agitador a 1.000 rpm y 4 grados Celsius. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo de 2 ml para su posterior procesamiento. La extracción y purificación del ARN se realizó con el kit de Suero/Plasma miRNeasy de Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se verificó el contenido de ARN y la calidad de miARN (se realizó control de calidad y cuantificación de eluatos de ARN) con Agilent 2100 Bioanalyzer utilizando el kit de ARN pequeño de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA.).
Medición de miARN: Para el perfilamiento de expresión de microARN, las muestras se analizaron en portaobjetos de microarreglos de miARN humano Agilent Sureprint G3 (8x60k) con el contenido más reciente de miRBase v21. Cada arreglo se dirige 2,549 microARNs con 20 repeticiones por sonda. Además, una parte de las muestras se midió en la versión v19 anterior de los portaobjetos de miARN Sureprint de Agilent para la evaluación técnica. El microARN extraído se marcó e hibridó utilizando el kit completo de etiquetado e hibridación de miARN de Agilent de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de rotar la hibridación durante 20 horas a 55 grados Celsius, los portaobjetos se lavaron dos veces y se escanearon en el escáner de microarreglos SureScan de Agilent. Los archivos de imagen del escáner se transformaron en datos de texto bruto utilizando el software Feature Extraction (Agilent Technologies).
Preprocesamiento de datos: Para el preprocesamiento de las muestras perfiladas, se aplicó la biblioteca de bioconductores AgiMicroRna, que está diseñada para preprocesar y analizar datos de microarreglos de microARN de Agilent. Los valores de expresión procesados se generaron en los siguientes tres pasos mediante el algoritmo promedio robusto de multiarreglo (PRM). La señal medida de una sonda (una de las 20 réplicas de la sonda para un miARN) primero se corrigió en segundo plano, luego los microarreglos se normalizaron por cuantil y, por último, se estimó la señal final de un miARN resumiendo las señales de sonda correspondientes. Al aplicar un filtrado adicional, las funciones de control y los miARNs que no se detectan en ningún grupo experimental se eliminan del conjunto de datos para obtener solamente las funciones expresadas para los análisis bioinformáticos.
Análisis bioinformáticos: Para evaluar reproducibilidad técnica, se calculó la correlación de Pearson para los controles del proceso. De este modo, se realizó una comparación entre chips pertenecientes a una versión de miRBase y una comparación entre chips pertenecientes a diferentes versiones de miRBase (v19 y v21). Al mismo tiempo, se estimó el coeficiente de variación (CV) para los valores relativos de expresión de miARN de las réplicas técnicas. Estos miARNs también se analizaron en cuanto a su contenido de GC y su primera introducción a miRBase.
Además, se aplicó un enfoque de agrupamiento jerárquico para la evaluación de los grupos y categorías experimentales en términos de diferentes condiciones ambientales como humedad y temperatura. La medida de la distancia entre pares de observaciones se basó en la distancia Euclidiana.
Para la evaluación bioestadística para encontrar candidatos que distingan entre los tres grupos (adyuvantes, paliativos y controles del proceso), se han realizado comparaciones por pares utilizando la prueba de t. Para controlar la tasa de descubrimiento falso, todos los valores de p se ajustaron mediante el ajuste de Benjamin-Hochberg. Además de los valores significativos, se calculó el valor del área bajo la curva (ABC) de características operativas del receptor.
Resultados
El objetivo del estudio era comprender si los perfiles de miARN de todo el genoma de las gotas de sangre seca se pueden medir de forma confiable, facilitando la aplicación en el diagnóstico de enfermedades. Se llevó a cabo una aproximación en tres etapas. Primero, se perfilaron las réplicas bajo diferentes condiciones ambientales. Segundo, se establecieron y midieron réplicas técnicas como control del proceso en una serie de microarreglos.
En tercer lugar, se probó la viabilidad clínica utilizando muestras de pacientes con cáncer de pulmón. Una descripción general del número de miRNomas medidos en las tres etapas se presenta en tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Número de miRNomas completos medidos en cada etapa
Estabilidad de miRNomas de manchas de sangre seca
Los miARN se extrajeron de una serie de muestras de gotas de sangre seca expuestas a diferentes condiciones ambientales. Se exploraron combinaciones de tres temperaturas y tres niveles de humedad, mientras que cada combinación se midió por triplicado. Así, al tener seis combinaciones en forma de triplicados, se ha perfilado un total de 18 miRNomas en microarreglos. Se estableció un mapa de calor de agrupamiento (datos no mostrados). Las diferentes condiciones se compararon entre sí. Los resultados se muestran en la Figura 8A. La correlación más baja de 0.997 se calculó para la temperatura. La correlación más alta, correspondiente a la influencia más baja, se calculó para la humedad (correlación de 0.999). Estos resultados también han sido confirmados por un análisis de componentes de variante principal (véase Figura 8B). Estos resultados muestran que los miARN medidos a partir de gotas de sangre seca tienen una estabilidad inherente y son técnicamente adecuados como portadores de información de diagnóstico, incluso si están expuestos a condiciones variables, por ejemplo, inducidas por el envío de muestras a un laboratorio central.
Reproducibilidad de miARNs a lo largo del tiempo
A continuación, se exploró cómo se pueden perfilar miRNomas reproducibles de manchas de sangre seca en microarreglos. De un individuo, se realizaron siete réplicas técnicas en siete portaobjetos diferentes de Agilent (la técnica de Agilent permite el procesamiento paralelo de 8 muestras en 8 arreglos separados físicamente en un portaobjetos). En este sentido, la muestra a procesar también se puede considerar como un control de proceso (= control saludable). La correlación media de estos controles de proceso fue tan alta como 0.993. Se han repetido las mismas medidas con la versión anterior de los microarreglos de Agilent de miRBAse versión 19 en lugar de 21. Aquí, se incluyeron cuatro controles del proceso, lo que llevó a una correlación comparable (datos no mostrados). Como los resultados en los análisis anteriores, los controles del proceso replicados de un individuo subrayan que los miARNs de las gotas de sangre seca son, desde una perspectiva técnica, adecuados como herramientas de diagnóstico.
Variación biológica dependiente del tratamiento del cáncer de pulmón
Por último, se investigó la variación biológica entre las muestras de pacientes con cáncer de pulmón y los controles del proceso. Esto se realizó en dos pasos. En primer lugar, se perfilaron 30 muestras (26 de cáncer de pulmón y cuatro controles del proceso) en microarreglos de Agilent de ambas versiones, V19 y V2. 1. Al aplicar el agrupamiento jerárquico, para cada versión se obtuvieron dos agrupamientos con una distribución muestral similar (datos no mostrados). No solamente las muestras con la misma forma de terapia tenían una tendencia a agruparse juntas, sino que también los controles de proceso cayeron en un solo grupo. En el segundo paso, se perfilaron 60 muestras (53 de cáncer de pulmón y los 7 controles del proceso mencionados anteriormente) en microarreglos Agilent de miRBase V21. La correlación promedio de este paso de análisis fue de 0.974. Mientras que la correlación promedio para los controles del proceso (0.993) y las muestras de cáncer de pulmón (0.976) superó este valor, la correlación promedio más baja (0.967) se calculó entre los controles de proceso y las muestras de cáncer de pulmón.
Más interesantes fueron las diferencias entre dos cohortes diferentes de tratamiento de cáncer de pulmón. Por lo tanto, las comparaciones estadísticas por pares entre los grupos de pacientes tratados con "adyuvante" y "paliativo" se realizaron a continuación utilizando la prueba t de dos colas. Debido a la naturaleza exploratoria del estudio, los miARNs con valores p brutos < 0.05 se consideraron significativamente desregulados. Para la comparación mencionada anteriormente (adyuvante contra paliativo), se encontraron 51 miARNs desregulados significativamente (8.6 % de los 591 miARNs expresados) según las pruebas t de dos colas y el nivel alfa seleccionado de 0.05. De estos 51 miARNs, 11 tuvieron mayor expresión en el grupo adyuvante (20%). El miARN más regulado al alza con un valor de p de 0.019 fue hsa-miR-150-5p, el marcador más regulado a la baja con un valor de p de 0.014 fue hsa-miR-642a-3p. Todos los miARN se muestran en el gráfico de dispersión en la Figura 9, donde los miARN regulados a la laza y a la baja se resaltan en gris oscuro (esquina superior derecha) y gris claro (esquina superior izquierda), respectivamente. Información detallada sobre intensidades de expresión, cambio múltiple, valores p y el área bajo la curva (valor ABC) de características del operador del receptor se proporcionan en la Figura 10.
Discusión
Un número creciente de estudios se ocupó de los miARN como biomarcadores no invasivos para diversas enfermedades humanas. En muchos casos, estos miARN se derivaron de suero, plasma o sangre total. Si bien los tubos de preservación como PAXgene y EDTA se utilizan comúnmente, la investigación de miARNs de GSS aún es un territorio nuevo.
En el presente estudio, la confiabilidad de las mediciones de miARN de GSS se analizó siguiendo los siguientes tres aspectos: (1) estabilidad de la muestra bajo diferentes condiciones ambientales, (2) estabilidad técnica y reproducibilidad entre versiones de chip y (3) comparación de muestras clínicas utilizando el ejemplo de pacientes con cáncer de pulmón.
Con respecto al primer aspecto, se ha demostrado que los miARNs medidos de GSS tenían una alta estabilidad al considerar las comparaciones de las diferentes condiciones ambientales (humedad y temperatura) dentro de una categoría.
En la segunda parte del estudio, se ha demostrado con los controles del proceso por un lado que las correlaciones iguales y altas brindan evidencia de estabilidad técnica a través de las diferentes versiones de chip V19 y V21. Por otro lado, el patrón de agrupamiento de las muestras clínicas y los controles del proceso de V21 también podría recuperarse con una estructura similar de v19. Estos resultados similares indican la alta reproducibilidad de los miARNs medidos en GSS a pesar de las diferentes versiones de miRBase en los chips.
La tercera parte del estudio fue sobre la comparación clínica entre los tres grupos diferentes: controles del proceso, pacientes que recibieron adyuvante y pacientes que recibieron terapia paliativa. En el caso de la significancia estadística de los miARNs desregulados, hubo un número muy elevado de miARNs significativos (valor de p ajustado < 0.05) entre los pacientes con cáncer de pulmón y los controles del proceso. Este alto número podría ser causado por la propia enfermedad de cáncer de pulmón y la aplicación de las terapias.
Claims (13)
1. Un método para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud de una muestra de sangre total que comprende los pasos de:
(i) proporcionar una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico en/hacia el cual se ha absorbido sangre total de la muestra de sangre total,
(ii) poner en contacto la sonda absorbente con un fluido que comprende un agente caotrópico, y
(iii) recuperar el fluido que comprende un agente caotrópico del paso (ii), eliminando así la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud, y
(iv) purificar la fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud del fluido recuperado mediante una o más técnicas de separación seleccionadas del grupo que consiste en centrifugación, evaporación/reconstitución, concentración, precipitación, extracción líquido/líquido y extracción en fase sólida,
en el que la fracción de ARN con > 200 nucleótidos de longitud no entra al fluido y permanece absorbida en el material polimérico hidrofílico
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y
en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
(i) el polisacárido es celulosa,
(ii) la poliolefina se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, o
(iii) el poliéster se selecciona del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el agente caotrópico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino.
4. Un método para determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y
(ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada.
5. Un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra de sangre total es de un individuo,
(ii) determinar el nivel de moléculas de ARN con < 200 nucleótidos de longitud mediante una técnica adecuada, (iii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iv) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
6. Un método para diagnosticar una enfermedad en un individuo que comprende los pasos de:
(i) llevar a cabo el método de la reivindicación 4, en el que la muestra de sangre total es de un individuo,
(ii) comparar dicho nivel con uno o más niveles de referencia, y
(iii) diagnosticar o diagnosticar diferencialmente si el individuo padece la enfermedad basándose en la comparación.
7. El método de las reivindicaciones 5 o 6, en el que uno o más niveles de referencia se determinan midiendo una o más muestras de sangre total de referencia de
uno o más sujetos sanos,
uno o más sujetos que padecen una enfermedad, y/o
uno o más sujetos que padecen otra enfermedad.
8. Uso de un material polimérico hidrofílico para purificar una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que
(i) el polisacárido es celulosa,
(ii) la poliolefina se selecciona del grupo que consiste en polietileno, polipropileno, polibutileno, poliisobutileno y polimetilpenteno, o
(iii) el poliéster se selecciona del grupo que consiste en policarbonato y polietilentereftalato.
10. Uso de un método según la reivindicación 4 para diagnosticar o diagnosticar diferencialmente una enfermedad.
11. Uso de un kit para la purificación de una fracción de ARN con < 200 nucleótidos de longitud a partir de una muestra de sangre total, en el que dicho kit comprende:
(i) una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico, y
(ii) un fluido que comprende un agente caotrópico para reconstituir la sangre total absorbida en/hacia una sonda absorbente que comprende un material polimérico hidrofílico,
en el que el material polimérico hidrofílico tiene una densidad de ≤ 6 g/cm3, y en el que el material polimérico hidrofílico se selecciona del grupo que consiste en algodón, un polisacárido, una poliolefina y un poliéster.
12. El uso de la reivindicación 11, en el que el kit se utiliza para llevar a cabo los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. El uso de las reivindicaciones 11 o 12, en el que el agente caotrópico se selecciona del grupo que consiste en tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidinio, cloruro de guanidinio, tiocianato alcalino, isotiocianato alcalino, yoduro alcalino y perclorato alcalino.
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