WO2016144125A2 - 용규 추출물의 신규 용도 - Google Patents

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WO2016144125A2
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류효정
강희철
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Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Kyung Hee University
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Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Kyung Hee University
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    • A61P15/02—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for disorders of the vagina
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Definitions

  • the present invention relates to a yonggyu extract, and more particularly to a novel use of the yonggyu extract.
  • Endometriosis is a very common gynecological disorder that occurs in 3-10% of women of childbearing age and 25-35% of infertile women, and the endometrial tissue abnormally proliferates in places other than the uterus (ovary, abdominal cavity, intestine, bladder). Disease.
  • Endometriosis is a symptom of dysmenorrhoea, dyspareunia, and various pains (eg, lung involvement: pneumothorax, hemothorax / ureteral involvement: ureter obstruction, hematuria), 30-50% of patients. Has been identified as the cause of infertility.
  • Endometriosis is not fatal, but it is a disease that causes discomfort in daily life due to extreme pain and even infertility in severe cases, and is a disease that must be seriously recognized and must be overcome in women's quality of life and pregnancy problems. So far, there is no prevention and treatment.
  • Yonggyu extract is known to have an AIDS therapeutic effect (Korean Patent Publication No. 1020060034178).
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 1020060034178, April 21, 2006, Summary
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel use of the extract.
  • Yonggyu extract has an effect on the treatment, improvement and / or prevention of endometriosis or its complications and completed the present invention.
  • the present invention provides a medicament and / or food use for treating, ameliorating and / or preventing endometriosis or complications thereof.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing endometriosis or its complications, comprising the extract of Yonggyu as an active ingredient.
  • the yonggyu (Solani Nigri Herba) is listed in the Korean Pharmacopoeia (Herbal Medicine) standard collection, may be the ground portion of the solarum nigrum (Solanum nigrum Linne (branch family Solanaceae)).
  • the ground portion includes stems and leaves, and may include flowers.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable additive, and may be composed of the yonggyu extract and the additive.
  • the endometriosis or complications thereof may be due to one or more overexpression selected from MMP-2, MMP-9, COX-2, TNF-alpha ( ⁇ ), or MCP-1.
  • the complication may be one or more selected from the group consisting of pelvic inflammatory disease, pelvic adhesion, ovarian cyst, uterine myoma, ectopic pregnancy and infertility.
  • the yonggyu extract is a solvent extract extracted from the yonggyu as a solvent, the solvent may be at least one selected from water, alcohol, or a mixture thereof.
  • the alcohol may be a lower alcohol having 1 to 5 carbon atoms.
  • the solvent may be 70% by volume ethanol.
  • the Yonggyu extract may be a butanol fraction extract obtained by fractionating 70% by volume of ethanol extract with 70% by volume of ethanol, butanol.
  • the butanol fraction extract (A) preparing a 70 volume% ethanol extract extracted with 70 volume% ethanol; (B) adding water to the 70% by volume ethanol extract of step (A); (C) fractionating 70 vol% ethanol extract added with water of step (B) with n-hexane; (D) removing the n-hexane fraction of step (C) and fraction-extracting the remaining aqueous layer with dichloromethane; (E) removing the dichloromethane fraction of step (D) and fractionating the remaining aqueous layer with ethyl acetate; And (F) may be a fraction extract obtained by removing the ethyl acetate fraction of step (E) and fraction extraction of the remaining aqueous layer with butanol.
  • the treatment or prevention may be by inhibiting adhesion or migration of endometriosis cells.
  • the attachment or migration inhibition may be by inhibition of expression of one or more selected from MMP-2 or MMP-9.
  • the treatment or prevention may be due to one or more selected from inhibition of inflammation and pain related enzyme expression or inhibition of inflammatory cytokine expression.
  • the present invention also provides a food composition for improving or preventing endometriosis or its complications, comprising the extract of Yonggyu as an active ingredient.
  • the food composition is equally applicable unless the contradictions mentioned in the pharmaceutical composition of the present invention are contradictory.
  • the term 'improvement' is included in the 'treatment' and means that the condition or symptom is improved.
  • the food composition may be included in a variety of foods, including beverages, may be in the form of beverages, gum, tea, health functional foods, etc.
  • the health functional foods may be formulated in the form of tablets, capsules and the like.
  • the health functional food refers to a food manufactured using a raw material or ingredient having functional functionality useful for the human body according to Korean Health Functional Food Act No. 12669 (including processing. The following is referred to). By means of nutrient control or physiological effects on the structure and function of the human body to obtain useful effects for health purposes.
  • the food composition may include a conventional food additive, the food additive is a natural chemical such as ketones, glycine, sodium citrate, nicotinic acid, cinnamon acid, navy, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, guar gum And mixed preparations such as additives, sodium L-glutamate preparations, noodle addition alkalis, preservatives, and tar dyes.
  • the food additive is a natural chemical such as ketones, glycine, sodium citrate, nicotinic acid, cinnamon acid, navy, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, guar gum
  • mixed preparations such as additives, sodium L-glutamate preparations, noodle addition alkalis, preservatives, and tar dyes.
  • the present invention also provides a treatment, or prophylaxis, of endometriosis or a complication thereof, comprising administering the yonggyu extract to a mammal, including a human being in need thereof, and the treatment of endometriosis or a complication thereof. Or for the preparation of prophylactic formulations.
  • the administered yonggyu extract may be an effective amount of yonggyu extract.
  • the present invention also provides a extract of yonggyu for use in the treatment, improvement or prevention of endometriosis or complications thereof.
  • the Yonggyu extract or composition can be administered orally or parenterally to mammals, including humans, and can be administered by formulating an active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable additive.
  • additives commonly used may be carriers, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, diluents, excipients and the like other than the active ingredient.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid form preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and And / or by adding gelatin or the like.
  • Lubricants such as magnesium and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and / or preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. May be included.
  • Formulations for parenteral administration include injectable solutions, suspensions, emulsions, lyophilizers, nasal washes and suppositories. Injectable solutions, suspensions and emulsions can be prepared by mixing water, non-aqueous solvents or suspending solvents with the active ingredient.
  • non-aqueous solvents and suspending solvents vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, and ethyl oleate Injectable esters such as and the like.
  • a suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and / or gelatin may be used.
  • Parenteral administration may be by subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection.
  • Yonggyu extract contained in the composition of the present invention or used in the use and method is a dose of 0.0001 to 1000 mg / kg, preferably 0.0001 to 100 mg / kg, more preferably 0.001 to 10 mg / kg per day, based on an adult woman Can be used as Administration can be administered once a day or in divided doses.
  • the scope of the present invention is not limited by the dose and frequency of administration.
  • composition of the present invention may contain 0.1 to 99.9% by weight of the active ingredient relative to the total weight of the composition.
  • the Yonggyu extract can be formulated by adding a pharmaceutically or food-acceptable carrier, excipient or diluent, etc.
  • a pharmaceutically or food-acceptable carrier for formulation, see Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA, etc. Reference may be made.
  • the present invention can effectively treat, ameliorate and / or prevent endometriosis or complications thereof.
  • Figure 1 is a view showing the results of the MMP-2 expression inhibitory effect confirmation experiment of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 2 is a view showing the results of confirming the inhibitory effect of MMP-9 expression of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of confirming the inhibitory effect of COX-2 expression of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 4 is a view showing the results of experiments confirming the inhibitory effect of TNF alpha expression of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 5 is a view showing the results of the MCP-1 expression inhibitory effect confirmation experiment of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 6 is a view showing the results of experiments confirming the effect of endometriosis cell adhesion and implantation inhibition of the alcoholic alcohol extract.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of experiments confirming the inhibitory effect of endometriosis cell migration of the alcoholic extract of Yonggyu.
  • FIG. 8 is a view showing the results of the effect confirmation experiment in the intraperitoneal administration model of Yonggyu alcohol extract.
  • Figure 9 is a diagram showing the results of effect verification experiments in the surgical induction model of Yonggyu alcohol extract.
  • FIG. 10 is a view showing the results of the MMP-2 expression inhibitory effect confirmation experiment of Yonggyu butanol fraction extract.
  • Figure 11 is a view showing the results of the MMP-9 expression inhibitory effect confirmed by the extract of Yonggyu butanol fraction.
  • Figure 12 is a view showing the results of the COX-2 expression inhibitory effect confirmed by the extract of Yonggyu butanol fraction.
  • Figure 13 is a view showing the results of the test TNF alpha expression inhibition effect of Yonggyu butanol fraction extract.
  • 15 is a diagram showing the results of experiments confirming the effect of endometriosis cell adhesion and implantation inhibition of the extract of Yonggyu butanol fraction.
  • Figure 16 is a diagram showing the results of confirming the inhibitory effect of MMP-2 expression of Yonggyu water extract.
  • Figure 17 is a diagram showing the results of confirming the inhibitory effect of COX-2 expression of Yonggyu water extract.
  • 19 is a view showing the results of confirming the inhibitory effect of MCP-1 expression of Yonggyu water extract.
  • the endometriosis model cells described in the following examples were prepared with a 12Z cell line, human immortalized endometriotic epithelial cells, developed using active endometriosis tissue of an endometriosis woman (Johann-Wolfgang-Goethe-). Dr. Universitaet (Germany) Offered by Starzinski-Powitz ⁇ . These cells have been shown to be similar to the molecular biology of known active endometotric tissues (Banu et al., 2008), and have been used as a new in vitro model for the molecular biology of endometriosis.
  • Cells were 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide-95 in RPMI 1640 and DMEM / F12 medium (10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin G, 100 g / ml streptomycin added; Life Technology, Grand Island, New York) % was maintained in air conditions.
  • Dried yonggyu (Solanum nigrum, production area: Yeongcheon, Gyeongsangbuk-do) was purchased at Gyeongdong market, South Korea, and yonggyu outpost was pulverized to 400um particle size.
  • 100 liters of a 70% (v / v) ethanol aqueous solution was added to 10 kg of the prepared solu- tion, and the filtrate was immersed at room temperature for 24 hours, and the extract was repeated once in the same manner.
  • the extracted filtrate was concentrated under reduced pressure at 60 degrees Celsius, and the concentrated solution was lyophilized to obtain 1.5 kg of powdered 70% ethanol extract.
  • RNA was extracted from RNA, followed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • the yonggyu extract untreated group as a control (control; CON), except that the treatment was the same as the yonggyu extract treated group.
  • 70% ethanol extract inhibited the mRNA expression of endogenous MMP-2 and MMP-9 which is a representative protein expressed in endometriosis and plays an important role in cell migration and infiltration. It confirmed (refer FIG. 1, FIG. 2).
  • Figure 1 is a view showing the results of the MMP-2 expression inhibitory effect confirmed experiment of Yonggyu alcohol extract
  • Figure 2 is a road showing the results of MMP-9 expression inhibitory effect confirmed by the alcoholic extract
  • 25 represents a 70 ⁇ g% ethanol extract 25ug / mL administration group
  • the y-axis of Figure 1 shows the relative MMP2 mRNA expression (Relative MMP2 mRNA expression)
  • the y-axis of Figure 2 relative MMP9 mRNA expression Relative MMP9 mRNA expression.
  • 70% by volume ethanol extract can be seen that effectively inhibits the expression of MMP-2 and MMP-9, even at a concentration of 25ug / mL.
  • Real-time PCR was performed to determine the effect of 70% by volume ethanol extract on the mRNA expression of COX-2, which is known to be associated with endometriosis pain. Specifically, erythrocytes were treated with 25% ug / mL, 50 ug / mL, or 100 ug / mL, respectively, for 24 hours in 12% (epithelial endometriotic cells) of endometriosis cells, followed by TRIzol (Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada) was used to extract the total RNA, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed.
  • TRIzol Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada
  • Figure 3 is a road showing the results of the COX-2 expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu alcohol extract, con on the x-axis of Figure 3 is a control, 25 is a 70wt% ethanol extract 25ug / mL administration group, y of Figure 3 The axis shows the relative COX2 mRNA expression. As shown in the figure, it can be seen that the 70% by volume ethanol extract effectively inhibits COX-2 expression even at a concentration of 25ug / mL.
  • Real-time PCR was performed to determine whether 70% by volume ethanol extract affects inflammatory cytokine mRNA expression, which is known to be overexpressed in endometriosis cells.
  • erythrocytes were treated with 25% ug / mL, 50 ug / mL, or 100 ug / mL, respectively, for 24 hours in 12% (epithelial endometriotic cells) of endometriosis cells, followed by TRIzol (Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada) was used to extract the total RNA, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed.
  • TRIzol Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada
  • a Thermal Cycler Dice Real Time PCR System (Takara, Japan) denaturation for 5 seconds at 95 degrees Celsius, annealing for 10 seconds at 57 degrees Celsius, 72 degrees Celsius SYBR Green real-time PCR was performed by repeating 45 times under the condition of performing extension for 20 seconds in the figure.
  • the TNF-a primer, MCP-1 primer, and calibration GAPDH primers used in the SYBR Green real-time PCR are shown in Table 3 below, and the average of Ct values of TNF-a and MCP-1 is tripletlicate ( triplicate) and corrected by the Ct value of GAPDH.
  • the yonggyu extract untreated group as a control (control; CON), except that the treatment was the same as the yonggyu extract treated group.
  • Figure 4 is a view showing the results of the test TNF-alpha expression inhibitory effect of Yonggyu alcohol extract
  • Figure 5 is a road showing the results of MCP-1 expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu alcohol extract
  • 25 denotes the administration volume of the 70% by volume ethanol extract 25ug / mL
  • the y-axis of Figure 4 shows the relative TNF-alpha mRNA expression
  • the y-axis of Figure 5 is the relative MCP-1 mRNA Expression (Relative MCP-1 mRNA expression).
  • the 70% by volume ethanol extract effectively inhibits TNF-alpha and MCP-1 expression even at a concentration of 25ug / mL.
  • Met-5A a human peritoneal methothelial cells
  • Met-5A a human peritoneal methothelial cells
  • yonggyu 70% ethanol extract inhibited endometriosis cells which are characteristic of endometriosis, from attaching and implanting to organs peritoneal peritoneal cavity.
  • Cells (American Type Culture Collection (ATCC)) were treated with 10% FBS, 100 U / ml penicillin G and 100 g / ml streptomycin (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), and 400 nM hydrocortisone (Sigma Chemical). Co, St. Louis, Mo., USA) was incubated in a 5% CO 2 incubator in 199 medium.
  • the Met-5A cells were dispensed into 96-well plates.
  • Cell tracker green DMEM / F12 containing 50 ug / mL, 100 ug / mL, or 200 ug / mL of 70% ethanol extract of 12Z cells (2 X 10 3 / well), an endometriosis cell line labeled with CMFDA. After mixing with the medium, it was added to previously dispensed Met-5A cells. The mixed cells were incubated in a 5% CO 2 -incubator at 37 degrees Celsius for one hour, then the plates were inverted and washed with a phosphate-buffered solution containing calcium and magnesium. Attached cells were analyzed at a wavelength of 490 nm, with the calibration control set at 100% and the percentage of attached cells calculated. In addition, the yonggyu extract untreated group was treated as a control (control; CON), the same as the yonggyu extract treated group except for the extract treatment.
  • control control
  • CON the same as the yonggyu extract treated group except for the extract treatment.
  • Figure 6 is a road showing the results of endometriosis cell adhesion and anti-implantation inhibitory effect of Yonggyu alcohol extract
  • the x-axis of Figure 6 is the control group
  • 50ug / ml is 70ug% ethanol extract 50ug / mL administration group
  • the y-axis of FIG. 6 shows the ratio of attachment cells (Optical Density (OD) ratio,% ⁇ ).
  • OD Optical Density
  • Transwell-migration assay was repeated three times to confirm the effect of Yonggyu 70% ethanol extract on the migration of endometriosis cells. Specifically, after dispensing 12Z cells, which are endometriosis cells, into an upper part of a transwell plate in a 24-well-transwell plate (8 um pore size), respectively, 25 ug / mL, 50 ug / mL, and 100 ug / mL of 70% ethanol extract was treated. After treatment with 70% ethanol extract, cells transferred to the membrane on the outer side of the transwell were fixed with methanol and stained with 0.5% crystal violet for 10 minutes.
  • FIG. 7 is a road showing the results of experiments to confirm the effect of inhibiting endometriosis cell migration of the alcoholic alcohol extract, on the x-axis of Figure 7 con is a control, 25ug / ml is a 70ug% ethanol extract 25ug / mL administration group, Figure 7 The y-axis represents the percentage of migration. As shown in the figure, it can be seen that the 70% by volume ethanol extract effectively inhibits cell adhesion even at a concentration of 25ug / mL.
  • Induction of endometriosis was induced by extracting the uterus to be implanted in a donor mouse and then sculpted into the abdominal cavity of the recipient mouse, drug administration is shown in [Table 4] below, 70% ethanol extract 125 mg / kg, 250 mg / kg and 500 mg / kg were orally administered for 5 weeks, respectively.
  • the abdominal cavity was opened at the expense of endometriosis-induced animal models to determine the number of implantations in the peritoneum and intraperitoneal (small intestine, large intestine, stomach, liver, bladder, ovary, etc.).
  • the vehicle (Vehicle) administration group was treated in the same manner as the Yonggyu extract administration group except that 200ul of 10% Tween 80 instead of the extract.
  • the positive control was treated in the same manner as the Yonggyu extract administration group, except that 0.3mg / kg dienogest instead of Yonggyu extract.
  • FIG. 8 is a road showing the results of experiments confirmed the effect of the ingestion model of the alcoholic extract of Yonggyu, vehicle on the x-axis of Figure 8 vehicle administration, dienogest dienogest administration group, Yonggyu 125 is 70% by volume ethanol extract 125mg / kg The administration group is shown, and the y-axis of FIG. 8 represents the number of implants. As shown in the figure, it can be seen that 70% by volume of ethanol extract, even at 125 mg / kg, effectively exhibited an endometriosis tissue formation inhibitory effect.
  • Induction of endometriosis was induced by implanting endometrial cells by cutting the left uterus of SD rat (female) to 7 mm length and suturing both ends with silkam so that the endometrial part was in contact with the peritoneum. 5], and 100 mg / kg, 300 mg / kg, and 500 mg / kg of 70% ethanol extract were orally administered for 4 weeks.
  • the implant size (inflammation site size) in the peritoneum where the endometriosis cells were transplanted by abdominal ablation was sacrificed at the expense of an endometriosis induced animal model.
  • vehicle (Vehicle) administration group was treated in the same manner as Yonggyu extract administration group, except that the solvent for dissolving the extract instead of the extract in proportion to the body weight.
  • the extract was dissolved in 10% Tween 80.
  • a positive control (Positive control) was treated in the same manner as the Yonggyu extract administration group, except that 0.3mg / kg dienogest instead of Yonggyu extract.
  • Figure 9 is a road showing the results of experiments confirming the effect of the surgical extract of Yonggyu alcohol extract, vehicle on the x-axis of Figure 9 vehicle administration vehicle, positive control group dienogest administration group, Yonggyu 100mg / kg Yonggyu extract 100mg / kg administration group
  • the y-axis represents the implant size. As shown in the figure, 70% by volume of ethanol extract, even 100mg / kg, it can be seen that effectively shows the effect of inhibiting endometriosis tissue formation.
  • Yonggyu butanol fraction extract was prepared by dividing into normal hexane fraction, dichloromethane fraction, ethyl acetate fraction, butanol fraction, and water layer through a systematic fraction of 1 kg of 70% ethanol extract prepared in the same manner as in 1-1. . Specifically, 4 L of water was added to 1 kg of the powdered extract, and the alcohol extract to which water was added was fractionated with 20 L of n-hexane, the n-hexane fraction was taken separately, and the remaining aqueous layer was fractionated with 20 L of dichloromethane to dichloromethane fraction.
  • the remaining aqueous layer was fractionated with 40 liters of ethyl acetate, the ethyl acetate fraction was separated separately, and the remaining aqueous layer was fractionated with 40 liters of butanol to obtain a butanol fraction, and the butanol fraction obtained by this procedure was concentrated under reduced pressure, The concentrated solution was lyophilized to obtain 141 g of butanol fraction extract in powdered 70% ethanol extract. In addition, the water layer remaining after the butanol fraction extraction was obtained separately.
  • the endometriosis cell is a representative protein expressed in endometriosis and the butanol fraction extract of 70% ethanol extract inhibits the mRNA expression of endogenous MMP-2 and MMP-9 which plays an important role in cell migration and infiltration. It was confirmed in the phosphorus 12Z cells (see Fig. 10, 11).
  • Figure 10 is a view showing the results of the MMP-2 expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu butanol fraction extract
  • Figure 11 is a road showing the results of the MMP-9 expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu butanol fraction extract
  • Figures 10 and 11 x In the axis, con denotes the control group, 0.5 denotes the 0.5ug / mL administration group of the silica gel butanol fraction extract, and the y-axis of FIG. 10 represents the relative levels of MMP-2 mRNA, and the y-axis of FIG. Relative levels of MMP-9 mRNA are shown. As shown in the figure, it can be seen that the extract of butyol butanol extract effectively inhibits MMP-2 and MMP-9 expression even at a concentration of 0.5 ug / mL.
  • Figure 12 is a road showing the results of the COX-2 expression inhibitory effect of the extract of the yonggyu butanol fraction extract, in the x-axis of Figure 12 con represents the control group, 0.5 represents the yonggyu butanol fraction extract 0.5ug / mL administration group, y-axis is COX- Relative levels of 2 mRNA (Relative levels of COX-2 mRNA) are shown. As shown in the figure, it can be seen that the extract of butyol butanol extract effectively inhibits COX-2 expression even at a concentration of 0.5 ug / mL.
  • Figure 13 is a view showing the results of the test TNF-alpha expression inhibitory effect of Yonggyu butanol fraction extract
  • Figure 14 is a road showing the results of MCP-1 expression inhibition test of Yonggyu butanol fraction extract
  • Figure 13 and 14 x In the axis, con represents the control group, 0.5 represents the 0.5ug / mL administration group of Yonggyu butanol fraction extract, the y axis of FIG. 13 represents the relative levels of TNF-a mRNA, and the y axis of FIG. Relative levels of MCP-1 mRNA are shown. As shown in the figure, it can be seen that the extract of Yonggyu butanol fraction effectively inhibits TNF-alpha and MCP-1 expression even at a concentration of 0.5 ug / mL.
  • Figure 15 is a road showing the results of confirming the effect of endometriosis cell adhesion and implantation inhibitory effect of the extract of Yonggyu butanol fraction
  • the x-axis of Figure 15 is the control group
  • 1 represents the 1ug / mL administration group of the extract of Yonggyu butanol fraction
  • y-axis The ratio of Attachment cells (Optical Density (OD) ratio,%) is shown.
  • OD Optical Density
  • Example 2-2 In the same manner as in Example 2-2, except that the fraction extract described in Table 6 or Table 7 was used instead of the extract of Butyol fraction.
  • Table 6 is the results for MMP-2
  • Table 7 shows the results for MMP-9.
  • each fraction extract inhibits MMP-2 and / or MMP-9 expression.
  • Table 9 is the results for TNF-alpha, the results for MCP-1 in Table 10.
  • Table 9 is the results for TNF-alpha, the results for MCP-1 in Table 10.
  • Yonggyu fraction extract is effective in the treatment, improvement or prevention of endometriosis and complications.
  • Dried Yonggyu (Solanum nigrum, production area: Yeongcheon, Gyeongsangbuk-do) was purchased at Gyeongdong Market (South Korea) and pulverized. 1 liter of distilled water was added to 500 g of the prepared silicon broth and extracted using a water bath for 3 hours. The extract was filtered using filter paper and lyophilized for 48 hours to obtain a powdered red water extract.
  • Example 1-2 In the same manner as in Example 1-2, except that 100 ug / mL of the water extract of 4-1. Was used instead of 25 ug / mL, 50 ug / mL, or 100 ug / mL of the 70% by volume ethanol extract. Was carried out.
  • Figure 16 is a road showing the results of the MMP-2 expression inhibitory effect of Yonggyuk water extract, in the x-axis of Figure 16 is the control group, 100ug / ml is 100ug / mL administration group of the water-based water extract, y-axis is MMP-2 Relative levels of MMP-2 mRNA are shown. As shown in the figure, it can be seen that yonggyu water extract effectively inhibits MMP-2 expression.
  • Example 1-3 In the same manner as in Example 1-3, except that 100 ug / mL of the water extract of 4-1. Was used instead of 25 ug / mL, 50 ug / mL, or 100 ug / mL of the 70% ethanol extract. It was.
  • Figure 17 is a road showing the results of the inhibitory effect of COX-2 expression of Yonggyu water extract, on the x-axis of Figure 17 con represents a control, 100ug / ml represents a 100ug / mL administration group, y-axis is COX-2 Relative levels of COX-2 mRNA are shown. As shown in the figure, it can be seen that the yonggyu water extract effectively inhibits COX-2 expression.
  • Example 1-4 In the same manner as in Example 1-4, except that 100 ug / mL of the water extract of 4-1. Was used instead of 25 ug / mL, 50 ug / mL, or 100 ug / mL of the 70% ethanol extract. It was.
  • FIG. 18 is a view showing the results of the TNF-alpha expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu water extract
  • Figure 19 is a road showing the results of MCP-1 expression inhibitory effect confirmed by Yonggyu water extract
  • 100ug / ml represents a 100ug / mL administration group yonggyu water extract
  • y-axis in Figure 18 represents the relative levels of TNF-alpha mRNA
  • y-axis in Figure 19 is MCP- Relative levels of 1 MCP-1 mRNA.
  • the water extract effectively inhibits TNF-alpha and MCP-1 expression.
  • the yonggyu water extract is effective in the treatment, improvement or prevention of endometriosis and complications.
  • Yonggyu extract is endometriosis or its complications by inhibiting cell migration and adhesion related enzyme expression, inhibiting inflammation and pain related enzyme expression, inhibiting inflammatory cytokine expression, endometriosis cell migration, endometriosis cell adhesion and / or implantation inhibition, etc. It can be seen that there is a treatment, improvement and / or prophylactic effect of.
  • a capsule was prepared by filling a gelatin capsule with 300 mg of yonggyu extract, corn starch 100 mg, lactose 100 mg, and magnesium stearate 2 mg prepared in the same manner as in any of the methods described in Examples 1-1 to 4-1.
  • Yonggyu extract (4% by weight), liquid fructose (0.5% by weight), oligosaccharide (2% by weight), sugar (2% by weight) prepared in the same manner as in any of the methods described in Examples 1-1 to 4-1. ), And salt (0.5% by weight) was added water to adjust the balance, and then homogeneously blended to instant sterilization to prepare a healthy beverage.
  • the present invention can effectively treat, ameliorate and / or prevent endometriosis or complications thereof, there is industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 용규 추출물의 신규 용도를 제공한다. 본 발명에 의해 자궁내막증 또는 이의 합병증을 효과적으로 치료, 개선 및/또는 예방할 수 있다는 장점이 있다.

Description

용규 추출물의 신규 용도
본 발명은 용규 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 용규 추출물의 신규 용도에 관한 것이다.
자궁내막증(endometriosis)은 가임기 여성의 3~10%, 불임 여성의 25~35% 정도에서 나타나는 매우 흔한 부인과 질환으로 자궁내막조직이 자궁 이외에 장소(난소, 복강, 장관, 방광)에서 비정상적으로 증식하는 질환이다.
자궁내막증은 월경통(dysmenorrhoea), 성교통(dyspareunia) 및 침범부위에 따른 다양한 통증 (ex. 폐침범시: 기흉, 혈흉/ 요관침범시: 요관폐쇄, 혈뇨)을 증상으로 하며, 30-50%의 환자에서 불임의 원인으로 확인되고 있다.
현재까지 수술을 통한 자궁내막 제거수술 외에 자궁내막증에 대한 근본적인 치료법이 없으며, 이러한 수술요법은 차후 임신에 제약을 줄 수 있으며 재발율 또한 높은 편이다.
현재 내과적 치료로는 통증완화를 위해 진통제, 소염제를 사용하는 보존적 요법과 다나졸, 프로게스테론, GnRH를 사용하여 생리주기를 제어하는 호르몬치료가 사용되고 있으나 이들은 근본적 치료법이 아닌 증상의 개선일 뿐이다.
또한 이들 호르몬의 장기적 사용은 여러 가지 부작용 (체중의 증가, 수분 축적, 피로, 여드름, 지성 피부, 조모증, 위축성 질염, 안면 홍조, 근육 경련, 불안정한 감정 상태, 간세포 독성)을 야기하며, 게다가 이러한 치료에 대한 재발률도 매우 높은 것으로 알려져 있다.
이처럼 자궁내막증은 치명적이지는 않지만 극심한 통증으로 인해 일상생활에 불편함이 있고 심한 경우 불임에까지 이르는 질환으로, 여성의 삶의 질과 임신의 문제에서 심각하게 인식되어야 하고 반드시 극복해야 할 질병임에도 불구하고 아직까지 이렇다 할 예방 및 치료방법이 존재하지 않고 있다.
따라서 여성, 특히 가임기 여성들에게 침습적인(invasive) 수술요법이나 단순한 진통요법, 인위적인 생리주기제어법 등이 아닌 자연적이면서도 부작용이 낮은 새로운 개념의 자궁내막증 예방, 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
한편, 용규 추출물은 AIDS 치료 효과를 가짐이 알려져 있다(대한민국 공개특허 제1020060034178호).
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제1020060034178호, 2006.4.21, 요약
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 용규 추출물의 신규 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제는 상기에 언급된 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 용규 추출물이 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료, 개선 및/또는 예방에 효과를 나타냄을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 용규 추출물의 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 의약 및/또는 식품 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 용규 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 용규(Solani Nigri Herba)는 대한민국약전외한약(생약)규격집에 수재된 것으로, 솔라눔니그럼{Solanum nigrum Linne(가지과 Solanaceae)}의 지상부일 수 있다. 지상부는 줄기와 잎을 포함하는 의미로, 꽃도 포함될 수 있다.
상기 약학조성물은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 상기 용규 추출물 및 상기 첨가제로 이루어질 수 있다.
상기 자궁내막증 또는 이의 합병증은 MMP-2, MMP-9, COX-2, TNF-알파(α), 또는 MCP-1 중에서 선택된 하나 이상의 과발현에서 기인하는 것일 수 있다.
상기 합병증은 골반염, 골반유착, 난소낭종, 자궁근종, 자궁외임신 및 불임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 용규 추출물은 상기 용규를 용매로 추출한 용매추출물로, 상기 용매는 물, 알코올, 또는 그 혼합물 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 알코올은 탄소수 1~5의 저급알코올일 수 있다.
상기 용매는 70부피% 에탄올일 수 있다.
상기 용규 추출물은 상기 용규를 70부피%에탄올로 추출한 70부피%에탄올추출물을 부탄올로 분획추출한 부탄올분획추출물일 수 있다.
상기 부탄올분획추출물은 (A) 용규를 70부피%에탄올로 추출한 70부피%에탄올추출물을 준비하는 단계; (B) 상기 (A)단계의 70부피%에탄올추출물에 물을 가하는 단계; (C) 상기 (B)단계의 물이 가해진 70부피%에탄올추출물을 n-헥산으로 분획추출하는 단계; (D) 상기 (C)단계의 n-헥산 분획을 제거하고 남은 수층을 디클로로메탄으로 분획추출하는 단계; (E) 상기 (D)단계의 디클로로메탄 분획을 제거하고 남은 수층을 에틸아세테이트로 분획추출하는 단계; 및 (F) 상기 (E)단계의 에틸아세테이트 분획을 제거하고 남은 수층을 부탄올로 분획추출하는 단계에 의해 수득한 분획추출물일 수 있다.
상기 치료 또는 예방은 자궁내막증 세포의 부착 또는 이동 억제에 의한 것일 수 있다.
상기 부착 또는 이동 억제는 MMP-2 또는 MMP-9 중에서 선택된 하나 이상의 발현 억제에 의한 것일 수 있다.
상기 치료 또는 예방은 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 또는 염증성 싸이토카인 발현 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 용규 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 또는 이의 합병증 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.
별도의 언급이 없는 한 상기 식품 조성물은 본 발명의 약학조성물에서 언급된 사항이 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다. 상기 '개선'은 '치료'에 포함되며, 상태 또는 증세가 호전되는 것을 의미한다.
상기 식품조성물은 음료를 포함하는 식품에 다양하게 포함될 수 있고, 음료, 껌, 차, 건강기능식품 등의 형태일 수 있으며, 상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 상기 건강기능식품이라 함은 대한민국 건강기능식품에 관한 법률 제12669호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다. 이하 같다)한 식품을 말하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 상기 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 케톤류, 글리신, 구연산나트륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명은 또한 용규 추출물을 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 용규 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 자궁내막증 또는 이의 합병증의 치료, 또는 예방법을 제공하며, 용규 추출물의 자궁내막증 또는 이의 합병증의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도를 제공한다. 상기 투여되는 용규 추출물은 유효량의 용규 추출물일 수 있다. 또한, 본 발명은 자궁내막증 또는 이의 합병증의 치료, 개선 또는 예방에 사용하기 위한 용규 추출물을 제공한다.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 약학 조성물에서 언급된 사항은 모순되지 않는 한 본 발명의 방법, 추출물 및 용도에도 동일하게 적용된다.
상기 용규 추출물 또는 조성물은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 첨가제와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 첨가제는 유효성분 이외의 물질로 담체, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제, 부형제 등일 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및/또는 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제 및 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등일 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및/또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여가능하다.
본 발명의 조성물에 포함되거나, 용도 및 방법 중 사용되는 용규 추출물은 성인 여성 기준으로 1일 0.0001 ~ 1000mg/kg, 바람직하게는 0.0001 ~ 100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001~10mg/kg의 용량으로 사용가능하다. 투여는 하루에 한번 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 범주는 상기 투여량 및 투여횟수에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분을 조성물 총 중량에 대하여 0.1~99.9중량% 함유할 수 있다.
상기 용규 추출물은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명에 의해 자궁내막증 또는 이의 합병증을 효과적으로 치료, 개선 및/또는 예방할 수 있다.
도 1은 용규 알콜 추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 용규 알콜 추출물의 MMP-9 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 용규 알콜 추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 용규 알콜 추출물의 TNF알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 용규 알콜 추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 용규 알콜 추출물의 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 용규 알콜 추출물의 자궁내막증 세포 이동 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 용규 알콜 추출물의 복강내투여모델에서 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 용규 알콜 추출물의 수술유도모델에서 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 용규 부탄올분획 추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 용규 부탄올분획 추출물의 MMP-9 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 용규 부탄올분획 추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 용규 부탄올분획 추출물의 TNF알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 용규 부탄올분획 추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 용규 부탄올분획 추출물의 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 용규 물 추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 용규 물 추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 용규 물 추출물의 TNF알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 용규 물 추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예, 제조예 및 도면을 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로 본 발명의 내용이 하기 실시예, 제조예 및 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.
자궁내막증의 특징인 세포이동 및 부착 관련 효소{MMP-2(matrix metallopeptidase-2) 및/또는 MMP-9(matrix metallopeptidase-9)}의 발현 변화, 염증 및 통증 관련 효소{COX-2(cyclooxygenase-2)}의 발현 변화, 염증성 싸이토카인{TNF-알파(tumor necrosis factor alpha) 및/또는 MCP-1(Monocyte chemotactic protein-1)}의 발현 변화, 자궁내막증세포 부착 및 착상 변화, 자궁내막증세포 이동 변화 등에 용규 추출물이 미치는 영향을 확인함으로써, 용규 추출물이 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료, 개선 또는 예방 효과를 가짐을 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
하기 실시예 중 기재된 자궁내막증 모델 세포는 자궁내막증 여성의 활성 자궁내막증 조직을 이용하여 개발된, 인간 불멸화 자궁내막증 상피세포(human immortalized endometriotic epithelial cells)인 12Z 세포주를 준비하였다{Johann-Wolfgang-Goethe-Universitaet(Germany)의 Dr. Starzinski-Powitz 제공}. 이 세포는 기존에 알려진 활성 자궁내막증 조직(active endometotric tissue)의 분자생물학적 성격과 유사함이 증명되어(Banu et al., 2008), 자궁내막증의 분자생물학적 연구에 대한 새로운 인 비트로 모델로 사용되고 있다. 세포는 RPMI 1640 및 DMEM/F12 배지(10% 우태아혈청, 100 U/ml 페니실린 G, 100g/ml 스트렙토마이신 첨가됨; 라이프 테크놀로지, 그랜드 아일랜드, 뉴욕) 중, 섭씨 37도, 5%이산화탄소-95%공기 조건에서 유지되었다.
<실시예 1> 용규 알코올 추출물의 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료, 개선 또는 예방 효과 확인
1-1. 용규 알코올 추출물의 준비
음건된 용규(Solanum nigrum, 산지: 경상북도 영천)을 대한민국 경동시장에서 구입하였고, 용규 전초를 400um 입자 사이즈가 되도록 분쇄하였다. 이와 같이 준비된 용규 10kg에 70%(v/v) 에탄올 수용액 100리터를 가하고 실온에서 24시간동안 침지하여 여액을 취하였고, 동일한 방법으로 1회 반복 추출하였다. 추출한 여액을 섭씨 60도에서 감압농축하고, 농축액을 동결건조하여 분말상태의 용규 70%에탄올 추출물 1.5kg을 얻었다.
1-2. 세포이동 및 부착 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70부피% 에탄올 추출물이 자궁내막증 세포의 이동 및 침투에 중요한 역할을 하는 단백질 분해효소인 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현을 억제하는지 확인하기 위하여, 실시간 PCR (real-time PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 자궁내막증 세포인 12Z(epithelial endometriotic cells)에 용규 70부피% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL을 각각 24시간 처리한 후 12Z 세포에서 TRIzol(Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 총 RNA를 추출한 후, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. 구체적으로, first-strand cDNA를 주형으로 하여, Thermal Cycler Dice Real Time PCR System(Takara, Japan)을 이용하여 섭씨 95도에서 5초 동안 변성, 섭씨 57도에서 10초 동안 어닐링(annealing), 섭씨 72도에서 20초 동안 연장을 수행하는 조건으로 45회 반복하여 SYBR Green real-time PCR을 수행하였다. 상기 SYBR Green real-time PCR에 사용된 MMP-2, MMP-9 및 보정용 GAPDH 프라이머들은 하기 [표 1]과 같으며, MMP-2, MMP-9의 Ct값의 평균은 트리플리케이트(triplicate) 측정으로 구해지며, GAPDH의 Ct값에 의해 보정되었다. 또한, 용규 추출물 미처리군은 대조군(control; CON)으로 하여, 추출물 처리를 제외하고 용규 추출물 처리군과 동일하게 처리하였다. 그 결과, 자궁내막증에서 발현되는 대표적인 단백질이며, 세포의 이동과 침투에 중요한 역할을 하는 내인성 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현을 용규 70% 에탄올 추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 1, 도 2 참조).
[표 1]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000001
도 1은 용규 알콜 추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 2는 용규 알콜 추출물의 MMP-9 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 1과 도 2의 x축에서 con은 대조군을, 25는 용규 70부피% 에탄올 추출물 25ug/mL 투여군을 나타내고, 도 1의 y축은 상대적인 MMP2 mRNA발현(Relative MMP2 mRNA expression)을 나타내며, 도 2의 y축은 상대적인 MMP9 mRNA발현(Relative MMP9 mRNA expression)을 나타낸다. 도에서와 같이, 70부피% 에탄올 추출물은 25ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 MMP-2와 MMP-9 발현을 억제함을 알 수 있다.
1-3. 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70부피% 에탄올 추출물이 자궁내막증의 통증과 관련되어 있다고 알려진 COX-2의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시간 PCR (real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 자궁내막증 세포인 12Z (epithelial endometriotic cells)에 용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 각각 24시간 처리한 후 12Z 세포에서 TRIzol (Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 총 RNA를 추출하여, 역전사 중합효소연쇄반응 (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. 구체적으로, first-strand cDNA를 주형으로 하여, Thermal Cycler Dice Real Time PCR System (Takara, Japan)을 이용하여 섭씨 95도에서 5초 동안 변성, 섭씨 57도에서 10초 동안 어닐링 (annealing), 섭씨 72도에서 20초 동안 연장을 수행하는 조건으로 45회 반복하여 SYBR Green real-time PCR을 수행하였다. 상기 SYBR Green real-time PCR에 사용된 COX-2 프라이머, 보정용 GAPDH 프라이머들은 하기 [표 2]와 같으며, COX-2의 Ct값의 평균은 트리플리케이트(triplicate) 측정으로 구해지며, GAPDH의 Ct값에 의해 보정되었다. 또한, 용규 추출물 미처리군은 대조군(control; CON)으로 하여, 추출물 처리를 제외하고 용규 추출물 처리군과 동일하게 처리하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000002
그 결과, 자궁내막증 세포의 통증 관련 특징적 효소인 COX-2의 mRNA 발현을 용규 70% 에탄올 추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 3 참조).
도 3은 용규 알콜 추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 3의 x축에서 con은 대조군을, 25는 용규 70부피% 에탄올 추출물 25ug/mL 투여군을 나타내고, 도 3의 y축은 상대적인 COX2 mRNA발현(Relative COX2 mRNA expression)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 25ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 COX-2 발현을 억제함을 알 수 있다.
1-4. 염증성 싸이토카인 발현 억제 효과 확인
용규 70부피% 에탄올 추출물이 자궁내막증 세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있는 염증성 사이토카인 mRNA 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 실시간 PCR (real-time PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 자궁내막증 세포인 12Z (epithelial endometriotic cells)에 용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 각각 24시간 처리한 후 12Z 세포에서 TRIzol (Invitrogen Canada, Burlington, ON, Canada)을 사용하여 총 RNA를 추출하여, 역전사 중합효소연쇄반응 (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. 구체적으로, first-strand cDNA를 주형으로 하여, Thermal Cycler Dice Real Time PCR System (Takara, Japan)을 이용하여 섭씨 95도에서 5초 동안 변성, 섭씨 57도에서 10초 동안 어닐링 (annealing), 섭씨 72도에서 20초 동안 연장을 수행하는 조건으로 45회 반복하여 SYBR Green real-time PCR을 수행하였다. 상기 SYBR Green real-time PCR에 사용된 TNF-a 프라이머, MCP-1 프라이머 및 보정용 GAPDH 프라이머들은 하기 [표 3]과 같으며, TNF-a 및 MCP-1의 Ct값의 평균은 트리플리케이트(triplicate) 측정으로 구해지며, GAPDH의 Ct값에 의해 보정되었다. 또한, 용규 추출물 미처리군은 대조군(control; CON)으로 하여, 추출물 처리를 제외하고 용규 추출물 처리군과 동일하게 처리하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000003
그 결과, 자궁내막증 세포의 염증 관련 사이토카인인 TNF-알파 및 MCP-1의 mRNA 발현을 용규 70% 에탄올 추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 4, 도 5 참조).
도 4는 용규 알콜 추출물의 TNF-알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 5는 용규 알콜 추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 4와 도 5의 x축에서 con은 대조군을, 25는 용규 70부피% 에탄올 추출물 25ug/mL 투여군을 나타내고, 도 4의 y축은 상대적인 TNF-알파 mRNA발현(Relative TNFa mRNA expression)을 나타내며, 도 5의 y축은 상대적인 MCP-1 mRNA발현(Relative MCP-1 mRNA expression)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 25ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 TNF-알파 및 MCP-1 발현을 억제함을 알 수 있다.
1-5. 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물이 자궁내막증 세포의 부착 및 착상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 부착 분석 (attachment assay)을 3번 반복 수행하였다.
구체적으로, 자궁내막증의 특징인 자궁내막증 세포가 복막 복강주위의 장기에 부착 및 착상하는 현상을 용규 70% 에탄올 추출물이 억제하는지 확인하기 위해, 인간 복막 중피 세포(Human peritoneal methothelial cells)인 Met-5A 세포 (American Type Culture Collection, ATCC)를 10%의 FBS, 100 U/ml의 페니실린 G 및 100 g/ml의 스트렙토마이신 (Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.), 및 400 nM의 hydrocortisone (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, U.S.A.)가 포함된 199 배지에서 5 % CO2 인큐베이터로 배양하였다. 상기 Met-5A 세포를 96-웰 플레이트에 분주하였다. Cell tracker green CMFDA로 표지한 자궁내막증 세포주인 12Z 세포 (2 X 103 개/well)를 50 ug/mL, 100 ug/mL, 또는 200 ug/mL 의 용규 70% 에탄올 추출물을 함유한 DMEM/F12배지와 섞은 후, 미리 분주해놓은 Met-5A 세포에 첨가하였다. 섞인 상기의 세포들은 섭씨37도의 5% CO2-인큐베이터에서 한 시간 동안 배양한 후, 플레이트를 뒤집고 칼슘 및 마그네슘이 들어있는 포스페이트-버퍼 용액 (phosphate-buffered solution)으로 씻었다. 부착된 세포들을 490 nm의 파장으로 분석하여, 보정용 대조군을 100%로 놓고 부착된 세포들의 퍼센트를 계산하였다. 또한, 용규 추출물 미처리군은 대조군(control; CON)으로 하여, 추출물 처리를 제외하고 용규 추출물 처리군과 동일하게 처리하였다.
그 결과, 용규 70% 에탄올 추출물을 처리한 자궁내막증 세포 12Z가, 복막 및 복강 주위 장기의 외부를 둘러싼 Met-5A 세포에 부착 억제되는 것을 확인하였다(도 6 참조).
도 6은 용규 알콜 추출물의 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 6의 x축에서 con은 대조군을, 50ug/ml은 용규 70부피% 에탄올 추출물 50ug/mL 투여군을 나타내고, 도 6의 y축은 부착세포(Attachment cells)의 비율{광학밀도(Optical Density; OD) 비율, %}을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 50ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 세포 부착을 억제함을 알 수 있다.
1-6. 자궁내막증 세포 이동 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물이 자궁내막증 세포의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 트랜스웰-이동 분석 (transwell-migration assay)을 3번 반복 수행하였다. 구체적으로, 24웰-트랜스웰 플레이트 (8 um pore size)에 자궁내막증 세포인 12Z 세포를 트랜스웰 플레이트의 윗 부분 (upper part)에 각각 분주한 후, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 및 100 ug/mL 의 용규 70% 에탄올 추출물을 처리하였다. 용규 70% 에탄올 추출물 처리 후, 트랜스웰 바깥쪽면의 막으로 이동한 세포들을 메탄올로 고정하여, 0.5%의 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색하였다. 상기의 트랜스웰 바깥쪽 면으로 이동한 세포들을 200 X 배율의 현미경으로 관찰하여 개수하여 그래프화 하였다. 또한, 용규 추출물 미처리군은 대조군(control; CON)으로 하여, 추출물 처리를 제외하고 용규 추출물 처리군과 동일하게 처리하였다. 그 결과, 용규 70% 에탄올 추출물을 처리한 자궁내막증 세포 12Z의 이동이 유의적으로 억제됨을 확인하였다(도 7 참조).
도 7은 용규 알콜 추출물의 자궁내막증 세포 이동 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 7의 x축에서 con은 대조군을, 25ug/ml은 용규 70부피% 에탄올 추출물 25ug/mL 투여군을 나타내고, 도 7의 y축은 이동(Migration)의 비율(%)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 25ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 세포 부착을 억제함을 알 수 있다.
1-7. 복강내투여(Intraperitoneal injection)유도모델에서의 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물이 Intraperitoneal injection 자궁내막증 유도 모델에서의 효과를 확인하기 위하여 평가를 수행하였다.
자궁내막증 유도는 Donor mouse에서 이식할 자궁을 적출하여 잘게 조각한 후 recipient mouse의 복강내로 spreading하여 유도하였고, 약물투여는 하기 [표 4]와 같으며, 용규 70% 에탄올 추출물 125 mg/kg, 250mg/kg, 500 mg/kg을 각각 경구로 5주간 투여하였다. 자궁내막증 유도된 동물모델을 희생시켜 복부를 개복하여 복막과 복강 내 (소장, 대장, 위, 간, 방광, 난소 등)의 implantation 수를 확인하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000004
또한, 비클(Vehicle) 투여군은, 추출물 대신 10% Tween 80을 200ul 투여한 것을 제외하고 용규 추출물 투여군과 동일하게 처리하였다. 또한, 양성 대조군은 용규 추출물 대신 dienogest를 0.3mg/kg 투여한 것을 제외하고, 용규 추출물 투여군과 동일하게 처리하였다.
그 결과, 용규 70% 에탄올 추출물이 유의적으로 자궁내막증 조직형성 억제 효과가 있는 것으로 확인하였다(도 8 참조).
도 8은 용규 알콜 추출물의 복강내투여모델에서 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 8의 x축에서 비클은 비클투여군을, Dieno는 dienogest 투여군을, 용규 125는 용규 70부피% 에탄올 추출물 125mg/kg 투여군을 나타내고, 도 8의 y축은 임플란트(implant) 갯수를 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 125mg/kg에서도, 효과적으로 자궁내막증 조직형성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
1-8. 수술 유도 모델(Surgical induced model)에서의 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물이 Surgical induced 자궁내막증 유도 모델에서의 효과를 확인하기 위한 평가를 수행하였다.
자궁내막증 유도는 SD rat (female)의 왼쪽 자궁을 7 mm길이로 절단 후 내막 부분이 복막에 맞닿게 양쪽 끝을 silkam으로 봉합하는 방법으로 자궁내막세포를 이식하여 유도하였고, 약물투여는 하기 [표 5]와 같으며, 용규 70% 에탄올 추출물 100 mg/kg, 300mg/kg, 500 mg/kg을 경구로 4주간 투여하였다. 자궁내막증 유도된 동물모델을 희생시켜 복부를 개복하여 자궁내막증 세포를 이식한 복막에서의 implant 크기{염증 부위의 크기}를 확인하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000005
또한, 비클(Vehicle) 투여군은, 추출물 대신 추출물을 녹이기 위한 용매를 체중에 비례하여 투여한 것을 제외하고 용규 추출물 투여군과 동일하게 처리하였다. 추출물은 10% Tween 80으로 녹였다. 또한, 양성 대조군(Positive control)은 용규 추출물 대신 dienogest를 0.3mg/kg 투여한 것을 제외하고, 용규 추출물 투여군과 동일하게 처리하였다.
그 결과, 용규 70% 에탄올 추출물이 자궁내막증 조직형성 억제 효과가 있는 것으로 확인하였다(도 9 참조).
도 9는 용규 알콜 추출물의 수술유도모델에서 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 9의 x축에서 비클은 비클투여군을, 양성대조군은 dienogest 투여군을, 용규 100mg/kg는 용규 추출물 100mg/kg 투여군을 나타내고, y축은 임플란트(implant) 크기를 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 70부피% 에탄올 추출물이 100mg/kg에서도, 효과적으로 자궁내막증 조직형성 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터, 용규 알코올 추출물의 자궁내막증 또는 이의 합병증을 치료, 개선 또는 예방 효과를 확인할 수 있다.
<실시예 2> 용규 부탄올분획 추출물의 자궁내막증 및 합병증 치료, 개선 또는 예방 효과 확인
2-1. 용규 부탄올분획 추출물의 준비
1-1.과 동일한 방법으로 준비한 70%에탄올 추출물 1kg의 계통적인 분획을 통하여 노말헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 그리고 물층으로 나누는 방법에 의해, 용규 부탄올분획 추출물을 준비하였다. 구체적으로, 분말상태의 추출물 1kg에 물 4L를 가하고, 물이 가해진 알콜 추출물을 n-헥산 20L로 분획추출하고, n-헥산 분획을 따로 취하고, 남은 수층을 디클로로메탄 20L로 분획추출하여 디클로로메탄 분획을 따로 취하고, 남은 수층을 에틸아세테이트 40L로 분획추출하여, 에틸아세테이트 분획을 따로 취하고, 남은 수층을 부탄올 40L로 분획추출하여, 부탄올 분획을 얻고, 이와 같은 과정에 의해 얻어진 부탄올 분획을 감압농축하고, 농축액을 동결건조하여 분말상태의 용규 70% 에탄올 추출물 중 부탄올 분획 추출물 141g을 얻었다. 또한, 부탄올 분획추출 후 남은 물층을 따로 얻었다.
2-2. 세포이동 및 부착 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70부피% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 2-1.의 용규 부탄올분획 추출물 0.5 ug/mL, 1 ug/mL, 또는 2 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-2.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증에서 발현되는 대표적인 단백질이며, 세포의 이동과 침투에 중요한 역할을 하는 내인성 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA 발현을 용규 70% 에탄올 추출물의 부탄올분획추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 10, 도 11 참조).
도 10은 용규 부탄올분획추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 11은 용규 부탄올분획추출물의 MMP-9 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 10과 도 11의 x축에서 con은 대조군을, 0.5는 용규 부탄올분획추출물 0.5ug/mL 투여군을 나타내고, 도 10의 y축은 MMP-2 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of MMP-2 mRNA)을 나타내며, 도 11의 y축은 MMP-9 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of MMP-9 mRNA)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 부탄올분획추출물이 0.5ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 MMP-2와 MMP-9 발현을 억제함을 알 수 있다.
2-3. 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 2-1.의 용규 부탄올분획 추출물 0.5 ug/mL, 1 ug/mL, 또는 2 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-3.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증 세포의 통증 관련 특징적 효소인 COX-2의 mRNA 발현을 용규 부탄올분획 추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 12 참조).
도 12는 용규 부탄올분획추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 12의 x축에서 con은 대조군을, 0.5는 용규 부탄올분획추출물0.5ug/mL 투여군을 나타내고, y축은 COX-2 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of COX-2 mRNA)을 나타낸다.도에서와 같이, 용규 부탄올분획추출물이 0.5ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 COX-2 발현을 억제함을 알 수 있다.
2-4. 염증성 싸이토카인 발현 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 2-1.의 용규 부탄올분획 추출물 0.5 ug/mL, 1 ug/mL, 또는 2 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-4.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증 세포의 염증 관련 사이토카인인 TNF-알파 및 MCP-1의 mRNA 발현을 용규 부탄올분획 추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 13, 도 14 참조).
도 13은 용규 부탄올분획 추출물의 TNF-알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 14는 용규 부탄올분획 추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 13과 도 14의 x축에서 con은 대조군을, 0.5는 용규 부탄올분획 추출물 0.5ug/mL 투여군을 나타내고, 도 13의 y축은 TNF-알파 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of TNF-a mRNA)을 나타내며, 도 14의 y축은 MCP-1 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of MCP-1 mRNA)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 부탄올분획 추출물이 0.5ug/mL의 농도에서도, 효과적으로 TNF-알파 및 MCP-1 발현을 억제함을 알 수 있다.
2-5. 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인
50 ug/mL, 100 ug/mL, 또는 200 ug/mL 의 용규 70% 에탄올 추출물 대신, 2-1.의 용규 부탄올분획 추출물 0.5 ug/mL, 1 ug/mL, 또는 2 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-5.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 용규 부탄올분획 추출물을 처리한 자궁내막증 세포 12Z가, 복막 및 복강 주위 장기의 외부를 둘러싼 Met-5A 세포에 부착 억제하는 것을 확인하였다(도 15 참조).
도 15는 용규 부탄올분획 추출물의 자궁내막증 세포 부착 및 착상 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 15의 x축에서 con은 대조군을, 1은 용규부탄올분획 추출물 1ug/mL 투여군을 나타내고, y축은 부착세포(Attachment cells)의 비율{광학밀도(Optical Density; OD) 비율, %}을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규부탄올분획 추출물이 낮은 농도에서도, 효과적으로 세포 부착을 억제함을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터, 용규 부탄올분획 추출물이 자궁내막증 또는 이의 합병증을 치료, 개선 또는 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
<실시예 3> 용규 분획 추출물의 자궁내막증 및 합병증 치료, 개선 또는 예방 효과 확인
3-1. 용규 분획 추출물의 준비
1-2.의 분획 추출법과 동일한 방법으로 얻어진, 노말헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 및 부탄올 분획추출 후 남은 물층 각각을 감압농축하고, 농축액을 동결건조하여 용규 70% 에탄올 추출물 중 노말헥산 분획 추출물, 디클로로메탄 분획 추출물, 에틸아세테이트 분획 추출물, 및 물층 추출물을 각각 분말상태로 105g, 16g, 36g, 477g 얻었다.
3-2. 세포이동 및 부착 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 부탄올분획 추출물 대신, 표 6 또는 표 7에 기재된 분획추출물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2-2.과 동일하게 실시하였다.
그 결과를 표 6과 표 7에 나타내었으며, 표 6은 MMP-2에 대한 결과이고, 표 7은 MMP-9에 대한 결과를 나타낸다.
[표 6]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000006
[표 7]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000007
그 결과, 각각의 분획 추출물이 MMP-2 및/또는 MMP-9 발현을 억제함을 알 수 있다.
3-3. 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 부탄올분획 추출물 대신, 표 8에 기재된 분획추출물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2-3.과 동일하게 실시하였다.
그 결과를 표 8에 나타내었다. 그 결과, 자궁내막증 세포의 통증 관련 특징적 효소인 COX-2의 mRNA 발현을 각 분획 추출물이 억제함을 알 수 있다.
[표 8]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000008
3-4. 염증성 싸이토카인 발현 억제 효과 확인
용규 부탄올분획 추출물 대신, 표 9 또는 표 10에 기재된 분획 추출물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 2-4.과 동일하게 실시하였다.
그 결과를 표 9와 표 10에 나타내었으며, 표 9는 TNF-알파에 대한 결과이고, 표 10의 MCP-1에 대한 결과이다. 그 결과, 자궁내막증 세포의 염증 관련 사이토카인인 TNF-알파 및 MCP-1의 mRNA 발현을 각각의 분획 추출물이 억제함을 알 수 있다.
[표 9]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000009
[표 10]
Figure PCTKR2016002427-appb-I000010
이와 같은 결과로부터, 용규 분획 추출물이 자궁내막증 및 합병증의 치료, 개선 또는 예방에 효과적임을 확인할 수 있다.
<실시예 4> 용규 물추출물의 자궁내막증 및 합병증 치료, 개선 또는 예방 효과 확인
4-1. 용규 물추출물의 준비
음건된 용규(Solanum nigrum, 산지: 경상북도 영천)를 경동시장(대한민국)에서 구입하였고, 용규 전초를 분쇄하였다. 이와 같이 준비된 용규 500g에 3차 증류수 1리터를 넣고 3시간동안 약탕기를 이용하여 추출하였다. 추출액을 여과지를 이용하여 여과한 후 48시간 동결건조하여 분말상태의 용규 물 추출물을 얻었다.
4-2. 세포이동 및 부착 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70부피% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 4-1.의 용규 물추출물 100 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-2.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증에서 발현되는 대표적인 단백질이며, 세포의 이동과 침투에 중요한 역할을 하는 내인성 MMP-2의 mRNA 발현을 용규 물추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 16 참조).
도 16은 용규 물추출물의 MMP-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 16의 x축에서 con은 대조군을, 100ug/ml은 용규 물추출물 100ug/mL 투여군을 나타내고, y축은 MMP-2 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of MMP-2 mRNA)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 물추출물이 효과적으로 MMP-2 발현을 억제함을 알 수 있다.
4-3. 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 4-1.의 용규 물추출물 100 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-3.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증 세포의 통증 관련 특징적 효소인 COX-2의 mRNA 발현을 용규 물추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 17 참조).
도 17은 용규 물추출물의 COX-2 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 17의 x축에서 con은 대조군을, 100ug/ml은 용규 물추출물 100ug/mL 투여군을 나타내며, y축은 COX-2 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of COX-2 mRNA)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 물추출물이 효과적으로 COX-2 발현을 억제함을 알 수 있다.
4-4. 염증성 싸이토카인 발현 억제 효과 확인
용규 70% 에탄올 추출물 25 ug/mL, 50 ug/mL, 또는 100 ug/mL 대신, 4-1.의 용규 물추출물 100 ug/mL을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1-4.과 동일하게 실시하였다.
그 결과, 자궁내막증 세포의 염증 관련 사이토카인인 TNF-알파 및 MCP-1의 mRNA 발현을 용규 물추출물이 억제함을 자궁내막증 세포인 12Z 세포에서 확인하였다(도 18, 도 19 참조).
도 18은 용규 물추출물의 TNF-알파 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도이고, 도 19는 용규 물추출물의 MCP-1 발현 억제 효과 확인 실험 결과를 나타낸 도로, 도 18과 도 19의 x축에서 con은 대조군을, 100ug/ml는 용규 물추출물 100ug/mL 투여군을 나타내고, 도 18의 y축은 TNF-알파 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of TNF-α mRNA)을 나타내며, 도 19의 y축은 MCP-1 mRNA의 상대적 수준(Relative levels of MCP-1 mRNA)을 나타낸다. 도에서와 같이, 용규 물추출물이 효과적으로 TNF-알파 및 MCP-1 발현을 억제함을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터, 용규 물추출물이 자궁내막증 및 합병증의 치료, 개선 또는 예방에 효과적임을 확인할 수 있다.
따라서, 용규 추출물은 세포이동 및 부착 관련 효소 발현 억제, 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제, 염증성 싸이토카인 발현 억제, 자궁내막증세포 이동 억제, 자궁내막증 세포 부착 및/또는 착상 억제 등에 의해, 자궁내막증 또는 그 합병증의 치료, 개선 및/또는 예방 효과가 있음을 알 수 있다.
<제조예 1> 약학 조성물의 제조
실시예 1-1 ~ 실시예 4-1에 기재된 방법 중 어느 하나와 동일한 방법으로 준비한 용규 추출물 300mg, 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제조예 2> 식품 조성물의 제조
실시예 1-1 ~ 실시예 4-1에 기재된 방법 중 어느 하나와 동일한 방법으로 준비한 용규 추출물(4중량 %), 액상과당(0.5중량%), 올리고당(2중량%), 설탕(2중량%), 및 식염(0.5중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.
본 발명에 의해 자궁내막증 또는 이의 합병증을 효과적으로 치료, 개선 및/또는 예방할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (14)

  1. 용규 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 또는 이의 합병증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 상기 용규 추출물 및 상기 첨가제로 이루어진 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자궁내막증 또는 이의 합병증은 MMP-2, MMP-9, COX-2, TNF알파, 또는 MCP-1 중에서 선택된 하나 이상의 과발현에서 기인하는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 합병증은 골반염, 골반유착, 난소낭종, 자궁근종, 자궁외임신 및 불임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 용규 추출물은 상기 용규를 용매로 추출한 용매추출물로, 상기 용매는 물, 알코올, 또는 그 혼합물 중에서 선택된 하나 이상인 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 용매는 70부피% 에탄올인 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 용규 추출물은 상기 용규를 70부피%에탄올로 추출한 70부피%에탄올추출물을 부탄올로 분획추출한 부탄올분획추출물인 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 부탄올분획추출물은
    (A) 용규를 70부피%에탄올로 추출한 70부피%에탄올추출물을 준비하는 단계;
    (B) 상기 (A)단계의 70부피%에탄올추출물에 물을 가하는 단계;
    (C) 상기 (B)단계의 물이 가해진 70부피%에탄올추출물을 n-헥산으로 분획추출하는 단계;
    (D) 상기 (C)단계의 n-헥산 분획을 제거하고 남은 수층을 디클로로메탄으로 분획추출하는 단계;
    (E) 상기 (D)단계의 디클로로메탄 분획을 제거하고 남은 수층을 에틸아세테이트로 분획추출하는 단계; 및
    (F) 상기 (E)단계의 에틸아세테이트 분획을 제거하고 남은 수층을 부탄올로 분획추출하는 단계에 의해 수득한 분획추출물인 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 자궁내막증 세포의 부착 또는 이동 억제에 의한 것인 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 부착 또는 이동 억제는 MMP-2 또는 MMP-9 중에서 선택된 하나 이상의 발현 억제에 의한 것인 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 염증 및 통증 관련 효소 발현 억제 또는 염증성 싸이토카인 발현 억제 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것인 약학 조성물.
  12. 용규 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁내막증 또는 이의 합병증 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  13. 용규 추출물의 자궁내막증 또는 이의 합병증의 치료 또는 예방용 제제 제조를 위한 용도.
  14. 용규 추출물 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 용규 추출물을 투여하는 단계를 포함하는 자궁내막증 또는 이의 합병증의 치료, 또는 예방법.
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