KR20060034178A

KR20060034178A - 용규 추출물을 유효성분으로 함유하는 ａｉｄｓ 치료제

Info

Publication number: KR20060034178A
Application number: KR1020040083338A
Authority: KR
Inventors: 유영법; 핫도리마사오; 미야시로히로주구; 윤유식; 신현규
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2004-10-18
Filing date: 2004-10-18
Publication date: 2006-04-21

Abstract

본 발명은 HIV 억제 활성을 갖는 용규 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것으로 본 발명의 치료제는 HIV-I 역전사효소 억제 활성, 프로테아제 억제 활성 및 HIV-I 증식 억제 활성이 뛰어나므로 AIDS를 치료하고, 진행을 억제시키며 감염을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

용규 추출물을 유효성분으로 함유하는 ＡＩＤＳ 치료제{A therapeutic agent for AIDS containing extract of Solani nigri Herba}

도 1은 본 발명의 추출물이 HIV-I 프로테아제의 활성을 억제함을 확인한 기질의 HPLC 분석 결과이다. 기질과 가수분해물의 지속시간(retention time)은 각각 12.00 분 및 5.80 분이다.

도 2는 용규의 물 추출물의 HIV-I 관련효소에 대한 억제율을 나타내는 그래프이다. (RT: HIV-I 역전사효소; PR: HIV-I 프로테아제; GL: 글루코시다제)

도 3은 용규의 메탄올 추출물의 HIV 관련효소에 대한 억제율을 나타내는 그래프이다. (RT: HIV-I 역전사효소; PR: HIV-I 프로테아제; GL: 글루코시다제)

본 발명은 AIDS 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HIV-I 증식 억제 활성을 갖는 용규 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것이 다.

레트로바이러스(retrovirus)의 한 종이며 에이즈(AIDS)의 병인자인 HIV-I(human immunodeficiency virus type Ⅰ)은 RNA를 유전적 모태로 하고 있다(Kaminchik, J. et. al., AIDS res. hum. retroviruses, 1994, 10: 1003-1010; Peliska, J.A. et. al., Science, 1992, 258:1112-1118). HIV-I은 표면 단백질인 당단백질 120(glycoprotein 120, gp120)이 헬퍼 T 세포의 CD4+ 수용체와 작용한 후 RNA를 숙주 세포에 삽입하고 역전사효소(RT)에 의해 바이러스 DNA로 전사되어 숙주의 염색체에 전구바이러스 DNA 형태로 존재한다. 숙주세포에서 잠복기를 거쳐 유전자가 발현될 때 RNA 중합효소(polymerase)에 의해 바이러스 mRNA가 생산되고, 프로테아제(PR)에 의해 바이러스 단백질의 프로세싱이 이루어진다(Katz, R.A. and Skalka, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1994, 63:133-173). 글루코시다제(GL) 등의 작용으로 바이러스 표면 당단백질이 형성되어 성숙한 바이러스 입자(mature virion)로 발아된다[Taylor, D.L., Antimicrobacterial Agents & Chemotherapy, 1994, 38(8):1780-1787; Mohan, P., Pharmaceutical Research, 1992, 9(6):703-714]. 이렇듯 바이러스가 헬퍼 T 세포 등에 자신의 유전자를 삽입하고 잠복기를 거쳐 자신을 복제하는 과정에서 숙주 세포를 파괴함으로써 인간의 면역기전에 심각한 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다.

HIV-I을 치료하기 위한 화학적 치료법(chemotherapy)으로는 수마린(suramin) 과 같은 약물이 사용되고(Mitsuya, H. et. al., Science, 1984, 226:172-174), HIV-I의 역전사효소를 억제하기 위한 약물로는 뉴클레오시드 유사체인 아지오티미딘(azidothymidine, AZT)(Ostertag, W. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 197, 471:4980-4985), 디다노신(didanosine, ddI) 및 잘시타빈(zalcitabine, ddC) 등이 사용되며, 비-뉴클레오시드 아날로그인 TIBO, 네비라핀(nevirapine) 및 피리디논(pyridinone) 등이 임상에서 사용되고 있다. 그러나, 아지오티미딘은 장기 투여할 경우 근질환과 구강 점막 착색증 등을 유발하는 부작용이 있다. 또한, 디다노신의 경우는 췌장염을 일으킨다고 보고되어 있다(Levin, T.L. et. al., Pediatric Radiology, 1997, 27(2):189-191).

이와 같이, 현재까지 사용되고 있는 AIDS 치료 약물은 부작용이 많기 때문에 이를 대체하기 위한 다양한 치료 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에 부합하여 최근에는 천연물을 이용한 AIDS 치료약물 개발이 활성화되고 있다. 그 예로, 고시폴(gossypol)과 그 합성 유도체(Prusoff, W. et. al., Pharmacology & Therapeutics, 1993, 60(2):315-329), 해양 천연 알카로이드인 피리도[4,3,2-mn]티아졸로[5,4-b]아크리딘(Taraporewala, I.B. et. al., J. Med. Chem., 1992, 35(15):2744-2752), 탄닌(Nakashima, H. et. al., Antiviral Research, 1992, 18:91-103), 플라보노이드[Kusumoto, I.T. et. al., Shoyakugaku Zasshi, 1993, 47:291-294] 등이 HIV-I 억제 활성을 가진다고 보고 되었다. 또한, HIV-I 억제 활성을 가진 물질을 찾기 위한 천연물 엑스의 광범위한 스크리닝이 행해지고 있는 실정이다[유영법 등, 한국생약학회지, 1998, 29(4):338-346; Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995. 9:180-184].

용규(龍葵, Solani nigri Herba)는 가지과(Solanaceae)에 속하는 까마중(Solanum nigrum Linne)전초로 까마중은 우리 나라 각처의 밭이나 길가에 흔히 나는 1년초이다. 키는 20-90cm이며 가지가 옆으로 많이 퍼지고, 원줄기에는 약간의 능선이 나타난다. 잎은 호생, 난형 또는 타원형, 길이 6-10cm, 폭 4-6cm 이며 가장자리는 밋밋하거나 물결모양의 톱니가 있다. 꽃은 취산화서가 산형으로 3-8송이씩 달리고, 흰색, 지름 6-7mm, 꽃받침은 5갈래, 1개의 암술과 5개의 수술이 있다. 열매는 장과로 둥근 모양이며 검게 익고, 지름은 약 6 mm, 단맛이 있으나 약간 독성이 있다. 성미는 차고, 맛은 쓰면서도 약간 달고, 청열해독(淸熱解毒), 산결(散結), 이수(利尿), 소염(消炎), 혈당저하(血糖低下), 진해(鎭咳), 거담(祛痰), 중추신경흥분(中樞神經興奮), 혈액응고저지 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다[국가중의약관리국<중화본초>편위회, 중화본초, 상해: 상해과학기술출판사. 1999, 7-309]. 용규의 함유성분으로는 솔라닌, 올라소닌(olasonine), 솔라마진(Solamargin), 디오스제닌(Diosgenin), 티고제틴(Tigogenin), 비타민 A, 비타민 C, 스테로이드성 올리고글리코시드인 니그룸닌 I(nigrumnin I), 니그룸닌 II(nigrumnin II) 등이 알려져 있으며, 용규의 약리활성으로는 간보호작용, 신장세포보호작용, 중추신경계진정, 항위궤양작용, 항당뇨작용, 혈압강하작용, 항염증작용, 등이 보고되어 있으나, 용규의 HIV-I 억제활성에 관해서는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 물 또는 메탄올을 이용하여 용규로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물이 HIV-I 역전사 효소의 억제 활성, HIV-I 프로테아제 억제 활성 및 HIV-I 바이러스 증식 억제 활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 용규 추출물을 함유하는 AIDS 치료제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 용규 추출물을 함유하는 HIV-I 역전사 효소 활성 억제제, HIV-I 프로테아제 활성 억제제 및 HIV-I 증식 활성 억제제를 제공하고자 한다.

본 발명은 용규 추출물을 함유하는 AIDS 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 용규 추출물을 함유하는 HIV-I 역전사 효소 활성 억제제, HIV-I 프로테아제 활성 억제제 및 HIV-I 증식 활성 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

용규(龍葵, Solani nigri Herba)는 가지과(Solanaceae)에 속하는 까마중(Solanum nigrum Linne) 전초로 까마중은 우리 나라 각처의 밭이나 길가에 흔히 나는 1년초이다. 덩굴 같은 줄기가 부드럽고 길게 뻗어 있어 마치 용의 형상과 닮았 다고 해서 용규(龍葵)라 불린다.

본 발명의 추출물은 채취된 용규를 건조시켜 세절한 후 적절한 추출용매를 사용하여 추출함으로써 제조할 수 있다. 추출용매로는 물, 알코올 또는 알코올 수용액이 사용될 수 있다. 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올이며, 메탄올인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 건조된 용규를 물 또는 메탄올을 용매로 사용하여 환류추출한 후 감압 농축하여 동결건조한 추출물을 제조하였다.

본 발명의 추출물은 HIV 관련 효소의 활성을 억제하고, HIV 증식을 억제한다. 용규의 물추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 역전사 효소 및 HIV-I 프로테아제를 각각 17.4%, 32.6%의 억제하며(도 2), 용규의 메탄올 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도에서 HIV-I 프로테아제를 24.6% 억제하여 유의적인 억제활성을 나타낸다(도 3). 반면, 물과 메탄올 추출물 모두 글루코시다제 억제활성에서는 유의할만한 활성을 보이지 않는다.

따라서 본 발명의 용규 추출물이 우수한 HIV-I 프로테아제 억제활성을 가짐과 동시에 바이러스의 증식억제에도 크게 기여하는 것을 알 수 있으며, 용규의 HIV-I 증식 억제활성이 프로테아제 억제와 상관관계가 있는 것으로 추정된다. 또한, 용규의 메탄올 추출물은 유전자 재조합 HIV-I 프로테아제의 억제에서 활성을 나타냄으로써 바이러스 증식억제에 일부 기여하는 것으로 추정된다. 용규의 물 추출물이 효소억제나 바이러스 증식억제에 높은 활성을 나타내는 것은 식물에 함유된 고분자 활성 물질인 타닌(tannin), 다당류(polysaccharide), 단백질 등이 물 추출물에 다량 함유되어 있어 효소결합능력이 탁월하고, 바이러스 표면의 당단백에의 결합이 용이하기 때문인 것으로 추정된다. 또한, 용규 추출물에는 다양한 복합분자들이 분포되어 있어 효소 억제 작용, 바이러스세포 융합 억제, 감염된 세포로부터 바이러스분자의 방출억제 등에도 관여할 것으로 예상된다.

본 발명의 용규 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제 및 효소활성억제제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 용규 추출물을 경구 비경구 투여를 위하여 제제화하는 경우 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 있으며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등이 사용된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 AIDS 치료제의 투여에 있어서, 용규 추출물의 유효용량은 0.1 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 5 내지 500 ㎎/㎏이며, 일일 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 용규 추출물의 제조

용규를 채취하여 세척하고 통풍이 잘되는 것에서 음지건조하였다. 건조된 용규 시료 5 g에 물 100 ㎖ 또는 메탄올 100 ㎖을 넣어 3시간 동안 환류추출하였다. 추출된 용액을 감압농축하고 동결건조하였다. 메탄올 추출물의 경우 메탄올의 최종농도가 2%를 넘지 않게 동결건조하여 활성실험의 재료로 사용하였다. 시료는 활성실험시에 멸균된 증류수나 DMSO에 100 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다.

<실험예 1> 용규 추출물이 HIV 관련효소 활성에 미치는 영향

<1> HIV-I 역전사 효소 활성 억제

본 발명의 용규 추출물이 HIV-I 역전사 효소(reverse transcriptase, 이하 "RT"라 약칭함)의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 RT 검출 킷트(RT-Detect^TM kit NEK-070A)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 ELOSA(Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay)를 수행하였다. RT 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-I RT(10 U/㎕, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.1, 1 mM 디티오트레이톨, 50% 글리세롤)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 효소완충액(100 m M Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM KCl, 1 mM EDTA, 3 mM 디티오트레이톨, 0.3%(v/v) 트리톤 X-100, 10%(v/v) 글리세롤)에 0.005 U/㎕ 농도로 희석하여 사용하였다. 프라이머가 부착된 RNA 주형(Dupont medical products, Boston, MA, USA)과 트리포스페이트-DNA 뉴클레오시드를 반응혼합물 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 40 mM MgCl₂)에 희석하여 반응혼합물(reaction mixture)을 제조하였다. 반응혼합물 완충액 10 ㎕, 반응혼합물 20 ㎕, 효소완충액 5.2 ㎕와 함께 용규 추출물 4 ㎕(100 ㎍/㎖)를 500 ㎕ 테스트 튜브(ependorf)에 넣고 37℃에서 4분간 예비 배양하였다. 예비 배양된 튜브에 RT 효소 0.8 ㎕를 가하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 시키고 90℃에서 1분간 가열하여 역전사 반응을 정지시켰다. 반응을 마친 RNA 주형에 알칼리용액(5.62% 포타슘 하이드록사이 드, 94.38% 물) 10 ㎕를 넣어 37℃에서 15분간 가수분해한 후, 완충액(13.6% 소듐 포스페이트, 모노베이직 모노하이드레이트, 86.4% 물)으로 중화하였다. ELOSA 반응을 위해 중화시킨 반응액 50 ㎕를 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트 웰에 옮기고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)-표지된 검출 프로브와 바이오틴-표지된 포착(capture) 프로브를 포함하는 ELOSA 용액 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다(Weber, P. C. et al., Science, 1989, 243:85-88). 반응이 종료된 후, 마이크로플레이트 웰에 남은 시약이나 가수분해된 RNA를 제거하기 위해 세척액(2-클로로아세트아미드 용액 20ㅧ)을 증류수로 희석하여 3회 세척하였다. 세척된 마이크로플레이트에 형광검출액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 서브스트레이트 용액) 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 정지액(2.2% 시트르산, 1.5% HCl, 1.5% 황산, 94.8% 물) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다(Josephy, P. D. et al., Journal of Biological Chemistry, 1989, 257:3669-3675). 반응이 완료된 반응액에 대하여 분광기(spectrophotometer)(Biorad 3550-UV)(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 RT 활성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

그 결과, 용규의 메탄올 추출물의 억제효과는 미미하였으나(도 3), 용규의 물 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도에서 17.4%의 억제활성을 보였다(도 2).

<2> HIV-I 프로테아제 활성 억제

용규 추출물이 HIV-I의 바이러스 증식에 관련된 효소인 프로테아제(protease)의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 유전자 재조합으로 생산된 HIV-I 프로테아제(PR)에 의한 기질의 절단정도를 HPLC로 측정하였다. 사용된 효소원은 쿠수모토 등의 방법(Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995, 9:180-184)에 의해준비하였다. 구체적으로, HIV-I 프로테아제를 코딩하는 DNA를 발현시키는 대장균 균주인 JM 105(Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995, 9:180-184)로부터 HIV-I 프로테아제를 수득하였다. 수득한 HIV-I 프로테아제는 [50 mM NaOAc(pH 5.0), 1 mM EDTA-2Na, 2 mM 2-머캅토에탄올]:글리세롤=75:25 용액에 희석하여 사용하였고, (주)단백질 연구소(Osaka, Japan)로부터 구입한 서열번호 1로 기재되는 올리고펩타이드{His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-(pNO₂-Phe)-Glu-Ala-Nle-Ser-NH₂(M.W. 1315)}를 완충액(50 mM NaOAc, pH 5.0)에 2 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 기질로 사용하였다. 상기 올리고펩타이드의 7번째 아미노산 잔기인 pNO₂-Phe를 프로테아제가 인식하여 절단함으로써 서열번호 2로 기재되는 분해산물 (pNO₂-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH₂가 생성된다.완충액 1 ㎕, 기질 1.0 ㎕, 본 발명의 용규 추출물 1 ㎕(100 ㎍/㎖), 효소용액 2 ㎕을 각각 가하여 전량 5 ㎕의 반응 혼합물을 조제하였으며, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 90℃에서 60초간 가열하여 HIV-I 프로테아제 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응이 정지된 반응혼합물을 증류수 35 ㎕로 희석하여 HPLC 분석을 하였다. HPLC 분석 조건으로 컬럼은 컬럼 사이즈 250 ㅧ4 ㎜인 리크로스피어(LiChrospher) 100 RP-18 컬럼(Merck, Darmstadt, FRG)을 사용하였고, 용매는 0.1% TFA와 아세토니트릴(20%-50% 농도구배)로 하였으며, 유속은 1.0 ㎖/분으로 하고, 분석은 UV 파장 280 nm로 설정하여 HPLC 기기(System controller: Shimadzu SCL-6B, Pump: Shimadzu LC-9A, Detector: Shimadzu SPD-6A(UV spectrophotometric detector), Recorder ＆ integrator: Shimadzu C-R6A Chromatopac)로 수행하였다(도 1).

상기 분석결과에 의하여 본 발명의 추출물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 유전자 재조합을 이용하여 제조된 HIV-I 프로테아제에 대하여 32.6%(물 추출물) 및 24.6%(메탄올 추출물)의 우수한 효소 억제 활성을 보이는 것으로 나타났다(도 2 및 도 3).

<3> 글루코시다제 활성 억제

본 발명의 용규 추출물이 글루코시다제 활성을 억제하는지 확인하기 위해 기질인 ρ-니트로페닐-α-D-글루코시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucoside)를 절단하는 α-글루코시다제의 활성 정도를 분광기로 측정하였다. 글루코시다제 활성 분석에 사용한 α-글루코시다제는 사카로마이세스 속 균주(Saccharomyces sp.)에서 얻은 α-글루코시다제(Toyobo Company, Osaka, Japan)를 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0, 20% 글리세롤)에 0.5 U/㎖ 농도로 희석하여 사용하였으며, α-글루코시다제가 절단하는 기질은 ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)(Nacalai Tesque Inc., Osaka, Japan)를 멸균 증류수에 10 mM 농도로 희석하여 사용하였다. 완충액(100 mM 소듐포스페이트, pH 7.0) 50 ㎕, 기질 용액 100 ㎕ 및 용규 추출물 20 ㎕(100 ㎍/㎖)을 혼합하여 α-글루코시다제 반응액을 제조하였으며, 이를 37℃에서 5분간 예비 반응시킨 후 α-글루코시다제 30 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 효소 반응 하였다. 효소반응 정지액(0.2 M sodium carbonate) 140 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 반응액을 마이크로플레이트 웰에 옮겨 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-글루코시다제 활성 억제(%)는 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

그 결과, 용규의 물 추출물 및 메탄올 추출물의 글루코시다제에 대한 억제 활성은 미미한 것으로 나타났다.

<실험예 2> 용규 추출물이 HIV-I 증식에 미치는 영향

본 발명의 용규 추출물이 HIV-I의 증식을 억제하는지 확인하기 위해 오타케 등의 방법(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)에 따라 HIV-I 증식 억제 활성을 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 HTLV-1에 감염된 MT-4 세포주(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)를 사용하였으며, 상기 세포를 페니실린 G(Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 100 U/㎖, 스트렙토마이신(Meiji Seika, Tokyo, Japan) 100 ㎍/㎖ 및 10% 우태아 혈청(fetal calf serum, FCS)(Flow Laboratories, North Ryde, Australia)이 제공되는 RPMI-1640 배지(Flow Laboratories, Irvine, Scotland)에서 5% CO₂와 37℃를 유지하면서 배양하였다. 바이러스는 MOLT-4/HTLV-3Ⅲ_B 세포(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)로부터 얻은 HIV-I(strain HTLV-Ⅲ_B)을 이용하였다. 먼저, HIV-I(HTLV-Ⅲ_B)을 이용하여 MT-4 세포를 50%-조직 배양 감염 농도(tissue culture infective dose, TCID₅₀)에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포를 RPMI-1640 배지에서 1 ×10⁵ 세포수/㎖로 재현탁시켜 96웰 배양 플레이트에 웰당 200 ㎕씩 넣고, 동시에 본 발명의 용규 추출물 각각을 0 내지 100 ㎍/㎕ 농도로 첨가하여 5일간 배양하였다. 용규 추출물을 첨가하지 않은 HIV-I에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. HIV 증식 억제제인 3'-아지도-3'데옥시티미딘(3'-Azido-3'-deoxythymidine)(AZT or zidovudine)과 덱스트란 설페이트 8000(DS8000)(Sigma (St. Louis, Mo.)을 각각 첨가한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 배양후 광학현미경으로 관찰하여 MT-4세포에 대한 HIV-I 유도 세포변성(CPE, cytopathic effect)을 완전히 억제하는 농도(IC₁₀₀, inhibitory concentration) 및 세포독성(CC₀, cytotoxic concentration)을 일으키는 용규 추출물의 첨가 농도를 확인하였다. MT-4 세포의 생존력이 감소되지 않은 정도를 세포독성이 없는 것으로 하였다.

그 결과, 용규의 물 추출물이 100 ㎍/㎖ 농도에서 바이러스 증식을 완전히 억제하는 것으로 나타났으며 세포독성을 거의 일으키지 않음을 알 수 있었다(표 1).

시료	IC₁₀₀(㎍/㎖)	CC₀(㎍/㎖)
물 추출물	100	>100
메탄올 추출물	-	>100
AZT	0.00195	>1
DS8000	0.97	>1000

<실험예 3> 용규 추출물의 급성독성 실험

본 발명의 용규 추출물을 직접 투여하였을 때 독성을 나타내는지 확인하기 위해 마우스와 랫트를 이용한 급성독성시험을 수행하였다. ICR계 마우스(28 ± 6 g)와 스프라그 도우리계 랫트(250 ± 12 g)를 사용하였으며, 각각 15마리씩 5군으로 나누었다. 본 발명의 용규 물 추출물을 각각 5, 20, 100 및 500 ㎎/㎏의 용량 으로 마우스 및 랫트에 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰하였다. 대조군으로는 물을 투여하였다.

그 결과, 5군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서, 본 발명의 용규 줄기 물 추출물은 경구투여시 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

본 발명의 용규 추출물을 함유하는 AIDS 치료제는, HIV 관련 효소인 HIV-I 역전사효소 및 HIV-I 프로테아제에 대한 우수한 억제활성을 가지며 HIV-I 증식억제 능력이 뛰어날 뿐 아니라 독성이 적어, AIDS를 치료하고 진행을 억제시키며 감염을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> A therapeutic agent for AIDS containing extract of Solani nigri Herba. <130> 4p-08-47 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate of HIV-1 protease <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> AMIDATION <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> ,Nle <400> 1 His Lys Ala Arg Val Leu Phe Glu Ala Xaa Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrolysate of peptide represented by SEQ. ID. No. 1 <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> AMIDATION, <400> 2 Phe Glu Ala Xaa Ser 1 5

Claims

용규 추출물을 함유하는 AIDS 치료제.
용규 추출물을 함유하는 HIV-I 역전사 효소 억제제.
용규 추출물을 함유하는 HIV-I 프로테아제 억제제.
용규 추출물을 함유하는 HIV-I 증식 억제제.
제 1항에 있어서, 상기 용규 추출물이 물, 알코올 또는 알코올수용액으로 추출되는 것을 특징으로 하는 AIDS 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 용규 추출물이 메탄올로 추출되는 것을 특징으로 하는 AIDS 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 용규 추출물이 물로 추출되는 것을 특징으로 하는 AIDS 치료제.