KR20130117942A

KR20130117942A - Ｈｉｖ 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료제

Info

Publication number: KR20130117942A
Application number: KR1020120040698A
Authority: KR
Inventors: 유영법
Original assignee: 남부대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2012-04-19
Publication date: 2013-10-29
Also published as: WO2013157697A1

Abstract

본 발명은 HIV 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 능소화 추출물은 HIV 역전사효소 활성 억제, 프로테아제 활성 억제, 글루코시다제 활성 억제 및 HIV 증식 억제 활성이 뛰어나므로 AIDS를 치료하고, 진행을 억제시키고, 감염을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＩＶ 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료제{Composition comprising the extract of Campsis Grandiflora for inhibiting human immunodeficiency virus and therapeutic agent for AIDS comprising thereof}

본 발명은 AIDS 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HIV 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것이다.

레트로바이러스(retrovirus)의 한 종이며 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)의 병인자(aetiological agent)인 HIV-I(human immunodeficiency virus type Ⅰ)은 RNA를 유전적 모태로 하고 있다(Kaminchik, J. et . al., AIDS res . hum . retroviruses , 1994, 10: 1003-1010; Peliska, J.A. et . al., Science , 1992, 258:1112-1118). HIV-I은 표면 단백질(surface protein)인 당단백질 120(glycoprotein 120, gp120)이 헬퍼 T 세포(helper T cell)의 CD4⁺ 수용체와 작용한 후(Weiss, S. et . al., Gene , 1992, 111:183-197; Hoxie, J.A. et . al., J. Immunol ., 1986, 136:361-363) RNA를 숙주 세포에 삽입하고 역전사효소(reverse transcriptase, RT)(Prasad, V.R. and Goff, S.P. Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 1989, 86:3104-3108)에 의해 바이러스(viral) DNA로 전사되어 숙주의 염색체에 전구바이러스(proviral) DNA 형태로 존재한다. 숙주세포에서 잠복기를 거쳐 유전자가 발현될 때 RNA 중합효소(polymerase)에 의해 바이러스 mRNA가 생산되고, 프로테아제(protease, PR)에 의해 바이러스 단백질의 프로세싱(processing)이 이루어진다(Katz, R.A. and Skalka, A.M., Annu . Rev . Biochem., 1994, 63:133-173). 글루코시다제(glucosidase, GL) 등의 작용으로 바이러스 표면 당단백질이 형성되어(Taylor, D.L., Antimicrobacterial Agents & Chemotherapy, 1994, 38(8):1780-1787; Mohan, P., Pharmaceutical Research , 1992, 9(6):703-714) 성숙한 바이러스 입자(mature virion)로 발아된다. 이렇듯 바이러스가 헬퍼 T 세포 등에 자신의 유전자를 삽입하고 잠복기를 거쳐 자신을 복제하는 과정에서 숙주 세포를 파괴함으로써 인간의 면역기전에 심각한 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다.

HIV-I을 치료하기 위한 화학적 치료법(chemotherapy)으로는 수마린(suramin)과 같은 약물이 사용되고(Mitsuya, H. et . al., Science , 1984, 226:172-174), HIV-I의 역전사효소를 억제하기 위한 약물로는 뉴클레오시드 아날로그(nucleoside analogues)인 아지오티미딘(azidothymidine, AZT)(Ostertag, W. et . al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA ., 197, 471:4980-4985), 디다노신(didanosine, ddI) 및 잘시타빈(zalcitabine, ddC) 등이 사용되며, 비-뉴클레오시드 아날로그인 TIBO, 네비라핀(nevirapine) 및 피리디논(pyridinone) 등이 임상에서 사용되고 있다. 그러나, AZT는 장기 투여할 경우 근질환(myopathy)(Schroder, J.M. et . al., Acta Neuropathologica , 1996, 92(2):138-149)과 구강 점막 착색증(Tadini, G. et . al., Archives of Dermatology , 1991, 127(2):267-268) 등을 유발하는 부작용이 있다. 또한, ddI의 경우는 췌장염을 일으킨다고 보고되어 있다(Levin, T.L. et . al., Pediatric Radiology , 1997, 27(2):189-191).

따라서, 현재까지 사용되고 있는 AIDS 치료 약물은 부작용이 많기 때문에 이를 대체하기 위한 다양한 치료 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에 부합하여, 최근에는 천연물을 이용한 AIDS 치료약물 개발이 활성화되고 있다. 그 예로, 고시폴(gossypol)과 그 합성 유도체(Prusoff, W. et . al., Pharmacology & Therapeutics , 1993, 60(2):315-329), 해양 천연 알카로이드인 피리도[4,3,2-mn]티아졸로[5,4-b]아크리딘(pyrido[4,3,2-mn]thiazolo[5,4-b]acridine)(Taraporewala, I.B. et . al., J. Med . Chem ., 1992, 35(15):2744-2752), 탄닌(Nakashima, H. et . al., Antiviral Research , 1992, 18:91-103), 플라보노이드(Kusumoto, I.T. et . al., Shoyakugaku Zasshi , 1993, 47:291-294) 등이 HIV-I 억제 활성을 가진다고 보고 되었다. 또한, HIV 억제 활성을 가진 물질을 찾기위한 천연물 엑스의 광범위한 스크리닝이 행해지고 있는 실정이다(유 등, 한국생약학회지, 1998, 29(4):338-346; Kusumoto, I.T. et . al., Phytother . Res ., 1995. 9:180-184).

능소화(Campsis grandifolia K. Schum)는 능소화과(Bignoniaceae)에 속하는 길이 10m의 낙엽활협 덩굴성 식물로 내한성이 약하여 중국 중부이남이 원산지이다. 잎은 마주나기하며 달걀모양이고 기수 1회 우상복엽으로 가장자리에 톱니가 있다. 열매는 삭과이고 꽃은 8-9월에 피고, 지름 6-8 cm 주홍색으로 능소화라 한다. 한방에서는 잎을 능소화 혹은 자위화(紫花), 근(根)을 자위근(紫根), 경엽(莖葉)은 자위경엽(紫莖葉)이라하여 약용으로 사용한다. 능소화는 7-9월에 꽃을 채취한 것을 사용하며 혈(血 )의 열을 낮추는 량혈(凉血), 혈의 정체를 제거하는 거어(祛瘀)의 효능이 있어 혈체, 월경불순, 토혈 등의 치료에 사용한다. 자위근은 량혈(凉血), 거풍(祛風), 산어(散瘀)의 효능이 있어 피부 소양(瘙痒), 통풍(痛風)등의 치료에 사용되어 오고 있다(Kim et al., J. Korean Soc . Appl. Biol . Chem ., 2004. 47(3):357-360).

능소화의 화학성분으로는 acetoside, oleanolic acid, ulsolic acid, beta-sitosterol, daucosterol 등 지용성 성분들이 밝혀져 있으며(Zhang et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2011 36(8):1043-1045), 잎에서는 cachinol 과 1-O-methyl cachinol등 iridoid 성분이 보고되어 있다(Jin et al., Planta Med ., 2005 71(6): 578-580). 약리활성으로는 cholesterol acyltransferase inhibitors로서 maslinic acid, corosolic acid, 23-hydorxyursolic acid, arjunolic acid 성분이 알려져 있으며(Kim et al., Arch . Pharm. Res ., 2005. 28(5):550-556), 능소화의 에탄올 추출물의 항산화, 항염증활성이 보고되었으며(Cui et al., J. Ethnopharmacol ., 2006. 103(2):223-228), oleanolic acid, hederagenin, ursolic acid, tormentic acid, myrianthic acid 등 triterpenoid 성분들의 항혈전작용이 보고되어 있다(Jin et al., Arch. Pharm . Res ., 2004. 27(4): 376-380). 또한 ursolic acid의 인슐린수용체 활성화 관한 보고가 있으나(Jung et al., Biochem . J., 2007. 403(2):243-250)능소화의 줄기 및 잎으로부터 HIV-1 억제 활성에 관해서는 아직까지 보고되지 않고 있다.

이에 본 발명자들은 물 또는 메탄올을 이용하여 능소화로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물이 HIV 역전사 효소, 프로테아제 및 글루코시다제 및 HIV 바이러스 증식 억제 활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 물, 알코올 또는 물과 알코올 혼합물을 이용하여 추출한 능소화 추출물 및 상기 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 능소화 추출물은 수용성 추출물 또는 알코성 추출물 또는 유기용매 추출물일 수 있다. 상기 능소화는 능소화의 잎, 줄기, 꽃, 옆병 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 알코올은 저급 알코올일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 메탄올 또는 에탄올의 10 내지 100중량 %의 수용액일 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 HIV 바이러스이다.

본 발명은 또다른 형태는 능소화를 준비하는 단계; 및 수용액 또는 알코올에 의해 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법을 제공한다. 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 메탄올 또는 에탄올의 10내지 100중량%의 수용액일 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스일 수있으며, 바람직하게는 에이즈 바이러스이다.

본 발명의 또 다른 형태는 바이러스 억제기능이 있는 능소화 추출물를 포함하는 기능성 건강 보조 식품 조성물을 제공한다. 상기 능소화 추출물은 메탄올 또는 에탄올 추출물일 수 있다. 상기 바이러스른 레트로바이러스일 수 있고, 바람직하게는 에이즈 바이러스이다.

본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 글로코시다제 억제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 역전사효소 억제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 프로테아제 억제제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 능소화의 잎, 줄기 또는 옆병을 물 또는 메탄올을 용매로 사용하여 환류추출한 후 감압농축하여 동결건조해 추출물 1 내지 추출물 4를 제조하였다(표 1 참조). 구체적으로는 능소화 잎의 물 추출물(추출물 1), 잎의 메탄올 추출물(추출물 2), 줄기의 물 추출물(추출물 3), 줄기의 메탄올 추출물(추출물 4) 을 제조하였다.

본 발명의 능소화 추출물이 AIDS의 주요 병인인 HIV 증식 관련 효소 활성 및 HIV 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 본 발명에서 추출한 추출물 1 내지 추출물 4을 사용하여 AIDS 억제 실험을 실시한 결과, 본 발명의 추출물은 추출 부위 및 추출 용매에 따라 약간의 차이가 있지만 대부분이 HIV-I 역전사효소 억제 활성(표 2 참조), 프로테아제 억제 활성(표 3 및 도 1 참조), 글루코시다제 억제 활성(표 4 참조) 및 HIV-I 증식 억제 활성(표 5 및 도 2 참조)을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 레트로바이러스의 한 종이며, AIDS의 주요한 병인자인 HIV의 증식을 억제하는 능력이 뛰어난 본 발명의 능소화 추출물은 AIDS를 억제하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제를 제공한다.

본 발명의 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 제제는 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 능소화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 AIDS 치료제에 있어서, 능소화 추출물의 유효용량은 10 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 10 내지 100 ㎎/㎏이며, 1 내지 3회 투여될 수 있다.

상기 결과로부터, 본 발명의 능소화 추출물은 HIV 관련 효소 활성 억제 및 HIV 복제억제 능력이 뛰어나므로 AIDS 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 동물실험에서 능소화 추출물에 대한 안정성을 확인하여 식품 또는 의약품으로의 사용 가능성이 높다.

도 1은 본 발명의 능소화 추출물이 HIV-I 프로테아제의 활성을 억제함을 확인한 기질의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 능소화 추출물의 HIV 복제억제 활성을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 능소화 추출물의 제조

능소화의 잎, 줄기를 채취하여 세척하고 통풍이 잘되는 것에서 음지건조하였다. 건조된 능소화 시료 5 g에 물 100 ㎖ 또는 100% 메탄올 100 ㎖을 넣어 3시간 동안 환류추출하였다. 추출된 용액을 감압농축하고 동결건조하였다. 메탄올 추출물의 경우 메탄올의 최종농도가 2%를 넘지 않게 동결건조하여 활성실험의 재료로 사용하였다. 시료는 활성실험시에 멸균된 증류수나 DMSO에 100 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다(표 1).

사용부위	추출 용매	추출물
잎	물	추출물 1
잎	메탄올	추출물 2
줄기	물	추출물 3
줄기	메탄올	추출물 4

<실시예 2> 능소화 추출물이 HIV 관련효소 활성에 미치는 영향

<2-1> HIV-I 역전사 효소 활성 억제

본 발명의 능소화 추출물이 HIV 역전사 효소(reverse transcriptase, 이하 RT라 약칭함)의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 RT 검출 킷트(RT-Detect^TM kit NEK-070A)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 이용하여 제조사의 방침에 따라 ELOSA(Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay) 방법으로 수행하였다. RT 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-I RT(10 U/㎕, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.1, 1 mM 디티오트레이톨, 50% 글리세롤)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 효소완충액(100 m M Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM KCl, 1 mM EDTA, 3 mM 디티오트레이톨, 0.3%(v/v) 트리톤 X-100, 10%(v/v) 글리세롤)에 0.005 U/㎕ 농도로 희석하여 사용하였다. 프라이머가 부착된 RNA 주형(Dupont medical products, Boston, MA, USA)과 트리포스페이트-DNA 뉴클레오시드를 반응혼합물 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 40 mM MgCl₂)에 희석하여 반응혼합물(reaction mixture)을 제조하였다. 역전사 효소의 활성억제 반응은 반응혼합물 완충액 10 ㎕, 반응혼합물 20 ㎕, 효소완충액 5.2 ㎕와 함께 각각의 능소화 추출물 4 ㎕(100 ㎍/㎖)를 500 ㎕ 테스트 튜브(ependorf)에 넣고 37℃에서 4분간 예비 배양하였다. 예비 배양된 튜브에 RT 효소 0.8 ㎕를 가해 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 시키고 90℃서 1분간 반응시켜 역전사 반응을 정지시켰다. 반응을 마친 RNA 주형에 알칼리용액(5.62% 포타슘 하이드록사이드, 94.38% 물) 10 ㎕를 넣어 37℃에서 15분간 가수분해한 후, 완충액(13.6% 소듐 포스페이트, 모노베이직 모노하이드레이트, 86.4% 물) 10 ㎕를 넣어 중화하였다. 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트 웰에 ELOSA 반응을 위해 중화시킨 반응액 50 ㎕를 옮기고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)-표지된 검출 프로브와 바이오틴-표지된 포착(capture) 프로브를 포함하는 ELOSA 용액 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다(Weber, P. C. et al., Science, 1989, 243:85-88). 반응이 끝나고 난 뒤 마이크로플레이트 웰에 남은 시약이나 가수분해된 RNA를 제거하기 위해 마이크로플레이트 세척기(Immunowash model 1250)(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)에서 세척액(2-클로로아세트아미드 용액)으로 3회 세척하였다. 세척한 마이크로플레이트에 형광검출액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 서브스트레이트 용액) 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 정지액(2.2% 시트릭산, 1.5% HCl, 1.5% 설퍼릭산, 94.8% 물) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다(Josephy, P. D. et al., Journal of Biological Chemistry, 1989, 257:3669-3675). 반응이 완료된 반응액은 분광기(spectrophotometer)(Biorad 3550-UV)(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 RT-활성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

그 결과, 능소화로 부터 추출한 본 발명의 추출물 1, 2 및 4는 역전사 효소 억제 활성이 낮거나 거의 없었으며, 능소화 추출물 3 은 100 ㎍/㎖ 농도에서 각각 37.9 %의 HIV 역전사 효소 억제 활성을 나타내었다(표 2).

추출물(100 ㎍/㎖)	역전사효소 억제(%)
추출물 1	5.0 ± 1.7
추출물 2	4.1 ± 0.5
추출물 3	37.9± 3.3
추출물 4	ND

상기에서 ND는 검출되지 않은 것을 나타낸다.

<2-2> HIV 프로테아제 활성 억제

능소화 추출물이 HIV의 바이러스 복제에 관련된 효소인 프로테아제(protease)의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 유전자 재조합으로 생산된 HIV-1 프로테아제에 의한 기질의 절단정도를 HPLC로 측정하였다. 사용된 효소원은 쿠수모토 등의 방법(Kusumoto, I.T. et . al., Phytother . Res ., 1995, 9:180-184)에 의해준비하였다. 구체적으로, HIV-I 프로테아제를 코딩하는 DNA를 발현하는 대장균 균주인 JM 105(Kusumoto, I.T. et . al., Phytother . Res ., 1995, 9:180-184)로부터 HIV-I 프로테아제를 수득하였다. 수득한 HIV-I 프로테아제는 [50 mM NaOAc(pH 5.0), 1 mM EDTA-2Na, 2 mM 2-머캅토에탄올]:글리세롤=75:25 용액에 희석하여 사용하였고, (주)단백질 연구소(Osaka, Japan)로부터 구입한 서열번호 1로 기재되는 올리고펩타이드{His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-(pNO₂-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH₂(M.W. 1315)}를 완충액(50 mM NaOAc, pH 5.0)에 2 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 기질로 사용하였다. 상기 올리고펩타이드는 7번째 pNO₂-Phe를 프로테아제가 인식하여 절단함으로써 서열번호 2로 기재되는 분해산물 (pNO₂-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH₂가 생성된다.완충액 1 ㎕, 기질 1.0 ㎕, 본 발명의 능소화 추출물 1 ㎕(100 ㎍/㎖), 효소용액 2 ㎕을 각각 가하여 전량 5 ㎕의 반응 혼합물을 조제하였으며, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 90℃에서 60초간 가열하여 HIV-I 프로테아제 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응이 정지된 반응혼합물을 증류수 35 ㎕로 희석하여 HPLC 분석을 하였다. HPLC 분석 조건으로 컬럼은 컬럼 사이즈 250 ×4 ㎜인 리크로스피어(LiChrospher) 100 RP-18 컬럼(Merck, Darmstadt, FRG)을 사용하였고, 용매는 0.1% TFA와 아세토니트릴(20%-50% 농도구배)로 하였으며, 유속은 1.0 ㎖/분으로 하고, 분석은 UV 파장 280 nm로 설정하여 HPLC 기기(System controller:Shimadzu SCL-6B, Pump:Shimadzu LC-9A, Detector:Shimadzu SPD-6A(UV spectrophotometric detector), Recorder ＆ integrator:Shimadzu C-R6A Chromatopac)로 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 능소화 추출물은 추출물 2와 추출물 4에서 프로테아제 억제 활성이 33.6%와 31.5% 로 나타나 가장 억제 활성이 높은 추출물임을 알 수 있었다(표 3 및 도 1).

추출물 (100 ㎍/㎖)	프로테아제억제(%)
추출물 1	18.8 ± 2.5
추출물 2	33.6 ±3.6
추출물 3	13.4 ±2.3
추출물 4	31.5 ±3.2

<2-3> 글루코시다제 활성 억제

본 발명의 능소화 추출물이 글루코시다제 활성을 억제하는지 확인하기 위해 기질인 ρ-니트로페닐-α-D-글루코시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucoside)를 절단하는 α-글루코시다제의 활성 정도를 분광기로 측정하였다. 글루코시다제 활성 분석에 사용한 α-글루코시다제는 사카로마이세스 속 균주(Saccharomyces sp .)에서 얻은 α-글루코시다제(Toyobo Company, Osaka, Japan)를 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0, 20% 글리세롤)에 0.5 U/㎖ 농도로 희석하여 사용하였으며, α-글루코시다제가 절단하는 기질은 ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)(Nacalai Tesque Inc., Osaka, Japan)를 멸균 증류수에 10 mM 농도로 희석하여 사용하였다. 완충액(100 mM 소듐포스페이트, pH 7.0) 50 ㎕, 기질 용액 100 ㎕ 및 능소화 추출물 20 ㎕(100 ㎍/㎖)을 혼합하여 α-글루코시다제 반응액을 제조하였으며, 이를 37℃에서 5분간 예비 반응시킨 후 α-글루코시다제 30 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 효소 반응 하였다. 효소반응 정지액(0.2 M sodium carbonate) 140 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 반응액을 마이크로플레이트 웰에 옮겨 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-글루코시다제 활성 억제(%)는 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

그 결과, 능소화로부터 추출한 추출물 1, 2 및 3 은 글루코시다제 억제 활성을 나타내지 않았지만 추출물 4 는 약한 글루코시다제 억제 활성을 가짐을 알 수 있었다(표 4).

추출물(100 ㎍/㎖)	글루코시다제 억제(%)
추출물 1	2.3 ± 2.1
추출물 2	5.2 ± 2.6
추출물 3	2.2 ± 2.3
추출물 4	10.5 ± 3.2

<실시예 3> 능소화 추출물이 HIV 복제에 미치는 영향

본 발명의 능소화 추출물이 HIV-I의 복제를 억제하는지 확인하기 위해 오타케 등의 방법(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines , 1994, 11:188-193)에 따라 HIV-I 복제 억제 활성을 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 HTLV-1에 감염된 MT-4 세포주(Otake, T. et . al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)를 사용하였으며, 상기 세포는 페니실린 G(Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 100 U/㎖, 스트렙토마이신(Meiji Seika, Tokyo, Japan) 100 ㎍/㎖ 및 10% 우태아 혈청(fetal calf serum, FCS)(Flow Laboratories, North Ryde, Australia)이 제공되는 RPMI-1640 배지(Flow Laboratories, Irvine, Scotland)에서 5% CO₂와 37℃를 유지하면서 배양하였다. 바이러스는 MOLT-4/HTLV-3Ⅲ_B 세포(Otake, T. et . al., J. Traditional medicines , 1994, 11:188-193)로부터 얻은 HIV-I(strain HTLV-Ⅲ_B)을 이용하였다. 먼저, HIV-1(HTLV-Ⅲ_B)을 이용하여 MT-4 세포를 50%-조직 배양 감염 농도(tissue culture infective dose, TCID₅₀)에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포를 RPMI-1640 배지에서 1 ×10⁵ 세포수/㎖로 재현탁시켜 96웰 배양 플레이트에 웰당 200 ㎕씩 넣고, 동시에 본 발명의 능소화 추출물 각각을 0 내지 100 ㎍/㎕ 농도로 첨가하여 5일간 배양하였다. 능소화 추출물을 첨가하지 않은 HIV-1에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포를 대조군으로 하였다. HIV 증식 억제제인 3-아지도-3데옥시티미딘(3'-Azido-3'-deoxythymidine)(AZT or zidovudine)과 덱스트란 설페이트 8000(DS8000)(Sigma (St. Louis, Mo.)을 각각 첨가한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 배양후 광학현미경으로 관찰하여 MT-4세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성(CPE, cytopathic effect)을 완전히 억제하는 농도(IC₁₀₀, inhibitory concentration) 및 세포독성(CC₀, cytotoxic concentration)을 일으키는 능소화 추출물의 첨가 농도를 확인하였다. MT-4 세포의 생존력이 감소되지 않은 정도를 세포독성이 없는 것으로 하였다.

그 결과, 본 발명의 능소화 추출물이 HIV 바이러스 증식(복제)을 완전히 억제하는 최소농도는 추출물 2와 3이 100 ㎍/㎖로 나타났으며(표 5), 처리 농도가 증가함에 따라 HIV 바이러스 증식 억제 활성도 증가하였다(도 2). 그러나, 추출물 1 및 추출물 4는 바이러스 증식 억제 활성이 없었다(표 5).

또한, 본 발명의 능소화 추출물을 처리하여 배양하였을 때 세포독성을 나타내는 최소농도는 추출물 1 내지 추출물 4 모두 100 ㎍/㎖ 이상으로 나타나 세포독성을 거의 일으키지 않음을 알 수 있었다(표 5).

추출물	MT-4/HIV-1 바이러스 복제를 완전히 억제하는 최소농도(㎍/㎖)	세포독성을 일으키는 최소농도(㎍/㎖)
추출물 1	NE	>100
추출물 2	NE	>100
추출물 3	100	>100
추출물 4	NE	>100

NE는 활성이 없음을 뜻한다.

<실시예 3> 능소화 추출물의 급성독성 실험

본 발명의 능소화 추출물을 직접 투여하였을 때 독성을 나타내는지 확인하기 위해 마우스와 랫트를 이용한 급성독성시험을 수행하였다. ICR계 마우스(28 ± 6 g)와 스프라그 도우리계 랫트(250 ± 12 g)를 사용하였으며, 각각 15마리씩 5군으로 나누었다. 본 발명의 능소화 줄기 물 추출물을 각각 5, 20, 100 및 500 ㎎/㎏의 용량으로 마우스 및 랫트에 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰하였다. 대조군으로는 물을 투여하였다.

그 결과, 5군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서, 본 발명의 능소화 줄기 물 추출물은 경구투여시 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

<110> YU, Young-Beob <120> Extract of Campsis grandiflora having inhibitory effect on replication of human immunodeficiency virus and therapeutic agent for AIDS containing the same <130> 3p-08-19 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate of HIV-1 protease <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> AMIDATION, <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> ,Nle <400> 1 His Lys Ala Arg Val Leu Phe Glu Ala Xaa Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrolysate of peptide represented by SEQ. ID. No. 1 <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> AMIDATION, <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> ,Nle <400> 2 Phe Glu Ala Xaa Ser 1 5

Claims

능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 능소화 추출물은 수용성 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 능소화 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 3 항에 있어서,
상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 능소화는 능소화의 잎, 줄기, 꽃, 옆병 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물.
능소화를 준비하는 단계; 및
상기 능소화를 수용액 또는 알코올에 의해 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
바이러스를 억제하는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
제 12 항에 있어서,
상기 능소화 추출물은 수용성 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
제 12 항에 있어서,
상기 능소화 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
제 14 항에 있어서,
상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 글로코시다제 억제제.
능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 역전사효소 억제제.
능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 프로테아제 억제제.