JPH1135476A - ノウゼンカズラ科植物の有機抽出物を含有する抗ｃ型肝炎ウイルス剤及びプロテアーゼｎｓ３の特異的阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 作用機序が明確であり、安定した薬効を発揮
する抗Ｃ型肝炎ウイルス剤及びＣ型肝炎ウイルスプロテ
アーゼＮＳ３の特異的阻害剤を提供する。 【解決手段】 抗Ｃ型肝炎ウイルス剤及びＣ型肝炎ウイ
ルスプロテアーゼＮＳ３の特異的阻害剤は、ノウゼンカ
ズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｓ）に属する植物の有
機溶媒抽出物を有効成分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ノウゼンカズラ科（Ｂ
ｉｇｎｏｎｉａｃｅａｓ）に属する植物の有機溶媒抽出
物を有効成分として含有する抗Ｃ型肝炎ウイルス剤、及
びＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼＮＳ３の特異的阻害剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｃ Ｖｉｒｕｓ；以下ＨＣＶとも称する）に対して有
効性を有する物質の研究は近年盛んに行われており、現
在までに、２’，３’−ジデオキシ−５−トリフルオロ
メチルウリジン類（特開平５−１４８２６１号公報）、
インドール誘導体（特開平７−５０４６７３号、及び特
開平７−５０４６７４号各公報）、チアジアゾール誘導
体（特開平７−１８８０１７号公報）などの有機物質、
あるいはアンチセンスヌクレオチド類（特開平６−５０
８０２６号、特開平６−２９６４９２号、特開平８−５
０６４７９号各公報）、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ
Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）結合物質
（特開平７−６９８９９号公報）、チモシン（特開平６
−５１０９９８号公報）、並びに混合生薬又はその抽出
物（特開平７−２０６６９４号公報）などが報告されて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
物質はその作用機序が明確でないものが多く、またアン
チセンスヌクレオチド類などでは、作用機序は明らかで
あるが、薬効が不安定であるという問題がある。従っ
て、現在までに開発されてきた抗ＨＣＶ剤は、あまり有
用にされておらず、作用機序が明確であり、安定した薬
効を発揮する抗ＨＣＶ剤が望まれていた。

【０００４】一方、ＨＣＶを構成するタンパク質とし
て、ＮＳ３と呼ばれるプロテアーゼが存在する［Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７１，ｐ．６３７−６３９，１
９８９；及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ Ｖｏｌ．８７，ｐ．２０５７−２０６１，１９
９０］。前記プロテアーゼＮＳ３を阻害することにより
ＨＣＶの活性を抑制できることが近年明らかになってき
ており、そこで、このプロテアーゼＮＳ３の阻害剤を抗
ＨＣＶ剤として利用することが検討されている［ウイル
ス Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．２，ｐ．１０５−１１５，１
９９５；及びＢｉｏ．Ｃｌｉｎ．Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．
９，ｐ．６８８−６９０，１９９６］。しかし、前記の
プロテアーゼＮＳ３はセリンプロテアーゼの一種である
ので、プロテアーゼＮＳ３に対して阻害活性を示して
も、それと同時に他のセリンプロテアーゼ、例えば、ト
リプシン、エラスターゼなども阻害してしまうと、重篤
な副作用の原因となる可能性がある。従って、プロテア
ーゼＮＳ３阻害剤を抗ＨＣＶ剤として利用する場合に
は、プロテアーゼＮＳ３を特異的に阻害することが求め
られる。しかしながら、従来、プロテアーゼＮＳ３を特
異的に阻害する物質は全く知られていない。

【０００５】ところで、南米産の薬草であるカツアヴァ
（ＣＡＴＵＡＢＡ、又はＫＡＴＵＡＶＡ）（一般名）
は、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｓ）に
属する植物であるアネモパエグマ・ミランドゥム・ディ
ー・シー（Ａｎｅｍｏｐａｅｇｍａ ｍｉｒａｎｄｕｍ
ＤＣ．）から調製され、その樹皮又は根の乾燥物が、
南米市場に出回っている。カツアヴァの温水又は冷水の
煎出液は、発汗剤、神経刺激剤、浄血清、又は駆梅剤と
して利用されている。しかし、その抽出成分に関しては
ほとんど報告されておらず、特に抗ウイルス作用につい
ては全く知られていない。

【０００６】本発明者は、プロテアーゼＮＳ３の特異的
阻害剤を鋭意探求したところ、ノウゼンカズラ科に属す
る植物、特に前記カツアヴァの有機溶媒抽出物に、プロ
テアーゼＮＳ３を特異的に阻害する効果があることを見
出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、ノウ
ゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｓ）に属する植
物の有機溶媒抽出物を含有することを特徴とする、抗Ｃ
型肝炎ウイルス剤に関する。また、本発明は、ノウゼン
カズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｓ）に属する植物の
有機溶媒抽出物を含有することを特徴とする、Ｃ型肝炎
ウイルスプロテアーゼＮＳ３の特異的阻害剤にも関す
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明の抗ＨＣＶ剤の有効成分を
抽出するノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａ
ｓ）に属する植物は、特に制限されないが、好ましくは
アネモパエグマ（Ａｎｅｍｏｐａｅｇｍａ）属に属する
植物、例えば、アネモパエグマ・ミランドゥム・ディー
・シー（Ａｎｅｍｏｐａｅｇｍａ ｍｉｒａｎｄｕｍ
ＤＣ．）を挙げることができ、特には、カツアヴァ（Ｃ
ＡＴＵＡＢＡ、又はＫＡＴＵＡＶＡ）を用いるのが好ま
しい。前記植物の任意の部位の１種又は２種以上を組み
合わせて、抽出工程に用いることができるが、葉、茎又
は根を用いるのが好ましく、それらの部位を乾燥させて
から抽出工程に用いるのが特に好ましい。

【０００９】有機溶媒としては、ハロゲン化アルキル若
しくはアルコール（特には水性アルコール）、又はそれ
らの混合物を用いることができる。前記のハロゲン化ア
ルキルとしては、好ましくは、塩素原子１個又はそれ以
上（特には１又は２個）で置換されている炭素数１〜４
個の低級アルキルを用いることができ、具体的には、ク
ロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン（クロ
ロホルム）、４塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタ
ン、トリクロロエタン、又はそれらの混合物、特にはジ
クロロメタン又はトリクロロメタンを用いることができ
る。また、前記のアルコールとしては、好ましくは、炭
素数１〜４個の低級アルコール、例えば、メチルアルコ
ール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、ｉ
−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｉ−ブ
チルアルコール、ｓ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルア
ルコール、又はそれらの混合物、特には、メチルアルコ
ールを用いることができる。

【００１０】抽出工程は、前記のノウゼンカズラ科に属
する植物（特には、カツアヴァ）の適当な部位を、好ま
しくは乾燥させた後で粉砕し、好ましくは室温で、前記
有機溶媒１種又はそれ以上によって抽出し、その有機溶
媒抽出液を、好ましくは減圧下で濃縮することからな
る。得られた濃縮液、若しくは濃縮液を更に濃縮乾固さ
せたもの、又は前記有機溶媒抽出液若しくは前記粗抽出
物を精製処理して得た精製抽出物を、本発明の抗Ｃ型肝
炎ウイルス剤の有効成分として用いることができる。前
記の精製処理方法としては、通常の方法、例えば、各種
のカラムクロマトグラフィーを用いることができ、好ま
しくは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用い
る。

【００１１】本発明による抗Ｃ型肝炎ウイルス剤は、前
記の有機溶媒抽出物の非毒性かつ有効量と、場合により
薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体とか
ら構成することができ、経口的又は非経口的に、動物、
好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することがで
きる。経口投与には舌下投与が含まれ、非経口投与に
は、局所投与（例えば、皮下投与若しくは筋肉内投
与）、静脈投与、直腸投与、又は肺投与などが含まれ
る。

【００１２】本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤は、錠剤、
粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、分散剤、注
射剤、舌下剤、細粒剤、外用剤、軟膏剤、座剤又はテー
プ剤などの各種剤型で用いることができる。これらの各
製剤は、それぞれ、必要により公知の担体（例えば、結
合剤、賦形剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、着色剤、希釈
剤、乳化剤、懸濁化剤、又は充填剤）を用いて、常法に
よって調製することができる。担体としては、例えば、
顆粒剤にトウモロコシデンプン、錠剤に結晶セルロー
ス、カプセル剤に無水ケイ酸、又は注射剤にブドウ糖液
などを用いることができる。本発明による抗Ｃ型肝炎ウ
イルス剤は、有効成分である前記有機溶媒抽出物（濃縮
乾固物）を５〜１００重量％、好ましくは２５〜１００
重量％の量で含有する。投与量は、投与対象、投与ルー
ト及び／又は症状などによっても異なるが、通常０．１
〜２００ｍｇ／ｋｇ／日であり、これを１日１回〜５回
に分けて投与することができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【製造例】本実施例では、カツアヴァから有機抽出物を
得て、精製する工程を説明する。 （１）ジクロロメタン抽出物の調製 南米産のノウゼンカズラ科植物の薬草であるカツアヴァ
の葉及び樹皮の乾燥物約１ｋｇに対して、ジクロロメタ
ン約１リットルを加え、室温で約１カ月浸蹟した後に、
ろ紙上でろ過し、ろ液と残さとを得た。得られたろ液を
ロータリーエバポレーターにより蒸発乾固し、ジクロロ
メタン抽出物を得た。

【００１４】

【活性評価試験例】本実施例では、抗ＨＣＶプロテアー
ゼＮＳ３活性を評価した。具体的には、周藤らの方法
［Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．
１，ｐ．９−１８，１９９６］に準じた方法を用いた。
すなわち、遺伝子組換技術によって大腸菌を用いてＨＣ
ＶプロテアーゼＮＳ３を大量生産する。一方、そのプロ
テアーゼＮＳ３が切断する部位として知られている結合
部（ジャンクション）〔ＮＳ５Ａ−５Ｂ結合〕を含む基
質を人工合成する。前記プロテアーゼＮＳ３と前記基質
とを含む反応系に、被験試料を添加した場合に、前記プ
ロテアーゼＮＳ３による前記基質の切断が阻害されるか
否かを検討する方法によって、抗ＨＣＶプロテアーゼＮ
Ｓ３活性を評価した。

【００１５】（１）ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３の大量生
産 ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３をコードしている遺伝子をＰ
ＣＲ法によって増幅させ、プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｂｅｒａｒｌｙ，マサチューセッツ州，アメリカ
合衆国）に組み込んだ。前記プラスミドを大腸菌ＪＭ１
０９に導入して増殖させた後に、イソプロピル−β−Ｄ
−（−）−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）０．
５ｍＭを添加することによってＨＣＶプロテアーゼＮＳ
３を生産させた。超音波によって菌体を破砕し、遠心分
離器で固液分離した。その液相を回収し、硫酸アンモニ
ウム（７０％）で塩析を行った。この析出物を、緩衝液
（３０ｍＭ−ＮａＣｌ、２ｍＭ−β−メルカプトエタノ
ール及び０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．２）に溶解し、アミロー
ス樹脂カラムに通し、カラムを洗浄し、カラムから結合
物を溶出液（０．５Ｍ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−β−メル
カプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液；ｐＨ７．８）によって溶出して、活性測定用のＨＣ
ＶプロテアーゼＮＳ３を得た。

【００１６】（２）ＮＳ５Ａ−５Ｂ結合の合成 自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ ＰＳＳＭ−８ Ｓｈ
ｉｍａｚｕ，京都，日本）により、式： ダンシル−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍ
ｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ のアミノ酸配列からなり、ＮＳ５Ａ−５Ｂ結合を含む２
０ｍｅｒの人工ペプチドを合成し、活性測定用人工基質
とした。

【００１７】（３）抗ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３活性の
評価 ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３（最終濃度＝０．０６０３μ
Ｍ）１．４μｇと、カツアヴァ抽出物（最終濃度＝１〜
１００μｇ／ｍｌ）とを、緩衝液［３０ｍＭ−ＮａＣｌ
と１ｍＭ−ＣａＣｌ₂ と２ｍＭ（±）−ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）とを含む５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．６）緩衝液］２００μｌに加え充分に攪拌し、３７
℃で１５分間保温した後に、人工基質（最終濃度２６μ
Ｍ）１２μｇを加えて充分に攪拌し、３７℃で１時間保
温した。続いて、２．５Ｍ酢酸４μｌを加えて反応を停
止し、反応液を、分析用ＨＰＬＣ装置（Ｔｙｐｅ ＳＣ
−８０２０，Ｔｏｓｏｈ，東京，日本）によって分析し
た。前記の分析用ＨＰＬＣ装置におけるカラムとして
は、ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（０．４６×１５ｃｍ）
（Ｔｏｓｏｈ，東京，日本）を用い、溶離液としては、
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と０．０９
％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル水溶液との混合液
（勾配＝０：１から１：１）を用いた。１．０ｍｌ／分
の流速で、２０分間かけて溶出し、２１４ｎｍにおける
溶出液の吸光度を連続的にモニターした。

【００１８】分解生成物、すなわち、ペプチド ダンシル−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＯＨ）、及
びペプチド Ｈ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＯＨ を、溶出時間の違いから検出し、それぞれのピークの高
さを検討することによって、人工基質の分解の程度、す
なわちＨＣＶプロテアーゼＮＳ３活性の程度を求めた。
前記抽出物について、５０％の阻害を示した濃度を測定
し、その結果を表１に示す。

【００１９】

【表１】 被検試料 ＨＣＶプロテアーゼＮＳ３阻害活性 カツアヴァ由来抽出物 ４．８（μｇ／ｍｌ）

【００２０】

【参考例】本参考例では、他のセリンプロテアーゼに対
する阻害活性を評価した。前記の製造例で調製したカツ
アヴァ由来抽出物を用いて、他のセリンプロテアーゼ、
すなわち、トリプシン、及びエラスターゼへの阻害活性
を、それらの各プロテアーゼに特異的な蛍光基質を用い
て、以下の方法で評価した。なお、酵素活性は、マルチ
プレート蛍光リーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ，テカンジャ
パン）により、測定（励起３８０ｎｍ、蛍光４６０ｎ
ｍ）した。

【００２１】（１）トリプシンに対する阻害活性の評価 ９６穴マイクロプレート（ＭＳＤ−８５９６，住友ベー
クライト社）内に種々の濃度でカツアヴァ由来抽出物を
入れ、蛍光基質として Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ （式中、Ｂｚはベンゾイル基であり、ＭＣＡは４−メチ
ルクマリル−７−アミドである）で表されるペプチド
［３０９２−ｖ，（株）ペプチド研究所］を最終濃度
０．１ｍＭとなるように加えた。トリプシン（フナコシ
社）水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）４μｌを加え、緩衝液
（０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液；ｐＨ７．８）で最終容量を２００μｌとし、
３７℃で１時間インキュベートし、酵素活性を測定し
た。５０％阻害を示した濃度を、表２に示す。

【００２２】（２）エラスターゼに対する阻害活性の評
価 蛍光基質として Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＭＣＡ （式中、Ｓｕｃはスクシニル基であり、ＭＣＡは４−メ
チルクマリル−７−アミドである）で表されるペプチド
［３１００−ｖ，（株）ペプチド研究所］を最終濃度
０．１ｍＭとなるように加えること、及び、エラスター
ゼ（シグマ社）水溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）４μｌを加
えること以外は、前記（１）に記載の操作を繰り返して
酵素活性を測定した。５０％阻害を示した濃度を表２に
示す。

【００２３】

【表２】セリンプロテアーゼの種類 阻害活性（μｇ／ｍｌ） トリプシン ＞１００エラスターゼ ＞１００

【００２４】

【製剤調製例】前記製造例で得たカツアヴァのジクロロ
メタン抽出物１０重量部と乳糖４２１．０重量部とジャ
ガイモ澱粉５０重量部とをよく混合し、この混合物を流
動層造粒機に入れ、ヒドロキシプロピルセルロース（結
合剤）１８．７５重量部を５％水溶液にして噴霧し、顆
粒を得た。次いで、カルボキシメチルセルロースカルシ
ウム（崩壊剤）２０重量部とステアリン酸マグネシウム
（滑沢剤）１５重量部とを添加して混合した。得られた
混合物を１錠の重量が１２５ｍｇとなるようにして、加
圧成形し錠剤を得た。この錠剤に下記の処方のコーティ
ング液を噴霧して、腸溶性錠剤を得た。 セルロースアセテートフタレート ５．０重量部 ９５％エタノール ４７．５重量部 酢酸エチル ４７．５重量部

【００２５】

【発明の効果】本発明の抗Ｃ型肝炎ウイルス剤は、Ｃ型
肝炎ウイルスのプロテアーゼＮＳ３に特異的な阻害作用
を有するため、Ｃ型肝炎ウイルスの活性を特異的に抑制
することができ、Ｃ型肝炎の予防又は治療の目的に有用
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 昌司 茨城県北相馬郡守谷町みずき野８−２−３ (72)発明者 野崎 浩 岡山県岡山市理大町１−１ 岡山理科大学 内 (72)発明者 周藤 健治 福島県福島市清明町１−40 ネオハイツ荒 川公園302号 (72)発明者 横田 智之 福島県福島市飯坂町平野字北下里20−１ (72)発明者 下遠野 邦忠 京都府京都市伏見区西奉行町官有地 伏見 合同宿舎245

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃ
   ｅａｓ）に属する植物の有機溶媒抽出物を含有すること
   を特徴とする、抗Ｃ型肝炎ウイルス剤。
2. 【請求項２】 ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃ
   ｅａｓ）に属する植物の有機溶媒抽出物を含有すること
   を特徴とする、Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼＮＳ３の
   特異的阻害剤。