WO2013157697A1 - Ｈｉｖ 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료제 - Google Patents

Ｈｉｖ 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료제 Download PDF

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유영법
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV

Definitions

  • the present invention relates to an AIDS therapeutic agent, and more particularly, to a toxin extract having HIV proliferation inhibitory activity and an AIDS therapeutic agent containing the same as an active ingredient.
  • HIV-I Human immunodeficiency virus type I
  • RNA Ribonucleic acid
  • Peliska JA et. al .
  • Science, 1992, 258: 1112-1118 HIV-I is a surface protein glycoprotein 120 (gp120) after the action of the helper T cells CD4 + receptors (Weiss, S. et. Al ., Gene, 1992 , 111: 183-197; Hoxie, JA et. Al ., J.
  • RNA into host cells and reverse transcriptase (RT) (Prasad, VR and Goff, SP Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 3104-3108), which are transcribed into viral DNA and present in the form of proviral DNA on the host chromosome.
  • Viral mRNA is produced by RNA polymerase when the gene is expressed through the incubation period in the host cell, and processing of the viral protein is performed by protease (PR) (Katz, RA and Skalka, AM). , Annu. Rev. Biochem ., 1994, 63: 133-173).
  • Viral surface glycoproteins are formed by the action of glucosidase (GL) (Taylor, DL, Antimicrobacterial Agents & Chemotherapy, 1994, 38 (8): 1780-1787; Mohan, P., Pharmaceutical Research, 1992, 9 (6): 703-714) Germinate into mature virus particles. As such, viruses are known to cause serious impairment of human immune system by inserting their genes into helper T cells and destroying host cells in the process of replicating themselves through incubation period.
  • GL glucosidase
  • drugs such as sumarin are used (Mitsuya, H. et. Al ., Science, 1984, 226: 172-174), and reverse transcription of HIV-I Drugs for inhibiting enzymes include nucleoside analogs azidothymidine (AZT) (Ostertag, W. et. Al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 197, 471: 4980-4985), didanosine (ddI) and zalcitabine (ddC) are used, and non-nucleoside analogs TIBO, nevirapine and pyridinone are used in the clinic. have.
  • AZT azidothymidine
  • ddI didanosine
  • ddC zalcitabine
  • Campsis grandifolia K. Schum is a 10m long deciduous broad-leaved vine-like plant belonging to the Bignoniaceae family.
  • the leaves are opposite each other, egg-shaped, and the rider's right upper lobe is serrated at the edge.
  • Fruits are capsules, flowers bloom in August-September, cinnabar red, 6-8 cm in diameter.
  • the leaves are jacaranda or masturbate ( ⁇ ), the roots ( ⁇ ⁇ ), the roots ( ⁇ ⁇ ), and the foliage ( ⁇ ⁇ ) are used as medicinal leaves.
  • Jacaranda uses flowers collected in July-September, and it has the effect of reducing blood heat, and removing the stagnation of blood.
  • fat-soluble components such as acetoside, oleanolic acid, ulsolic acid, beta-sitosterol and daucosterol have been identified.
  • iridoids such as cachinol and 1-O-methyl cachinol have been reported in leaves (Jin et al ., Planta Med. , 2005 71 (6): 578-580).
  • cholesterol acyltransferase inhibitors are known as maslinic acid, corosolic acid, 23-hydorxyursolic acid and arjunolic acid.
  • the present inventors completed the present invention by preparing an extract from protonation using water or methanol and confirming that the extract has HIV reverse transcriptase, protease and glucosidase and HIV virus proliferation inhibitory activity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting virus, characterized in that it comprises a protonated extract.
  • the protonated extract may be a water-soluble extract or an alcoholic extract or an organic solvent extract.
  • the toxophorization may be selected from the group consisting of leaves, stems, flowers, side diseases, and roots of jacaranda.
  • the alcohol may be a lower alcohol, but is not limited thereto, and may be methanol or ethanol, and may be an aqueous solution of 10 to 100% by weight of methanol or ethanol.
  • the virus may be a retrovirus, preferably an HIV virus.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preparing a progenitor, comprising the steps of preparing for protonation; And it provides a method for producing a composition for inhibiting virus comprising the step of extracting with an aqueous solution or alcohol.
  • the alcohol may be methanol or ethanol, and may be an aqueous solution of 10 to 100% by weight of methanol or ethanol.
  • the virus may be a retrovirus, preferably an AIDS virus.
  • Another form of the present invention provides a functional dietary supplement composition
  • a functional dietary supplement composition comprising a toxin extract with a virus inhibitory function.
  • the protonated extract may be a methanol or ethanol extract.
  • the virus may be a retrovirus, preferably an AIDS virus.
  • Another form of the present invention provides a glycosidase inhibitor, characterized in that it comprises a protonated extract.
  • Another form of the present invention provides an HIV reverse transcriptase inhibitor, characterized in that it comprises a protonated extract.
  • Another form of the present invention provides an HIV protease inhibitor, characterized in that it comprises a protonated extract.
  • extracts 1 to 4 were prepared by extracting reflux with the leaves, stems or side bottles of the hydrogenation using water or methanol as a solvent and then concentrated under reduced pressure (see Table 1). Specifically, the water extract of the jacaranda leaves (extract 1), the methanol extract (extract 2) of the leaves, the water extract (extract 3) of the stem, the methanol extract (extract 4) of the stem was prepared.
  • the protonated extract of the present invention which is a species of retrovirus and is excellent in inhibiting the proliferation of HIV, a major etiology of AIDS, can be usefully used to inhibit or treat AIDS.
  • the present invention provides an AIDS therapeutic agent containing the above-mentioned protonated extract as an active ingredient.
  • AIDS therapeutics containing the toxin extract of the present invention as an active ingredient can be administered orally or parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
  • the formulation of the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations during actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used Is prepared using.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, water, etc. Prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As a suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the effective dose of the toxin extract is 10 to 1000 mg / kg, preferably 10 to 100 mg / kg, and may be administered 1 to 3 times.
  • the protonated extract of the present invention can be usefully used as a treatment for AIDS because it has excellent ability to inhibit HIV-related enzyme activity and HIV replication.
  • it is highly likely to be used as a food or medicine by confirming the stability of the toxin extract in animal experiments.
  • Figure 2 is a graph showing the HIV replication inhibitory activity of the toxin extract of the present invention.
  • the leaves and stems of Jacaranda were harvested, washed, and dried in shade with good ventilation. 100 g of water or 100 ml of 100% methanol was added to 5 g of the dried protonated sample and refluxed for 3 hours. The extracted solution was concentrated under reduced pressure and lyophilized. In the case of methanol extract, the final concentration of methanol was lyophilized so as not to exceed 2% and used as a material for the activity test. Samples were used after dilution at a concentration of 100 ⁇ g / ml in sterile distilled water or DMSO at the time of activity experiment (Table 1).
  • RT detection kit (RT-Detect TM kit NEK-070A) (Dupont medical products, Boston, MA, USA) to determine if the probiotic extract of the present invention inhibits the activity of HIV reverse transcriptase (abbreviated as RT) ) was performed by the Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay (ELOSA) method according to the manufacturer's policy.
  • the RT enzyme was used to synthesize HIV-I RT (10 U / ⁇ l, 100 mM potassium phosphate, pH 7.1, 1 mM dithiothreitol, 50% glycerol) produced by genetic recombination (Dupont medical products, Boston, MA, USA).
  • Inhibition of reverse transcriptase activity was performed by adding 10 ⁇ l of the reaction mixture buffer, 20 ⁇ l of the reaction mixture, and 5.2 ⁇ l of the enzyme buffer, and adding 4 ⁇ l (100 ⁇ g / ml) of each protonated extract to a 500 ⁇ l test tube (ependorf). Preincubation for minutes. 0.8 ⁇ l of RT enzyme was added to the pre-cultured tube, followed by reverse transcription for 1 hour at 37 ° C, and 1 minute reaction at 90 ° C to stop reverse transcription. 10 ⁇ l of alkaline solution (5.62% potassium hydroxide, 94.38% water) was added to the finished RNA template and hydrolyzed at 37 ° C.
  • the microplate washer (Immunowash model 1250) (Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan) was used as a wash solution (2-chloroacetamide solution) to remove remaining reagents or hydrolyzed RNA in the microplate well. Wash three times. 100 ⁇ l of a fluorescence detection solution (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine substrate solution) was added to the washed microplates for 1 hour at room temperature, followed by a stop solution (2.2% citric acid, 1.5% HCl).
  • a fluorescence detection solution 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine substrate solution
  • the extracts 1, 2, and 4 of the present invention extracted from protonation had low or almost no reverse transcriptase inhibitory activity, and the protonated extract 3 showed 37.9% of HIV reverse transcriptase inhibitory activity at 100 ⁇ g / ml, respectively. (Table 2).
  • ND indicates that it was not detected.
  • Oligopeptide described by SEQ ID NO: 1 purchased from Japan, Japan) (His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu- (pNO 2 -Phe) -Glu-Ala- Nle-Ser-NH 2 (M.W. 1315) ⁇ was diluted to 2 mg / ml in buffer (50 mM NaOAc, pH 5.0) and used as a substrate.
  • the oligopeptide is the seventh pNO 2 Degradation products described in SEQ ID NO: 2 by cleaving -Phe by the protease 2 -Phe) -Glu-Ala- Nle-Ser-NH 2 Is generated.
  • a total of 5 ⁇ l of the reaction mixture was prepared by adding 1 ⁇ l of buffer, 1.0 ⁇ l of substrate, 1 ⁇ l of the protonated extract of the present invention (100 ⁇ g / ml), and 2 ⁇ l of enzyme solution, respectively. Heating for 60 seconds to stop the HIV-I protease enzyme reaction.
  • the reaction mixture in which the enzyme reaction was stopped was diluted with 35 ⁇ l of distilled water and analyzed by HPLC.
  • the column was a LiChrospher 100 RP-18 column (Merck, Darmstadt, FRG) with a column size of 250 ⁇ 4 mm, and the solvent was 0.1% TFA and acetonitrile (20% -50% concentration). Gradient), the flow rate was 1.0 ml / min, and the analysis was set at a UV wavelength of 280 nm, and the HPLC apparatus (System controller: Shimadzu SCL-6B, Pump: Shimadzu LC-9A, Detector: Shimadzu SPD-6A (UV spectrophotometric) was used. detector), Recorder & Integrator: Shimadzu C-R6A Chromatopac).
  • the protonase extract of the present invention showed that the protease inhibitory activity was 33.6% and 31.5% in the extract 2 and extract 4 was the highest inhibitory activity (Table 3 and Figure 1).
  • ⁇ -glucosidase Activity of ⁇ -glucosidase that cleaves ⁇ -nitrophenyl- ⁇ -D-glucoside, a substrate, to determine if the protonated extract of the present invention inhibits glucosidase activity The degree was measured by spectroscopy. ⁇ -glucosidase was used for assaying glucosidase activity in a solution of ⁇ -glucosidase (Toyobo Company, Osaka, Japan) obtained from Saccharomyces sp.
  • ⁇ -glucosidase reaction solution 50 ⁇ l of buffer (100 mM sodium phosphate, pH 7.0), 100 ⁇ l of substrate solution, and 20 ⁇ l (100 ⁇ g / ml) of the toxin extract were mixed to prepare ⁇ -glucosidase reaction solution, which was then preliminarily reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After 30 ⁇ l of ⁇ -glucosidase was added, the enzyme was reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After stopping the reaction by adding 140 ⁇ l of the enzyme stop solution (0.2 M sodium carbonate), the reaction solution was transferred to a microplate well and the absorbance was measured at 405 nm. % inhibition of ⁇ -glucosidase activity was calculated according to the following equation.
  • HIV-I replication according to the method of Otake et al . (Otake, T. et. Al ., J. Traditional medicines, 1994, 11: 188-193) in order to confirm that the toxin extract of the present invention inhibits the replication of HIV-I. Inhibitory activity was measured.
  • the cell used in the experiment was an MT-4 cell line infected with HTLV-1 (Otake, T. et. Al ., J. Traditional medicines, 1994, 11: 188-193), which cells were penicillin G (Banyu Pharmaceutical).
  • RPMI provided 100 U / mL, 100 ⁇ g / mL streptomycin (Meiji Seika, Tokyo, Japan) and 10% fetal calf serum (FCS) (Flow Laboratories, North Ryde, Australia) Incubation was performed at -1640 medium (Flow Laboratories, Irvine, Scotland) while maintaining 37 ° C with 5% CO 2 .
  • the virus used HIV-I strain HTLV-III B obtained from MOLT-4 / HTLV-3III B cells (Otake, T. et. Al ., J. Traditional medicines, 1994, 11: 188-193).
  • MT-1 cells were infected with HIV-1 (HTLV-III B ) for 1 hour at 50% -tissue culture infective dose (TCID 50 ).
  • Infected cells were resuspended in 1 ⁇ 10 5 cell number / ml in RPMI-1640 medium and placed in 200 ⁇ l per well in a 96 well culture plate, and at the same time, each of the protonated extracts of the present invention was added at a concentration of 0 to 100 ⁇ g / ⁇ l. Incubated daily. HIV-1 infected cells and uninfected cells without addition of the toxin extract were used as controls.
  • HIV-proliferative inhibitor 3-azido-3'-deoxythymidine (AZT or zidovudine) and dextran sulfate 8000 (DS8000) (Sigma (St. Louis, Mo.), respectively)
  • the added cells were used as a positive control, and were observed by light microscopy after incubation and cytotoxicity (IC 100 , inhibitory concentration) that completely inhibits HIV-1 induced cytopathic effect (CPE) on MT-4 cells.
  • IC 100 inhibitory concentration
  • CPE HIV-1 induced cytopathic effect
  • the concentration of the protonated extract causing (CC 0 , cytotoxic concentration) was confirmed, and the degree to which the viability of MT-4 cells was not reduced was determined to be non-cytotoxic.
  • the minimum concentration at which the toxin extract of the present invention completely inhibits HIV virus proliferation was 100 ⁇ g / ml of extracts 2 and 3 (Table 5). Activity was also increased (FIG. 2). However, extract 1 and extract 4 had no virus growth inhibitory activity (Table 5).
  • the minimum concentration showing cytotoxicity when treated with the incubated extract of the present invention was found to be 100 ⁇ g / ml or more in extracts 1 to 4 (Table 5).
  • Table 5 extract Minimum concentration ( ⁇ g / ml) that completely inhibits MT-4 / HIV-1 virus replication Minimum concentration that causes cytotoxicity ( ⁇ g / ml) Extract 1 NE > 100 Extract 2 NE > 100 Extract 3 100 > 100 Extract 4 NE > 100
  • NE means no activity.
  • mice and rats were used and divided into 5 groups of 15 rats each.
  • the toxin stem water extract of the present invention was orally administered to mice and rats at doses of 5, 20, 100 and 500 mg / kg, respectively, and observed for 2 weeks. Water was administered as a control.
  • the toxin stem water extract of the present invention has little acute toxicity upon oral administration.

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Abstract

본 발명은 HIV 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 능소화 추출물은 HIV 역전사효소 활성 억제, 프로테아제 활성 억제, 글루코시다제 활성 억제 및 HIV 증식 억제 활성이 뛰어나므로 AIDS를 치료하고, 진행을 억제시키고, 감염을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＩＶ 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 에이즈 치료제
본 발명은 AIDS 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 HIV 증식 억제 활성을 갖는 능소화 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제에 관한 것이다.
레트로바이러스(retrovirus)의 한 종이며 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)의 병인자(aetiological agent)인 HIV-I(human immunodeficiency virus type Ⅰ)은 RNA를 유전적 모태로 하고 있다(Kaminchik, J. et. al., AIDS res. hum. retroviruses, 1994, 10: 1003-1010; Peliska, J.A. et. al., Science, 1992, 258:1112-1118). HIV-I은 표면 단백질(surface protein)인 당단백질 120(glycoprotein 120, gp120)이 헬퍼 T 세포(helper T cell)의 CD4+ 수용체와 작용한 후(Weiss, S. et. al., Gene, 1992, 111:183-197; Hoxie, J.A. et. al., J. Immunol., 1986, 136:361-363) RNA를 숙주 세포에 삽입하고 역전사효소(reverse transcriptase, RT)(Prasad, V.R. and Goff, S.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:3104-3108)에 의해 바이러스(viral) DNA로 전사되어 숙주의 염색체에 전구바이러스(proviral) DNA 형태로 존재한다. 숙주세포에서 잠복기를 거쳐 유전자가 발현될 때 RNA 중합효소(polymerase)에 의해 바이러스 mRNA가 생산되고, 프로테아제(protease, PR)에 의해 바이러스 단백질의 프로세싱(processing)이 이루어진다(Katz, R.A. and Skalka, A.M., Annu. Rev. Biochem., 1994, 63:133-173). 글루코시다제(glucosidase, GL) 등의 작용으로 바이러스 표면 당단백질이 형성되어(Taylor, D.L., Antimicrobacterial Agents & Chemotherapy, 1994, 38(8):1780-1787; Mohan, P., Pharmaceutical Research, 1992, 9(6):703-714) 성숙한 바이러스 입자(mature virion)로 발아된다. 이렇듯 바이러스가 헬퍼 T 세포 등에 자신의 유전자를 삽입하고 잠복기를 거쳐 자신을 복제하는 과정에서 숙주 세포를 파괴함으로써 인간의 면역기전에 심각한 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다.
HIV-I을 치료하기 위한 화학적 치료법(chemotherapy)으로는 수마린(suramin)과 같은 약물이 사용되고(Mitsuya, H. et. al., Science, 1984, 226:172-174), HIV-I의 역전사효소를 억제하기 위한 약물로는 뉴클레오시드 아날로그(nucleoside analogues)인 아지오티미딘(azidothymidine, AZT)(Ostertag, W. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 197, 471:4980-4985), 디다노신(didanosine, ddI) 및 잘시타빈(zalcitabine, ddC) 등이 사용되며, 비-뉴클레오시드 아날로그인 TIBO, 네비라핀(nevirapine) 및 피리디논(pyridinone) 등이 임상에서 사용되고 있다. 그러나, AZT는 장기 투여할 경우 근질환(myopathy)(Schroder, J.M. et. al., Acta Neuropathologica, 1996, 92(2):138-149)과 구강 점막 착색증(Tadini, G. et. al., Archives of Dermatology, 1991, 127(2):267-268) 등을 유발하는 부작용이 있다. 또한, ddI의 경우는 췌장염을 일으킨다고 보고되어 있다(Levin, T.L. et. al., Pediatric Radiology, 1997, 27(2):189-191).
따라서, 현재까지 사용되고 있는 AIDS 치료 약물은 부작용이 많기 때문에 이를 대체하기 위한 다양한 치료 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에 부합하여, 최근에는 천연물을 이용한 AIDS 치료약물 개발이 활성화되고 있다. 그 예로, 고시폴(gossypol)과 그 합성 유도체(Prusoff, W. et. al., Pharmacology & Therapeutics, 1993, 60(2):315-329), 해양 천연 알카로이드인 피리도[4,3,2-mn]티아졸로[5,4-b]아크리딘(pyrido[4,3,2-mn]thiazolo[5,4-b]acridine)(Taraporewala, I.B. et. al., J. Med. Chem., 1992, 35(15):2744-2752), 탄닌(Nakashima, H. et. al., Antiviral Research, 1992, 18:91-103), 플라보노이드(Kusumoto, I.T. et. al., Shoyakugaku Zasshi, 1993, 47:291-294) 등이 HIV-I 억제 활성을 가진다고 보고 되었다. 또한, HIV 억제 활성을 가진 물질을 찾기위한 천연물 엑스의 광범위한 스크리닝이 행해지고 있는 실정이다(유 등, 한국생약학회지, 1998, 29(4):338-346; Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995. 9:180-184).
능소화(Campsis grandifolia K. Schum)는 능소화과(Bignoniaceae)에 속하는 길이 10m의 낙엽활협 덩굴성 식물로 내한성이 약하여 중국 중부이남이 원산지이다. 잎은 마주나기하며 달걀모양이고 기수 1회 우상복엽으로 가장자리에 톱니가 있다. 열매는 삭과이고 꽃은 8-9월에 피고, 지름 6-8 cm 주홍색으로 능소화라 한다. 한방에서는 잎을 능소화 혹은 자위화(紫花), 근(根)을 자위근(紫根), 경엽(莖葉)은 자위경엽(紫莖葉)이라하여 약용으로 사용한다. 능소화는 7-9월에 꽃을 채취한 것을 사용하며 혈(血 )의 열을 낮추는 량혈(凉血), 혈의 정체를 제거하는 거어(祛瘀)의 효능이 있어 혈체, 월경불순, 토혈 등의 치료에 사용한다. 자위근은 량혈(凉血), 거풍(祛風), 산어(散瘀)의 효능이 있어 피부 소양(瘙痒), 통풍(痛風)등의 치료에 사용되어 오고 있다(Kim et al., J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 2004. 47(3):357-360).
능소화의 화학성분으로는 acetoside, oleanolic acid, ulsolic acid, beta-sitosterol, daucosterol 등 지용성 성분들이 밝혀져 있으며(Zhang et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2011 36(8):1043-1045), 잎에서는 cachinol 과 1-O-methyl cachinol등 iridoid 성분이 보고되어 있다(Jin et al., Planta Med., 2005 71(6): 578-580). 약리활성으로는 cholesterol acyltransferase inhibitors로서 maslinic acid, corosolic acid, 23-hydorxyursolic acid, arjunolic acid 성분이 알려져 있으며(Kim et al., Arch. Pharm. Res., 2005. 28(5):550-556), 능소화의 에탄올 추출물의 항산화, 항염증활성이 보고되었으며(Cui et al., J. Ethnopharmacol., 2006. 103(2):223-228), oleanolic acid, hederagenin, ursolic acid, tormentic acid, myrianthic acid 등 triterpenoid 성분들의 항혈전작용이 보고되어 있다(Jin et al., Arch. Pharm. Res., 2004. 27(4): 376-380). 또한 ursolic acid의 인슐린수용체 활성화 관한 보고가 있으나(Jung et al., Biochem. J., 2007. 403(2):243-250) 능소화의 줄기 및 잎으로부터 HIV-1 억제 활성에 관해서는 아직까지 보고되지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 물 또는 메탄올을 이용하여 능소화로부터 추출물을 제조하고, 상기 추출물이 HIV 역전사 효소, 프로테아제 및 글루코시다제 및 HIV 바이러스 증식 억제 활성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 물, 알코올 또는 물과 알코올 혼합물을 이용하여 추출한 능소화 추출물 및 상기 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 능소화 추출물은 수용성 추출물 또는 알코성 추출물 또는 유기용매 추출물일 수 있다. 상기 능소화는 능소화의 잎, 줄기, 꽃, 옆병 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 알코올은 저급 알코올일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 메탄올 또는 에탄올의 10 내지 100중량 %의 수용액일 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 HIV 바이러스이다.
본 발명은 또다른 형태는 능소화를 준비하는 단계; 및 수용액 또는 알코올에 의해 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법을 제공한다. 상기 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있고, 메탄올 또는 에탄올의 10내지 100중량%의 수용액일 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스일 수있으며, 바람직하게는 에이즈 바이러스이다.
본 발명의 또 다른 형태는 바이러스 억제기능이 있는 능소화 추출물를 포함하는 기능성 건강 보조 식품 조성물을 제공한다. 상기 능소화 추출물은 메탄올 또는 에탄올 추출물일 수 있다. 상기 바이러스른 레트로바이러스일 수 있고, 바람직하게는 에이즈 바이러스이다.
본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 글로코시다제 억제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 역전사효소 억제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 형태는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 프로테아제 억제제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 능소화의 잎, 줄기 또는 옆병을 물 또는 메탄올을 용매로 사용하여 환류추출한 후 감압농축하여 동결건조해 추출물 1 내지 추출물 4를 제조하였다(표 1 참조). 구체적으로는 능소화 잎의 물 추출물(추출물 1), 잎의 메탄올 추출물(추출물 2), 줄기의 물 추출물(추출물 3), 줄기의 메탄올 추출물(추출물 4) 을 제조하였다.
본 발명의 능소화 추출물이 AIDS의 주요 병인인 HIV 증식 관련 효소 활성 및 HIV 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 본 발명에서 추출한 추출물 1 내지 추출물 4을 사용하여 AIDS 억제 실험을 실시한 결과, 본 발명의 추출물은 추출 부위 및 추출 용매에 따라 약간의 차이가 있지만 대부분이 HIV-I 역전사효소 억제 활성(표 2 참조), 프로테아제 억제 활성(표 3 및 도 1 참조), 글루코시다제 억제 활성(표 4 참조) 및 HIV-I 증식 억제 활성(표 5 및 도 2 참조)을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 레트로바이러스의 한 종이며, AIDS의 주요한 병인자인 HIV의 증식을 억제하는 능력이 뛰어난 본 발명의 능소화 추출물은 AIDS를 억제하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제를 제공한다.
본 발명의 능소화 추출물을 유효성분으로 함유하는 AIDS 치료제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 제제는 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 능소화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.
본 발명의 AIDS 치료제에 있어서, 능소화 추출물의 유효용량은 10 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 10 내지 100 ㎎/㎏이며, 1 내지 3회 투여될 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 능소화 추출물은 HIV 관련 효소 활성 억제 및 HIV 복제억제 능력이 뛰어나므로 AIDS 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 동물실험에서 능소화 추출물에 대한 안정성을 확인하여 식품 또는 의약품으로의 사용 가능성이 높다.
도 1은 본 발명의 능소화 추출물이 HIV-I 프로테아제의 활성을 억제함을 확인한 기질의 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 능소화 추출물의 HIV 복제억제 활성을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 능소화 추출물의 제조
능소화의 잎, 줄기를 채취하여 세척하고 통풍이 잘되는 것에서 음지건조하였다. 건조된 능소화 시료 5 g에 물 100 ㎖ 또는 100% 메탄올 100 ㎖을 넣어 3시간 동안 환류추출하였다. 추출된 용액을 감압농축하고 동결건조하였다. 메탄올 추출물의 경우 메탄올의 최종농도가 2%를 넘지 않게 동결건조하여 활성실험의 재료로 사용하였다. 시료는 활성실험시에 멸균된 증류수나 DMSO에 100 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다(표 1).
표 1
사용부위 추출 용매 추출물
잎 물 추출물 1
잎 메탄올 추출물 2
줄기 물 추출물 3
줄기 메탄올 추출물 4
<실시예 2> 능소화 추출물이 HIV 관련효소 활성에 미치는 영향
<2-1> HIV-I 역전사 효소 활성 억제
본 발명의 능소화 추출물이 HIV 역전사 효소(reverse transcriptase, 이하 RT라 약칭함)의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 RT 검출 킷트(RT-DetectTM kit NEK-070A)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 이용하여 제조사의 방침에 따라 ELOSA(Enzyme Linked Oligonucleotide Sorbent Assay) 방법으로 수행하였다. RT 효소는 유전자 재조합에 의해 생산된 HIV-I RT(10 U/㎕, 100 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.1, 1 mM 디티오트레이톨, 50% 글리세롤)(Dupont medical products, Boston, MA, USA)를 효소완충액(100 m M Tris-HCl, pH 8.0, 160 mM KCl, 1 mM EDTA, 3 mM 디티오트레이톨, 0.3%(v/v) 트리톤 X-100, 10%(v/v) 글리세롤)에 0.005 U/㎕ 농도로 희석하여 사용하였다. 프라이머가 부착된 RNA 주형(Dupont medical products, Boston, MA, USA)과 트리포스페이트-DNA 뉴클레오시드를 반응혼합물 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 40 mM MgCl2)에 희석하여 반응혼합물(reaction mixture)을 제조하였다. 역전사 효소의 활성억제 반응은 반응혼합물 완충액 10 ㎕, 반응혼합물 20 ㎕, 효소완충액 5.2 ㎕와 함께 각각의 능소화 추출물 4 ㎕(100 ㎍/㎖)를 500 ㎕ 테스트 튜브(ependorf)에 넣고 37℃에서 4분간 예비 배양하였다. 예비 배양된 튜브에 RT 효소 0.8 ㎕를 가해 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 시키고 90℃서 1분간 반응시켜 역전사 반응을 정지시켰다. 반응을 마친 RNA 주형에 알칼리용액(5.62% 포타슘 하이드록사이드, 94.38% 물) 10 ㎕를 넣어 37℃에서 15분간 가수분해한 후, 완충액(13.6% 소듐 포스페이트, 모노베이직 모노하이드레이트, 86.4% 물) 10 ㎕를 넣어 중화하였다. 스트렙타비딘 코팅된 마이크로플레이트 웰에 ELOSA 반응을 위해 중화시킨 반응액 50 ㎕를 옮기고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)-표지된 검출 프로브와 바이오틴-표지된 포착(capture) 프로브를 포함하는 ELOSA 용액 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다(Weber, P. C. et al., Science, 1989, 243:85-88). 반응이 끝나고 난 뒤 마이크로플레이트 웰에 남은 시약이나 가수분해된 RNA를 제거하기 위해 마이크로플레이트 세척기(Immunowash model 1250)(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)에서 세척액(2-클로로아세트아미드 용액)으로 3회 세척하였다. 세척한 마이크로플레이트에 형광검출액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 서브스트레이트 용액) 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 정지액(2.2% 시트릭산, 1.5% HCl, 1.5% 설퍼릭산, 94.8% 물) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다(Josephy, P. D. et al., Journal of Biological Chemistry, 1989, 257:3669-3675). 반응이 완료된 반응액은 분광기(spectrophotometer)(Biorad 3550-UV)(Biorad, Nippon Biorad KK, Tokyo, Japan)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며 RT-활성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 18.09.2012]　
수학식 1
Figure WO-DOC-MATHS-1
그 결과, 능소화로 부터 추출한 본 발명의 추출물 1, 2 및 4는 역전사 효소 억제 활성이 낮거나 거의 없었으며, 능소화 추출물 3 은 100 ㎍/㎖ 농도에서 각각 37.9 %의 HIV 역전사 효소 억제 활성을 나타내었다(표 2).
[규칙 제91조에 의한 정정 18.09.2012]　
표 2
Figure WO-DOC-TABLE-2
상기에서 ND는 검출되지 않은 것을 나타낸다.
<2-2> HIV 프로테아제 활성 억제
능소화 추출물이 HIV의 바이러스 복제에 관련된 효소인 프로테아제(protease)의 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 유전자 재조합으로 생산된 HIV-1 프로테아제에 의한 기질의 절단정도를 HPLC로 측정하였다. 사용된 효소원은 쿠수모토 등의 방법(Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995, 9:180-184)에 의해 준비하였다. 구체적으로, HIV-I 프로테아제를 코딩하는 DNA를 발현하는 대장균 균주인 JM 105(Kusumoto, I.T. et. al., Phytother. Res., 1995, 9:180-184)로부터 HIV-I 프로테아제를 수득하였다. 수득한 HIV-I 프로테아제는 [50 mM NaOAc(pH 5.0), 1 mM EDTA-2Na, 2 mM 2-머캅토에탄올]:글리세롤=75:25 용액에 희석하여 사용하였고, (주)단백질 연구소(Osaka, Japan)로부터 구입한 서열번호 1로 기재되는 올리고펩타이드{His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-(pNO2-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH2(M.W. 1315)}를 완충액(50 mM NaOAc, pH 5.0)에 2 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 기질로 사용하였다. 상기 올리고펩타이드는 7번째 pNO2-Phe를 프로테아제가 인식하여 절단함으로써 서열번호 2로 기재되는 분해산물 (pNO2-Phe)-Glu-Ala- Nle-Ser-NH2가 생성된다. 완충액 1 ㎕, 기질 1.0 ㎕, 본 발명의 능소화 추출물 1 ㎕(100 ㎍/㎖), 효소용액 2 ㎕을 각각 가하여 전량 5 ㎕의 반응 혼합물을 조제하였으며, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 90℃에서 60초간 가열하여 HIV-I 프로테아제 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응이 정지된 반응혼합물을 증류수 35 ㎕로 희석하여 HPLC 분석을 하였다. HPLC 분석 조건으로 컬럼은 컬럼 사이즈 250 ×4 ㎜인 리크로스피어(LiChrospher) 100 RP-18 컬럼(Merck, Darmstadt, FRG)을 사용하였고, 용매는 0.1% TFA와 아세토니트릴(20%-50% 농도구배)로 하였으며, 유속은 1.0 ㎖/분으로 하고, 분석은 UV 파장 280 nm로 설정하여 HPLC 기기(System controller:Shimadzu SCL-6B, Pump:Shimadzu LC-9A, Detector:Shimadzu SPD-6A(UV spectrophotometric detector), Recorder ＆ integrator:Shimadzu C-R6A Chromatopac)로 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 능소화 추출물은 추출물 2와 추출물 4에서 프로테아제 억제 활성이 33.6%와 31.5% 로 나타나 가장 억제 활성이 높은 추출물임을 알 수 있었다(표 3 및 도 1).
표 3
추출물 (100 ㎍/㎖) 프로테아제억제(%)
추출물 1 18.8 ± 2.5
추출물 2 33.6 ±3.6
추출물 3 13.4 ±2.3
추출물 4 31.5 ±3.2
<2-3> 글루코시다제 활성 억제
본 발명의 능소화 추출물이 글루코시다제 활성을 억제하는지 확인하기 위해 기질인 ρ-니트로페닐-α-D-글루코시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucoside)를 절단하는 α-글루코시다제의 활성 정도를 분광기로 측정하였다. 글루코시다제 활성 분석에 사용한 α-글루코시다제는 사카로마이세스 속 균주(Saccharomyces sp.)에서 얻은 α-글루코시다제(Toyobo Company, Osaka, Japan)를 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, pH 7.0, 20% 글리세롤)에 0.5 U/㎖ 농도로 희석하여 사용하였으며, α-글루코시다제가 절단하는 기질은 ρ-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)(Nacalai Tesque Inc., Osaka, Japan)를 멸균 증류수에 10 mM 농도로 희석하여 사용하였다. 완충액(100 mM 소듐포스페이트, pH 7.0) 50 ㎕, 기질 용액 100 ㎕ 및 능소화 추출물 20 ㎕(100 ㎍/㎖)을 혼합하여 α-글루코시다제 반응액을 제조하였으며, 이를 37℃에서 5분간 예비 반응시킨 후 α-글루코시다제 30 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 효소 반응 하였다. 효소반응 정지액(0.2 M sodium carbonate) 140 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 반응액을 마이크로플레이트 웰에 옮겨 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-글루코시다제 활성 억제(%)는 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 18.09.2012]　
수학식 2
Figure WO-DOC-MATHS-2
그 결과, 능소화로부터 추출한 추출물 1, 2 및 3 은 글루코시다제 억제 활성을 나타내지 않았지만 추출물 4 는 약한 글루코시다제 억제 활성을 가짐을 알 수 있었다(표 4).
[규칙 제91조에 의한 정정 18.09.2012]　
표 4
Figure WO-DOC-TABLE-4
<실시예 3> 능소화 추출물이 HIV 복제에 미치는 영향
본 발명의 능소화 추출물이 HIV-I의 복제를 억제하는지 확인하기 위해 오타케 등의 방법(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)에 따라 HIV-I 복제 억제 활성을 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 HTLV-1에 감염된 MT-4 세포주(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)를 사용하였으며, 상기 세포는 페니실린 G(Banyu Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 100 U/㎖, 스트렙토마이신(Meiji Seika, Tokyo, Japan) 100 ㎍/㎖ 및 10% 우태아 혈청(fetal calf serum, FCS)(Flow Laboratories, North Ryde, Australia)이 제공되는 RPMI-1640 배지(Flow Laboratories, Irvine, Scotland)에서 5% CO2와 37℃를 유지하면서 배양하였다. 바이러스는 MOLT-4/HTLV-3ⅢB 세포(Otake, T. et. al., J. Traditional medicines, 1994, 11:188-193)로부터 얻은 HIV-I(strain HTLV-ⅢB)을 이용하였다. 먼저, HIV-1(HTLV-ⅢB)을 이용하여 MT-4 세포를 50%-조직 배양 감염 농도(tissue culture infective dose, TCID50)에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염된 세포를 RPMI-1640 배지에서 1 ×105 세포수/㎖로 재현탁시켜 96웰 배양 플레이트에 웰당 200 ㎕씩 넣고, 동시에 본 발명의 능소화 추출물 각각을 0 내지 100 ㎍/㎕ 농도로 첨가하여 5일간 배양하였다. 능소화 추출물을 첨가하지 않은 HIV-1에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포를 대조군으로 하였다. HIV 증식 억제제인 3-아지도-3데옥시티미딘(3'-Azido-3'-deoxythymidine)(AZT or zidovudine)과 덱스트란 설페이트 8000(DS8000)(Sigma (St. Louis, Mo.)을 각각 첨가한 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 배양후 광학현미경으로 관찰하여 MT-4세포에 대한 HIV-1 유도 세포변성(CPE, cytopathic effect)을 완전히 억제하는 농도(IC100, inhibitory concentration) 및 세포독성(CC0, cytotoxic concentration)을 일으키는 능소화 추출물의 첨가 농도를 확인하였다. MT-4 세포의 생존력이 감소되지 않은 정도를 세포독성이 없는 것으로 하였다.
그 결과, 본 발명의 능소화 추출물이 HIV 바이러스 증식(복제)을 완전히 억제하는 최소농도는 추출물 2와 3이 100 ㎍/㎖로 나타났으며(표 5), 처리 농도가 증가함에 따라 HIV 바이러스 증식 억제 활성도 증가하였다(도 2). 그러나, 추출물 1 및 추출물 4는 바이러스 증식 억제 활성이 없었다(표 5).
또한, 본 발명의 능소화 추출물을 처리하여 배양하였을 때 세포독성을 나타내는 최소농도는 추출물 1 내지 추출물 4 모두 100 ㎍/㎖ 이상으로 나타나 세포독성을 거의 일으키지 않음을 알 수 있었다(표 5).
표 5
추출물 MT-4/HIV-1바이러스 복제를 완전히 억제하는 최소농도(㎍/㎖) 세포독성을 일으키는 최소농도(㎍/㎖)
추출물 1 NE >100
추출물 2 NE >100
추출물 3 100 >100
추출물 4 NE >100
NE는 활성이 없음을 뜻한다.
<실시예 3> 능소화 추출물의 급성독성 실험
본 발명의 능소화 추출물을 직접 투여하였을 때 독성을 나타내는지 확인하기 위해 마우스와 랫트를 이용한 급성독성시험을 수행하였다. ICR계 마우스(28 ± 6 g)와 스프라그 도우리계 랫트(250 ± 12 g)를 사용하였으며, 각각 15마리씩 5군으로 나누었다. 본 발명의 능소화 줄기 물 추출물을 각각 5, 20, 100 및 500 ㎎/㎏의 용량으로 마우스 및 랫트에 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰하였다. 대조군으로는 물을 투여하였다.
그 결과, 5군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서, 본 발명의 능소화 줄기 물 추출물은 경구투여시 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.
2

Claims (20)

  1. 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 능소화 추출물은 수용성 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 능소화 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 능소화는 능소화의 잎, 줄기, 꽃, 옆병 및 뿌리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 약학적 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물.
  8. 능소화를 준비하는 단계; 및
    상기 능소화를 수용액 또는 알코올에 의해 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
  11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 억제용 조성물 제조방법.
  12. 바이러스를 억제하는 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 능소화 추출물은 수용성 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 능소화 추출물은 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 알코올은 10% 내지 100% 에탄올 또는 10% 내지 100% 메탄올인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  17. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스는 에이즈 바이러스인 것을 특징으로 하는 기능성 건강 보조 식품 조성물.
  18. 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 글로코시다제 억제제.
  19. 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 역전사효소 억제제.
  20. 능소화 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV 프로테아제 억제제.
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JPH1135476A (ja) * 1997-07-17 1999-02-09 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk ノウゼンカズラ科植物の有機抽出物を含有する抗ｃ型肝炎ウイルス剤及びプロテアーゼｎｓ３の特異的阻害剤
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