WO2016143886A1

WO2016143886A1 - 抗アレルギー組成物およびインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物、ならびにそれらの製造方法および使用方法

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Publication number: WO2016143886A1
Application number: PCT/JP2016/057701
Authority: WO
Inventors: 内田　勝幸; 勝紀木村; 智奈弥溝口; 裕行福井; 憲昭武田; 良樹柏田; 博之水口
Original assignee: 株式会社明治; 国立大学法人徳島大学
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2016-09-15
Also published as: JPWO2016143886A1

Abstract

　製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい、抗アレルギー組成物を提供することを課題とする。阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した酢酸エチル抽出成分を有効成分とする抗アレルギー組成物と、ピロガロールを有効成分とする抗アレルギー組成物である。このとき、酢酸エチル抽出成分を２０μｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有することが好ましく、ピロガロールを５０μＭ以上５０ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有することが好ましい。

Description

抗アレルギー組成物およびインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物、ならびにそれらの製造方法および使用方法

　本発明は、抗アレルギー組成物ならびにその製造方法および使用方法に関する。また、本発明は、インターロイキン４遺伝子発現抑制組成物ならびにその製造方法および使用方法にも関する。

　過去に「阿波番茶の熱水抽出成分と桑茶の熱水抽出成分とを含む抗アレルギー組成物」が提案されている（例えば、特開２０１２－１５３６１３号公報等参照）。なお、この抗アレルギー組成物は、阿波番茶の熱水抽出成分と桑茶の熱水抽出成分の混合物であってもよいし、阿波番茶の熱水抽出成分と桑茶の熱水抽出成分が分包されるセット品であってもよいとされている。そして、この抗アレルギー組成物は、実験結果により、ヒスタミン受容体Ｈ１遺伝子発現を有意に抑制することが実証されている。

特開２０１２－１５３６１３号公報

　しかし、上述の抗アレルギー組成物が「阿波番茶の熱水抽出成分と桑茶の熱水抽出成分の混合物」とされる場合、阿波番茶の熱水抽出・乾燥操作と桑茶の熱水抽出・乾燥操作が別々に行われた上で、それらの熱水抽出成分が紛体混合される。したがって、このような抗アレルギー組成物を製造する際、その製造の工程数が比較的に多くなると共に、抽出装置も阿波番茶抽出用と桑茶抽出用の少なくとも２台が必要となる。よって、このような抗アレルギー組成物を製造する際、比較的製造費が嵩みやすい。

　一方、上述の抗アレルギー組成物が「阿波番茶の熱水抽出成分と桑茶の熱水抽出成分が分包されるセット品」とされる場合、摂取者は、阿波番茶の熱水抽出成分の包装体と桑茶の熱水抽出成分とをそれぞれ開封してから、それらを摂取しなければならない。よって、このような抗アレルギー組成物は、摂取者の手間を増やし、摂取者の摂取意欲を削いでしまうことが懸念される。

　本発明の課題は、製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい、抗アレルギー組成物を提供することにある。

　本発明の第１局面に係る抗アレルギー組成物は、阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分（以下「熱湯・酢酸エチル抽出成分」という。）を有効成分とする。すなわち、この抗アレルギー組成物（すなわちアレルギー患者の症状を緩和するための組成物）は、熱湯・酢酸エチル抽出成分を使用して製造される。なお、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる（本文言の定義は、以下の他の局面に係る発明にも適用される。）。また、ここにいう「阿波番茶」は、徳島県の山間部を中心とする極限られた地域で生産されている後発酵茶であって、最近、「阿波晩茶」とも称されている。この阿波番茶は、茹でた茶葉を木桶に漬け込んで１０日から半月程度、乳酸発酵させた後に、天日乾燥させることによって製造される。また、本明細書でいう「抗アレルギー組成物」には、インターロイキン４遺伝子発現抑制成分およびヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）遺伝子発現抑制成分が含まれ得る。さらに、この熱湯・酢酸エチル抽出成分には、抗アレルギーの有効成分として、ピロガロール（以下の化学式（Ｉ）参照）の他、エピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートが含まれていることが実証されている。

　この抗アレルギー組成物を製造する際、先ず、阿波番茶を熱湯（熱水）抽出した後、その熱湯抽出液を冷却する。次に、その抽出装置に酢酸エチルを投入し、それを撹拌混合してから静置する。次いで、その抽出装置から水相を取り除いて、酢酸エチル相を得る。このため、この抗アレルギー組成物を製造する際、その工程数は比較的に少なく、抽出装置は１台でよい。したがって、この抗アレルギー組成物は、製造費が嵩みにくい。一方、この抗アレルギー組成物は、分包する必要がない。このため、この抗アレルギー組成物は、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。以上より、この抗アレルギー組成物は、製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。さらに、熱湯・酢酸エチル抽出成分には、高効率な抗アレルギー成分であるピロガロールが熱湯抽出成分よりも高濃度で含有されている。このため、この抗アレルギー組成物の摂取者は少量の摂取で、その効果を享受することができる。

　本発明の第２局面に係る抗アレルギー組成物は、ピロガロールを有効成分とする。すなわち、この抗アレルギー組成物（すなわちアレルギー患者の症状を緩和するための組成物）は、ピロガロールを使用して製造される。なお、ピロガロールは、ベンゼン－１,２,３－トリオール、１,２,３－トリヒドロキシベンゼン、１,２,３－ベンゼントリオール、３－ヒドロキシピロカテコール、トリヒドロキシベンゼン、ピロ没食子酸、焦性没食子酸とも称されている。

　ピロガロールは、没食子酸の脱炭酸やラクトバチルス・ペントーサス（例えば、ＯＬＬ２０３９６９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８６）、ＯＬＬ２０３９８２株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８７）、ＯＬＬ２０３９８４株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８８）等の乳酸菌発酵で比較的に容易に合成される。したがって、この抗アレルギー組成物は、その製造費が嵩みにくい。一方、この抗アレルギー組成物は、分包する必要がない。このため、この抗アレルギー組成物は、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。さらに、ピロガロールは、高効率な抗アレルギー成分そのものである。このため、この抗アレルギー組成物の摂取者は少量の摂取で、その効果を享受することができる。

　本発明の第３局面に係るインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物は、阿波番茶の熱湯抽出成分を有効成分とする。すなわち、このインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物（インターロイキン４遺伝子の発現を抑制する組成物）は、阿波番茶の熱湯抽出成分を使用して製造される。なお、上述の通り、熱湯・酢酸エチル抽出成分では、高効率なインターロイキン４遺伝子発現抑制の有効成分であるピロガロールの濃度が高まっている。このため、阿波番茶の熱湯抽出操作後に、さらに酢酸エチル抽出操作を行うことは好ましい。

　このインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物を製造する際、単純に阿波番茶に対して熱湯抽出操作および乾燥操作を行うのみでよい。このため、この抗アレルギー組成物を製造する際、その工程数は減り、抽出装置は１台でよい。したがって、この抗アレルギー組成物は、製造費が嵩みにくい。一方、この抗アレルギー組成物は、分包する必要がない。このため、この抗アレルギー組成物は、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。以上より、この抗アレルギー組成物は、製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。

　本発明の第４局面に係る方法は、熱湯・酢酸エチル抽出成分を抗アレルギー組成物として使用する方法である。なお、本方法は、熱湯・酢酸エチル抽出成分を患者に投与することによりアレルギー疾患を抑制する方法と言い換えることもできる。すなわち、熱湯・酢酸エチル抽出成分は、抗アレルギー組成物として使用し得る。ただし、ヒトを治療する医療行為は除かれる。

　本方法で使用される熱湯・酢酸エチル抽出成分を製造する際、阿波番茶を熱湯抽出した後、その熱湯抽出液を冷却する。次に、その抽出装置に酢酸エチルを投入し、それを撹拌混合してから静置する。次いで、その抽出装置から水相を取り除いて、酢酸エチル相を得る。このため、この熱湯・酢酸エチル抽出成分を製造する際、その工程数は比較的に少なく、抽出装置は１台でよい。したがって、この熱湯・酢酸エチル抽出成分は、製造費が嵩みにくい。一方、この熱湯・酢酸エチル抽出成分は、分包する必要がない。このため、この熱湯・酢酸エチル抽出成分は、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。以上より、この熱湯・酢酸エチル抽出成分は、製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。さらに、熱湯・酢酸エチル抽出成分には、高効率な抗アレルギー成分であるピロガロールが熱湯抽出成分よりも高濃度で含有されている。このため、この熱湯・酢酸エチル抽出成分の摂取者は少量の摂取で、その効果を享受することができる。

　本発明の第５局面に係る方法は、ピロガロールを抗アレルギー組成物として使用する方法である。なお、本方法は、ピロガロールを患者に投与することによりアレルギー疾患を抑制する方法と言い換えることもできる。すなわち、ピロガロールは、抗アレルギー組成物として使用し得る。ただし、ヒトを治療する医療行為は除かれる。

　本方法で使用される「ピロガロール」は、没食子酸の脱炭酸やラクトバチルス・ペントーサス（例えば、ＯＬＬ２０３９６９株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８６）、ＯＬＬ２０３９８２株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８７）、ＯＬＬ２０３９８４株（受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９８８）等の乳酸菌発酵で比較的に容易に合成される。したがって、ピロガロールは、その製造費が嵩みにくい。一方、このピロガロールは、分包する必要がない。このため、このピロガロールは、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。さらに、ピロガロールは、高効率な抗アレルギー成分そのものである。このため、このピロガロールの摂取者は少量の摂取で、その効果を享受することができる。

　本発明の第６局面に係る方法は、阿波番茶の熱湯抽出成分をインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物として使用する方法である。なお、本方法は、阿波番茶の熱湯抽出成分によりインターロイキン４遺伝子の発現を抑制する方法と言い換えることもできる。すなわち、阿波番茶の熱湯抽出成分は、インターロイキン４遺伝子発現抑制組成物として使用し得る。ただし、ヒトを治療する医療行為は除かれる。

　本方法で使用される「阿波番茶の熱湯抽出成分」を製造する際、単純に阿波番茶に対して熱湯抽出操作および乾燥操作を行うのみでよい。このため、この阿波番茶の熱湯抽出成分を製造する際、その工程数は減り、抽出装置は１台でよい。したがって、この阿波番茶の熱湯抽出成分は、その製造費が嵩みにくい。一方、この阿波番茶の熱湯抽出成分は、分包する必要がない。このため、この阿波番茶の熱湯抽出成分は、摂取者の手間を増やすことなく、摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。以上より、この阿波番茶の熱湯抽出成分は、その製造費が嵩みにくく、且つ摂取者の摂取意欲を削ぎにくい。

　本発明の第７局面に係る容器詰飲料は、抗アレルギー作用を有する容器詰飲料であって、上述の熱湯・酢酸エチル抽出成分を２０μｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する。なお、熱湯・酢酸エチル抽出成分には、有効成分としてピロガロールの他、エピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートが含まれていることが実証されている。なお、この容器詰飲料中のピロガロール濃度は、通常の阿波番茶のピロガロール濃度よりも高い。

　このため、摂取者は、容易に高濃度の熱湯・酢酸エチル抽出成分を摂取することができる。

　本発明の第８局面に係る容器詰飲料は、抗アレルギー作用を有する容器詰飲料であって、ピロガロールを５０μＭ（マイクロモル／リットル）以上５０ｍＭ（ミリモル／リットル）以下の範囲内の濃度で含有する。なお、この容器詰飲料中のピロガロール濃度は、通常の阿波番茶中のピロガロール濃度よりも高い。

　このため、摂取者は、容易に高濃度のピロガロールを摂取することができる。

　本発明の第９局面に係る容器詰飲料は、インターロイキン４遺伝子発現抑制作用を有する容器詰飲料であって、阿波番茶の熱湯抽出成分を１００μｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する。なお、この容器詰飲料中のピロガロール濃度は、通常の阿波番茶のピロガロール濃度よりも高い。

　このため、摂取者は、容易に阿波番茶の熱湯抽出成分を摂取することができる。

　本発明の第１０局面に係る抗アレルギー組成物の製造方法は、準備工程および抽出工程を備える。準備工程では、阿波番茶の熱湯抽出成分が準備される。なお、ここで、阿波番茶の熱湯抽出成分は、購入されてもよいし、製造（調製）されてもよい。抽出工程では、酢酸エチルにより、阿波番茶の熱湯抽出成分から酢酸エチル抽出成分が抽出される。

　このため、この抗アレルギー組成物の製造方法では、その工程数は比較的に少なく、抽出装置は１台でよい。したがって、この抗アレルギー組成物は、その製造費が嵩みにくい。

　本発明の第１１局面に係るインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物の製造方法は、準備工程および抽出工程を備える。準備工程では、阿波番茶が準備される。なお、ここで、阿波番茶は、購入されてもよいし、製造（調製）されてもよい。抽出工程では、熱湯により、阿波番茶から熱湯抽出成分が抽出される。

　このため、このインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物の製造方法では、その工程数は比較的に少なく、抽出装置は１台でよい。したがって、このインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物は、その製造費が嵩みにくい。

実施例１の上勝町産の阿波番茶の熱湯抽出成分のインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。実施例２の那賀町産の阿波番茶の熱湯抽出成分のインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。実施例３の上勝町産の阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分のインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。実施例４のピロガロールのインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。実施例４のラットのくしゃみ回数に及ぼすピロガロールの影響を示すグラフ図である。実施例４のラットの鼻過敏症スコアに及ぼすピロガロールの影響を示すグラフ図である。実施例４のピロガロールのヒスタミンＨ１受容体のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。実施例４のピロガロールのインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。比較例１の上勝町産の不発酵茶の熱湯抽出成分のインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。比較例２の那賀町産の不発酵茶の熱湯抽出成分のインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。参考例１のエピカテキンのインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。参考例２のエピガロカテキンのインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。参考例３のエピガロカテキンガレートのインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すグラフ図である。

　本発明の抗アレルギー作用を有する容器詰飲料では、上述の熱湯・酢酸エチル抽出成分を２０μｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上５ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、さらに好ましくは７０μｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、とくに好ましくは１００μｇ／ｍＬ以上５００μｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する。

　本発明の抗アレルギー作用を有する容器詰飲料では、ピロガロールを５０μＭ以上５０ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有し、好ましくは７０μＭ以上２０ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有し、より好ましくは１００μＭ以上１０ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有し、さらに好ましくは２００μＭ以上５ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有し、とくに好ましくは５００μＭ以上１ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有する。

　本発明のインターロイキン４遺伝子発現抑制作用を有する容器詰飲料では、阿波番茶の熱湯抽出成分を１００μｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、好ましくは２００μｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、より好ましくは３００μｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、さらに好ましくは４００μｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有し、とくに好ましくは５００μｇ／ｍＬ以上５ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する。

　以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。なお、以下に示される実施例は、例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。

　（実施例１）
　１．阿波番茶からの熱湯抽出
　１０ｇの上勝町産の阿波番茶の茶葉を、１０００ｍＬの熱湯（９０℃）に投入して、そのまま５分間で静置し、その阿波番茶から熱湯に熱湯抽出成分を抽出した。そして、茶葉入りの熱湯を熱時濾過して、その濾液を自然冷却させた後、濾液を真空凍結乾燥したところ、７３０ｍｇの粉末状の熱湯抽出成分を得た。

　２．熱湯抽出成分の成分分析
　上述の熱湯抽出成分を高速液体クロマトグラフおよびＮＭＲ装置（核磁気共鳴装置）を用いて成分分析したところ、この熱湯抽出成分にはピロガロール、エピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートが含有されていることが明らかとなった。

　３．阿波番茶の熱湯抽出成分の抗アレルギー作用の確認
　先ず、１０％のＦＢＳおよび抗生物質（１０，０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンＧナトリウムと１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを含む０．９％の生理食塩水）を含むイーグル最小必須培地（米国ニューヨーク州のＧｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ製）を２枚の６ウェルプレートのウェルに添加し、その培地上で、ラットの好塩基球性の白血病細胞（ＲＢＬ－２Ｈ３細胞）を培養した。次いで、上述の好塩基球性の白血病細胞を無処置群、コントロール群およびサンプル群の３群に分け、無処置群を除く各細胞を１００ｎｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル　免疫グロブリンＥ（シグマ－アルドリッチ社製）で感作すると共に、サンプル群の細胞に１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分の水溶液を与えた。そして、それから１２時間後に、コントロール群およびサンプル群の細胞に対して、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬのジニトロフェノール－アルブミン（ジニトロフェノール－ヒト血清アルブミン）（シグマ－アルドリッチ社製）で抗原刺激を行った。そして、この抗原刺激の１時間後に、各細胞から　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、表１に示すプライマー・プローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図１に示した。図１より、上勝町産の阿波番茶の熱湯抽出成分は、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった（なお、ピロガロールの抗アレルギー作用は実施例４を、エピカテキンの抗アレルギー作用は参考例１を、エピガロカテキンの抗アレルギー作用は参考例２を、エピガロカテキンガレートの抗アレルギー作用は参考例３を参照。）。

　なお、上述の「ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出」および「リアルタイムＰＣＲ」は以下の通りに行った。
　（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出
　先ず、抗原刺激の後に、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を、Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋フリーのリン酸緩衝の生理食塩水（ＰＢＳ（－））により、数回、洗浄してから、その細胞に１ウェル当たり０．７ｍＬの　ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社製）を加えた。次いで、その細胞を掻き取って、サンプルチューブに移し、さらに、そのサンプルチューブに２１０μＬのクロロホルムを加えて蓋を閉じた。そして、そのサンプルチューブを３０秒間、強く振盪した後、３分間、室温で静置した。なお、その３分間経過後に、サンプルチューブを観察したところ、その中の流体が二相に分離していた。続いて、そのサンプルチューブを４℃にて、１５，０００ｒｐｍで１５分間、遠心処理した後、水相（ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを含んでいる相）を別のサンプルチューブに移した。続けて、水相と同量のイソプロパノールをサンプルチューブに加えて蓋を閉じた。そして、そのサンプルチューブを３０秒間、強く振盪した後、室温にて３分間、静置した。最後に、そのサンプルチューブを４℃にて、１５，０００ｒｐｍで１５分間、遠心処理して、ペレット状のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。そして、サンプルチューブの上澄みを排出してから、そのサンプルチューブに、７５％の凍結エタノール（－２０℃）を加えて、ペレット状のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを洗浄した。そして、そのサンプルチューブを４℃にて、１５，０００ｒｐｍで１５分間、遠心処理した後、最終的に得られたペレット状のｔｏｔａｌ　ＲＮＡにジエチルピロカーボネート水を加えて、ＲＮＡ溶液とした。最後に、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｎａｎｏｄｒｏｐ　ＮＤ－１０００）により、ＲＮＡ溶液のｔｏｔａｌ　ＲＮＡの濃度と純度を測定した。

　（２）リアルタイムＰＣＲ
　先ず、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの量が１．０μｇとなるように、サンプルチューブに上述のＲＮＡ溶液を加えた後、全容量が５μＬとなるように、ジエチルピロカーボネート水を加えて、二次ＲＮＡ溶液を調製した。次いで、最終の組成が表２に示されるようになるように、二次ＲＮＡ溶液にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）の各液を加えて、逆転写反応用のサンプル液を調製した。そして、そのサンプル液をそれぞれ用いて、サーマルサイクラ―（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製、Ｔ３０００　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）により、逆転写反応を行って、ｃＤＮＡを調製した。なお、逆転写反応は、表３のプログラムに従って行われた。

　次に、表４に列挙されている試薬を上述の各サンプル液に混合した後、それらの混合液を用いて、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＧｅｎｅＡｍｐ　７３００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）により、ＰＣＲ反応を行った。その結果、全ての混合液において、ＰＣＲ産物の増幅曲線が検出された。また、この得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）の値で補正された。なお、このとき、Ｒａｔ　Ｇ３　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ｒａｔ　Ｇ３　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ＰｒｉｍｅｒおよびＲａｔ　Ｇ３　ｐｒｏｂｅとして、ＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。また、ＰＣＲ反応は、表５のプログラムに従って行われた。

　（実施例２）
　１．阿波番茶からの熱湯抽出
　阿波番茶の茶葉を那賀町産のものに代えた以外は、実施例１と同様に処理して、粉末状の熱湯抽出成分を得た。

　２．熱湯抽出成分の成分分析
　実施例１と同様にして、上述の熱湯抽出成分の成分分析を行ったところ、この熱湯抽出成分には、ピロガロール、エピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートが含有されていることが明らかとなった。

　３．阿波番茶の熱湯抽出成分の抗アレルギー作用の確認
　実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図２に示した。図２より、那賀町産の阿波番茶の熱湯抽出成分は、有効にインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

　（実施例３）
　１．阿波番茶からの熱湯抽出
　１０ｇの上勝町産の阿波番茶の茶葉を、１０００ｍＬの熱湯（９０℃）に投入して、そのまま５分間、静置し、その阿波番茶から熱湯に熱湯抽出成分を抽出した。そして、茶葉入りの熱湯を熱時濾過して、その濾液を自然冷却させた。

　２．熱湯抽出成分からの酢酸エチル抽出
　先ず、６００ｍＬの上述の濾液（真空凍結乾燥後の質量：４３８ｍｇ）と等量の酢酸エチルとを蓋付き分液ロートに投入し、その蓋付き分液ロートを強く振盪した後、水相と酢酸エチル相が分離するまで、その蓋付き分液ロートを静置した。そして、この操作を５回、繰り返した。次いで、下側の水相を三角フラスコに回収した後、上側の酢酸エチル相を別の三角フラスコに回収した。そして、三角フラスコに回収した水相と等量の酢酸エチルとを再び蓋付き分液ロートに投入し、その蓋付き分液ロートを強く振盪した後、水相と酢酸エチル相が分離するまで、その蓋付き分液ロートを静置した。そして、この操作を３回繰り返した。続いて、下側の水相を三角フラスコに回収した後、上側の酢酸エチル相を別の三角フラスコに回収した。そして、この酢酸エチル相と先に回収した酢酸エチル相とを再び蓋付き分液ロートに投入し、さらに、その酢酸エチル相の合計量と等量の飽和食塩水を同蓋付き分液ロート投入し、その蓋付き分液ロートを強く振盪した後、飽和食塩水相と酢酸エチル相が分離するまで、その蓋付き分液ロートを静置した。その後、蓋付き分液ロートから下側の飽和食塩水相を排出し、酢酸エチル相を三角フラスコに回収した。そして、この酢酸エチル相に１０ｇの硫酸マグネシウムを加えて、酢酸エチル相を脱水処理した。さらに、その酢酸エチル相をナス型フラスコに入れてから、そのナス型フラスコをロータリーエバポレーターに取り付け、ロータリーエバポレーターによりナス型フラスコから酢酸エチルを蒸発除去して、その抽出成分を濃縮・乾固させた。最後に、ナス型フラスコにアセトンを投入し、その抽出成分をアセトンに溶解させて、ナス型フラスコから回収したところ、２４９ｍｇの酢酸エチル抽出成分を得た（以下、この酢酸エチル抽出成分を「熱湯・酢酸エチル抽出成分」と称する。）。

　３．熱湯・酢酸エチル抽出成分の抗アレルギー作用の確認
　１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分の水溶液を、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの熱湯・酢酸エチル抽出成分の水溶液に代えた以外は、実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図３に示した。図３より、熱湯・酢酸エチル抽出成分は、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

　４．熱湯・酢酸エチル抽出成分の成分分析
　先ず、室温にて、クロマトグラフィー管、すなわち、下端部にコックを有するガラス管（直径：　２５ｍｍ、　長さ：　２１０ｍｍ）に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ２０（ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ社製、以下「固定相」という）を充填して、カラムを作製した。そして、このカラムの上端開口からアセトンを流し入れて、アセトンにより、固定相を平衡化した。次いで、熱湯・酢酸エチル抽出成分のアセトン溶液（１１０ｍｇの酢酸エチル抽出成分を含む）をカラムの上端開口から投入した後、アセトンで展開し、その溶出液を５０フラクション（１０ｍＬ／ｔｕｂｅ）に分けて回収した。次に、各フラクションを薄層クロマトグラフ（順相のシリカゲル担体、展開溶媒：　クロロホルム：メタノール＝１０：１、発色溶液：　ＦｅＣｌ_２）で解析した。次いで、その解析の結果により、フラクションＮｏ．１０～１２、フラクションＮｏ．１８～２７およびフラクションＮｏ．２８～５０の３つのフラクションに分けた。なお、フラクションＮｏ．１０～１２には５２．７ｍｇの熱湯・酢酸エチル抽出成分が存在し、フラクションＮｏ．１８～２７には６４．１ｍｇの熱湯・酢酸エチル抽出成分が存在し、フラクションＮｏ．２８～５０には９８．７ｍｇの熱湯・酢酸エチル抽出成分が存在した。ここで、上述と同様にして、これら３つのフラクションについて、抗アレルギー作用を確認したところ、全てのフラクションについて、抗アレルギー作用が確認された。

　そこで、１次元^１Ｈ－ＮＭＲおよび^１３Ｃ－ＮＭＲを用いて、これら３つのフラクションに含有されている成分を同定したところ、フラクションＮｏ．１０～１２にピロガロールが含有されていることが明らかとなった。なお、ここでは、ＮＭＲ装置として、Ｂｒｕｋｅｒ　ＡＶＡＮＣＥ４００（^１Ｈ－ＮＭＲ　４００ＭＨｚ;^１３Ｃ－ＮＭＲ　１００ＭＨｚ）を用いた。また、溶媒として重アセトンを用い、内部標準としてテトラメチルシランを用いた。

　（実施例４）
　１．ピロガロール水溶液の調製
　市販のピロガロールを水に溶かして、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの濃度のピロガロール水溶液を調製した。
　２．ピロガロールの抗アレルギー作用の確認
　１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分の水溶液を、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのピロガロール水溶液に代えた以外は、実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図４に示した。図４より、ピロガロールは、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

　３．鼻過敏症モデルラットへのピロガロールの効能
　（１）アレルギーモデルラットの作製
　先ず、６週齢のＢｒｏｗｎ－Ｎｏｒｗａｙ系の雄性ラットの両側鼻前庭に、極細耳鼻用綿棒を用いて、１０μＬの１０質量％トルエン－２，４－ジイソシアネート酢酸エチル溶液を、１日１回のペースにて連日５日間塗布してから、２日間の期間を空けた後、再び先の処置を繰り返した。さらに、その処置から２日間の経過時点から１週間の無処置期間を設けた後、ラットの両側鼻前庭に、極細耳鼻用綿棒を用いて、１０μＬの１０質量％トルエン－２，４－ジイソシアネート酢酸エチル溶液を塗布して発作を誘発した。なお、コントロール群として、トルエン－２，４－ジイソシアネートの代わりに、酢酸エチルを塗布した群を作製した。次いで、１日当たり１ｍｇ、３ｍｇおよび６ｍｇのピロガロールを３匹のラットそれぞれに経口投与し、それを２週間、続けた。そして、ラット鼻症状を示す指標として、上述の発作誘発時から１０分間における、くしゃみ回数を計数した。また、各ラットの症状を表６に照合して、各ラットの鼻過敏症スコアを導出した。さらに、発作誘発時から４時間の経過後に、ラットから鼻粘膜を採取して、鼻粘膜中のヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）およびインターロイキン４のｍＲＮＡを定量した。これらの結果を図５～８に示した。図５～８より、ピロガロールは、有効に鼻過敏症の改善作用（効能）を発揮することが明らかとなった。

　なお、鼻粘膜中のヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）のｍＲＮＡの定量は、実施例１の「（２）リアルタイムＰＣＲ」におけるＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に代えた以外は、実施例１の記載の通りに行った。また、鼻粘膜中のインターロイキン４のｍＲＮＡの定量は、実施例１に記載の通りに行った。

　４．ピロガロールの検出方法
　参考までに、高速液体クロマトグラフィー法を利用したピロガロールの検出方法を示す。なお、ピロガロールは、以下の条件の高速液体クロマトグラフにおいて、１４．０１５分の時点で溶出する。
　・カラム：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標）　５Ｃ_１８－ＭＳ　ＩＩ　（直径：　４．６ｍｍ、　長さ：　２５０ｍｍ）（ナカライテスク株式会社製）
　・移動層：　溶媒Ａ（水：酢酸＝９９：１）、溶媒Ｂ（メタノール：アセトン：酢酸＝９５：４：１）
　・溶出条件：
　　　　０－１５分：　溶媒Ａ　　　　９５質量％／溶媒Ｂ　　　　　　５質量％
　　　１５－３０分：　溶媒Ａ　４５－５０質量％／溶媒Ｂ　　５５－５０質量％
　　　３０－４０分：　溶媒Ａ　　５０－０質量％／溶媒Ｂ　５０－１００質量％
　　　４０－５０分：　溶媒Ａ　　　　　０質量％／溶媒Ｂ　　　　１００質量％
　　　４５－５５分：　溶媒Ａ　　０－９５質量％／溶媒Ｂ　　１００－５質量％
　・カラム温度：　室温
　・測定波長：　２７０ｎｍ
　サンプル注入量：　１０μＬ
　・流速：　０．５ｍＬ／分

　（比較例１）
　１．不発酵茶からの熱湯抽出
　上勝町産の阿波番茶の茶葉を上勝町産の不発酵茶（阿波番茶の発酵前の茶葉）に代えた以外は、実施例１と同様にして、熱湯抽出成分を得た。

　２．熱湯抽出成分の成分分析
　上述の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分を薄層クロマトグラフ（順相のシリカゲル担体、展開溶媒：　クロロホルム：メタノール＝１０：１、発色溶液：　ＦｅＣｌ_２）で解析した。ここで、上述した同成分にエピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートは検出されたが、ピロガロールは検出されなかった。したがって、上勝町産の茶葉の発酵により、ピロガロールが産生されるものと考察される。

　３．不発酵茶の熱湯抽出成分の抗アレルギー作用の確認
　実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図９に示した。図９より、上勝町産の不発酵茶の熱湯抽出成分は、ほとんどインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示さないことが明らかとなった。

　（比較例２）
　１．不発酵茶からの熱湯抽出
　上勝町産の阿波番茶の茶葉を那賀町産の不発酵茶（阿波番茶の発酵前の茶葉）に代えた以外は、実施例１と同様にして、熱湯抽出成分を得た。

　２．熱湯抽出成分の成分分析
　上述の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分を薄層クロマトグラフ（順相のシリカゲル担体、展開溶媒：　クロロホルム：メタノール＝１０：１、発色溶液：　ＦｅＣｌ_２）で解析した。ここで、上述した同成分にエピカテキン、エピガロカテキンおよびエピガロカテキンガレートは検出されたが、ピロガロールは検出されなかった。したがって、茶葉の発酵により、ピロガロールが産生されるものと考察される。

　３．不発酵茶の熱湯抽出成分の抗アレルギー作用の確認
　実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図１０に示した。図１０より、那賀町産の不発酵茶の熱湯抽出成分は、ほとんどインターロイキン４のｍＲＮＡ発現抑制作用を示さないことが明らかとなった。

　（参考例１）
　１．エピカテキン水溶液の調製
　市販のエピカテキンを水に溶かして、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび８０μｇ／ｍＬの濃度のエピカテキン水溶液を調製した。

　２．エピカテキンの抗アレルギー作用の確認
　１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分の水溶液を、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび８０μｇ／ｍＬのエピカテキン水溶液に代えた以外は、実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図１１に示した。図１１より、エピカテキンは、ピロガロールと同様に、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

　（参考例２）
　１．エピガロカテキン水溶液の調製
　市販のエピガロカテキンを水に溶かして、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび７０μｇ／ｍＬの濃度のエピガロカテキン水溶液を調製した。

　２．エピガロカテキンの抗アレルギー作用の確認
　１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分の水溶液を、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび７０μｇ／ｍＬのエピガロカテキン水溶液に代えた以外は、実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図１１に示した。図１１より、エピガロカテキンは、ピロガロールと同様に、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

　（参考例３）
　１．エピガロカテキンガレート水溶液の調製
　市販のエピガロカテキンガレートを水に溶かして、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬの濃度のエピガロカテキンガレート水溶液を調製した。

　２．エピガロカテキンガレートの抗アレルギー作用の確認
　１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬの阿波番茶の熱湯抽出成分水溶液を、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬのエピガロカテキンガレート水溶液に代えた以外は、実施例１と同様にして、インターロイキン４　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図１１に示した。図１１より、エピガロカテキンガレートは、ピロガロールと同様に、有効にインターロイキン４　ｍＲＮＡ発現抑制作用を示すことが明らかとなった。

[規則26に基づく補充 30.03.2016]　

Claims

　阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分を有効成分とする抗アレルギー組成物。
　ピロガロールを有効成分とする抗アレルギー組成物。
　阿波番茶の熱湯抽出成分を有効成分とするインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物。
　阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分を抗アレルギー組成物として使用する方法。
　ピロガロールを抗アレルギー組成物として使用する方法。
　阿波番茶の熱湯抽出成分をインターロイキン４遺伝子発現抑制組成物として使用する方法。
　阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した酢酸エチル抽出成分を２０μｇ／ｍＬ以上２０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する、
抗アレルギー作用を有する容器詰飲料。
　ピロガロールを５０μＭ以上５０ｍＭ以下の範囲内の濃度で含有する、
抗アレルギー作用を有する容器詰飲料。
　阿波番茶からの抽出物を１００μｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下の範囲内の濃度で含有する、
インターロイキン４遺伝子発現抑制作用を有する容器詰飲料。
　阿波番茶の熱湯抽出成分を準備する準備工程と、
　酢酸エチルで前記阿波番茶の熱湯抽出成分から酢酸エチル抽出成分を抽出する抽出工程と
を備える、抗アレルギー組成物の製造方法。
　阿波番茶を準備する準備工程と、
　熱湯で前記阿波番茶から熱湯抽出成分を抽出する抽出工程と
を備える、インターロイキン４遺伝子発現抑制組成物の製造方法。
　阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分を患者に投与することによりアレルギー疾患を抑制する方法（ただし、ヒトを治療する行為を除く。）。
　ピロガロールを患者に投与することによりアレルギー疾患を抑制する方法（ただし、ヒトを治療する行為を除く。）。
　阿波番茶の熱湯抽出成分によりインターロイキン４遺伝子の発現を抑制する方法（ただし、ヒトを治療する行為を除く。）。
　抗アレルギー組成物としての使用のための、阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分。
　抗アレルギー組成物としての使用のためのピロガロール。
　インターロイキン４遺伝子発現抑制組成物としての使用のための阿波番茶の熱湯抽出成分。
　アレルギー患者の症状を緩和するための組成物の製造のための、阿波番茶の熱湯抽出成分をさらに酢酸エチルで抽出した成分の使用。
　アレルギー患者の症状を緩和するための組成物の製造のためのピロガロールの使用。
　インターロイキン４遺伝子発現抑制組成物の製造のための阿波番茶の熱湯抽出成分の使用。