WO2016137004A1 - カルパイン活性検出蛍光プローブ - Google Patents
カルパイン活性検出蛍光プローブ Download PDFInfo
- Publication number
- WO2016137004A1 WO2016137004A1 PCT/JP2016/056030 JP2016056030W WO2016137004A1 WO 2016137004 A1 WO2016137004 A1 WO 2016137004A1 JP 2016056030 W JP2016056030 W JP 2016056030W WO 2016137004 A1 WO2016137004 A1 WO 2016137004A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- calpain
- salt
- compound
- hmrg
- retinal
- Prior art date
Links
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 42
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 32
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 claims description 26
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 21
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 20
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims description 15
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 13
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 11
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 11
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 11
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 10
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 10
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 claims description 8
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 7
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 7
- 206010067013 Normal tension glaucoma Diseases 0.000 claims description 6
- 201000002978 low tension glaucoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 19
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- HOKKHZGPKSLGJE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-D-aspartic acid Natural products CNC(C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 102000003900 Calpain-2 Human genes 0.000 description 13
- 108090000232 Calpain-2 Proteins 0.000 description 13
- 102000003895 Calpain-1 Human genes 0.000 description 12
- 108090000236 Calpain-1 Proteins 0.000 description 12
- -1 di-substituted amino group Chemical group 0.000 description 10
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 8
- 230000004491 retinal development Effects 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 6
- DVGHHMFBFOTGLM-UHFFFAOYSA-L fluorogold Chemical compound F[Au][Au]F DVGHHMFBFOTGLM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000004410 intraocular pressure Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 4
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 3
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 CCN(*C)C1=CC=*C(C(C2C(O3)=CC(*)CCC2)C2C=CC=CC(CN=O)C2)C3=C1 Chemical compound CCN(*C)C1=CC=*C(C(C2C(O3)=CC(*)CCC2)C2C=CC=CC(CN=O)C2)C3=C1 0.000 description 2
- 229940121926 Calpain inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100035037 Calpastatin Human genes 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010030348 Open-Angle Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 108010079785 calpain inhibitors Proteins 0.000 description 2
- 108010044208 calpastatin Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229940105631 nembutal Drugs 0.000 description 2
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 description 2
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 125000001834 xanthenyl group Chemical group C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010012565 Developmental glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001136634 Iris collettii Species 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCNNZELZXFXXJQ-BZSNNMDCSA-N Leu-Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCNNZELZXFXXJQ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- NTISAKGPIGTIJJ-IUCAKERBSA-N Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C NTISAKGPIGTIJJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N Leu-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061876 Obstruction Diseases 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N Protium Chemical compound [1H] YZCKVEUIGOORGS-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 201000007527 Retinal artery occlusion Diseases 0.000 description 1
- 206010038903 Retinal vascular occlusion Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 125000000332 coumarinyl group Chemical group O1C(=O)C(=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N lichenxanthone Natural products COC1=CC(O)=C2C(=O)C3=C(C)C=C(OC)C=C3OC2=C1 QDLAGTHXVHQKRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 201000006366 primary open angle glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 208000032253 retinal ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M toluene-4-sulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/10—Spiro-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/16—Ophthalmology
- G01N2800/168—Glaucoma
Definitions
- calpain activity can be detected in the green wavelength region, light stability is excellent, a fluorescent substance produced by reaction with calpain has a high quantum yield, and a bright fluorescent probe can be provided.
- calpain activity in living cells is monitored in real time, and retinal neuropathy that progresses through activation of calpain in the ophthalmic region (for example, glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular) It is possible to provide a diagnostic agent for retinal diseases that enables elucidation of pathophysiology, clinical diagnosis, and determination of therapeutic effects of retinal diseases such as degeneration, retinal neuropathy associated with diabetic retinopathy and retinal vascular occlusive disease.
- One embodiment of the present invention is a compound of the following general formula (I): (Wherein R 1 represents 1 to 4 identical or different substituents bonded to a hydrogen atom or a benzene ring; R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or a halogen atom; R 8 and R 9 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group; X represents a C 1 -C 3 alkylene group; R 10 represents a monovalent substituent that is cleaved by contact with calpain) Or a salt thereof.
- R 1 represents 1 to 4 identical or different substituents bonded to a hydrogen atom or a benzene ring
- R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , and R 7 each independently represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or a
- X represents a C 1 -C 3 alkylene group.
- the alkylene group may be a linear alkylene group or a branched alkylene group.
- a methylene group —CH 2 —
- an ethylene group —CH 2 —CH 2 —
- a propylene group —CH 2 —CH 2 —CH 2 —
- a branched alkylene group such as —CH ( CH 3 ) —, —CH 2 —CH (CH 3 ) —, —CH (CH 2 CH 3 ) — and the like can also be used.
- a methylene group or an ethylene group is preferable, and a methylene group is more preferable.
- the monovalent substituent containing an oligopeptide residue is preferably Leu-Leu-Tyr, Leu-Met, Leu-Leu-Val-Tyr, Thr-Pro-Leu-Leu, Thr-Pro-Leu-Lys.
- the N-terminus of a monovalent substituent containing an oligopeptide residue may be protected, and examples of the protecting group include an acetyl group, a glutaryl group, a succinyl group, a tert-butoxycarbonyl group, and a benzyloxycarbonyl group.
- the protecting group include an acetyl group, a glutaryl group, a succinyl group, a tert-butoxycarbonyl group, and a benzyloxycarbonyl group.
- substituents other than these may be used.
- a fluorescent probe comprising a compound represented by the general formula (I), formula (3) or formula (4) or a salt thereof provided by the present invention has an R 10 substituent or an oligopeptide residue by contact with calpain.
- a compound (corresponding to a compound in which R 10 is a hydrogen atom in the above general formula (I)) in which the monovalent substituent contained therein is cleaved and the absorption wavelength is shifted to a long wavelength can be generated, and calpain is measured. Can be suitably used as a fluorescent probe.
- the following steps (a) a step of bringing a compound represented by the general formula (I) having a monovalent substituent cleaved by contact with calpain or a salt thereof with calpain, And (b) a method including a step of measuring the fluorescence intensity of the compound after contact with the calpain produced in the step (a).
- the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited.
- the activity of calpain contained in the isolated and purified enzyme and cell lysate, the measurement of calpain activity in living cells, and the long wavelength optical The activity measurement of the enzyme used as the cancer biomarker in the biological tissue which utilized the characteristic is mentioned.
- the compounds and salts of the present invention can detect calpain activity in the green wavelength region and have excellent photostability, retinal neuropathy that progresses through the activation of calpain when used in the ophthalmic region, for example, , Glaucoma (especially normal-tension glaucoma), retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, retinal neuropathy associated with diabetes, retinal vascular obstruction disease, etc. It is what.
- the compound of the present invention emits green fluorescence having almost the same wavelength as that of fluorescein, it can be observed with a fluorescein fluorescent fundus contrast examination instrument already widely used in the ophthalmic field, and can be immediately applied to actual clinical practice. Have advantages.
- Example 3 Evaluation of Ac-LM-HMRG as a fluorescent probe (in vitro enzyme assay using calpain) A calpain enzyme addition assay was performed in TRIS buffer using the probe synthesized and designed by the above method. As a result, it was confirmed that Calpain 2 functions as a calpain probe by increasing the absorption and fluorescence intensity of Ac-LM-HMRG by a factor of about 4 by the enzymatic reaction. The results are shown in FIG. 2a (using calpain 1) and FIG. 2b (using calpain 2).
- Example 7 Evaluation of Ac-LM-HMRG using mouse NMDA disorder model retinal extension specimen (experimental procedure) A mouse NMDA disorder model was examined using a retinal extension specimen. First, mouse gold BL6 / J was injected with fluorogold (FG), a retrograde fluorescent staining tracer, from the upper hill to label retinal ganglion cells (FIGS. 7a and 8a). One week later, anesthesia was performed with Nembutal, and 1 ⁇ L of NMDA 30 mM (PBS dissolved) or 1 ⁇ L of PBS was administered into the vitreous in the eye.
- FG fluorogold
- FIG. 7a to 7c show photographs of retinal development specimens in the NMDA administration group.
- FIG. 7a shows a stained image with FG of the NMDA administration group
- FIG. 7b shows a stained image with Ac-LM-HMRG
- FIG. 7c shows a stained image with Sytox (registered trademark) Orange.
- calpain activation was detected by Ac-LM-HMRG and cell death was also detected in the NMDA administration group.
- 8a to 8c show photographs of retinal development specimens in the PBS administration group.
- 8a shows an image stained with FG of the PBS administration group
- FIG. 8b shows an image stained with Ac-LM-HMRG
- FIG. 8c shows an image stained with Sytox® Orange.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
【解決課題】 細胞内のカルパイン活性を高感度に検出する蛍光プローブを提供すること 【解決手段】 下記の一般式（Ｉ）：で表される化合物又はその塩。
Description
本発明は、カルパインの活性を検出することができる緑色蛍光プローブに関する。また、本発明は、当該蛍光プローブを用いた網膜疾患の診断薬に関する。
緑内障は、日本において成人の中途失明原因第一位の疾患であり、４０歳以上の平均有病率は約５％である。緑内障の定義は、「視神経と視野に特徴的変化を有し、通常、眼圧を十分に下降させることにより視神経障害を改善もしくは抑制しうる、目の機能的構造的異常を特徴とする疾患」である（非特許文献１）。分類としては、Ｉ）原発緑内障、ＩＩ）続発緑内障、ＩＩＩ）発達緑内障、に大きく分類されており、Ｉ）原発緑内障は、更に細かく、１）緑内障原発開放隅角緑内障(広義)（Ａ：原発開放隅角緑内障、Ｂ：正常眼圧緑内障）、２）原発閉塞隅角緑内障（Ａ：原発閉塞隅角緑内障、Ｂ：プラトー虹彩緑内障）、３）混合型緑内障、に分類されている（非特許文献１）。
緑内障に多く見られる所見の一つとして眼圧上昇があるが、日本においては、緑内障の発生進行過程において眼圧が常に正常値に留まる、正常眼圧緑内障が全緑内障患者の約７０％を占めている。これはアジアにおいて顕著にみられる傾向である。しかし、現在の緑内障に対する確実な治療法は、眼圧を下降することのみであり、眼圧以外の因子に対する治療法が模索されている。
緑内障のいずれの病型においても、進行性の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の消失とそれに対応した視野異常が特徴的である。近年、ＲＧＣの消失はカルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）活性に影響されることが示唆されており、正常眼圧緑内障の病態モデル動物にカルパイン阻害薬を投与することで、ＲＧＣの消失が減少すると報告されている（非特許文献２）。
また、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿網膜症に伴う網膜神経障害においてもカルパインの関与が示唆されている（非特許文献３～６）。
また、虚血性疾患である網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症等の網膜血管閉塞性疾患においてもカルパインの活性化が関与すると考えられている（非特許文献７及び８）。
緑内障のいずれの病型においても、進行性の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の消失とそれに対応した視野異常が特徴的である。近年、ＲＧＣの消失はカルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）活性に影響されることが示唆されており、正常眼圧緑内障の病態モデル動物にカルパイン阻害薬を投与することで、ＲＧＣの消失が減少すると報告されている（非特許文献２）。
また、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び糖尿網膜症に伴う網膜神経障害においてもカルパインの関与が示唆されている（非特許文献３～６）。
また、虚血性疾患である網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症等の網膜血管閉塞性疾患においてもカルパインの活性化が関与すると考えられている（非特許文献７及び８）。
カルパインは、Ｃａ２＋依存的に働くシステインプロテアーゼである。中枢神経系で普遍的に発現しており、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患に関わっている。網膜においてはＲＧＣと神経線維層で発現しており（非特許文献９～１１）、カルパインの活性化は、軸索切断後の網膜移植片のＧＣＬ（神経節細胞層）やラットの緑内障モデルで確認されている（非特許文献１２～１３）。カルパインは間接的にアポトーシス経路を誘導し、結果としてＲＧＣの消失につながる。
上記の観点から、カルパイン活性を病態動物でリアルタイムに観察できるようにすることにより、
（１）カルパイン活性が、いつ、どこで、どのように網膜疾患の病態に関与しているのか解明する、
（２）（１）が分かることにより、網膜疾患の進行具合や、治療介入のタイミングの判断に用いる、
ことが可能になると考えられる。
上記の観点から、カルパイン活性を病態動物でリアルタイムに観察できるようにすることにより、
（１）カルパイン活性が、いつ、どこで、どのように網膜疾患の病態に関与しているのか解明する、
（２）（１）が分かることにより、網膜疾患の進行具合や、治療介入のタイミングの判断に用いる、
ことが可能になると考えられる。
これまでに報告されているカルパインのプローブとして、
（Ａ）カルパインの基質となるペプチドに蛍光タンパクドメインを結合させた、タンパク質ベースのプローブ（非特許文献１４）
（Ｂ）クマリンにジペプチドを結合させたプローブ（非特許文献１５）
が報告されているが、生細胞でのイメージングにおいては、遺伝子導入に頼らず、また、励起光にＵＶ光を用いなくてよいカルパイン活性検出蛍光プローブの開発が求められている。
（Ａ）カルパインの基質となるペプチドに蛍光タンパクドメインを結合させた、タンパク質ベースのプローブ（非特許文献１４）
（Ｂ）クマリンにジペプチドを結合させたプローブ（非特許文献１５）
が報告されているが、生細胞でのイメージングにおいては、遺伝子導入に頼らず、また、励起光にＵＶ光を用いなくてよいカルパイン活性検出蛍光プローブの開発が求められている。
日本緑内障学会HP(http://www.ryokunaisho.jp/)
M. Ryu, M.Yasuda, D. Shi, A. Y. Shanab, R. Watanabe, N. Himori, K. Omodaka, Y. Yokoyama, J. Takano, T. Saido, T. Nakazawa, J Neurosci Res. 2012, 90, 802-815.
Eye (2014) 28, 85-92
Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1783-1795
PLOS ONE August 2013, Volume 8, Issue 8, e71650
Neurobiology of Disease 48 (2012) 556-567
Retinal ischemia: Mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Osborne NN, Casson RJ, Wood JP, Chidlow G, Graham M, Melena J. Prog Retin Eye Res. 2004 Jan;23(1):91-147.
Degeneration and dysfunction of retinal neurons in acute ocular hypertensive rats: Involvement of calpains. Suzuki R, Oka T, Tamada Y, Shearer TR, Azuma M. J Ocul Pharmacol Ther. 2014 Jun;30(5):419-28.
K. Blomgren, J. O. Karlsson, Neurosci. Lett. 1990, 112, 179-183.
H. Persson, S. Kawashima, J. O. Karlsson, Brain Res. 1993, 611, 272-278.
M. Azuma, T. R. Shearer, Surv. Ophthalmol. 2008, 53, 150-163.
D. P. McKernan, M. B. Guerin, O’Brien, C. J., T. G. Cotter, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007, 48, 5420-5430.
W. Huang, J. B. Fileta, I. Rawe, J. Qu, C. L. Grosskreutz, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010, 51, 3049-3054.
P. W. Vanderklish, L. A. Krushel, B. H. Holst, J. A. Gally, K. L. Crossin, G. M. Edelman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 2253-2258.
M. Niapour, S. Berger, Cytometry A. 2007, 71, 475-485.
本発明は、細胞内のカルパイン活性を高感度に検出する蛍光プローブを提供することを目的とする。
また、本発明は、当該蛍光プローブを用いて、カルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することを目的とする。
また、本発明は、当該蛍光プローブを用いて、カルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討したところ、ＨＭＲＧを基本骨格として、カルパインの基質となるペプチド鎖をアミド結合させることにより、細胞内でカルパインと酵素反応した時に蛍光が上昇する蛍光プローブを提供することができることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ１０が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）又は（２）で表される、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
［５］以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［７］カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
［８］［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、網膜疾患の診断薬。
［９］前記網膜疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患である、［８］に記載の診断薬。
［１０］前記緑内障が正常眼圧緑内障である、［９］に記載の診断薬。
を、提供するものである。
［１］下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ１０が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）又は（２）で表される、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
［５］以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［７］カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
［８］［１］～［５］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、網膜疾患の診断薬。
［９］前記網膜疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患である、［８］に記載の診断薬。
［１０］前記緑内障が正常眼圧緑内障である、［９］に記載の診断薬。
を、提供するものである。
本発明の化合物を用いることにより、緑色波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れ、カルパインとの反応で生成する蛍光物質の量子収率が高く、明るい蛍光プローブを提供することができる。
また、本発明の化合物を用いることにより、生細胞におけるカルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害（例えば、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿網膜症に伴う網膜神経障害及び網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患）の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することができる。特に、本発明の化合物は、フルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能である
従って、本発明は、生細胞におけるカルパイン活性のモニタリングのツールとして、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明に貢献するものである。
また、本発明の化合物を用いることにより、生細胞におけるカルパイン活性をリアルタイムにモニタリングし、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害（例えば、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿網膜症に伴う網膜神経障害及び網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患）の病態解明、臨床診断、治療効果判定を可能とする網膜疾患の診断薬を提供することができる。特に、本発明の化合物は、フルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能である
従って、本発明は、生細胞におけるカルパイン活性のモニタリングのツールとして、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の病態解明に貢献するものである。
本明細書において、アルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１～６個程度、好ましくは炭素数１～４個程度である。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルキルオキシ基やアラルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
また、本明細書において、アリール基は単環性アリール基又は縮合多環性アルール基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含んでいてもよい。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアラルキル基など）のアリール部分についても同様である。
本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩である。
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩である。
Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の置換基を示す。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。ベンゼン環上に２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。Ｒ１としては水素原子が好ましい。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示す。Ｒ２及びＲ７が水素原子であることが好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６が水素原子であることも好ましい。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７がいずれも水素原子であることがさらに好ましい。
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ８及びＲ９がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合、及びＲ８がアルキル基であり、かつＲ９が水素原子である場合が好ましく、Ｒ８及びＲ９の両者が水素原子である場合がさらに好ましい。
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示す。アルキレン基は直鎖状アルキレン基又は分枝鎖状アルキレン基のいずれであってもよい。例えば、メチレン基（－ＣＨ２－）、エチレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、プロピレン基（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）のほか、分枝鎖状アルキレン基として－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）－なども使用することができる。これらのうち、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がさらに好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ１０は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す。カルパインとの接触により切断される一価の置換基としては、好ましくは、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である。
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基としては、好ましくは、Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ、Ｌｅｕ－Ｍｅｔ、Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ、Ｌｅｕ－Ｔｙｒの配列を有するオリゴペプチド残基（配列の右端のアミノ酸がキサンテン骨格に結合したＮＨ基と直接結合している）を含む一価の置換基である。
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基のＮ末端は保護されていてもよく、保護基としては、アセチル基、グルタリル基、スクシニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などが挙げられるが、これら以外の置換基を用いてもよい。
オリゴペプチド残基を含む一価の置換基のＮ末端は保護されていてもよく、保護基としては、アセチル基、グルタリル基、スクシニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などが挙げられるが、これら以外の置換基を用いてもよい。
本発明の一つの実施態様において、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基は、以下の式（１）又は（２）で表される。
本発明の一つの好ましい実施態様は、以下の式（３）又は（４）で表される化合物又はその塩である。
本発明における上記一般式（Ｉ）、式（３）及び式（４）で表される化合物の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
本発明により提供される一般式（Ｉ）、式（３）又は式（４）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、カルパインとの接触によりＲ１０置換基又はオリゴペプチド残基を含む一価の置換基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ１０が水素原子になった化合物に相当する）を生成することができ、カルパインの測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。
上記した蛍光プローブを用いるカルパインの測定は、当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：（ａ）カルパインと接触することで切断される一価の置換基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれるカルパインの活性測定や、生細胞内でのカルパイン活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物及び塩を含む、網膜疾患の診断薬である。
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物及び塩を含む、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患（網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症）の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障の診断薬である。
また、本発明の一つの側面は、本発明の化合物及び塩を含む、正常眼圧緑内障の診断薬である。
本発明のもう一つの態様は、本発明の化合物及び塩を含む、眼科領域におけるカルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患（網膜静脈閉塞症及び網膜動脈閉塞症）の診断薬である。
また、本発明の更なる態様は、本発明の化合物及び塩を含む、緑内障の診断薬である。
また、本発明の一つの側面は、本発明の化合物及び塩を含む、正常眼圧緑内障の診断薬である。
本発明の化合物及び塩は、緑色波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れていることから、眼科領域で使用することにより、カルパインの活性化を介して進行する網膜神経障害、例えば、緑内障（特に、正常眼圧緑内障）、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害及び網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患の病態解明、臨床診断、治療効果の判定を可能とするものである。
また、本発明の化合物はフルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能であるという利点を有する。
また、本発明の化合物はフルオレセインとほぼ同じ波長の緑色蛍光を発することから、眼科領域で既に汎用されているフルオレセイン蛍光眼底造影検査機器で観察可能であり、実臨床へすぐに適用可能であるという利点を有する。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明の化合物１（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ）を合成した。
以下のスキーム１により、本発明の化合物１（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ）を合成した。
スキーム１：本発明の化合物１（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ）の合成方法
（１）ｌｅｕｃｏＨＭＲＧの合成
Ｒｈｏｄａｍｉｎ１１０ ３６２ｍｇ（０．９８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）と硫酸４００μＬ（７．５０４ｍｍｏｌ、７．６ｅｑ．）をメタノール４０ｍＬに溶かし８０°Ｃで終夜撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。得られた固体を水及びメタノールで抽出した。有機層の溶媒を除去し、固体を得た。続いて、ＴＨＦ６０ｍＬに溶かし、氷冷下でＬＡＨ ２４７．８ｍｇ（６．５３ｍｍｏｌ、６．６ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて０°Ｃで終夜撹拌した。メタノールでクエンチ後、ジクロロメタンを５０ｍＬ、ロッシェル塩水溶液を１００ｍＬ加え、終夜撹拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層に硫酸ナトリウム加えてろ過した後に、溶媒を除去し固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロロメタン／メタノール＝９７／３）目的化合物（６４ｍｇ、２１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.36-7.34 (m, 1H), 7.12-7.10 (m, 2H), 6.96-6.94 (m, 1H), 6.59 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 6.24 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.16 (dd, 2H, J = 8.2 Hz, 2.2 Hz), 5.29 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 5.07 (s, 4H), 4.54 (d, 2H, J = 4.9 Hz). HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 341.12605, Found, 341.12576 (-0.29 mmu).
Ｒｈｏｄａｍｉｎ１１０ ３６２ｍｇ（０．９８６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）と硫酸４００μＬ（７．５０４ｍｍｏｌ、７．６ｅｑ．）をメタノール４０ｍＬに溶かし８０°Ｃで終夜撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。得られた固体を水及びメタノールで抽出した。有機層の溶媒を除去し、固体を得た。続いて、ＴＨＦ６０ｍＬに溶かし、氷冷下でＬＡＨ ２４７．８ｍｇ（６．５３ｍｍｏｌ、６．６ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて０°Ｃで終夜撹拌した。メタノールでクエンチ後、ジクロロメタンを５０ｍＬ、ロッシェル塩水溶液を１００ｍＬ加え、終夜撹拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層に硫酸ナトリウム加えてろ過した後に、溶媒を除去し固体を得た。固体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロロメタン／メタノール＝９７／３）目的化合物（６４ｍｇ、２１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.36-7.34 (m, 1H), 7.12-7.10 (m, 2H), 6.96-6.94 (m, 1H), 6.59 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 6.24 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 6.16 (dd, 2H, J = 8.2 Hz, 2.2 Hz), 5.29 (s, 1H), 5.19 (t, 1H, J = 4.9 Hz), 5.07 (s, 4H), 4.54 (d, 2H, J = 4.9 Hz). HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 341.12605, Found, 341.12576 (-0.29 mmu).
（２）Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ（本発明の化合物１）の合成
Ｌｅｕｃｏ－ＨＭＲＧ６．３ｍｇ（０．０１９８ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．２ｍＬに溶かし、Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ５ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）５．７ｍｇ（０．０１５０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）５μＬ（０．０２８７ｍｍｏｌ、２．９ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで２時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残査８．０ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル６．６ｍｇ（０．０２６８ｍｍｏｌ、２．７ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。続いてチオアニソール５８μＬ（０．４９５ｍｍｏｌ、５０ｅｑ．）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２ｍｌを加え７時間撹拌し、ショートカラムで粗精製した。次に、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ） ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ １０／９０ ２０ｍｉｎ））目的化合物（１．４ｍｇ、１９％（ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 748.37048, Found, 748.36998 (-0.5 mmu).
Ｌｅｕｃｏ－ＨＭＲＧ６．３ｍｇ（０．０１９８ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．２ｍＬに溶かし、Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ５ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）５．７ｍｇ（０．０１５０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）５μＬ（０．０２８７ｍｍｏｌ、２．９ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで２時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残査８．０ｍｇ（０．００９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル６．６ｍｇ（０．０２６８ｍｍｏｌ、２．７ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。続いてチオアニソール５８μＬ（０．４９５ｍｍｏｌ、５０ｅｑ．）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２ｍｌを加え７時間撹拌し、ショートカラムで粗精製した。次に、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ） ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ １０／９０ ２０ｍｉｎ））目的化合物（１．４ｍｇ、１９％（ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 748.37048, Found, 748.36998 (-0.5 mmu).
［合成実施例２］
以下のスキーム２により、本発明の化合物２（Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）を合成した。
以下のスキーム２により、本発明の化合物２（Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）を合成した。
スキーム２：本発明の化合物２（Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）の合成方法
（１）Ａｃ－ＬＭ－ｌｅｕｃｏＨＭＲＧの合成
Ｌｅｕｃｏ－ＨＭＲＧ１０．６ｍｇ（０．０３３ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３ｍＬに溶かし、Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－ＯＨ５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）９．５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）８．６μＬ（０．０４９ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで９０分間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロルメタン／メタノール＝９１／９）目的化合物（８．１ｍｇ、８２％）を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 627.26116, Found, 627.25978 (-1.4 mmu).
Ｌｅｕｃｏ－ＨＭＲＧ１０．６ｍｇ（０．０３３ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．３ｍＬに溶かし、Ａｃ－Ｌｅｕ－Ｍｅｔ－ＯＨ５ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）９．５ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）８．６μＬ（０．０４９ｍｍｏｌ、３ｅｑ．）を加え、アルゴン雰囲気下にて７０°Ｃで９０分間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して（ジクロルメタン／メタノール＝９１／９）目的化合物（８．１ｍｇ、８２％）を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+Na]+, 627.26116, Found, 627.25978 (-1.4 mmu).
（２）Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ（本発明の化合物２）の合成
Ａｃ－ＬＭ－ｌｅｕｃｏＨＭＲＧ８．１ｍｇ（０．０１３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル９．２ｍｇ（０．０３７４ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。ショートカラムで粗精製した後、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ） ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝７５／２５ ｔｏ ２５／７５ ３０ｍｉｎ））目的化合物（１．３ｍｇ、１３％（ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 603.26357, Found, 603.26343 (-0.13 mmu).
Ａｃ－ＬＭ－ｌｅｕｃｏＨＭＲＧ８．１ｍｇ（０．０１３４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とクロラニル９．２ｍｇ（０．０３７４ｍｍｏｌ、２．８ｅｑ．）をジクロルメタン溶液に溶解し、３０分間室温で撹拌した。ショートカラムで粗精製した後、ＨＰＬＣを用いて精製を行い（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（９９％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／１％ＣＨ３ＣＮ） ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（９９％ＣＨ３ＣＮ、１％Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝７５／２５ ｔｏ ２５／７５ ３０ｍｉｎ））目的化合物（１．３ｍｇ、１３％（ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ））を得た。
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 603.26357, Found, 603.26343 (-0.13 mmu).
カルパインプローブ（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）の機能機序
カルパインの基質であるアミノ酸を、ＨＭＲＧのキサンテン環の一方のアミノ基にアミド結合でつなげたプローブ（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）から、カルパインによってアミノ酸が切り出されると、ＨＭＲＧに変化する。このように反応前後で閉環構造から開環構造へと変化することで、無吸収・無蛍光から強蛍光性へと大きく変化する（スキーム３）。
カルパインの基質であるアミノ酸を、ＨＭＲＧのキサンテン環の一方のアミノ基にアミド結合でつなげたプローブ（Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ）から、カルパインによってアミノ酸が切り出されると、ＨＭＲＧに変化する。このように反応前後で閉環構造から開環構造へと変化することで、無吸収・無蛍光から強蛍光性へと大きく変化する（スキーム３）。
スキーム３ カルパインプローブの作用機序
［実施例１］
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ及びＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの光学特性の測定
ｐＨ２の０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ及びＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの光化学特性を測定した。下記の表１に酵素反応生成物であるＨＭＲＧの光化学特性と共に示す。
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ及びＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの光学特性の測定
ｐＨ２の０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ及びＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの光化学特性を測定した。下記の表１に酵素反応生成物であるＨＭＲＧの光化学特性と共に示す。
［実施例２］
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いて、以下の条件でＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、酵素反応によりＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が２倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図１ａ(カルパイン１を使用)及び図１ｂ(カルパイン２を使用)に示す。
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いて、以下の条件でＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、酵素反応によりＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が２倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図１ａ(カルパイン１を使用)及び図１ｂ(カルパイン２を使用)に示す。
（実験条件）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２．４ ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３．８ ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ－１ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ－２ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０８７１５）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２．４ ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３．８ ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ－１ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ－２ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（Ｃａｔ． Ｎｏ．２０８７１５）
［実施例３］
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いてＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、カルパイン２では酵素反応によりＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が４倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図２ａ(カルパイン１を使用)及び図２ｂ(カルパイン２を使用)に示す。
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの蛍光プローブとしての評価（カルパインを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイ）
上記の方法で合成・設計したプローブを用いてＴＲＩＳバッファー中でカルパイン酵素添加アッセイを行った。その結果、カルパイン２では酵素反応によりＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの吸収および蛍光強度が４倍ほど上昇し、カルパインプローブとして機能することが確認された。結果を図２ａ(カルパイン１を使用)及び図２ｂ(カルパイン２を使用)に示す。
（実験条件）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２４ ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３８ ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ－１ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ． Ｎｏ． ２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ－２ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ （Ｃａｔ． Ｎｏ． ２０８７１５）
プローブのＤＭＳＯ溶液（１ｍＭ）のうち３μＬを３ｍＬの５０ｍＭＴＲＩＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）（カルパイン１では５μＭのＣａＣｌ２、カルパイン２では５００μＭのＣａＣｌ２を含有）に溶かし（最終プローブ濃度：１μＭ）、カルパイン（カルパイン１は２４ ｕｎｉｔｓ、カルパイン２は３８ ｕｎｉｔｓ）を加え、２５℃で酵素反応を行った。励起波長は４９５ｎｍ、蛍光波長は５２４ｎｍであった。
（酵素）
カルパイン１：ｃａｌｐａｉｎ－１ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ（Ｃａｔ． Ｎｏ． ２０８７１３）
カルパイン２：ｃａｌｐａｉｎ－２ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ （Ｃａｔ． Ｎｏ． ２０８７１５）
［実施例４］
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。
その結果を図３に示す（図３の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図３で示すように、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。
その結果を図３に示す（図３の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図３で示すように、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。
［実施例５］
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、（ｂ）１μＭ ＡＬＬＮ（カルパイン選択的阻害剤）を含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、（ｃ）２μＭ ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、（ｄ）５μＭ ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。その結果を図４ａ～図４ｄに示す（各図の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図４ａで示すように、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。また、図４ｂ～４ｄで示すように、カルパイン選択的阻害剤であるＡＬＬＮの添加により細胞内の蛍光強度は低下し、ＡＬＬＮの添加濃度が増大に伴い蛍光強度が低下した。
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを用いた生細胞イメージング
Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを用いて、以下の手順によりＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
（実験手順）
（ａ）ＦＢＳ（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ）を含有していないＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、（ｂ）１μＭ ＡＬＬＮ（カルパイン選択的阻害剤）を含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、（ｃ）２μＭ ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、（ｄ）５μＭ ＡＬＬＮを含有するＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））、を用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１時間培養し、更に、１０μＭのＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧで３０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像及び透過像を撮影した。その結果を図４ａ～図４ｄに示す（各図の左側は蛍光像で、右側は透過像である）。図中のスケールバーは５０μｍである。
図４ａで示すように、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧを添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。また、図４ｂ～４ｄで示すように、カルパイン選択的阻害剤であるＡＬＬＮの添加により細胞内の蛍光強度は低下し、ＡＬＬＮの添加濃度が増大に伴い蛍光強度が低下した。
上記の実施例で例証したように、本発明により、カルパインをターゲットとした新たな蛍光プローブを提供することができる。具体的には、実施例２～３で示した通り、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧはカルパインと反応することで、蛍光強度が上昇することが分かった。また、両者を細胞に適用した結果、Ａｃ－ＬＬＹ－ＨＭＲＧ、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧともに蛍光強度上昇を示した。また、実施例５の阻害剤添加実験から、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの蛍光上昇が低下したことから、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧは細胞内カルパイン活性を特異的に蛍光検出できることが示された。
［実施例６］
ラットＮＭＤＡ障害モデルを用いたＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
ＳＤラットにネンブタールを用いて全身麻酔を行った。眼内にＮ‐メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）（１０ｍＭ、２μＬ）、またはＰＢＳを眼内に投与した。４時間後にケタミン・キサラジン混合液で再度麻酔を行い、眼内にＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ（２ｍＭ、２μＬ）を投与した。その後、Ｆ１０（ニデック社共焦点生体顕微鏡）で眼底を撮影した。
その結果を図５ａ～図５ｄ及び図６ａ～図６ｄに示す。図５及び図６中、矢印で示す箇所は、ＨＭＲＧで染色された神経細胞を示す。
図５ａで示すように、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与前には明らかなシグナルを認めていない。しかし、図５ｂ～図５ｄで示すように、ＮＭＤＡを投与したラット（ＮＭＤＡ投与群）では、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを投与して３０分後、６０分後、９０分後には明らかに神経細胞が染色された。一方、ＰＢＳを投与したラット（ＰＢＳ投与群）では、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与前にシグナルを認められず（図６ａ）、３０分後（図６ｂ）、６０分後（図６ｃ）、９０分後（図６ｄ）にはごくわずかに神経細胞が染色された。
ラットＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。
ラットＮＭＤＡ障害モデルを用いたＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
ＳＤラットにネンブタールを用いて全身麻酔を行った。眼内にＮ‐メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）（１０ｍＭ、２μＬ）、またはＰＢＳを眼内に投与した。４時間後にケタミン・キサラジン混合液で再度麻酔を行い、眼内にＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ（２ｍＭ、２μＬ）を投与した。その後、Ｆ１０（ニデック社共焦点生体顕微鏡）で眼底を撮影した。
その結果を図５ａ～図５ｄ及び図６ａ～図６ｄに示す。図５及び図６中、矢印で示す箇所は、ＨＭＲＧで染色された神経細胞を示す。
図５ａで示すように、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与前には明らかなシグナルを認めていない。しかし、図５ｂ～図５ｄで示すように、ＮＭＤＡを投与したラット（ＮＭＤＡ投与群）では、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧを投与して３０分後、６０分後、９０分後には明らかに神経細胞が染色された。一方、ＰＢＳを投与したラット（ＰＢＳ投与群）では、Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与前にシグナルを認められず（図６ａ）、３０分後（図６ｂ）、６０分後（図６ｃ）、９０分後（図６ｄ）にはごくわずかに神経細胞が染色された。
ラットＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。
［実施例７］
マウスＮＭＤＡ障害モデル網膜進展標本を用いたＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
マウスＮＭＤＡ障害モデルは網膜伸展標本で検討を行った。まず、マウス オス ＢＬ６／Ｊに上丘から逆行性蛍光染色トレーサーであるフルオロゴールド（ＦＧ）を注入して、網膜神経節細胞をラベルした（図７ａ及び図８ａ）。１週間後、ネンブタールで麻酔を行い、眼内にＮＭＤＡ３０ｍＭ １μＬ（ＰＢＳ溶解）またはＰＢＳ １μＬを硝子体に投与した。その２時間後に再度ケタミン・キサラジン混合液で麻酔を行い、眼内にＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ（０．５ｍＭ、１μＬ、ＰＢＳ溶解）を投与した。Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与の更に１時間後にＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（細胞死を起こした細胞を染色する目的、２５μＬ、１μＬ，ＰＢＳ溶解）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を硝子体投与した。その１０分後に眼球摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定を2時間行い、網膜進展標本を作製した。
その結果を図７ａ～図７ｃ及び図８ａ～図８ｃに示す。
図７ａ～図７ｃはＮＭＤＡ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図７ａはＮＭＤＡ投与群のＦＧによる染色像、図７ｂはＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧによる染色像、図７ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図７ｂ、図７ｃで示すように、ＮＭＤＡ投与群ではカルパインの活性化がＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧで検出され、細胞死も検出された。図８ａ～図８ｃはＰＢＳ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図８ａはＰＢＳ投与群のＦＧによる染色像、図８ｂはＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧによる染色像、図８ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図８ｂ及び図８ｃで示すように、ＰＢＳ投与群では細胞死が起こっていないためＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ及びＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで染色像が認められなかった。
マウスＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。
マウスＮＭＤＡ障害モデル網膜進展標本を用いたＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧの評価
（実験手順）
マウスＮＭＤＡ障害モデルは網膜伸展標本で検討を行った。まず、マウス オス ＢＬ６／Ｊに上丘から逆行性蛍光染色トレーサーであるフルオロゴールド（ＦＧ）を注入して、網膜神経節細胞をラベルした（図７ａ及び図８ａ）。１週間後、ネンブタールで麻酔を行い、眼内にＮＭＤＡ３０ｍＭ １μＬ（ＰＢＳ溶解）またはＰＢＳ １μＬを硝子体に投与した。その２時間後に再度ケタミン・キサラジン混合液で麻酔を行い、眼内にＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ（０．５ｍＭ、１μＬ、ＰＢＳ溶解）を投与した。Ａｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ投与の更に１時間後にＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（細胞死を起こした細胞を染色する目的、２５μＬ、１μＬ，ＰＢＳ溶解）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を硝子体投与した。その１０分後に眼球摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定を2時間行い、網膜進展標本を作製した。
その結果を図７ａ～図７ｃ及び図８ａ～図８ｃに示す。
図７ａ～図７ｃはＮＭＤＡ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図７ａはＮＭＤＡ投与群のＦＧによる染色像、図７ｂはＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧによる染色像、図７ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図７ｂ、図７ｃで示すように、ＮＭＤＡ投与群ではカルパインの活性化がＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧで検出され、細胞死も検出された。図８ａ～図８ｃはＰＢＳ投与群の網膜進展標本の写真を示す。図８ａはＰＢＳ投与群のＦＧによる染色像、図８ｂはＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧによる染色像、図８ｃはＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅによる染色像を示す。図８ｂ及び図８ｃで示すように、ＰＢＳ投与群では細胞死が起こっていないためＡｃ－ＬＭ－ＨＭＲＧ及びＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅで染色像が認められなかった。
マウスＮＭＤＡ障害モデルは、網膜疾患モデルと考えられていることから、本発明の蛍光プローブは、網膜疾患の診断に有用であると考えられる。
本発明の蛍光プローブを緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患等の網膜疾患の患者に適用することで、まず患者個人の眼底・網膜神経節細胞におけるカルパイン活性を迅速に知ることが出来るため、臨床診断・治療選択に大きな効果を発揮すると期待される。具体的には、カルパイン活性上昇が確認された患者には、カルパイン阻害薬の処方を実施するなど、本発明の蛍光プローブの医療上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きい。
Claims (10)
- 下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１は水素原子又はベンゼン環に結合する１個ないし４個の同一又は異なる置換基を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７はそれぞれ独立に水素原子、水酸基、アルキル基、又はハロゲン原子を示し；
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し；
ＸはＣ１－Ｃ３アルキレン基を示し；
Ｒ１０はカルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す）
で表される化合物又はその塩。 - Ｒ１０が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）又は（２）で表される、請求項２に記載の化合物又はその塩。
- 以下の式（３）で表される化合物又はその塩。
- 以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
- カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、網膜疾患の診断薬。
- 前記網膜疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、糖尿病に伴う網膜神経障害又は網膜血管閉塞性疾患である、請求項８に記載の診断薬。
- 前記緑内障が正常眼圧緑内障である、請求項９に記載の診断薬。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16755748.7A EP3275889A4 (en) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | Fluorescent probe for detecting calpain activity |
| US15/553,970 US10294240B2 (en) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | Fluorescent probe for detecting calpain activity |
| US17/327,001 USRE49518E1 (en) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | Fluorescent probe for detecting calpain activity |
| EP21184784.3A EP3954697B1 (en) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | Fluorescent probe for detecting calpain activity |
| JP2017502539A JP6881294B2 (ja) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015-039502 | 2015-02-27 | ||
| JP2015039502 | 2015-02-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2016137004A1 true WO2016137004A1 (ja) | 2016-09-01 |
Family
ID=56788587
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2016/056030 WO2016137004A1 (ja) | 2015-02-27 | 2016-02-29 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | USRE49518E1 (ja) |
| EP (2) | EP3275889A4 (ja) |
| JP (1) | JP6881294B2 (ja) |
| WO (1) | WO2016137004A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3168288A4 (en) * | 2014-07-11 | 2018-01-24 | The University of Tokyo | Fluorescent probe for detecting dipeptidyl peptidase iv |
| WO2021070906A1 (ja) * | 2019-10-09 | 2021-04-15 | 国立大学法人 東京大学 | ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ又はブレオマイシン加水分解酵素検出用蛍光プローブ。 |
| US11236061B2 (en) * | 2017-12-26 | 2022-02-01 | Lg Chem, Ltd. | Xanthene-based compound and photosensitive resin composition comprising same |
| WO2022270607A1 (ja) * | 2021-06-24 | 2022-12-29 | 株式会社 東北テクノアーチ | 蛍光プローブ |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010095450A1 (ja) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | 国立大学法人 東京大学 | プロテアーゼ測定用蛍光プローブ |
| WO2013180181A1 (ja) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 国立大学法人 東京大学 | 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 |
| WO2014136780A1 (ja) * | 2013-03-04 | 2014-09-12 | 国立大学法人 東京大学 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9925136D0 (en) * | 1999-10-22 | 1999-12-22 | Smithkline Beecham Plc | Novel treatment |
| AU2003234638A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Molecular Devices Corporation | Luminogenic protease substrates |
| EP3323431B1 (en) * | 2010-01-13 | 2021-10-13 | The University Of Tokyo | Diagnostic for cancer |
| EP3144315B1 (en) * | 2014-05-14 | 2022-07-06 | The University of Tokyo | Enzyme-specific fluorescent compound capable of being retained in cells |
| WO2016006678A1 (ja) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | 国立大学法人 東京大学 | ジペプチジルペプチダーゼｉｖ検出用蛍光プローブ |
-
2016
- 2016-02-29 JP JP2017502539A patent/JP6881294B2/ja active Active
- 2016-02-29 EP EP16755748.7A patent/EP3275889A4/en not_active Withdrawn
- 2016-02-29 EP EP21184784.3A patent/EP3954697B1/en active Active
- 2016-02-29 US US17/327,001 patent/USRE49518E1/en active Active
- 2016-02-29 WO PCT/JP2016/056030 patent/WO2016137004A1/ja active Application Filing
- 2016-02-29 US US15/553,970 patent/US10294240B2/en not_active Ceased
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010095450A1 (ja) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | 国立大学法人 東京大学 | プロテアーゼ測定用蛍光プローブ |
| WO2013180181A1 (ja) * | 2012-05-30 | 2013-12-05 | 国立大学法人 東京大学 | 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 |
| WO2014136780A1 (ja) * | 2013-03-04 | 2014-09-12 | 国立大学法人 東京大学 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| FUJII, T. ET AL.: "In vivo imaging of intraperitoneally disseminated tumors in model mice by using activatable fluorescent small- molecular probes for activity of cathepsins", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 25, no. 10, 2014, pages 1838 - 1846, XP055433450, ISSN: 1043-1802 * |
| HINMAN, J. D. ET AL.: "Activation of calpain-1 in myelin and microglia in the white matter of the aged rhesus monkey", JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, vol. 89, no. 2, 2004, pages 430 - 441, XP055438600, ISSN: 0022-3042 * |
| LIU, L. ET AL.: "p-calpain regulates caspase- dependent and apoptosis inducing factor- mediated caspase-independent apoptotic pathways in cisplatin-induced apoptosis", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 125, no. 12, 2009, pages 2757 - 2766, ISSN: 0020-7136 * |
| O'BRIEN, M. ET AL.: "Light up your calpain acctivity Calpain no Kassei Seibutsu Hakko Assay", PROMETECH JOURNAL, no. 18, 2005, pages 3 - 6, Retrieved from the Internet <URL:http://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj18/PJ-No18-02.pdf> * |
| ROSSER, B. G. ET AL.: "Calpain activity increases in hepatocytes following addition of ATP. Demonstration by a novel fluorescent approach", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 268, no. 31, 1993, pages 23593 - 23600, XP055438604, ISSN: 0021-9258 * |
| RYU, M. ET AL.: "Critical role of calpain in axonal damage-induced retinal ganglion cell death", JOURNAL OF NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 90, 2012, pages 802 - 815, XP055438609, ISSN: 1097-4547 * |
| SAKABE, M. ET AL.: "Rational design of highly sensitive fluorescence probes for protease and glycosidase based on precisely controlled spirocyclization", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 135, no. 1, 2013, pages 409 - 414, XP055216401, ISSN: 0002-7863, doi:10.1021/ja309688m * |
| See also references of EP3275889A4 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3168288A4 (en) * | 2014-07-11 | 2018-01-24 | The University of Tokyo | Fluorescent probe for detecting dipeptidyl peptidase iv |
| US10383956B2 (en) | 2014-07-11 | 2019-08-20 | The University Of Tokyo | Fluorescent probe for detecting dipeptidyl peptidase IV |
| US11236061B2 (en) * | 2017-12-26 | 2022-02-01 | Lg Chem, Ltd. | Xanthene-based compound and photosensitive resin composition comprising same |
| WO2021070906A1 (ja) * | 2019-10-09 | 2021-04-15 | 国立大学法人 東京大学 | ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ又はブレオマイシン加水分解酵素検出用蛍光プローブ。 |
| WO2022270607A1 (ja) * | 2021-06-24 | 2022-12-29 | 株式会社 東北テクノアーチ | 蛍光プローブ |
| KR20240024104A (ko) | 2021-06-24 | 2024-02-23 | 가부시키가이샤 토호쿠 테크노 아치 | 형광 프로브 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| USRE49518E1 (en) | 2023-05-02 |
| JPWO2016137004A1 (ja) | 2018-02-15 |
| US20180162871A1 (en) | 2018-06-14 |
| JP6881294B2 (ja) | 2021-06-02 |
| EP3954697A1 (en) | 2022-02-16 |
| EP3954697B1 (en) | 2024-01-03 |
| EP3275889A1 (en) | 2018-01-31 |
| EP3275889A4 (en) | 2018-11-21 |
| US10294240B2 (en) | 2019-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016137004A1 (ja) | カルパイン活性検出蛍光プローブ | |
| JP6346689B2 (ja) | 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 | |
| JP6090934B2 (ja) | 酸性環境検出蛍光プローブ | |
| JP5688826B2 (ja) | カルパイン活性検出蛍光プローブ | |
| EP2350013A2 (en) | Compositions for labeling and identifying autophagosomes and methods for making and using them | |
| WO2016040891A2 (en) | In vitro compositions comprising human sample and amyloid targeting agent | |
| CN108290889A (zh) | 新的哌嗪和哌啶衍生物、它们的合成及其在抑制vdac寡聚化、细胞凋亡和线粒体功能障碍中的用途 | |
| JPWO2014136781A1 (ja) | 蛍光プローブ | |
| US10383956B2 (en) | Fluorescent probe for detecting dipeptidyl peptidase IV | |
| JP7140398B2 (ja) | ニトロベンゼン誘導体またはその塩およびそれらの用途 | |
| CN112225731A (zh) | FAPα特异性识别的具有肿瘤诊断治疗功能的亚甲蓝衍生物及其制备方法和应用 | |
| JP2014524913A (ja) | 抗アミロイド形成性αヘリックス破壊性超小型ペプチド治療薬 | |
| KR100976230B1 (ko) | 세포내 칼슘의 실시간 모니터링용 이광자 염료, 그 제조방법 및 이를 이용한 세포내 칼슘의 실시간 모니터링 방법 | |
| US20140212360A1 (en) | Imaging Beta-Amyloid Peptides and Inhibition of Beta-Amyloid Peptide Aggregation | |
| WO2018105667A1 (ja) | Ａｌｄｈ３ａ１検出蛍光プローブ | |
| EP3974438A1 (en) | Fluorescent probe for use in detection of brain tumor | |
| US9403794B2 (en) | Imaging beta-amyloid peptides and inhibition of beta-amyloid peptide aggregation | |
| JP7100363B2 (ja) | 深赤色蛍光プローブ | |
| WO2002102795A1 (fr) | Sondes fluorescentes pour le zinc | |
| JP2016193897A (ja) | ｐＨ依存性蛍光化合物 | |
| JP7525161B2 (ja) | カルボキシペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ | |
| Martínez-Feduchi Belmonte | Synthesis of multifunctional peptides containing a fluorophore group as fluorescent probe |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 16755748 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2017502539 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| REEP | Request for entry into the european phase |
Ref document number: 2016755748 Country of ref document: EP |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 15553970 Country of ref document: US |