KR20240024104A - 형광 프로브 - Google Patents

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KR20240024104A
KR20240024104A KR1020237044082A KR20237044082A KR20240024104A KR 20240024104 A KR20240024104 A KR 20240024104A KR 1020237044082 A KR1020237044082 A KR 1020237044082A KR 20237044082 A KR20237044082 A KR 20237044082A KR 20240024104 A KR20240024104 A KR 20240024104A
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calpain
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KR1020237044082A
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도루 나카자와
유키 스즈키
다카유키 오카
다카토시 우치다
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가부시키가이샤 토호쿠 테크노 아치
가부시키가이샤 토호쿠 테크노 아치
고료 가야쿠 가부시키가이샤
센주 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 칼파인 효소 활성을 고감도로 검출하는 형광 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 펩티드쇄의 N 말단에, 산소 원자와 결합한 α 탄소를 갖는 아미드기를 결합함으로써, 칼파인과의 효소 반응성이 향상된다. 본 발명의 프로브는, 종래 보고되고 있는 HMRG 형광 프로브와 비교하여, 칼파인과의 반응성이 향상되고 있는 점에서, 보다 고감도로 칼파인 활성을 검출하는 형광 프로브를 제공하는 것이다. 구체적으로는, 본 발명은, 하기의 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
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Description

형광 프로브
본 발명은 칼파인의 활성을 검출하는 형광 프로브에 관한 것이다.
칼파인은 Ca2 + 의존적으로 활성화되는 시스테인 프로테아제이고, 기질 단백질의 한정 절단에 의해, 그 단백질의 기능이나 구조를 조절하는 모듈레이터 분자이다. 칼파인은 다양한 생명 현상에 관여하는 반면에, 그 활성이나 그 유전자의 병원성 변이가, 신경 변성 질환, 심·근질환, 허혈성 질환, 암, 안질환 등, 다양한 질환에 관련된 것이 보고되고 있다. 나아가, 칼파인이 병원체의 생존이나 감염 등에 필수적인 감염증도 있으며, 예를 들어 말라리아, 트리파노소마증, 시스토소마(주혈흡충)증 등에도, 칼파인이 관련된 것이 알려져 있다. 따라서, 칼파인 관련 질환의 진단이나 질환 메커니즘의 해석/창약 연구에 있어서, 칼파인의 활성을 가시화하는 것은 중요하다.
칼파인 활성을 실시간으로 검출하기 위해서는, 형광 이미징법이 유용한 수단이 된다. 특히, 생세포 중의 칼파인 활성을 유전자 도입에 의존하지 않고 검출하는 수단으로서, 지금까지 쿠마린(비특허문헌 1)이나 Hydroxymethyl Rhodamine Green(HMRG)(특허문헌 1)이라는 유기 소분자에 의한 형광 프로브가 개발되고 있다.
특히, 녹색의 형광 프로브로서, 형광 색소인 Hydroxymethyl Rhodamine Green(HMRG)에 펩티드를 결합시킨 프로브가 보고되고 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 2). HMRG 프로브는 효소 비존재 하에서는 무형광성이며, 형광 기질이 효소와 반응함으로써 형광성이 되는 것을 특징으로 한다.
국제 공개 공보 WO2016/137004
THE JOURNAL OF BIOLOGICACLH(1993) 268: 23593-23600 BIOCONJUGATE CHEMISTRY(2020) 31: 2241-2251
특허문헌 1에 기재되는 종래형의 HMRG 프로브에는, 효소 존재 하에 있어서의 형광 강도에 개선의 여지가 있었다. 본 발명은, 칼파인 효소 활성을 고감도로 검출하는 형광 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 칼파인과 형광 프로브의 반응성을 높임으로써 칼파인 활성의 검출 감도가 향상되는 것, 보다 구체적으로는, 형광 프로브에 펩티드를 아미드 결합한 칼파인 프로브의 기본 골격에 있어서, 펩티드쇄의 N 말단에, 산소 원자와 결합한 α 탄소를 갖는 아미드기를 결합함으로써, 칼파인과의 효소 반응성이 향상되는 것을 발견했다.
본 발명은 하기의 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염(이하, 「화합물 (I)」이라고 하는 경우가 있다)에 관한 것이다:
[식 중, A 및 B는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 다른 아미노산 잔기를 나타내고,
여기서, A와, A에 결합하는 NH 사이의 결합은, A의 C 말단과 해당 NH 사이의 아미드 결합이고, A와 B는 아미드 결합으로 결합되어 있고, 또한 B와, B에 결합하는 카르보닐(C=O) 사이의 결합은, B의 N 말단과 해당 카르보닐(C=O) 사이의 아미드 결합이고;
R1은 동일하거나 또는 상이하고, 벤젠환에 결합하는 치환기를 나타내고;
p는 0 내지 4의 정수를 나타내고;
R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은, 각각 독립적으로 수소 원자, 히드록실기(OH기), 할로겐 원자, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내고;
R8 및 R9는, 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내거나, 혹은 R8과 R9가 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고, 혹은 R3과 R8이 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고, 또한/또는 R4와 R9가 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
X는 직쇄 또는 분지 C1 내지 C3 알킬렌기를 나타내고;
R10 및 R11은, 각각 독립적으로 수소 원자, 히드록실기(OH), 알콕시기, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내거나, 혹은 R10과 R11이 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
R12는 수소 원자; 치환되어도 되는, 직쇄, 분지 혹은 환상 알킬기; 치환되어도 되는, 직쇄 혹은 분지 알케닐기; 치환되어도 되는, 직쇄 혹은 분지 알키닐기; 치환되어도 되는 아릴기; 또는 치환되어도 되는 복소환기를 나타내거나, 혹은 R10 또는 R11과 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
L은 아미드 결합, 에스테르 결합, 또는 -(직쇄 혹은 분지 알킬렌-O-)n-(n은 1 내지 10의 정수)을 나타내거나, 혹은 단결합을 나타낸다.]
화합물 (I)에 있어서, R1은 벤젠환에 결합하는 치환기를 나타낸다. p는 0 내지 4의 정수이고, 0 내지 3, 0 내지 2, 0 내지 1, 1 또는 0이어도 된다. R1로서는, 예를 들어 치환되어도 되는, 직쇄 또는 분지 알킬기; 치환되어도 되는, 직쇄 또는 분지 알콕시기; 할로겐 원자; 치환되어 있어도 되는 아미노기; 치환 실릴기; 또는 아실기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 일은 없다. p가 2 이상인 경우, 복수의 R1은, 각각 동일하거나 상이해도 된다.
R8과 R9가 결합해서 환을 형성하는 경우, R3과 R8이 결합해서 환을 형성하는 경우, R4와 R9가 결합해서 환을 형성하는 경우, R10과 R11이 결합해서 환을 형성하는 경우, 당해 환은, 헤테로 원자(산소 원자, 질소 원자, 황 원자 등)를 포함하고 있어도 되고, 예를 들어 시클로알킬 또는 환상 에테르여도 된다. R12와 R10 또는 R11이 결합해서 환을 형성하는 경우, 당해 환은, 환상 에테르여도 된다. 또한 이들 환은 3 내지 14원, 3 내지 10원, 3 내지 8원, 또는 3 내지 6원으로 할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 알킬기 또는 기타의 기의 알킬 부분에 있어서의 치환기로서는, 할로겐 원자, 수산기, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 티올기, 알킬티올기, 술포닐기, 알킬술포닐기, 알콕시기, 환상 에테르, 카르복실기, 알킬카르보닐기, 알콕시카르보닐기, 알콕시카르보닐아미노기, 알킬카르보닐옥시기, 알킬아미노카르보닐기, 알킬카르보닐아미노기, 카르보닐아미노기, 히드라지닐기를 들 수 있다. 알킬기가 치환되어 있는 경우, 해당 치환기의 수는, 예를 들어 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개, 2개, 또는 3개로 할 수 있다.
아미노기에 있어서의 치환기로서는, 치환되어도 되는, 직쇄 또는 분지 알킬기여도 된다. 아미노기가 치환되어 있는 경우, 해당 치환기의 수는 1 내지 2개, 1개, 또는 2개로 할 수 있다.
치환 실릴기의 치환기로서는, 치환되어도 되는, 직쇄 또는 분지 알킬기 또는 치환되어도 되는 페닐기여도 된다. 실릴기의 치환기 수는, 예를 들어 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 1개, 2개, 3개, 또는 4개로 할 수 있다.
일반식 (I)에 있어서, 아미노산은, 칼파인에 의해 절단되는 아미노산이면, 천연에 존재하는 아미노산 또는 그의 유도체여도 되고, 예를 들어 천연 아미노산의 입체 이성체여도 된다. 아미노산으로서는, 예를 들어 Met, Ser, Ala, Thr, Val, Tyr, Leu, Asn, Ile, Gln, Pro, Asp, Phe, Glu, Trp, Lys, Cys, Arg, Gly, His(이상, 아미노산 3문자 표기로 나타낸다), 노르류신(Nle), 또는 메티오닌술폭시드(MetO)여도 된다.
본 명세서에 있어서, 「알킬기」또는 기타 기에 있어서의 「알킬」 부분은, 직쇄, 분지 또는 환상의 포화 탄화수소기를 의미하고, 바람직하게는 탄소수가 1 내지 6개의 포화 탄화수소기이고, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기,sec-부틸기, t-부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 2,3-디메틸프로필기, 헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기 및 시클로헥실기 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, C1 내지 5 알킬기이고, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기,sec-부틸기, t-부틸기, 이소부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 또는 2,3-디메틸프로필기를 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, C1 내지 3 알킬기이고, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기 및 i-프로필기이고, 가장 바람직하게는, 메틸기 또는 에틸기이다. 또한, 「알킬렌기」는 상기 알킬기로부터 수소 원자를 1개 제외함으로써 얻어지는 2가의 기이다.
「알콕시기」는 상기 알킬기와 산소 원자를 개재해서 결합하는 기((알킬기)-O-기)이고, 해당 알킬기 부분은 상술에서 정의한 바와 같다. 예를 들어, 알콕시기는 알킬기 부분의 탄소 원자수가 1 내지 6개여도 된다. 알콕시기로서는, 예를 들어 메톡시기, 에톡시기, 1-프로필옥시기, 2-프로필옥시기, 2-메틸-1-프로필옥시기, 2-메틸-2-프로필옥시기, 2,2-디메틸-1-프로필옥시기, 1-부틸옥시기, 2-부틸옥시기, 2-메틸-1-부틸옥시기, 3-메틸-1-부틸옥시기, 2-메틸-2-부틸옥시기, 3-메틸-2-부틸옥시기, 1-펜틸옥시기, 2-펜틸옥시기, 3-펜틸옥시기, 2-메틸-1-펜틸옥시기, 3-메틸-1-펜틸옥시기, 2-메틸-2-펜틸옥시기, 3-메틸-2-펜틸옥시기, 1-헥실옥시기, 2-헥실옥시기, 3-헥실옥시기 등을 들 수 있다. C1 내지 6 알콕시기로서, 바람직하게는 C1 내지 5 알콕시기이고, 보다 바람직하게는, 메톡시기, 에톡시기, n-프로필옥시기, i-프로필옥시기, n-부틸옥시기,sec-부틸옥시기, t-부틸옥시기, 이소부틸옥시기, 펜틸옥시기, 이소펜틸옥시기 및 2,3-디메틸프로필옥시기이다.
「알케닐기」는 1개 이상의 탄소-탄소간의 이중 결합을 갖는 직쇄, 분지, 또는 환의 불포화 탄화수소의 임의의 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거해서 이루어지는 1가의 기이고, 예를 들어 탄소 원자수가 2 내지 10개, 2 내지 6개, 또는 2 내지 4개여도 된다. C2 내지 10 알케닐기로서는, 예를 들어 비닐기, 프로페닐기, 이소프로페닐기, 1-부테닐기, 2-부테닐기, 3-부테닐기, 1-펜테닐기, 2-펜테닐기, 3-펜테닐기, 4-펜테닐기, 1-메틸-1-부테닐기, 1-메틸-2-부테닐기, 1-메틸-3-부테닐기, 1-메틸리덴부틸기, 2-메틸-1-부테닐기, 2-메틸-2-부테닐기, 2-메틸-3-부테닐기, 2-메틸리덴부틸기, 3-메틸-1-부테닐기, 3-메틸-2-부테닐기, 3-메틸-3-부테닐기, 1-에틸-1-프로페닐기, 1-에틸-2-프로페닐기, 1-헥세닐기, 2-헥세닐기, 3-헥세닐기, 4-헥세닐기, 5-헥세닐기, 1-메틸-1-펜테닐기, 1-메틸-2-펜테닐기, 1-메틸-3-펜테닐기, 1-메틸-4-펜테닐기, 1-메틸리덴 펜틸기, 2-메틸-1-펜테닐기, 2-메틸-2-펜테닐기, 2-메틸-3-펜테닐기, 2-메틸-4-펜테닐기, 2-메틸리덴 펜틸기, 3-메틸-1-펜테닐기, 3-메틸-2-펜테닐기, 3-메틸-3-펜테닐기, 3-메틸-4-펜테닐기, 3-메틸리덴 펜틸기, 4-메틸-1-펜테닐기, 4-메틸-2-펜테닐기, 4-메틸-3-펜테닐기, 4-메틸-4-펜테닐기, 1-헵테닐기, 2-헵테닐기, 3-헵테닐기, 4-헵테닐기, 5-헵테닐기, 6-헵테닐기, 옥테닐기, 노네닐기 및 데세닐기를 들 수 있다.
「알키닐기」는 1 이상의 탄소-탄소간의 삼중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지 상의 불포화탄화수소 임의의 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거해서 이루어지는 1가의 기이고, 예를 들어 탄소 원자수가 2 내지 6개 또는 2 내지 4개여도 된다. 알키닐기로서는, 에티닐기, 1-프로피닐기, 2-프로피닐기, 1-부티닐기, 2-부티닐기, 3-부티닐기, 펜티닐기, 헥시닐기, 페닐에티닐기 등을 들 수 있다.
「아실기」는 알카노일기와 동일한 의미이고, R-C(=O)-로 표현되는 기이다. 이 구조에서 나타내지는 아실기에 있어서의 R 부분으로서는, 수소 원자, 치환되어도 되는, 직쇄 또는 분지 알킬기, 또는 치환되어도 되는 아릴기를 들 수 있다. 예를 들어, 아실기는 탄소 원자수 2 내지 7개여도 되고, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 발레릴기, 이소 발레릴기, 피발로일기, 발레릴기, 이소 발레릴기, 헥사노일기, 헵타노일기를 포함한다.
「아릴기」란, 1가의 방향족 탄화수소기이고, 예를 들어 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖고 있어도 되고, 페닐기 및 나프틸기를 포함한다.
「복소환기」는 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자에서 선택되는 1종류 이상의 헤테로 원자를 적어도 1개 포함하는 1가의 기이고, 바람직하게는 5 내지 14원이다. 복소환기는 단환식 복소환기 또는 축합 복소환기여도 된다. 5 내지 14원의 복소환기가 함유하는 헤테로 원자의 수는, 예를 들어 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 2개, 1개여도 된다. 예를 들어, 질소 원자를 1개 포함하는 복소환기, 질소 원자를 2개 포함하는 복소환기, 질소 원자를 3개 포함하는 복소환기, 산소 원자 1개를 포함하는 복소환기, 산소 원자를 2개 포함하는 복소환기, 산소 원자 1개와 질소 원자 1개를 포함하는 복소환기, 황 원자를 1개 포함하는 복소환기 등 다양한 조합이 존재한다. 5 내지 14원의 복소환기는, 방향족성이거나, 비방향족성이어도 된다. 단환식 복소환기는, 바람직하게는 5 내지 6원환이다. 축합 복소환기는, 바람직하게는 8 내지 10원환이다. 5 내지 14원의 복소환기로서는, 예를 들어 피페리딜, 피페라질, 모르폴릴, 퀴누클리딜, 피롤리딜, 아제티딜, 옥세틸, 아제티딘-2-온-일, 아지리디닐, 트로파닐, 푸릴, 테트라히드로푸릴, 티에닐, 피롤릴, 피롤리닐, 피롤리디닐, 디옥솔라닐, 옥사졸릴, 옥사졸리닐, 이소옥사졸릴, 티아졸릴, 티아졸리닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 티아졸리디닐, 피라졸릴, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 옥사디아졸릴, 푸라자닐, 티아디아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라닐, 피리딜, 피페리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 옥사지닐, 모르폴리닐, 티아디닐, 트리아지닐, 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로이소벤조푸라닐, 벤조티에닐, 이소벤조티에닐, 디히드로벤조티에닐, 디히드로이소벤조티에닐, 테트라히드로벤조티에닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 쿠마릴, 크로모닐, 1,4-벤조디아제피닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸릴, 푸리닐, 아크리디닐, 페녹사지닐, 페노티아지닐, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조디옥솔라닐, 벤조디옥사닐크로메닐, 크로마닐, 이소크로마닐, 크로마노닐, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 인돌리지닐, 퀴놀리지닐, 이미다조피리딜, 나프티리디닐, 디히드로벤조옥사지닐, 디히드로벤조옥사졸리노닐, 디히드로벤조옥사지노닐 및 벤조티옥사닐을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「할로겐 원자」란, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자를 의미하고, 바람직하게는 불소 원자, 염소 원자 및 브롬 원자이고, 보다 바람직하게는, 불소 원자, 또는 염소 원자이다. 본 명세서에 있어서, 「카르복실기」란, -C(=O)-OH로 표현되는 기이다.
아미노산 A로서, 바람직하게는 Met, Thr, His, Tyr, Phe, Ser, Gln, Arg, Lys, MetO 및 Nle이다. 아미노산 B로서, 바람직하게는 소수성 아미노산, 예를 들어 Leu, Val이고, 보다 바람직하게는 Leu이다. (아미노산 B)-(아미노산 A)의 조합으로서 바람직하게는, Leu-Met, Leu-Nle, Leu-Phe, Leu-Tyr, Leu-Thr, Leu-Arg, Leu-Lys, Leu-His, Leu-MetO, Val-Tyr, Val-Met 및 Leu-Ser을 들 수 있다.
R1로서 바람직하게는, 직쇄 또는 분지 알킬기이다. 또한, p는 바람직하게는 0 또는 1이고, 보다 바람직하게는 0이다.
R2로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R3으로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R4로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R5로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R6으로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R7로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R8로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R9로서 바람직하게는, 수소 원자이다.
R10으로서 바람직하게는, 수소 원자, 알킬기 또는 알콕시기이고, 보다 바람직하게는 수소 원자, 메틸기 또는 메톡시기이다.
R11로서 바람직하게는, 수소 원자, 알킬기 또는 알콕시기이고, 보다 바람직하게는 수소 원자, 메틸기 또는 메톡시기이다.
혹은 R10 및 R11로서 바람직하게는, 서로 결합해서 시클로알킬기를 형성하고, 보다 바람직하게는 C3-C5 시클로알킬기를 형성한다.
R12로서 바람직하게는, 수소 원자 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지 혹은 환상 알킬기이고, 보다 바람직하게는, 수소 원자 또는 수산기, 카르복실기, 시클로에테르, 알콕시기(예를 들어, 메톡시기, 에톡시기), 술포닐기, 할로겐 원자, 아미노기, 메틸아미노기 및 디메틸아미노기에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄, 분지 혹은 환상 알킬기이고, 더욱 바람직하게는 수소 원자 또는 수산기, 카르복실기, 시클로에테르, 알콕시기(예를 들어, 메톡시기, 에톡시기), 술포닐기, 할로겐 원자, 아미노기, 메틸아미노기 및 디메틸아미노기에서 선택되는 1개 이상의 기로 치환되어도 되는 탄소수 1 내지 4의 직쇄 혹은 분지 알킬기(예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, t-부틸기)이다. 혹은, R12는, 바람직하게는 R10 또는 R11과 결합해서 산소 원자를 1개 또는 2개 포함하는 3 내지 8원의 복소환기(예를 들어, 디옥솔라닐, 디옥사닐)를 형성한다.
L로서 바람직하게는, -(직쇄 혹은 분지 알킬렌-O-)n-(n은 1 내지 10의 정수) 또는 단결합이다. 직쇄 혹은 분지 알킬렌은, 예를 들어 탄소수 1 내지 4, 바람직하게는 탄소수 2 또는 3, 보다 바람직하게는 탄소수 2의 알킬렌일 수 있다.
예를 들어, 상기 식 (I)에 있어서, -O-L-R12로 표현되는 기는, 이하의 식 (II)로 표시되는 기여도 된다.
Figure pct00002
[식 중, n은 0 내지 10의 정수를 나타낸다.]
또한, 예를 들어 상기 식 (I)에 있어서, -O-L-R12로 표현되는 기는, 수산기 또는 이하에서 선택되는 기여도 된다.
Figure pct00003
또한, 예를 들어 상기 식 (I)에 있어서,
Figure pct00004
로 표현되는 부분 구조는, 이하의 식(식 중, m은 1 내지 3의 정수, q는 0 또는 1을 나타낸다)으로 표현되는 구조여도 된다.
Figure pct00005
본 발명의 화합물로서, 바람직하게는 예를 들어 식 (III)의 화합물을 들 수 있다. 또한, 식 (III)에 있어서, 아미노산의 조합을 적절히 변경한 화합물도 또한, 본 발명의 화합물로서 바람직하게 예시할 수 있다.
Figure pct00006
화합물 (I)의 염으로서는, 염기 부가염, 산 부가염, 아미노산염 등을 들 수 있다. 염기 부가염으로서는, 예를 들어 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 금속염; 암모늄염, 메틸아민염, 디메틸아민염, 디시클로헥실아민염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염, N,N-비스(히드록시에틸)피페라진염, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올염, 에탄올아민염, N-메틸글루카민염, L-글루카민염, 트리에틸아민염, 피페리딘염, 모르폴린염 등의 유기 아민염; 또는 리신, δ-히드록시리신, 아르기닌 등의 염기성 아미노산과의 염을 들 수 있다. 산 부가염으로서는, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 시트르산염, 옥살산염, 아세트산염, 프로피온산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 말레산염, 말산염, 숙신산염, 벤조산염, 만델산염, 신남산염, 락트산염, 글리콜산염, 글루쿠론산염, 아스코르브산염, 니코틴산염, 살리실산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 아미노산염으로서는 글리신염 등을 예시할 수 있다. 무엇보다, 본 발명의 화합물의 염은 이들에 한정되는 일은 없다.
화합물 (I)은 치환기의 종류에 따라 1개 또는 2개 이상의 비대칭 탄소를 갖는 경우가 있고, 광학 이성체 또는 디아스테레오 이성체 등의 입체 이성체가 존재하는 경우가 있다. 순수한 형태의 입체 이성체, 입체 이성체의 임의의 혼합물, 라세미체 등은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염은, 수화물 또는 용매화물로서 존재하는 경우도 있지만, 이들 물질은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 용매화물을 형성하는 용매의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 에탄올, 아세톤, 이소프로판올 등의 용매를 예시할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「화합물 (I)」에 관한 언급은, 그것이 명확하게 부적합한 경우를 제외하고, 명시되어 있지 않은 경우에도, 화합물 (I)의 이성체의 임의의 혼합물 또는 특정한 입체 이성체, 화합물 (I)의 약리학적으로 허용되는 염, 수화물 및 용매화물, 그리고 화합물 (I)의 약리학적으로 허용되는 염의 수화물 또는 용매화물도 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 화합물 (I)을 포함하는 형광 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 형광 프로브는, 효소와의 접촉에 의해, 형광 응답을 하는 프로브이다. 바람직하게는, 본 발명의 형광 프로브는, 효소와 반응하지 않는 상태에서는 형광을 발하지 않고, 효소와 반응함으로써 형광을 발한다. 이러한 효소로서는, 칼파인이 포함된다. 즉, 해당 형광 프로브는, 칼파인의 존재 하에서 형광 응답을 하는 점에서, 칼파인 활성 검출용으로 할 수 있다. 또한, 본 발명은 화합물 (I) 또는 그의 염을 유효 성분으로서 포함하는 칼파인 활성 측정제를 포함한다.
칼파인은 인간의 칼파인-1(μ-칼파인, μCANP, μ80K, 칼파인 I, CDP I)의 촉매 도메인에 유의미하게 상동성이 있는 배열 영역을 갖는 유전자 산물이며, 칼파인-1 내지 16을 포함한다. 예를 들어, 칼파인-1은 CAPN1과 CAPNS1의 헤테로 이량체이며, 칼파인-2는 CAPN2와 CAPNS1과의 헤테로 이량체이다. 칼파인이 다양한 질환에 관여하는 것이 알려져 있기 때문에, 화합물 (I)은 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단약으로서 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 화합물 (I)을 함유하는, 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
칼파인 활성에 관련된 질환이란, 칼파인의 발현 또는 그 활성이 발증 또는 증악화에 기여하는 질환일 수 있다. 칼파인 활성에 관련된 질환으로서는, 예를 들어 정상 안압 녹내장을 포함하는 녹내장, 상염색체 우성 신생 혈관 염증성 초자체 망막증, 망막 색소 변성증, 가령 황반 변성, 당뇨병에 수반하는 망막 신경 장애 또는 망막 혈관 폐색성 질환, 망막 허혈 등의 망막 질환 또는 망막 신경 장애 , 혹은 백내장 등의 안질환; 근디스트로피 등의 근질환; 당뇨병; 급성 식도염, 다발성 경화증, 특발성 염증성 근질환, 자기 면역성 뇌염 등의 염증성 질환 또는 자기 면역 질환; 척수 손상, 파킨슨병, 신경 변성 질환, 활뇌증, 알츠하이머병, 척수 소뇌 변성증 등의 신경 질환; 심허혈 재관류 장애, 만성 심질환, 복부 대동맥류·아테로마성 동맥경화증 등의 심·혈관 질환; 흑색종, 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 자궁경암, 난소암, 연부 육종 등의 암; 뇌종양; 가령 증후군; 조로증; 말라리아 감염증, 트리파노소마증, 아프리카 수면병, 시스토소마(주혈흡충)증, 리슈마니아증, 겸형 적혈구증 등의 기생충·병원성 미생물의 감염증; 외상성 뇌장애; 마카도 조셉병; 자간전증; 폐섬유증을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 (I)은, 칼파인 저해제와 조합하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 화합물 (I)은 칼파인 저해제의 적응이나 치료 효과를 판정하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 치료 대상 후보 또는 당해 후보 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)과의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는 치료 대상을 동정 또는 선택하는 것 및 당해 감수성을 갖는 치료 대상으로, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 칼파인 활성에 관련된 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 치료 대상에 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것, 및 당해 치료 대상 또는 치료 대상 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)과의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 당해 의약 조성물의 치료 효과를 판정하는 것을 포함하는, 의약 조성물의 치료 효과의 판정 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료하기 위한 의약 조성물이며, 치료 대상 후보 또는 당해 후보 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)과의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는다고 판정된 치료 대상에 투여되는, 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 해당 의약 조성물의 제조에 있어서의 칼파인 저해제의 사용에도 관한 것이다. 치료 대상 후보 또는 당해 후보 유래의 샘플 등에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)과의 상호 작용에 의한 형광 응답은, 형광 이미징 방법을 사용해서 가시화 또는 화상화할 수 있다. 예를 들어, 치료 대상 후보 또는 당해 후보 유래의 샘플 등에 있어서 측정되는 화합물 (I)로부터의 형광 강도에 기초하여, 칼파인의 농도 혹은 양 또는 칼파인 활성을 얻을 수 있다. 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는 치료 대상의 동정 또는 선택은, 예를 들어 후술하는 D항에 기재된 방법을 사용해서 행할 수 있다. 또한, 의약 조성물의 치료 효과의 판정은, 예를 들어 후술하는 C항에 기재된 방법을 사용해서 행할 수 있다. 상기 의약 조성물의 대상 질환으로서는, 상술한 칼파인 활성에 관련된 질환이면 되고, 예를 들어 녹내장 질환이어도 된다. 본 발명은 또한, 칼파인 활성에 관련된 질환의 예방에 있어서, 예방 대상에 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것, 및 당해 예방 대상 또는 예방 대상 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)과의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 당해 의약 조성물의 예방 효과를 판정하는 것을 포함하는, 의약 조성물의 예방 효과의 판정 방법에 관한 것이다. 예방 대상의 동정 또는 선택은, 치료 대상의 동정 또는 선택과 마찬가지로 하여 행할 수 있다. 치료 대상 또는 예방 대상은, 대표적으로는 포유류 대상이다.
일 양태에 있어서 본 발명의 형광 프로브(보다 구체적으로는, 화합물 (I))는 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 사용한 당해 질환의 치료 또는 예방에 있어서, 그 효과의 정도를 판정하기 위해서, 당해 의약 조성물과 조합해서 사용될 수 있다. 다른 양태에 있어서 본 발명의 형광 프로브(보다 구체적으로는, 화합물 (I))는 치료 대상 후보 또는 예방 대상 후보가, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 사용한 치료 대상 또는 예방 대상에 해당하는지의 여부를 미리 검사하기 위한 진단약(소위, 컴패니언 진단약)으로서 사용될 수 있다.
일 양태에 있어서 본 발명은, 화합물 (I)을 유효 성분으로서 함유하는, 암 외과 치료 또는 암 검사에 있어서 사용되는 암 진단약 또는 암 영역 특정용 의약 조성물이어도 되고, 암 외과 치료 또는 암 검사로서는, 예를 들어 개두, 개흉 혹은 개복 등의 개창 수술, 경시하 수술, 또는 내시경 검사를 들 수 있다. 본 발명의 암 진단약 또는 암 영역 특정용 의약 조성물은, 수술 중 신속 진단용으로 할 수도 있다.
본 발명의 형광 프로브(보다 구체적으로는, 화합물 (I))는 일 양태에 있어서, 카텝신과 반응하지 않는 상태에서는 형광을 발하지 않고, 카텝신과 반응함으로써 형광을 발한다. 즉, 해당 형광 프로브는, 카텝신의 존재 하에서 형광 응답을 하는 점에서, 카텝신 활성 검출용으로 할 수 있다.
카텝신은 리소좀에 국재하는 산성 프로테아제의 총칭이며, 시스테인을 활성 부위로 하는 카텝신 B, C, F, H, K, L1, L2, O, S, W, X/Z, 세린을 활성 부위로 하는 카텝신 A, G, 아스파르트산을 활성 부위로 하는 카텝신 D, E를 포함한다. 카텝신은 췌액에 포함되어 있는 점에서, 카텝신의 존재 하에서 형광 응답을 하는 본 발명의 형광 프로브(보다 구체적으로는, 화합물 (I))는 췌액의 검출에 사용할 수 있다. 따라서, 일 양태에 있어서 본 발명은, 화합물 (I)을 포함하는 췌액 검출용 키트일 수 있다. 키트는, 샘플 채취 기구, 샘플 처리액 등의 시약을 포함하고 있어도 되고, 또한 검출에 필요한 기구 등을 포함하고 있어도 된다.
본 발명은 또한, 이하의 방법을 제공한다.
[A] 샘플 중의 칼파인 활성의 측정 방법이며, 화합물 (I)과 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
[B1] 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 화합물 (I)과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
[B2] 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단 방법이며, 화합물 (I)을, 상기 포유류 대상에 투여하는 것, 상기 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 상기 포유류 대상이 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있을 가능성을 판정하는 것을 포함하는, 방법.
[C] 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 후보 화합물의 치료 효과를 판정하기 위한 시험 방법으로서, 칼파인 활성에 관련된 질환 모델에 있어서, 후보 화합물이 미투여 및 투여의 샘플을 조제하는 것, 화합물 (I)과, 상기 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
[D1] 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 모니터링을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 화합물 (I)과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 상기 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
[D2] 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 모니터링 방법이며, 화합물 (I)을, 상기 포유류 대상에 투여하는 것, 상기 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 칼파인 활성에 관련된 질환의 경과를 판정하는 것을 포함하는, 방법.
본 발명은 또한, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서, 치료 혹은 예방 대상 후보 또는 해당 후보 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 화합물 (I)의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는다고 판정된 치료 또는 예방 대상에 투여되는, 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 프로브는, 종래 형의 HMRG 프로브와 비교하여, 칼파인과의 반응성이 향상되고 있는 점에서, 보다 고감도로 칼파인 활성을 검출할 수 있다.
도 1의 (a)는 각 pH에 있어서의 화합물 19의 흡수 스펙트럼이고, (b)는 각 pH에 있어서의 화합물 19의 형광 스펙트럼이다.
도 2의 (a)는 화합물 19로의 칼파인-1 첨가에 의한 흡수 스펙트럼의 변화를 도시한 도면이고, (b)는 화합물 19로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 스펙트럼의 변화를 도시한 도면이다.
도 3은 화합물 19로의 칼파인-1 첨가에 의한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 화합물 16 및 화합물 19로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 도시한 도면이다.
도 5의 (a)는 화합물 16 및 화합물 19-25로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 16-18 및 화합물 26-29로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 16 및 화합물 30-36으로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6의 (a)는 화합물 37로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 42로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 45로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7의 (a)는 화합물 48로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 51로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 53으로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8의 (a)는 화합물 55로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 57로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 59로의 칼파인-1 첨가에 의한 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9의 (a)는 화합물 37-41로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 42-44로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 45-47로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10의 (a)는 화합물 48-50으로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 51 및 화합물 52로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 53 및 화합물 54로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11의 (a)는 화합물 55 및 화합물 56으로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (b)는 화합물 57 및 화합물 58로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이고, (c)는 화합물 59-66으로의 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12의 (a)는 화합물 16을 사용한 생세포 이미징이고, (b)는 화합물 19를 사용한 생세포 이미징이다.
도 13의 (a)는 화합물 20을 사용한 생세포 이미징이고, (b)는 화합물 21을 사용한 생세포 이미징이고, (c)는 화합물 22를 사용한 생세포 이미징이다.
도 14의 (a)는 화합물 23을 사용한 생세포 이미징이고, (b)는 화합물 38을 사용한 생세포 이미징이고, (c)는 화합물 56을 사용한 생세포 이미징이다.
도 15는 화합물 19 투여의 안저 촬영상(래트)이다.
도 16은 화합물 19 투여의 안저에 있어서의 HMRG 양성 세포수(래트)이다.
도 17은 NMDA 투여군, 화합물 19 투여의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 18은 PBS 투여군, 화합물 19 투여의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 19는 NMDA 투여군, 화합물 16 투여(19μL)의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 20은 NMDA 투여군, 화합물 16 투여(38μL)의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 21은 PBS 투여군, 화합물 16 투여(19μL)의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 22는 PBS 투여군, 화합물 16 투여(38μL)의 안저 촬영상(토끼)이다.
도 23은 화합물 16 및 화합물 19 투여의 안저에 있어서의 HMRG 양성 세포수(토끼)이다.
도 24는 화합물 19를 사용한 망막 신경절 세포의 형광 이미징이다.
도 25는 화합물 19를 사용한 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직의 형광 촬영상(글루탐산 최종 농도 0μM)이다.
도 26은 화합물 19를 사용한 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직의 형광 촬영상(글루탐산 최종 농도 300μM)이다.
도 27은 화합물 19를 사용한 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직의 형광 촬영상(글루탐산 최종 농도 1mM)이다.
도 28은 화합물 19를 사용한 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직의 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 29는 화합물 19와 화합물 16의 형광 강도의 비교 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 칼파인 저해제 존재 하 또는 비존재 하에서의 화합물 19를 사용한 생세포 이미징이다.
도 31은 칼파인 저해제 투여군 또는 컨트롤군에 있어서의 화합물 19 투여의 안저 촬영상(래트)이다.
도 32는 칼파인 저해제 투여군 또는 컨트롤군에 있어서의 화합물 19 투여의 안저 촬영상(래트)에 있어서의 HMRG 양성 세포수이다.
도 33은 칼파인 저해제 투여군 또는 컨트롤군에 있어서의 화합물 19 투여의 안저 촬영상(래트)에 있어서의 HMRG 양성 세포수이다.
도 34는 칼파인 저해제 투여군 또는 컨트롤군에 있어서의 화합물 19 투여의 안저 촬영상(래트)에 있어서의 HMRG 양성 세포수이다.
도 35는 각 칼파인 저해제 투여군에 있어서의 화합물 19 투여의 안저 촬영상에 있어서의 HMRG 양성 세포수이다.
도 36은 화합물 19를 사용한 iPS 세포 유래 RGC 축삭 모델의 형광 촬영상이다.
도 37은 화합물 19로의 카텝신 B 첨가 또는 미첨가 시의 형광 강도의 경시 변화를 나타낸 그래프이다.
(A. 화합물 (I)의 합성)
화합물 (I)은 임의의 적절한 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 화합물 (I)은 본원 실시예 2에 기재된 방법에 준해서 합성할 수 있다. 실시예 2에 나타내는 합성 스킴에 있어서, 공정 a에서는 HMRG의 N 원자와 아미노산의 C 말단에서 아미드 결합을 형성한다. 이후는, 고상 합성법에 의해, 공정 b에서 화합물 A1을 레진에 담지하고, 순차, 공정 c에 의한 아미노산의 보호기의 탈보호, 공정 d에서 아미노산의 신장을 행한다. 공정 e에서 아미노산의 보호기를 탈보호하고, 공정 f에서 식 (I)의 R12-L-O-C(R10)(R11)의 부분 구조를 갖는 카르복시 화합물 R12-L-O-C(R10)(R11)-COOH 또는 유도되는 산 무수물 혹은 산 할로겐화물 등을 반응시켜서, 펩티드쇄의 N 말단에, R12-L-O-C(R10)(R11)-기를 갖는 아미드기를 결합한다. 공정 g에서 레진으로부터의 잘라내기를 행함으로써, 식 (I)의 화합물을 얻을 수 있다. 공정 g에서는, 적절히 각 치환기 R 및 아미노산 A, 아미노산 B에 포함되는 보호기를 동시에 탈보호할 수도 있다. 얻어지는 식 (I)의 화합물의 조정제물은, 더욱 정제해도 된다. 예를 들어, 얻어진 조정제물은 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제해도 된다.
(B. 칼파인 활성의 측정 방법 또는 검출 방법)
화합물 (I)은 칼파인과 반응해서 형광 응답을 하는 점에서, 칼파인 또는 칼파인 활성의 측정 또는 검출에 사용할 수 있다. 따라서, 다른 양태에 있어서, 본 발명은 샘플 중의 칼파인(또는 칼파인 활성)의 측정 방법(또는 검출 방법)이고, 화합물 (I)과 샘플을 접촉시키는 것, 및 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정(또는 검출)하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 형광이 검출된 경우에는, 해당 샘플 중에 칼파인 또는 칼파인 활성이 존재하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 검출된 형광이 해당 샘플의 칼파인 농도 또는 칼파인 활성의 정도를 나타낼 수 있다. 칼파인(또는 칼파인 활성)의 측정 및 검출은, 측정된 형광 강도를 절댓값으로서 사용함으로써 행해도 되고, 또는 측정된 형광 강도를 형광 강도의 경시적인 변화량이나, 컨트롤의 형광 강도를 비교 대상으로서 측정해도 된다. 이러한 컨트롤의 형광 강도는, 샘플과 동시에 컨트롤을 측정함으로써 얻어도 되고, 미리 컨트롤을 사용하여 얻은 값을 사용해도 된다. 화합물 (I)과 샘플의 접촉은, 화합물 (I)을 포함하는 용액 또는 현탁액을 첨가, 도포, 분무, 혹은 주입함으로써 행하는 것을 들 수 있지만, 샘플의 형태나 측정 환경 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 접촉 시의 온도 조건은 칼파인이 그 촉매 작용을 발휘할 수 있는 한에 있어서 제한되지 않는다. 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광은, 접촉 후의 임의의 시점(예를 들어, 접촉 직후로부터 수시간 경과할 때까지의 임의의 시점)에서, 440 내지 510㎚ 정도의 가시광을 여기 파장으로서 샘플에 조사해서 측정할 수 있다. 또한, 필요에 따라 미리 농도나 활성이 판명되고 있는 칼파인 함유 샘플을 마찬가지 방법으로 측정해서 표준 곡선을 작성하고, 당해 표준 곡선을 이용해서 칼파인 농도나 활성을 산출해도 된다. 샘플로서는, 생체 유래의 조직, 액체, 또는 그들의 처리물; 세포 배양물, 세포 배양 상청, 세포 파쇄물, 세포 용해액, 또는 그들의 처리물; 단리 정제한 효소 등을 사용할 수 있고, 예를 들어 후술하는 포유류 대상 유래의 샘플을 예시할 수 있다. 또한, 상기 칼파인 활성의 측정 또는 검출 방법은, 측정 또는 검출 대상의 샘플로서 생체를 적용함으로써, 인 비보로도 행해질 수 있다. 인 비보로 상기 칼파인 활성의 측정 또는 검출 방법을 행하는 경우, 화합물 (I)과 샘플의 접촉은, 화합물 (I)을 측정 또는 검출 대상의 생체에 투여함으로써 행해진다. 화합물 (I)의 생체로의 투여는, 칼파인 활성의 측정 또는 검출의 대상 부위에 따라서 임의의 적절한 경로 및 방법이 선택될 수 있다. 투여 방법으로서는, 예를 들어 점안, 점비, 점이, 주사, 점적 등을 들 수 있다. 측정 또는 검출 대상의 생체로서는, 후술하는 포유류 대상을 들 수 있다.
이하의 방법에 있어서의 칼파인의 측정은, 상술한 측정 방법에 준해서 행할 수 있다.
(C. 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단 방법)
상술한 바와 같이, 칼파인은 다양한 질환에 관여하는 것이 알려져 있기 때문에, 화합물 (I)을 이용해서 칼파인 활성을 측정함으로써, 칼파인 활성에 관련된 질환을 진단하거나, 그 병상을 판정하거나, 병태를 모니터링할 수 있다. 따라서, 본 발명은 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 화합물 (I)과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제공되는 정보에 기초하여, 상기 진단 대상인 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환을 진단할 수 있다. 제공되는 정보로서는, 형광 강도, 형광을 발하는 세포수(예를 들어, 단위 면적당에 있어서의 소정의 강도 이상의 형광을 발하는 세포수), 형광을 발하는 범위의 면적 등의 형광 응답을 반영하는 정보를 들 수 있다. 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단은, 예를 들어 상기 제공되는 정보를 소정의 기준값과 비교함으로써 행해질 수 있다. 이러한 기준값으로서는, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않은 포유류 대상(이하, 음성 컨트롤) 유래의 샘플에 있어서의 측정값, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있는 포유류 대상(이하, 양성 컨트롤) 유래의 샘플에 있어서의 측정값 등을 들 수 있다. 상기 기준값은, 샘플의 측정과 동시에 측정된 값이어도 되고, 미리 측정된 값이어도 되고, 미리 측정된 값으로부터 통계학적으로 산출한 값이어도 된다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 음성 컨트롤에 기초한 기준값을 초과하는 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우 및/또는 양성 컨트롤에 기초한 기준값 이상의 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우에, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있을 가능성이 있다고 진단할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서는, 음성 컨트롤에 기초한 기준값 이하의 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우 및/또는 양성 컨트롤에 기초한 기준값 미만의 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우에, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않을 가능성이 있다고 진단할 수 있다. 또한, 본 발명은 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 모니터링을 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 화합물 (I)과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제공되는 정보에 기초하여, 상기 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 경과를 판정할 수 있다. 제공되는 정보로서는, 상기와 마찬가지 형광 응답을 반영하는 정보를 들 수 있다. 칼파인 활성에 관련된 질환의 경과의 판정은, 예를 들어 상기 제공되는 정보를 그 이전에 당해 포유류 대상으로부터 얻어진 정보와 비교함으로써 행해질 수 있다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 이전에 얻어진 형광 응답보다 낮은 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우에, 칼파인 활성에 관련된 질환이 치유 또는 개선되고 있거나, 혹은 예방되고 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서는, 이전에 얻어진 형광 응답 이상의 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우에, 칼파인 활성에 관련된 질환이 치유 또는 개선되고 있지 않거나, 혹은 예방되고 있지 않을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서는, 이전에 얻어진 형광 응답과 동일 정도의 형광 응답을 반영하는 정보가 제공된 경우에, 칼파인 활성에 관련된 질환의 진행이 억제되고 있거나 또는 발증이 예방되고 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다.
다른 양태에 있어서 본 발명은, 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단 방법이며, 화합물 (I)을, 상기 포유류 대상에 투여하는 것, 상기 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 상기 포유류 대상이 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있을 가능성을 판정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 측정 결과는, 예를 들어 상기와 마찬가지로, 형광 강도, 형광을 발하는 세포수(예를 들어, 단위 면적당에 있어서의 소정의 강도 이상의 형광을 발하는 세포수), 형광을 발하는 범위의 면적 등의 형광 응답을 반영하는 정보일 수 있다. 상기 포유류 대상이 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있을 가능성의 판정은, 예를 들어 상기 측정 결과를 소정의 기준값과 비교함으로써 행해질 수 있다. 이러한 기준값으로서는, 음성 컨트롤에 있어서의 측정값, 양성 컨트롤에 있어서의 측정값 등을 들 수 있다. 상기 기준값은, 샘플의 측정과 동시에 측정된 값이어도 되고, 미리 측정된 값 또는 미리 측정된 값으로부터 통계학적으로 산출한 값이어도 된다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 측정 결과가 음성 컨트롤에 기초한 기준값을 초과하는 경우 및/또는 양성 컨트롤에 기초한 기준값 이상인 경우에, 상기 포유류 대상이 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서는, 측정 결과가 음성 컨트롤에 기초한 기준값 이하인 경우 및/또는 양성 컨트롤에 기초한 기준값 미만인 경우에, 상기 포유류 대상이 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 또한, 본 발명은, 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 모니터링 방법이며, 화합물 (I)을, 상기 포유류 대상에 투여하는 것, 상기 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 칼파인 활성에 관련된 질환의 경과를 판정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 측정 결과는, 예를 들어 상기 형광 응답을 반영하는 정보일 수 있다. 상기 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 경과의 판정은, 예를 들어 상기 측정 결과를 그 이전에 당해 포유류 대상에 있어서 측정된 측정 결과와 비교함으로써 행해질 수 있다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 이전의 측정 결과 이상의 형광 응답을 나타내는 측정 결과가 얻어진 경우, 칼파인 활성에 관련된 질환이 치유 또는 개선되고 있지 않거나, 혹은 예방되고 있지 않을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서는, 이전의 측정 결과보다 낮은 형광 응답을 나타내는 측정 결과가 얻어진 경우, 칼파인 활성에 관련된 질환이 치유 또는 개선되고 있거나, 혹은 예방되고 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다. 또 다른 실시 형태에 있어서는, 이전의 측정 결과와 동일 정도의 형광 응답을 나타내는 측정 결과가 얻어진 경우, 칼파인 활성에 관련된 질환의 진행이 억제되고 있거나 또는 발증이 예방되고 있을 가능성이 있다고 판정할 수 있다.
「모니터링」은 후보 치료약을 상기 포유류 대상에 투여하거나, 또는 후보가 되는 치료 방법을 상기 포유류 대상에 적용한 후에, 그 치료 효과를 판정하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 모니터링 방법은, 모니터링 공정 전에 후보 치료약을 상기 포유류 대상에 투여하는 것, 또는 후보가 되는 치료 방법을 상기 포유류 대상에 적용하는 것을 포함하고, 질환이 치유 또는 개선되고 있지 않은 것이 당해 치료약 또는 치료 방법이 효과가 없는 것을 나타내고, 질환이 치유 또는 개선되고 있는 것 또는 질환의 진행이 억제되고 있는 것이 당해 치료약 또는 치료 방법이 효과가 있는 것을 나타내고 있어도 된다.
예를 들어, 안과 영역에 있어서는, 화합물 (I)을 포유류 대상에 투여하는 경우, 안과 영역에서 이미 범용되고 있는 플루오레세인 형광 안저 조영 검사 기기를 사용함으로써, 형광 관찰이 가능하다.
본 명세서에 있어서, 「포유류 대상 유래의 샘플」이란, 포유류 대상으로부터 채취된 검체를 의미하고, 조직 또는 체액을 들 수 있다. 「체액」이란, 피험자 유래의 액체를 의미하고, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 전혈 또는 혈구의 용혈액 등의 혈액; 타액; 오줌; 눈물; 침출액; 림프액: 장액; 수액; 뇌척수액; 관절액; 안방수; 유리체액 또는 그들 분획물 혹은 처리물, 그리고 이들의 희석액이나 농축액을 들 수 있다.
칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않는 컨트롤 샘플로서는, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않는 것이 알려져 있는 포유류 대상 유래의 샘플, 또는 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하지 않는 것이 명확한 포유류 대상 유래의 샘플이어도 된다. 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있는 컨트롤 샘플로서는, 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있는 것이 알려져 있는 포유류 대상 유래의 샘플, 또는 칼파인 활성에 관련된 질환으로 이환하고 있는 것이 명확한 포유류 대상 유래의 샘플이어도 된다.
상기 포유류 대상 유래의 샘플과 화합물 (I)과의 접촉은, 인 비보, 인 비트로, 또는 엑스 비보로 행할 수 있다.
「포유류 대상」으로서는, 예를 들어 인간, 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 양, 토끼, 래트 등의 포유 동물을 포함하고, 바람직하게는 인간이다.
본 명세서 전체에 있어서, 판정이나 가능성은, 그것에 의해 포유류 대상(예를 들어, 환자)의 상태를 예측하는 것을 의미하고, 100%의 정확함으로 판단 가능한 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서 전반에 있어서, 비교되는 「형광 강도」는, 필요에 따라 당해 형광 강도로부터 산출된 값(예를 들어, 농도, 양, 또는 활성값)으로 변환된 값이어도 된다. 예를 들어, 미리 농도가 판명되어 있는 칼파인 함유 샘플을 마찬가지 방법으로 측정해서 표준 곡선을 작성하고, 당해 표준 곡선을 이용해서 칼파인 농도를 산출하고, 칼파인 농도를 사용해서 샘플간의 형광 강도의 상승(농도 상승)을 비교해도 된다.
(D. 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상의 선택 및 치료 방법)
칼파인 활성에 관련된 질환의 치료약으로서 칼파인 저해제가 알려져 있다. 특히, 당해 질환에 있어서, 칼파인 농도가 높거나 또는 칼파인 활성이 강한 경우, 칼파인 저해제가 효과를 발휘하기 쉽다(환언하면, 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는다)고 생각된다. 따라서, 본 발명은 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상을 선택하는 방법으로서, 화합물 (I)과, 피험 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상을 선택하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 혹은, 본 발명은 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상을 선택하는 방법으로서, 화합물 (I)을 피험 포유류 대상에 투여하는 것, 상기 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상을 선택하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 측정 결과는, 예를 들어 C항에 기재된 형광 응답을 반영하는 정보일 수 있다. 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상의 선택은, 예를 들어 상기 측정 결과를 소정의 기준값과 비교함으로써 행해질 수 있다. 이러한 기준값으로서는, 음성 컨트롤에 있어서의 측정값, 양성 컨트롤에 있어서의 측정값 등을 들 수 있다. 상기 기준값은, 샘플의 측정과 동시에 측정된 값이어도 되고, 미리 측정된 값 또는 미리 측정된 값으로부터 통계학적으로 산출한 값이어도 된다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 측정 결과가 음성 컨트롤에 기초한 기준값을 초과하는 경우 및/또는 양성 컨트롤에 기초한 기준값 이상인 경우에, 상기 피험 포유류 대상을, 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상으로서 선택할 수 있다.
상기 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상의 치료 방법은, 또한 칼파인 저해제에 의해 치료 가능한 포유류 대상으로서 선택된 포유류 대상에 칼파인 저해제를 투여하는 것을 포함하고 있어도 된다.
칼파인 저해제로서는, ALLNal, PD150606, calpeptin, MDL28170, Calpain inhibitor XI(AK295), calpastatin peptide(CAST), SNJ-1945, SJA6017, ABT-957, BDA-410, Macrocyclic aldehyde(CAT811), NH2-GRKKRRQRRRPP QPDALKSRTLR-COOH(Tat-μCL), Dipeptidyl α,β-unsaturated ester, Hypervalent organotellurium compound(RF19), Sm-p80(재조합 단백질)을 들 수 있다.
(E. 칼파인 활성에 관련된 질환의 치료약 스크리닝 방법)
나아가, 화합물 (I)은 특정한 후보 화합물이나 치료 방법이 칼파인 레벨 또는 칼파인 활성에 영향을 주는지의 여부를 측정하는 데 사용할 수 있는 점에서, 칼파인을 표적으로 한 치료 효과를 조사할 수 있다. 따라서, 화합물 (I)은 칼파인 활성에 관련된 질환의 치료약 스크리닝 방법에 사용할 수 있다. 일례로서, 본 발명은 후보 화합물 또는 후보 치료 방법의 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 치료 효과를 판정하기 위한 방법이며, 칼파인 활성에 관련된 질환 모델에, 후보 화합물을 투여하는 것 또는 후보 치료 방법을 적용하는 것, 화합물 (I)과 상기 질환 모델 유래의 샘플을 접촉시키는 것 또는 상기 질환 모델에 화합물 (I)을 투여하는 것, 상기 접촉 또는 투여 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것, 및 측정 결과에 기초하여 상기 후보 화합물 또는 후보 치료 방법의 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 치료 효과를 판정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 측정 결과는, 예를 들어 C항에 기재된 형광 응답을 반영하는 정보일 수 있다. 치료 효과의 판정은, 예를 들어 상기 측정 결과를 소정의 기준값과 비교함으로써 행해질 수 있다. 이러한 기준값으로서는, 후보 화합물 미투여 또는 후보 치료 방법의 미 적용의 질환 모델에 있어서의 측정 결과가 사용될 수 있다. 1개의 실시 형태에 있어서는, 측정 결과가 상기 소정의 기준값 이상의 형광 응답을 나타내는 경우에, 상기 화합물 또는 치료 방법에 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 치료 효과가 없다고 판정할 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서는, 측정 결과가 상기 소정의 기준값 미만의 형광 응답을 나타내는 경우에, 상기 화합물 또는 치료 방법에 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 치료 효과가 있다고 판정할 수 있다. 또한, 본 발명은, 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 후보 화합물의 치료 효과를 판정하기 위한 시험 방법으로서, 칼파인 활성에 관련된 질환 모델에 있어서, 후보 화합물이 미투여 및 투여의 샘플을 조제하는 것, 화합물 (I)과 상기 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 당해 측정 결과에 기초하여, 상기와 마찬가지로 하여, 후보 화합물의 치료 효과를 판정할 수 있다. 칼파인 활성에 관련된 질환 모델로서는, 예를 들어 NMDA에서 유도되는 망막 질환 모델, 글루탐산에서 유도되는 망막 신경절 세포 장애 모델 등을 들 수 있다.
본 명세서 전체에 있어서, 「레벨」이란, 수치화된 존재량에 관한 지표를 의미하고, 예를 들어 농도, 양 혹은 그 대신으로서 사용할 수 있는 지표를 포함한다. 따라서, 레벨은 형광 강도 등의 측정값 그 자체여도 되고, 농도로 환산된 값이어도 된다. 또한, 레벨은, 절대적인 수치(존재량, 단위 면적당 존재량 등)여도 되고, 또는 필요에 따라 설정된 비교 대조와 비교한 상대적인 수치여도 된다
본 명세서 전반에 있어서, 칼파인 활성에 관련된 질환이 안과 질환인 경우, 화합물 (I)의 투여는, 초자체 주사에 의해 행할 수 있다.
(F. 카텝신 활성의 측정 방법 또는 검출 방법)
화합물 (I)은 카텝신과 반응해서 형광 응답을 하는 점에서, 카텝신 또는 카텝신 활성의 측정 또는 검출에 사용할 수 있다. 따라서, 다른 양태에 있어서, 본 발명은, 샘플 중 카텝신(또는 카텝신 활성)의 측정 방법(또는 검출 방법)이며, 화합물 (I)과 샘플을 접촉시키는 것, 및 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광을 측정(또는 검출)하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 형광이 검출된 경우에는, 해당 샘플 중에 카텝신 또는 카텝신 활성이 존재하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 검출된 형광이 해당 샘플의 카텝신 농도 또는 카텝신 활성의 정도를 나타낼 수 있다. 카텝신(또는 카텝신 활성)의 측정 및 검출은, 측정된 형광 강도를 절댓값으로서 사용함으로써 행해도 되고, 또는 측정된 형광 강도를 형광 강도의 경시적인 변화량이나, 컨트롤의 형광 강도를 비교 대상으로서 측정해도 된다. 이러한 컨트롤의 형광 강도는, 샘플과 동시에 컨트롤을 측정함으로써 얻어도 되고, 미리 컨트롤을 사용하여 얻은 값을 사용해도 된다. 샘플, 화합물 (I)과 샘플의 접촉, 접촉 후의 화합물 (I)로부터의 형광의 측정에 대해서는, 칼파인 활성의 측정 방법 또는 검출 방법에 관해서 기재한 바와 같다.
이하에 실시예를 사용해서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본원 명세서 전체를 통해서 인용하는 문헌은, 참조에 의해 그 전체가 본원 명세서에 포함된다.
실시예
(실시예 1) 화합물 1-5의 합성
(1) 화합물 1의 합성
Figure pct00007
NaH(1.20g, 30.0mmol)의 THF 용액(30mL)에, 0℃에서, 에틸렌글리콜모노터트부틸에테르(1.4mL, 11.0mmol), 브로모아세트산(1.39g, 10.0mmol)을 더하여, 실온에서 14시간 교반했다. 반응 용액에 물을 더하여, 디에틸에테르로 추출했다. 수상에 2M 염산을 더하여, 용액을 중화하고, 아세트산에틸로 추출했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거해서 목적 화합물을 얻었다(1.22g, 69%).
1H NMR(400㎒, CDCl3)δ1.26(9H, s), 3.55-3.59(2H, m), 3.72-3.77(2H, m), 4.14(2H, s)
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 199.0946; found, 199.0941(-0.5mmu)
(2) 화합물 2의 합성
Figure pct00008
NaH(1.20g, 30.0mmol)의 THF 용액(30mL)에, 0℃에서, N,N-디메틸아미노에탄올(1.1mL, 11.0mmol), 브로모아세트산(1.39g, 10.0mmol)을 더하여, 실온에서 14시간 교반했다. 반응 용액에 2M 염산을 더하여, 디에틸에테르로 추출했다. 수상을 회수하고, 용매를 감압 증류 제거해서 목적 화합물을 얻었다(1.80g, 98%).
1H NMR(400㎒, D2O)δ2.95(6H, s), 3.39(2H, t, J=4.8㎐), 3.89(2H, t, J=4.8㎐), 4.19(2H, s)
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 148.0968; found, 148.0967(-0.1mmu)
(3) 화합물 3의 합성
Figure pct00009
NaH(0.40g, 10.0mmol)의 THF 용액에, 0℃에서, 3-(터트-부톡시카르보닐아미노)-1-프로판올(1.0mL, 5.88mmol), 브로모아세트산(742㎎, 5.34mmol)을 더하여, 실온에서 19.5시간 교반했다. 반응 용액에 증류수를 더하여, 디클로로메탄으로 추출했다. 수상에 2M 염산을 더하여, 용액을 중화하고, 디클로로메탄으로 추출했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(전개 용매:헥산/아세트산에틸=85/15→35/65)로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(0.578g, 46%).
1H NMR(400㎒, CDCl3)δ1.44(9H, s), 1.78(2H, q, J=6.0㎐), 3.32(2H, br-s), 3.60(2H, t, J=6.0㎐), 4.09(2H, s)
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 256.1161; found, 256.1151(-1.0mmu)
(4) 화합물 4의 합성
Figure pct00010
NaH(2.00g, 50.0mmol)의 THF 용액에, 0℃에서, 3-메틸-3-옥세탄메탄올(2.4mL, 30.0mmol), 브로모아세트산(1.39g, 10.0mmol)을 더하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응 용액에 물을 더하여, 디에틸에테르로 추출했다. 수상에 2M 염산을 더하여, 용액을 중화하고, 아세트산에틸로 추출했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거해서 목적 화합물을 얻었다(1.7g, 79%).
1H NMR(400㎒, CDCl3)δ1.34(3H, s), 3.66(2H, s), 4.19(2H, s), 4.42(2H, d, J=6.0㎐), 4.60(2H, d, J=6.0㎐)
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 183.0633; found, 183.0629(-0.4mmu)
(5) 화합물 5의 합성
Figure pct00011
NaH(0.60g, 15.0mmol)의 THF 용액에, 0℃에서, 2-프로판올(0.77mL, 10.0mmol), 브로모아세트산(0.695g, 5.0mmol)을 더하여, 실온에서 21시간 교반했다. 반응 용액에 물을 더하여, 디클로로메탄으로 추출했다. 수상에 2M 염산을 더하여, 용액을 중화하고, 디클로로메탄으로 추출했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거해서 목적 화합물을 얻었다(0.219g, 37%).
1H NMR(400㎒, CDCl3)δ1.24(6H, d, J=6.0㎐), 3.76(1H, qn, J=6.0㎐), 4.08(2H, s)
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 119.0703; found, 119.0704(0.1mmu)
(실시예 2) 화합물 A7 및 화합물 A7'의 합성
이하의 스킴에 기재된 스텝에 의해, 다양한 펩티드 부위를 갖는 화합물 A7 및 화합물 A7'를 합성했다.
Figure pct00012
(1) 화합물 A1로서, 화합물 6 내지 화합물 15를 합성했다.
Figure pct00013
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 670.2370; found, 670.2311(-5.9mmu)
Figure pct00014
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 696.3068; found, 696.3093(2.5mmu)
Figure pct00015
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 918.3650; found, 918.3627(-2.3mmu)
Figure pct00016
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 758.3225; found, 758.3242(1.7mmu)
Figure pct00017
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 686.2649; found, 686.2654(0.5mmu)
Figure pct00018
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 682.2912; found, 682.2914(0.2mmu)
Figure pct00019
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 909.3647; found, 909.3628(-1.9mmu)
Figure pct00020
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 947.3797; found, 947.3770(-2.7mmu)
Figure pct00021
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 767.3439; found, 767.3486(4.7mmu)
Figure pct00022
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 652.2806; found, 652.2797(-0.9mmu)
(2) 화합물 A7 및 화합물 A7'로서, 화합물 16 내지 60을 합성했다.
(2-1) 화합물 16의 합성
Figure pct00023
HMRG 염산염(고료 카야꾸 가부시키가이샤, 1.41g, 2.83mmol)의 DMF 용액(13mL)에, 실온에서 DIPEA(2.1mL, 12.0mmol), Fmoc-Met-OH(1.49g, 4.00mmol), HATU(1.52g, 4.00mmol)를 더하여, 15시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거하고, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피로 조정제했다. 얻어진 화합물 6은, 가일층의 정제를 하지 않고, 다음 공정에 사용했다.
화합물 6의 디클로로메탄 용액(10mL)에, 실온에서 DIPEA(1.0mL, 5.73mmol), Cl-Trt(2-Cl)-레진(818㎎, 1.33mmol)을 더하여, 15시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 DMF로 세정하고, 화합물 A2(A=Met)를 얻었다.
화합물 A2(A=Met)에 20% 피페리딘/DMF 용액(10mL)을 더하여, 실온에서 1시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 DMF, CH2Cl2의 순으로 세정하고, 화합물 A3(A=Met)을 얻었다.
화합물 A3(A=Met)에, DMF(20mL), DIPEA(2.1mL, 12.0mmol), Fmoc-Leu-OH(1.41g, 3.99mmol), HATU(1.52g, 3.99mmol)를 순차 더하여, 실온에서 13.5시간 진탕했다. 레진을 DMF로 세정하고, 화합물 A4(A=Met, B=Leu)를 얻었다.
화합물 A4(A=Met, B=Leu)에 20% 피페리딘/DMF 용액(10mL)을 더하여, 실온에서 1시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 DMF, CH2Cl2의 순으로 세정했다. 레진을 진공 건조해서 화합물 A5(A=Met, B=Leu)를 얻었다.
0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Met, B=Leu)에 20% Ac2O/CH2Cl2 용액을 1mL 더하여, 실온에서 1시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 CH2Cl2로 세정하고, 화합물 A6'(A=Met, B=Leu, R=Me)를 얻었다.
화합물 A6'(A=Met, B=Leu, R=Me)에 TFA/TES/H2O=15:1:1 용액(1mL)을 더하여, 차광 하에서 실온에서 1시간 진탕했다. 레진을 여과 제거하고, 여액을 감압 증류 제거했다. 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(H2O(0.1% TFA)/CH3CN(0.1% TFA)=80:20→65:35)로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(7.6㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 603.2636; found, 603.2643(0.7mmu)
(2-2) 화합물 17의 합성
Figure pct00024
0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Met, B=Leu)에 DMF(4mL), DIPEA(0.09mL, 0.50mmol), 프로피온산(0.014mL, 0.15mmol), HATU(57.0㎎, 0.15mmol)를 순차 더하여, 실온에서 12시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 DMF, CH2Cl2로 순차 세정했다. TFA/TES/H2O=15:1:1 용액(1mL)을 더하여, 차광 하에서 실온에서 1시간 진탕했다. 레진을 여과 제거하고, 여액을 감압 증류 제거했다. 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(H2O(0.1% TFA)/CH3CN(0.1% TFA)=80:20→65:35)로 정제하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.5㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 617.2792; found, 617.2802(1.0mmu)
(2-3) 화합물 18의 합성
Figure pct00025
화합물 18을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 부티르산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.3㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 631.2949; found, 631.2962(1.3mmu)
(2-4) 화합물 19의 합성
Figure pct00026
화합물 19를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 메톡시아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(12.8㎎).
1H NMR(400㎒, CD3OD+Na2CO3)
δ0.94(3H, d, J=6.0Hz), 0.97(3H, d, J=6.0Hz), 1.59-1.73(3H, m), 1.97-2.08(1H, m), 2.09(3H, s), 2.11-2.21(1H, m), 2.49-2.65(2H, m), 3.43(3H, s), 3.94(2H, s), 4.51(1H, t, J=7.2Hz), 4.59(1H, dd, J=5.2, 9.2Hz), 5.25(2H, s), 6.41(1H, d, J=8.4Hz), 6.50(1H, s), 6.65(1H, d, J=8.4Hz), 6.81(1H, d, J=7.6Hz), 6.84(1H, d, J=8.8Hz), 7.13(1H, d, J=8.8Hz), 7.27(1H, t, J=7.2Hz), 7.38(1H, t, J=7.6Hz), 7.41(1H, t, J=7.6Hz), 7.62(1H, s)
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 633.2741; found, 633.2723(-1.8mmu)
(2-5) 화합물 20의 합성
Figure pct00027
화합물 20을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 2-(2-메톡시에톡시)아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(16.3㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 677.3003; found, 677.2997(-0.6mmu)
(2-6) 화합물 21의 합성
Figure pct00028
화합물 21을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 [2-(2-메톡시에톡시)에톡시]아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(19.7㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 721.3266; found, 721.3246(-2.0mmu)
(2-7) 화합물 22의 합성
Figure pct00029
화합물 22를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 2-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에톡시]아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(5.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 765.3528; found, 765.3520(-0.8mmu)
(2-8) 화합물 23의 합성
Figure pct00030
화합물 23을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 [2-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(10.8㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 809.3790; found, 809.3821(3.1mmu)
(2-9) 화합물 24의 합성
Figure pct00031
화합물 24를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 [2-[2-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(10.8㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 853.4052; found, 853.4048(-0.4mmu)
(2-10) 화합물 25의 합성
Figure pct00032
화합물 25를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 [2-[2-[2-[2-[2-(2-메톡시에톡시)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(10.8㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 897.4314; found, 897.4312(-0.2mmu)
(2-11) 화합물 26의 합성
Figure pct00033
화합물 26을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 히드록시아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 619.2585; found, 619.2595(1.0mmu)
(2-12) 화합물 27의 합성
Figure pct00034
화합물 27을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 에톡시아세트산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(8.2㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 647.2898; found, 647.2898(0.0mmu)
(2-13) 화합물 28의 합성
Figure pct00035
화합물 28을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 화합물 4를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(11.8㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 703.3160; found, 703.3160(0.0mmu)
(2-14) 화합물 29의 합성
Figure pct00036
화합물 29를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 화합물 3을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(11.8㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 676.3163; found, 676.3137(-2.6mmu)
(2-15) 화합물 30의 합성
Figure pct00037
화합물 30을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 화합물 1을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(13.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 663.2847; found, 663.2837(-1.0mmu)
(2-16) 화합물 31의 합성
Figure pct00038
화합물 31을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 화합물 5를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(28.3㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 661.3054; found, 661.3044(-1.0mmu)
(2-17) 화합물 32의 합성
Figure pct00039
화합물 32를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 DL-젖산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(26.2㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 633.2741; found, 633.2731(-1.0mmu)
(2-18) 화합물 33의 합성
Figure pct00040
화합물 33을 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 2-히드록시이소부티르산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(19.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 647.2898; found, 647.2890(-0.8mmu)
(2-19) 화합물 34의 합성
Figure pct00041
화합물 34를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 1-히드록시시클로프로판카르복실산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(18.4㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 645.2741; found, 645.2717(-2.4mmu)
(2-20) 화합물 35의 합성
Figure pct00042
화합물 35를 (2-2)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 카르복실산에는 (R)-(+)-테트라히드로푸란-2-카르복실산을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(6.4㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 659.2898; found, 659.2885(-1.3mmu)
(2-21) 화합물 36의 합성
Figure pct00043
화합물 19(0.0410g, 0.0647mmol)의 THF 용액(2mL)에, 과산화수소수(0.5mL)을 더하여, 실온에서 2시간 교반했다. 반응 용액에 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 티오황산나트륨 수용액을 더하여, 디클로로메탄으로 추출했다. 유기상을 황산나트륨으로 건조 후, 용매를 감압 증류 제거해서 목적 화합물을 얻었다(0.0417g, 99%).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 649.2690; found, 649.2660(-3.0mmu)
(2-22) 화합물 37의 합성
Figure pct00044
화합물 37을 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Thr(tBu)-OH로 치환하고, 화합물 7을 합성했다. 화합물 7로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)을 합성하고, 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)을 0.05mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(5.5㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 573.2708; found, 573.2715(0.7mmu)
(2-23) 화합물 38의 합성
Figure pct00045
화합물 38을 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(10.7㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 603.2813; found, 603.2818(0.5mmu)
(2-24) 화합물 39의 합성
Figure pct00046
화합물 39를 (2-15)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(3.6㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 633.2919; found, 633.2876(-4.3mmu)
(2-25) 화합물 40의 합성
Figure pct00047
0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)의 CH2Cl2 용액(1mL)에, DIPEA(0.043mL, 0.25mmol), 디글리콜릭안히드로(29.0㎎, 0.25mmol)를 더하여, 실온에서 24시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 CH2Cl2로 세정했다. TFA/TES/H2O=15:1:1 용액(1mL)을 더하여, 차광 하에서 실온에서 1시간 진탕했다. 레진을 여과 제거하고, 여액을 감압 증류 제거했다. 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 목적 화합물을 얻었다(18.6㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 647.2712; found, 647.2716(0.4mmu)
(2-26) 화합물 41의 합성
Figure pct00048
화합물 41을 (2-14)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Thr(tBu), B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(16.5㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 646.3235; found, 646.3206(-2.9mmu)
(2-27) 화합물 42의 합성
Figure pct00049
화합물 42를 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-His(Trt)-OH로 치환하고, 화합물 8을 합성했다. 화합물 8로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=His(Trt), B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=His(Trt), B=Leu)를 0.05mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 609.2820; found, 609.2820(0mmu)
(2-28) 화합물 43의 합성
Figure pct00050
화합물 43을 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.10mmol 상당의 화합물 A5(A=His(Trt), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(15.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 639.2926; found, 639.2949(2.3mmu)
(2-29) 화합물 44의 합성
Figure pct00051
화합물 44를 (2-25)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=His(Trt), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(11.2㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 683.2824; found, 683.2820(-0.4mmu)
(2-30) 화합물 45의 합성
Figure pct00052
화합물 45를 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Tyr(tBu)-OH로 치환하고, 화합물 9를 합성했다. 화합물 9로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Tyr(tBu), B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=Tyr(tBu), B=Leu)를 0.025mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(3.0㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 635.2864; found, 635.2867(0.3mmu)
(2-31) 화합물 46의 합성
Figure pct00053
화합물 46을 (2-14)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Tyr(tBu), B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(23.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 708.3392; found, 708.3358(-3.4mmu)
(2-32) 화합물 47의 합성
Figure pct00054
화합물 47을 (2-25)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Tyr(tBu), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(22.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 709.2868; found, 709.2868(0.0mmu)
(2-33) 화합물 48의 합성
Figure pct00055
화합물 48을 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Phe-OH로 치환하고, 화합물 10을 합성했다. 화합물 10으로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Phe, B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=Phe, B=Leu)를 0.025mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(3.0㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 619.2915; found, 619.2910(-0.5mmu)
(2-34) 화합물 49의 합성
Figure pct00056
화합물 49를 (2-14)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Phe, B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(15.4㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 692.3443; found, 692.3412(-3.1mmu)
(2-35) 화합물 50의 합성
Figure pct00057
화합물 50을 (2-25)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Phe, B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.3㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 693.2919; found, 693.2922(0.2mmu)
(2-36) 화합물 51의 합성
Figure pct00058
화합물 51을 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Ser(tBu)-OH로 치환하고, 화합물 11을 합성했다. 화합물 11부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Ser(tBu), B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=Ser(tBu), B=Leu)를 0.025mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(6.4㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 559.2551; found, 559.2555(0.4mmu)
(2-37) 화합물 52의 합성
Figure pct00059
화합물 52를 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.025mmol 상당의 화합물 A5(A=Ser(tBu), B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(7.2㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 589.2657; found, 589.2692(3.5mmu)
(2-38) 화합물 53의 합성
Figure pct00060
화합물 53을 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Gln(Trt)-OH로 치환하고, 화합물 12를 합성했다. 화합물 12부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Gln(Trt), B=Leu)을 합성하고, 화합물 A5(A=Gln(Trt), B=Leu)을 0.025mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(2.9㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 600.2817; found, 600.2821(0.4mmu)
(2-39) 화합물 54의 합성
Figure pct00061
화합물 54를 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.025mmol 상당의 화합물 A5(A=Gln(Trt), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(3.4㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 630.2922; found, 630.2916(-0.6mmu)
(2-40) 화합물 55의 합성
Figure pct00062
화합물 55를 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Arg(Pbf)-OH로 치환하고, 화합물 13을 합성했다. 화합물 13으로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Arg(Pbf), B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=Arg(Pbf), B=Leu)를 0.025mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(1.5㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 628.3242; found, 628.3237(-0.5mmu)
(2-41) 화합물 56의 합성
Figure pct00063
화합물 56을 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.025mmol 상당의 화합물 A5(A=Arg(Pbf), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(3.3㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 658.3348; found, 658.3353(0.5mmu)
(2-42) 화합물 57의 합성
Figure pct00064
화합물 57을 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Lys(Boc)-OH로 치환하고, 화합물 14를 합성했다. 화합물 14부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Lys(Boc), B=Leu)을 합성하고, 화합물 A5(A=Lys(Boc), B=Leu)을 0.050mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(11.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 600.3180; found, 600.3176(-0.4mmu)
(2-43) 화합물 58의 합성
Figure pct00065
화합물 58을 (2-4)와 마찬가지 공정에 의해 합성했다. 0.10mmol 상당의 화합물 A5(A=Lys(Boc), B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(12.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 630.3286; found, 630.3287(0.1mmu)
(2-44) 화합물 59의 합성
Figure pct00066
화합물 59를 (2-1)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다.
공정 (a)의 아미노산을 Fmoc-Met-OH로부터 Fmoc-Nle-OH로 치환하고, 화합물 15를 합성했다. 화합물 15로부터 마찬가지 공정에 의해 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)를 합성하고, 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)를 0.050mmol 상당 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(6.7㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 585.3071; found, 585.3077(0.6mmu)
(2-45) 화합물 60의 합성
Figure pct00067
화합물 60을 (2-4)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(8.2㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 615.3177; found, 615.3184(0.7mmu)
(2-46) 화합물 61의 합성
Figure pct00068
0.05mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)에 DMF(4mL), DIPEA(0.09mL, 0.50mmol), 화합물 2(29.6㎎, 0.20mmol), HATU(57.0㎎, 0.15mmol)를 순차 더하여, 실온에서 24시간 진탕했다. 반응 용액을 여과하고, 레진을 DMF, CH2Cl2로 순차 세정했다. TFA/TES/H2O=15:1:1 용액(1mL)을 더하여, 차광 하에서 실온에서 1시간 진탕했다. 레진을 여과 제거하고, 여액을 감압 증류 제거했다. 잔사를 역상 칼럼 크로마토그래피(H2O(0.1% TFA)/CH3CN(0.1% TFA)=80:20→65:35)로 정제하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(4.7㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 672.3756; found, 672.3762(0.6mmu)
(2-47) 화합물 62의 합성
Figure pct00069
화합물 62를 (2-14)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(12.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 658.3599; found, 658.3608(0.9mmu)
(2-48) 화합물 63의 합성
Figure pct00070
화합물 63을 (2-13)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(9.1㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 685.3596; found, 685.3607(1.1mmu)
(2-49) 화합물 64의 합성
Figure pct00071
화합물 64를 (2-15)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)를 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(4.6㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 645.3283; found, 645.3256(-2.7mmu)
(2-50) 화합물 65의 합성
Figure pct00072
화합물 65를 (2-25)와 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(8.0㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 659.3075; found, 659.3073(-0.2mmu)
(2-51) 화합물 66의 합성
Figure pct00073
화합물 66을 (2-11)과 마찬가지 방법에 의해 합성했다. 0.050mmol 상당의 화합물 A5(A=Nle, B=Leu)을 사용하여, 목적 화합물의 TFA염을 얻었다(5.5㎎).
HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 601.3021; found, 601.3046(2.5mmu)
(실시예 3) 형광 프로브의 광학 특성
화합물 19의 각 pH에 있어서의 흡수 스펙트럼 및 형광 스펙트럼을 각각 측정했다. 구체적으로는, pH 2 내지 11의 각 pH의 10mM 인산 완충액에, 화합물 19의 DMSO 용액(0.1mM)을 첨가하여, 최종 프로브 농도 1μM, 최종 DMSO 농도 1%가 되도록 측정 용액을 조제했다. 측정 용액의 형광 스펙트럼은 여기 파장 490㎚로 측정했다.
도 1의 (a), (b)에 각 pH에 있어서의 스펙트럼을 나타낸다. 본 발명의 형광 프로브인 화합물 19는, 중성 조건에서는 주로 무색 무형광성이 되는 것이 나타났다.
(실시예 4) 칼파인에 대한 형광 프로브(화합물 19)의 반응성
화합물 19에 칼파인-1을 작용시켜서, 흡수 스펙트럼 및 형광 스펙트럼의 변화를 측정했다. 구체적으로는, 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 5mM CaCl2, 100mM NaCl, 1mM EGTA)에, 화합물 19의 DMSO 용액(0.5mM), 칼파인-1(100Units)(Calpain-1 from Human Erythrocytes, Cat.No.208713, Merck Millipore사, 이하 마찬가지)을 첨가하여, 2mL의 반응 용액을 제작했다(최종 프로브 농도 5μM). 37℃에서 효소 반응을 실시했다. 반응 용액의 형광 스펙트럼을 여기 파장 490㎚로 측정했다. 또한, 반응 용액을 HPLC 크로마토그래피에 의해 해석했다. 컨트롤로서, 칼파인-1 미첨가의 화합물 19(최종 농도 5μM)를 사용했다.
흡수 및 형광 스펙트럼을 측정한 결과를 도 2의 (a), (b)에 나타낸다. 칼파인-1의 첨가에 수반하여, 프로브 용액의 흡광도 및 형광 강도의 증가가 관측되었다. 또한, HPLC의 결과를 도 3에 나타낸다. 칼파인-1과의 반응에 의해, 화합물 19의 피크 위치가 HMRG와 동일해졌다. 따라서, 칼파인-1에 의해 화합물 19의 펩티드 부위가 가수 분해됨으로써, 형광 물질인 HMRG가 생성되는 것이 나타났다.
(실시예 5) 칼파인-1에 의한 형광 강도의 경시 변화
화합물 19와 화합물 16에 대해서, 경시적인 형광 어세이를 행하였다. 구체적으로는, 10μM의 합성한 형광 프로브를 포함하는 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 2mM EGTA, 2mM DTE)에, 17.4U/mL의 칼파인-1 및 5mM CaCl2를 더하여, 37℃에서 효소 반응을 실시했다. 음성 대조로서, 칼파인-1이나 CaCl2 미첨가의 각 화합물도, 마찬가지로 측정했다.
칼파인-1에 의한 형광 강도의 경시 변화를 측정한 결과를 도 4에 나타낸다(여기 파장 475㎚, 형광 파장 500-550㎚). 화합물 16 및 화합물 19는, 모두 칼파인-1에 대한 형광 프로브로서 기능했다. 특히, 화합물 19는 칼파인-1과의 반응성이 보다 향상되어 있는 것이 나타났다. 또한, 칼파인의 활성화는 Ca2 +에 의해 야기되기 때문에, Ca2 +을 포함하지 않는 용액 중에서는 형광 상승은 일어나지 않는 것이 확인되었다.
(실시예 6) 칼파인에 대한 형광 프로브(화합물 16-36)의 반응성
마찬가지로, 화합물 16-36의 형광 어세이를 실시했다. 10μM의 합성한 형광 프로브를 포함하는 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 2mM EGTA, 2mM DTE)에, 50U/mL(화합물 16, 19-25) 또는 17.4U/mL(화합물 16-18, 26-36)의 칼파인-1 및 5mM CaCl2를 더하여, 37℃에서 효소 반응을 실시했다.
칼파인-1 첨가 후 10분에 있어서의 형광 강도의 증가를 도 5의 (a) 및 (b)에 나타낸다(여기 파장 475㎚, 형광 파장 500-550㎚). 어느 것의 화합물도 칼파인-1에 대한 형광 프로브로서 기능하는 것이 나타났다. 또한, 화합물 19-25의 형광 강도는 화합물 16과 비교해서 크고, 화합물 26-29의 형광 강도는 화합물 16-18과 비교해서 컸다. 칼파인-1 첨가 후 30분에 있어서의 형광 강도의 증가를 도 5의 (c)에 나타낸다(여기 파장 460㎚, 형광 파장 530㎚). 어느 것의 화합물도 칼파인-1에 대한 형광 프로브로서 기능하는 것이 나타났다. 또한, 화합물 30-36의 형광 강도는 화합물 16과 비교해서 컸다.
이상으로부터, 본 발명의 화합물인 화합물 19-36은, 비교 화합물인 화합물 16 또는 화합물 17, 18과 비교하여, 칼파인과의 효소 반응성이 향상되는 것이 인지되었다. 또한, 본 발명의 화합물로서, 식 (I)의 R10이나 R11에 알킬기를 갖는 화합물, R10과 R11로 환 형성한 화합물 및 R12-L-이 R10과 환 형성을 한 화합물은 모두 칼파인과의 효소 반응성이 양호한 것이 나타났다. 반면에, 비교 화합물인 화합물 17, 18은 화합물 16과 비교해서 형광 강도가 감소했다. 즉, 칼파인-1의 효소 활성 검출로의 감도 향상에는, 식 (I)에 있어서, 펩티드쇄의 N 말단에, R12-L-O-C(R10)(R11)-기를 갖는 아미드기가 결합하는 것이 중요한 것이 나타났다. 여러가지 R12-L-O-C(R10)(R11)-기가 마찬가지로 감도 향상으로의 효과를 나타낸 점에서, R12-L-O-C(R10)(R11)-기는 본 실시예에 기재된 화학 구조에 한정되지 않고, 임의의 화학 구조여도 마찬가지로 칼파인 활성 검출로의 감도 향상의 효과를 초래하는 것이 시사되었다.
(실시예 7) 칼파인에 의한 형광 프로브(화합물 37, 42, 45, 48, 51, 53, 55, 57, 59)의 경시 변화
계속해서, 화합물 37, 42, 45, 48, 51, 53, 55, 57, 59에 대해서, 칼파인-1에 의한 마찬가지 형광 어세이를 실시했다. 구체적으로는, 10μM의 합성한 형광 프로브를 포함하는 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 2mM EGTA, 2mM DTE)에, 17.4U/mL의 칼파인-1 및 5mM CaCl2를 더하여, 37℃에서 효소 반응을 실시했다. 칼파인-1을 미첨가의 각 화합물을 컨트롤로서 사용했다.
형광 강도의 시간 의존성을 플롯한 결과를 도 6 내지 도 8에 나타낸다(여기 파장 475㎚, 형광 파장 500-550㎚). 어느 것의 프로브도, 칼파인-1과 작용함으로써 형광 강도의 증가가 보이고, 칼파인-1 효소 기질이 되는 것이 나타났다.
(실시예 8) 칼파인에 대한 형광 프로브(화합물 37-66)의 반응성
아미노산이 동일한 화합물간에 있어서, R12-L-O-기에 의한 칼파인-1과의 반응성으로의 영향을 평가하기 위해서, 화합물 37-66에 대해서, 칼파인-1에 의한 형광 어세이를 상술의 방법에 따라서 실시했다. 구체적으로는, 10μM의 합성한 형광 프로브를 포함하는 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 2mM EGTA, 2mM DTE)에, 17.4U/mL의 칼파인 1 및 5mM CaCl2를 더하여, 37℃에서 효소 반응을 실시하고, 칼파인-1 첨가 10분 후에 있어서의 형광 강도의 증가를 측정했다.
얻어진 결과를 도 9 내지 도 11에 나타낸다. 어느 것의 화합물도 R12-L-O-기를 갖는 화합물에 있어서, R12-L-O-기를 갖지 않는 화합물과 비교해서 형광 강도가 보다 증대하는 것을 확인했다. 아미노산 A 및 B의 다양한 조합에 대해서도, R12-L-O-기를 갖는 화합물은 칼파인 활성을 효과적으로 검출할 수 있는 것이 나타났다.
화합물 16-66에 있어서, 칼파인-1에 대한 반응성은 식 (I) 중의 R12-L-O-C(R10)(R11)-기에 의존하고, R12-L-O-C(R10)(R11)-기가 존재하는 경우에, 칼파인-1에 대한 반응성 향상이 보였다. 나아가, R12-L-O-C(R10)(R11)-기를 갖는 것에 의한 칼파인과의 반응성 향상은, 아미노산 A 및 B의 다양한 조합에 대해서도 효과가 보였다.
(실시예 9) 형광 프로브(화합물 16 및 화합물 19)에 의한 생세포 이미징
상술한 실험에 의해 확인된 본 발명의 화합물과 칼파인의 효소 반응성의 향상이, 세포 내에서도 마찬가지인지에 대해서 검증했다. 화합물 16과 19에 대해서, SH-SY5Y 세포에 있어서의 칼파인 활성 이미징을 실시했다. 구체적으로는, SH-SY5Y 세포(American Type Culture Collection, VA, USA)를, 둘베코 개변 이글 배지/햄 F-12 혼합 배지(DMEM/F-12; Thermo Fisher Scientific)(10% 소 태아 혈청(FBS; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 및 100U/mL 페니실린-100μg/mL 스트렙토마이신(PS; Thermo Fisher Scientific)을 포함한다) 중, 37℃, 5% CO2-95% 공기의 조건 하에서 배양했다. 폴리-D-리신(Thermo Fisher Scientific) 및 라미닌(BD Biosciences, CA, USA)으로 코트한 멀티웰 플레이트(μ-Plate 96 Well;ibidi, Grafelfing, Germany)에, 6×104 내지 8×104 세포/웰의 세포를 파종하고, 배양액으로 프리인큐베이션 했다. 웰내의 배양액을 제거한 후, 즉시 200μL의 어세이액(5μM 프로브를 포함하는 배양액)을 더하여, 37℃, 5% CO2-95% 공기의 조건 하에서 인큐베이션하고, 10분 후에 공초점 현미경(LSM710, Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 명시야상 및 형광상을 촬영했다.
도 12의 (a), (b)에서 도시한 바와 같이, 어느 것에 있어서도 화합물을 첨가함으로써, SH-SY5Y 세포 내의 칼파인 활성을 관찰할 수 있었다. 화합물 16과 비교하여, 화합물 19에서는 명료한 이미징을 할 수 있었던 점에서, 식 (I) 중의 R12-L-O-C(R10)(R11)-기에 의한 효소 반응성의 향상이 생세포 이미징에 있어서도 효과적인 것이 나타났다.
(실시예 10) 형광 프로브에 의한 생세포 이미징
실시예 9와 마찬가지로, 화합물 20-23, 화합물 38 및 화합물 56에 대해서, SH-SY5Y 세포에 있어서의 칼파인 활성 이미징을 실시했다. 화합물 20-23과 화합물 38은 30분간의 인큐베이션 후에, 화합물 56은 20분간의 인큐베이션 후에 명시야상 및 형광상을 촬영했다. 도 13 및 도 14에 도시한 바와 같이, 어느 것의 화합물에 있어서도 SH-SY5Y 세포 내의 칼파인 활성을 관찰할 수 있었다.
상술한 실시예에서 예증한 바와 같이, 본 발명에 의해, 칼파인을 타깃으로 한 새로운 형광 프로브를 제공할 수 있다. 구체적으로는, 식 (I)이 R12-L-O-C(R10)(R11)-기를 가짐으로써, 칼파인과의 효소 반응성이 향상된 프로브를 창출할 수 있는 것을 발견했다. R12-L-O-C(R10)(R11)-기로서는, 폭넓은 기에서 이러한 향상이 확인되고, 예를 들어 수산기, 카르복실기, 알콕시기, 및/또는 아미노기 등의 치환기를 갖고 있는 경우에 있어서도, 양호한 효소 반응성을 나타냈다. 또한, R12와 R10 또는 R11이 결합해서 환을 형성하고 있는 경우, R10 및 R11이 알킬기의 경우나, R10과 R11이 환을 형성하고 있는 경우에도, 칼파인과의 효소 반응성은 양호했다. 나아가, 아미노산 A 및 B가 다양한 아미노산인 경우도, 칼파인과의 효소 반응성은 양호한 결과를 부여했다. 또한, 세포의 형광 이미징에 있어서도, R12-L-O-C(R10)(R11)-기에 의존해서 형광 강도의 증강이 보였다. 이상의 결과는, 식 (I)이 R12-L-O-C(R10)(R11)-기를 가짐으로써, 임의의 아미노산 A 및 B를 갖는 화합물이 칼파인 활성을 효과적으로 검출할 수 있는 것을 나타냈다. 즉, 본 발명의 형광 프로브는 칼파인의 효소 활성을 효과적으로 검출할 수 있는 화합물인 것을 실증하는 것이다.
(실시예 11) 래트 NMDA 장애 모델을 사용한 평가
흑색 브라운 노르웨이 래트에 이소플루란을 사용해서 전신마취를 행하였다. PBS 또는 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA)(10mM, 2μL)을 안내에 투여했다. 6시간 후에 케타민·크실라진 혼합액으로 다시 마취를 행하여, 안내에 화합물 19(18.3μM, 3μL)을 투여했다. 화합물 19의 투여 전 및 투여 20분 후에, F10(니데크사 공초점 생체 현미경)으로 안저를 촬영했다.
그 결과를 도 15에 나타낸다. 화살표로 나타내는 개소는, HMRG로 염색된 신경 세포의 예를 나타낸다. PBS를 투여한 래트에서는, 화합물 19 투여 전에 시그널이 인지되지 않고(도 15의 a), 20분 후(도 15의 b)에는 대부분 신경 세포가 염색되어 있지 않다. NMDA를 투여한 래트에서는, 도 15의 c에서 나타낸 바와 같이, 화합물 19 투여 전에는 명확한 시그널이 인지되지 않았다. 그러나, 도 15의 d에서 나타낸 바와 같이 화합물 19를 투여하고 20분 후에 명확하게 신경 세포가 다수 염색되었다. 또한, 도 15에서 나타낸 래트의 안저 촬영 화상의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측한 결과를 도 16에서 나타낸다. PBS를 투여한 래트에 대해서, HMRG 양성 세포수는 극히 적었고, NMDA를 투여한 래트의 HMRG 양성 세포수는 유의미한 증가가 보였다.
래트 NMDA 망막 장애 모델은, 망막 질환 모델로 생각되고 있는 점에서, 본 발명의 형광 프로브는 망막 질환의 진단에 유용하다고 생각된다. 특히 안저에 있어서의 칼파인의 활성화를 신속하게 검출하는 것이 가능하고, 임상 진단이나 치료 선택에 유용하다고 기대된다. 또한, 본 발명의 형광 프로브는, 칼파인 저해약에 의한 치료 효과의 평가에도 유용하다고 기대된다. 구체적으로는, 칼파인 활성 상승이 확인된 포유류 대상(예를 들어, 환자)에 칼파인 저해약에 의한 치료를 실시하고, 그 치료 효과도 판정하는 등, 본 발명의 형광 프로브의 의료상, 산업상의 이용 가치, 경제 효과는 매우 크다.
(실시예 12) 토끼 NMDA 장애 모델을 사용한 화합물 19의 평가
흑색 더치 토끼에 케타민·크실라진의 혼합액을 사용해서 전신마취를 행하였다. N-메틸-D-아스파르트산(NMDA)(12mM, 50μL), 또는 PBS를 안내에 투여했다. 9 시간 후에 케타민·크실라진의 혼합액으로 다시 마취를 행하여, 안내에 화합물 19(18.3μM, 19μl), 화합물 16(20μM, 19μl), 또는 화합물 16(20μM, 38μl)을 투여했다. 각 화합물의 투여 전 및 투여로부터 소정 시간 경과 후에, Mirante(니데크사, 공초점 주사형 다이오드 레이저 검안경)로 안저를 촬영했다.
그 결과를 도 17 내지 22에 나타낸다. 화살표로 나타내는 개소는 HMRG로 염색된 신경 세포의 예를 나타낸다. 도 17의 a에서 나타낸 바와 같이, 화합물 19 투여 전에는 명확한 시그널이 인지되지 않았다. 그러나, 도 17의 b 내지 17의 d로 나타낸 바와 같이, NMDA를 투여한 토끼에서는, 화합물 19를 투여하고 30분 후, 45분 후, 60분 후에는 명확하게 다수의 신경 세포가 HMRG로 염색되었다.
PBS 투여 눈의 결과를 도 18에 나타낸다. 도 18의 a에서 나타낸 바와 같이, 화합물 19 투여 전에는 명확한 시그널이 인지되지 않았다. 또한 도 18의 b 내지 18의 d에서 나타낸 바와 같이, 화합물 19를 투여하고 30분 후, 45분 후, 60분 후에도 신경 세포의 HMRG에 의한 염색은 거의 인지되지 않았다.
도 19의 a와 도 20의 a에서 나타낸 바와 같이, 화합물 16(19μl 또는 38μl) 투여 전에는 명확한 시그널이 인지되지 않았다. 그러나, 도 19의 b 내지 d, 도 20의 b 내지 d에서 나타낸 바와 같이, NMDA를 투여한 토끼에서는, 화합물 16(19μl 또는 38μl)을 투여하고 30분 후, 45분 후, 60분 후에는 명확하게 다수의 신경 세포가 HMRG로 염색되었다.
한편, PBS를 투여한 토끼에서는, 도 21의 a, 도 22의 a에서 나타낸 바와 같이, 화합물 16(19μl 또는 38μl) 투여 전에는 어느 군이라도 시그널은 인지되지 않고, 또한 도 21의 b 내지 d, 도 22의 b 내지 d에서 나타낸 바와 같이, 30분 후, 45분 후, 60분 후에도 신경 세포의 HMRG에 의한 염색은 거의 인지되지 않았다.
도 17 내지 22에서 나타낸 화합물 19 및 화합물 16(19μl 및 38μl)의 안저 촬영 화상의 시신경 유두 상방의 일정한 영역(819×819pix)의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측한 결과를 도 23에 나타낸다. NMDA를 투여한 토끼에 대해서, 화합물 19의 HMRG 양성 세포수는, 화합물 16(19μl)보다 유의미하게 상승하고 있고, 화합물 16(38μl)보다 상승하고 있는 경향이 있었다. PBS를 투여한 토끼에 대해서, HMRG 양성 세포수는 극히 얼마 안되고, 화합물 19 및 화합물 16(38μl)의 HMRG 양성 세포수는 NMDA를 투여한 토끼의 HMRG 양성 세포수보다 유의미하게 감소했다.
토끼 NMDA 장애 모델은, 망막 질환 모델이라 생각되고 있는 점에서, 본 발명의 형광 프로브는, 망막 질환의 진단에 유용하다고 생각된다. 중형 동물인 토끼의 안구 사이즈는, 소형 동물인 래트의 안구 사이즈보다 인간의 안구 사이즈에 유사하고 있어, 인간에서의 투여 조건에 유사한 것으로 생각된다. 또한, 화합물 19는 화합물 16보다 저용량으로 양호한 반응성이 얻어지고 있는 점에서, 본 발명의 형광 프로브는 특히 인간의 안내 투여에 유용하다고 생각된다.
이상의 결과는, 본 발명의 화합물을 사용함으로써, 안저 내의 칼파인 활성을 검출할 수 있고, 칼파인 활성 유래의 녹내장 진단약으로서 유용한 것을 실증하는 것이다.
(실시예 13) 인간 iPS 세포 유래 입체 망막 조직에 의한 칼파인 프로브의 평가
기보의 방법에 경미한 수정을 더해서 인간 iPS 세포(201B7주, CiRA로부터 구입)로부터 인공적으로 3차원 입체 망막 조직을 분화 유도하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 60일간 유지 배양했다. 이 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직에 대하여 칼파인을 활성화하고 망막 신경절 세포의 장애를 유도하는 글루탐산 장애 모델을 제작하고, 화합물 19에 의한 칼파인 활성을 평가했다. 먼저 글루탐산 장애에 의한 망막 신경절 세포 장애를 동정하기 위해서, iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직으로부터 auto MACS pro(등록상표)를 사용해서 CD90 Microbeads로 망막 신경절 세포를 단리했다. 이 세포에 대하여, 글루탐산(최종 농도 300μM)을 첨가하고, 1시간 반응시켰다. 글루탐산의 첨가로부터 1시간 후에 화합물 19(최종 농도 5μM)를 첨가하고, 그 1 시간 후에 형광 현미경(ZEISS Axio Vert.A1)으로 그 상태 및 형광을 촬영(RGB 및 B/W 모드)한바, 신경 돌기의 감약 및 형광의 증강을 보이고 있고, 칼파인 활성화에 의한 망막 신경절 세포 장애가 유도되고 있는 것을 확인했다(도 24).
이어서, 보다 생체에 가까운 조건에서의 반응을 확인하기 위해서 분화 유도 60일째의 iPS 세포 유래 3차원 입체 망막 조직을 반응 배지(HBSS 용액에 CaCl2(최종 농도 2.4mM), HEPES(최종 농도 20mM)를 첨가한 것)를 1mL씩 넣은 24웰 플레이트에 정치했다(n=5). 반응 배지 1mL로 2회 세정하고, 글루탐산을 최종 농도가 0μM, 300μM, 1mM이 되도록 첨가하고, 1시간 반응시켰다. 글루탐산의 첨가로부터 1시간 후에 화합물 19의 최종 농도 0μM, 0.25μM, 1.2μM, 5.0μM이 되도록 첨가하고, 그 1시간 후에 형광 현미경(ZEISS Axio Vert.A1)으로 그 형광을 촬영(RGB 모드(하단) 및 B/W 모드(상단))했다. 모든 촬영에 있어서 노출 시간은 200ms로 고정했다. 글루탐산의 최종 농도가 0μM, 300μM 및 1mM의 결과를, 각각 도 25, 도 26 및 도 27에 나타낸다. 글루탐산의 최종 농도가 300μM, 1mM의 군에 있어서 화합물 19의 농도에 비례해서 형광 발현의 증강을 보였다. 또한, B/W 모드로 촬영한 형광 강도의 평균값을 산출하고(n=3), 그래프화한 것을 도 28에 나타낸다. 이 결과로부터, 글루탐산 농도가 동일한 조건 하에서는 화합물 19의 농도 의존적으로 형광이 강하게 확인되고, 글루탐산의 농도에 따라서 형광이 강하게 발현하는 것이 확인되었다. 또한, 화합물 19와 화합물 16의 형광 강도의 비교 검토를 행한 결과를 도 29에 나타낸다. 글루탐산의 최종 농도 1mM의 조건에서 각 화합물을 첨가한바, 최종 농도 0.25μM, 1.2μM, 5.0μM에 있어서 화합물 19 쪽이 형광 발현을 많이 보이고 있었다.
이상으로부터, 화합물 19는 인간 iPS 세포 유래의 칼파인 활성화에 의한 망막 신경절 세포 장애를 평가하는데도 유용하다고 생각된다. 화합물 19는 인간 iPS 세포 유래의 망막 신경절 세포 및 입체 망막 조직에서 반응성이 확인된 점에서, 인간 생체의 망막에서의 칼파인 활성화에 의한 망막 신경절 세포 장애의 평가에 유용한 것이 기대된다.
본 발명의 일 양태인 형광 프로브는, 상술한 바와 같이, 공지 또는 신규의 칼파인 저해제와 병용할 수 있다. 예를 들어 당해 칼파인 저해제에 의해 치료 또는 예방 가능한 포유류 대상을 형광 프로브에서 선택한 다음 당해 포유류 대상에 칼파인 저해제를 투여하는 형태에서의 병용도 가능하고, 또한 예를 들어 당해 칼파인 저해제가 투여된 포유류 대상에 형광 프로브를 투여함으로써 당해 칼파인 저해제에 의한 치료 또는 예방 효과의 정도를 판별하는 형태에서의 병용도 가능하다. 본 발명의 일 양태인 형광 프로브는, 포유류 대상에 대한 칼파인 저해제의 투여 전, 투여후, 투여 전후, 또는 투여와 동시에 당해 포유류 대상에 투여되어 그 칼파인 활성 등(환언하면, 칼파인 저해제의 효과)을 평가 가능하게 할 수 있다. 이후의 실시예군에서는, 형광 프로브와 칼파인 저해제의 병용에 의한 작용을 구체적으로 나타낸다.
(실시예 14) 생세포 이미징에서의 칼파인 저해제와의 병용
형광 프로브로서 화합물 19를 사용하고, 어세이액이 공지된 칼파인 저해제인 SNJ-1945를 10μM의 농도로 더 포함하는 것 이외에는 실시예 9와 마찬가지로 해서 행한 생세포 이미징 결과를 도 30에 나타낸다. 도 30 중, (a)는 저해제 함유 어세이액을 사용한 이미징이고, (b)가 저해제 비함유 어세이액을 사용한 이미징이다. 도 30에 나타나는 바와 같이, 저해제 함유 어세이액을 사용한 경우(도 30의 (a)), 저해제 비함유 어세이액을 사용한 경우(도 30의 (b))와 비교해서 세포 내 형광 강도가 감약하고 있다. 이와 같이 본 발명에 의한 형광 프로브는 칼파인 저해제의 생세포에 대한 약리 작용의 판별을 위해 병용할 수 있다.
(실시예 15) 포유류 대상에서의 칼파인 저해제와의 병용 1
카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 증류수에 녹여서 0.5%(w/v) CMC 용액을 조제했다. 0.5%(w/v) CMC 용액에 SNJ-1945를 2.5%(w/v)가 되도록 현탁해서 저해제 함유 CMC 용액을 조제했다. 래트에 이소플루란을 사용해서 전신마취를 행하고, NMDA(10mM, 2μL)를 안내에 투여했다. NMDA 투여로부터 2시간 후에, 저해제 함유 CMC 용액을, SNJ-1945의 투여량이 100㎎/kg 체중이 되도록 래트에 복강내 투여했다. 저해제의 투여로부터 4시간 후(NMDA 투여로부터 6시간 후)에, 래트에 이소플루란으로 다시 마취를 행하고, 안내에 화합물 19(15μM, 4μL)를 투여했다. 화합물 19의 투여로부터 20분 내지 30분 후에, F10으로 안저를 촬영했다. 또한, 컨트롤군(N=8)에는, 저해제 함유 CMC 용액 대신에 0.5%(w/v) CMC 용액을 투여한 것 이외에는 SNJ-1945 투여군(N=8)과 마찬가지 조작을 행하였다.
결과를 도 31에 나타낸다. 도 31에 나타내는 바와 같이, 컨트롤군에서는, SNJ-1945 투여군보다 신경 세포가 다수 염색되고 있다. 도 31에서 나타낸 래트의 안저 촬영 화상의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측한 결과를 도 32에 나타낸다. 도 32에 나타내는 바와 같이, SNJ-1945 투여군에서는, 컨트롤군에 비하여 HMRG 양성 신경 세포수가 유의미하게 감소하고 있었다.
(실시예 16) 포유류 대상에서의 칼파인 저해제와의 병용 2
카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 증류수에 녹여서 0.5%(w/v) CMC 용액을 조제했다. 0.5%(w/v) CMC 용액에 SNJ-1945를 2.5%(w/v)가 되도록 현탁해서 저해제 함유 CMC 용액을 조제했다. 래트에 이소플루란을 사용해서 전신마취를 행하여, NMDA(10mM, 2μL)을 안내에 투여했다. NMDA 투여로부터 2시간 후에, 저해제 함유 CMC 용액을, SNJ-1945의 투여량이 100㎎/kg 체중이 되도록 래트에 경구 투여했다. 저해제의 투여로부터 4시간 후(NMDA 투여로부터 6시간 후)에, 래트에 이소플루란으로 다시 마취를 행하고, 안내에 화합물 19(15μM, 4μL)를 투여했다. 화합물 19의 투여로부터 20분 내지 30분 후에, F10으로 안저를 촬영했다. 또한, 컨트롤군(N=7)에는, 저해제 함유 CMC 용액 대신에 0.5%(w/v) CMC 용액을 투여한 것 이외에는 SNJ-1945 투여군(N=8)과 마찬가지 조작을 행하였다.
안저 촬영 화상의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측한 결과를 도 33에 나타낸다. 도 33에 나타내는 바와 같이, SNJ-1945 투여군에서는, 컨트롤군에 비하여 HMRG 양성 신경 세포수가 유의미하게 감소하고 있었다.
(실시예 17) 포유류 대상에서의 칼파인 저해제와의 병용 3
카르복시메틸셀룰로오스나트륨을 증류수에 녹여서 0.5%(w/v) CMC 용액을 조제했다. 0.5%(w/v) CMC 용액에 SNJ-1945를 2.5%(w/v)가 되도록 현탁해서 저해제 함유 CMC 용액을 조제했다. 저해제 함유 CMC 용액을, SNJ-1945의 투여량이 100㎎/kg 체중이 되도록 래트에 복강내 투여했다. 복강내 투여로부터 2시간 후에 래트에 이소플루란을 사용해서 전신마취를 행하고, NMDA(10mM, 2μL)을 안내에 투여했다. NMDA 투여로부터 6시간 후에, 래트에 이소플루란으로 다시 마취를 행하고, 안내에 화합물 19(15μM, 4μL)를 투여했다. 화합물 19의 투여로부터 20분 내지 30분 후에, F10으로 안저를 촬영했다. 또한, 컨트롤군(N=7)에는, 저해제 함유 CMC 용액 대신에 0.5%(w/v) CMC 용액을 투여한 것 이외에는 SNJ-1945 투여군(N=8)과 마찬가지 조작을 행하였다.
안저 촬영 화상의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측한 결과를 도 34에 나타낸다. 도 34에 나타내는 바와 같이, SNJ-1945 투여군에서는, 컨트롤군에 비하여 HMRG 양성 신경 세포수가 유의미하게 감소하고 있었다.
실시예 15 내지 17에 나타나는 바와 같이, 본 발명에 의한 형광 프로브는, 포유류 대상에 있어서의 칼파인 저해제의 치료 또는 예방 효과의 정도를 판별하기 위해서 칼파인 저해제와 병용할 수 있다. 구체적으로는, 실시예 15 및 16은, 칼파인이 활성화하고 있는(결과로서, 칼파인 저해제에 대하여 감수성을 가질 수 있는) 포유류 대상에 칼파인 저해제를 투여하고, 본 발명에 의한 형광 프로브를 사용해서 그 효과의 정도를 평가하는 양태에 상당한다. 또한, 실시예 17은 예방적으로 칼파인 저해제가 투여된 포유류 대상에 있어서 칼파인의 활성화가 야기된 경우에 있어서의 칼파인 저해제의 효과의 정도를, 본 발명에 의한 형광 프로브를 사용해서 평가하는 양태에 상당한다.
(실시예 18) 포유류 대상에서의 칼파인 저해제와의 병용 4
칼파인 저해제로서, 공유 결합적 저해제인 SNJ-1945(CAS 854402-59-8), C2I(CAS 677275-28-4), 또는 MDL 28, 170(CAS 88191-84-8) 혹은 비공유 결합적 저해제인 PD-151746(CAS 179461-52-0)을 병용한 경우의 신경 세포의 이미징을 비교했다. 구체적으로는, 0.5%(w/v) CMC 용액에 각 칼파인 저해제를 2.5%(w/v)가 되도록 현탁해서 조제한 저해제 함유 CMC 용액을 사용한 것 이외에는 실시예 16과 마찬가지로 하여, 래트의 신경 세포의 이미징을 행하였다.
안저 촬영 화상의 HMRG 양성 신경 세포수를 계측하고, SNJ-1945 투여군과 다른 칼파인 저해제 투여군과의 2군간 비교를 행한 결과를 도 35에 나타낸다. 도 35에 나타내는 바와 같이, SNJ-1945 투여군에서는, 다른 칼파인 저해제 투여군에 비하여 HMRG 양성 신경 세포수가 유의미하게 감소하고 있었다. 당해 결과는, 본 발명의 형광 프로브가 다양한 칼파인 저해제의 저해능을 검출하는 것이 가능한 것을 나타내고, 또한 본 발명의 형광 프로브는 칼파인 저해제 중, 특히 SNJ-1945의 칼파인 저해능을 보다 높은 정밀도로 검출할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
(실시예 19) 인 비트로 RGC 축삭 모델에 있어서의 칼파인 활성의 검출
인간 iPS 세포(201B7주, CiRA로부터 구입)에 대하여, 기보의 방법(STEM CELLS TRANSL MED(2017) 6: 1972-1986)을 참고로, 망막 신경절 세포로 풍부하게 발현하는 BRN3B의 프로모터 하류에 tdTomato 형광 단백의 배열이 삽입된 게놈 편집을 행하였다. 이어서, 기보의 방법(METHODS CELL BIOL(2020) 159: 279-302)에 경미한 수정을 더해서 iPS 세포로부터 망막 오르가노이드를 분화 유도하고, 37℃, 5% CO2-95% 공기의 조건 하에서, 41일간의 부유 배양의 후에 7일간의 접착 배양을 함으로써, 망막 신경절 세포 유래의 축삭 신장을 유도했다. 계속해서, 칼슘 이오노포어 A23187을 50nM으로 인큐베이트함으로써 세포 내 칼슘 농도를 상승시키는 평가계에서, 화합물 19의 1μM을 동시에 첨가하고, HMRG가 생성된 세포를 공초점 현미경LSM710에 의해 경시적으로 형광 촬영했다. 또한, HMRG의 생성이 칼파인 활성화에 기인하는 것을 증명하기 위해서, A23187 첨가의 1시간 전에 SNJ-1945를 100μM으로 인큐베이트한 망막 오르가노이드에서도 화합물 19로부터의 HMRG 생성의 확인을 행하였다. 결과를 도 36의 (a)에 나타낸다. 또한, 도 36 중, (b)는 화합물 19의 첨가만을 행하고, SNJ-1945 및 A23187을 모두 첨가하지 않은 축삭의 촬영 화상이고, (c)는 화합물 19 및 A23187의 첨가만을 행하고, SNJ-1945를 첨가하지 않은 축삭의 촬영 화상이다. 또한, 도 36의 (a) 내지 (c)의 상열 좌단부의 화상은, 이들 축삭에 있어서 tdTomato의 형광을 검출하기 위한 형광 촬영 화상이고, 어느 것의 화상에 있어서도 망막 신경절 세포의 축삭에 발현한 tdTomato를 확인할 수 있다.
도 36의 (a) 내지 (c)로부터, 칼슘 이오노포어에 의해 칼파인 활성이 증대하는(결과로서, 형광 프로브 반응이 증대하는) 것, 및 칼파인 저해제에 의해 당해 칼파인 활성의 증대가 소실한 것을 알 수 있다. 녹내장의 발증 또는 진행에 관련하여, 고안압이 된 경우에는 허혈이 일어나서, 신경 세포 내로 칼슘이 유입된다. 또한, 글루탐산 수용체를 포함하는 다양한 칼슘 유입 메커니즘을 생각할 수 있고, 이들 칼슘 유입에 기인해서 칼파인 활성의 증대가 발생할 수 있다. 실시예 19는, 칼슘 이오노포어 자극에 의한 비선택적인 칼슘 유입 모델에 있어서의 RGC 축삭에서의 형광 프로브의 반응성을 확인한 것이고, 본 발명의 실시 형태에 따른 형광 프로브가 축삭에서의 칼파인 활성의 검출에도 유효한 것을 알 수 있다.
(실시예 20) 카텝신 B에 의한 형광 강도의 경시 변화
화합물 19에 대해서, 경시적인 형광 어세이를 행하였다. 구체적으로는, 10μM의 합성한 형광 프로브를 포함하는 50mM TRIS 완충액(pH 7.4, 2mM EGTA, 2mM DTE)에, 880ng/mL의 재조합 인간 카텝신 B(953-CY; R&D Systems, MN, USA)를 더하여, 37℃에서 효소 반응을 실시했다. 음성 대조로서, 카텝신 B를 첨가하지 않은 것 이외에는 상기와 마찬가지 조작을 행하였다. 카텝신 B에 의한 형광 강도의 경시 변화를 측정한 결과를 도 37에 나타낸다(여기 파장 475㎚, 형광 파장 500-550㎚).
도 37에 도시되는 바와 같이, 화합물 19는, 카텝신 B에 대한 형광 프로브로서 기능했다.

Claims (25)

  1. 하기의 일반식 (I)로 표시되는 화합물 또는 그의 염:

    [식 중, A 및 B는, 각각 독립적으로 동일하거나 또는 다른 아미노산 잔기를 나타내고,
    여기서, A와, A에 결합하는 NH 사이의 결합은, A의 C 말단과 해당 NH 사이의 아미드 결합이고, A와 B는 아미드 결합으로 결합되어 있고, 또한 B와, B에 결합하는 카르보닐(C=O) 사이의 결합은, B의 N 말단과 해당 카르보닐(C=O) 사이의 아미드 결합이고;
    R1은 동일하거나 또는 상이하고, 벤젠환에 결합하는 치환기를 나타내고;
    p는 0 내지 4의 정수를 나타내고;
    R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은, 각각 독립적으로 수소 원자, 히드록실기(OH기), 할로겐 원자, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내고;
    R8 및 R9는, 각각 독립적으로 수소 원자, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내거나, 혹은 R8과 R9가 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고, 혹은 R3과 R8이 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고, 또한/또는 R4와 R9가 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
    X는 직쇄 또는 분지 C1 내지 C3 알킬렌기를 나타내고;
    R10 및 R11은, 각각 독립적으로 수소 원자, 히드록실기(OH), 알콕시기, 또는 치환되어도 되는, 직쇄, 분지, 혹은 환상 알킬기를 나타내거나, 혹은 R10과 R11이 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
    R12는 수소 원자; 치환되어도 되는, 직쇄, 분지 혹은 환상 알킬기; 치환되어도 되는, 직쇄 혹은 분지 알케닐기; 치환되어도 되는, 직쇄 혹은 분지 알키닐기; 치환되어도 되는 아릴기; 또는 치환되어도 되는 복소환기를 나타내거나, 혹은 R10 또는 R11과 결합해서 환을 형성하고 있어도 되고;
    L은 아미드 결합, 에스테르 결합, 또는 -(직쇄 혹은 분지 알킬렌-O-)n-(n은 1 내지 10의 정수)을 나타내거나, 혹은 단결합을 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, -O-L-R12로 표현되는 기는, 이하의 식 (II)로 표시되는 기인, 화합물 또는 그의 염.
    Figure pct00075

    [식 중, n은 0 내지 10의 정수를 나타낸다.]
  3. 제1항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, -O-L-R12로 표현되는 기가 수산기 또는 이하에서 선택되는 기인, 화합물 또는 그의 염.
    Figure pct00076
  4. 제1항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서,
    Figure pct00077

    로 표현되는 부분 구조가, 이하의 식(식 중, m은 1 내지 3의 정수, q는 0 또는 1을 나타낸다)
    Figure pct00078

    으로 표현되는 구조인, 화합물 또는 그의 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R10 및 R11이 알킬기이거나, 서로 결합해서 시클로알킬기인, 화합물 또는 그의 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, 아미노산 B가 Leu인, 화합물 또는 그의 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)에 있어서, 아미노산 A가 Met, Thr, His, Tyr, Phe, Ser, Gln, Arg, Lys, Nle, 또는 MetO인, 화합물 또는 그의 염.
  8. 제1항에 있어서, 하기의 일반식 (III)으로 표시되는, 화합물 또는 그의 염.
    Figure pct00079
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 형광 프로브.
  10. 제9항에 있어서, 칼파인 활성 검출용인, 형광 프로브.
  11. 샘플 중의 칼파인 활성의 측정 방법이며, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염과 샘플을 접촉시키는 것, 및 상기 접촉 후의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 칼파인 활성에 관련된 질환이 안질환, 근질환, 당뇨병, 염증성 질환, 자기 면역 질환, 신경 질환, 심장 또는 혈관 질환, 암, 뇌종양, 가령 증후군, 조로증, 감염증, 외상성 뇌장애, 마카도 조셉병, 자간전증 혹은 폐섬유증인, 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 안질환이 녹내장, 상염색체 우성 신생 혈관 염증성 초자체 망막증, 망막 색소 변성증, 가령 황반 변성, 당뇨병에 수반하는 망막 신경 장애 또는 망막 혈관 폐색성 질환, 망막 허혈 혹은 백내장인, 진단용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 녹내장이 정상 안압 녹내장인, 진단용 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 암이, 흑색종, 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 자궁경암, 난소암, 또는 연부 육종인, 진단용 조성물.
  17. 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 및
    상기 접촉 후의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염으로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 칼파인 활성에 관련된 질환에 대한 후보 화합물의 치료 효과를 판정하기 위한 시험 방법으로서,
    칼파인 활성에 관련된 질환 모델에 있어서, 후보 화합물이 미투여 및 투여의 샘플을 조제하는 것,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염과, 상기 샘플을 접촉시키는 것, 및
    상기 접촉 후의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염으로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 포유류 대상에 있어서의 칼파인 활성에 관련된 질환의 모니터링을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염과, 상기 포유류 대상 유래의 샘플을 접촉시키는 것, 및
    상기 접촉 후의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염으로부터의 형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제9항에 있어서, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 사용한 해당 질환의 치료 또는 예방에 있어서, 그 효과의 정도를 판정하기 위해서, 해당 의약 조성물과 조합해서 사용되는, 형광 프로브.
  21. 제9항에 있어서, 치료 대상 후보 또는 예방 대상 후보가, 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물을 사용한 치료 대상 또는 예방 대상에 해당하는지의 여부를 미리 검사하기 위해서 사용되는, 형광 프로브.
  22. 제9항에 있어서, 카텝신 활성 검출용인, 형광 프로브.
  23. 제9항에 있어서, 췌액 검출용인, 형광 프로브.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 췌액 검출용 키트.
  25. 칼파인 저해제를 유효 성분으로서 함유하는 칼파인 활성에 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서, 치료 혹은 예방 대상 후보 또는 해당 후보 유래의 샘플에 있어서의 칼파인과 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 염의 상호 작용에 의한 형광 응답을 지표로 해서, 칼파인 저해제에 대한 감수성을 갖는다고 판정된 치료 또는 예방 대상에 투여되는, 의약 조성물.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2826656B1 (fr) * 2001-06-29 2003-09-12 Genethon Iii Methode de detection de l'activite de la calpaine 3 dans un echantillon biologique et peptides pour la mise en oeuvre de ladite methode
CA2816041C (en) * 2010-12-29 2019-01-08 Arrowhead Research Corporation In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
JP5688826B2 (ja) * 2013-03-04 2015-03-25 国立大学法人 東京大学 カルパイン活性検出蛍光プローブ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016137004A1 (ja) 2015-02-27 2016-09-01 国立大学法人 東京大学 カルパイン活性検出蛍光プローブ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCONJUGATE CHEMISTRY(2020) 31: 2241-2251
THE JOURNAL OF BIOLOGICACLH(1993) 268: 23593-23600

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