WO2016136942A1 - 大腸炎抑制剤 - Google Patents

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WO2016136942A1
WO2016136942A1 PCT/JP2016/055811 JP2016055811W WO2016136942A1 WO 2016136942 A1 WO2016136942 A1 WO 2016136942A1 JP 2016055811 W JP2016055811 W JP 2016055811W WO 2016136942 A1 WO2016136942 A1 WO 2016136942A1
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colitis
lactobacillus
lactic acid
inhibitor
acid bacteria
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杏輔 小林
幸夫 浅見
里美 小山
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Meiji Co Ltd
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Meiji Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a colitis inhibitor comprising Lactobacillus lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • Colitis is an inflammatory disease that occurs in the large intestine.
  • Colitis includes inflammatory bowel disease that is an autoimmune disease, idiopathic diseases such as Behcet's disease, ischemic enteritis, and infectious enteritis. included.
  • Inflammatory bowel disease is roughly divided into ulcerative colitis and Crohn's disease, both of which are designated as specific diseases in Japan. The etiology of these is unknown, and involvement of enteric bacteria and abnormal immune functions are considered as the etiology.
  • the incidence of ulcerative colitis is about 100 per 100,000 population in Japan and less than half in the United States, and the incidence of Crohn's disease is about 27 per 100,000 population in Japan. Although it is about one-tenth in the United States, in the future, it is considered that the incidence of inflammatory bowel disease will increase in Japan in the future with the westernization of life.
  • Ulcerative colitis and Crohn's disease are difficult to treat, and no fundamental treatment method has been established.
  • drug therapy sulfa drugs such as 5-aminosalicylic acid (5-ASA), steroids such as prednisolone, immunomodulators / suppressants, etc.
  • 5-ASA 5-aminosalicylic acid
  • steroids such as prednisolone
  • immunomodulators / suppressants etc.
  • Nutrition therapy and diet therapy are also used in combination with the disease.
  • Patent Document 1 JP 2010-83881 A discloses intestinal inflammation similar to ulcerative colitis induced by DSS (sodium dextran sulfate) by oral administration of heat-killed cells of Lactobacillus brevis SBC8803 strain. Suppression has been reported.
  • DSS sodium dextran sulfate
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 5116194 discloses a prophylactic and therapeutic agent for inflammatory bowel disease comprising a bacterial cell or a polysaccharide fraction derived from Lactobacillus ⁇ ⁇ casei YIT9029 and Lactobacillus gasseri YIT0168 as Lactobacillus bacteria. Has been reported.
  • Lactobacillus genus is not sufficient in suppressing colitis, and only specific strains are used.
  • no highly effective colitis inhibitor has been reported which contains a lactic acid bacterium that can be safely and easily ingested as an active ingredient.
  • JP 2010-83881 A Japanese Patent No. 5116194
  • An object of the present invention is to provide a colitis inhibitor having a safe and excellent colitis inhibitory effect and a method for producing the same.
  • the present inventors have recently found that Lactobacillus lactic acid bacteria exhibiting a heat shock protein 70 expression enhancing activity have a safe and excellent colitis-inhibiting action in colon cells cultured together in vitro. .
  • the present invention is based on such knowledge.
  • a colitis inhibitor comprising, as an active ingredient, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having activity to enhance expression of heat shock protein (HSP) 70 in colon cells.
  • HSP heat shock protein
  • the expression level of HSP70 in colon cells cultured together in vitro with Lactobacillus lactic acid bacteria is 1.5 times or more compared to that of colon cells cultured without the addition of Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • the colitis inhibitor according to any one of (1) to (3) which can be increased.
  • the colitis inhibitor according to any one of (1) to (4), wherein the colitis is an inflammatory bowel disease.
  • the colitis inhibitor according to (5), wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis.
  • the colitis inhibitor of the present invention can effectively suppress colitis, particularly inflammatory bowel disease. Since the colitis inhibitor of the present invention contains Lactobacillus lactic acid bacteria as an active ingredient, it can be advantageously used for safely suppressing colitis and improving convenience.
  • FIG. 1 is a graph showing the ratio of the expression level of HSPA1A gene / the expression level of GAPDH gene in induction of HSPA1A gene expression by administration of several types of Lactobacillus johnsonii strains in Caco-2 cells.
  • N 3.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing an outline of an animal experiment schedule.
  • FIG. 3 is a graph showing the change rate of the average body weight of each group at the time of administration of DSS (* p ⁇ 0.05, comparison with G1 group). The rate of change when day 1 (the first day) is 100.
  • FIG. 4 is a graph showing inflammation scores of the DSS administration groups (G3 and G4) at the time of dissection (* p ⁇ 0.05).
  • G3 DSS + PBS administration group
  • G4 DSS + Lactobacillus johnsononi OLL203565 strain administration group.
  • G5 is a graph showing the length of the large intestine and the weight per unit length of each group at the time of dissection (** p ⁇ 0.01, comparison with the G1 group).
  • G1 Distilled water + PBS administration group
  • G2 Distilled water + Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group
  • G3 DSS + PBS administration group
  • G4 DSS + Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group.
  • the colitis inhibitor of the present invention is characterized by containing a lactobacillus lactic acid bacterium having HSP70 expression enhancing activity in colon cells as an active ingredient. It is a surprising fact that Lactobacillus lactic acid bacteria having HSP70 expression enhancing activity have a remarkable colitis-suppressing action.
  • HSP70 is one type of protein whose expression is induced by heat, ultraviolet rays, or the like, for example, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • HSP70 is a protein encoded by HSPA1A (HSPA1A), and the gene sequence of HSPA1A can be identified by referring to SEQ ID NO: 2, for example. Therefore, the colitis inhibitor of the present invention may be characterized by containing a lactobacillus lactic acid bacterium having HSPA1A expression enhancing activity in colon cells as an active ingredient.
  • the presence or absence of HSP70 expression enhancing activity in Lactobacillus lactic acid bacteria is determined by a comparative test using the expression level of HSPA1A encoding HSP70 as an index, as described in Example 1 of the present specification (in vitro test). Can do.
  • a comparative test when the expression level of HSPA1A in colon cells cultured with Lactobacillus lactic acid bacteria is higher than the expression level of HSPA1A in colon cells cultured without adding the Lactobacillus lactic acid bacteria, Lactobacillus The genus lactic acid bacteria are considered to have HSP70 expression enhancing activity.
  • the expression level of HSPA1A can be calculated based on the expression level of a housekeeping gene (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)) in colon cells as described in Example 1 of the Examples of the present specification. it can.
  • GPDH glycosyl-phosphate dehydrogenase
  • Lactobacillus lactic acid bacteria are expressed in HSP70 expression levels in colon cells cultured together in vitro, and in HSP70 expression levels in colon cells cultured without the addition of Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • Lactobacillus lactic acid bacteria are expressed as follows: HSPA1A expression level in colon cells cultured together in vitro, and HSPA1A expression level in colon cells cultured without the addition of Lactobacillus lactic acid bacteria Is preferably 1.5 times or more, more preferably 1.7 times or more, still more preferably 1.8 times or more, still more preferably 1.9 times or more, still more preferably 2.0 times or more, Preferably, it can be increased to 2.5 times or more, more preferably 3.0 times or more, further preferably 3.5 times or more, and even more preferably 4.0 times or more.
  • the Lactobacillus lactic acid bacterium is divided between experimental groups by dividing the expression level of HSPA1A in colon cells cultured together in vitro (the expression level of housekeeping gene (GAPDH)). Is a value obtained by dividing the expression level of HSPA1A in colon cells cultured without adding the Lactobacillus lactic acid bacterium (the expression level of housekeeping gene (GAPDH)), thereby correcting the variation among experimental groups.
  • the colon cells used for the measurement of the expression enhancing activity of HSP70 are preferably Caco-2 cells as described in Example 1 of the Examples of the present specification.
  • the Lactobacillus lactic acid bacteria are, for example, Lactobacillus Johnsoni, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Gasseri, Lactobacillus Helveticas, and preferably Lactobacillus Johnsonii (L. johnsonii).
  • the lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus are preferably viable cells. By ingesting them, the intestinal environment is improved, and the number of defecations, the amount of stool, its shape, color, smell, etc. Can be improved.
  • Lactobacillus spp. Johnsoni is a Gram-positive bacilli and has growth in the form of homolactic fermentation and aerobic conditions. Then, Lactobacillus spp. Johnsoni is coated on an MRS agar medium (BD) plate and cultured in anaerobic conditions using Aneropac Kenki (Mitsubishi Gas Chemical) at 37 ° C. for 48 hours. To form flat colonies. In addition, Lactobacillus spp. Johnsoni can be used particularly advantageously in effectively suppressing colitis.
  • the Lactobacillus Johnsonii strain is preferably Lactobacillus Johnsonii 65 OLL203565 strain, Lactobacillus Johnsonii OLLL204255 strain, more preferably Lactobacillus Johnsonii OLL203565 strain, more preferably Lactobacillus Johnsonii OLL203565 strain, It is Johnsoni OLL 203565 strain.
  • One of these may be used as an active ingredient, or a mixture of two or more may be used as an active ingredient.
  • Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain was incorporated in the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Deposit Center (Kazusa-Kamashita 2-5-8 122, Kisarazu City, 292-0818, Chiba Prefecture) The deposit number is NITE BP-02003 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL203565).
  • Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain was incorporated into the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Deposit Center (Kazusa-Kamashita 2-5-8 122, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818), The deposit number is NITE BP-02004 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL204255).
  • Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain is incorporated in the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Deposit Center (Kazusa Kamashi, Kisarazu City, 2292-8818, Chiba Prefecture) The deposit number is NITE BP-0202 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL2978).
  • Lactobacillus lactic acid bacteria may be used as they are, or other orally acceptable components may be used in combination with Lactobacillus lactic acid bacteria.
  • ingredients that are orally acceptable are not particularly limited as long as they do not interfere with the effects of the present invention.
  • excipients such as excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorings And additives such as fragrances, fragrances, buffers, antioxidants and pH adjusters, and medicines for internal medicine.
  • the form of the colitis inhibitor of the present invention is not particularly limited, and may be powder, tablet, capsule or drink form.
  • the form of the colitis inhibitor of the present invention is preferably composed of a single intake unit so that Lactobacillus lactic acid bacteria is an effective amount for the suppression of colitis.
  • the unit of the intake amount of the colitis inhibitor of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 9 CFU / ml of Lactobacillus lactic acid bacteria, preferably 100 ml or more, and 200 ml or more. More preferably.
  • the form of the colitis inhibitor of the present invention is preferably provided by being packaged in a unit per one intake.
  • the form of unit packaging per ingestion amount of the colitis inhibitor of the present invention is a packaging material such as a soft pack or a plastic container, and a form that defines a certain amount can be mentioned.
  • a component display per one intake, or a display of use such as suppression of colitis may be attached. Examples of the form of such unit packaging can suitably include supplements, pharmaceutical preparations and the like.
  • the form of the colitis inhibitor of the present invention may be a sustained-release preparation. Making the form of the colitis inhibitor of the present invention into a sustained-release preparation is preferable for allowing Lactobacillus lactic acid bacteria to be orally ingested and then allowing them to reach colon cells while alive.
  • the colitis inhibitor of the present invention can be easily produced by mixing Lactobacillus lactic acid bacteria with other orally acceptable components as desired. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a colitis inhibitor characterized by containing Lactobacillus lactic acid bacteria having HSP70 expression enhancing activity in colon cells.
  • the production method of the present invention includes a step of culturing both Lactobacillus lactic acid bacteria and colon cells in vitro, and selecting Lactobacillus lactic acid bacteria in which the expression level of HSP70 in the colon cells is higher than a preset threshold value. Also good.
  • the method for measuring the expression level of HSP70 is not particularly limited, and a technique for directly or indirectly measuring the expression level of HSP70 can be used.
  • Such measurement methods include, for example, real-time PCR, Northern blot, RNA sequencing and the like.
  • the preset threshold is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not hindered.
  • the expression level of HSP70 in colon cells cultured without adding Lactobacillus lactic acid bacteria can do.
  • the threshold value for the expression level of HSP70 may be measured using the expression level of HSPA1A as an index, as described in Example 1 of the examples of the present specification.
  • the expression level of HSPA1A may be calculated based on the expression level of a housekeeping gene in colon cells.
  • GAPDH is preferably used as described in Example 1 of the present specification, but hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), beta actin (ACTB), and the like may also be used. Good.
  • the method for culturing both Lactobacillus lactic acid bacteria and colon cells is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not hindered, and those skilled in the art can appropriately set.
  • Examples of such culture conditions include, for example, when the colon cells are Caco-2 cells, 24 hours at 37 ° C. in a high glucose Dulbecco modified Eagle medium, CO 2 environment.
  • the colitis inhibitor of the present invention can provide a composition comprising a colitis inhibitor. That is, the colitis inhibitor of the present invention can be used alone as it is, but as long as the colitis inhibitory function is exhibited, various compositions for oral intake (for oral administration) such as foods and pharmaceuticals. On the other hand, it can also be included as a raw material (material), an additive, etc., and the composition which has a colitis inhibitory effect can be obtained. Therefore, according to one embodiment of the present invention, a composition comprising the colitis inhibitor of the present invention is provided.
  • composition of the present invention it is possible to provide a composition comprising, as an active ingredient, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells.
  • the composition of the present invention may be a food composition or a pharmaceutical composition. Such an embodiment can be carried out according to the description of the colitis inhibitor described above.
  • the food composition is other than the pharmaceutical composition, and is not particularly limited as long as it is a form that can be taken orally, such as a solution, suspension, emulsion, powder, or solid molded product.
  • instant noodles, retort food, canned food, microwave food, instant soup / miso soup, freeze-dried food, etc . soft drink, fruit juice drink, vegetable drink, soy milk drink, coffee drink, tea Beverages such as beverages, powdered beverages, concentrated beverages, alcoholic beverages; flour products such as bread, pasta, noodles, cake mixes, bread crumbs; rice cakes, caramel, chewing gum, chocolate, cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Confectionery such as Japanese confectionery, dessert confectionery; sauces, tomato processing seasonings, flavor seasonings, cooking mixes, sauces, dressings, soups, curry and stew ingredients; processed fats, butter, margarine, Fats and oils such as mayonnaise; milk drinks, yogurts, lactic acid bacteria drinks, ice creams, creams
  • the food includes health foods (including supplements), functional foods, dietary supplements, functional labeling foods, foods for specified health use, foods for the sick, infant formula, milk powder for pregnant and lactating women, and disease risk. Classifications such as food with a reduced label are also included.
  • a dairy product for suppressing colitis preferably a dairy product for suppressing colitis, a yogurt, a lactic acid bacteria beverage comprising, as an active ingredient, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having HSP70 expression enhancing activity in colon cells.
  • ice creams are provided.
  • Such an embodiment can be carried out according to the description of the colitis inhibitor described above.
  • the pharmaceutical composition is prepared as an oral preparation or a parenteral preparation according to a conventional method using additives that are acceptable for formulation.
  • oral preparations take the form of solid preparations such as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, pills, sustained-release preparations, and liquid preparations such as solutions, suspensions, and emulsions. Can do.
  • a parenteral preparation it can take the form of an injection or a suppository. From the viewpoint of simplicity, an oral preparation is preferable.
  • Additives that are acceptable for formulation include, for example, excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, fragrances, buffers, antioxidants, pH Examples thereof include regulators.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutical composition for diseases requiring suppression of colitis, such as inflammatory bowel disease, Behcet's disease, ischemic enteritis and infectious enteritis, more specifically prevention. And therapeutic compositions.
  • the suppression of colitis comprising ingesting an effective amount of Lactobacillus lactic acid bacteria having HSP70 expression enhancing activity in colon cells to a subject in need thereof
  • a method is provided.
  • “suppression” includes not only treating an established disease state but also a concept of preventing a disease state that may be established in the future.
  • “suppression” of the present invention also includes non-therapeutic concepts such as amelioration or alleviation of symptoms or conditions resulting from or associated with inflammation in the large intestine.
  • the suppression of colitis is an improvement or alleviation of symptoms or conditions resulting from or associated with inflammation in the large intestine, preferably non-therapeutic.
  • the method for suppressing colitis can set or adjust the effective amount of Lactobacillus lactic acid bacteria in the same manner as the unit of single intake in the aforementioned colitis inhibitor.
  • the method for ingesting an effective amount of Lactobacillus lactic acid bacteria to a subject in need thereof is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not hindered, and is, for example, oral intake or enteral intake, preferably oral. It is ingestion.
  • the intake plan of the Lactobacillus lactic acid bacteria of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art depending on the age, sex, symptoms and condition of the subject.
  • a unit of an oral intake may be administered, for example, 1 to 10 times per day, preferably 1 to 3 times per day, More preferably, it is administered once per day.
  • the colitis inhibitor of this invention can be ingested with a meal.
  • the colitis of the present invention is, for example, inflammatory bowel disease, Behcet's disease, ischemic enteritis and infectious enteritis, preferably inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), more preferably Ulcerative colitis.
  • the subject of the present invention is a mammal, for example, a rodent, a dog, a cat, a cow, a primate, a human, preferably a human, and more preferably a patient suffering from colitis.
  • the subject of the present invention may be a healthy person. Examples of such healthy persons are preferably those who are not diagnosed as patients suffering from colitis, but have symptoms or conditions caused by or associated with inflammation in the large intestine, or which may cause those symptoms or conditions. .
  • ulcerative colitis is Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee, Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan, IBP Research 4: 189-239, 2010 (particularly ( 14) Page 2, 2 (see Figure 1 on page 16)), etc., such as Fumiaki Ueno et. Al. Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn's disease, integrated with formal consensus of experts in Japan, J Gastroenterol (2013 ) 48: 31-72 (especially II on page 38, II-8 on page 43, see Table 5 on page 44), etc., can be used for diagnosis.
  • the use of a Lactobacillus genus lactic acid bacterium having HSP70 expression enhancing activity in colon cells in the manufacture of a colitis inhibitor Moreover, according to one aspect of the present invention, there is provided the use of Lactobacillus lactic acid bacteria having HSP70 expression enhancing activity in colon cells for the suppression of colitis. According to one preferred embodiment of the invention, the use is a non-therapeutic use. Such use can be carried out according to the description of the colitis inhibitor and the method for suppressing colitis described above.
  • a Lactobacillus genus lactic acid bacterium having HSP70 expression enhancing activity in colon cells for suppressing colitis Such an embodiment can be carried out according to the description of the colitis inhibitor described above.
  • Example 1 HSPA1A gene expression induction test (in vitro test) (1) Preparation of viable cell suspension and Caco-2 cells Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain, Lactobacillus johnsoni OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain using Difco (trademark) Lactobacilli MRS broth medium (BD), 37 The cells were cultured in one passage under anaerobic conditions at ° C. Each bacterium is precipitated by centrifugation (8,000 rpm, 5 minutes), washed with a phosphate buffer (PBS, Phosphate Buffered Saline), and then used with a spectrophotometer (U-2810 Spectrophotometer, HITACHI).
  • PBS phosphate buffer
  • HITACHI spectrophotometer
  • turbidity was measured at a wavelength of 650 nm.
  • PBS Phosphate Buffered Salts
  • TaKaRa Phosphate Buffered Salts
  • Caco-2 cells were subcultured to 6-well plates (TPP) so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / well.
  • HSP gene expression induction test At 20 ⁇ l / well, the viable cell suspension was added to the 6-well plate containing the Caco-2 cells after the passage, and placed under an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. For 24 hours. Immediately after the completion of this co-culture, the culture medium (medium) was removed by aspiration, and RNA later (Ambion) was added thereto to immerse the cells. From these cells, RNA was extracted by NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL), and then reverse transcription reaction was performed using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time, TaKaRa).
  • Tables 1 and 2 show the compositions of primers and reaction solutions used in real-time PCR, respectively.
  • Real-time PCR reaction conditions are (95 ° C, 30 seconds) ⁇ (95 ° C, 5 seconds ⁇ 60 ° C., 30 seconds) ⁇ 40 cycles ⁇ 95 ° C., 15 seconds ⁇ 60 ° C., 30 seconds ⁇ 95 ° C., 15 seconds ⁇ 4 ° C.
  • PBS As a control group, instead of viable cell suspension, PBS was administered and co-cultured.
  • the HSPA1A gene expression increased in the live Lactobacillus johnsononi administration group.
  • Example 2 In vivo test Lactobacillus johnsoni OLL203565 strain was administered to mice, and the effect of suppressing coltranitis induced by sodium dextran sulfate (DSS, molecular weight: 36,000-50,000 Da, MP Biomedicals) was tested in animals. Was examined.
  • DSS sodium dextran sulfate
  • the live cell suspension was prepared by suspending 1 ⁇ 10 8 cfu of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain in 200 ⁇ l of PBS.
  • the viable cell suspension was forcibly orally administered daily by a sonde. DSS water was used as free drinking water.
  • Each group consisted of 10 animals using BALB / c mice (4 weeks old, male, Charles River). From one week before administration of DSS water (2.0 w / v%), the viable cell suspension was administered to mice every day. The mixture of DSS water and viable cell suspension was administered daily for one week (up to the seventh day after administration of DSS water), with the first day of DSS water administration as the first day.
  • distilled water was administered instead of DSS water
  • PBS was administered instead of viable suspension
  • distilled water and PBS were administered instead of DSS and viable suspension. What was used was used (refer FIG. 2).
  • mice body weight measurements and inflammation scores were recorded daily.
  • mice After completion of the DSS administration period (day 8), the mice were dissected, the large intestine was collected, and their length and weight were measured. As the inflammation score at the time of dissection, the average of the total diarrhea and bloody stool scores was compared between the groups administered with DSS.
  • mice body weight, the length of the large intestine, and the weight per unit length of the large intestine were compared between groups using Tukey's test.
  • Mann-Whitney U test compared between groups.
  • the average value ⁇ standard deviation (SD) is shown.
  • the inflammation score was significantly decreased in the DSS + Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group compared to the DSS + PBS administration group.
  • the length of the large intestine was shortened in the DSS administration group.
  • the weight per unit length was significantly increased in the DSS + PBS administration group compared with the distilled water + PBS administration group, but no significant difference was observed in the DSS + Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group. .

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Abstract

　本発明は、安全で優れた大腸炎抑制効果を有する大腸炎抑制剤およびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎抑制剤に関する。

Description

大腸炎抑制剤 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国特許出願である特願２０１５－０３８３０２号（出願日：２０１５年２月２７日）に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本願発明の開示の一部とされる。
発明の背景
技術分野
　本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎抑制剤に関する。
背景技術
　大腸炎は、大腸におこる炎症性疾患であり、大腸炎には、自己免疫性疾患である炎症性腸疾患、特発性疾患であるベーチェット症、虚血性腸炎、および感染症性腸炎などが含まれる。炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　Ｂｏｗｅｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ）は、潰瘍性大腸炎とクローン病の２つに大別され、これらは共に日本の特定疾患に指定されている。これらの病因は不明であり、腸内細菌の関与や免疫機能の異常などが病因として考えられている。現在のところ、潰瘍性大腸炎の発症は、日本において、人口１０万人あたり１００人程度と、米国における半分以下であり、クローン病の発症は、日本において、人口１０万人あたり２７人程度と、米国における約１０分の１であるが、将来には、日本においても、生活の欧米化に伴い、炎症性腸疾患の罹患率は増加すると考えられている。
　潰瘍性大腸炎とクローン病では、治療が困難であり、根本的な治療方法は確立されていない。内科療法として、潰瘍性大腸炎には、薬物療法（５－アミノサリチル酸薬（５－ＡＳＡ）などのサルファ剤、プレドニゾロンなどのステロイド剤、免疫調節剤・抑制剤など）が主体的に用いられ、クローン病には、栄養療法・食事療法（完全静脈栄養療法、経腸栄養療法、食餌療法）も併用されている。
　一方、炎症性腸疾患をはじめとする大腸炎では、外的刺激から腸粘膜を保護するために、哺乳動物の腸管で働いている種々の防御機構が破綻することにより発症すると考えられており、腸管保護剤の開発が進められている。例えば、特許文献１：特開２０１０－８３８８１号公報には、ラクトバチルス ブレビス ＳＢＣ８８０３菌株の加熱死菌体の経口投与によって、ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）により誘発される潰瘍性大腸炎類似の腸管炎症が抑制されたことが報告されている。
　また、特許文献２：特許第５１１６１９４号公報には、ラクトバチルス属細菌のラクトバチルス カゼイ ＹＩＴ９０２９、ラクトバチルス ガッセリ ＹＩＴ０１６８の菌体または菌体由来多糖画分を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤が報告されている。
　一方で、これらのラクトバチルス属の大腸炎抑制効果は十分ではなく、また特定の菌株が用いられているのみである。このように、日常的に安全に簡単に摂取できる乳酸菌を有効成分とする効果の高い大腸炎抑制剤は報告されていない。
特開２０１０－８３８８１号公報 特許第５１１６１９４号公報
　本発明は、安全で優れた大腸炎抑制効果を有する大腸炎抑制剤およびその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、今般、インビトロにて共に培養される大腸細胞において、特にヒートショックプロテイン７０の発現増強活性を示すラクトバチルス属乳酸菌が、安全で優れた大腸炎抑制作用を有することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制剤。
（２）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である、（１）に記載の大腸炎抑制剤。
（３）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株から選択されるものである、（１）または（２）に記載の大腸炎抑制剤。
（４）ラクトバチルス属乳酸菌が、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞のそれと比較して１．５倍以上に増加させることができる、（１）～（３）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（５）大腸炎が炎症性腸疾患である、（１）～（４）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（６）炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、（５）に記載の大腸炎抑制剤。
（７）便性を改善するための、（１）～（６）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（８）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法。
（９）大腸炎抑制剤の製造における、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１０）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１１）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌。
（１２）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法。
　本発明の大腸炎抑制剤によれば、大腸炎、特に炎症性腸疾患を効果的に抑制することができる。本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることから、大腸炎を安全に抑制し、かつ便性を改善する上で有利に利用することができる。
図１は、Ｃａｃｏ－２細胞における数種類のラクトバチルス ジョンソニ株の投与によるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子発現誘導におけるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の比率を示したグラフである。Ｎ＝３。 図２は、動物実験のスケジュールの概略を示す概念図である。　第１群（１０匹）：蒸留水＋ＰＢＳ（リン酸緩衝液）の投与群、　第２群（１０匹）：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、　第３群（１０匹）：ＤＳＳ水溶液（２．０ｗ／ｖ％）＋ＰＢＳの投与群、　第４群（１０匹）：ＤＳＳ水溶液（２．０ｗ／ｖ％）＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。 図３は、ＤＳＳの投与時の各群の平均体重の変化率を示すグラフである（＊ｐ＜０．０５、Ｇ１群との比較）。　ｄａｙ１（１日目）を１００とした場合の変化率である。　Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、　Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。 図４は、解剖時のＤＳＳの投与群（Ｇ３とＧ４）の炎症スコアを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。　Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。 図５は、解剖時の各群の大腸の長さと単位長さ当たりの重量を示すグラフである（＊＊ｐ＜０．０１、Ｇ１群との比較）。　Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、　Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。
発明の具体的説明
大腸炎抑制剤
　本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としている。ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が、顕著な大腸炎抑制作用を有することは意外な事実である。
　ＨＳＰ７０は、熱や紫外線などにより発現が誘導されるタンパク質の１種であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ＨＳＰ７０は、ＨＳＰＡ１Ａ（エイチエスピーエーワンエー）がコードするタンパク質であり、ＨＳＰＡ１Ａの遺伝子配列は、例えば、配列番号２を参照することで特定できる。よって、本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としてもよい。
　ラクトバチルス属乳酸菌におけるＨＳＰ７０の発現増強活性の有無は、本願明細書の実施例の例１（インビトロ試験）の記載の通り、ＨＳＰ７０をコードするＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標とした比較試験により判定することができる。かかる比較試験では、ラクトバチルス属乳酸菌と共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して高い場合、ラクトバチルス属乳酸菌はＨＳＰ７０の発現増強活性を有するものとされる。
　ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））の発現量を基準として算出することができる。
　本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。
　本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。
　本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍倍以上、さらに好ましく１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは、３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。
　ＨＳＰ７０の発現増強活性の測定に用いられる大腸細胞は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、Ｃａｃｏ－２細胞が好ましい。
　本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、例えば、ラクトバチルス ジョンソニ、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス ガッセリ、ラクトバチルス ヘルベティカスなどであり、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である。そして、ラクトバチルス属乳酸菌は、好ましくは、生菌体であり、これを摂取することにより、腸内環境が改善され、排便の回数、便の量、その形、色あるいは臭いなどの便性を改善することができる。
　ラクトバチルス ジョンソニは、グラム陽性の桿菌であり、ホモ乳酸発酵の形式、好気的条件にて発育性を有する。そして、ラクトバチルス ジョンソニは、ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ）平板上に、それを塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学）を用いた嫌気的条件にて３７℃、４８時間で培養すると、円形、白色、扁平状コロニーを形成する。また、ラクトバチルス ジョンソニは、大腸炎を効果的に抑制する上で、特に有利に使用することができる。
　ラクトバチルス ジョンソニは、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株であり、より好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、さらに好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株である。これらは１種類の単独のものを有効成分として用いてもよいし、２種類以上を混合したものを有効成分として用いてもよい。
　ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００３（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL203565）として寄託されている。
　ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００４（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL204255）として寄託されている。
　ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ－０２００２（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL2978）として寄託されている。
　本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌をそのまま用いてもよく、ラクトバチルス属乳酸菌と共に経口上で許容可能な他の成分を併用してもよい。
　経口上で許容可能な他の成分は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤等の添加剤や、内科療法用の薬剤などである。
　本発明の大腸炎抑制剤の形態は、特に制限されず、粉末状、錠剤状、カプセル状またはドリンク剤状であってよい。
　本発明の大腸炎抑制剤の形態は、ラクトバチルス属乳酸菌が大腸炎の抑制のための有効量となるように、１回の摂取量の単位から構成されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量の単位は、ラクトバチルス属乳酸菌を、１×１０７～１×１０９ＣＦＵ／ｍｌで、１００ｍｌ以上で含有することが好ましく、２００ｍｌ以上で含有することがより好ましい。
　本発明の大腸炎抑制剤の形態は、１回の摂取量当たりの単位で包装されて提供されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量当たりの単位包装の形態は、ソフトパック、プラスチック容器などの包材で、一定量を規定する形態が挙げられ、それら包材などの表面には、１回の摂取量当たりの成分表示や、大腸炎の抑制などの用途表示を付していてもよい。かかる単位包装の形態は、サプリメント、医薬製剤などを好適に例示できる。
　本発明の大腸炎抑制剤の形態は、徐放性製剤にしてもよい。本発明の大腸炎抑制剤の形態を徐放性製剤にすることは、ラクトバチルス属乳酸菌が経口摂取されてから、それらを生きたままで大腸細胞に到達させる上で好ましい。
　本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を、所望により経口上許容な他の成分と共に混合して簡易に製造することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法が提供される。
　本発明の製造方法は、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共にインビトロにて培養し、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量が、予め設定した閾値よりも高いラクトバチルス属乳酸菌を選択する工程を含んでいてもよい。
　前記の選択する工程において、ＨＳＰ７０の発現量を測定する方法は、特に制限されず、ＨＳＰ７０の発現量を直接的または間接的に測定する手法を用いることができる。かかる測定方法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングなどが挙げられる。
　また、前記の選択する工程において、予め設定した閾値は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量とすることができる。かかるＨＳＰ７０の発現量の閾値は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標として測定してもよい。さらに、ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を基準として算出してもよい。かかるハウスキーピング遺伝子として、例えば、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＧＡＰＤＨを用いることが好ましいが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）などを用いてもよい。
　さらに、前記の選択する工程において、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共に培養する方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、当業者であれば適宜設定することができる。かかる培養条件（温度、培地、培養時間）として、例えば、大腸細胞がＣａｃｏ－２細胞である場合、３７℃、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地、ＣＯ２環境下で、２４時間が挙げられる。
　本発明の別の態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤では、大腸炎抑制剤を含んでなる組成物を提供することができる。すなわち、本発明の大腸炎抑制剤では、そのまま単独で使用することもできるが、大腸炎抑制機能が発揮される限りにおいて、食品や医薬品などの種々の経口摂取用（経口投与用）の組成物に対して、原料（素材）や添加剤などとして含ませることもでき、大腸炎抑制効果を有する組成物を得ることができる。よって、本発明の一つの実施態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤を含んでなる組成物が提供される。
　本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする組成物を提供することができる。本発明の組成物は、食品組成物または医薬組成物であってよい。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。
　食品組成物とは、医薬組成物以外のものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物など、経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品などが挙げられる。好ましくは、食品は、乳製品であり、より好ましくは乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類である。
　また食品には、健康食品（サプリメント含む）、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調整粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または疾病リスク低減表示を付した食品のような分類のものも包含される。
　本発明の好ましい態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制用乳製品、好ましくは大腸炎抑制用乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。
　医薬組成物とは、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製したものである。経口製剤の場合には、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態をとることができる。また、非経口製剤の場合には、注射剤や座剤の形態をとることができる。簡易性の点からは、経口製剤であることが好ましい。製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物には、大腸炎の抑制を必要とする疾患、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎のための医薬組成物、より具体的には予防用組成物および治療用組成物が含まれる。
　また、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法が提供される。ここで、「抑制」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来に確立される可能性がある病態を予防する概念も含まれる。さらに本発明の「抑制」には、非治療的な概念、例えば、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和も含まれる。したがって、別の態様によれば、大腸炎の抑制は、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和であり、好ましくは非治療的である。
　大腸炎の抑制方法は、ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、上述した大腸炎抑制剤における１回の摂取量の単位と同様に設定や調整することができる。
　ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させる方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、経口摂取や経腸摂取などであり、好ましくは経口摂取である。
　本発明のラクトバチルス属乳酸菌の摂取計画は、特に限定されず、対象の年齢、性別、症状および状態に応じて、当業者が適宜設定することができる。本発明の対象に対して、１回の経口摂取量の単位を、例えば、１日当たり１～１０回で投与してもよいが、好ましくは、１日当たり１～３回で投与することであり、より好ましくは、１日当たり１回で投与することである。また、本発明の大腸炎抑制剤は、食事とともに摂取することができる。
　本発明の大腸炎として、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎であり、好ましくは、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）であり、より好ましくは、潰瘍性大腸炎である。
　本発明の対象として、哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類、ヒトであり、好ましくは、ヒトであり、より好ましくは、大腸炎を患う患者である。また、本発明の対象は、健常者であってもよい。かかる健常者の例としては、大腸炎を患う患者と診断されないものの、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態を有するか、あるいはそれらの症状または状態を生じる恐れのある者であることが好ましい。なお、大腸炎を患う患者か否かは、例えば、潰瘍性大腸炎は、Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee, Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan, IBP Research 4: 189-239, 2010（特に（１４）頁の２、（１６）頁の図１参照）等、クローン病は、Fumiaki Ueno et. al. Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn's disease, integrated with formal consensus of experts in Japan, J Gastroenterol (2013) 48: 31-72（特に３８頁のＩＩ、４３頁のＩＩ－８、４４頁の表５参照）等、公知の診断方法に基づき診断することができる。
　本発明の一つの態様によれば、大腸炎抑制剤の製造における、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用が提供される。また、本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の、大腸炎を抑制するための使用が提供される。本発明の好ましい一つの態様によれば、該使用は、非治療的使用である。かかる使用は、上述した大腸炎抑制剤および大腸炎の抑制方法の記載に準じて実施することができる。
　本発明の一つの態様によれば、大腸炎を抑制するための、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。
　本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
例１：ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現誘導試験（インビトロ試験）
（１）生菌懸濁液とＣａｃｏ－２細胞の調製
　ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株、ラクトバチルス ジョンソニＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ）を用いて、３７℃、嫌気条件下にて１回の継代で培養した。そして、各菌を遠心分離処理（８，０００ｒｐｍ、５分間）して沈殿させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後に、分光光度計（Ｕ－２８１０　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，　ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、波長６５０ｎｍで濁度（ＯＤ）を測定した。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｔｓ）タブレット（ＴａＫａＲａ社）を蒸留水に溶解して調製した。その後に、ＰＢＳを用いて、各菌がＯＤ＝５となるように調整し、生菌懸濁液を調製した。
　ヒト結腸癌由来細胞であるＣａｃｏ－２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社）を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンとなるように配合した、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ－ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、　Ｄ６５４６，　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、３７℃、５％のＣＯ２の環境下（ＮＡＰＣＯ Ｓｅｒｉｅｓ ５４００ ＣＯ２ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，　Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて培養した。
　生菌懸濁液を投与する前日に、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、Ｃａｃｏ－２細胞を６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ社）に継代した。
（２）ＨＳＰ遺伝子の発現誘導試験
　生菌懸濁液を２０μｌ／ｗｅｌｌで、前記の継代後のＣａｃｏ－２細胞を含む６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃、５％のＣＯ２の環境下にて２４時間で共培養した。この共培養を終了した直後に、これら培養液（培地）を吸引除去し、そこに、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ （Ａｍｂｉｏｎ社）を添加し、細胞を浸漬した。これら細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ）により、ＲＮＡを抽出してから、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ，　ＴａＫａＲａ社）を用いて、逆転写反応を行った。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ，　ＴａＫａＲａ社）を用いて、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ－８００（ＴａＫａＲａ）により、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃａｃｏ－２細胞のＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現解析を行った。
　リアルタイムＰＣＲで用いたプライマーと反応液の組成をそれぞれ表１と表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　リアルタイムＰＣＲの反応条件は、（９５℃、３０秒間）　→　（９５℃、５秒間　→
　６０℃、３０秒間）×４０サイクル　→　９５℃、１５秒間　→　６０℃、３０秒間　→　９５℃、１５秒間　→　４℃とした。
　対照群として、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与し、共培養したものを用いた。
　結果を図１に示す。
　図１に示されるように、対照群と比較して、ラクトバチルス ジョンソニの生菌の投与群では、ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現上昇が見られた。
例２：インビボ試験
　ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株をマウスに投与し、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、分子量：　３６，０００～５０，０００Ｄａ、ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で誘発される大腸炎への抑制効果を、動物実験により検討した。
　生菌懸濁液では、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の １×１０８ｃｆｕを、ＰＢＳの ２００μｌに懸濁して調製した。そして、この生菌懸濁液を、ゾンデにより毎日で強制経口投与した。なお、ＤＳＳ水を自由飲水とした。
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、オス、チャールスリバー社）を用いて、各群を１０匹ずつとした。ＤＳＳ水（２．０ｗ／ｖ％）の投与の１週間前から、生菌懸濁液をマウスに毎日で投与した。ＤＳＳ水の投与の初日を１日目として１週間で（ＤＳＳ水の投与後の７日目まで）、ＤＳＳ水と生菌懸濁液の混合物を毎日で投与した。
　対照群として、ＤＳＳ水の代わりに、蒸留水を投与したものと、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与したもの、ＤＳＳと生菌懸濁液の代わりに、蒸留水とＰＢＳを投与したものを用いた（図２参照）。
　ＤＳＳの投与期間中には、マウスの体重の測定値と炎症スコアを毎日で記録した。
　炎症スコアでは、下痢と血便のスコアを付けて、表３に従って、スコアを０から３までで評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＤＳＳの投与期間の終了後（８日目）に、マウスを解剖し、大腸を採取して、それらの長さと重量を測定した。解剖時の炎症スコアとして、下痢と血便のスコアの合計を平均したものについて、ＤＳＳの投与群間で比較した。
　マウスの体重、大腸の長さ・大腸の単位長さ当たりの重量では、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔで群間を比較した。炎症スコアでは、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔで群間を比較した。統計処理の結果、ｐ＜０．０５のときに、有意であると判断した。グラフでは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。
　それぞれの結果を図３～５に示す。
　図３に示されるように、ＤＳＳで誘発される大腸炎により、マウスの体重が減少するが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与により、マウスの体重の減少が抑制されることを確認できた。なお、Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、　Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、　Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。
　図４に示されるように、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、炎症スコアが有意に減少していた。
　図５に示されるように、ＤＳＳの投与群では、大腸の長さが短縮されていた。また、蒸留水＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群では、単位長さ当たりの重量が有意に増加したが、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、有意差が見られなかった。
　結論として、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の生菌を投与することで、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制されることを確認できた。
　ここにはデータを示さないが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の代わりに、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を用いた場合にも、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株と同様にして、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制される傾向があることを確認した。

Claims (12)

  1. 　大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制剤。
  2. 　ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニである、請求項１に記載の大腸炎抑制剤。
  3. 　ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株から選択されるものである、請求項１または２に記載の大腸炎抑制剤。
  4. 　ラクトバチルス属乳酸菌が、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞のそれと比較して１．５倍以上に増加させることができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の大腸炎抑制剤。
  5. 　大腸炎が炎症性腸疾患である、請求項１～４のいずれか一項に記載の大腸炎抑制剤。
  6. 　炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項５に記載の大腸炎抑制剤。
  7. 　便性を改善するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の大腸炎抑制剤。
  8. 　大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法。
  9. 　大腸炎抑制剤の製造における、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
  10. 　大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
  11. 　大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌。
  12. 　大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法。
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