WO2016088380A1 - ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン - Google Patents

ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン Download PDF

Info

Publication number
WO2016088380A1
WO2016088380A1 PCT/JP2015/006009 JP2015006009W WO2016088380A1 WO 2016088380 A1 WO2016088380 A1 WO 2016088380A1 JP 2015006009 W JP2015006009 W JP 2015006009W WO 2016088380 A1 WO2016088380 A1 WO 2016088380A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mumps virus
mir449
virus
sequence
rodate
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/006009
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
木所　稔
大志 加藤
Original Assignee
公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 filed Critical 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団
Priority to JP2016562313A priority Critical patent/JP6620294B2/ja
Publication of WO2016088380A1 publication Critical patent/WO2016088380A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/165—Mumps or measles virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units

Definitions

  • the present invention relates to a method for attenuating mumps virus, a mumps virus attenuated using the method, and a novel mumps vaccine that does not cause aseptic meningitis and retains immunogenicity.
  • mumps Epidemic parotitis
  • MoV mumps virus
  • It is classified into the Paramyxoviridae rubravirus genus, and it is an infectious disease mainly caused by diffuse swelling / pain and fever of the parotid gland. It is.
  • the prognosis is generally good, but sometimes causes complications such as aseptic meningitis, encephalitis, hearing loss, pancreatitis, or testitis.
  • mumps hearing loss has been attracting attention due to its poor prognosis and unexpectedly high frequency of occurrence.
  • There is no cure for mumps and the only measure is prevention with live vaccines using attenuated viruses with reduced pathogenicity.
  • Mumps live vaccine began in 1966 with the development of the Leningrad-3 (L-3) strain in the USSR, and more than 10 types of attenuated strains (Hoshino, Torii, L- Live vaccines using 3 derivative strains such as L-Zagreb) have been developed in several countries including Japan.
  • L-3 strain Leningrad-3
  • Hoshino, Torii L- Live vaccines using 3 derivative strains such as L-Zagreb
  • the current mumps vaccine still has some problems due to the characteristics of MuV.
  • One is severe aseptic meningitis that occurs as a side reaction after vaccination.
  • Sofia-6 strain developed in Bulgaria has withdrawn from the market due to aseptic meningitis.
  • MuV has a problem of over-attenuation that easily loses its immunity by subculture. It is thought that the mechanism of overattenuation is that sufficient immunity induction cannot be performed due to a decrease in the ability of the vaccine virus to proliferate in the human body.
  • the Rubini and BBM-18 strains developed in Switzerland and the Towata strain first developed in Japan were not put into practical use due to over-attenuation.
  • the incidence of aseptic meningitis is very low, and the JL strain, which is the most widely used in the world, has a large number of mumps in countries where the rate of two vaccinations is maintained at 90% or higher. There are frequent epidemics and there are doubts about its immunogenicity (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • the present invention has been made in view of such problems, and reliably produces a live mumps vaccine with reduced central neuropathogenicity while maintaining efficacy (virus growth ability) without accidental reliance. It is an object of the present invention to provide a mumps virus and a live vaccine that are both attenuated and effective and safe.
  • the method for attenuating mumps virus according to the present invention is characterized in that a sequence complementary to miRNA highly expressed in the choroid plexus is incorporated into mumps virus.
  • the attenuated mumps virus according to the present invention is attenuated by incorporating a sequence complementary to miRNA highly expressed in the choroid plexus.
  • the live vaccine according to the present invention is a product obtained by freeze-drying the attenuated mumps virus described above.
  • a live vaccine is obtained.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the flow of preparation of plasmid pMuV-Odate.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the flow of preparation of plasmid pMuV-Odate / miR449. It is a figure explaining the outline of a recombinant mumps virus collection method. It is a figure which shows the growth curve in a Vero cell. It is a figure which shows the proliferation ability in a rat brain, (A) is the amount of viral genomic RNA in a rat brain, (B) is the infectious virus titer in a rat brain.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the evaluation of the neuropathogenicity which used the ventricular dilation of the rat as a parameter
  • the method for attenuating a mumps virus incorporates a sequence complementary to miRNA highly expressed in the choroid plexus into the mumps virus.
  • MuV mumps virus
  • the present inventor has found that the main target tissue in the central nervous system of MuV is not a nerve cell but a choroid plexiform cell existing on the surface of the ventricle. I found out.
  • miRNAs are small RNAs that are expressed in cells. By binding to specific messenger RNAs (mRNAs), miRNAs are inhibited from translating into proteins, thereby controlling the functional expression of cells such as differentiation and cell division. Is involved. There are more than 1000 miRNA coding regions on the human genome, and the presence of miRNAs that are expressed specifically in tissues is also known.
  • the virus protein synthesis in the choroid plexus can be inhibited and the virus growth in the choroid plexus can be suppressed.
  • the virus can be expected not to cause aseptic meningitis.
  • high immune induction can be expected.
  • the miRNA highly expressed in the choroid plexus is not particularly limited, but is, for example, miR449, miR204 or miR224.
  • the sequence complementary to miR204 is AGGCATAGGATGACAAAGGGAA for miR-204-5p and ACGTCCCTTTGCCTTCCCAGC for miR-204-3p.
  • AGGCATAGGATGACAAAGGGAA a sequence complementary to miR204, or a sequence connecting at least two AGGCATAGGATGACAAAGGGAA into MuV.
  • ACGTCCCTTTGCCTTCCCAGC which is a sequence complementary to miR204, or a sequence connecting at least two of this ACGTCCCTTTGCCTTCCCAGC into MuV.
  • the sequence complementary to miR224 is AACGGAACCACTAGTGACTTG for miR-224-5p and TGTAGTCACTAGGGCACCATTTT for miR-224-3p. It is possible to obtain an attenuated virus strain by incorporating AACGGAACCACTAGTGACTTG, a sequence complementary to miR224, or a sequence connecting at least two AACGGAACCACTAGTGACTTGs into MuV. In addition, an attenuated virus strain can be obtained by incorporating TGTAGTCACTAGGGCACCATTTT, which is a sequence complementary to miR224, or a sequence connecting at least two of these TGTAGTCACTAGGGCACCATTTTs into MuV.
  • ACCAGCTAACAATACACTGCCA which is a sequence complementary to miR449, or a sequence in which at least two ACCAGCTAACAATACACTGCCA are linked is incorporated into MuV to obtain an attenuated virus strain.
  • an attenuated virus strain by incorporating into MuV a sequence that is a combination of at least two of the sequence complementary to miR449, the sequence complementary to miR204, and the sequence complementary to miR224. It is. Further, it is defined that the sequence incorporated into the mumps virus includes a sequence in which a part of the sequence is deleted, substituted or added.
  • the mumps virus is not particularly limited, but is, for example, a field isolate including an Odate strain or an existing vaccine strain.
  • Field isolates include for example 02-49 strains.
  • Existing vaccine strains include, for example, Jery-Lynn, RIT-4385, Rubini, Urabe-AM9, Torii, Hoshino-L32, Miyahara, NK M-46, Leningrad-3, L-Zagreb, Sofia-6, S-12 , BBM-18 etc. are included.
  • the genome of the mumps virus included in the genus Rubravirus in the Paramyxoviridae family is composed of seven genes: NP, V / P, M, F, SH, HN, and L, but incorporates a miRNA complementary sequence.
  • the gene is not particularly limited and can be inserted at any site.
  • a sequence complementary to miR449 is inserted at the end of the L gene. More preferably, a sequence in which three sequences complementary to miR449 are linked to the end of the L gene of the highly pathogenic strain Odate-3 is inserted by the RG method. It has been reported that miR449 is involved in choroid plexus differentiation and functional expression, as well as cell division and cilia formation in ciliated epithelial cells.
  • the concept of the present invention can be applied as a method for attenuating Paramyxoviridae viruses, and a sequence complementary to miRNA highly expressed in the choroid plexus is incorporated into Paramyxoviridae viruses.
  • Paramyxoviridae viruses include the respirovirus genus and the morbillivirus genus in addition to the above-mentioned rubraviruses.
  • the genome of the genus Respirovirus is composed of N, P / C / V, M, F, HN, and L genes, but the gene incorporating the miRNA complementary sequence is not particularly limited, It can be inserted at any site.
  • a sequence complementary to miR449 is inserted at the end of the L gene.
  • Morbillivirus is composed of N, P / C / V, M, F, H, and L genes, but the gene incorporating the miRNA complementary sequence is not particularly limited, It can be inserted at any site.
  • a sequence complementary to miR449 is inserted at the end of the L gene.
  • the live vaccine according to this embodiment is a freeze-dried vaccine preparation containing an attenuated virus strain, which is dissolved at the time of use and administered by injection.
  • a live vaccine As a method for producing a live vaccine, methods commonly used by those skilled in the art can be appropriately employed. For example, excipients, pH regulators, stabilizers, solubilizers, soothing agents, etc. 1 type (s) or 2 or more types can be used. It is preferable to fill the lyophilized virus in one vial so that the infectious titer upon dissolution is 10,000 CCID 50 / ml or more.
  • the method of using the vaccine of the present invention is not particularly limited, and the dose and method of administration can be appropriately selected according to the purpose of use of the vaccine and the age, weight, etc. of the patient.
  • About 0.5 ml of the vaccine solution prepared by adding and dissolving can be injected subcutaneously into the extensor arm.
  • CDNA was synthesized from RNA extracted from the brain emulsion of MuV Odate strain-infected marmoset using random hexamers and PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit (TaKaRa).
  • primers rOdate-Not-F1 (5'-taa tac gac tca cta taacca agg ggaaaa tgg agat-3 '), rOdate-Not-F (5'-gaa gcg gtggcg gcc gctaat acg act cac tat a- 3 ') and rOdate-Nru-R (5'-ttg ggacag gcc tcg cga gtt cat ccaaat-3') to create a fragment (1-2955 region) (fragment 1) with the T7 promoter added to the 5 'end Then, it was cloned into pMuV-Y213 treated with NotI and NruI using In Fusion (registered trademark, Clontech) (pMuV-Odate-1).
  • primers rOdate-Ngo-F (5'-ccg ttg cac tat gcc ggc gat ccaacc tcc-3 ') and rOdate-Xho-R (5'-tct tgt cct gctcga gat ctg gta aac aa-3') (6258-8898 region) (fragment 3) was amplified and cloned into NgoMIV and XhoI treated pMuV-Odate-1 / 2 using In Fusion (pMuV-Odate-1 / 3).
  • ROdate-Spe-F (5'-aag cac gaa aac tag tgtcga gta cat tat-3 '), rOdate-LR (5'-ttg tta gct ggt gcttaa att atgtcc ccg-3'), miR449-F ( 5'-cgg ggacat aat tta agc acc agctaa caa-3 '), miR449-R (5'-gtc tttagc tga tttaat ggc agtgta ttg-3'), rOdate-UTR-F (5'-caa tac act gcc att aaa tcagct aa ga-3 ′) and rOdate-Rsr-R2 (5′-atg ccc agg tcg gac cgcgag gag gtg gag
  • the DNA solution was added and cultured at 37 ° C. After 48 hours, the cells were detached by trypsin treatment and further cultured in a 10 cm dish with the same number of Vero cells (FIG. 3).
  • the culture supernatant was collected, cell debris was removed by low speed centrifugation, and stored at ⁇ 80 ° C. to obtain a stock virus.
  • the recovered viruses were designated as rOdate and rOdate / miR449, respectively.
  • the insertion sequence of rOdate / miR449 was confirmed by sequencing.
  • Example 5 Evaluation of proliferative ability and neuropathogenicity in newborn rat brain
  • 10 ⁇ l (10 2 PFU / head) of the virus prepared at 10 4 PFU / ml was inoculated into the brain of newborn Lewis rats within 24 hours after birth. Inoculation was performed between the coronary suture and the lambda suture using a dedicated two-stage microsyringe at a site 2 mm to the left of the sagittal suture.
  • 2 stomachs about 10 pups per stomach
  • RNA extraction was performed using RNeasy Mini Kit, and reverse transcription reaction was performed using PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa).
  • a genomic RNA-specific primer (MuV-1s; 5′-acc aag ggg aaaatg aag atgg-3 ′) was used.
  • primers targeted to the N gene region (MuNP1398s; 5'-ttc ctc cag ttc aac agc aa-3 'and MuNP1474as; 5'-acc gtc gtc atctga ttc ct-3') and Universal Probe Using library # 62 (Roche), real-time RCR quantified the viral genomic RNA in the brain.
  • LightCycler 480 Probes Master reagent (Roche) and LightCycler 480 system (Roche) were used.
  • the average amount of viral genome in the rat brain inoculated with rOdate was 1.05 x 10 5 copies / mg, whereas the amount of viral genome in the rat brain inoculated with rOdate / miR449 was the limit of detection in all three animals. It was as follows (FIG. 5A).
  • infectious virus titer in the brain was measured. MEM medium was added to the frozen brain powder to prepare a 10% emulsion, and the virus titer was measured.
  • infectious virus titer in the brain of rOdate inoculated rats averaged 6.57 x 10 6 PFU / g
  • rOdate / miR449 inoculated group detected only 1.11 x 10 2 PFU / g virus.
  • the remaining two were below the detection limit (FIG. 5B).
  • the remaining inoculated rats were observed for ventricular dilatation using MRI about 1 month after virus inoculation.
  • MRI imaging was performed using MRmini SA (DS Pharma Biomedical) under deep anesthesia with isoflurane.
  • the evaluation of neuropathogenicity was calculated from the obtained sagittal images using ImageJsoftware (National Institutes of Health, USA) as the neurovirulence test (NVT) score for the ratio of ventricular expansion area to the total area of the cerebrum .
  • NVT neurovirulence test
  • Fig. 6A, 6B The difference in NVT score between the two groups was statistically significant (p ⁇ 0.0001) (FIG. 6B).
  • the Odate-3 strain is a highly pathogenic strain that was isolated during an outbreak in Odate City in 1993.
  • the Odate-3 strain has a very high incidence of aseptic meningitis at that time of over 70%, and is a strain that is guaranteed to be pathogenic in humans.
  • model animals newborn rats and marmosets
  • FIG. 5 and FIG. 6 described above since an attenuated strain can be produced with the Odate-3 strain according to the present invention, it is naturally possible to attenuate other mumps virus strains.
  • Example 6 Evaluation of immunogenicity against cynomolgus monkeys. Cynomolgus monkeys ( ⁇ , about 10 years old) Three mice in each group were inoculated subcutaneously with 10 5 PFU / head each of Jeryl-Lynn (JL) strain and rOdate / miR449 strain.
  • Plasma diluted 30 minutes at 56 ° C is serially diluted from 4 -1 to 4 -5 times, and half amount of mumps virus for attack (field isolate Y01, genotype G) and half amount 100 times diluted guinea pig Complement (DENKA SEIKEN) was added and mixed well. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, Vero cells cultured on a 12-well plate were inoculated and adsorbed at 37 ° C. for 1 hour.
  • eagle medium containing 0.5% agarose was overlaid and cultured for 4 days. Viable cells were stained with neutral red, and the number of plaques was counted. The dilution factor of plasma that reduced the number of plaques by 50% was calculated as the neutralizing antibody titer.
  • Example 5 For each organ collected, 10% emulsion was prepared using Eagle MEM, and the amount of viral RNA was measured according to the method of Example 5 (FIGS. 9 (a) and 9 (b)).
  • virus sputum RNA was detected in the central nervous system tissue from 2 out of 5 rOdate inoculated groups. In one of them (individual # 5235), viral RNA was detected in all central nervous system tissues collected, and in the other (individual # 5230), viral RNA was detected from the bridge.
  • FIG. 9 (b) no viral RNA was detected in the central nervous system tissue from any individual in the rOdate / miR449 inoculated group.
  • gland tissue which is another target tissue of mumps virus
  • FIG. 9 (a) in the rOdate inoculated group, two virus RNAs were detected from the parotid gland and three from the pancreas.
  • FIG. 9 (b) in the rOdate / miR449 inoculated group, only one virus RNA was detected from the pancreas.
  • SEQ ID Nos: 1 to 5 miRNA SEQ ID Nos: 6-26: Primers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

　継代培養による不確実な作出ではなく、miRNA相補配列の導入による確実な手法により、有効性を維持しつつ、中枢神経病原性が軽減されたムンプス生ワクチンを提供する。MuVの中枢神経系における主たる標的組織が神経細胞では無く、脳室内部の表面に存在する脈絡叢上衣細胞であることをつきとめた。脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込むことによりムンプスウイルスを弱毒化する。具体的には、脈絡叢で特異的に発現しているmiR449というmiRNAに着目し、miR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又はACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする。

Description

ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン
　本発明は、ムンプスウイルスの弱毒化方法、その方法を使用して弱毒化したムンプスウイルス、及び、無菌性髄膜炎を起こさず且つ免疫原性を保持した新規のムンプスワクチンに関する。
　流行性耳下腺炎（ムンプス、おたふくかぜ）はパラミクソウイルス科ルブラウイルス属に分類されるムンプスウイルス(MuV)によって引き起こされ、耳下腺のびまん性腫脹・疼痛、発熱を主症状とする感染症である。予後は一般に良好であるが、時に無菌性髄膜炎、脳炎、難聴、膵炎、精巣炎等の合併症を引き起こす。特にムンプス難聴は予後が悪く、発生頻度が予想外に高いことで注目されている。おたふくかぜに対する治療法は無く、病原性を減弱させた弱毒ウイルスを用いた生ワクチンによる予防が唯一の対策である。
　ムンプス生ワクチンは1966年のソ連におけるLeningrad-3 (L-3)株の開発に始まり、米国におけるJeryl Lynn (JL)株の開発等、10種類以上の弱毒株（星野株、鳥居株、L-3株の派生株であるL-Zagreb株等）を用いた生ワクチンが日本を含むいくつかの国で開発されている。しかしながら現行のムンプスワクチンには、MuVの特性に起因するいくつかの課題が残されている。その1つは、ワクチン接種後に副反応として発生する、重篤な無菌性髄膜炎である。例えば、ブルガリアで開発されたSofia-6株は無菌性髄膜炎が原因で、市場から撤退している。また、国産の占部株（阪大微研）では、この株を含むMMRワクチン（麻疹おたふくかぜ風疹3種混合ワクチン）導入後、占部株による無菌性髄膜炎が多発し、MMRワクチンが中止される事態に至っている。これ以降、日本国内のワクチン接種率は低迷し、おたふくかぜの流行はいまだに制御できていない。こうした国内の状況を受けて、無菌性髄膜炎を起こさない安全性の高いムンプスワクチンの提供が強く求められている（非特許文献１）。
　一方で、MuVには継代培養によって容易にその免疫性を失う過弱毒化という問題が存在する。過弱毒化のメカニズムは、人体内におけるワクチンウイルスの増殖能の低下によって十分な免疫誘導ができなくなることにあると考えられる。例えばスイスで開発されたRubini株やBBM-18株、国内で最初に開発されたTowata株は過弱毒化が原因で実用化に至らなかった。また、無菌性髄膜炎の発生頻度が非常に低く、世界中で最も広く使用されているJL株においても、2回のワクチン接種率が90％以上に維持されている国々で、おたふくかぜの大規模流行が頻発しており、その免疫原性に疑義が生じている（非特許文献２）。
　加えて、JL株の場合には流行株との抗原性の齟齬という固有の問題点もある。MuVの系統学的分類では、JL株やRubini株は遺伝子型Aに分類される。そしてこの遺伝子型はこれまでに検出されている他の遺伝子型から唯一、系統学的に大きく乖離していることが知られている。従って、ワクチン株と異なる遺伝子型の流行が起こった場合、遺伝子型Aのワクチン株では交差免疫が機能しにくく、相対的に防御効果が低下することが想定される。従って、ワクチン株には遺伝子型A以外のウイルスを用いることが望ましい。
　従来、生ワクチンに用いられる弱毒株は培養細胞又はニワトリ胚中で野外株の継代培養を繰り返し、偶然に出現した弱毒株をワクチンとしてきた。しかし、前述したように従来の作出方法では有効性と安全性を両立させたワクチンウイルスを得ることはきわめて難しい（非特許文献３）。
庵原俊昭, 臨床とウイルス 38: 386-392, 2010 Plotkin SA, Pediatr Infect Dis J 32: 381-382, 2013 小児感染免疫 vol.21 No.3 263-273, 2009
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、偶然に頼ることなく、有効性（ウイルスの増殖能）を維持しつつ、中枢神経病原性が軽減されたムンプス生ワクチンを確実に作出するための弱毒化方法と、それによって作出された有効性と安全性を両立したムンプスウイルス及び生ワクチンを提供することを目的とする。
　本発明にかかるムンプスウイルスの弱毒化方法は、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする。
　また本発明にかかる弱毒化されたムンプスウイルスは、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列が組み込まれて弱毒化されたものである。
　また本発明にかかる生ワクチンは、前述の弱毒化されたムンプスウイルスが凍結乾燥されたものである。
　本発明によれば、継代培養による不確実な作出ではなく、miRNA相補配列の導入による確実な手法により、有効性（ウイルスの増殖能）を維持しつつ、中枢神経病原性が軽減されたムンプス生ワクチンが得られる。
プラスミドpMuV-Odate作製の流れを説明する図である。 プラスミドpMuV-Odate/miR449作製の流れを説明する図である。 組換えムンプスウイルス回収法の概略を説明する図である。 Vero細胞における増殖曲線を示す図である。 ラット脳内における増殖能を示す図であり、そのうち(A)はラット脳内のウイルスゲノムRNA量であり、(B)はラット脳内の感染性ウイルス力価である。 ラットの脳室拡張を指標とした神経病原性の評価を示す図であり、そのうち(A)はMRI画像であり、(B)はNVTスコアである。 カニクイザルに、Jeryl-Lynn(JL)株及びrOdate/miR449株をそれぞれ皮下接種した場合における免疫原性の評価を示す図である。 マーモセットに、rOdate株及びrOdate/miR449株をそれぞれ静脈内接種した場合における免疫原性の評価を示す図である。 マーモセットに、rOdate株及びrOdate/miR449株をそれぞれ静脈内接種した場合における病原性の評価を示す図であり、そのうち(a)はrOdate株の評価であり、(b)はrOdate/miR449株の評価である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本発明にかかるムンプスウイルス(以下「MuV」とする。)の弱毒化方法は、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込む。本発明者は、マーモセットやラットの感染動物モデルによるMuVの病原性発現機構の解析を通して、MuVの中枢神経系における主たる標的組織が神経細胞では無く、脳室内部の表面に存在する脈絡叢上衣細胞であることをつきとめた。そこで、脈絡叢でのみ選択的に増殖できないウイルスを作成できれば、ウイルスのヒト体内での増殖能を大きく損なうことなく、無菌性髄膜炎を起こさない、つまりワクチンとしての有効性を損なうことなく、安全性の高いワクチン株を作出できると考えた。
　一方で本発明者は、MuVの遺伝子組換え技術であるリバースジェネティクス(RG)法を独自に確立しており、脈絡叢で特異的に発現されるマイクロRNA(miRNA)に着目した。miRNAは細胞内で発現される低分子RNAで、特定のメッセンジャーRNA(mRNA)に結合することにより、mRNAの蛋白質への翻訳を抑制することにより、分化や細胞分裂等の細胞の機能発現の制御に関わっている。ヒトのゲノム上には1000種類以上のmiRNAコード領域が存在し、組織特異的に発現するmiRNAの存在も知られている。脈絡叢で特異的に発現されているmiRNAに相補的な配列をMuVの遺伝子内に組み込むことによって、脈絡叢でのウイルス蛋白質の合成を阻害し、脈絡叢内でのウイルス増殖を抑制できれば、結果的にそのウイルスは無菌性髄膜炎を起こさなくなることが期待でき、一方で、脈絡叢以外の組織におけるウイルスの増殖は抑制されないため、高い免疫誘導が期待できる。
　脈絡叢で高発現するmiRNAは、特に限定されるものではないが、例えばmiR449、miR204又はmiR224である。
　miR204に相補的な配列は、miR-204-5pではAGGCATAGGATGACAAAGGGAAであり、miR-204-3pではACGTCCCTTTGCCTTCCCAGCである。miR204に相補的な配列であるAGGCATAGGATGACAAAGGGAA又はこのAGGCATAGGATGACAAAGGGAAを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。また、miR204に相補的な配列であるACGTCCCTTTGCCTTCCCAGC又はこのACGTCCCTTTGCCTTCCCAGCを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。
　miR224に相補的な配列は、miR-224-5pではAACGGAACCACTAGTGACTTGであり、miR-224-3pではTGTAGTCACTAGGGCACCATTTTである。miR224に相補的な配列であるAACGGAACCACTAGTGACTTG又はこのAACGGAACCACTAGTGACTTGを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。また、miR224に相補的な配列であるTGTAGTCACTAGGGCACCATTTT又はこのTGTAGTCACTAGGGCACCATTTTを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。
　好ましくはmiR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又はこのACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とする。
　なお、miR449に相補的な配列、miR204に相補的な配列、及び、miR224に相補的な配列の中から少なくとも２つを組み合わせて繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることも可能である。また、ムンプスウイルスに組み込まれる配列には、その配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列も含まれるものと規定する。
　ムンプスウイルスは、特に限定されるものではないが、例えばOdate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株である。野外分離株には例えば02-49株も含まれる。既存のワクチン株には、例えばJery-Lynn、RIT-4385、Rubini、Urabe-AM9、Torii、Hoshino-L32、Miyahara、NK M-46、Leningrad-3、L-Zagreb、Sofia-6、S-12、BBM-18等が含まれる。
　パラミクソウイルス科のウイルスのうちルブラウイルス属に含まれるムンプスウイルスのゲノムは、NP、V/P、Ｍ、Ｆ、SH、HN、Ｌの７つの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。より好ましくは、RG法により、高病原性株Odate-3のL遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列を３つ繋いだ配列を挿入する。miR449は脈絡叢の分化や機能発現に関与しているほか、細胞分裂や繊毛上皮細胞の繊毛形成にも関与することが報告されている。
　なお、本発明の概念はパラミクソウイルス科ウイルスの弱毒化方法として応用可能であり、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をパラミクソウイルス科ウイルスに組み込む。パラミクソウイルス科ウイルスは上記のルブラウイルス属以外にレスピロウイルス属、モルビリウイルス属が含まれる。レスピロウイルス属のウイルスのゲノムは、Ｎ、P/C/V、Ｍ、Ｆ、HN、Ｌの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。モルビリウイルス属のウイルスのゲノムは、N、P/C/V、Ｍ、Ｆ、Ｈ、Ｌの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。
　本実施形態にかかる生ワクチンは、弱毒ウイルス株を含む凍結乾燥状態のワクチン製剤であり、使用時に溶解して注射により投与される。
　生ワクチンの製造方法については当業者に汎用される方法を適宜採用することができ、例えば、賦形剤、pH調節剤、安定化剤、溶解補助剤、無痛化剤等の製剤用添加物を１種又は２種以上使用することができる。１バイアル中に溶解時感染価が10,000 CCID50/ml以上となるように凍結乾燥ウイルスを充填することが好ましい。
　本発明のワクチンの使用方法は特に限定されるものではなく、投与量及び投与方法はワクチンの使用目的や患者の年齢、体重等に応じて適宜選択できるが、例えば用時に注射用蒸留水等を添加し、溶解して調製したワクチン溶液を0.5ml程度上腕伸側に皮下注射することが可能である。
　次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
　[実施例１　MuV Odate株の全ゲノムcDNAのクローニング]
　MuV Odate株感染マーモセットの脳乳剤より抽出したRNAよりランダムヘキサマーとPrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit (TaKaRa社)を用いてcDNAを合成した。このcDNAより、まずプライマーrOdate-Not-F1 (5’-taa tac gac tca cta taacca agg ggaaaa tgg agat-3’)、rOdate-Not-F (5’-gaa gcg gtggcg gcc gctaat acg act cac tat a-3’)及びrOdate-Nru-R (5’-ttg ggacag gcc tcg cga gtt cat ccaaat-3’)を用いて5’末端にT7 プロモーターを付加したフラグメント(1-2955領域)(フラグメント1)を作製し、NotI及びNruI処理したpMuV-Y213にIn Fusion(登録商標,Clontech社)を用いてクローニングした(pMuV-Odate-1)。
　次にプライマーrOdate-Nru-F (5’-att tgg atg aac tcgcga ggc ctgtcc cca-3’)及びrOdate-Ngo-R (5’-gga ggt tgg atcgcc ggc atagtg cta cggcag gg-3’)を用いて(2926-6287領域)(フラグメント2)を増幅し、NruI及びNgoMIV処理したpMuV-Odate-1にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/2)。続いて、プライマーrOdate-Ngo-F (5’-ccg ttg cac tat gcc ggc gat ccaacc tcc-3’)及びrOdate-Xho-R(5’-tct tgt cct gctcga gat ctg gta aac aaa-3’)を用いて(6258-8898領域)(フラグメント3)を増幅し、NgoMIV及びXhoI処理したpMuV-Odate-1/2にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/3)。 同様に、プライマーrOdate-Xho-F (5’-ttt acc aga tctcga gca ggacaa gac gca-3’)及びrOdate-Dra-R (5’-tta gaa ctc tat cac tga gtgtga gtt ggc-3’)を用いて(8872-13277領域) (フラグメント4)を増幅し、XhoI及びDraIII処理したpMuV-Odate-1/3にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/4)。最後にプライマーrOdate-Dra-F (5’-aaa gcc aac tca cactca gtg atagag ttc-3’)、rOdate-Rsr-R1 (5’-agg tggaga tgc cat gcc gac ccacca agg ggagaa agt aaaa-3’)及びrOdate-Rsr-R (5’-atg ccc aggtcg gac cgcgag gag gtg gag atg cca t-3’)を用いて3’末端にT7転写終止シグナル配列及びD型肝炎ウイルスのリボザイム配列を付加したフラグメント5(13245-15384領域)を作製し、DraIII及びRsrII処理したpMuV-Odate-1/4にIn Fusionを用いてクローニングし、Odate株の全ゲノムcDNAを保持するプラスミドDNAを作製した(pMuV-Odate)。(図1)
　[実施例２　pMuV-OdateへのmiR449相補配列の挿入]
　PCRによってL遺伝子の3’UTR領域に、脈絡叢で特異的に発現するmiRNAであるmiR449に相補的な配列を3つつないだフラグメントを作製した(図2)。プライマーにはrOdate-Spe-F(5’-aag cac gaa aac tag tgtcga gta cat tat-3’), rOdate-L-R(5’-ttg tta gct ggt gcttaa att atgtcc ccg-3’), miR449-F(5’-cgg ggacat aat tta agc acc agctaa caa-3’), miR449-R(5’-gtc tttagc tga tttaat ggc agtgta ttg-3’), rOdate-UTR-F(5’-caa tac act gcc att aaa tcagct aaa ga-3’)及びrOdate-Rsr-R2(5’-atg ccc agg tcg gac cgcgag gag gtg gag-3’)を用いた。このフラグメントを制限酵素SpeI及びRsrIIで処理したpMuV-Odateに、In Fusionを用いて導入した(pMuV-Odate/miR449)。挿入配列はシークエンスによって確認した。
　[実施例３　組換えムンプスウイルスの回収]
　pMuV-OdateまたはpMuV-Odate/miR449 5 μg、pCR2.1-N 300 ng、pCR2.1-P 50 ng及びpCR2.1-L 200 ngをTrasIT LT1 (Mirus社) 16 μlと共に625 μlのOpti-MEM (Gibco社)に混合し、20分室温で静置した。6 well plateに80%コンフルエントに培養されたT7ポリメラーゼを恒常的に発現するBHK細胞(BHK/T7-9細胞)(岐阜大学・伊藤直人先生より分与)の培地を抗生物質を含まない培地に交換し、DNA溶液を加え、37℃で培養した。48時間後に、細胞をトリプシン処理で剥がし、同じ細胞数のVero細胞と共に10 cmディッシュでさらに培養を続けた(図3)。多核巨細胞を特徴とするCPEがディッシュ全体に観察されたら、培養上清を回収し、低速遠心で細胞片を除去した後、-80℃で保存しストックウイルスとした。回収されたウイルスをそれぞれrOdate及びrOdate/miR449とした。rOdate/miR449の挿入配列をシークエンスによって確認した。
　[実施例４　培養細胞における増殖能の評価]
　24 well plateに培養されたVero細胞にMOI=0.01でrOdateまたはrOdate/miR449を100 μl接種し、37℃で1時間吸着させた。吸着後、細胞をMEMで3回洗った後、37℃で培養した。ウイルス感染後、24、48、72及び96時間後に培養上清を回収し、その感染性ウイルス力価を測定し、それぞれのウイルスのVero細胞における増殖能を評価した。その結果、両ウイルスとも高い増殖能を示し、両者間に明確な増殖能の差は認められなかった(図4)。
　[実施例５　新生ラット脳内における増殖能及び神経病原性の評価]
　生後24時間以内の新生Lewisラットの脳内に104 PFU/mlに調製したウイルスを10 μl(102 PFU/head)接種した。接種は冠状縫合とラムダ縫合の中間で、矢状縫合から左側に2 mm離れた部位に専用の二段針マイクロシリンジを用いて行った。各ウイルス接種群につき、2腹(産仔数は1腹あたり約10匹)ずつ実施した。
　接種3日後に、各群から3匹ずつ脳を採材した。採材した脳は液体窒素下で凍結破砕し粉末にした。凍結脳粉末は一部をリアルタイムRCR 用RNAの抽出に、一部をウイルス力価測定用に供した。RNA抽出はRNeasy Mini Kitを用いて、逆転写反応はPrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)(TaKaRa社)を用いて行った。逆転写プライマーには、ゲノムRNA特異的なプライマー(MuV-1s; 5’-acc aag ggg aaaatg aag atgg-3’)を用いた。得られたcDNAより、N遺伝子領域を標的としたプライマー(MuNP1398s; 5’-ttc ctc cag ttc aac agc aa-3’、及び MuNP1474as; 5’-acc gtc gtc atctga ttc ct-3’)及びUniversal Probe library #62 (Roche社)を用いて、リアルタイムRCRによる脳内のウイルスゲノムRNAの定量を行った。リアルタイムPCRにはLightCycler480 Probes Master試薬(Roche社)及びLightCycler 480 system(Roche社)を用いた。結果、rOdateを接種したラット脳内のウイルスゲノム量の平均が1.05 x 105 copy/mgであったのに対し、rOdate/miR449を接種したラット脳内のウイルスゲノム量は3匹すべてで検出限界以下であった(図5A)。
　さらに脳内における感染性ウイルスの力価を測定した。凍結脳粉末にMEM培地を加え、10%乳剤を作製し、ウイルス力価を測定した。結果、rOdate接種ラットの脳内の感染性ウイルス力価は平均6.57 x 106 PFU/gであったのに対し、rOdate/miR449接種群では1匹のみ1.11 x 102 PFU/gのウイルスが検出されたが、残りの2匹では検出限界以下であった(図5B)。
　残る接種ラットについて、ウイルス接種から約1ヶ月後にMRIを用いて、脳室拡張を観察した。MRI撮像はラットをイソフルランによる深麻酔下で、MRmini SA (DS Pharma Biomedical社)を用いて、実施した。神経病原性の評価は、得られた矢状断画像より、ImageJsoftware(National Institutes of Health, USA)を用いて、大脳全体の面積に占める脳室拡張面積の割合をNeurovirulencetest(NVT)スコアとして算出した。結果、rOdate接種ラットでは重度の脳室拡張（平均NVTスコア：25％）が観察されたのに対し、rOdate/miR449接種ラットでは脳室拡張は非常に軽度であった（平均NVTスコア：2％）(図6A, 6B)。両群のNVTスコアの差は統計学的に有意であった(p<0.0001)(図6B)。
　rOdate/miR449 株のベースとなったOdate-3株は、1993年に大館市で発生したアウトブレイクの際に分離された高病原性株である。Odate-3株は、当時の無菌性髄膜炎発生率が70％以上と極めて高かったことから、ヒトでの病原性が担保されている株である。また、モデル動物（新生ラット及びマーモセット）においても同様に極めて高い病原性を示す。上述の図5及び図6に示されたように、本発明によってOdate-3株で弱毒株の作出が可能なのだから、その他のムンプスウイルス株の弱毒株化は、当然、可能である。
[実施例6　カニクイザルに対する免疫原性の評価]
　カニクイザル(♂、約10歳齢) 各群3頭に、Jeryl-Lynn(JL)株、及びrOdate/miR449 株をそれぞれ105 PFU/頭ずつ皮下接種した。
　接種後0,4,7,10,14,21,28,35日に塩酸ケタミンによる麻酔下で約5 ml採血し、900×g、20分、室温で遠心して血漿を分離した。56℃で30分非働化処理した血漿を4-1から4-5倍まで段階希釈し、半分量の攻撃用ムンプスウイルス液(野外分離株Y01、遺伝子型G)と半分量の100倍希釈モルモット補体(デンカ生研)を加えて、十分に混和した。37℃、2時間インキュベーションした後、12 well plateに培養したVero細胞に接種し、37℃で1時間吸着した。吸着後、0.5%アガロースを含むイーグル培地を重層し、4日間培養した。ニュートラルレッドで生細胞を染色し、プラーク数をカウントした。プラーク数を50%減じる血漿の希釈倍率を中和抗体価として算出した。
　その結果、JL接種群及びrOdate/miR449接種群どちらの群も接種後14日から中和抗体価の上昇が認められ、28日でピークに達した(図7)。ピーク時の平均中和抗体価は、JL群で41.5、rOdate/miR449群で43.73で、rOdate/miR449群が有意に高値であった。
[実施例7　マーモセットにおける免疫原性及び病原性の評価]
　コモンマーモセット(♂、14箇月齢) 5頭にrOdate株、及び4頭にrOdate/miR449 株をそれぞれ106 PFU/頭ずつ静脈内接種した。接種後0,4,7,10,14日目に麻酔下で約1 ml採血した。接種後20日目に塩酸ケタミンによる過麻酔下で全採血を行った後、病理解剖によって、中枢神経系組織、リンパ系組織、耳下腺、膵臓、精巣及びその他主要臓器を採材した。
　末梢血は、2,000×g、10分、4℃で遠心して血漿を分離した後、血漿中の中和抗体価測定を実施例6の方法に準じて行った。結果、rOdate接種群及びrOdate/miR449接種群どちらの群も接種後7日から中和抗体価の上昇が認められ、接種20日後がピークであった(図８)。ピーク時の平均中和抗体価は、rOdate群で44.88、rOdate/miR449群で45.06で、両群で有意な差は認められなかった。
　採材した各種臓器は、イーグルMEMを用いて10%乳剤を調製し、実施例5の方法に準じてウイルスRNA量を測定した(図９(a)(b))。結果、図９(a)に示されるように、rOdate接種群5頭のうち、2頭から中枢神経系組織にウイルス RNAが検出された。その内の1頭(個体#5235)では採材したすべての中枢神経系組織からウイルスRNAが検出され、他の1頭(個体#5230)では橋からウイルスRNAが検出された。一方、図９(b)に示されるように、rOdate/miR449接種群ではいずれの個体からも中枢神経系組織からウイルスRNAは検出されなかった。また、ムンプスウイルスの別の標的組織である腺組織については、図９(a)に示されるように、rOdate接種群では、耳下腺から2頭、膵臓から3頭ウイルスRNAが検出されたのに対し、図９(b)に示されるように、rOdate/miR449接種群では、膵臓から1頭、ウイルスRNAが検出されたのみであった。
　以上の結果から、rOdate/miR449の免疫原性が弱毒化によって減弱していないことが示された。また、rOdate/miR449の中枢神経病原性、及び腺組織に対する病原性が減弱していることが、マーモセットにおいても証明された。
　流行性耳下腺炎の治療に利用できる。
　配列番号１～５：miRNA
　配列番号６～２６：プライマー

Claims (11)

  1. 　脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とするムンプスウイルスの弱毒化方法。
  2. 　前記脈絡叢で高発現するmiRNAは、miR449、miR204又はmiR224であることを特徴とする請求項１に記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
  3. 　前記脈絡叢で高発現するmiRNAはmiR449であり、miR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又は前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする請求項１に記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
  4. 　前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを３つ繋いだ配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする請求項３記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
  5. 　前記ムンプスウイルスは、Odate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
  6. 　脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列が組み込まれて弱毒化されたムンプスウイルス。
  7. 　前記脈絡叢で高発現するmiRNAは、miR449、miR204又はmiR224であることを特徴とする請求項６に記載のムンプスウイルス。
  8. 　前記脈絡叢で高発現するmiRNAはmiR449であり、miR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又は前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列が組み込まれて弱毒化された請求項６に記載のムンプスウイルス。
  9. 　前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを３つ繋いだ配列が組み込まれて弱毒化された請求項８記載のムンプスウイルス。
  10. 　前記ムンプスウイルスは、Odate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株であることを特徴とする請求項６乃至９の何れか１項に記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
  11. 　請求項６乃至１０の何れか１項に記載の弱毒化されたムンプスウイルスが凍結乾燥された生ワクチン。
PCT/JP2015/006009 2014-12-03 2015-12-03 ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン WO2016088380A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016562313A JP6620294B2 (ja) 2014-12-03 2015-12-03 ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014244999 2014-12-03
JP2014-244999 2014-12-03
JP2015-215651 2015-11-02
JP2015215651 2015-11-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016088380A1 true WO2016088380A1 (ja) 2016-06-09

Family

ID=56091342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/006009 WO2016088380A1 (ja) 2014-12-03 2015-12-03 ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6620294B2 (ja)
WO (1) WO2016088380A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019522986A (ja) * 2016-07-08 2019-08-22 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列
JP2020055763A (ja) * 2018-10-01 2020-04-09 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ワクチンウイルス

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009130479A2 (en) * 2008-04-23 2009-10-29 Isis Innovation Limited Virus
WO2012051491A1 (en) * 2010-10-14 2012-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institutes Of Health Compositions and methods for controlling neurotropic viral pathogenesis by micro-rna targeting
JP2012519484A (ja) * 2009-03-06 2012-08-30 マウント・シナイ・スクール・オヴ・メディシン マイクロｒｎａ応答要素を含む弱毒化生インフルエンザウイルスワクチン

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009130479A2 (en) * 2008-04-23 2009-10-29 Isis Innovation Limited Virus
JP2012519484A (ja) * 2009-03-06 2012-08-30 マウント・シナイ・スクール・オヴ・メディシン マイクロｒｎａ応答要素を含む弱毒化生インフルエンザウイルスワクチン
WO2012051491A1 (en) * 2010-10-14 2012-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institutes Of Health Compositions and methods for controlling neurotropic viral pathogenesis by micro-rna targeting

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARNES, DWIGHT ET AL.: "Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines", CELL HOST MICROBE, vol. 4, no. 3, 2008, pages 239 - 248, XP002544788, DOI: doi:10.1016/j.chom.2008.08.003 *
DEO, MONIKA ET AL.: "Detection of mammalian microRNA expression by in situ hybridization with RNA oligonucleotides", DEV. DYN., vol. 235, 2006, pages 2538 - 2548, XP002587629, DOI: doi:10.1002/DVDY.20847 *
NORIYO NAGATA ET AL.: "Dobutsu Model o Mochiita Mumpsvirus no Shinkei Byogensei ni Kansuru Byorigakuteki Kento", DAI 62 KAI THE JAPANESE SOCIETY OF VIROLOGY GAKUJUTSU SHUKAI PROGRAM SHOROKUSHU, vol. 361, 31 October 2014 (2014-10-31), pages 2 - 020 *
REDSHAW, NICHOLAS ET AL.: "microRNA-449 is a putative regulator of choroid plexus development and function", BRAIN RES., vol. 1250, 2009, pages 20 - 26, XP025769106, DOI: doi:10.1016/j.brainres.2008.11.020 *
YLOSMAKI, ERKKO ET AL.: "Attenuation of Semliki Forest virus neurovirulence by microRNA- mediated detargeting", J. VIROL., vol. 87, 2013, pages 335 - 344 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019522986A (ja) * 2016-07-08 2019-08-22 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列
JP7046848B2 (ja) 2016-07-08 2022-04-04 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列
JP2020055763A (ja) * 2018-10-01 2020-04-09 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ワクチンウイルス

Also Published As

Publication number Publication date
JP6620294B2 (ja) 2019-12-18
JPWO2016088380A1 (ja) 2017-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5652830B2 (ja) マイクロｒｎａ制御組換えワクシニアウイルス及びその使用
CN102858959B (zh) 溶瘤弹状病毒
WO2015076422A1 (ja) 分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性組換えワクシニアウイルス（md-rvv)及びその使用
BRPI0710626A2 (pt) ácido nucleico isolado, vetor de expressão, métodos para produzir um rna genÈmico da influenza e um vìrus da influenza recombinante, célula, método para gerar em células caninas cultivadas um vìrus de rna, vìrus da influenza, e, sequência de ácido nucleico isolado
US20110091490A1 (en) Novel vaccine for dog
US20210205436A1 (en) Recombinant mopeia virus and vaccine platform
US8921101B2 (en) Attenuated poliovirus
JP2021508696A (ja) がん処置のためのコドン対脱最適化領域を有する組換え型ウイルス及びその使用法
JP2020513421A (ja) Ｂ型肝炎の予防または治療用医薬組成物
JP6620294B2 (ja) ムンプスウイルスの弱毒化方法、ムンプスウイルス、及び、生ワクチン
Luo et al. Single amino acid change at position 255 in rabies virus glycoprotein decreases viral pathogenicity
US11421247B2 (en) Borna viral vector and use thereof
CN109136200A (zh) 一种重组传染性造血器官坏死病毒及其构建方法与应用
JP2023532735A (ja) 組み換えエンテロウイルスおよびその使用
CN111041001B (zh) 治疗kras突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物
JPH04504357A (ja) ワクシニアベクター、ワクシニア遺伝子およびその発現産物
JP5299879B2 (ja) ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用
WO2016101326A1 (zh) 溶瘤异源重组新城疫病毒及其制备方法与应用
JP2023523643A (ja) 抗腫瘍のウイルス
US11530422B2 (en) Oncolytic virus for treating brain tumors using recombinant Newcastle disease virus into which Newcastle disease virus vector-based PTEN gene is inserted and composition for treating brain tumors using same
CN105586319B (zh) 复制型痘苗病毒载体艾滋病疫苗
WO2024019113A1 (ja) 不活化全粒子インフルエンザワクチンの発熱活性低減方法
Menghini Assessing the Impact of Sf-Rhabdovirus and Its Progenitor on the Biosafety Profile of the Baculovirus-Insect Cell System
JP2022531976A (ja) 弱毒化黄熱ウイルス及びがんの処置のためのその使用
CN113528468A (zh) 一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15865303

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016562313

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15865303

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1